Universidad de la República Oriental del Uruguay Facultad de Ingeniería Instituto de Ingeniería Eléctrica MANUAL DE USUARIO ELECTROFORESIS DICIEMBRE 2006 Tratamiento de Imágenes por Computadora Proyecto de Fin de Cursos Marcelo Lavagna – Carolina Etchart electroforesis.timag@gmail.com INTRODUCCIÓN: La electroforesis en gel es un grupo de técnicas empleadas por los científicos para separar moléculas basándose en propiedades como tamaño, forma o punto isoeléctrico. La electroforesis en gel se utiliza generalmente con propósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar una espectroscopia de masas, una PCR, una clonación o una secuenciación de ADN. La segunda parte del nombre, gel, se refiere a la matriz usada para separar las moléculas. En muchos casos un gel es un polímero entrelazado de porosidad controlable. Cuando la separación es de proteínas, ADN o ácidos nucleicos pequeños, el gel está compuesto por diferentes concentraciones de acrilamida y un iniciador de la polimerización, para producir redes de poliacrilamida de diferentes tamaños. Para separar ácidos nucleicos grandes (más de unos centenares de bases), la matriz empleada es de agarosa purificada, un polisacárido extraído de algas marinas. En ambos casos, el gel forma una matriz sólida pero porosa La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que es empleada para desplazar las moléculas a través del gel. Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las moléculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el cátodo si están cargadas positivamente y hacia el ánodo si están cargadas negativamente. En los ácidos nucleicos la dirección de migración es del electrodo negativo al positivo, y esto es debido a que poseen una carga negativa. En los fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hélice) la velocidad de migración es proporcional a su tamaño. En fragmentos simples de ADN (una sola cadena) y ARN, dichas moléculas tienden a plegarse de forma compleja y a migrar de forma complicada, según la estructura terciaria formada tras el plegamiento. Sin embargo, compuestos que puedan romper los enlaces de puente de hidrógeno, como el hidróxido de sodio o la formamida, son empleados para 'desplegar' las moléculas plegadas y permitir que la velocidad de migración dependa únicamente del tamaño y no de la estructura formada tras el plegamiento. Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al ánodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adición de un colorante específico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio o la plata. Asimismo se emplean otros métodos para visualizar la separación de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente 1 bajo luz UV, se puede simplemente hacer una fotografía de la placa bajo dicha luz. También, si las moléculas contienen átomos radiactivos se puede efectuar un autoradiograma. Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirán separaciones paralelas. Cada separación mostrará distintas bandas correspondientes a cada componente de la mezcla. Si las separaciones son incompletas, se dará un solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles dos o más componentes. Las bandas en diferentes separaciones paralelas están a la misma distancia del principio significa que contienen moléculas que han atravesado el gel a la misma velocidad. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de moléculas de tamaño conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla desconocida, llamada patrón, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas a las obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamaño. La distancia a la que se encuentra la banda del principio es (aproximadamente) inversamente proporcional al logaritmo del tamaño de la molécula. 2 1. CAPÍTULO I: INSTALACIÓN DEL SOFTWARE I. Requisitos del sistema i. Matlab R14 o superior ii. Imágenes a tratar 2. CAPÍTULO II: FUNCIONAMIENTO I. Requisitos de la entrada al programa (imagen) i. Debe presentar hendiduras (al menos una) ii. Hendiduras del mismo tamaño (aproximadamente) iii. Hendiduras “hacia arriba” 3. CAPÍTULO III: EJEMPLO EJEMPLO DE APLICACIÓN Realizamos la electroforesis de ciertas muestras de ADN, y nos interesa determinar con cierta exactitud el largo de las cadenas presentes en dichas muestras. Para ello, sacamos una fotografía al gel de la “corrida” a evaluar, con una cámara digital, y la guardamos en la PC, en alguna carpeta definida por el usuario. A continuación, ejecutamos electroforesis.m. Esta acción provocará la siguiente cadena de interacciones PC-usuario. I. Selección de la imagen a procesar Para ello haga clic en el botón Examinar… y se le desplegará la ventana que le permitirá seleccionar la imagen deseada desde archivo. Formato jpg. 3 II. Selección de las características de la imagen La imagen seleccionada es mostrada en pantalla, y a continuación se le pedirá que indique las características de la imagen. Presionar botón Guardar datos. Luego, se mostrará en pantalla la imagen con las hendiduras detectadas 4 III. Valores en pb de algunos puntos del patrón A continuación presione el botón Presione para valorar la primera marca, con lo que se mostrará la imagen del patrón y una cruz que le permitirá cliquear sobre el patrón. Haga usted clic donde considere que se encuentra la primera marca necesaria para la detección de las marcas de las muestras. Luego de haber cliqueado, rellene la casilla a la derecha indicando el valor en pb de la marca elegida. Continúe este procedimiento hasta completar las cuatro marcas, siempre en orden descendente. 5 IV. Selección de la planilla excel donde serán guardados los resultados Habiendo rellenado las 4 casillas anteriores, haga clic en el boton Procesar datos, que dara inicio al programa. A su vez, le abrirá una ventana para seleccionar la planilla Excel donde se guardarán los resultados. Esta operación puede tardar unos minutos. Luego se irán mostrando imágenes de las marcas detectadas en cada muestra, hasta que finalmente el programa llega a su fin, indicándole que debe apretar cualquier tecla para continuar. Esta acción borra todas las imágenes abiertas. Aclaración: Los botones Ver planilla Excel y Salir no pudieron ser implementados. 6 V. Visualización de resultados en una planilla Excel Observación: Los campos a la derecha de Muestra Activa: i – en posición j son los valores generados por el programa electroforesis.m descrito anteriormente. Los campos consecuentes hacia abajo, Valor real de la muestra activa i, son destinados para la escritura manual de los valores esperados por el usuario, a modo de comparación. 7