aislamiento y diagnostico de campylobacter fe`tus ssp

Rev. Méd. Hosp. Nal. Niños Costa Rica 18 (1): 1 -
AISLAMIENTO Y DIAGNOSTICO DE CAMPYLOBACTER
FETU~
19,1983.
SSP JEJUNI
Dr. Francisco Hernández*, Dra. Patricia Rivera**
Dr. Marco L. Herrera** y Dra. Rosa Rodríguez**
INTRODUCCION
El género CIDllP'y1obacter se ubica taxonómicamente en la familia §p-irillaceae y está
subdividido en tres especies: ~ fecalis, ~ fetus y C.Jp-utorum, con cinco subespe·
cies (Cuadro 1). Unicamente las subespecies C. fetus intestinalis y ~ fetus j~~ se
han incriminado con infecciones en humanos. La primera se asocia con septicemias
y la segunda con diarreas y esporádicamente también con septicemias (16).
Posiblemente la primera infección en humanos causada por c..ww>ylQbacter fue descrita en 1913 (6). Sübsecuentemente se informó de otros casos de septicemias cau·
sadas por ese agente, que era conocido entonces como Vibrio fetus y el cuadro clínico que provocaba se denominó "vibriosis". Entre 1944 y 1967 se habían descrito
20 casos de vibriosis, en los cuales el agente se había aislado en hemocultivos (8,20
32 Y 33). No obstante, esta bacteria era más importante en medicina veterinaria que
en humana, ya que causante de abortos y septicemias en bovinos (17). Sin em·
bargo, el interés médico por este agente aumentó progresivamente a partir de 1972,
cuando se informó por primera vez del aislamiento de esta bacteria a partir de heces provenientes de pacientes con diarrea (9). Actualmente el C,fetus ssp_~j~juni es
uno de los principales agentes bacterianos causantes de diarrea (10).
Los primeros aislamientos fecales se hicieron inoculando los medios de cultivo con
filtrados de heces, que se hacían a través de filtros Millipore con porosidad de 0,65
um de diámetro, los cuales retenían gran parte de la flora fecal y permitían el paso
del Campylobacter, de manera que se eliminaban microorganismos que posiblemen·
te inhibían su crecimiento por competición (9).
Posteriormente se simplificaron los métodos para el aislamiento de este agente,
cuando se desarrollaron medios de cultivo selectivos a base de antibióticos, como el
descrito por Bützler (5) y el de Skirrow (26), los que permiten el aislamiento de la
bacteria directamente a partir de heces.
En este informe se describen los métodos bacteriológicos, medios de cultivo e implementos de laboratorio necesarios para el aislamiento e identificación del CAmp.Y.:.
lobacter fetus ssp j~juni. El objetivo ha sido recopilar la información mínima nec\:·
saria, para establecer la metodología de trabajo, tendiente a diagnosticar rutinaria·
mente este agente.
AISLAMIENTO
MEDIOS DE CULTIVO:
la Organización Mundial de la Salud recomienda el medio de Bützler, como el más
apropiado para el aislamiento del Campv.lobacter (36). Este medio tiene una base
* Unidad de Microscopía Electrónica, Universidad de Costa Rica. San José, Costa
Rica.
** Hospital Nacional de Niños "Dr. Carlos Sáenz Herrera" San José, Costa Rica.
1
2
REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NIl'lOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA
de tioglicolato y se le adiciona agar el 1,5 % , sangre de carnero o humana en un 5 a
10 % , extracto de levadura en 1 % Y las siguientes cantidades de antibióticos por
litro: bacitracina 250 mg, novobiocina 5 mg. antidiona 50 mg, colicistina 10.000
UI y cefoxitina 15 mg (36).
Unicamente el aislamiento primario de Campyloba~ requiere el empleo de medios selectivos, ya que posteriormente puede cultivarse en medios como agar sangre
o tioglicolato.
Para el aislamiento primario las heces se inoculan directamente sobre el medio de
Bützler, esparciéndolas con asa bacteriológica para aislar colonias.
En el Laboratorio Clínico del Hospital Nacional de Niños (HNNl, uno de los autores (MLH) ha logrado buena recuperación del Campylobacter a partir de tubos con
tetrationato·iodo (15) siguiendo la metodolOQT'a empleada en el aislamiento de
enterobacterias. Los tubos con tetrationato se inoculan con una torunda impregnada en heces y se incuban a 37 oC durante 24 horas. Luego se homogenizan y se
saca una asada que se raya en un plato de agar Bützler, tal como se hace con un<l
muestra de heces. Hasta el momento este método ha permitido el aislamiento del
95,5 % de las cepas con respecto a la inoculación directa de las heces en Bützler,
incluso en algunas ocasiones la bacteria sólo se aisló del tetrationato.
CONDICIONES DE CULTIVO:
El ~ fetus ssp j~juni es capaz de crecer a temperaturas entre 37 y 42 oC, sin embargo, la temperatura recomendada para su aislamiento es de 42 OC, ya que inhibe a
otras bacterias y a la vez permite diferenciarla de ~ fetus intestinalis que sólo crece
a 37°C (Cuadro 2) (16).
La atmósfera de incubación debe ser microaerofílica que contenga aproximadamente 90-95 % de mezcla de nitrógeno - anhidrido carbónico y un 5 a 10 % de oxígeno (7, 16, 18,27). Esta condición puede lograrse con un sobre generador tipo
"Gas Pack" en una jarra de anaerobiosis sín catalizador. O bien, de una manera más
económica empleando el sistema de evacuación y reemplazo, que consiste en ex·
traer el aire de una jarra de anaerobiosis con válvula (tipo BBL 60465), mediante
una bomba de vacio, hasta alcanzar una presión de 8 torro Luego la atmósfera de la
jarra se reemplaza por una mezcla de N 2- CO2 , hasta recuperar la presión normal.
Esta mezcla de gases también se utiliza cuando la bacteria se inocula en tubos, tal
como se ilustra en la Figura 1 (16).
Cuando se requieren almacenar cepas de Campylobacter, éstas se inoculan en tubos
con tioglicolato-agar al 0,16 % en microaerobiosis, se incuban a 37 oC durante 24
horas y luego se guardan a ·70 OC. Cuando se van a reutilizar se descongelan lenta·
mente a temperatura ambiente y se rayan en platos de agar sangre para evaluar la
pureza del cultivo.
MORFOLOGIA DE LA COLONIA:
Es posible distinguir dos tipos morfológicos de colonias de acuerdo con el grado de
humedad de los medios de cultivo (4). Así, en medios frescos (húmedos) las colonías son no hemolíticas, planas, con bordes irregulares, de color blanco grisáceo y
superficie brillante, que se esparcen siguiendo las estrías del asa, llegando a hacerse
confluentes. Las colonias separadas semejan gotas de agua derramadas sobre la
superficie del agar (Figura 2a).
Hernández, F. et al: AISLAMIENTO Y DIAGNOSTICO DE CAMPYLOBACTER
3
En medios secos, por ejemplo cuando se incuban a 37 OC durante 48 horas antes de
inocularlos, las colonias son: no hemolíticas, convexas, con borde liso de color
blanco grisáceo y superficie brillante (Figura 2b).
Además, es posible encontrar tipos de colonias intermedios entre los descritos anteriormente.
IDENTlFICACION:
El primer paso en la identificación de las posibles cepas de Campylobacter es la
tinción de Gram; sin embargo, esta bacteria no se tiñe bien con la safranina, por la
que ésta se sustituye por fucsina fenicada. Con esta tinción se observan bacilos
pequeños, curvados en forma de C o de S, monotricos bipolares (Figura 3).
En segundo término se estudia la movilidad de la bacteria en gota pendiente, usando
caldo de tripticasa; este agente presenta un movimiento característico, muy rápido
en forma de dardo. También, en algunas ocasiones las bacterias pueden quedar
ancladas por uno de sus flagelos, presentando entonces un movimiento de rotación
muy rápido. Estas observaciones pueden hacerse al microscopio de campo claro,
pero se facilitan cuando se emplea un microscopio de·contraste de fase o de campo
oscuro.
En tercer lugar, deben realizarse las pruebas de oxidasa y cata lasa, ya que las tres
especies son oxidasa positivas y con excepción de ~. 1P.utorum las otras son catalasa
positivas.
La identificación de C. fetus. ssp jgjuni puede confirmarse por otras pruebas, por
ejemplo: no reduce nitratos, es capaz de crecer en soluciones tanto de glicina como
de bilis al 1 %, pero no en NaCI al 3 % Y es H 2S negativo. Además, crece a tempe·
raturas entre 35 y 42 oC, es sensible al ácido nalidíxico (30 ug/disco) y es resistente
a la cefalotina (30 ug/disco). Estas pruebas sencillas permiten diferenciar el género
Campylobacter hasta subespecie, como se resume en el Cuadro 2.
También es posible hacer un diagnóstico presuntivo, mediante un frotis de heces
teñido con Giensa o Gram, en el que se buscan bacterias morfológicamente similares
al Campylobacter, o bien, examinando las heces en un microscopio de campo
oscuro en busca de bacterias con movimiento característico en dardo. Se ha informado que este diagnóstico presuntivo suele confirmarse con el cultivo en el 57% de
los casos (22).
SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS y TRATAMIENTO
Las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos pueden realizarse por el método de dilución en agar, como se describe a continuación: para la preparación del
inóculo se cultiva la bacteria en tioglicolato con agar al 0,16 % Y se incuba a 37 Oc
en microaerobiosis, durante 12 a 24 horas hasta lograr una turbidez semejante a la
del tubo No. 2 del nefelómetro de McFarland. De estos cultivos se hace una dilución 1:100 en amortiguador de fosfatos el pH 7,4 Y se inoculan alícuotas de 50 ul en
los platos con las diluciones del antibiótico e incuban a 37 OC, durante 48 horas. El
medio base para las diluciones del antibiótico es tioglicolato complementado con
agar al 1,5 %, sangre humana al 10 %, extracto de levadura al 1 % (Figura 4).
Empleando esta metodología se encontró en el HNN que las condiciones mínimas
inhibitorias para eritromicina y gentamicina eran de 1,6 ug/ml y para ampicilina
1,2 ug/ml. A pesar de que un 10% de las cepas fueron resistentes a la eritromicina
4
REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NIÑOS DR. CARLOS SAEN2 HERRERA
y ninguna a la gentamicina, el primer antibiótico se sigue recomendando como tra-
tamiento de elección, en tanto la gentamicina, debido a su alta toxicidad se deja
para casos más graves, como por ejemplo las septicemias causadas por CampyJobacter.
El tratamiento que se recomienda en las diarreas por este agente es la rehidratación vía oral y en los casos crónicos (evolución entre 2 y 3 semanasl se debe implantar una terapia antimicrobiana para erradicar la bacteria, ya que es posible la excreción prolongada de este agente, aún durante períodos mayores de un año (24). Sin
embargo debe tenerse cuidado con el uso indiscriminado de antibióticos, pues ya se
ha demostrado la presencia de un plásmido en ~ylobacter que le brinda resistencia a la tetraciclina; aunque tal plásmido no pudo ser transmitido a cepas de
Escherichia coli (29). debe tenerse presente la posibilidad de conjugación y transmisión de plásmidos de resistencia múltiple (21).
MORFOlOGIA y UlTRAESTRUCTURA DEL CAMPYlOBACTER
Para proporcionar mayor información respecto a la morfología del ~pylobacter
fetus ssp iID\!.!!1 se hizo un estudio al microscopio electrónico (14), que permitió
observar cuatro tipos morfológicos:
Formas esferoides o cocoides, que presentan un cráter o agujero central y un
solo flagelo.
11) Formas curvadas en e con un flagelo polar en cada extremo.
,,1) Formas bi o tricurvadas monotricas bipolares.
1V) Formas filamentosas multicurvadas, monotricas monopolares o bipolares de
hasta 8 um de largo (Figura 5),
1)
Posiblemente las formas normales son los tipos 11 y 111. El tipo" (monocurvadas)
posiblemente corresponde a células jóvenes de reciente división (Figura 6), en tanto
las formas bi y tricurvadas serían células maduras. Por otra parte, las formas cocoides pueden corresponder a células en degeneración, ya que se observan con más
frecuencia en los cultivos viejos y las formas filamentosas pueden deberse a alteraciones metabólicas, tal como se ha propuesto que podría ocurrir en Legionella
p'neumop'hila (12), o bien, se deben a alteraciones inducidas por antibióticos beta
lactámicos. Así, cuando se cultiva el Campylobacter en presencia de ampicilina
frecw:mtemente se observan formas filamentosas, tal como se encontró en un estudio que se está realizando para evaluar las alteraciones morfológicas inducidas por
antibióticos. En la Figura 7 se observa un Campylobacter cultivado en tioglicolato
con 30 ug/ml de ampicilina.
las formas bi y tricurvadas miden como promedio 1,9 .t 0,1 um de largo y su diámetro promedio es de 0,49 ±. 0,1 um. los flagelos pueden medir hasta 15 um de
largo y salen de sendos poros caliciformes localizados en los extremos de la bacteria.
la pared muestra una serie de surcos que le brindan un aspecto cerebriforme (Figura 8a). Además, la bacteria presenta una microcápsula (Figura 8b) (14).
CUADRO ClINICO
En patología humana el Campylobacter se ha asociado fundamentalmente con la
etiología de las diarreas, pero también se le ha incriminado con la causalidad de
septicemias e infecciones perinatales.
DIARREA: Afecta principalmente a niños menores de dos años de edad, y su prevalencia oscila entre un 5 y 14 '~;, (36).
~1ernández, F.
et al:
AISLAMIENTO Y DIAGNOSTICO DE CAMPYLOBACTER
5
El período de incubación es de 48 horas y entre los signos y síntomas destacan la
fiebre mayor de 38 oC, diarreas, dolor periumbilical severo, vómitos, leucocitos con
presencia de bandas y puede presentarse deshidratación en más del 50 % de los
casos. Las heces son acuosas con moco y en ocasiones pueden ser sanguinolentas
con leucocitos (2, 17, 23) y el número de deposiciones diario puede ser hasta de
20 (34).
SEPTICEMIA: Afecta principalmente a adultos y la subespecie involucrada más
frecuentemente es C. fetus intestinalis. El cuadro es poco frecuente y está asociado
con enfermedades crónicas como diabetes, cirrosis, cuadros cardiopulmonares y
neoplasia, o bien con tratamientos inmunosupresores.
Clínicamente el cuadro es pleomórfico presentando: fiebre, escalofríos, sudoración
especialmente nocturna, vómitos, dolor abdominal y también puede presentarse
hepatosplenomegalia, ictericia y diarrea (17).
Cuando la septicemia afecta a madres en el período de embarazo puede ocurrir una
infección perinatal, cuya letalidad es de cerca del 80 'X,. Clínicamente hay fiebre,
tos, vómitos, dificultad respiratoria, cianosis e ictericia (17,30).
EPIDEMIOLOGIA
El Campylobacter fetus ssp j~uni es un agente distribuido ampliamente, descrito
como una importante causa de diarrea tanto en países desarrollados como en desarrollo, el cual se aisla también de otros mamíferos aparte del hombre (28) y de aves
que conviven con éste (11, 31) por lo tanto la infección se da como una zoonosis.
Sin embargo, es posible que uno de los principales mecanismos de transmisión sea
la contaminación fecal entre humanos (2, 3).
Se ha informado que la prevalencia de este agente en casos de diarrea oscila entre un
5 y 14 %; no obstante, en un estudio realizado en el HNN (25) se encontró que en
algunos meses este agente se aislaba del 25 % de los casos, presentando una curva de
prevalencia ascendente, cuyo máximo valor se presenta a finales del año_ En estudios realizados anteriormente, se había observado este incremento de diarreas hacia
final del año y se había encontrado que los agentes etiológicos más importantes en
esas diarreas eran los rotavirus (13, 19); estos datos nos indican que en esos casos de
final de año hay involucrados por lo menos dos agentes importantes: rotavirus y
CampylQbactel'c
Por otra parte, al comparar la etiología bacteriana de las diarreas entre enero y julio
de 1983, se observó que el principal agente era ~. fetus ssp j~1l!!.L aislándose gene·
ralmente en mayor proporción que Shigella y Salmonella (25).
Estos datos, junto con los de etiología de diarrea en niños no hospitalizados del área
rural (35), colocan al
fetus ssp ~juni como uno de los principales agentes bacterianos causantes de diarrea.
c..
CONCLUSION
Este informe resume los principales métodos de aislamiento y diagnóstico del CamI!}'lobacter fetus ssp ~juni. A pesar de que a primera vista la metodología parece un
tanto compleja, es relativamente simple.
Los equipos e implementos necesarios para su aislamiento en resumen son:
a)
Incubadora a 42°C.
6
REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NII'lOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA
b)
Jarra de anaerobíosis tipo Gas Pack con válvula (incluso a las jarras corrientes
puede adaptársele una válvula tal como se hizo en el HNNl.
e)
Una bomba de vacío, que puede sustituirse por una trampa de agua.
d)
Cilindro de N z y COz
e)
Medios de cultivo: cuya base es tioglicolato, adicionado de agar, sangre huma·
na, extracto de levadura y antibióticos.
Por lo tanto, es factible montar esta metodología en cualquier laboratorio el ínico
donde se trabaje en bacteriología.
El aislamiento e identificación del Campylobacter a partir de casos de diarrea es importante, tanto desde el punto de vista epidemiológico, como clínico. La importan·
cia radica en el esquema de tratamiento, que incluye además de la rehidratación,
antibióticoterapia, al menos en los casos que evolucionan crónicamente. Epidemiológicamente, el diagnóstico es importante, ya que se ha propuesto que algunos pa·
cientes pueden continuar excretando la bacteria intermitentemente durante pe·
ríodos mayores de un año, con lo cual se convierten en reservarías.
CUADRO 1
CLASIFICACION DEL GENERO CAMPYLOBACTER
Familia
Spirillaceae
Género
Carnpy!obacter
Especies y subespecies
C. fetus ssp fetus
C. fetus ssp intestinalis
C. fetus ssp jejUnJ
(**)
t * 1<)
C. sputorurn ssp sputorum_
C. sputorum ssp bubulus
C. sputorum sSIl mucosal!s
C. recalis
--------._-_.
(*)
Modificación de Kaplan, R. L. 1980.
(**)
Involucrado con patología en humanos.
(16)
(*)
+
+
+
+
+
C. fetus SSp fetus
C. fetus SSp intestinalis
C. fetus ssp jeju ni
C. sputorum ssp sputorum
C. sputorum ssp bubulus
Tomado de Kaplan, R. L., 1980
+
C. fecalis
---
OXIOASA
(6)
--
-
+
+
+
+
CATALASA
S
+
+
R
-
AC. NALlDIXICO
R
S
-
+
H
R
S
CEFALOTINA
+
+
+
+
+
r-
1%
- -GLICINA
ANTIMICROBIANOS (30U9/discO)
DIFERENCIACION BIOQUIMICA DE CAMPYLOBACTER
CUADRO 2
+
V
3,5%
NaCL
V
+
+
-
+
42°C
-
OC
+
+
+
-
25
CRECIMIENTO
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REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NIÑOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA
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l)OMtSA
OE
VACIO
FIGURA 1.
Sistema de eV(jcuación y reemplazo necesario para lograr ulla atmós
fer" microaerofílica en Jarras para al1i:lerobiosis y aplicación de este sistema para
cambiar la atmósfera a las dp, tubos de cultivo, paso que es fundamental piJra lograr'
un buen crecimiento de Campylobacter, aún en caldo de tlogliealido, El esquerna
del dispositivo para conectar los cilindros de gas, la bomba de vacío y la J"t'Ui, fUI:'
construido según indican Afien V Siders (1),
Hernández, F. et al: AISLAMIENTO Y DIAGNOSTICO DE CAMPYLOBACTER
9
FIGURA 2:
Morfología dé las colonias de Campylobacter en agar de Bützler
A. en medio fresco (húmedo) B. en medio seco (incubado a 37 oC durante 48
horas antes de inocular la bacteria).
10
REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NIÑOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA
FIGURA 3:
Tinción de Gram de un frotis de Campylobacter obtenido de un cultivo en agar de Bützler. La safranina fue sustituida por fucsina. Obsérvese la forma
curvada característica de esta bacteria.
Hernandez, F. el al:
AISLAMIENTO y DIAGNOSTICO DE CAMPYLOBACTER
T10GLlCOLATO
0,16
%
agar
AGAR-SANGRE
mic roaerobiósi s
-70°C
TIOGLlCOLATO
24 - 48h
37 oC
~··::9~
TIOGLlCOLATO
1,5 O/o agar
10 % sangre
antibióticos
FIGURA 4:
11
INOCULADOR
PARA DILUCION
EN PLATO
Iml
amortiguador
de fosfatos
Diagrama de la metodología empleada para estudiar la sensibilidad a
los antibióticos por el método de dilución en agar, aplicada al estudio de Campylobacter.
12
REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE N I 1'1 OS DR. CARLOS SAENZ HERRERA.
FIGU RA 5: Microfotografías electrónicas de transmisión de una preparación de Campylobacter, procesada mediante la técnica de
réplicas de platino. Se presentan cuatro tipos morfológicos (números romanos) descritos en el texto. Barras - 1um.
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14
REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NIÑOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA
FIGURA 6:
A. Réplica de platino de un Campylobacter en división, obsérvese el
estrechamiento de la célula en el sitio de división que originaría dos células hijas
curvadas en C (tipo morfológico 11). En la figura B, se observa otro Campylobacter
en división, pero en una preparación teñida con ácido fosfotúngstico (tinción negativa). Barra = 1 um.
Hernández, F. el al: AISLAMIENTO Y DIAGNOSTICO DE CAMPYLOBACTER
15
FIGURA 7:
Microfotografía electrónica de una preparación de Campylobacter
teñida con ácido fosfotúngstico (tinción negativa). Se observa una forma alargada,
semejante al tipo morfológico IV; éstas son las formas que predominan cuando la
bacteria se inocula en tioQlicolato con 30 u!l/ml de amoicilina. E' arra = 1 um.
16
REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NIÑOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA
b
FIGURA 8:
A. Microfotografía electrónica de transmisión del extremo de un
CampyJ.Qbacter en el que se aprecia el poro polar del cual sale el flagelo. Además,
se observa el aspecto ccrebri forme de la pared bacteriana. Barra = 0.25 um.
B. Mi::rofotografía electrónica de transmisión de '.In Campylobacter teñido con
ácido fosfotúngstico (tinc;ón negativa). Se observa la microcápslJfa que envuelvp. el
cuerpo de la bacteria (flecha\. Barra = 1 um.
Hernández, F. et al:
AISLAMIENTO V DIAGNOSTICO OE CAMPVLOBACTER
17
RESUMEN
Se describen los métodos bacteriológicos, medios de cultivo e implementos de laboratorio necesarios para el aislamiento, identificación y estudio de sensibilidad a los
antibióticos del Campylobacter fetus ssp jgj\!!!i. Además, se hace una sinopsis histórica respecto al conocimiento de la patología en humanos causada por esta bacteria,
que recientemente se está considerando como uno de los principales agentes causantes de diarrea. Etiológicamente esta bacteria resultó tan importante o más, que
Shig~ y Salmonella en casos de diarrea en niños menores de dos años de edad,
atendidos en el Hospital Nacional de Niños entre enero y julio en 1983.
SUMMARY
We described the bacteriological methods, culture medium and laboratory implements for isolation, identification and antibiotic sensibility tests ofCamp'y'lobacter
fetus ssp j~uni. We also reviewed the historic sinopsis about the knowledge of
Campylobacter in human pathology. Recently this bacteria has been considered as
an important etiologic agent of children's diarrhea, as much as Shigella and Salmonella in hospitalized cases studied at the National Children.s Hospital, Costa Rica,
from Janllary and JlIly, 1983.
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