Facultad de Ingeniería Química Universidad Tecnológica de La Habana “José Antonio Echeverría” Empleo de las energías de microondas y ultrasonido en el proceso de extracción de mangiferina de hojas de Mangifera indica L. Tesis presentada en opción al título de Máster en Química Autora: Lic. Iliana Sevilla Fernández Tutores: DraC. Jhoany Acosta Esquijarosa DrC. Julio C. Llópiz Yurell La Habana, 2016 A mi familia, amigos y a Jhoany Agradecimientos AGRADECIMIENTOS Agradezco a todo el que participó en la elaboración de este trabajo sin los cuales no hubiese sido posible realizar este sueño. A mi tutor Llópiz, por sus consejos y apoyo. A toda mi familia, mis padres y mis hermanos, que han sabido guiarme por el buen camino y no se cansan de aconsejarme para bien. A todos mis compañeros de trabajo por su preocupación constante para que yo pudiera culminar mi tesis. A los profesores de la Facultad de Química en la Universidad de la Habana por su ayuda y preocupación. A mis amigos Jeni, Turiño, por sus consejos y apoyo Y por último a la persona que fue más que una compañera de trabajo, una amiga y una hermana, a Jhoa y a toda su familia por acogerme como un miembro más. A todos ustedes de todo corazón muchas gracias por todo su apoyo, confianza, dedicación y sacrificio. Resumen RESUMEN La mangiferina, glucosil xantona natural, presente en varias partes de Mangifera indica L. (árbol del mango), posee gran variedad de efectos farmacológicos. La literatura refiere mayor concentración de este metabolito en las hojas, por lo que su obtención a partir de esta fuente es de gran importancia para el desarrollo de medicamentos. En Cuba se ha desarrollado un procedimiento de obtención de mangiferina a partir de hojas de mango, mediante un método tradicional en tanque agitado. Los métodos no convencionales de extracción, como las microondas y el ultrasonido, se caracterizan por su rapidez y eficiencia en la obtención de fitoconstituyentes. En el presente trabajo se realizó la identificación de los componentes presentes en las hojas de mango, donde se observó la presencia de sesquiterpenoides no oxigenados, ácidos fenólicos, taninos y, como componente mayoritario, la mangiferina. Se determinaron las mejores condiciones de extracción para la etapa de extracción de compuestos no polares y de extracción de mangiferina mediante microondas a partir de hojas de mango, con el empleo de n-hexano y agua como disolventes de extracción respectivamente, donde se obtuvo para cada etapa un tiempo de irradiación de 5 min, una potencia de 900W y una relación disolvente/material vegetal de 10 ml/g para un valor máximo de contenido de mangiferina extraída de 18,65 ± 1,53 mg/g. Además, se obtuvieron las mejores condiciones para ambas etapas mediante ultrasonido, donde para la etapa de extracción de compuestos no polares, el mejor valor experimental (29,03 ± 1,10 mg/g) se alcanza para un tiempo de 90 min y una relación de 47 ml/g, con el empleo de n- hexano como disolvente y para la etapa de extracción de mangiferina, las mejores condiciones son un tiempo de extracción de 62 min, una relación de 49 ml/g y una concentración de etanol de 46,8% para un valor máximo de contenido de mangiferina extraída de 24,16 ± 0,02 mg/g. El análisis comparativo realizado demostró que el método de microondas es más ventajoso en cuanto al ahorro de tiempo y energía y al consumo de disolventes, con rendimientos similares al método tradicional en tanque agitado. Abstract ABSTRACT Mangiferin, a natural glucosil xanthone, presents in many parts of Mangifera indica L. (mango tree) has many pharmacological effects. Literature refers a great concentration of this metabolite in the leaves, that’s why its obtaining from this source has a high importance for the development of medicaments. In Cuba a method of obtaining of mangiferin from mango leaves using a traditional method in stirred tank, was developed. The non-conventional methods of extraction such as microwave and ultrasound are characterized for its decrease in time and high efficiency in the phytoconstituents obtaining. In this work the identification of components in mango leaves were realized, observing the presence of sesquiterpenoids no oxygenated, phenolic acids, tannins and as major compound mangiferin. The influence of operational parameters were studied for the stage of extraction of non-polar compounds and mangiferin extraction using microwave from mango leaves using nhexane and water as extraction solvents respectively, where the best operational conditions for each stage were an irradiation time of 5 min, a power of 900 W and a ratio solvent/vegetal material of 10 ml/g for a mangiferin content of 18.65 ± 1.53 mg/g. Also, we obtain the best conditions for each stages using ultrasound, were for the stage of extraction of non-polar compounds, the best experimental value (29.03 ± 1.10 mg/g) was reached for a time of 90 min and a ratio of 47 ml/g using n-hexane as solvent and for the stage of extraction of mangiferin, the best conditions were a time of 62 min, a ratio of 49 ml/g and an ethanol concentration of 46.8% for a content of mangiferin of 24.16 ± 0.02 mg/g. The comparative analysis showed that microwave is better according with time, energy and solvent consumption, obtaining similar values of efficiency comparing with the traditional method in stirred tank. Índice ÍNDICE INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 1 CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 5 1.1 Uso de plantas medicinales con fines terapéuticos.................................................................... 5 1.1.1 Uso etnomédico del árbol del mango ................................................................................. 5 1.2 Composición química de las hojas del árbol del mango ........................................................... 5 1.3 Mangiferina ............................................................................................................................... 6 1.3.1 Aspectos físico químicos .................................................................................................... 6 1.3.2 Fuentes de obtención .......................................................................................................... 7 1.3.3 Propiedades farmacológicas ............................................................................................... 7 1.4 Métodos de extracción de metabolitos secundarios presentes en las plantas medicinales ........ 8 1.5 Extracción asistida por microondas ........................................................................................... 9 1.5.1 Fundamento del método ..................................................................................................... 9 1.5.2 Horno de microondas ....................................................................................................... 12 1.5.3 Factores que afectan la EAM ........................................................................................... 14 1.5.4 Ventajas y desventajas de la EAM ................................................................................... 15 1.5.5 Aplicaciones del empleo de la EAM en la extracción de metabolitos secundarios a partir de plantas........................................................................................................................................ 15 1.5.6 Procedimientos de extracción de mangiferina por microondas ........................................ 16 1.6 Extracción asistida por Ultrasonido (EAU) ............................................................................. 17 1.6.1 Fundamento del método ................................................................................................... 17 1.6.2 Principios básicos de los dispositivos basados en ultrasonidos ........................................ 17 1.6.3 Principio de extracción de fitoconstituyentes mediante la energía de ultrasonido ........... 18 1.6.4 Variables que influyen en la EAU .................................................................................... 20 1.6.5 Ventajas y desventajas de la EAU .................................................................................... 20 1.6.5 Aplicaciones de la EAU en la extracción de metabolitos secundarios a partir de plantas 21 1.6.6 Procedimientos de extracción de mangiferina por ultrasonido......................................... 21 1.7 Métodos analíticos para la identificación y cuantificación de productos naturales................. 22 1.7.1 Cromatografía de capa delgada (CCD) ............................................................................ 22 1.7.2 Espectrometría ultravioleta (UV) ..................................................................................... 23 1.7.3 Espectrometría Infrarroja (IR) .......................................................................................... 23 Índice 1.7.4 Espectrometría de masas (EM)......................................................................................... 24 1.7.4 Resonancia Magnética nuclear (RMN) ............................................................................ 24 1.7.5 Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR) ....................................................... 25 1.8 Análisis crítico de la bibliografía ............................................................................................ 26 CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 27 2.1 Materiales ................................................................................................................................ 27 2.1.1 Reactivos .......................................................................................................................... 27 2.1.2 Equipos ............................................................................................................................. 27 2.1.3 Recolección y preparación del material vegetal ............................................................... 27 2.2 Estudio del proceso de extracción mediante la energía de las microondas ............................. 28 2.2.1 Estudio de las mejores condiciones de extracción de la fracción apolar (desengrase) ..... 28 2.2.2 Selección del mejor disolvente de extracción de la mangiferina contenida en el material vegetal ....................................................................................................................................... 29 2.2.3 Estudio de las mejores condiciones para la etapa de extracción de mangiferina ............. 30 2.3 Estudio del proceso de extracción sólido-líquido mediante ultrasonido a baja frecuencia ..... 31 2.3.1 Estudios preliminares del proceso de extracción de la fracción apolar por ultrasonido ... 31 2.3.2 Estudio de las mejores condiciones en la etapa de extracción de la fracción apolar (desengrase) mediante el empleo del ultrasonido ...................................................................... 32 2.3.3 Estudios preliminares del proceso de extracción de mangiferina por ultrasonido ........... 33 2.3.4 Estudio de las mejores condiciones en la etapa de extracción de la mangiferina ............. 34 2.4 Técnicas analíticas empleadas ................................................................................................. 36 2.4.1 Determinación del contenido de fracción apolar .............................................................. 36 2.4.2 Determinación del contenido de mangiferina por CLAR ................................................. 36 2.4.3 Cálculo del contenido de mangiferina .............................................................................. 36 2.4.4 Cromatografía gaseosa acoplada a masas (CG-EM) ........................................................ 37 2.4.5 Cromatografía líquida acoplada a masas (CLAR-EM) .................................................... 37 2.5 Análisis estadístico de los resultados ...................................................................................... 37 CAPÍTULO III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 38 3.1. Identificación de los componentes presentes en las hojas de mango ..................................... 38 3.2 Resultados del estudio del proceso de extracción de la fracción apolar (FA) ......................... 45 3.2.1 Estudio de las variables que influyen en la extracción de la fracción apolar (desengrase) mediante la energía de las microondas ...................................................................................... 46 3.2.2 Estudio del proceso de extracción sólido-líquido de la fracción apolar (desengrase) mediante el empleo del ultrasonido a baja frecuencia .............................................................................. 48 Índice 3.2.3 Comparación de la EAU y la EAM con tanque agitado para la etapa de desengrase ...... 53 3.3 Resultados del estudio de la etapa de extracción de mangiferina............................................ 55 3.3.1 Verificación por CLAR de la presencia de mangiferina en extractos obtenidos mediante ultrasonido y por microondas .................................................................................................... 55 3.3.2 Evaluación de disolventes para la etapa de extracción de mangiferina mediante la energía de microondas ................................................................................................................................ 56 3.3.3 Estudio de las variables que influyen en la etapa de extracción de mangiferina mediante la energía de microondas ............................................................................................................... 57 3.3.3 Estudio del proceso de extracción sólido – líquido de mangiferina mediante el empleo del ultrasonido a baja frecuencia ..................................................................................................... 60 3.3.4 Comparación de la EAU y la EAM con tanque agitado para la etapa de extracción de mangiferina................................................................................................................................ 65 CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 67 RECOMENDACIONES ................................................................................................................. 68 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 69 ANEXOS .......................................................................................................................................... 79 Introducción INTRODUCCIÓN Los materiales vegetales son recursos invaluables y útiles diariamente, ellos proveen un medio inagotable de materias primas a las industrias farmacéutica, cosmética y de alimentos (Massibo, 2008). La historia de la humanidad recoge diferentes estudios acerca de la utilización de variedades de plantas para diversos fines. Sus primeros usos en la antigüedad tuvieron propósitos nutricionales, pero sus cualidades medicinales fueron descubiertas muy pronto por los pueblos antiguos, que a partir de las propias necesidades del hombre, acompañadas del desarrollo de las fuerzas productivas estimuló el empleo de medicamentos de origen natural (Bruneton, 1999). El interés por las plantas se ha intensificado en los últimos tiempos, ya que muchas de ellas sintetizan un amplio espectro de metabolitos y han sido probados sus efectos medicinales con baja toxicidad y prácticamente efectos secundarios nulos. Debido a esto, las grandes transnacionales tienen como objetivo primordial la búsqueda de nuevas fuentes de origen vegetal y tienen en cuenta la amplia riqueza biótica presente en el planeta, donde existen aún regiones sin explorar (Vinatoru, 2001). Una importante planta medicinal es la Mangifera Indica L., la que es fuente de muchas xantonas naturales y polifenoles; comúnmente usada en una amplia variedad de remedios caseros para el tratamiento de numerosas enfermedades (Pal y col., 2013). Estudios fitoquímicos de diversas partes de esta planta revelaron que contiene ácidos fenólicos, ésteres fenólicos, flavonoides y la c-glicosilxantona, mangiferina (Ribeiro y col., 2008, Nuevas y col., 2012). Mangiferina es la denominación común de un compuesto químico nombrado 2--Dglucopiranosil-1,3,6,7-tetrahidroxi-9H-xanten-9-ona, según las reglas de la IUPAC. Esta sustancia se encuentra presente en varias partes de Mangifera indica L., las raíces de Anemarrhena asphodeloides Bunge (hierba China conocida por Zhi-Mu), las flores y los extremos de las ramas de especies de Hypericum, las hojas de Hibiscus liliastrum, así como en diferentes familias de angiospermas y helechos (Valdés y Germán, 2008). En la literatura se reporta que la mangiferina posee actividad antioxidante, lo que ha sido asociado a la capacidad 1 Introducción que tiene para atrapar el oxígeno singlete, especie radical de oxígeno de alta reactividad (Sato y col, 1992; Mohan y col., 2013). Además se le ha reportado actividad antidiabética (Muruganandan y col., 2005), antitumoral (Noratto y col., 2010), inmunomoduladora (Wauthoz y col., 2007), antiinflamatoria (Carvalho y col., 2009) y antiviral (Zhu y col., 1993). La etapa principal en el tratamiento del material vegetal, es la extracción de los analitos de la matriz, que consiste en la transferencia de los compuestos al disolvente. Este proceso raramente es selectivo, ya que el extracto está constituido por los componentes en estudio y otros compuestos (compuestos endógenos, macromoléculas, y otros contaminantes), los cuales pueden interferir durante el análisis y en las propiedades curativas de estos compuestos (Letellier y Budzinski, 1999). Las técnicas tradicionales de extracción como la maceración, la extracción por soxhlet y la extracción por reflujo de plantas vegetales, se basan mayormente en la elección correcta de los disolventes así como en el uso del calor y la agitación para aumentar la solubilidad de los compuestos deseados y mejorar la transferencia de masa. Usualmente estas técnicas requieren tiempos de extracción muy largos con lo que se corre un gran riesgo de degradación térmica para la mayoría de los fitoconstituyentes (Luque y García, 1998). El largo tiempo empleado requiere un uso intensivo de mano de obra, un gran consumo de energía calórica y limita el número de muestras que pueden ser procesadas, lo que no es fiable para aspectos comerciales. Además, el uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos requiere un paso adicional de recuperación y una subsiguiente evaporación para concentrar el extracto, lo que resulta en un proceso más engorroso y también más perjudicial para el ambiente (Sanghi y Kannamkumarath, 2004). Debido a estas muchas desventajas de las técnicas de extracción tradicionales, las técnicas no convencionales como la extracción por fluidos supercríticos, la extracción asistida por microondas y la extracción asistida por ultrasonido han ganado en importancia (Dean, 2010). Estos métodos disminuyen considerablemente el tiempo de extracción, lo que evita la degradación térmica de constituyentes termolábiles y, además, reduce el consumo de disolvente, lo que disminuye la contaminación al medio ambiente, con rendimientos más elevados y menor costo de operación (Bagherian y col., 2011; Cui y col., 2014). 2 Introducción Las microondas por su naturaleza, son radiaciones electromagnéticas no ionizantes, con una frecuencia que oscila entre los 0,3 y 300 GHz y, correspondientemente, a una longitud de onda de 1m a 1mm. Se caracterizan por desplazarse en forma de ondas sinusoidales. Su principal efecto, cuando interactúan con un material receptivo, es de naturaleza térmica (Jain y col., 2009). La rapidez en el calentamiento es la principal ventaja de las microondas frente a los métodos tradicionalmente empleados en la extracción con disolventes. Permite, por tanto, significativos ahorros de tiempo, disminución de los volúmenes de disolventes necesarios en los tratamientos y en consecuencia de energía en el proceso, no contamina el medio ambiente todo lo cual se traduce en reducción de los costos en general, lo que constituyen aspectos deseables de alcanzar en todo proceso de extracción, además se obtienen altos recobrados de los compuestos de interés. Su empleo es objeto de investigación continua en la extracción de fitoconstituyentes con probadas actividades farmacológicas (Chan y col., 2011). La extracción asistida por ultrasonido para productos naturales utiliza sonidos de alta frecuencia, con el fin de extraer el compuesto de interés, del material vegetal. Las partículas sólidas y líquidas vibran y se aceleran ante la acción ultrasónica, como resultado el soluto pasa rápidamente de la fase sólida al disolvente (Gao y Liu, 2005). Esta técnica es la más económica y posee los requerimientos instrumentales más bajos entre las últimas técnicas de extracción desarrolladas (Rostagno y col., 2003). En la literatura aparecen diferentes reportes o patentes relacionadas con la obtención de mangiferina por métodos tradicionales. En Cuba se ha desarrollado un procedimiento para el aislamiento y purificación de la mangiferina en tanque agitado. El mismo consta de una etapa de extracción de los componentes apolares que facilita la extracción de la mangiferina en una etapa posterior. Los rendimientos de extracción y el consumo de tiempo y disolvente sugieren la necesidad de explorar otros métodos no convencionales de extracción. Además, existen pocos reportes, o se muestran de forma incompleta los resultados asociados con la obtención de mangiferina a partir de hojas de Mangifera indica L. mediante la extracción asistida por microondas y la extracción asistida por ultrasonido. De acuerdo a lo planteado se enuncia el siguiente Problema Científico: ¿Será posible sustituir el método tradicional establecido en tanque agitado por métodos que apliquen las energías de 3 Introducción microondas y de ultrasonido en la obtención de un extracto de mangiferina a partir de hojas de Mangifera indica L. con ventajas técnicas y económicas? Para dar respuesta al problema científico, se plantea la siguiente Hipótesis: Si se emplean las energías de microondas y de ultrasonido y se seleccionan los mejores parámetros de extracción para cada técnica, se podrá obtener el extracto de mangiferina a partir de hojas de Mangifera indica L. con un rendimiento igual o superior respecto al método tradicional evaluado en tanque agitado, con la consiguiente disminución del volumen de disolvente, el tiempo y los costos de operación. Por lo tanto el Objetivo General del trabajo es: Aplicar las energías de microondas y de ultrasonido en la obtención de mangiferina a partir de hojas de Mangifera indica L.A partir del cual se derivan los siguientes Objetivos Específicos: 1. Identificar los componentes presentes en las hojas de Mangifera indica L. 2. Determinar las mejores condiciones en las etapas de separación de los compuestos apolares y de extracción de mangiferina a partir de hojas de Mangifera indica L. mediante las energías de microondas y de ultrasonido. 3. Comparar los métodos de extracción asistida por microondas y extracción asistida por ultrasonido con el método tradicional establecido en tanque agitado. 4 Revisión bibliográfica CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1 Uso de plantas medicinales con fines terapéuticos Las plantas medicinales, base de la medicina verde, han sido utilizadas desde la antigüedad en el tratamiento y prevención de enfermedades, por ser ellas fuentes de innumerables compuestos químicos biológicamente activos que le confieren sus propiedades terapéuticas. Los últimos años han mostrado una popularidad creciente en el uso de la medicina herbaria en todo el mundo. Debido a este creciente interés, la obtención de extractos estandarizados de manera más económica, segura y amigable con el medio ambiente, ha guiado a las investigaciones al desarrollo de nuevos métodos y tecnologías, superiores a los métodos convencionales de extracción. Además la extracción en muchos casos puede ser más económica que la síntesis química de los compuestos de interés (Kimura, 2006). 1.1.1 Uso etnomédico del árbol del mango En muchos países, se utiliza el extracto de las hojas, frutos, semillas, raíz y corteza del árbol del mango (Mangifera indica L.) con propósitos medicinales para el tratamiento de diversas enfermedades como la leucorrea, la disentería, las hemorroides, la bronquitis, los problemas de la garganta, el asma, el estreñimiento, entre otras (Kant y col., 2009). En Cuba, el uso etnomédico del extracto acuoso del árbol del mango ha sido ampliamente estudiado. Se ha utilizado extensivamente en patologías como: cáncer, diabetes, asma bronquial, infertilidad, lupus, prostatitis, hiperplasia prostática benigna, desórdenes gástricos, y otras enfermedades frecuentes (Guevara y col., 2004). 1.2 Composición química de las hojas del árbol del mango La hoja del árbol del mango, ha sido ampliamente estudiada y contiene, entre otros componentes, sesquiterpenos: allo-aromadendreno (Craveiro y col., 1980); flavonoides: epi-3O-galato (-)-catequina (Tanaka y col., 1984), quercetina (Proctor y Creasy, 1969), rutina (Shaft y Ikram, 1982); aceite esencial (Craveiro y col., 1980); xantonas: euxantona (Proctor y Creasy, 1969), mangiferina, homomangiferina e isomangiferina (Tanaka y col., 1984; Pharm y Phaim, 1991); triterpenos (Njaneyulu y col., 1982); bencenoides (Lu y col., 1982); taninos (Tanaka y col., 1984) y esteroides: β-sitosterol (Njaneyulu y col., 1982). 5 Revisión bibliográfica Un análisis aproximado de 100 g de hoja fresca refiere que contiene: calorías: 66%; agua: 81,7%; proteínas: 0,7%; grasas: 0,4%; carbohidratos: 16,8%; fibras: 0,9%; cenizas: 0,4%; calcio: 10 mg; fósforo: 13 mg; hierro: 0,4 mg; sodio: 7 mg; potasio: 189 mg; caroteno: 2880 μg; tiamina: 0,05 mg; riboflavina: 0,05 mg; niacina: 1,1 mg y ácido ascórbico: 35 mg (Duke y Atchlet, 1986). En la literatura se reportan los resultados de la extracción y cuantificación de algunos metabolitos secundarios presentes en la corteza, la semilla, la cáscara y las hojas verdes y maduras existentes en 17 variedades diferentes de Mangifera indica en Brasil. El residuo fue analizado por dos métodos, Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR) y mediante la técnica de Cromatografía Líquida de Alta Resolución acoplada a espectrometría de masa (CLAR-EM). Se detectaron como los principales compuestos fenólicos presentes en cada una de las partes estudiadas, la penta-O-galoil glucosa, el ácido gálico y el galato de metilo, donde la mangiferina fue el principal metabolito detectado en cantidades de 4,94; 6,40; 18,33; 36,9 y 58,12 g/kg de material vegetal correspondientes a la cáscara, el fruto, la corteza, las hojas maduras y las hojas verdes, respectivamente. Resulta significativo que los mayores contenidos de mangiferina se presentan en las hojas, de ahí que se justifique la posibilidad de obtención de este metabolito de esta parte de la planta (Barreto y col., 2008). 1.3 Mangiferina 1.3.1 Aspectos físico químicos La mangiferina fue aislada por primera vez de las hojas de Mangifera indica L., en 1924 y su estructura determinada en 1964 (Bhatia y col., 1967). Mangiferina (figura 1) es una xantona cuya denominación común del compuesto químico nombrado es 2-β-D-glucopiranosil-1,3,6,7-tetrahidroxi-9H-xanten-9-ona, según las reglas de la IUPAC, aunque también aparece en la literatura como alpizarin, euxantogen, maniferin, chedisarine, aphloiol, chinomin y hedysarid (DPN, 2005). 6 Revisión bibliográfica Figura 1. Estructura de la mangiferina Es un compuesto de color amarillo pálido, no posee sabor ni olor y tiene una masa molar de 421,22 g/mol y una temperatura de fusión de 272 °C con descomposición. Debe almacenarse a temperatura ambiente, protegida de la humedad y la luz (DPN, 2005). Es soluble en etanol, ligeramente soluble en agua y metanol y prácticamente insoluble en n-hexano, cloroformo, acetona y éter dietílico (Acosta y col., 2016). 1.3.2 Fuentes de obtención Esta sustancia se encuentra en muchas especies vegetales correspondientes a diferentes familias y géneros vegetales y no hay preferencia entre ellos para su existencia, aunque su nombre está muy relacionado con el género Mangifera, ya que en las especies que la conforman es donde se concentra la mayor prevalencia del compuesto. Está presente en varias partes de Mangifera indica L. (corteza y hojas), las raíces de Anemarrhena asphodeloides Bunge (hierba China conocida por Zhi-Mu), las flores y los extremos de las ramas de especies de Hypericum, las hojas de Hibiscus liliastrum, así como en diferentes familias de angiospermas y helechos (Napralert, 2010). 1.3.3 Propiedades farmacológicas Las características químicas de la mangiferina hacen suponer que tiene los atributos necesarios para alcanzar tejidos y órganos de forma significativa por su elevada biodisponibilidad. La aglicona que se produce a partir de ella (noratiriol), después de la pérdida del resto glicosídico por la hidrólisis que debe ocurrir durante el metabolismo, tiene un efecto potente en la captación de oxígeno singlete (Hsu y col., 1997). En la literatura se ha reportado que la mangiferina posee actividad antioxidante (Prabhu y col., 2006; Benping y col., 2016), antidiabética (Guo y col., 2011; Apontes y col., 2014), 7 Revisión bibliográfica antitumoral (García y col., 2011; Khurana y col., 2016), inmunomoduladora (Guha y col., 1996; Leiro y col., 2004), antiviral (Zhu y col., 1993) y antiinflamatorio (Gong y col., 2013). Una búsqueda de patentes muestra la utilidad de esta sustancia en tratamientos de diferentes enfermedades, tales como el caso de herpes, sangre, infección, cáncer y en padecimientos y enfermedades relativas a la tercera edad. También existen registros de su aplicación en infecciones parasitarias. Otro estudio indica el uso cosmético de la mangiferina, tales como: sistema de liberación tópica, antiarrugas, desodorante, nutraceútica tópica y otras aplicaciones cosméticas. Otras aplicaciones se han encontrado en la agricultura y en la industria alimentaria referidas a alimentos fortificantes y a una preparación externa para el control calórico (González y Domínguez, 2009). 1.4 Métodos de extracción de metabolitos secundarios presentes en las plantas medicinales La extracción, como término farmacéutico, se refiere a la separación de las porciones medicinalmente activas de la planta o tejido animal, de los componentes inactivos o inertes, mediante el uso de disolventes adecuados. (Swami y col., 2008). Durante el proceso de extracción ocurren dos fenómenos paralelos: la lixiviación de las sustancias solubles de células rotas y la disolución y difusión de las sustancias solubles de células intactas. Mientras la lixiviación de las sustancias de las células rotas es rápida, la difusión de las sustancias a través de la membrana de células intactas es lenta y requiere etapas de humectación y ablandamiento para aumentar la permeabilidad de la membrana. Este proceso comprende tres etapas gobernadas por procesos de equilibrio químico: la penetración del disolvente en la célula, la disolución de las sustancias extraíbles y la difusión de la disolución fuera de la célula vegetal (Sharapin, 2000). Existen diversos procedimientos de extracción, los cuales pueden ser empleados en dependencia de la complejidad de la muestra cuyos componentes se desean separar. Dentro de los métodos de extracción tradicionales se encuentran: la decocción, la infusión, la digestión, la maceración, la percolación, la extracción Soxhlet y la extracción en tanque agitado, los cuales requieren altos tiempos de operación, grandes cantidades de disolventes, instalaciones costosas, y son procesos contaminantes y de baja eficiencia energética, entre otras limitaciones, que se manifiestan de manera aislada o en conjunto (Swami y col., 2008). 8 Revisión bibliográfica Por estos motivos, desde hace algunos años se utilizan otras técnicas y métodos extractivos, de los que se pueden mencionar la extracción mediante fluidos en condiciones supercríticas, extracción asistida por ultrasonido (EAU), extracción acelerada por disolventes, extracción con pulso eléctrico, extracción asistida por enzimas y la extracción asistida por microondas (EAM) (figura 2). Estos tienen entre sus ventajas el ahorro de disolventes y energía, mayor selectividad y disminución de los tiempos de operación (Azmir y col., 2013). Figura 2. Métodos de extracción no convencionales. A: Extracción mediante fluidos en condiciones supercríticas; B: EAU; C: EAM 1.5 Extracción asistida por microondas La extracción asistida por microondas (EAM) consiste en el calentamiento del disolvente en contacto con el material vegetal bajo la irradiación de microondas. El proceso implica la perturbación de los enlaces por puente de hidrógeno, como resultado de la oscilación de dipolos por la radiación en las moléculas y la migración de iones, con la consiguiente penetración del disolvente en la matriz y transporte al seno del líquido de los componentes extraídos (Alupulu, 2012). 1.5.1 Fundamento del método Las microondas se sitúan en la región del espectro electromagnético desde la longitud de onda 1mm hasta 1m (0,3 – 300 GHz), por lo que constituye una radiación de baja energía no ionizante. Actualmente las microondas se utilizan en las comunicaciones, la radiolocalización, el blindaje de cámaras anecoicas y como fuentes de energía. Para evitar problemas de interferencia, la región permitida a aplicaciones civiles se encuentra limitada entre 2450 MHz y 915 MHz (Chan y col., 2011). 9 Revisión bibliográfica La radiación de microondas tiene las mismas propiedades de otras ondas del espectro electromagnético. La energía puede transmitirse mediante la radiación electromagnética y se caracteriza por desplazarse en forma de ondas sinusoidales (según la teoría ondulatoria). Siguen las leyes de la óptica y están sujetas a los fenómenos de reflexión y dispersión al interactuar con las heterogeneidades internas y la superficie de los materiales. Se propagan en línea recta, se refractan, difractan, interfieren y dispersan del mismo modo que lo hace cualquier otra radiación del resto del espectro electromagnético. Por su naturaleza, son consideradas radiaciones no ionizantes, esto quiere decir que no modifican la estructura electrónica del material, a diferencia del efecto de otras radiaciones más energéticas como los rayos X o la radiación gamma. Así pues, su principal efecto, cuando interactúan con un material receptivo es de naturaleza térmica (Chemat y Cravotto, 2013). El calentamiento por microondas está gobernado por dos fenómenos: conducción iónica, y vibración bipolar, los cuales, en algunos casos pueden tener lugar simultáneamente. La conducción iónica se refiere a la migración de los iones bajo la influencia del campo eléctrico cambiante. La resistencia ofrecida por la disolución a la oscilación o vibración bajo el campo eléctrico oscilante de la radiación de los iones genera calor, que eleva su temperatura. Cuando se irradia un disolvente polar, las moléculas tienden a alinearse con el campo eléctrico, pero el cambio de este ocurre a una velocidad que no permite que las moléculas se acomoden completamente (figura 3), por lo que se generan vibraciones, que por efectos de fricción provocan el calentamiento del cuerpo del líquido (Chan y col., 2011). Figura 3. Efecto de las microondas sobre las moléculas de agua 10 Revisión bibliográfica Cuando las ondas son absorbidas por el material, los dipolos existentes o los inducidos se ponen en acción, esto es, vibran y rotan, lo que produce energía térmica en todo el seno del material, básicamente por fenómenos de fricción a nivel atómico-molecular (Chan y col., 2011). La eficiencia con la cual los diferentes disolventes se calientan bajo las microondas depende del factor de disipación o ―tangente de pérdida‖ (tan δ), el cual es una medida de la habilidad del disolvente para absorber la energía de las microondas y pasarla en forma de calor a las moléculas circundantes. El factor de disipación viene dado por la ecuación: , donde es la constante dieléctrica o permitividad, que describe la polarizabilidad de una molécula en un campo eléctrico, es decir, es la medida de la habilidad de una molécula para absorber la energía de las microondas. El factor de pérdida dieléctrica, , mide la eficiencia de absorber la energía de las microondas y convertirla en calor (Jain y col., 2009). Para los líquidos polares la permitividad decrece, generalmente, al aumentar la tan δ. La relajación rotacional asociada con la región de las microondas involucra, generalmente, la rotación de la molécula entera aunque, excepcionalmente puede afectar la rotación de algunos grupos funcionales polares en moléculas grandes ligeramente rígidas con sustituyentes laterales. Es posible, por tanto, observar, en la región de las microondas, la rotación intramolecular de los grupos funcionales OH y NH2 unidos a moléculas grandes. Para la mayoría de los disolventes, el factor de disipación se incrementa con la temperatura. Como resultado, la velocidad de calentamiento de estos disolventes es mayor con las microondas que con el calentamiento térmico. Este fenómeno de sobrecalentamiento puede conducir a un incremento de la temperatura de ebullición del disolvente, probablemente debido a la limitada formación de centros de ebullición y al efecto de transferencia invertida del calor desde la superficie donde éstos se forman (Chan y col., 2011). Al seleccionar un disolvente para utilizarlo en un proceso de EAM se debe tener en cuenta, además de la solubilidad del componente a extraer, la constante dieléctrica y el factor de pérdida. En la tabla 1 se muestran los parámetros físicos para algunos de los disolventes más empleados en la industria farmacéutica y extractiva (Chan y col., 2011). 11 Revisión bibliográfica Tabla 1. Constantes físicas de los disolventes más comúnmente empleados Disolventes Agua 78,3 1570 100 Etanol 24,3 2500 78,3 Methanol 32,6 6400 64,7 n-hexano 1,69 200 68,7 Éter de petróleo - - 34-80 El mayor valor de constante dieléctrica lo presenta el agua, pero su capacidad para calentarse es menor que para otros disolventes, como el metanol y el etanol, debido a su bajo valor de tan δ, por lo tanto la velocidad con la que absorbe energía es menor que la velocidad de disipación de esta. Este fenómeno explica el efecto de ―supercalentamiento‖, que ocurre cuando hay agua en el sistema bajo estudio. Esto puede ser beneficioso o perjudicial, en dependencia de la matriz, en algunos casos puede aumentar la difusividad de los metabolitos y acelerar la extracción, o puede degradarlos. Por otra parte, el hexano y otros disolventes menos polares permanecen transparentes a las microondas y no producen calor. De forma general se ha demostrado que los requerimientos necesarios para lograr una adecuada penetración de esta radiación son: constante dieléctrica moderada y altos factores de pérdida (Mandal y col., 2007). 1.5.2 Horno de microondas Todos los dispositivos de microondas tienen dos componentes principales: un generador de microondas y un aplicador. La conexión de ambos componentes convierte la energía eléctrica en microondas. El magnetrón (figura 4) consiste en un cátodo calentado y un ánodo, separados en un alto vacío por una diferencia de potencial elevada (aproximadamente 4 kV), colocado todo en un campo magnético axial. Los electrones se emiten desde el cátodo y se aceleran hasta el ánodo mediante el potencial entre ellos. El campo magnético hace que los electrones sigan trayectorias curvas espirales alejándose del cátodo. 12 Revisión bibliográfica Figura 4. Esquema de un magnetrón El ánodo tiene un número par de cavidades (normalmente ocho), cada una de las cuales se comporta como un circuito regulado. Cada cavidad actúa como un oscilador eléctrico que resuena a una determinada frecuencia específica. La energía de los electrones se convierte en energía de microondas en dichas cavidades (Chan y col., 2011). El aplicador tiene la finalidad de asegurar la transferencia de la energía electromagnética al material. Su diseño depende de la naturaleza, forma y dimensiones del material a tratar. Para materiales de gran volumen, el aplicador es una cavidad de dimensiones grandes comparadas con las del material y la longitud de onda. La forma del campo eléctrico formado por las ondas estáticas dentro de la cavidad puede ser muy compleja. Algunas áreas pueden recibir una gran cantidad de energía y otras casi ninguna. Para asegurar una distribución homogénea, a menudo se usa un sistema de agitación para mover la zona de máxima potencia por toda la cavidad. Haya muestra o no, las microondas se reflejan en las paredes del horno, lo que produce un frente estacionario. Se debe asegurar una reproducibilidad de las ondas al colocar la muestra que, si es pequeña, puede ocupar zonas de muy diferente densidad de campo (Chan y col., 2011). Los hornos de microondas pueden tener cavidad monomodo o multimodo. La cavidad monomodo (Figura 5a) puede generar una frecuencia que excita solo un modo de resonancia y la muestra se puede colocar en el máximo del campo eléctrico ya que la distribución del campo es conocida. La cavidad multimodo (Figura 5b) es larga y la onda incidente es capaz de afectar muchos modos de resonancia. Esta superimposición de los modos permite la homogenización del campo (Chan y col., 2011). 13 Revisión bibliográfica Figura 5. Esquema de diferentes configuraciones de hornos de microondas 1.5.3 Factores que afectan la EAM La eficiencia de la EAM está fuertemente relacionada con la selección de los parámetros de operación que afectan los mecanismos de extracción y el rendimiento. Los factores que pueden influir en el desarrollo de la EAM son: naturaleza y volumen de disolvente, tiempo de extracción, potencia del microondas, temperatura, características de la muestra y agitación (Chung-Hung y col., 2011). La elección correcta del disolvente es fundamental para obtener un proceso óptimo de extracción, es establecida por la solubilidad del analito, por la interacción entre la matriz de la planta y el disolvente, y finalmente por las propiedades de absorber las microondas (alta constante dieléctrica) (Chung-Hung y col., 2011). Disolventes como etanol, metanol y agua son suficientemente polares para ser calentados por las microondas. Disolventes no polares con constantes dieléctricas bajas (Tabla 1) como hexano y tolueno no son los mejores para la EAM. La selectividad de la extracción y la habilidad del disolvente para interactuar con las microondas pueden ser variadas mediante mezclas de solventes (Wang y Weller, 2006). Como en otras técnicas de extracción, el tiempo es otro parámetro cuya influencia necesita ser tomada en consideración. Generalmente, cuando se aumenta el tiempo de extracción, la cantidad de analitos extraídos aumenta, aunque hay un riesgo de que pueda ocurrir degradación (Wang y Weller, 2006). 14 Revisión bibliográfica 1.5.4 Ventajas y desventajas de la EAM En los últimos años la EAM ha tenido un creciente interés, debido a que permite la extracción de solutos de matrices sólidas, con una eficiencia de extracción comparable a la de las técnicas clásicas. El calentamiento ocurre de forma selectiva y homogénea sin prácticamente pérdida de calor al medio ambiente y el mecanismo puede reducir considerablemente el tiempo de extracción, usualmente entre pocos segundos a pocos minutos. Esto significa que requiere menos consumo de disolvente y energía (Ferguson y col., 2012). Además, presenta buena reproducibilidad, mínima manipulación de las muestras en el proceso de extracción, es posible realizar varias extracciones en una misma corrida, se puede automatizar el proceso, lo que provee una mejor exactitud y precisión, puede extraer trazas de componentes, incluyendo metales pesados y residuos de pesticidas y el calentamiento puede ser interrumpido bruscamente en cualquier momento. Por otro lado, se debe prestar especial atención a los productos termolábiles, pues el calentamiento es muy rápido, y la temperatura difícil de controlar si no se dispone del equipo adecuado, lo cual puede favorecer la degradación de los mismos. Así, se han ideado métodos que combinan las microondas con fluidos supercríticos y con ultrasonido, lo que hace los procesos de extracción más eficientes y eficaces (Chan y col., 2011). Las principales desventajas de la EAM son: (1) los disolventes no polares usualmente no se pueden utilizar debido a su bajo poder absorbente de las microondas; (2) baja selectividad y altamente dependiente de la naturaleza del disolvente y de la temperatura de extracción; (3) coste elevado del equipo; (4) si el diseño del horno de microondas no es adecuado o la forma del recipiente no es regular, la radiación será más intensa en unas zonas que en otras, lo que permite la existencia de puntos fríos y calientes; y (5) sobrecalentamiento (Chung-Hung y col., 2011). 1.5.5 Aplicaciones del empleo de la EAM en la extracción de metabolitos secundarios a partir de plantas La primera publicación relacionada con la eficiencia de calentamiento por microondas para extracciones orgánicas apareció en 1986 cuando Ganzler y col. desarrollaron protocolos de extracción de lípidos, antinutritivos y pesticidas de suelos, semillas, alimentos y piensos en unos pocos mililitros de disolvente, irradiados por 30 s hasta 7 veces en un horno doméstico a 15 Revisión bibliográfica una potencia de 1140 W. Desde esta fecha, numerosos laboratorios han estudiado las posibilidades analíticas de esta nueva técnica de extracción, lo que se puede comprobar en la gran cantidad de patentes y artículos publicados, que se refieren al método como novedoso y económico, algunos de estos ejemplos se muestran en la tabla 2. Tabla 2. Aplicaciones de la EAM en la obtención de fitoconstituyentes Metabolitos Cocaína Origen Bibliografía Hojas de coca Brachet y col., 2002 Antraquinonas Morinda citrifolia Saponinas Hemwimon y col., 2007 Frutas de Spondias Arif y col., 2011 mangifera Willd Flavonoides y Hojas de Tunisian Taamalli y col., 2012 polifenoles olive Aceites esenciales Coffea arabica L. Tsukuk y col., 2014 Carbohidratos Cynara scolymus L. Ruiz y col., 2016 1.5.6 Procedimientos de extracción de mangiferina por microondas En la literatura se encontraron pocos procedimientos relacionados con la obtención de mangiferina mediante extracción asistida por microondas. Uno de estos es el desarrollado por Venkatesh y colaboradores en el 2010, donde demostraron la factibilidad de la EAM sobre el Soxhlet en la obtención de mangiferina a partir de hojas desengrasadas de Mangifera indica L. Se obtuvo, a una potencia de 210 W durante 56 min y etanol como disolvente, un rendimiento 31,3 veces superior al método tradicional con 20 h de tratamiento. De igual forma en otro trabajo se estudió la influencia de la potencia, la concentración de etanol y el tiempo de irradiación en el contenido de mangiferina obtenida a partir de rizomas de Curcuma amada. El mayor contenido (1,1156 mg/g) se obtuvo con una potencia de 550 W, un tiempo de extracción de 50 s y una concentración de etanol de 80%. Los resultados indicaron que la potencia del microondas y la concentración de etanol son los factores que más influyen en el contenido de mangiferina. La presencia de mangiferina en el extracto final se confirmó mediante Cromatografía líquida de Alta resolución (CLAR) y los grupos funcionales son identificados mediante Infrarrojo – transformada de Fourier (FT-IR, por sus siglas en inglés) y se comparó con un estándar de mangiferina (Kullu y col., 2013). 16 Revisión bibliográfica 1.6 Extracción asistida por Ultrasonido (EAU) 1.6.1 Fundamento del método Ultrasonido es el nombre dado a cualquier onda o sonido cuya frecuencia es más alta que lo que el oído humano es capaz de captar. Es un tren de ondas mecánicas, generalmente longitudinales, originadas por la vibración de un cuerpo elástico y propagado por un medio material. Se encuentran en el intervalo desde 20 kHz hasta los 500 MHz (Mulet y col, 2003). Al igual que el sonido, los ultrasonidos viajan a través de un medio con una velocidad definida y en forma de onda pero, a diferencia de las electromagnéticas, la onda del sonido es una distorsión mecánica del medio mediante el cual se transporta la energía del sonido (Mulet y col, 2003). 1.6.2 Principios básicos de los dispositivos basados en ultrasonidos 1.6.2.1 Generadores ultrasónicos Los generadores o transductores ultrasónicos son aparatos que constan de un elemento, primario o transformador, que está en contacto con el medio y que transforma la señal eléctrica, magnética o mecánica en una onda ultrasónica. Esta señal es proporcionada por el elemento secundario (Figura 6) (Mulet y col, 2003). Figura 6. Esquema general de un generador ultrasónico 1.6.2.2 Tipos de ultrasonidos De acuerdo a la intensidad acústica, se clasifican en ultrasonidos de baja intensidad o de señal y en ultrasonidos de alta intensidad o de potencia (Mulet y col., 2003). a) Ultrasonido de baja intensidad o de señal: Son señales de ultrasonido donde el producto modifica la señal, y ésta proporciona información sobre dicho producto. Sus frecuencias 17 Revisión bibliográfica oscilan entre los 100 kHz a 1 MHz con intensidades inferiores a 1 W/cm2. Son utilizadas para determinar las cualidades de un material, o sea en aplicaciones que precisen de una inspección no destructiva del material objeto de estudio. b) Ultrasonido de alta intensidad o de potencia: Son señales que afectan o modifican un proceso o un producto, como consecuencia del efecto de la cavitación provocada. Son fuentes de energía. Estos ultrasonidos tienen una frecuencia más baja (18- 100 kHz) y una mayor potencia. Suelen aplicarse mediante ondas continuas, aunque también puede hacerse mediante pulsos. Se requiere de un medio líquido, un generador de energía y un transductor, el cual convierte la energía eléctrica, magnética o cinética en energía acústica. 1.6.3 Principio de extracción de fitoconstituyentes mediante la energía de ultrasonido La EAU utiliza sonidos de alta frecuencia con el fin de desprender el compuesto buscado del material vegetal. Se basa en el fenómeno físico conocido por cavitación. La cavitación es un proceso físico, casi exactamente igual al que ocurre durante la ebullición. La mayor diferencia entre ambos consiste en cómo se efectúa el cambio de fase. La ebullición eleva la presión de vapor del líquido por encima de la presión ambiente local para producir el cambio a fase gaseosa, mientras que la cavitación es causada por una caída de la presión local por debajo de la presión de vapor. O sea, si la energía inducida en forma de onda sonora es suficiente, se pueden superar las fuerzas atractivas entre las moléculas del medio líquido, el cual pasa a estado gaseoso, lo que genera bolsas de vapor (cavidades) que son las llamadas burbujas de cavitación. Estas burbujas crecen (en un proceso conocido como ―difusión rectificada‖) durante unos pocos ciclos, hasta llegar a un estado de equilibrio para una determinada frecuencia aplicada. Finalmente las burbujas implotan, lo que provoca microcorrientes. Esto ocurre asimétricamente cerca de las interfases sobre la superficie sólida, como se muestra en la figura 7 (Mulet y col., 2003). 18 Revisión bibliográfica Figura 7. Generación y destrucción de las burbujas por cavitación La cavitación está influenciada por parámetros propios de la onda, como la frecuencia y la intensidad; por las propiedades del medio y por las condiciones operatorias del sistema (Mulet y col, 1999). Debido a la cavitación, las partículas vibran y se aceleran ante la acción ultrasónica, lo cual provoca la ruptura de las células de la planta, con lo que se disminuye el tamaño de las partículas del material vegetal, por lo que se aumenta el área de exposición al disolvente y el soluto pasa rápidamente de la fase sólida al medio. El ultrasonido, además, facilita la rehidratación del tejido si se usan materiales secos, al abrir los poros, lo cual a su vez incrementa el transporte de masa de los constituyentes solubles por difusión y procesos osmóticos, lo que a su vez es adecuado en los procesos de extracción de sustancias termolábiles (Toma y col., 2007). El tiempo de vida de la burbuja de cavitación es del orden de los microsegundos y la implosión violenta de las mismas genera, de manera localizada y transitoria, altas temperaturas (5000 ºC en el interior de la burbuja), altas presiones (100 MPa) y la formación de especies altamente reactivas tales como los radicales hidroxilos (HO•), los radicales hidroxiperoxilo (HO2•) y el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Quesada y col., 2009). La EAU en laboratorio no es difícil mediante el empleo de un baño, equipos que son de fácil adquisición en el mercado de variadas marcas. También se pueden conseguir equipos de casas comerciales a escala industrial para utilizar en procesos como homogeneización, emulsificación, dispersión, molienda y limpieza. En el Anexo 1 se observan distintos equipos 19 Revisión bibliográfica experimentales comúnmente utilizados en la extracción de sustancias asistida por ultrasonido (Azuola y Vargas, 2007). 1.6.4 Variables que influyen en la EAU Según Palma y Barroso, 2001, las variables que se deben analizar para optimizar esta técnica son temperatura por calentamiento resistivo adicional; tipo de disolvente y volumen; tiempo de extracción, potencia y frecuencia del ultrasonido y duración del ciclo aplicado. Además, es necesario tener en cuenta las características del material vegetal: como el contenido de humedad y el tamaño de partícula, ya que al reducir el tamaño de las partículas del material vegetal se aumenta el área de exposición al disolvente y a la cavitación producida (Wang y Weller, 2006). Sin embargo, la presencia de una fase dispersa contribuye a la atenuación de la onda de ultrasonido y la parte activa dentro del extractor está restringida a una zona localizada en las afueras del emisor ultrasónico. Por consiguiente, este factor debe ser considerado cuidadosamente en el diseño de extractores de ultrasonido (Wang y Weller, 2006). La distribución de la onda ultrasónica dentro de un extractor es también un parámetro crucial en el diseño del mismo, debido a que la potencia máxima de ultrasonido es observada en la superficie del reactor y la intensidad ultrasónica decrece al aumentar la distancia de la superficie radiante (Romdhane y col., 1995). 1.6.5 Ventajas y desventajas de la EAU Los beneficios de la EAU se deben principalmente a los efectos mecánicos de la cavitación acústica. Es una alternativa barata, simple y eficiente. Su mayor beneficio incluye el incremento del rendimiento y la cinética de extracción respecto a los métodos tradicionales, ya que intensifican la transferencia de masa, la ruptura celular, lo que aumenta la penetración del disolvente y los efectos capilares, lo que conlleva un menor tiempo y un menor costo. El ultrasonido también puede reducir la temperatura de trabajo y permitir la extracción de compuestos termolábiles. Existe disponibilidad de equipamiento a nivel industrial y es de reconocida importancia en la reducción del empleo de disolventes orgánicos, por lo que se considera una tecnología más limpia (Vilkhu y col, 2008). 20 Revisión bibliográfica Comparado con otras técnicas novedosas de extracción como la EAM, el aparato de ultrasonido es más barato y su operación es más fácil. Puede ser usada con cualquier disolvente para extraer una amplia variedad de compuestos a partir de las plantas. Además, se ha comprobado mediante distintos estudios, que la EAU puede asistir a otros métodos de extracción no convencionales, tales como la extracción por fluidos supercríticos. No obstante requiere un mayor consumo de disolvente y un mayor tiempo que la EAM (Azuola y Vargas, 2007). 1.6.5 Aplicaciones de la EAU en la extracción de metabolitos secundarios a partir de plantas La aplicación del ultrasonido como una técnica de laboratorio para la extracción a partir de plantas ha sido ampliamente publicada. Estas publicaciones incluyen extracciones de aceites, proteínas, flavonoides y compuestos fenólicos. En la tabla 3 se muestran algunos ejemplos de la aplicación de esta tecnología en la extracción de metabolitos a partir de materiales vegetales. Tabla 3. Aplicaciones de la EAU en la obtención de fitoconstituyentes Metabolitos Origen Bibliografía Saponinas Raíz de Ginseng Jianyong y col., 2001 Antraquinonas Rheum palmatum L Lu y col., 2008 Melanina Frutas de Auricularia auricula Zou y col., 2010 Flavonoides Inula helenium Jin y col., 2012 Fenoles Vino Tao y col., 2014 Antocianinas Lonicera caerulea L. Celli y col., 2015 1.6.6 Procedimientos de extracción de mangiferina por ultrasonido En la literatura consultada se encontraron pocos procedimientos relacionados con la obtención de mangiferina mediante EAU. Uno de ellos consiste en la determinación de las mejores condiciones de extracción de mangiferina mediante la energía del ultrasonido a partir de Anemarrhena asphodeloides Bge a través de un diseño ortogonal. Las condiciones más adecuadas fueron un tiempo de 30 min, 21 Revisión bibliográfica una potencia de 40 W, una relación de 70 ml/g y etanol al 60% como disolvente para un rendimiento respecto al material vegetal de 1,85% (Yang y col, 2006). Otro estudio fue el realizado por Tang-Bin y col., 2014, donde evaluaron la influencia de diferentes parámetros, mediante un diseño de superficie de respuesta, en el rendimiento de mangiferina obtenida a partir de hojas de Mangifera indica L. Las condiciones óptimas fueron concentración de etanol del 44%, relación líquido-sólido 38:1 ml/g y un tiempo de extracción de 19,2 min a 60ºC bajo una potencia de irradiación de ultrasonido de 200 W. Bajo estas condiciones se obtuvo un rendimiento de mangiferina de 58,46 ± 1,27 mg/g. 1.7 Métodos analíticos para la identificación y cuantificación de productos naturales Para el análisis e identificación de xantonas en hierbas medicinales y formulaciones existen diferentes métodos, entre ellos se encuentran la cromatografía de capa delgada (CCD), la espectrofotometría ultravioleta (UV), la espectroscopía infrarroja (IR), la resonancia magnética nuclear (RMN), la espectrometría de masas y la cromatografía líquida de alta resolución (CLAR). De éstos, la CLAR ha sido ampliamente aceptada como un método de rutina para la separación de xantonas y se ha aplicado para seguir procesos de extracción, aislamiento y purificación de estos compuestos (Bo y Liu, 2004). 1.7.1 Cromatografía de capa delgada (CCD) La CCD consiste en una placa fina que tiene impregnada la fase estacionaria. La muestra es aplicada en la placa cercana al borde, como una mancha o banda. La separación se lleva a cabo en una cámara cerrada que contiene la fase móvil, la cual asciende por capilaridad o mediante la aplicación de un gradiente de presión externa. Las muestras se separan de acuerdo a su afinidad por la fase estacionaria y por la fase móvil. Comparado con otros métodos cromatográficos, se considera que la CCD presenta deficiencia en reproducibilidad y exactitud, pero presenta algunos atributos que deben ser considerados como bajo costo, gran capacidad de análisis de muestras, preparación mínima e integridad total de la muestra. El parámetro fundamental utilizado para caracterizar la posición de una zona de la muestra en el cromatograma es el factor de retardo o valor de Rf; este representa la relación entre la distancia de migración de la muestra y el recorrido del frente del disolvente (Poole, 1999). 22 Revisión bibliográfica En la literatura se reporta la caracterización de mangiferina obtenida a partir de hojas de diferentes variedades de mango. Emplearon como adsorbente para la fase normal gel de sílice 60 F254 y como disolventes soluciones de acetato de etilo-acetona-ácido fórmico-agua (8:2:1:1) y acetato de etilo-metanol-ácido fórmico-agua (8:2:1:1). Las placas fueron detectadas con ácido sulfúrico al 10 % en metanol y calentadas a 110ºC por 10 min. El Rf de los compuestos aislados estuvo en un intervalo entre 0,42 y 0,44, cercano al estándar (0,43) cuando se empleó solución de acetato de etilo-acetona-ácido fórmico-agua (8:2:1:1) como disolvente revelador. Mientras que el Rf estuvo en el intervalo de 0,61 a 0,63 al desarrollar con disolución de acetato de etilo-metanol-ácido fórmico-agua (8:2:1:1) (Jutiviboonsuk y Sardsaengjun, 2010). 1.7.2 Espectrometría ultravioleta (UV) Para la espectrometría UV la región empleada es la ubicada entre las longitudes de onda de 200 y 400 nm, llamada UV cercano, de gran utilidad en la determinación estructural de insaturación conjugada, aromaticidad o de ciertos grupos insaturados con pares electrónicos libres (carbonilo, nitro, etc.) (Bart y Pilz, 2011). Aparece en la literatura un trabajo relacionado con la caracterización de mangiferina extraída en metanol a partir hojas de diferentes variedades de mango, donde aparecen en los espectros UV tres picos principales a longitudes de onda de 262, 315 y 364 nm, los cuales coinciden con el estándar de mangiferina evaluado (Jutiviboonsuk y Sardsaengjun, 2010). En otro trabajo se compararon los espectros UV de muestras de mangiferina obtenidas a partir de Mangifera indica L. mediante el método convencional y la energía de las microondas, donde se obtienen picos a 365, 314, 267 y 241 nm con una absorbancia de 0,496; 0,635; 1,008; 1,079 respectivamente para el método convencional y picos a 365, 315, 257 y 240 nm con una absorbancia de 0,536; 0,685; 1,393 y 1,190 para las microondas (Venkatesh y col., 2010). 1.7.3 Espectrometría Infrarroja (IR) La sección de mayor utilidad práctica para nuestros propósitos, de la extensa región IR, es la que se extiende entre 4000 y 650 cm-1 denominada región infrarroja media. El análisis IR prueba ser una herramienta para la caracterización e identificación de compuestos o grupos funcionales presentes en una mezcla de extractos de plantas, ya que ciertas agrupaciones 23 Revisión bibliográfica atómicas dan lugar siempre a bandas en un determinado intervalo de frecuencias, independiente de la naturaleza del resto de la molécula. (Eberhardt y col., 2007). En un trabajo realizado por Kullu y col., 2013, se obtuvo el espectro de IR-Transformada de Fourier (FT-IR) de mangiferina extraída por microondas a 550 W a partir de Curcuma amada. Se identificaron cinco grupos funcionales, uno a 3399 cm-1 que muestra la presencia del enlace antisimétrico C-H, un pico a 1658,70 cm-1 que indica la presencia del enlace del OH secundario, otro pico a 1436,91 cm-1 del enlace CH-CH, otro a 1316,17 cm-1 del enlace C-O y un pico a 1023,22 cm-1 que muestra la presencia del enlace C–C en la estructura de la mangiferina. Este espectro fue comparado con un estándar de mangiferina lo que reveló la similitud en los grupos funcionales. 1.7.4 Espectrometría de masas (EM) La EM es una técnica de análisis basada en la separación de acuerdo a las razones masa/carga de especies cargadas formadas a partir de la ionización de una muestra. Se trata de una técnica extremadamente sensible, de gran versatilidad y cuyos campos de aplicación experimentan un crecimiento vertiginoso en nuestros días. Suministra información muy valiosa sobre los compuestos químicos: la masa molecular, la fórmula global y, a partir del patrón de fragmentaciones, la estructura molecular, así como la composición isotópica en sustancias naturales o marcadas isotópicamente (Ferreres y col., 2011). En un trabajo (Campa y col., 2011), se analizó el espectro de masas de la mangiferina y la isomangiferina obtenida a partir de hojas de café mediante una fuente de ionización por electrospray. El espectro de masas obtenido sugiere que ambos compuestos son isómeros y que exhiben una señal a m/z 423 (M+H). 1.7.4 Resonancia Magnética nuclear (RMN) La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) es un método químico-físico basado en las propiedades magnéticas de los núcleos atómicos. Muchos núcleos se comportan como pequeños imanes, lo que genera un débil campo magnético. La ubicación de dichos núcleos en una zona donde existe un campo magnético intenso hace que los estados que difieren en la orientación de los momentos magnéticos nucleares posean diferente energía. La interacción 24 Revisión bibliográfica del sistema con una radiofrecuencia adecuada produce transiciones entre dichos niveles energéticos, que se detecta como una débil señal de absorción (Agiomyrgianaki y col., 2012) En un trabajo realizado por Campa y col., 2011 se analizó el espectro RMN de la mangiferina obtenida a partir de hojas de café a 400,13 MHz para 1H y a 100,62 MHz para 13 C. Los espectros de RMN fueron interpretados mediante las versiones de gradiente convencional de las secuencias COSY, HMQC y HMBC. El espectro 1H muestra tres singletes a 7,371; 6,845 y 6,374 ppm y un sistema complejo de 7 espines entre 3,0 y 5,0 ppm. El análisis de este sistema de segundo orden revela un acoplamiento de la constante típica de la entidad de glucosa. El corrimiento químico de RMN-13C a 73,6 ppm sugiere un enlace C-C entre el azúcar y la aglicona. 1.7.5 Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR) La técnica CLAR es un método ampliamente utilizado en el análisis de xantonas y otros metabolitos secundarios. Es un método de columna donde la fase móvil y la muestra son forzadas a atravesar la fase estacionaria que se encuentra en la columna. Es aquí, donde tienen lugar diversos tipos de interacciones entre sus componentes tales como: interacciones bipolares, hidrófobas, puentes de hidrógeno e interacciones electrostáticas. Las fases estacionarias que más han sido utilizadas son la C8 y la C18 y como fase móvil se han utilizado mezclas de metanol-agua y metanol-ácido acético al 2,5% (Castiñeira, 2002). En un trabajo (Campa y col., 2011), determinó la mangiferina en hojas de café mediante una columna LiChrospher 100 RP- 18 (5 μm), y otra Cl8 y un detector de fotodiodo. El sistema de elución usado (0,8 ml/min) contiene un eluente A, compuesto de una solución acuosa de ácido fosfórico (2 mol/l), y un eluente B, compuesto de metanol. El tiempo de retención y las características espectrales de cada muestra fueron comparados con una muestra de referencia de mangiferina. Otro artículo (Kullu y col., 2013), refiere el análisis por CLAR, equipado con un detector UV– vis, de un extracto de Curcuma amada. La separación cromatográfica fue realizada en una columna de fase reversa (C18, 4,6 X 250 mm) con una temperatura de la columna mantenida a 25ºC. La fase móvil usada fue acetonitrilo y ácido acético al 3% en una relación 16:84 a un flujo de 0,5 ml/min. El volumen de inyección fue de 10 µl. los picos fueron evaluados basados 25 Revisión bibliográfica en su absorbancia a 254 nm. El tiempo de retención y la concentración de las muestras fueron comparados con el estándar puro de mangiferina. Se verifica la presencia de mangiferina a un tiempo de retención de 6,51 min. 1.8 Análisis crítico de la bibliografía En la bibliografía consultada se aprecia una tendencia creciente en el uso de las técnicas no convencionales de extracción debido a las múltiples ventajas que se reportan. No obstante, se observa que existe poca bibliografía sobre la obtención de mangiferina mediante microondas y ultrasonido, por lo que se decidió abordar el estudio de la extracción de este metabolito contenido en las hojas de Mangifera indica L. mediante el empleo de estas técnicas no convencionales de extracción. 26 Materiales y métodos CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Materiales 2.1.1 Reactivos El disolvente n-hexano fue suministrado por Merck (MERCK L-K 26455380920) con una pureza superior al 99%. El etanol fue suministrado por UniChem (E14623-3J) con una pureza de 99%. El agua desionizada empleada es proporcionada por el Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). 2.1.2 Equipos Balanza analítica Sartorius R 200 D (precisión 0,0001g) Balanza técnica Mettler Toledo P B 8001 (precisión 0,1g) Bomba de vacío Edwards Criostato Sanyo M K- 70 Rotoevaporador Büchi R- 124 Estufa eléctrica Electric Drying Oven modelo 101-2 Horno de microondas doméstico modificado SANYO EM-T109SS Baño ultrasónico Sakura US-5E (Potencia 150W y Frecuencia 60kHz) Cromatógrafo gas-masa Shimadzu QP-2010S Cromatógrafo líquido-masa TermoFinigan LCQ-Ion Trap 2.1.3 Recolección y preparación del material vegetal Se utilizaron hojas secas y molidas (3-5 mm de tamaño de partículas) de Mangifera indica L. de la variedad ―Mango Macho‖ suministradas en abril del 2011 y de la variedad ―Super Hade‖ suministradas en diciembre del 2012, provenientes de la arboleda ubicada en la Estación Experimental de Plantas Medicinales ―Dr. Juan Tomás Roig‖, en la localidad de San Antonio de los Baños, provincia Artemisa. Fueron codificadas en el Herbario del Instituto de Ecología y Sistemática del Ministerio de Ciencias y Tecnología (CITMA), con el número de herbario 41722. 27 Materiales y métodos Las hojas de la variedad ―Mango Macho‖ contienen un 3,23% de mangiferina, un 9,0% de humedad y 5,10% de fracción apolar (Sarduy, 2012). Mientras que las hojas de la variedad ―Super Hade‖ tienen un valor de humedad de 11,8%, un contenido de mangiferina de 2,15% en base anhidra determinado por CLAR y un contenido de fracción apolar determinado por soxhlet de 11,22% (Betancourt, 2013). 2.2 Estudio del proceso de extracción mediante la energía de las microondas Los experimentos se llevaron a cabo en un horno de microondas doméstico modificado SANYO EM-T109SS, de potencia variable con una frecuencia de operación de 2450 MHz (Anexo 2). Se empleó un reactor de vidrio de fondo redondo de un litro de capacidad (conectado a un condensador de serpentín y enchaquetado en posición de reflujo), el que se ubica dentro de la cavidad del horno, colocado en el sitio de mayor radiación determinado previamente por Pérez, 2012. 2.2.1 Estudio de las mejores condiciones de extracción de la fracción apolar (desengrase) Para la evaluación de las variables que influyen en la etapa de desengrase, se emplearon hojas de la variedad ―Super Hade‖ del árbol del mango. Se utilizó un diseño de superficie respuesta Box-Behnken aleatorizado de 15 corridas incluyendo 3 puntos centrales por bloque, donde las variables estudiadas fueron la potencia (W), el tiempo de irradiación (min) y la relación volumen de disolvente por masa de material vegetal (ml/g), y se empleó n-hexano como disolvente de extracción. Estos parámetros se escogieron según estudios previos realizados para el que se empleó el método tradicional en tanque agitado (Sarduy, 2012). Como variable respuesta se seleccionó el contenido de fracción apolar extraída respecto a la masa inicial de hojas. En la tabla 4 se muestran los valores de los niveles estudiados en el diseño. Tabla 4. Niveles de los factores experimentales Factores Bajo Alto Unidades Tiempo 1,0 5,0 min Potencia 540,0 900,0 W Relación 10,0 20,0 ml/g En la tabla 5 se muestra la matriz del diseño experimental empleado. 28 Materiales y métodos Tabla 5. Matriz del diseño experimental de extracción de la fracción apolar Experimentos Potencia( W) Relación(ml/g) Tiempo(min) 1 540 15 1 2 540 20 3 3 720 20 1 4 720 15 3 5 900 15 1 6 540 10 3 7 540 15 5 8 720 10 1 9 720 15 3 10 720 10 5 11 900 10 3 12 720 20 5 13-15* 720 15 3 *Experimentos en el centro del plano Fueron empleados en todos los casos 10 g de hojas molidas y homogenizadas. Una vez concluido cada ensayo, el extracto se separó del residuo vegetal mediante gasa y se filtró bajo presión reducida. Posteriormente se concentró en el rotoevaporador a presión reducida hasta sequedad. 2.2.2 Selección del mejor disolvente de extracción de la mangiferina contenida en el material vegetal Para conocer el disolvente que mejor extrae la mangiferina se utilizaron 10 g de hojas verdes de la variedad ―Macho‖ del árbol del mango previamente desengrasadas y se extrajo con 150 ml de disolvente a una potencia de 750 W durante un tiempo de 3 min. Se utilizó agua, etanol al 96% y mezclas etanol – agua (80, 50 y 30%), cada ensayo se realizó por duplicado. El extracto se separó del residuo vegetal mediante gasa y se filtró bajo presión reducida. Luego se midió el volumen del licor obtenido. El seguimiento del proceso extractivo se realizó mediante la cuantificación de la mangiferina por CLAR (Nuevas y col., 2012). Como variable de respuesta se evaluó el contenido de mangiferina extraída respecto a la masa inicial de hojas. 29 Materiales y métodos 2.2.3 Estudio de las mejores condiciones para la etapa de extracción de mangiferina Para evaluar las variables que influyen en la etapa de extracción de mangiferina mediante la energía de las microondas, se empleó un diseño de superficie respuesta Box-Behnken aleatorizado de 15 corridas incluyendo 3 puntos centrales por bloque, donde las variables estudiadas fueron la potencia (W), el tiempo de irradiación (min) y la relación volumen de disolvente por masa de material vegetal (ml/g), y se empleó agua como disolvente de extracción. Como variable respuesta se seleccionó el contenido de mangiferina respecto a la masa inicial de hojas. Los niveles de los factores estudiados se muestran en la tabla 6. Tabla 6. Niveles de los factores estudiados en el diseño experimental de extracción de mangiferina Factores Bajo Alto Unidades Tiempo 1,0 5,0 min Potencia 540,0 900,0 W Relación 10,0 20,0 ml/g Se utilizaron 10 g de hojas desengrasadas de la variedad ―Macho‖ de mango en todos los casos y los ensayos fueron realizados según la matriz experimental mostrada en la tabla 7. Posteriormente se separó el extracto del residuo vegetal mediante gasa y se filtró bajo presión reducida. Al extracto obtenido se le determinó la concentración de mangiferina por CLAR. 30 Materiales y métodos Tabla 7. Matriz del diseño experimental de extracción de mangiferina Experimentos Tiempo(min) Relación (ml/g) Potencia(W) 1 1 15 540 2 3 20 540 3 1 20 720 4 3 20 900 5 1 15 900 6 3 10 540 7 5 15 540 8 1 10 720 9 5 15 900 10 5 10 720 11 3 10 900 12 5 20 720 13-15* 3 15 720 *Experimentos en el centro del plano 2.3 Estudio del proceso de extracción sólido-líquido mediante ultrasonido a baja frecuencia Los experimentos se llevaron a cabo en un baño ultrasónico (Anexo 3). Se empleó un reactor de vidrio de fondo plano de un litro de capacidad, que se ubica dentro del baño. En todos los ensayos se emplearon hojas de la variedad ―Macho‖ del árbol de mango. 2.3.1 Estudios preliminares del proceso de extracción de la fracción apolar por ultrasonido 2.3.1.1 Influencia de la relación sólido-líquido en el proceso de extracción de la fracción apolar Para conocer la mejor relación para la extracción de la fracción apolar se utilizaron 5 g de hojas verdes del árbol del mango que se extrajeron con n-hexano como disolvente durante un tiempo de 1 h. Se emplearon como relaciones volumen disolvente/ material vegetal 10, 20, 30, 31 Materiales y métodos 40 y 50 ml/g. Cada ensayo se realizó por duplicado. Como variable respuesta se seleccionó la masa de fracción apolar extraída respecto a la masa inicial de hojas. 2.3.1.2 Influencia del tiempo en la extracción de la fracción apolar Para el estudio de extracción de la fracción apolar en el tiempo se utilizaron 15 g de hojas de mango, una relación volumen disolvente / material vegetal de 20 ml/g y n-hexano como disolvente de extracción. Se tomaron alícuotas del líquido de extracción (4 ml) en los tiempos de 5, 15, 45, 60 y 90 min. Posteriormente se separó el extracto del residuo vegetal de cada muestra mediante gasa y se filtró bajo presión reducida. La muestra se concentró hasta sequedad. Como variable de respuesta se evaluó la masa de fracción apolar extraída, que se determinó mediante un método gravimétrico. 2.3.2 Estudio de las mejores condiciones en la etapa de extracción de la fracción apolar (desengrase) mediante el empleo del ultrasonido Para la evaluación de los parámetros que influyen en la etapa de desengrase, se utilizó un diseño factorial aleatorizado de 11 corridas incluyendo 2 puntos centrales, donde las variables estudiadas fueron el tiempo de extracción (min) y la relación volumen de disolvente por masa de material vegetal (ml/g) y se empleó n-hexano como disolvente de extracción. Como variable respuesta se seleccionó la masa de fracción apolar extraída respecto a la masa inicial de hojas. En la tabla 8 se muestran los valores de los niveles estudiados en el diseño. Tabla 8. Niveles de los factores experimentales para la extracción de la fracción apolar por ultrasonido Factores Bajo Alto Unidades Tiempo 30 90 min Relación 30 50 ml/g En la tabla 9 se muestra la matriz del diseño experimental que se utilizó. 32 Materiales y métodos Tabla 9. Matriz experimental del diseño de extracción de la fracción apolar por ultrasonido Experimentos Relación (ml/g) Tiempo (min) 1 40,0 90,0 2 30,0 60,0 3 30,0 90,0 4 50,0 30,0 5 30,0 30,0 6 50,0 90,0 7 40,0 30,0 8 50,0 60,0 9-11* 40,0 60,0 *Experimentos en el centro del plano Fueron empleados en todos los casos 5 g de hojas de mango. Una vez concluido cada ensayo, el extracto se separó del residuo vegetal mediante gasa y se filtró bajo presión reducida. Posteriormente se concentró en el rotoevaporador a presión reducida hasta sequedad. 2.3.3 Estudios preliminares del proceso de extracción de mangiferina por ultrasonido 2.3.3.1 Influencia de la relación sólido-líquido en el proceso de extracción de mangiferina Para conocer la mejor relación volumen/ masa de hojas para la extracción de mangiferina, se utilizaron 5 g de hojas verdes del árbol del mango previamente desengrasadas. Para la extracción se utilizó agua como disolvente durante un tiempo de 45 min. Se usó este disolvente, ya que es el empleado para el método tradicional. Se utilizaron como relaciones volumen disolvente/ material vegetal 20, 30, 40, 50, 60, 70 y 80 ml/g y cada ensayo se realizó por duplicado. Como variable respuesta se evaluó la masa de mangiferina extraída respecto a la masa inicial de hojas. 33 Materiales y métodos 2.3.3.2 Selección del mejor disolvente de extracción de la mangiferina contenida en el material vegetal Para conocer el disolvente que mejor extrae la mangiferina se utilizó 1 g de hojas verdes del árbol del mango previamente desengrasadas y se extrajo con 20 ml del disolvente seleccionado, durante un tiempo de 45 min. Se utilizó agua, etanol al 96% y mezclas etanol – agua (70, 50 y 30%) y cada ensayo se realizó por duplicado. El extracto se separó del residuo vegetal mediante gasa y se filtró bajo presión reducida. Luego se midió el volumen del licor obtenido. El seguimiento del proceso extractivo se realizó mediante la cuantificación de la mangiferina por CLAR (Nuevas y col., 2012). Como variable de respuesta se evaluó la masa de mangiferina extraída respecto a la masa inicial de hojas. 2.3.3.3 Influencia del tiempo en la extracción de mangiferina Para el estudio de extracción de mangiferina en el tiempo se utilizaron 15 g de hojas de mango previamente desengrasadas, una relación volumen disolvente / material vegetal de 20 ml/g y agua como disolvente de extracción. Se tomaron alícuotas del líquido de extracción (4 ml) en los tiempos de 5, 30, 45, 60, 90 y 120 min. Posteriormente se separó el extracto del residuo vegetal de cada muestra mediante gasa y se filtró bajo presión reducida. Como variable respuesta se evaluó la masa de mangiferina extraída respecto a la masa inicial de hojas. 2.3.4 Estudio de las mejores condiciones en la etapa de extracción de la mangiferina Para evaluar la influencia de las variables en la etapa de extracción de mangiferina mediante la energía del ultrasonido, se empleó un diseño de superficie respuesta compuesto central aleatorizado de 17 corridas que incluye 3 puntos centrales, donde las variables estudiadas fueron la concentración de etanol (%), el tiempo de extracción (min) y la relación volumen de disolvente por masa de material vegetal (ml/g). Los niveles de los factores estudiados se muestran en la tabla 10. 34 Materiales y métodos Tabla 10. Niveles de los factores estudiados en el diseño experimental para la extracción de mangiferina mediante ultrasonido Factores Bajo Alto Unidades Tiempo 30 90 min Concentración de etanol 20 70 % Relación 30 60 ml/g Se utilizó 1 g de hojas de mango desengrasadas en todos los casos y los ensayos fueron realizados según la matriz experimental mostrada en la tabla 11. Posteriormente se separó el extracto del residuo vegetal mediante gasa y se filtró bajo presión reducida. Al extracto obtenido se le determinó la concentración de mangiferina por CLAR. Como variable de respuesta se evaluó la masa de mangiferina extraída respecto a la masa inicial de hojas. Tabla 11. Matriz del diseño experimental para la extracción de mangiferina por ultrasonido Experimentos Tiempo(min) Relación(ml/g) Concentración etanol (%) 1 60 20 45 2 90 60 70 3 30 30 70 4 110 45 45 5 90 30 70 6 60 45 0 7 30 60 20 8 30 30 20 9 60 45 90 10 10 45 45 11 60 70 45 12 90 30 20 13 30 60 70 14 90 60 20 15-17 60 45 45 35 Materiales y métodos 2.4 Técnicas analíticas empleadas 2.4.1 Determinación del contenido de fracción apolar La determinación del contenido de fracción apolar se realizó mediante la siguiente ecuación: (ecuación 1) Donde: m (FA):masa de fracción apolar (mg) g (hojas): gramo de hojas empleadas en el experimento. Para determinar la masa de la fracción apolar presente en las hojas extraída experimentalmente, se utilizó un método gravimétrico. Primeramente, se pesó en la balanza analítica el balón vacío en el que se concentró posteriormente el extracto, y seguidamente se pesó el balón lleno. Después, por diferencia de peso se pudo determinar la masa de fracción apolar extraída. Para este cálculo se utilizó la siguiente ecuación: m (FA)= masa balón lleno - masa balón vacío (ecuación 2) 2.4.2 Determinación del contenido de mangiferina por CLAR Para realizar el análisis por cromatografía líquida de alta resolución se empleó una bomba de gradiente L6200A (Merck-Hitachi) acoplada a un detector UV-VIS L-3000 ajustado a 254 nm. Para realizar la separación cromatográfica se empleó una columna LiChrospher RP-18 (Merck) de 250 mm de largo y 4,6 mm diámetro interno y un tamaño de partículas de 5 µm. La fase móvil consistió en una mezcla de ácido trifluoroacético al 0,1% y acetonitrilo en una relación 88:12 v/v. El volumen de inyección fue de 20 µl. 2.4.3 Cálculo del contenido de mangiferina El contenido de mangiferina extraída se determinó según la ecuación siguiente: (ecuación 3) Donde: m (MgF): masa de mangiferina extraída (mg) La masa de mangiferina extraída se calcula a partir de la ecuación que se muestra a continuación: 36 Materiales y métodos m (MgF)= Vf * c(MgF) (ecuación 4) donde: Vf: Volumen final del extracto. c(MgF): Concentración final de mangiferina en el extracto determinada por CLAR. 2.4.4 Cromatografía gaseosa acoplada a masas (CG-EM) Para el análisis por CG-EM se empleó un equipo Shimadzu QP-2010S acoplado con una columna DB-5 MS de diámetro 30 m x 0,25 mm. El gas portador empleado fue helio a una velocidad de flujo de 1 ml/min. La inyección se realizó a 250ºC y el volumen de inyección fue de 1 µl. 2.4.5 Cromatografía líquida acoplada a masas (CLAR-EM) Se realizó en un equipo equipado con una sonda de ionización por electrospray (ESI), una trampa de iones y un detector DAD 996 (Waters, USA). Los espectros de masas se registraron en modo de ESI positivo (ESI +) y negativo (ESI-) en el intervalo de 50 a 1500 Da y los espectros ultravioleta entre 190 y 450 nm. Como gas nebulizador se usó nitrógeno seco a un flujo de 10 ml/min, una presión de 4,1 bar; temperatura de 375 °C y como gas colisionador helio. La fragmentación se realizó a una presión de 1,2*10-5 mbar. Los espectros de masas de primer orden (EM) y de segundo orden (EM2) se obtuvieron a 1,2 V y 1,5 V, respectivamente. La separación cromatográfica previa se llevó a cabo en una columna RP-18 de 250 x 4,6 mm a un flujo de 1 ml/min. La fase móvil consistió en ácido fórmico 0,1 % (A) y acetonitrilo- ácido fórmico 0,1 % (B). Las muestras se prepararon a una concentración de 1 mg/ml en dimetilsulfóxido y el volumen de inyección fue de 5 μl. 2.5 Análisis estadístico de los resultados Los resultados fueron analizados con el Software STATGRAPHICS Centurion XV Versión 15.2.05 StatPoint, Inc, 1982 – 2007a partir del análisis de varianza, diagramas de Pareto y los gráficos de superficie de respuesta. 37 Resultados y discusión CAPÍTULO III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Identificación de los componentes presentes en las hojas de mango Para la identificación de los componentes en las hojas verdes de Mangifera indica L., los metabolitos fueron extraídos mediante extracción por Soxhlet con n-hexano, acetato de etilo y metanol como disolventes. Los extractos de n-hexano y acetato de etilo fueron analizados mediante Cromatografía gaseosa acoplada a masas (CG-EM) y el extracto metanólico fue analizado por Cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas (CLAR-EM). La identificación de los componentes en las fracciones apolares fue realizada por comparación del espectro de masas adquirido con el reportado por la base de datos NIST. La identificación de los compuestos por CLAR-EM se realizó mediante la comparación de los espectros obtenidos con los informados en la literatura por varios autores o por comparación con patrones de los compuestos. El cromatograma de la CG-EM para los componentes extraídos con n-hexano y la estructura de los compuestos principales encontrados se muestran en la Figura 8. QF_HEX 11 100 10 19 8 42 % 15 29 9 17 20 34 38 40 25 6 3 2 1 4 28 12 13 5 33 27 30 32 31 7 41 35 45 43 44 49 4748 46 51 50 0 53 52 rt 5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 30.000 35.000 H2C CH3 H3C H 10 CH3 7 OH H H3C CH3 H3C CH3 β-elemeno (8) Aromandreno (11) -guaieno (10) Hinesol (6) Figura 8. Cromatograma y estructuras principales de los componentes extraídos con nhexano 38 Resultados y discusión En el Anexo 4 aparece la identificación de cada pico. La identificación muestra la presencia de estructuras de sesquiterpenoides no oxigenados en el extracto. Los componentes principales fueron -elemeno, -guaieno, aromandreno e hinesol, los cuales tienen reportado diferentes actividades farmacológicas. Aparece en la literatura un trabajo que refiere los aceites volátiles extraídos de las hojas de Mangifera indica L. por destilación al vapor y analizados mediante CG-EM, donde se identificaron 15 compuestos de la fracción oleosa. Los principales compuestos fueron βSelineno (28,89%), α-Gurjuneno (11,64%), α-Selineno (10,04%), Cariofileno (10, 01%), βElemeno (6,81%) y α-Humuleno (6,19%) (Li y col., 2007). Otro estudio refiere la presencia de esteroides, flavonoides, azúcares reductores y glicósidos cardiacos en el extracto de n-hexano obtenido a partir de hojas de Mangifera indica (variedad Edward) (Aiyelaagbe y Osamudiamen, 2009). En extracto de acetato de etilo (Figura 9) y en extracto metanólico (Figura 10) los principales metabolitos identificados son compuestos fenólicos. CH3 CH3 CH3 CH3 OH CH2 CH3 H3C OH CH2 β-selineno (5) β-eudesmol (6)Hinesol (19) Figura 9. Cromatograma y estructuras de algunos compuestos identificados en extracto de acetato de etilo 39 Resultados y discusión OH OH OH OH HO O O HO OH OH OH OH (+) catequina OH HO O H3C OH O OH O OH OH OH HO (-) epicatequina OH O O O OH OH OH HO OH O OH mangiferina homomangiferina Figura 10. Cromatograma UV y estructuras de los principales compuestos identificados en extracto metanólico Compuestos oxigenados, como el ácido hexanoico, fueron los principales metabolitos extraídos en el extracto de acetato de etilo (Anexo 5). En el extracto metanólico se observó la presencia de 52 compuestos, los cuales fueron identificados mediante el análisis de los espectros UV entre 190 y 450 nm y de la 40 Resultados y discusión fragmentación de los espectros de masas de primer (EM) y segundo orden (EM2) de cada pico y la información descrita en la literatura (Anexo 6). Los compuestos con tiempo de retención 3,58 (1); 4,33 (2) y 8,27 (5) min presentaron un espectro UV similar, con máximos de absorción a 230 y 265 nm, absorción típica de los ácidos fenólicos. Los EM presentaron iones moleculares [M-H] a m/z 331, 169 y 153 Da respectivamente. En el EM2 de (1) se observaron fragmentos a m/z 271 [M-H-60], 241 [M-H90], 211 [M-H-120] y 169 [M-H-162] que revelaron la presencia de una hexosa O-glicosilada y el ión m/z 169 sugirió la presencia de ácido gálico. Para (2) y (5) en el EM2 se observó un ión prominente a m/z 125 y 109 [M-H-44] respectivamente que se debe a la pérdida de 44 Da, que corresponde a un grupo carboxilo. De acuerdo con estos resultados estos compuestos fueron identificados como monogaloil glucosa (332,26 g/mol) (1), ácido gálico (170,11g/mol) (2) y ácido 3,4 dihidroxibenzoico (154,23 g/mol) (5). La presencia de estos ácidos fenólicos en las hojas de mango había sido informada previamente por Barreto y col., 2008. El compuesto con tiempo de retención de 6,27 min (3) presentó máximos de absorción a 230 y 265 nm y el ión molecular a m/z 170 [M-H] en EM y otro a m/z 125 [M-H-44] en EM2, lo que sugiere que sea probablemente un ácido fenólico, no obstante, este compuesto no pudo ser identificado. Los picos que eluyeron a 11,9 (6); 12,82 (7) y 20,34 (16) min fueron identificados como maclurina 3-(2-galoil)-ß-D-glucósido (576,11 g/mol); iriflofenona 3-C-ß-D-glucósido (408,07 g/mol) y maclurina (262,21 g/mol). Los compuestos (6) y (16) presentaron el espectro UV característico de estas benzofenonas con máximos a 230 y 285 nm y el (7) presentó máximos a 235 y 290 nm. En el EM se observaron sus iones moleculares [M-H] a m/z 575, 407 y 261 Da, lo cual está en correspondencia con las masas molares calculadas. La presencia de fragmentos en el EM2 para el compuesto (6) a m/z 423 [M-H-152], m/z 405 [M-H-170], m/z 313 [M-H152-110] y m/z 303 [M-H-152-120] se relacionaron con la pérdida de residuos como galoil (152 Da), ácido gálico (170 Da) y glucosa con enlace C-C (120 Da). El fragmento a m/z 285 se debe a la pérdida de una molécula de agua del fragmento m/z 303 y el fragmento a m/z 261 correspondió al ión molecular de la maclurina. Para el compuesto 7, los fragmentos a m/z 317 [M-H-90] y m/z 287 [M-H-120] indicaron la pérdida de una unidad de glucosa con enlace CC. Para el compuesto 16 en el EM2 se observaron los fragmentos m/z a 151 y 106,9 que se 41 Resultados y discusión deben a la pérdida de 110 y 151 Da del ión molecular. Iguales fragmentaciones han sido registradas en EM para estos compuestos por Barreto y col., 2008. Los picos con tiempo de retención 14,4 (8) y 19,3 (13) min, se sugieren como catequina y epicatequina, respectivamente. Los espectros UV fueron similares y presentaron máximos de absorción a 235 y 280, 315 y 365 nm. Los EM tienen un fragmento prominente a m/z 289 relacionado con el ión molecular de ambos compuestos. En el EM2 se observaron fragmentos a m/z 245, 205 y 179 Da que se corresponde con la fragmentación típica informada en la literatura para estas dos estructuras (Hui-Jing y Deinzer, 2007). El compuesto con tiempo de retención 15,04 min (9), no pudo ser identificado. Presentó un espectro UV con un máximo de absorción a 230 nm y otros dos más pequeños a 260 y 370 nm. El EM presentó un ión molecular de m/z 565 [M-H] por lo que este compuesto presente una masa molecular de 566 g/mol. En el EM2 se observaron fragmentos a m/z 475, 445 y 385 Da producto de la pérdida de 90, 120 y 180 Da del ión molecular, que indica la presencia de una hexosa O-glicosilada. Los compuestos con tiempo de retención 17,80 (11) y 18,90 (12) min, fueron identificados como mangiferina e isomangiferina. El compuesto 11 presentó máximos de absorción a 235, 255, 320 y 365 nm. Los EM y EM2 de estos compuestos fueron similares, en ambos se observó un ión molecular a m/z 421 [M-H] para una masa molar de 422 g/mol y se observaron fragmentos a m/z 331 [M-H-90], 301 [M-H-120] y 259 [M-H-162] que correspondieron a la pérdida de una unidad de C-glucosa. La asignación de cada uno de los picos se realizó a partir del trabajo de Shieber y col., 2003, quien informó que la mangiferina eluye antes de la isomangiferina bajo condiciones cromatográficas similares a las utilizadas en este trabajo. El compuesto con tiempo de retención 19,69 min (14) se identificó como homangiferina. Su EM posee un ión molecular a m/z 435 [M-H] para una masa molar de 436 g/mol y fragmentos a 315, 287 y 272 Da. En su EM2 se observó el mismo patrón de fragmentación de la mangiferina y la isomangiferina, es decir, la pérdida de 90, 120 y 162 Da que corresponden a la glucosa. El ión en m/z 272 [M-H-162] pertenece al derivado metoxilado de la mangiferina. El pico con tiempo de retención de 20,79 min (17) presentó el ión molecular a m/z 693 [M-H] y fragmentos a m/z 573 [M-H-120], m/z 421 [M-H-120-152] y m/z 403 [M-H-120-170]. La pérdida de 120 Da indicó la presencia de un grupo benzoilo, mientras que la de 152 Da se 42 Resultados y discusión debió a la existencia de un grupo galoil en la estructura, los cuales deben estar unidos en diferentes sitios de la unidad de glucosa de acuerdo con su comportamiento cromatográfico. En el espectro EM2 de los picos el fragmento predominante fue m/z 421 [M-H-272] que presentó la fragmentación característica de la mangiferina, por lo que este compuesto se identificó como 6’-O-galoil-2’-benzoil-mangiferina (694,24 g/mol). Por su parte, los picos con tiempo de retención 21,59 (19); 21,95 (20); 22,85 (24), y 24,30 (27) min presentaron espectros UV similares al de la mangiferina. En los EM se observó un ión molecular a m/z 573 [M-H] y fragmentos a m/z 421 [M-H-152] y m/z 403 [M-H-170] que indicaron la pérdida de ácido gálico. En el espectro EM2 se observó la presencia del ión predominante a m/z 421 [M-H-152] con la fragmentación característica de la mangiferina. Los tres primeros compuestos se identificaron como isómeros de posición de la 6’-O-galoilmangiferina (574,09 g/mol) y el último como 6´-O-galoilisomangiferina, por semejanza de su espectro UV con el de la isomangiferina. Los picos con tiempo de retención 23,62 (25); 23,98 (26); 24,73 (28) y 24,90 (29) min se suponen que son isómeros de posición de la mangiferina o compuestos derivados de ella pues sus espectros son característicos de las tetrahidroxixantonas. La diferencia se encuentra en la zona de 300 a 400 nm, lo cual indica que los sustituyentes se encuentran en el anillo B de la estructura. Los EM presentaron un ión molecular a m/z 421 [M-H] con poca intensidad y otro muy intenso a m/z 403 [M-H-18], que se debe a la pérdida de una molécula de agua. En el EM2 se observaron fragmentos a m/z 373 [M-H-18-30], 343[M-H-18-60], 313[M-H-18-90], 285[M-H-18-118], 271 [M-H-150] y 259 [M-H-162] que indican la pérdida de una hexosa con enlace C-C a la xantona. El ion m/z 259 se corresponde con el ión molecular de la tetrahidroxixantona. La diferencia en los tiempos de retención podría estar provocada por la presencia de hexosas diferentes a la glucosa y en diferentes posiciones en el anillo B. Los picos que aparecen a tiempo de retención de 25,19 (30) y 25,74 (32), 26,10 (33) y 28,08 (38) min se identificaron como isómeros de posición de la p-hidroxibenzoilmangiferina (542,44 g/mol). Estos compuestos presentaron espectros UV y EM similares. La presencia del ion en m/z 541, así como de los fragmentos a m/z 421 [M-H-120], 403 [M-H-138] y 259 [MH-120-162] indicaron la pérdida del ácido p-hidroxibenzoico (120 y 138 Da) y de una glucosa con enlace C-C (162 Da). 43 Resultados y discusión El pico con tiempo de retención de 31,40 min (45) presentó el espectro UV similar al de la mangiferina con máximos de absorción a 235, 255, 315 y 360 nm y un ión molecular a m/z 259 [M-H]. Este compuesto se identificó como noratiriol (260,19 g/mol) por comparación con el espectro publicado en la literatura (Barreto y col., 2008). El compuesto (48), con tiempo de retención de 33,81 min se identificó como quercetina (302,19 g/mol). El espectro UV presentó máximos a 235, 255 y 370 nm y el espectro EM presentó un ión prominente a m/z 301 [M-H], mientras que el EM2 presentó iones a m/z 179 y 151 típicos de la fragmentación de este compuesto. Aunque no se pudieron identificar, también están presentes algunos derivados de los flavonoides. El análisis de los espectros UV sugiere que los compuestos con tiempo de retención de 27,77 (37); 30,27 (42); 31,10 (44) y 33,52 (47) min pueden ser flavanonas o isoflavonas pues presentaron un solo máximo de absorción muy intenso entre 270 y 290 nm y casi ninguna banda de absorción entre 300 y 450 nm, lo cual se debe a la falta de conjugación del anillo C3. Por otra parte, los picos con tiempo de retención de 25,50 (31); 26,82 (35); 27,53 (36); 30,63 (43); 32,70 (46); 35,01 (50) y 37,44 (51) min pueden ser flavonoles o flavonas. Sus espectros UV presentan una banda absorción entre 240 y 260 nm y dos bandas entre 300 y 400 nm típicos de estos compuestos. En los espectros de EM están presentes los fragmentos con m/z 107, 109, 131, 151, 165, 175, 177, 181 y 195 Da que les son característicos. Como se observa, la mayoría de los compuestos identificados el extracto metanólico lo constituyen xantonas C-glicosiladas derivadas de la mangiferina, benzofenonas, ácidos fenólicos simples y flavonoides. Muchos reportes de extractos acuosos de hojas de mango muestran la presencia de mangiferina, homomangiferina, catequina, epicatequina, flavonoides, saponinas y taninos, sin trazas de alcaloides o antraquinonas (Zhou y Zhong-Li, 2005). Todos estos compuestos tienen actividad farmacológica reportada y juegan un papel importante en la prevención de las células del organismo contra lesiones provocadas por el agua oxigenada, además neutralizan los radicales libres. Además, ha sido reportado que un alto contenido de fenoles totales aumenta la actividad antioxidante. 44 Resultados y discusión 3.2 Resultados del estudio del proceso de extracción de la fracción apolar (FA) El proceso actual de obtención de mangiferina incluye una etapa de desengrase o extracción de la fracción apolar contenida en las hojas con el objetivo de facilitar el posterior proceso de extracción de la mangiferina (Acosta, 2013). Por lo anterior, resulta necesario evaluar la etapa de desengrase. Teniendo en cuenta que existen diferencias en la composición química y en la época de recolección de las hojas de las dos variedades de mango disponibles, empleadas en la etapa de desengrase, se hace necesario evaluar la influencia del método de extracción tradicional establecido (Sarduy, 2012) sobre el % másico de fracción apolar. El análisis de varianza realizado al contenido de fracción apolar, que se muestra en la figura 11, indica que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los porcientos másicos de extracción de la fracción apolar de ambas variedades, por ser el valor de probabilidad (0,5241) mayor que 0,05. Esto es lógico si tenemos en cuenta que este proceso solo depende de la capacidad extractiva del disolvente, en este caso el n-hexano. Es decir, depende de la naturaleza o tipo de disolvente utilizado. El n-hexano una vez puesto en contacto con el material vegetal, extrae el soluto contenido en las hojas hasta que llega al equilibrio bajo las condiciones estudiadas. Figura 11. Contenido de fracción apolar presente en las hojas de mango de las variedades Macho y Super Hade Teniendo en cuenta los resultados obtenidos es factible comparar los métodos de extracción por ultrasonido y el de microondas, con el de tanque agitado, cuando se trabaje indistintamente 45 Resultados y discusión con estas variedades. No obstante se debe realizar un estudio de las diferentes variedades de mango disponibles, con el objetivo de evaluar la mejor época de recolección. 3.2.1 Estudio de las variables que influyen en la extracción de la fracción apolar (desengrase) mediante la energía de las microondas Para evaluar la influencia de los parámetros de operación en la etapa de desengrase fue empleado n-hexano como disolvente de extracción de la fracción apolar. En el estudio previo realizado (Sarduy, 2012), para el método tradicional, este disolvente es el seleccionado de acuerdo a los rendimientos en la extracción y el precio del mismo. En la tabla 12 se muestran los resultados del diseño experimental en el cual el contenido de fracción apolar respecto a la masa inicial de hojas fue la variable de respuesta elegida. Como se observa los valores de rendimiento en la extracción de la fracción apolar toma valores en el intervalo de 10,5 y 34,6 mg/g. Tabla 12. Resultados del diseño experimental para la fracción apolar No. de corrida Tiempo (min) (X1) Relación (ml/g) (X2) Potencia (W) (X3) Contenido de FA (mg FA extraída/g hojas) 1 1 15 540 11,4 2 1 15 900 11,9 3 3 20 540 16,3 4 1 10 720 10,5 5 1 20 720 15,0 6 5 10 720 24,6 7 5 20 720 34,6 8 3 10 540 13,3 9 3 10 900 24,2 10 5 15 540 24,0 11 5 15 900 30,0 12 3 20 900 16,6 13-15* 3 15 720 14,6 ± 2,3 * réplicas en el punto central 46 Resultados y discusión Mediante la aplicación del análisis de regresión múltiple a los datos experimentales, las variables respuestas y las variables independientes se correlacionan a un polinomio de segundo orden como se muestra en la ecuación 5. Contenido de FA = -10,82 - 2,13*X1 + 1,03*X12 (ecuación 5) El análisis de varianza (ANOVA) del modelo de regresión cuadrático muestra que los valores del coeficiente de determinación (R2) y del coeficiente de determinación ajustado (R2ajustada) fueron 89,9 y 82,2%, respectivamente, los cuales sugieren un alto grado de correlación entre los valores observados y predichos. En la figura 12, se muestra el diagrama de Pareto (A), el gráfico de efectos principales (B) y el gráfico de superficie de respuesta (C) obtenidos para el diseño. A B C Figura 12. Análisis de varianza para la extracción de la FA mediante microondas. A: Diagrama de Pareto; B: Gráfico de efectos principales; C: Gráfico de superficie de respuesta El parámetro que tiene influencia significativa para un 95 % de confianza sobre el proceso es el tiempo y su relación cuadrática, por ser el valor de probabilidad menor que 0,05 (0,0001 y 47 Resultados y discusión 0,0336 respectivamente); sin embargo no ocurre así para la relación, la potencia y su interacción. Al analizar los gráficos de Pareto y de efectos principales se puede observar que el tiempo tiene una influencia positiva sobre el contenido de FA. Esto es debido a que un aumento del tiempo de irradiación favorece el calentamiento por el incremento de la energía cinética de las partículas, lo que aumenta la difusividad y por tanto, la cantidad de las sustancias que se extraen, además del incremento de la solubilidad. Por otra parte, a mayor tiempo de extracción, hay un mayor contacto entre el sólido y el líquido, lo que permite al disolvente llegar a las zonas de más difícil acceso en los tejidos de la planta. Se debe tener en cuenta que el n-hexano es un disolvente que no absorbe las microondas por sí solo, por su baja polaridad y constante dieléctrica (1,69), por lo que el calentamiento producido es debido al agua presente en la matriz de la planta que absorbe fácilmente las microondas, además de los fragmentos de moléculas polares presentes. Al tener en cuenta la influencia que ejerce cada uno de los factores estudiados y según el gráfico de superficie de respuesta, las condiciones más favorables, de las estudiadas, para llevar a cabo la extracción de la fracción apolar contenida en las hojas de mango mediante EAM son: un tiempo de irradiación de 5 min, una potencia de 900 W y una relación de 10 ml/g para un valor máximo de la fracción apolar extraída de 32,7 mg/g. 3.2.2 Estudio del proceso de extracción sólido-líquido de la fracción apolar (desengrase) mediante el empleo del ultrasonido a baja frecuencia En todos los experimentos se emplearon hojas de la variedad Macho de Mangifera indica L. 3.2.2.1 Efecto del tiempo en la extracción de la FA Los resultados del estudio de extracción de la FA en el tiempo mediante ultrasonido aparecen reflejados en la figura 13. 48 Resultados y discusión Figura 13. Extracción de la fracción apolar presente en las hojas con el tiempo mediante ultrasonido Como se observa, los valores de fracción apolar extraída varían entre los 1,65 ± 0,69 y 4,13 ± 1,38 mg para los tiempos de 5 y 60 min respectivamente. El análisis de varianza realizado a la cinética de extracción de la fracción apolar indica que existen diferencias estadísticamente significativas entre las medias de las masas de fracción apolar para un 95% de confianza, por ser el valor de probabilidad (0,0002) menor que 0,05. Se aprecia que, con el aumento del tiempo, se favorece la extracción de fracción apolar hasta los 60 min, tiempo en el cual se alcanza una meseta. Como no existen diferencias estadísticamente significativas entre los 60 y los 90 min, se puede afirmar que la mayor extracción se alcanza a los 60 min de iniciada la operación. 3.2.2.2 Efecto de la relación disolvente-material vegetal en la extracción de FA Los resultados del estudio sobre la influencia de la relación disolvente-material vegetal en la extracción de la FA presentes en las hojas de Mangifera indica L. variedad macho, se muestran en la figura 14. 49 Resultados y discusión Figura 14. Comportamiento de la relación volumen de disolvente/material vegetal en la extracción de la FA presentes en las hojas de Mangifera indica L. Los valores de rendimiento alcanzados oscilan desde 16,95 mg/g para cuando se utiliza una relación volumen de disolvente/material vegetal de 10 ml/g, hasta 27,52 mg/g para una relación de 40 ml/g. Como se observa existen diferencias estadísticamente significativas entre las medias de los rendimientos de fracción apolar para un 95% de confianza, por ser el valor de probabilidad (0,0002) menor que 0,05. Se aprecia que con el aumento del volumen de disolvente se incrementa el rendimiento de extracción, obteniéndose los mayores valores de rendimiento de fracción apolar extraída para una relación disolvente/material vegetal de 40 y 50 ml/g, los cuales a su vez no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre sí, por lo que es recomendable trabajar con la relación de 40 ml/g para garantizar el ahorro de disolvente. 3.2.2.3 Estudio de la influencia de los parámetros de extracción de la FA mediante ultrasonido El estudio de los parámetros que influyen en la etapa de desengrase se realizó con el empleo de n-hexano como disolvente de extracción. Este disolvente fue elegido, debido a que brindó excelentes rendimientos de extracción de fracción apolar en estudios previos (Sarduy, 2012). Los parámetros que se evaluaron fueron el tiempo de extracción (X1) expresado en minutos (min) y la relación volumen de disolvente/ material vegetal (X2) en ml/g. Los niveles de las variables de estudio fueron seleccionados de acuerdo a los resultados preliminares obtenidos. La variable respuesta seleccionada fue la masa de fracción apolar extraída respecto a la masa inicial de hojas. 50 Resultados y discusión En la tabla 13 se muestran los resultados del contenido de la fracción apolar (FA) en cada uno de los experimentos realizados. Tabla 13. Resultados del diseño experimental Ensayo Tiempo (min) Relación (ml/g) (X2) (X1) Contenido FA (mg FA/g hojas) 1 90 30 18,2 2 30 30 13,7 3 30 50 22,9 4 90 50 29,5 5 60 30 17,4 6 30 40 20,3 7 60 50 24,9 8 90 40 26,6 9-11 60 40 25,1 ± 1,7 El mayor valor de rendimiento de la FA (29,5 mg/g) se alcanzó para los niveles más altos del diseño experimental (90 min y 50 ml/g) y el menor valor de rendimiento (13,7 mg/g) se obtuvo para los niveles más bajos del diseño (30 min y 30 ml/g). Estos resultados son lógicos pues los procesos difusivos por métodos de extracción convencionales y por ultrasonido, como todo proceso cinético, se favorecen con un aumento de la relación volumen de disolvente/material vegetal y del tiempo de contacto entre las fases, para sustancias que no se descomponen con facilidad, como la de estudio. El análisis de varianza (ANOVA) del modelo de regresión cuadrático muestra que los valores del coeficiente de determinación (R2) y del coeficiente de determinación ajustado (R2ajustado) fueron 95,5 y 91,0%, respectivamente, lo que sugiere un alto grado de correlación entre los valores observados y predichos. Las variables objeto de estudio y las variables de respuesta se correlacionan en un polinomio de segundo orden como se muestra en la ecuación 6 Contenido FA = -48,72 + 0,14*X1 + 2,86*X2 - 0,03*X22(ecuación 6) 51 Resultados y discusión En la figura 15, se muestran el diagrama de Pareto (A), el gráfico de efectos principales (B) y el de superficie de respuesta (C) del diseño. A B C Figura 15. Análisis de varianza para la variable contenido de FA extraída mediante ultrasonido Los parámetros que influyen estadísticamente para un 95% de confianza sobre el proceso extractivo son: la relación, el tiempo y la relación cuadrática de la relación por ser los valores de probabilidad 0,0004; 0,0034 y 0,0074 respectivamente, menores que 0,05. El diagrama de Pareto confirma lo anteriormente expuesto, donde se observa que la relación es el parámetro que presenta una mayor influencia, teniendo una influencia positiva sobre el contenido de FA. Al analizar el diagrama de efectos principales, se puede observar que el tiempo tiene una influencia positiva sobre el porciento másico de la fracción apolar, observándose un efecto cuadrático negativo aunque no tiene una influencia estadísticamente significativa. En el gráfico correspondiente a los estudios cinéticos (Figura 13) se observa que para los 90 min, ya se alcanzó una especie de meseta, es decir la masa de fracción apolar extraída no varía 52 Resultados y discusión prácticamente con el tiempo, y si se compara con los resultados obtenidos en el diseño experimental, podemos concluir que este tiempo podría ser suficiente para llevar a cabo la etapa de desengrase de las hojas por ultrasonido. Para el caso de la relación el contenido de FA aumenta hasta un máximo cercano a los valores más altos estudiados donde comienza a disminuir, esto pudiera ser debido, a que una parte del disolvente (n-hexano) es absorbido en las hojas, que se saturan con el disolvente y por tanto no intercambia soluto, por lo que una disminución de la solubilidad es debido a la pérdida del extrayente atrapado en la matriz. A partir de los resultados obtenidos y el gráfico de superficie de respuesta, las condiciones más favorables para la extracción de la FA a partir de hojas de Mangifera indica L., bajo las condiciones evaluadas, mediante ultrasonido, al emplear n-hexano como disolvente son: tiempo de irradiación de 90 min y una relación de 47 ml/g, para un rendimiento de FA de 29,0 ± 1,7 mg/g. 3.2.3 Comparación de la EAU y la EAM con tanque agitado para la etapa de desengrase Se comparó la eficiencia de la extracción de la fracción apolar para la mejor variante obtenida por ultrasonido (EAU) y mediante la extracción asistida por microondas (EAM) con el método de extracción en tanque agitado (TA) al utilizar n-hexano como disolvente. En la tabla 14 se muestran los valores del rendimiento de fracción apolar, el tiempo de extracción y la relación disolvente/ material vegetal que se tuvo en cuenta para el análisis de los métodos de extracción. Tabla 14. Comparación de los diferentes métodos de extracción de fracción apolar Tipo de extracción Parámetros TA EAM EAU Relación (ml/g) 20 10 47 Tiempo de extracción (min) 120 5 90 33,4 ± 1,0 32,7 ± 2,3 29,0 ± 1,7 Contenido de FA (mg/g) Como se muestra en la tabla, los mayores valores de rendimiento de mangiferina se alcanzan con el método tradicional (tanque agitado) y la extracción por microondas, aunque con el empleo de la EAM se reducen los tiempos de operación y el consumo de disolvente. La 53 Resultados y discusión operación con mayor tiempo de extracción en la obtención de mangiferina fue la extracción en tanque agitado y la de mayor consumo de disolvente fue la EAU. La figura 16 muestra los resultados del análisis de varianza realizado para el rendimiento, donde se aprecia que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los tres métodos de extracción utilizados, ya que el valor de probabilidad es mayor de 0,05 (0,06030). Figura 16.Contenido de FA obtenido por diferentes métodos Tanto para la extracción por microondas como para el método tradicional el estudio fue llevado a cabo para un intervalo de relación al de 10 a 20 ml/g, mientras que para la EAU se hace necesario el empleo de una relación de 47 ml/g. Este resultado es lógico para la EAU y se explica debido a que mayores volúmenes de disolvente favorecen la transferencia de masa y la cavitación. Para el caso de las microondas, los mayores rendimientos de extracción de la fracción apolar se logran con la menor relación (10 ml/g) lo cual coincide con lo reportado en la bibliografía, ya que en la EAM elevadas proporciones de disolvente provocan menores recobrados debido a una inadecuada agitación del disolvente por las microondas, puesto que ocurre menor calentamiento, pues este depende de la absorción de las microondas por el disolvente. Sin embargo, existe una gran diferencia en el tiempo en el cual se lleva a cabo la extracción de la fracción apolar contenida en las hojas. En este sentido mediante un proceso de microondas la extracción es 12 y 18 veces más rápida en comparación con el método de extracción por ultrasonido y en tanque agitado respectivamente. Esto, sin dudas, es una de las ventajas del uso de las microondas sobre otros métodos por emplear cortos periodos de tiempo. 54 Resultados y discusión No obstante, cuando se emplea un proceso de ultrasonido la extracción es 2 veces más rápida en comparación con el método de extracción en tanque agitado. Esto, sin dudas, constituye, además, una ventaja del uso del ultrasonido sobre métodos convencionales. 3.3 Resultados del estudio de la etapa de extracción de mangiferina Una vez concluida la etapa de desengrase, donde se eliminan mayoritariamente los compuestos de polaridad baja (fracción apolar) presentes en las hojas de Mangifera indica L., la próxima etapa es la extracción de la mangiferina, que es el metabolito de interés. En todos los casos fueron empleadas hojas desengrasadas de la variedad Macho de Mangifera indica L. 3.3.1Verificación por CLAR de la presencia de mangiferina en extractos obtenidos mediante ultrasonido y por microondas La figura 17 muestra el perfil cromatográfico de la mangiferina obtenida de hojas desengrasadas de Mangifera indica L. después de utilizar el equipo ultrasónico (B) y el microondas (C) y la mangiferina estándar de referencia (A). El tiempo de retención de 7,3 min. obtenido en ambos extractos, se corresponde con la mangiferina y concuerda con el estándar de referencia, verificándose la presencia de este metabolito en extractos de hojas de Mangifera indica L. obtenidos por ultrasonido y por microondas. Además, próximo a los 3 min aparecen unos picos, los cuales se corresponden con compuestos polares como se vio en el epígrafe 3.1. Figura 17. Cromatogramas correspondientes al estándar de referencia de la mangiferina (A) y al extracto de mangiferina presentes en las hojas de mango después de usar el equipo ultrasónico (B) y el de microondas (C) 55 Resultados y discusión 3.3.2 Evaluación de disolventes para la etapa de extracción de mangiferina mediante la energía de microondas En la evaluación de los candidatos a disolventes de extracción se utilizó el agua y mezclas hidroalcohólicas, de acuerdo a la naturaleza química del metabolito de interés. En la figura 18 se muestra el contenido de mangiferina (mg/g) para cada disolvente evaluado. Se aprecia que el mayor valor de rendimiento (26,31 ± 0,76 mg/g) se obtiene cuando se utiliza el etanol a una concentración del 50%, esto está de acuerdo con las características de la mangiferina (figura 1), que es un polifenol de polaridad media. Figura 18. Contenido de mangiferina extraída en los disolventes evaluados mediante microondas Según se observa en la figura anterior no existen diferencias estadísticamente significativas entre los rendimientos obtenidos para las concentraciones de etanol 30, 50 y 80% debido a que el valor de probabilidad es igual a 0,2839, mayor que 0,05. Los valores del rendimiento de la mangiferina extraída aumentan con el incremento de la concentración de etanol desde 0 (agua) hasta el 50%, donde alcanza su valor máximo. Este resultado coincide con otros trabajos donde emplean igual disolvente para la extracción de compuestos fenólicos. Ejemplos de esto se muestran en la tabla 15 para otros materiales. 56 Resultados y discusión Tabla 15. Compuestos fenólicos extraídos con etanol al 50 % Metabolitos Especie vegetal (Planta) Bibliografía Isoflavonas Glycinemax Rostagno y col., 2007 Rutina Euonymusalatus(Thunb.) Sieb Zhang y col., 2009 Quercetina Cinnamomumzeylanicum Coriandrumsativum Polifenoles totales Cuminumcyminum Gallo y col., 2010 Crocussativus Al utilizar agua como disolvente se obtiene un valor en la extracción de mangiferina de 24,32 ± 0,38 mg/g. No existieron diferencias estadísticamente significativas entre el empleo de este disolvente y el etanol al 50%, que fue el que mejores resultados brindó. El agua es un disolvente no tóxico y barato, comúnmente usado para la extracción de compuestos bioactivos. Además, presenta una elevada constante dieléctrica (78,3), lo que permite que absorba las microondas fácilmente. 3.3.3 Estudio de las variables que influyen en la etapa de extracción de mangiferina mediante la energía de microondas El estudio de las variables que influyen en la etapa de extracción de la mangiferina fue realizado con agua como disolvente de extracción. Se evaluó el efecto de la potencia (X1), el tiempo (X2) y la relación volumen de disolvente/ material vegetal (X3). En todos los ensayos realizados en el diseño experimental se emplearon 10 g de hojas desengrasadas de la variedad Macho de Mangifera indica L. La extracción fue optimizada mediante la metodología de superficie de respuesta. En la tabla 16 se muestran los resultados del diseño experimental Boxh-Benken, que se utilizó. Los valores de mangiferina fueron determinados por CLAR. 57 Resultados y discusión Tabla 16. Resultados de las corridas de las diferentes variantes del diseño experimental de extracción de mangiferina mediante microondas Exp. Tiempo (min) (X1) Relación (ml/g) (X2) Potencia (W) (X3) Contenido de mangiferina extraída (mg / g hojas) 1 1 15 540 10,60 2 3 20 540 18,34 3 1 20 720 10,99 4 1 15 900 10,06 5 3 10 540 11,91 6 5 15 540 12,11 7 1 10 720 10,31 8 5 10 720 15,79 9 3 10 900 15,63 10 5 20 720 15,73 11 3 20 900 14,96 12 5 15 900 17,93 13-15* 3 15 720 14,07 1,53 El análisis de varianza (ANOVA) del modelo de regresión cuadrático muestra que los valores del coeficiente de determinación (R2) y del coeficiente de determinación ajustado (R2ajustado) fueron 86,7 y 76,7%, respectivamente, lo que sugiere un alto grado de correlación entre los valores observados y predichos. La variable de respuesta y las variables objeto de estudio se correlacionan en un polinomio de segundo orden como se muestra en la ecuación 7. Contenido de mangiferina = -33,76 + 2,45*X1 - 1,51*X12 + 0,01*X1*X3 - 0,00669167*X2*X3 (ecuación 7) La figura 19 muestra el diagrama de Pareto (A), la gráfica de efectos principales (B) y los gráficos de superficie respuesta (C) obtenidos para el diseño. 58 Resultados y discusión B A C Figura 19. Análisis de varianza para la variable contenido de mangiferina extraída mediante microondas Los parámetros que tienen influencia significativa para un 95% de confianza, son el tiempo, su relación cuadrática y las interacciones de los factores potencia y relación y tiempo y potencia por ser los valores de probabilidad 0,0004; 0,0214; 0,0187 y 0,0302 respectivamente, menores que 0,05. De acuerdo al gráfico de interacción, se muestra que el tiempo aumenta hasta un valor máximo donde comienza a decaer. Esto puede ser debido a que ocurra una posible degradación de la mangiferina debido al calentamiento interno que provocaría este tipo de energía, ya que el agua contenida en la matriz de la planta absorbe la energía de las microondas lo que provoca, en el interior de las células, el fenómeno conocido como supercalentamiento, (en el agua la velocidad de absorción de la energía de las microondas es mayor que la capacidad de disipación). Este fenómeno de supercalentamiento localizado puede, en algunos casos, promover eficientemente la extracción de los metabolitos por ruptura celular lo que provoca la 59 Resultados y discusión desabsorción de los mismos, y en otros, la degradación de los metabolitos por el intenso calentamiento de acuerdo al régimen de operación que se lleve a cabo. Al tener en cuenta la influencia que ejerce cada uno de los factores estudiados, y según el gráfico de superficie de respuesta, las condiciones más favorables de las evaluadas para llevar a cabo la extracción de mangiferina contenida en las hojas desengrasadas de Mangifera indica L. mediante la EAM, y con el empleo de agua como disolvente son: un tiempo de irradiación de 5 min, una potencia de 900 W y una relación disolvente/ material vegetal de 10 ml/g para un valor máximo de contenido de mangiferina de 18,65±1,53 mg/g. 3.3.3 Estudio del proceso de extracción sólido – líquido de mangiferina mediante el empleo del ultrasonido a baja frecuencia 3.3.3.1 Selección del mejor disolvente de extracción de la mangiferina contenida en el material vegetal En la evaluación de los candidatos a disolventes de extracción se utilizó el agua y mezclas hidroalcohólicas de acuerdo a la naturaleza química del metabolito de interés. En la figura 20 se muestran los contenidos de mangiferina extraída (mg/g) para cada disolvente evaluado. Figura 20. Contenido de mangiferina extraída en los disolventes evaluados mediante ultrasonido Según se observa en la figura anterior, el contenido de mangiferina extraída aumenta hasta una concentración de etanol de 50%, donde alcanza su valor máximo de 13,67 ± 0,44 mg/g, y posteriormente disminuye con el aumento de la concentración de etanol. Esto se debe a las características del metabolito que se extrae, que es un polifenol, de polaridad media. 60 Resultados y discusión 3.3.3.2 Efecto de la relación disolvente-material vegetal en la extracción de mangiferina Los resultados del estudio de la relación disolvente-material vegetal sobre la obtención de mangiferina se muestran en la figura 21. El agua fue seleccionada como el disolvente de extracción como en la tecnología tradicional y como la extracción por microondas para llevar a cabo los estudios preliminares. Figura 21. Comportamiento de la relación en la extracción de mangiferina presentes en las hojas desengrasadas de Mangifera indica L. Como se observa en la figura anterior, a medida que aumenta la relación se incrementa el contenido de mangiferina extraída, que alcanza su valor máximo de 16,33 ± 0,29 mg/g, con la mayor relación estudiada. Este comportamiento es esperado debido a que la extracción ultrasónica es más eficiente cuando la cantidad de disolvente es elevada, ya que se favorece el fenómeno de cavitación. Generalmente, grandes cantidades de disolvente pueden disolver constituyentes más eficientemente, lo que lleva a un aumento del rendimiento de extracción. Sin embargo, esto causa gastos de disolvente y algunos problemas en la siguiente etapa, donde es necesario evaporar para concentrar y disminuir la cantidad de muestra a tratar. Debido a esto, no se trabajó con mayores cantidades de disolvente. 3.3.3.3 Efecto del tiempo en la extracción de mangiferina Para llevar a cabo los estudios cinéticos se utilizó agua como disolvente y una relación volumen de disolvente/material vegetal de 20 ml/g, de forma similar al método tradicional (Sarduy, 2012). La concentración de mangiferina obtenida fue determinada por CLAR. Los resultados del estudio de extracción que se realizó, se muestran en la figura 22. 61 Resultados y discusión Figura 22. Extracción de mangiferina en el tiempo mediante ultrasonido Como se observa en la figura, el porcentaje de extracción de mangiferina se incrementa con el aumento del tiempo de extracción ultrasónica, donde a partir de los 60 min. se alcanza una meseta. El más alto rendimiento alcanzado fue de 1,11 ± 0,26 mg/ml a los 60 min. 3.3.3.4 Estudio de las variables que influyen en la etapa de extracción de mangiferina El estudio de las variables que influyen en la etapa de extracción de la mangiferina fue realizado con 1 g de hojas desengrasadas en cada ensayo. La extracción fue optimizada mediante la metodología de superficie de respuesta. En la tabla 17 se muestran los resultados del diseño experimental rotacional central, que se utilizó. Los valores de mangiferina fueron determinados por CLAR. El contenido de mangiferina extraída, en las condiciones experimentales y de diseño evaluadas, se obtuvo en el intervalo de 9,35 a 24,05 mg/g. 62 Resultados y discusión Tabla 17. Resultados del diseño experimental Concentración de etanol (%) (X3) Contenido de mangiferina extraída (mg/g) Exp. Tiempo (min.) (X1) Relación disolvente/material vegetal (ml/g) (X2) 1 60 45 90 11,60 2 30 30 70 15,77 3 30 60 20 16,82 4 90 60 20 17,55 5 60 70 45 16,50 6 90 60 70 17,91 7 60 45 0 9,59 8 110 45 45 14,28 9 30 60 70 15,43 10 10 45 45 9,35 11 90 30 20 10,80 12 30 30 20 13,20 13 90 30 70 13,52 14 60 20 45 14,20 15-17 60 45 45 24,04 ± 0,01 Mediante la aplicación del análisis de regresión múltiple a los datos experimentales, las variables respuestas y las variables independientes se correlacionan en un polinomio de segundo orden (ecuación 8). Contenido de mangiferina = -30,87 - 0,004*X12 -0,01*X22 - 0,006*X32 (ecuación 8) El análisis de varianza (ANOVA) del modelo de regresión cuadrático muestra que los valores del coeficiente de determinación (R2) y del coeficiente de determinación ajustado (R2ajustado) fueron 83,0 y 72,8% respectivamente, lo que sugiere un alto grado de correlación entre los valores observados y predichos. Los valores de probabilidad fueron utilizados para chequear la significación de cada coeficiente. Los resultados muestran que los términos cuadráticos son los significativos. 63 Resultados y discusión En la figura 23, se muestran el diagrama de Pareto (A), el gráfico de efectos principales (B) y los gráficos de superficie de respuesta (C) obtenidos para el diseño. A B C Figura 23. Análisis de varianza para la variable contenido de mangiferina extraída por ultrasonido a baja frecuencia En el diagrama de efectos principales se observa un incremento del rendimiento de mangiferina con el aumento del tiempo hasta un nivel máximo a partir del cual este rendimiento comienza a decaer, este comportamiento indica que tiempos de extracción muy prolongados pueden provocar la descomposición química de la mangiferina. Aun cuando la EAU se caracteriza por su utilización en el campo de los productos naturales para la extracción de los metabolitos de interés, se ha referido que la composición de algunos metabolitos puede ser deteriorada después de someterla a acción ultrasónica, debido a la 64 Resultados y discusión producción de radicales libres generados por la cavitación. Por esto, es de vital importancia el estudio del mecanismo de degradación ultrasónica de la mangiferina y de otros compuestos de la Mangifera indica L., que no ha sido reportado en la literatura. Con respecto al comportamiento de la concentración de etanol se observa que con el aumento de la misma, hasta un 50%, se incrementa el rendimiento de extracción, pero a partir de este valor máximo el rendimiento comienza a decaer. Esto puede ser explicado por el hecho de que la mangiferina es una xantona (polifenol) con polaridad media y el etanol a una concentración del 50% puede contribuir a su extracción, lo que ha sido observado para muchos compuestos polifenólicos, tales como antraquinonas presentes en la raíz de Morinda citrifolia (Hemwimol y col., 2006) y rutina y quercetina, en Euonymus alatus (Yang y Zhan, 2008). En el gráfico de superficie de respuesta se muestra que las condiciones más para la extracción de mangiferina a partir de hojas de Mangifera indica L. previamente desengrasadas, bajo las condiciones evaluadas, son: tiempo de irradiación 62 minutos, relación volumen de disolvente/ material vegetal de 49 ml/g y una concentración de etanol de 46,8% lo que permite obtener un valor de contenido de mangiferina extraída de 24,16 ± 0,02 mg/g. 3.3.4 Comparación de la EAU y la EAM con tanque agitado para la etapa de extracción de mangiferina Se comparó la eficiencia de la extracción de mangiferina obtenida por ultrasonido y por microondas con el método de extracción en tanque agitado (TA) (Sarduy, 2012). En la tabla 18 se muestran los valores del contenido de mangiferina extraída, el tiempo de extracción y la relación que se tuvo en cuenta para el análisis de los diferentes métodos de extracción. Tabla 18. Comparación de los diferentes métodos de extracción de mangiferina Tipo de extracción Parámetros TA EAM EAU Relación (ml/g) 20 10 49 Tiempo de extracción (min) 120 5 62 Contenido de mangiferina extraída (mg/g) ± DS 18,90 ± 0,40 18,30 ± 1,50 24,16 ± 0,02 65 Resultados y discusión Como se muestra en la tabla, los mayores valores de rendimiento de mangiferina se alcanzan con el método de ultrasonido, aunque con el empleo de la EAM se reducen los tiempos de operación y el consumo de disolvente. La operación con mayor tiempo de extracción en la obtención de mangiferina fue la extracción en tanque agitado y la de mayor consumo de disolvente fue la EAU. Para el contenido de mangiferina no existen diferencias estadísticamente significativas entre el método de extracción por microondas y en tanque agitado ya que el valor de probabilidad es mayor de 0,05 (p=0,5639). Sin embargo, respecto al tiempo en que transcurre la operación, en este caso el proceso de extracción por microondas es 24 veces más rápido en comparación con el método de extracción en tanque agitado. Este resultado confirma lo referido en la literatura que expresa la ventaja de las microondas sobre otros métodos de extracción. Al comparar el método de extracción en tanque agitado con la EAU se observa que con este último se reduce a la mitad el tiempo de extracción y el contenido de mangiferina extraída es mucho mayor, lo que expresa la ventaja del ultrasonido con respecto a métodos tradicionales en cuanto a eficiencia y tiempo de extracción. Desde el punto de vista técnico podemos plantear que el proceso de obtención de mangiferina mediante extracción asistida por microondas se ve favorecido en una reducción de la proporción de disolvente a emplear y en la disminución del tiempo de operación, mientras que los rendimientos obtenidos son similares estadísticamente cuando se compara con el método de extracción en tanque agitado. Si bien el uso del ultrasonido permite la extracción de la mangiferina con elevados rendimientos, no garantiza bajo las condiciones experimentales establecidas, obtener mejoras en cuanto a volumen de disolvente empleado y en cuanto al tiempo respecto al método tradicional y al de microondas. 66 Conclusiones CONCLUSIONES 1. Se realizó la identificación de los componentes presentes en las hojas de mango, las cuales contienen, básicamente, sesquiterpenoides no oxigenados, ácidos fenólicos y como componente mayoritario la xantona mangiferina. 2. Se determinaron las condiciones más favorables para el proceso de extracción de la fracción apolar y de mangiferina a nivel de laboratorio mediante microondas, donde se obtuvieron como parámetros de operación, un tiempo de irradiación de 5 min, una potencia de 900 W y una relación disolvente/material vegetal de 10 ml/g para ambas etapas de extracción. 3. Se determinaron las condiciones más favorables para el proceso de extracción de la fracción apolar y de mangiferina a nivel de laboratorio mediante ultrasonido y se seleccionaron como parámetros de operación para la etapa de extracción de la fracción apolar un tiempo de extracción de 90 min y una relación disolvente/material vegetal de 47 ml/g y para la etapa de extracción de mangiferina se obtuvo un tiempo de extracción de 62 min, una relación disolvente/material vegetal de 49 ml/g y una concentración de etanol del 46,8%. 4. Se comparó la eficiencia de las etapas de extracción de la fracción apolar y de mangiferina para la mejor variante obtenida por ultrasonido y por microondas con el método de extracción establecido en tanque agitado, demostrándose la eficiencia de las microondas sobre ambos métodos, debido al ahorro de tiempo y consumo de disolventes, con lo que se disminuye el impacto sobre el medio ambiente. 67 Recomendaciones RECOMENDACIONES 1. Realizar un estudio de las diferentes variedades de Mangifera indica L. existentes en el lugar de suministro para poder seleccionar la más adecuada para su utilización y establecer el procedimiento apropiado para el proceso de extracción de mangiferina en varias regiones del planeta. 2. Caracterizar, según normas internacionales, el extracto final de mangiferina obtenido por ambos métodos, para un uso más diversificado. 68 Referencias bibliográficas REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Acosta J. (2013). 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Principales compuestos identificados en la fracción de n-hexano Pico Nombre Compuesto Pico Nombre Compuesto 1 Octanal 31 3-Metildibenzotiofeno 2 Dodecanal 32 Metil 13Metilpentadecanoato 3-5 Hidrocarburos saturados 33 Metil 2Metilhexadecanoato 6 2-Butiloctanol 34 3-Eicoseno 7 Pentametilheptilbenceno 35 Hidrocarburo insaturado 8 -Elemeno 36 Metil 10-Octadecenoato 9 -Selineno 37-38 Hidrocarburos saturados 10 -Guaieno 39 Metil 2-Oxohexadecanoato 11 Aromandreno 40 N-fenil-1-naftalenamina 12 -Elemeno 41 Desconocido 13 Bulnesol 42 Esqualeno 14 1-Etildecilbenceno 43 Desconocido 15 Hidrocarburo saturado 44 3-Campesterol 16 Alquilbenceno 45 3,5-4,4-dimetilcolesta8,14-dien-3-ol acetato 17 Ledol 46 Desconocido 18 Alquilbenceno 47 -Sitosterol 19 Hinesol 48 Terpenoide Pentacíclico (Amirina o Oleaneno) 20-25 Alquilbencenos 49 -Amirina 26 Espatulenol 50 D:C-Friedoolean-3-ona ( Multifluorenona ) 27 Nootkatona 51 Cicloartano-3 ,25-diol 28 3,8-Dimetil-4-(1metilideno)-(8S-cis)2,4,6,7,8,8-hexahidro5(1H)-azulenono 52 4-Estigmasten-3-ona 29 1-Octadecenoato 53 24-Metilencicloartanol 30 Hidrocarburo saturado Anexos Anexo 5. Principales compuestos identificados en la fracción de acetato de etilo Pico Componente 1 Ácido hexanoico 2 1,1-Etoxipropoxiethano 3 -Chamigreno 4 Sesquiterpenoide Oxigenado, C15H24O 5 -Selineno 6 -Eudesmol 7 2,5-Dihidroxi--metilfenetil alcohol 8 Derivado del Naftalenometanol (sesquiterpenoide oxigenado, C15H26O) 9 N-fenil-2-naftalenamina 10 Hidrocarburo saturado ramificado Anexos Anexo 6. Principales compuestos identificados en el extracto metanólico y espectros UV y de masa de primer y segundo orden obtenidos Compuesto Monogaloil glucosa (1) Tiempo de retención (min) 3,58 Espectros de masa de primer orden Espectros UV 230 Espectros de masa de segundo orden 271 331 265 250 Wavelength (nm) ácido gálico (2) 4,33 300 80 211 241 169 169 160 240 150 320 200 m/z m/z 270 250 125 169 230 169 125 100 100 124 125.0 150 300 350 Wavelength (nm) 400 100 200 300 400 m/z 600 463 350 400 445 301 500 373 403 137 171 315 343 260 250 125.5 m/z m/z 365 168 450 m/z 475 493 400 160 126 113 125 300 350 Wavelength (nm) 144 152 m/z 583 250 6,66 136 125 230 265 Desconocido (4) 128 150 m/z 161 6,27 300 373 423 ácido fenólico (3) 250 Wavelength (nm) 171 200 500 550 Anexos 295 230 300 400 m/z 320 400 200 250 250 15,04 300 350 Wavelength (nm) 400 100 150 200 m/z 230.0 250 289.2 370.0 250 150 300 565.2 260.0 300 350 Wavelength (nm) 544.6 91.0 471.2 158.8 402.9 100 200 300 400 m/z 500 407 350 205 179 137 151 365 245 137 159 280 Desconocido (9) 300 m/z 400 245 320 235 315 480 317 329 159 179 207 243 240 m/z 400 m/z 289 14,37 160 152 285 313 327 333 405 423 439 240 290 300 350 Wavelength (nm) 144 303 500 261 193 407 285 303 200 235 113 Catequina (8) 128 136 m/z 287 100 300 350 Wavelength (nm) 250 120 407 12,82 112 150 m/z 285 230 250 Iriflofenona 3-C-ß-Dglucósido (7) 153 100 200 m/z 289 400 113 137 159 11,92 300 350 Wavelength (nm) 575 250 Maclurina 3-(2galoil)-ß-D-glucósido (6) 109 153 260 Espectros de masa de segundo orden 287 317 ácido 3,4 dihidroxibenzoico (5) Espectros de masa de primer orden Espectros UV 109 Compuesto Tiempo de retención (min) 8,27 250 445.1 415.1 385.1 343.2 331.1 300 350 565.1 475.0 487.2 400 450 m/z 500 550 Anexos 100 120 151 105 140 160 110 120 130 m/z m/z 255 140 150 331 301 17,80 300 350 Wavelength (nm) 421 250 310 137 275 Mangiferina (11) Espectros de masa de segundo orden 151 235 109 113 Desconocido (10) Espectros de masa de primer orden Espectros UV 91 Compuesto Tiempo de retención (min) 17,31 240 160 240 320 m/z 400 235 360 50 300 350 Wavelength (nm) 100 150 200 m/z 250 300 331 301 160 240 300 350 Wavelength (nm) 160 240 320 m/z 400 315 272 287 315 400 320 272 287 320 360 350 m/z 260 250 250 300 m/z 435 250 137 159 315 19,69 200 179 205 275 Homomangiferina (14) 150 400 435 80 289 400 250 345 300 350 Wavelength (nm) 400 245 19,30 350 m/z 289 250 300 400 255.0 310.0 355.0 Epicatequina (13) 259 271 320 m/z 207 235.0 160 405 18,90 400 301 Isomangiferina (12) 300 350 Wavelength (nm) 421 250 272 301 331 365 403 320 300 350 m/z 400 Anexos 250 150 200 300 573 400 500 200 300 400 m/z 421 259 283 301 331 240 500 400 100 200 300 400 m/z 500 327 175 421 573 405 300 350 Wavelength (nm) 285 159 365 400 480 m/z 235 260 280 320 320 285 100 600 m/z 403 421 435 283 301 331 400 250 421 600 543 300 350 Wavelength (nm) 261.0 m/z 400 m/z 365 381 410 311 106.9 260 250 168.8 218.0 199.1 403 200 400 400 240 320 m/z 387 405 300 350 Wavelength (nm) 350 151.0 320 21,59 300 m/z 342 158 179 479 375 317 329 150 200 m/z 250 573 20,98 200 403 260 280 320 250 Isómero de posición del 6’-O-galoil-mangiferina (19) 100 400 235 250 480 693 20,79 400 261.2 151.1 158.7 181.2 249.0 196.4 132.8 109.4 91.0 300 350 Wavelength (nm) 320 m/z 365 Isómero de posición del 6’-O-galoil-2’-benzoilmangiferina (18) 240 285 250 6’-O-galoil-2’-benzoilmangiferina (17) 160 303 235 80 260 20,34 400 91 Maclurina (16) 300 350 Wavelength (nm) 301 331 250 207 113 91 325 259 269 287 280 Espectros de masa de segundo orden 449 261 235 159 Flavona o Isoflavona (15) Espectros de masa de primer orden Espectros UV 301 405 421 Compuesto Tiempo de retención (min) 20,14 400 480 Anexos 100 200 300 400 m/z 421 403 283 301 331 320 400 480 m/z 260 80 400 80 160 400 80 160 160 240 m/z 320 400 300 350 Wavelength (nm) 240 320 m/z 300 m/z 400 300 260 350 350 m/z 421 235 250 400 400 331 365 389 331 260 320 22,61 200 301 235 250 150 331 400 259 22,50 300 350 Wavelength (nm) 421 250 259 271 301 331 365 Derivado de la mangiferina (23) 240 235 320 Derivado de la mangiferina (22) 500 331 400 301 22,20 300 350 Wavelength (nm) 421 250 259 360 Derivado de la mangiferina (21) 573 421 235 260 280 320 Espectros de masa de segundo orden 301 331 389 389 Isómero de posición del 6’-O-galoil-mangiferina (20) Espectros de masa de primer orden Espectros UV 137 159 Compuesto Tiempo de retención (min) 21,95 250 300 350 Wavelength (nm) 400 200 259 271 403 301 400 259 331 290 350 m/z 301 260 300 400 573 22,85 240 320 m/z 169 272 283 301 331 Isómero de posición del 6’-O-galoil-mangiferina (24) 300 350 Wavelength (nm) 421 250 271 360 331 320 400 600 m/z 800 250 300 350 m/z 400 Anexos 200 403 806 271 400 400 600 800 300 m/z 250 300 240 400 200 320 400 m/z 480 560 211 241 169 403 421 271 301 331 400 400 240 320 m/z 400 255 403 403 24,73 300 350 Wavelength (nm) 350 m/z 275 320 250 373 403 800 343 806 600 260 360 Derivado de la mangiferina (28) 400 m/z 453 200 271 400 573 24,30 300 350 Wavelength (nm) 271 355 259 271 285 301 313 320 6´-O-galoilisomangiferina (27) 400 403 421 255 250 350 m/z 301 331 23,98 300 350 Wavelength (nm) 403 250 259 271 285 301 311 313 320 373 255 360 Derivado de la mangiferina (26) Espectros de masa de segundo orden 403 Derivado de la mangiferina (25) Espectros de masa de primer orden Espectros UV 421 Compuesto Tiempo de retención (min) 23,62 300 600 350 400 m/z 403 255 320 360 250 300 350 Wavelength (nm) 400 200 400 600 m/z 800 259 271 285 301 311 24,90 400 m/z 807 Derivado de la mangiferina (29) 300 350 Wavelength (nm) 403 250 807 360 259 271 285 301 311 320 250 300 m/z 350 400 Anexos 80 160 320 240 400 100 200 300 400 m/z 500 400 80 160 240 320 m/z 400 403 283 400 m/z 480 259 271 320 160 240 320 400 m/z 80 160 240 320 m/z 560 300 350 m/z 400 300 350 Wavelength (nm) 400 400 373 360 313 271 301 255 275 320 259 271 235 250 480 403 400 403 300 350 Wavelength (nm) 400 331 343 359 367 385 403 421 360 259 269 285 299 403 315 350 x 10 313 260 26,55 300 m/z 235 250 250 541 26,10 300 350 Wavelength (nm) 313 331 343 260 250 isómeros de posición de la phidroxibenzoilmangiferina (34) 320 403 235 360 isómeros de posición de la phidroxibenzoilmangiferina (33) 385 300 350 Wavelength (nm) 400 403 250 320 m/z 301 331 245 283 360 445 160 235 260 25,74 400 m/z 310 isómeros de posición de la phidroxibenzoilmangiferina (32) 240 150 171 193 205 216 231 282 297 325 400 541 25,50 300 350 Wavelength (nm) x 10 389 421 355 Espectros de masa de segundo orden 421 265 320 250 Flavonoles o flavonas (31) 403 445 235 301 isómeros de posición de la phidroxibenzoilmangiferina (30) Espectros de masa de primer orden Espectros UV 389 403 421 435 Compuesto Tiempo de retención (min) 25,19 300 350 m/z 400 Anexos 417 260 100 200 300 400 m/z 160 240 m/z 300 500 350 235 255 400 80 250 300 m/z 350 350 m/z 400 200 300 m/z 500 300 400 500 275 100 260 280 320 360 250 300 350 Wavelength (nm) 100 150 200 m/z 250 300 250 350 m/z x 10 109 121 139 235 109 113 137 159 165 28,39 400 150 400 x 10 165 159 365 300 350 Wavelength (nm) 301 260 315 403 269 283 250 343 367 385 403 421 300 400 m/z 235 250 400 207 200 301 100 239 283 301 400 541 28,08 300 350 Wavelength (nm) 403 421 x5 250 Desconocido (39) 200 400 260 325 isómeros de posición de la phidroxibenzoilmangiferina (38) 320 275 235 500 541 27,77 300 350 Wavelength (nm) 403 419 Flavanona o isoflavona (37) 450 259 271 285 313 360 191 272 320 250 400 m/z 403 400 343 27,53 300 350 Wavelength (nm) 403 250 297 360 541 159 305 Flavonoles o flavonas (36) Espectros de masa de segundo orden 555 235 403 417 Flavonoles o flavonas (35) Espectros de masa de primer orden Espectros UV 249 Compuesto Tiempo de retención (min) 26,82 200 m/z 250 Anexos 400 80 320 150 200 403 373 331 240 320 m/z 400 320 400 150 250 300 m/z 300 350 Wavelength (nm) 400 80 160 320 240 m/z 320 283 207 148 165 313 259 240 m/z 200 400 250 300 403 350 350 m/z 235 313 403 250 137 159 360 231 259 273 235 331 219 231 259 269 283 200 403 240 m/z 313 160 309 325 331 80 403 400 121 139 165 331 137 300 350 Wavelength (nm) 403 421 301 500 367 300 400 m/z 367 200 260 305 250 300 350 Wavelength (nm) 80 160 400 200 250 300 m/z 350 403 355 367 191 205 219 231 254 269 283 163 317 305 137 31,10 350 313 100 164 181 192 207 175 207 300 350 Wavelength (nm) 235 250 Flavanona o isoflavona (44) 300 m/z 290 30,63 250 403 250 Flavonoles o flavonas (43) 299 313 331 259 139 400 x 10 310 30,27 240 m/z 240 270 Flavanona o isoflavona (42) 160 301 29,09 300 350 Wavelength (nm) 541 250 219 235 165 260 275 310 271 240 360 Desconocido (41) Espectros de masa de segundo orden 403 Desconocido (40) Espectros de masa de primer orden Espectros UV 301 317 331 Compuesto Tiempo de retención (min) 28,98 Anexos Espectros de masa de segundo orden 255 235 x 10 259 Noratriol (45) Espectros de masa de primer orden Espectros UV 259 Compuesto Tiempo de retención (min) 31,40 32,70 400 100 200 300 m/z 400 80 160 240 m/z 500 200 231 220 m/z 240 367 Flavonoles o flavonas (46) 300 350 Wavelength (nm) 367 250 216 360 187 519 315 235 100 349 258 308 323 350 165 300 m/z 400 500 259 100 150 200 250 m/z 300 350 Wavelength (nm) 400 100 200 m/z 250 301 300 150 257 273 151 259 151 179 150 200 m/z 250 160 250 300 Wavelength (nm) 350 240 m/z 320 150 205 215 173 139 280 247 113 137 147 159 181 x 10 200 250 m/z 367 235 248 273 34,44 247 367 250 113 370 179 235 255 Desconocido (49) 217 192 151 327 200 300 301 33,81 250 m/z 150 290 235 250 300 350 Wavelength (nm) Desconocido (48) 200 320 121 33,52 165 Flavanona o isoflavona (47) 300 350 Wavelength (nm) 259 250 360 519 320 258 260 300 350 Anexos 150 200 250 300 m/z 385 281 291 309 313 325 231 453 400 131 157 175 203 219 385 421 291 240 320 m/z 235 350 x 10 250 m/z 300 350 200 315 250 300 Wavelength (nm) 360 350 100 150 200 m/z 250 350 258 231 255 300 x 10 202 235 250 m/z 339 231 247 258 272 298 150 220 240 m/z 260 273 200 258 41,74 150 273 250 300 350 Wavelength (nm) 151 360 109 320 258 271 275 Desconocido (52) 160 367 37,44 80 300 350 Wavelength (nm) 229 Flavonoles o flavonas (51) Espectros de masa de segundo orden 367 250 355 219 260 305 113 137 159 235 113 137 159 Flavonoles o flavonas (50) Espectros de masa de primer orden Espectros UV 113 137 159 Compuesto Tiempo de retención (min) 35,01