MODELAMIENTO DE LA CINÉTICA DE HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA

Revista EIA, ISSN 1794-1237 Número 17, p. 71-84. Julio 2012
Escuela de Ingeniería de Antioquia, Medellín (Colombia)
MODELAMIENTO DE LA CINÉTICA DE HIDRÓLISIS
ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS DEL PLASMA BOVINO
Omar Alfredo Figueroa*
José Édgar Zapata**
Gail Albeiro Gutiérrez***
RESUMEN
Se utilizó un modelo cinético para estudiar la velocidad de reacción en la hidrólisis de proteínas de plasma
de bovino con alcalasa 2,4 L en un reactor batch. Se estudió la influencia de variables como la concentración
inicial de sustrato y enzima sobre el grado de hidrólisis y se determinaron los parámetros cinéticos de la ecuación
de velocidad, analizando su relación con las variables de trabajo. Se ajustó un modelo cinético de orden cero y
desactivación enzimática por sustrato, de segundo orden, así como la relación directa entre la fracción enzima-sustrato y la tasa de formación de productos de hidrólisis.
PALABRAS CLAVE: hidrolizados proteicos; hidrólisis enzimática; cinética enzimática; modelos bioquímicos.
* Ingeniero Agroindustrial, Universidad Popular del Cesar; Magíster (c) en Ciencias Farmacéuticas: Alimentos, Facultad
de Química Farmacéutica, Universidad de Antioquia. Medellín, Colombia. omfimo22@gmail.com
** Ingeniero Químico, Universidad de Antioquia; Doctor en Biotecnología, Universidad de Granada, España. Docente
de Planta, Departamento de Alimentos, Facultad de Química Farmacéutica, Universidad de Antioquia. Medellín,
Colombia. jedgar_4@yahoo.es
***Ingeniero Mecánico, Universidad Industrial de Santander; Doctor en Ingeniería, Universidad Pontificia Bolivariana,
Sede Medellín. Docente, Universidad Popular del Cesar. Valledupar, Colombia. gailgutierrez@unicesar.edu.co
Artículo recibido 14-XII-2011. Aprobado 2-V-2012
Discusión abierta hasta diciembre de 2012
Modelamiento de la cinética de hidrólisis enzimática...
MODELING OF THE KINETICS OF ENZYMATIC HYDROLYSIS
OF BOVINE PLASMA PROTEINS
ABSTRACT
A kinetic model was used to study the reaction rate of hydrolysis of bovine plasma proteins and alcalase 2.4 L,
in a batch reactor. The influence of variables, such as the concentration of initial enzyme substrate and the degree
of hydrolysis was studied, and kinetic parameters of the rate equation were determined by analyzing its relationship
with the work variables. A zero-order kinetic model and enzyme deactivation by substrate was found, as well as the
direct relationship between the fraction of enzyme-substrate and the rate of formation of hydrolysis products.
KEY WORDS: protein hydrolysates; enzymatic hydrolysis; enzymatic kinetics; biochemical models.
MODELAção DA CINÉTICA DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS
DO PLASMA BOVINO
RESUMO
Utilizou-se um modelo cinético para estudar a velocidade de reação na hidrólise de proteínas de plasma
de bovino com alcalasa 2,4 L em um reator batch. Estudou-se a influência de variáveis como a concentração
inicial de substrato e enzima sobre o grau de hidrólise e determinaram-se os parâmetros cinéticos da equação de
velocidade, analisando sua relação com as variáveis de trabalho. Ajustou-se um modelo cinético de ordem zero
e desativação enzimática por substrato, de segunda ordem, bem como a relação direta entre a fração enzimasubstrato e a taxa de formação de produtos de hidrólise.
PALAVRAS-CÓDIGO: hidrolisados proteicos; hidrólise enzimática; cinética enzimática; modelos bioquímicos.
1.
INTRODUCCIÓN
La sangre bovina es un subproducto de la
industria cárnica con un importante valor biológico,
representado en su contenido de proteínas, lo que
la convierte en una buena fuente de aminoácidos,
cuyo uso como ingrediente, en especial la fracción
plasmática, se ha extendido en alimentación humana
y animal, en aplicaciones como la formulación de
embutidos, pudines, panes, galletas, etc. (Rodas et
al., 1998). No obstante, la mayor parte de la sangre
producida en el sacrificio de animales se vierte a las
fuentes de agua, contribuyendo al daño del medio
ambiente (Hyun y Park, 2002).
72
Los hidrolizados de proteínas se han utilizado en muchos procesos alimentarios, gracias a sus
propiedades funcionales, como mayor capacidad de
agitación, dispersión y elevada solubilidad (Ramos et
al., 2006; Dàvila et al., 2007; Benítez, Ibarz y Pagan,
2008). Desde el punto de vista de la nutrición, las
proteínas y péptidos procedentes de alimentos se
están empleando con el fin de mejorar funciones
biológicas (Möller et al., 2008; Bernardini et al.,
2010), pues los péptidos obtenidos por hidrólisis
son capaces de ejercer efectos biológicos específicos (Martínez y Martínez, 2006). Tal es el caso de
hidrolizados de plasma a los que se les ha reportado
actividad inhibidora de la enzima convertidora de la
Revista EIA Rev.EIA.Esc.Ing.Antioq
angiotensina (ACE), actividad antigenotóxica (reducción de daños en el ADN) (Hyun y Park, 2002) y
actividad antioxidante (Liu et al., 2010). Por otro lado,
han sido aislados péptidos de hemoglobina bovina
con propiedades antimicrobianas (Daoud, DuboisDelval y Bors-Dodita, 2005; Nedjar et al., 2006).
Debido al uso potencial del plasma y otras
proteínas de la sangre, existe hoy día gran interés
por modelar el comportamiento de sistemas que
involucran reacciones de hidrólisis enzimática, con el
fin de dimensionar equipos industriales, pronosticar
comportamientos dinámicos, controlar tiempos de
proceso y otras variables cinéticas (Arantes, 2008).
Es importante resaltar que la optimización de estos
procesos depende del comportamiento cinético,
que puede llegar a ser muy complejo para sistemas
con sustratos proteicos, más aun cuando se tienen
varias proteínas en el mismo sistema reaccionante
(Guadix et al., 2000). En este sentido, un modelo muy
simple es insuficiente para representar un proceso, y
uno muy complejo se hace poco práctico (Márquez
y Vázquez, 1999). Unos modelos cinéticos para sistemas batch que explican la velocidad de hidrólisis
de caseínas (Camacho et al., 1993), lactoalbúminas
(González-Tello et al., 1994), hemoglobina bovina
(Márquez y Vázquez, 1999) y sustratos de origen
vegetal (Márquez y Fernández, 1993) se han probado con éxito, generando información básica para la
optimización de procesos.
Considerando que las reacciones enzimáticas
de proteínas tienen cierto grado de complejidad, se
han venido estudiando modelos cinéticos de agrupamiento que contemplan la distribución de pesos
moleculares de los productos de reacción (Shi, He
y Qi, 2005), así como sistemas discontinuos de separación empleando membranas, a fin de reducir los
inconvenientes con las inhibiciones enzimáticas por
producto (Cheison, Wang y Xu, 2006; Prieto, Guadix
y Guadix, 2008; Trusek-Holownia, 2008).
En el presente trabajo se aborda el modelado
de la hidrólisis de proteínas de plasma bovino, cuya
exploración, desde la perspectiva de los modelos
Escuela de Ingeniería de Antioquia
de hidrólisis, ha sido poco documentada. Se realizó
un estudio cinético de la hidrólisis enzimática de
proteínas de dicho sustrato, por medio del análisis
de las curvas de hidrólisis bajo diferentes condiciones de trabajo, y se encontró que es posible
ajustar el comportamiento descrito a un modelo
matemático basado en una cinética de reacción de
orden cero, desactivación enzimática de segundo
orden e inhibición irreversible inicial de una fracción de la enzima, pudiéndose determinar de esta
forma los parámetros cinéticos del mecanismo de
reacción propuesto. Este estudio permitió obtener
información útil para predecir y manipular el comportamiento de las variables del proceso, lo que
podría servir para dirigir la hidrólisis enzimática
hacia la obtención de fracciones peptídicas de
interés biológico.
2.
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Materiales
Los reactivos usados en el estudio fueron de
grado analítico y los métodos empleados fueron
estandarizados a priori. El plasma fue suministrado
por la empresa Yeruvá S. A., en la ciudad de Esperanza, provincia de Santa Fe, República Argentina.
La presentación del producto fue líquida, con un
contenido proteico de 6,5 %. A este se le realizaron
controles microbiológicos de mohos y levaduras,
coliformes totales y mesófilos, en el momento de la
recepción. Para la hidrólisis de proteínas, se utilizó
alcalasa 2,4 L grado alimenticio (actividad específica
de 2,45 ± 0,07 AU/g), cuya actividad se verificó con
el método de Takami, Akiba y Horikoshi (1989) modificado; es una enzima proteolítica producida por
fermentación sumergida de una cepa seleccionada
de Bacillus licheniformis. El componente principal
de la enzima, subtilisina A (subtilisina Carlsberg), es
una endoproteasa. Las condiciones óptimas para
alcalasa 2,4 L son temperaturas entre 55 °C y 70 °C,
dependiendo del tipo de sustrato, y valores de pH
entre 6,5 y 8,5.
73
Modelamiento de la cinética de hidrólisis enzimática...
2.2 Sistema de reacción
Se usó un reactor de vidrio con camisa de
circulación de agua para regulación de la temperatura y capacidad volumétrica de 1 L. El control
de pH y el registro de temperatura se hicieron con
un electrodo combinado de vidrio LL con diafragma esmerilado fijo (temperatura entre 0-80 °C),
conectado a un titulador automático (Titrando 842)
marca Metrohm, operado por computador (software
tiamo 1.2.1). El sistema de reacción se mantuvo en
agitación constante usando un agitador magnético
801 (Metrohm), con variación de velocidad. La
temperatura en el sistema fue de 55 °C, el pH de 8
y la agitación de 200 rpm.
2.3 Métodos analíticos
2.3.1 Análisis del contenido proteico
La concentración de proteínas del plasma
recibido fue determinada por el método de Bradford
(1976). La curva patrón se construyó empleando albúmina bovina, referencia A7030 de Sigma-Aldrich.
Las mediciones espectrofotométricas se hicieron
en un espectrofotómetro UV-1700 PharmaSpec de
Shimadzu. La absorbancia a temperatura ambiente
se midió a 595 nm (Trusek-Holownia, 2008).
2.3.2 Seguimiento de la reacción
de hidrólisis
Unos estudios previos de hidrólisis con alcalasa
2,4 L y hemoglobina bovina revelan que concentraciones iniciales de sustratos del orden de 1-10
g/L de proteína presentan buen comportamiento
respecto a la velocidad de formación de péptidos
(Márquez y Vázquez, 1999). El contenido de proteínas
del plasma se varió entre concentraciones de 4, 6 y
8 g/L, y fue hidrolizado con concentraciones de enzima de 2, 2,5 y 3 % en peso. El pH y la temperatura
en el reactor se ajustaron con base en los valores
óptimos de trabajo recomendados por el proveedor
de la enzima (alcalasa 2,4 L), es decir, 8,0 y 55 °C
respectivamente. Los ensayos de hidrólisis con cada relación enzima-sustrato fueron efectuados por
duplicado. Cada ensayo tuvo una duración total de
una hora, tomando registros del grado de hidrólisis
(GH) cada 5 min.
La reacción a pH alcalino se observó para la
determinación del GH, expresado como la relación
entre el número de enlaces peptídicos cedidos en
la hidrólisis (h) y el número de enlaces peptídicos
totales en la proteína nativa por unidad de peso
(ht). Para este caso se empleó un valor reportado
para proteínas de la sangre de ht de 8,3 eqv/kg
(Adler-Nissen, 1986). El método empleado para la
determinación del grado de hidrólisis es el de valoración del protón o método del pH-estato. Consiste
en mantener constante el pH del medio de reacción
con adición de una solución básica (hidróxido de
sodio 0,1 N), pues a medida que la hidrólisis avanza
en medio alcalino, el grupo carboxilo terminal se
disocia por completo y los protones formados se
reparten de acuerdo con el equilibrio de protonación de los grupos α-amino liberados. La base
agregada para mantener constante el pH neutraliza
únicamente los protones que son sustituidos por el
catión de la base (Guadix, 2002).
En la hidrólisis de un enlace amido a pH alcalino, se siguen las siguientes etapas (Guadix, 2002):
El grupo carboxilo terminal se disocia por completo:
74
Revista EIA Rev.EIA.Esc.Ing.Antioq
La base agregada neutraliza los protones:
Luego este consumo de base puede relacionarse con el GH según la ecuación 1 (Márquez y
Vázquez, 1999).
entre la velocidad de la reacción, la concentración
inicial de sustrato (S0) y de enzima (e0) con dos
parámetros de ajuste a y b (véase ecuación 2), que
fueron determinados con la función “lsqcurvefit” del
“toolbox” de MATLAB, la cual resuelve problemas de
ajuste de datos de curvas no lineales. 1a)
1b)
Donde B = volumen consumido de base
(en litros), Mp = masa de la proteína (en kg),
NB = normalidad de la base (eqv/L).
En 1b, α es el grado de disociación de los grupos α-NH2 (grupos aminos liberados en la reacción).
Para la estimación del promedio del grado de
disociación de los grupos α-NH2 liberados en la reacción, es necesario conocer el valor del pK medio y
establecer de esta forma la relación entre el consumo
de base y el grado de hidrólisis.
En la tabla 1, se muestran los valores del grado
de disociación de proteínas en función del pH y la
temperatura de reacción (Adler-Nissen, 1986).
Tabla 1. Valores de α para distintas temperaturas
y pH (Adler-Nissen, 1986)
T (°C)
pH
α
50
7,5
0,71
50
8,0
0,89
60
7,5
0,80
60
8,0
0,93
3.
(2)
RESULTADOS Y DISCUSIONES
3.1 Modelo cinético
Los resultados obtenidos al estudiar el comportamiento del GH con respecto al tiempo, a
diferentes concentraciones iniciales de enzima y de
proteína, se muestran en las figuras 1 y 2, en las cuales
se puede observar que al principio de la reacción el
GH aumenta con el tiempo y luego tiende a valores
constantes, que son directamente proporcionales a
e0 e inversamente a S0.
Algunos autores (González-Tello et al., 1994;
Márquez y Vázquez, 1999) han indicado que en la
hidrólisis enzimática de proteínas, cuando se tienen
curvas de declinación exponencial de la dGH/dt en
función del tiempo, se puede ajustar un modelo de la
forma de la ecuación 2 para el estudio cinético de la
reacción, tal como se muestra en la figura 3, donde
se pone en evidencia la disminución exponencial de
la velocidad de la reacción (d(GH)/dt ) con el GH.
2.4 Modelo matemático
Por otro lado, el GH de la reacción aumenta cuando se trabaja a concentraciones iniciales
más altas de enzima (véase figura 1), lo cual es
un comportamiento típico en cinética enzimática
de proteínas (He, Qi y He, 2002), debido a que la
reacción de hidrólisis está ligada a la formación del
complejo enzima-sustrato, que a su vez depende de
la concentración de la enzima activa.
Se propuso un modelo matemático basado en
el mecanismo de acción enzimática (González-Tello
et al., 1994), que establece una relación exponencial
Se alcanzaron en este caso porcentajes de
hidrólisis superiores al 12 % en una hora de reacción,
con una relación enzima-sustrato de 2 % (w/w),
Escuela de Ingeniería de Antioquia
75
Modelamiento de la cinética de hidrólisis enzimática...
Figura 1. Comportamiento del GH con el tiempo a pH = 8,0, T = 55 °C, S0 = 8 g/L y e0 variable
S0
Figura 2. Comportamiento del GH con el tiempo a pH = 8,0, T = 55 °C, e0 = 0,3885 AU/L y S0 variable
76
Revista EIA Rev.EIA.Esc.Ing.Antioq
1,60
1,40
R² = 0,9719
So= 4 g/L
1,20
R² = 0,9997
So= 6 g/L
dGH/dt (min‒1 )
1,00
R² = 0,9991
0,80
So= 8 g/L
0,60
0,40
0,20
0,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
GH (%)
Figura 3. Disminución de dGH/dt con el GH para el sistema plasma bovino-alcalasa 2,4 L
a diferentes S0 y e0 = 0,3885 AU/L, pH = 8,0, T = 55 °C
mientras que los rendimientos inferiores se registran
con concentraciones menores de enzima (véase figura 1). Unas investigaciones anteriores (González-Tello
et al., 1994; Márquez y Vázquez, 1999; Qi y He, 2006)
indican que la disminución en la tasa de hidrólisis de
la reacción responde, por lo general, a tres factores:
(a) Disminución en la concentración de enlaces peptídicos susceptibles a la hidrólisis por las proteasas,
(b) posible inhibición de las enzimas causada por el
sustrato de hidrólisis; (c) desnaturalización térmica
de la enzima (González-Tello et al., 1994).
Esto se prueba de forma experimental, adicionando
enzima fresca a un hidrolizado después de 30 minutos de reacción, al producirse un aumento notable
en el grado de hidrólisis, lo que pone en evidencia
el fenómeno de desactivación indicado, como se
observa en la figura 4.
Analizando las figuras 1 y 2, para todos los
niveles de enzima y sustrato hidrolizados, se observa
la tendencia del grado de hidrólisis hacia valores
límites distintos, por lo que es claro que el factor
controlante en la velocidad no es la disminución
de enlaces peptídicos disponibles. Por otro lado, el
fenómeno de desactivación enzimática demostró ser
influyente en la disminución de la tasa de hidrólisis.
Escuela de Ingeniería de Antioquia
Se considera que la velocidad de hidrólisis a
pH y temperatura constantes está dada por la ecuación 3 (González-Tello et al., 1994):
(3)
Separando variables e integrando la ecuación
3, para el caso en que no hay desnaturalización
enzimática (González-Tello et al., 1994):
(4)
77
Modelamiento de la cinética de hidrólisis enzimática...
16
y = 8E-10x6 + 1E-07x5 - 4E-05x4 + 0,0026x3 - 0,0779x2 + 1,2205x
R² = 0,9974
14
12
GH (%)
GH (%)
10
8
Grado de hidr¢lisis (%)
6
4
2
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Tiempo (min)
Figura 4. Efecto de la adición de enzima fresca (alcalasa 2,4 L) durante el proceso de hidrólisis de plasma
a pH = 8,0, T = 55 °C, e0 = 0,3885 AU/L y S0 = 4 g/L.
De la misma manera, la expresión integrada
para el caso en que se presente inactivación enzimática de segundo orden está dada por (5) (GonzálezTello et al., 1994):
(5)
Como puede verse en las ecuaciones 3 y 5,
existe una relación directa entre el grado de hidrólisis y el producto e0*t, por lo que es posible decir
que, para el caso de los experimentos realizados, la
desactivación es de segundo orden, lo cual puede
corroborarse con los resultados de la figura 5, donde
se muestra que los datos de GH a igual S0 y distintas
concentraciones de enzima inicial siguen la misma
línea.
Por otra parte, una inactivación enzimática
por el sustrato en el rango de concentraciones
estimadas no se considera, puesto que los valores
78
registrados en los parámetros a y b, para distintas
concentraciones de e0 y S0, no concuerdan con el
comportamiento esperado en el caso de adicionar
al mecanismo este efecto inhibidor.
Estudios anteriores sugieren que un modelo
de la forma de la ecuación 2 puede ser explicado
suponiendo una hidrólisis enzimática de orden cero,
simultánea con una desnaturalización de la enzima
de segundo orden, como lo muestra el siguiente
mecanismo (Márquez y Vázquez, 1999).
k1
K2
E + S ⇄ ES → E + P
k-1
k3
E + ES → Ea +Ei +P
Donde E, S y P representan la concentración
de enzima, sustrato y producto, respectivamente.
Revista EIA Rev.EIA.Esc.Ing.Antioq
k1
K2
E + S ⇄ ES
k1 → E + P
K2
E k+-1S ⇄ ES → E + P
k-1
k3
E + ES → Eka3 +Ei +P
Figura 5. Influencia
concentración
inicial de enzima por el tiempo en el GH, pH = 8,0, T = 55 °C, S0 = 8 g/L
Eala+E
E + ES →de
i +P
ES es el complejo enzima sustrato.
Ea y Ei indican la concentración de enzima
activa e inactiva en la reacción.
Luego las ecuaciones cinéticas para la formación de producto y para la etapa de desactivación
enzimática son:
d�GH�
d�GH�
| | (6)(6)
r = sr0= s0 dt= k=
2 |ES
2 |kES
dt
-
de
dt
(6)
de
E|||ES| (7)(7)
=- dtk3=|Ek3|||ES
(7)
Donde k2 es la constante cinética de velocidad
de formación de productos, k3 es la constante de
desactivación enzimática.
Teniendo en cuenta que la enzima interviene
como catalizador del sistema, la concentración de
enzima en todo momento resulta de:
e =E + ES
e =E + ES
(8)
(8)
e = E + ES
(8)
Se sugiere la presencia de un inhibidor irreversible en el sustrato, que bien puede estar presente
o formarse en la reacción de hidrólisis. Puede estar
asociado a inhibidores α-AT presentes en la sangre
humana y bovina (Beatty, Bieth y Travis, 1980) o
inhibidores similares a estos, como los encontrados
por Weber y Nielsen en matrices lácteas (Weber y
Nielsen, 1991).
Esta hipótesis sugiere que parte de la enzima
inicial se liga al inhibidor, modificando la concentración de enzima inicial disponible de manera
instantánea, en la forma que se muestra en (9)
(González-Tello et al., 1994):
E0act =e0 -ВS0
Escuela de Ingeniería de Antioquia
(9)
(9)
79
K +K2
-1
(12)
K K
e=E0act exp �− 3 m �GH��
K2
|E|=
Modelamiento de la cinética de hidrólisis enzimática...
e=E0act exp �−
Donde B*S0 es la fracción de sustrato ligada al
inhibidor y E0act es la concentración de enzima inicial
E0act
=sistema,
e0E-ВS
e0 -ВS0(9)para la reacción.
(9)
real activa
en el
0act0=disponible
Según la aproximación de Briggs-Haldane (Tzafriri y
Edelman, 2007), la constante de Michaelis-Menten
Km es:
E0act =e0 -ВS0
Km =
(9)
K +K2
-1
K1
dt
r= s0
d(gh)
dt
|ES|=
(10)
Km << S0:
y Km << S0:
|E|=
S0
|E|=
(11)
r= s0
d(gh)
dt
e=E0act exp �−
K2
=k (e0 -ВS0 )EXP �−
2
�GH��
K2
�GH��
K3 Km
K2
d(gh)
�GH��
r= s0d(gh) =k (e0 -ВS0 )EXPK3�K−
m
K3 Km
K2
�GH��
�GH��
(14)
(14)
k3 km
bk2
k k (16) = 3 m k2
(15)
(15)
(16) (16)
Los datos obtenidos en los ensayos experimentales se ajustaron a un modelo general de la forma
de la ecuación 2. El ajuste del modelo con los datos
experimentales fue satisfactorio y los parámetros a
y b estimados están de acuerdo con el mecanismo
propuesto (tabla 2).
Km e
K3 Km
2
K2
3.2 Determinación de los parámetros cinéticos
(11)
|E|=
(12)se obtiene
De las ecuaciones
(6), (7) y (12)
S0
por integración una expresión para e, donde el límite
K K
inferior
integración3esmla enzima inicial(13)
realmente
e=Ede
0act exp �− K �GH��
2
activa E0act:
K3 Km
e=E0act exp �−
=k (e0 -ВS0 )EXP �−
b=
(12)(12)
S0 2
a = k2 [(eo/S0 )-B]
(12)
Km e
(13)
/S )-В]
k02/S[(e
a =ak2=[(e
0 )-В]
0 0 (15)
Sustituyendo la ecuación 11 en la (8) y suponiendo que la concentración
|E||S| de sustrato [S] = S0
|ES|=
(11)
Km
y Km << S0: Km e
< S0:
0
Km
�GH��
Es decir, llega a un modelo general de la
forma de la ecuación 2, obteniéndose para a y b las
siguientes expresiones:
para el complejo ES indica que
|E||S|
K2
(13)
Entonces
d(gh) una ecuación de velocidad
K3para
Km el
(10)
2
|ES|= K = K-1+K|E||S|
(11) (10)
Kmm
K1
K3 Km
(e0 -ВS
r=
s0 puede=k
0 )EXP
sistema
expresarse
como
sigue:�−
K +K(10)
-1 2
Un balance de masa
estado estacionario
m enKel
1
K =
S0
Se aprecia que los valores de a aumentan con
la relación e0/S0, mientras que los valores del pa(13)rámetro b permanecen en torno a un cierto valor,
para el rango de concentración de sustrato y enzima
(13)
(13)
evaluados, con un promedio de (0,255 ± 0,038) min-1.
K3 Km
(14)
�GH��
(14)
dt =k (e
K2 ��
�GH
2 0 -ВS
r=Tabla
s0 2.
)EXP �− a evaluado
(14)
Valores
del0parámetro
y recalculado
arec a distintas relaciones enzima-sustrato
dt
K2
2
con su correspondiente coeficiente R2
[e0]/[S0] (AU/g)
a (min-1)
R2
arecalculado (min-1)
R2
0,036
0,072
0,9999
0,066
0,9995
0,9992
0,414
0,9962
0,9992
0,466
0,9957
0,9997
0,654
0,9998
a = k2 [(e0 /S0 )-В]
b
0,049
0,061
0,065
80
(15)
k3 km
/S (16)
)-В]
(15) (15)
=a =a k= 2 k[(e
0,380
2 0[(e00 /S
0 )-В]
k2
b=
k3 km
b
0,413
k k
k2 3 m =
(16) k2 0,639
(16) 0,073
0,657
0,9966
0,698
0,9875
0,097
1,652
0,9998
1,578
0,9992
Revista EIA Rev.EIA.Esc.Ing.Antioq
= s0
Este comportamiento concuerda con reportes de literatura previos sobre hidrólisis enzimática de proteínas
de la sangre (Márquez y Vázquez, 1999). Los valores
de a fueron recalculados con la magnitud promedio
del parámetro b y analizados a la luz de la variación
de la relación enzima-sustrato, tal como se muestra
en la tabla 2.
Cuando los valores de arec se grafican contra
e0/S0, es posible estimar la constante de formación
de producto k2 y la constante B de la ecuación 15
(ver figura 6).
De la misma manera, una representación
gráfica del producto de los parámetros ab contra
(e0/S0-B) en una línea que pasa por el punto (0,0) permite la determinación del producto de las constantes
k3km (ver figura 7), que en el mecanismo propuesto
equivale a la constante de desactivación enzimática de segundo orden de la reacción (kd), como se
muestra en la siguiente expresión:
-
de
dt
=k3 km
e2
S0
(17)
(17)
Donde k3km
activación.
= kd, constante cinética de des-
Los valores de los parámetros cinéticos calculados para el sistema alcalasa 2,4 L-plasma bovino
son: K2 (g/AU*min)= 22,940; В (AU/g)= 0,035 con
R2=0,9329 y Kd (g/AU*min)= 5,848 con R2=0,9386.
Con base en esto, el modelo cinético quedaría
como se presenta en la ecuación 18.
e
n
d(GH)
-5, 848
�GH��
r= s0 =22,,940(e0 -0,03
35S0 )exp �
dt
22, 940
(18)
(18))
En la figura 8 se muestran los valores predichos por el modelo propuesto en la ecuación 18
(línea continua en cada curva), así como los valores experimentales (curvas con marcadores) para
diferentes relaciones de e0/S0. El modelo muestra
un error relativo promedio con respecto a los datos
experimentales del 7,30 %, lo cual indica un buen
ajuste del modelo propuesto, teniendo en cuenta
que es una reacción multisustrato.
Figura 6. Variación de los diferentes valores de arec con e0 /S0 (AU/g).
Límite de confianza del 95 % y R2= 0,965
Escuela de Ingeniería de Antioquia
d(GH)
dt
=22,,940(e0 -0,03
35S0 )exp �
e
-5, 848
22, 940
n
�GH��
n
(18))
n
81
Modelamiento de la cinética de hidrólisis enzimática...
Figura 7. Variación de los diferentes valores de a*b con (e0 /S0)-В (AU/g.
Límite de confianza del 95 % y R2= 0,938
GRADO DE HIDRÓLISIS Vs TIEMPO (SISTEMA PLASMA-ALCALASA (W/V)
14
0,0607 AU/g
12
0,0647 AU/g
0,0971 AU/g
GH (%)
10
8
6
4
2
0
0
10
20
30
t (Minutos)
40
50
60
Figura 8. Comportamiento del GH en función del tiempo a diferentes e0 /S0 (La línea continua representa los
valores predichos por el modelo y los marcadores representan los datos experimentales), pH=8,0, T=55 °C
82
Revista EIA Rev.EIA.Esc.Ing.Antioq
La ecuación 2 ha sido empleada para estudiar
la relación entre el grado de hidrólisis y el tiempo de
reacción de diversas fuentes proteicas como garbanzo (Márquez y Fernández, 1993), sistema alcalasa-caseína (Camacho et al., 1993) e hidrólisis tríptica
de caseína (He, Qi y He, 2002), albúminas de suero
lácteo (González-Tello et al., 1994), seroalbúmina bovina (Qi y He, 2006) y hemoglobina bovina (Márquez
y Vázquez, 1999). Ello demuestra el amplio espectro
de aplicación de este modelo, tanto desde el punto
de vista del sustrato, como de complejos enzimáticos
y condiciones de operación (Márquez y Vázquez,
1999). Un enfoque más reciente es la aplicación de
redes neuronales artificiales para la estimación de los
parámetros de la ecuación 2 (Abakarov et al., 2010).
determinación de los parámetros a y b del modelo
general y la relación entre S0, e0, GH con el tiempo de
reacción es información de gran valor en actividades
de optimización de parámetros, para una potencial
producción industrial de péptidos, así como para el
diseño y funcionamiento de biorreactores.
Estos resultados ponen de manifiesto la
importancia de la relación e0/S0 sobre la cinética
de hidrólisis enzimática de plasma de bovino y la
presentan como una variable clave para optimizar
las condiciones de operación tendientes a orientar
los valores de GH hacia regiones de interés. Tal
información es importante cuando se quiere dirigir
la hidrólisis a la consecución de péptidos en determinados rangos de tamaño, a la optimización de
condiciones de operación en escala industrial y al
diseño de biorreactores.
REFERENCIAS
4.
CONCLUSIONES
En este trabajo se evaluó y validó un modelo
matemático que puede usarse para simular la reacción de hidrólisis enzimática de plasma bovino
con alcalasa 2,4 L en un reactor batch. El modelo
sugiere un mecanismo de reacción que representa
una cinética de orden cero con respecto al sustrato,
simultánea con una desactivación enzimática de
segundo orden e inhibición irreversible de una parte
de la enzima presente en la reacción.
Un análisis de la reacción de hidrólisis enzimática de proteínas a la luz de la ecuación 2 puede
llevarse a cabo para distintos tipos de sistemas
proteicos (bien de origen animal o vegetal). La
deducción del mecanismo cinético basado en la
Escuela de Ingeniería de Antioquia
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos al Comité para el Desarrollo de
la Investigación (CODI) de la Universidad de Antioquia y al Centro de Investigación para el Desarrollo
Tecnológico del Carbón (CIDTEC) de la Universidad
Popular del Cesar.
Abakarov, A.; Almonacid, S.; Urtubia, S. and Simpson,
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