instituto politécnico nacional escuela nacional de medicina y

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR
“PARTICIPACIÓN DE LA PROTEÍNA PTB EN LA REPLICACIÓN DE
ASTROVIRUS 8”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN
CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR
PRESENTA:
LBM. VÉLEZ URIZA DORA EMMA
DIRECTOR DE TESIS:
DRA. MÓNICA ASCENCIÓN DE NOVA OCAMPO
MÉXICO D. F. 30 DE NOVIEMBRE DE 2012
1
2
El trabajo experimental de esta tesis fue realizado en el laboratorio de Virología, de la
Sección de Estudios de Posgrado e Investigación de la Escuela Nacional de Medicina y
Homeopatía (ENMyH) del Instituto Politécnico Nacional (IPN) y en el laboratorio 11 del
Departamento de Bioquímica del Centro de Investigación y Estudios Avanzados del IPN
(Cinvestav) a cargo del Dr. Jesús Valdés Flores.
Esta tesis de maestría se realizó gracias al apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología (CONACyT), con número de proyecto CB-2008-99682.
Proyectos SIP-IPN (20100054,20110182 y 20120790).
Se contó con beca de Maestría del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
CONACYT (Becaria 244629), así como beca Tesis del Instituto Politécnico Nacional
(IPN).
3
AGRADECIMIENTOS
A Aquél que jamás se separa de mi camino y con mano firme y amorosa siempre me ha
guiado y me ha permitido alcanzar cada una de mis metas hasta ahora.
A la Dra. Mónica por darme la oportunidad de desarrollar este proyecto y por todo el
apoyo brindado durante el mismo.
A cada miembro de mi comité y al Dr. Jesús Valdés por el tiempo dedicado a este
trabajo y los consejos dados para mejorarlo.
De manera especial, a la Dra. Cristina por todo el apoyo que me brindó durante este
trabajo, el tiempo invertido y los consejos dados. Muchas gracias.
A todas las personas que participaron en la realización de este proyecto, sin su
colaboración y asesorías no habría igual:
QFB. Matilde García Espitia (Lab. Virología, Sección de Estudios de Posgrado e
Investigación, ENMyH)
Biol. Mariana Salas Benito (Lab. Virología, Sección de Estudios de Posgrado e
Investigación, ENMyH)
Dr. Renato León Rodríguez (Depto. de Biología Molecular y Biotecnología del Instituto
de Investigaciones Biomédicas, UNAM).
QFB. Leticia Aleman (Depto. de Biomedicina Molecular, CINVESTAV)
QBP. José Manuel Galindo Rosales (Depto. de Bioquímica, CINVESTAV).
A mis compañeras de laboratorio Wendy y Tania quienes no solo me apoyaron en lo
laboral sino también en lo personal.
A mis compañeros y amigos de la maestría con quienes recorrí este camino. Gracias por
las risas y las palabras de aliento, se les quiere: Alicia, Angie, Lesly, Liz, Sandrita,
4
Violetita, Víctor Manuel y Toñito y Rafa que, aunque solo estuvieron un tiempo con
nosotros, siempre los recuerdo con mucho cariño.
A Brenda, César y Óscar, gracias por su amistad.
A mis padres que siempre han estado ahí para apoyarnos a pesar de las dificultades que
puedan presentarse. Gracias por ser uno de los pilares más fuertes que se puedan
desear. Gracias por ser más que mis padres y convertirse en mis amigos, de esos que
comparten alegrías y que no solo curaron raspadas de rodillas, sino mejor aún, de
aquellos que curan raspones que el corazón se hace al estar viviendo. No podría haber
elegido mejores padres que no solo me han dado lo mejor de sí, sino que además me
dieron la gran dicha de mis hermanos.
A Carlos y Zhamyr, agradezco todo su amor y apoyo, gracias por ser el otro pilar de mi
vida. Gracias por ayudarme en los momentos difíciles y gracias por ser mis cómplices.
Sin ustedes, definitivamente nada sería igual.
A mi familia en general, porque siempre me han apoyado y me han demostrado el amor
que me tienen.
A mi chaparro, por ser el hombre que siempre me levanta cuando todo parece venirse
abajo. Gracias por aparecerte en mi vida y mil gracias más por permanecer en ella.
A cada uno de mis amigos, por ser parte de esta aventura llamada vida, gracias por
siempre estar ahí a pesar de la distancia y el tiempo. Martín, gracias por convertirte en
esa persona tan especial.
Probablemente se me escape el nombre de alguien, pero le agradezco sinceramente a
cada una de las personas con las que he cruzado mi camino, gracias por los momentos
juntos y porque aún sin saberlo, me han enseñado algo.
5
ÍNDICE
Lista de abreviaturas
……………………….……………………………
9
índice de figuras
……………………….……………………………
11
Índice de gráficas
……………………….……………………………
12
Índice de tablas
……………………….……………………………
12
Resumen
……………………….……………………………
13
Abstract
……………………….……………………………
14
I. Introducción
……………………….……………………………
15
I. 1 Patogenia de la infección ……………..…………………………
17
I. 2 Morfología y organización genómica …………………………
18
I. 3 Ciclo replicativo ………………………..…………………………
20
…………………………………………..…………
22
II. Antecedentes
II. 1 Proteínas celulares involucradas en la replicación......………
22
II. 2 Importancia de las regiones no traducidas ……………………
24
II. 3 Proteína PTB ………………………….…………………………
25
III. Justificación
……………………….……………………………
30
IV. Objetivos
……………………….……………………………
31
………………………………………………
31
…………………………………………
31
IV. 1 Objetivo general
IV. 2 Objetivos específicos
6
V. Estrategia experimental
……………….……………………………
32
VI. Materiales y métodos
……………….……………………………
33
VI. 1 Células y virus
……………….……………………………
33
VI. 2 Infección viral
……………….……………………………
33
...………….……………………………
33
VI. 3 Inmunofluorescencia
VI. 4 RT-PCR de células CaCo-2 infectadas y/o transfectadas
con siRNA
……………….………….……………………………
VI. 5 Ensayos de transfección con siPTB, siGAPDH y siScramble
VI. 6 Obtención de proteínas totales de células CaCo-2
transfectadas
……………….………………………………………
37
39
40
VI. 7 Ensayos tipo Western blot ……….……………………………
41
VI. 8 Remoción de anticuerpos ……………….……………………
42
VI. 9 Ensayo de titulación viral ……………….………………………
42
……………………….……………………………
45
VII. 1 Infección de células CaCo-2 con HAstV-8 …………………
45
VII. 2 Inmunofluorescencia …………….……………………………
46
VII. 3 Transfección de células CaCo-2 no infectadas ……………
50
VII. 4 Silenciamiento de PTB en células no infectadas …………..
51
VII. 5 Silenciamiento de PTB en células infectadas ………………
55
VII. Resultados
7
VII. 6 Titulación de virus en células CaCo-2 transfectadas e
infectadas con HAstV-8 ………………………………………………
57
VIII. Discusión
……………………….……………………………
63
IX. Conclusiones
……………………….……………………………
68
x. Perspectivas
……………………….……………………………
68
Xi. Bibliografía
……………………….……………………………
69
8
LISTA DE ABREVIATURAS
BCA
Ácido bicinconínico
BMV
Virus del mosaico del bromo
BSA
Albúmina de suero bovino
CaCo-2
Adenocarcinoma colo-rectal
cDNA
DNA complementario
DAB
Diaminobencidina
DAPI
4',6-diamidino-2-fenilindol
DENV
Virus Dengue
dNTPs
Desoxirribonucleótidos trifosfato
EDTA
Ácido etilen-diamino-tetra-acético
EMCV
Virus de la encefalomiocarditis
FCV
Calicivirus felino
FITC
Fluoresceina 5-isotiocianato
FMDV
Virus de la fiebre del ratón
GAPDH
Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa
HAstV
Astrovirus humano
HCV
Virus de la hepatitis C
hnRNP I
Ribonucleoproteína heterogénea nuclear I
hpi
Horas post-infección
HRP
Peroxidasa de rábano
IRES
Sitio interno de entrada al ribosoma
ITAFs
Factores trans-IRES
9
kDa
Kilodaltones
mM
Milimolar
NES
Señal de exportación nuclear
NLS
Señal de localización nuclear
nt
Nucleótidos
ORF
Marco de lectura abierta
pb
Pares de bases
PBS
Amortiguador salino de fosfatos
PKA
Proteína cinasa A
PTB
Proteína de unión al tracto de polipirimidina
PV
Poliovirus
RdRp
RNA polimerasa dependiente de RNA
RNAg
RNA genómico
RNAsg
RNA subgenómico
RNT
Región no traducida
RRM
Motivo de reconocimiento de RNA
siRNA
Pequeño RNA silenciador
TBE
Tris boratos EDTA
TGEV
Coronavirus de la gastroenteritis transmisible
VPg
Proteína viral unida al genoma
10
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Micrografía de Astrovirus.
16
Figura 2. Organización genómica de Astrovirus.
18
Figura 3. Ciclo replicativo de Astrovirus.
21
Figura 4. Modelo de la estructura de PTB y de su interacción con el RNA.
26
Figura 5. Silenciamiento de PTB en células Vero disminuye la traducción y
28
replicación de DENV.
Figura 6. Esquema del ensayo para titulación viral.
43
Figura 7. Infección de células CaCo-2 con HAstV-8.
45
Figura 8. Inmunofluorescencia de células CaCo-2 infectadas con HAstV-8.
48
Figura 9. Silenciamiento de PTB en células CaCo-2.
52
Figura 10. Inmunofluorescencia de células CaCo-2 transfectadas.
53
Figura 11. Silenciamiento de PTB en células CaCo-2 transfectadas e infectadas
56
Figura 12. Titulación de sobrenadantes de células CaCo-2 transfectadas e
57
infectadas con HAstV-8
Figura 13. Titulación de HAstV-8.
59
Figura 14. Inmunofluorescencia de células CaCo-2 infectadas.
62
11
ÍNDICE DE GRÁFICAS
Gráfica 1. Densitometría de las bandas obtenidas por RT-PCR de
51
células CaCo2 transfectadas
Gráfica 2. Densitometría de las bandas obtenidas por western blot de
53
células CaCo-2 transfectadas.
Gráfica 3. Densitometría de las bandas obtenidas por western blot de
56
células CaCo-2 transfectadas e infectadas con HAstV-8.
Gráfica 4. Producción de virus en células CaCo-2 transfectadas e
60
infectadas con HAstV-8.
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Descripción de anticuerpos primarios
34
12
RESUMEN
Los astrovirus son virus pequeños, desnudos de entre 28-41 nm, su genoma es de RNA
de cadena sencilla de polaridad positiva (RNAcs+) de aproximadamente 7kb, organizado
en tres marcos de lectura abiertos (ORF1a, ORF1b y ORF2). Contiene dos regiones no
traducidas (RNTs), localizadas en los extremos 5’ y 3’. Diversos estudios han reportado
la interacción de proteínas celulares y virales con las RNTs de los virus de RNAcs +,
participando en diversas funciones virales. PTB, proteína chaperona del RNA implicada
en el metabolismo de éste, es una de ellas. Al respecto, se ha reportado que PTB
participa de manera importante en la replicación y traducción de virus de RNAcs +, como
Dengue o Calicivirus felino. Antecedentes de nuestro grupo predijeron un sitio de unión
para PTB en la RNT 3’ de HAstV-8 y mostraron su presencia en complejos RNAproteínas, por lo que decidimos analizar la participación de PTB en la replicación de
éste. Para ello, se transfectaron células CaCo-2 con un siRNA específico para PTB y un
siRNA irrelevante; 72 horas post-transfección las células se infectaron con HAstV-8 y 15
horas y media post-infección se recuperó el sobrenadante, el cual se tituló para evaluar
la producción de virus. Los resultados mostraron una disminución en los títulos virales
en las células que fueron transfectadas con dos concentraciones del siRNA para PTB en
comparación con el título viral obtenido con las células control transfectadas con el
siRNA
irrelevante.
Este
resultado
se corroboro
mediante
inmunofluorescencia
observándose la perdida de la señal fluorescente de PTB en las células infectadas y
transfectadas con el siRNA para PTB. Estos resultados, sugieren la posible participación
de PTB en el ciclo replicativo de HAstV-8.
13
ABSTRACT
Human Astrovirus (HAstVs) are single-stranded positive RNA virus (ssRNA+), which
includes 5’ and 3’ untranslated region (UTRs). Very little are known about the
participation of these regions in astrovirus replication. Several studies described the
interaction of the viral UTRs with cellular and viral proteins. PTB function as a RNA
chaperone and it has been reported that PTB participate in the replication and translation
of several ssRNA+ viruses. Previous results our group, showed a putative binding site for
the PTB in HAstV-8 3' UTR and the presence of PTB was detected in RNA-protein
complexes from infected CaCo2 cells. To explore the participation of PTB in HAstV-8
viral replication, we using RNA interference and the siRNA- mediated knockdown of PTB
resulted in a reduction in virus titers on transfected and infected CaCo2 cells. Moreover,
to corroborate these results, the immunofluorescence assay was carried out and the PTB
signal was observed diminished only in the CaCo2 cells transfected with PTB-specific
siRNAs. These results suggest the possible involvement of PTB in the replicative cycle
of HAstV-8.
14
INTRODUCCIÓN
La gastroenteritis aguda es una de las causas más comunes en el mundo de infecciones
en humanos. Los virus han sido reconocidos como causa importante de éstas,
particularmente en niños. El agente etiológico más importante en niños menores de 5
años es rotavirus, seguido por astrovirus, calicivirus, y adenovirus entéricos (Wilhelmi, et
al, 2003; Méndez, et al, 2003; Caballero, et al, 2004; Chadwick, et al, 2008). El
perfeccionamiento en los métodos de diagnóstico molecular ha permitido encontrar a
astrovirus como causa de varios brotes esporádicos (Trayner, 1998; Guix, 2005; Victoria,
et al, 2007) y de manera creciente, se le ha reconocido como un importante agente
causal no bacteriano de diarrea en niños (Guix, et al, 2004). Su importancia médica se
estableció inicialmente en estudios a gran escala en Tailandia en 1991, donde mediante
ensayos de inmunoabsorbancia asociada a enzimas (ELISA), en muestras de heces de
niños pequeños, fue detecta la presencia del virus, reconociéndose como la segunda
causa más común de diarrea viral a nivel mundial (Brown, et al, 2008); sin embargo, un
estudio longitudinal en zonas rurales de México demostró que astrovirus es la causa
más común de gastroenteritis infantil, sugiriendo que la prevalencia de diarrea infantil
causada por este virus puede ser muy alta en países en vías de desarrollo (Maldonado,
et al. 1998).
Los astrovirus humanos (HAstVs), fueron descritos por primera vez en 1975 en heces de
recién nacidos con gastroenteritis (Appleton y Higgins , 1975; Madeley y Cosgrove,
1975) y su nombre fue propuesto por estos mismos autores después del análisis de las
de heces mediante microscopía electrónica, observándose la morfología parecida a una
estrella (Fig. 1) (Guix, et al, 2007).
15
Figura 1. Micrografía de Astrovirus. Obtenida con microscopio electrónico, mostrando el diámetro de 28
nm de las partículas virales (Wilhelmi, et al, 2003).
La familia Astroviridae, a la cual pertenecen los HAstVs se divide en dos géneros:
Mamastrovirus, en el cual se agrupan aquéllos virus que infectan a mamíferos, incluido
el hombre, y el género Avastrovirus, en el que se incluyen a los astrovirus que infectan
aves, tales como patos, pollos y pavos (Brown, et al, 2008; Guix, et al, 2007). En la
mayoría de los mamíferos, las infecciones por astrovirus están asociadas a
gastroenteritis,
sin
embargo,
en
las
especies
aviares
se
ha
asociado
con
manifestaciones tanto intestinales como extraintestinales (Méndez y Arias, 2007).
Desde su descubrimiento se han descrito ocho serotipos, siendo el más prevalente a
nivel mundial el serotipo 1 (Caballero, et al, 2004; Guix, et al, 2005; 2007; Finkbeiner, et
al, 2008). Recientemente, en muestras diarreicas humanas se han identificado cinco
nuevas especies de astrovirus altamente divergentes: MLB1, MLB2, VA1, VA2 y VA3
(Finkbeiner, et al, 2009a, b).
16
PATOGENIA DE LA INFECCIÓN
La patogénesis de la infección por astrovirus se ha visto principalmente en intestino
delgado, en las células epiteliales maduras cercanas a la punta de las vellosidades,
principalmente en el yeyuno (Méndez y Arias, 2007). En estudios llevados a cabo en
pavos se ha observado un cambio mínimo en la histología intestinal, a diferencia de lo
provocado por diversos enteropatógenos, además de la ausencia de infiltrados de
células inflamatorias (Koci, et al, 2003), estos eventos han sido reportados también en
infecciones causadas por HAstV en niños inmunocomprometidos (Sebire, et al, 2004).
Un estudio realizado por Quan y colaboradores (2010), mostró por primera vez que
HAstV podría ser el agente etiológico responsable de encefalitis en un niño
inmunocomprometido.
La infección sintomática ocurre principalmente en niños de 6 meses a dos años de edad
y ancianos (Whilhelmi, et al, 2003; Trayner, 1998). Después de 1-4 días del período de
incubación, la infección por astrovirus se presenta típicamente como diarrea acuosa que
se asemeja a una gastroenteritis leve con rotavirus y de corta duración. Puede
presentarse junto con anorexia, fiebre, vómito y dolor abdominal. Generalmente, la
diarrea provocada por estos no resulta grave y se autolimita, sin embargo, en personas
desnutridas, inmunosuprimidas, con infección severa mixta o con alguna enfermedad
gastrointestinal subyacente, se pueden presentar complicaciones. La transmisión de
estos virus es vía fecal-oral, principalmente de persona a persona, aunque puede ocurrir
a través de agua o comida contaminadas (Trayner, 1998; Willcoks, et al, 1994;
Caballero, et al, 2003).
17
MORFOLOGÍA Y ORGANIZACIÓN GENÓMICA
Los HAstV son virus pequeños, no envueltos de 28-41 nm, con apariencia de estrella de
6 picos. Poseen una cápside icosaédrica que contiene al genoma de RNA de cadena
sencilla de polaridad positiva (RNA cs+) de 6.8 a 7.9kb, flanqueado por dos regiones no
traducidas (RNTs), una en el extremo 5’ y otra en el extremo 3’. En su extremo 3’ posee
una cola de poli-A de aproximadamente 30 nucleótidos (nt). Durante la infección en
células susceptibles se observa el RNA subgenómico (RNAsg) de aproximadamente 2.4
kb (Willcocks, et al 1994; Monceyron, et al, 1997; Méndez, et al, 2003; Whilhelmi, et al.,
2003; Caballero, et al, 2004; Al-Mutairy; et al, 2005; Guix, et al, 2005; 2007; Méndez y
Arias, 2007; De Benedictis, et al 2011). Recientemente, Fuentes y colaboradores (2012)
demostraron la presencia de la proteína viral unida al genoma (VPg), en lugar del “cap” y
establecieron que es esencial para la infectividad de HAstV.
El genoma viral está organizado en tres marcos de lectura abiertos (ORFs) sobrelapados
(Fig. 2), que codifican para dos poliproteínas, que posteriormente son procesadas para
generar las proteínas no estructurales y estructurales (Méndez, et al, 2003).
Figura 2. Organización genómica de astrovirus. Los ORFs están indicados con cajas: ORF1a está
representado en color azul, el ORF1b, en color morado y el ORF2, de color rosa. Los números indican la
posición de nucleótidos en el que se localiza cada ORF. Las RNTs se encuentran flanqueando los ORFs.
(Modificada de Willcocks, et al, 1994).
18
Los ORF1a y ORF1b, ubicados en el extremo 5’, codifican para las proteínas no
estructurales como una posible proteasa y la RNA polimerasa dependiente de RNA
(RdRp), involucradas en la replicación, mientras que el ORF2, localizado en el extremo
3’, se encuentra tanto en el RNA genómico (RNAg) como en el RNA subgenómico
(RNAsg) y codifica para las proteínas estructurales (De Benedictis, et al, 2011; Méndez,
y Arias, 2007; Caballero, et al, 2004; Guix, et al, 2005).
Se cree que astrovirus sigue una estrategia similar a la de Alphavirus durante su
replicación. El RNAg es utilizado como templado para sintetizar una cadena de RNA de
polaridad negativa y ésta a su vez, sirve como templado para generar el RNAg y RNAsg
(Méndez y Arias, 2007). Posterior a la infección, a partir del RNAg se traducen dos
poliproteínas: nsP1a y nsP1a/1b, las cuales son procesadas por proteasas virales y
celulares, generando dos proteínas no estructurales maduras, nsP1a de 101kDa y
nsP1a/1b de 160kDa, esta última se traduce mediante corrimiento -1 del marco de
lectura por parte del ribosoma, la cual, una vez procesada, da origen a la RdRp (nsP1b
de 59 kDa), que pertenece al supergrupo 1 RdRp (Lewis, et al, 1994).
De los productos maduros de nsP1a se ha descrito que uno de ellos (nsP1a-3) posee un
motivo de serina-proteasa, un motivo putativo para una RNA helicasa y otro para la
proteína VPg (nsP1a-4). Las proteínas maduras generadas por estas dos poliproteínas,
nsP1a y nsP1a/1b, se propone están implicadas en la replicación del RNA de polaridad
negativa (Guix, et al, 2007).
Por otro lado, el RNAsg es traducido en una poliproteína de 782-794 aa, dependiendo
del serotipo, llamada VP90 que es procesada intracelularmente por proteasas celulares
o por tripsina de manera extracelular y genera a VP70, ésta a su vez, es procesada en
tres proteínas estructurales maduras de 32-34 kDa (VP34), 29-31 kDa (VP29) y 24-26
19
kDa (VP26) (Guix, et al, 2007). Méndez y colaboradores (2002), demostraron que en la
cepa Yuc8, VP90 es procesada en su porción carboxilo terminal dando origen a la
proteína VP70, la cual necesita ser nuevamente procesada para que el virus sea
infectivo. Posterior a la activación in vitro del virus con tripsina, VP70 es procesada en
VP41 y VP28, las cuales son procesadas de manera secuencial hasta originar a las
proteínas que componen al virus infectivo, VP34, VP27 y VP25. Posteriormente, se
describió que la participación de caspasas (caspasas 3, 7, 8 y 9) es importante en el
procesamiento intracelular de esta poliproteína para HAstV-8 (Baños-Lara, et al, 2010).
CICLO REPLICATIVO
Una vez que el virus ha entrado a la célula, probablemente mediante endocitosis
mediada por receptor (Donelli, et al, 1992), el RNAg se traduce en una poliproteína para
generar las proteínas no estructurales, las cuales son detectadas a partir de las 6 horas
post-infección (hpi) (Jang, et al, 2010). Se ha postulado que la RNA polimerasa viral se
asocia a proteínas celulares y virales aún desconocidas para sintetizar el RNA de
cadena negativa, el cual servirá como molde para sintetizar las nuevas cadenas de
RNAg de polaridad positiva. Por otro lado, el RNAsg debe traducirse en una poliproteína
que es procesada para generar a las proteínas de cápside, las cuales posteriormente se
ensamblan para generar las nuevas partículas virales (Fig. 3).
Para HAstV, se ha propuesto que la replicación del RNA viral está asociada a las
membranas del retículo endoplásmico rugoso; recientemente se ha sugerido que como
resultado de la infección con HAstV-8, la célula sintetiza membranas intracelulares
dentro de las cuales se localizan los complejos activos en replicación por lo que dicho
20
proceso al parecer es llevado a cabo en este compartimento celular (Méndez, et al.,
2011, comunicación personal).
Hasta ahora se desconocen las proteínas que conforman al complejo replicativo, lo único
reportado a la fecha es la co-localización de proteínas no estructurales (nsP1a-4) con el
RNA viral y membranas del retículo endoplásmico, sugiriéndose con esta evidencia que
las membranas forman una plataforma de empaquetamiento del RNA viral dentro de las
cápsides ensambladas (Guix, et al, 2004; 2007). Asimismo, poco se conoce acerca de la
regulación de la replicación de astrovirus mediada por factores celulares. Un estudio
reveló que astrovirus activa la cascada de cinasas 1/2 regulada por señales
extracelulares (ERK 1/2) durante la infección y que la inhibición de ERK 1/2 provocaba
la disminución de la replicación viral (Moser y Schultz-Cherry, 2008).
Figura. 3 Ciclo replicativo de Astrovirus. Una vez que HAstV ha entrado a la célula, el genoma es
traducido (1), generando a las proteínas estructurales y no estructurales, posteriormente se forman
complejos proteicos que permiten la replicación del genoma (2) para finalmente ensamblar a las partículas
virales (3).
21
ANTECEDENTES
La replicación de los genomas de virus de RNAcs+ ocurre en complejos asociados a
membranas intracelulares, usualmente en forma de vesículas u otros rearreglos de
membrana. Por ejemplo, Alphavirus utiliza membranas endosomales y lisosomales
(Kaariainen, et al, 2002), el virus del mosaico de bromo (BMV) utiliza membranas del
retículo endoplásmico (Restrepo-Hartwig, et al, 1996), nodavirus utiliza membranas
mitocondriales (Miller, et al, 2001) y los complejos replicativos de poliovirus se forman en
vesículas densas (Rust, et al, 2001). Como se mencionó anteriormente, para HAstV se
ha sugerido que la replicación está asociada a membranas del retículo endoplásmico, en
la región perinuclear (Guix, et al, 2004; 2007).
En los virus de RNAcs+, una vez que han entrado a la célula y liberado su genoma, es
necesario que éste se traduzca para producir las proteínas esenciales que participan en
el complejo replicativo. Todos ellos poseen genes para la RdRp, necesaria para la
replicación (Ahlquist, et al, 2003). Los virus con genomas mayores a las 6 kb, codifican
para una helicasa (Guix, et al, 2007) y en algunos casos para una VPg. Se sabe que en
estos virus, los factores de la célula hospedera juegan un papel importante en la
infección, incluyendo la entrada del virus, la expresión génica viral, el ensamblaje y la
liberación de los viriones (Ahlquist, et al, 2003).
PROTEÍNAS CELULARES INVOLUCRADAS EN LA REPLICACIÓN
Los factores del hospedero pueden mediar la traducción viral o pueden estar
involucrados en la regulación de la traducción de factores específicos virales importantes
para la replicación del RNA, como es el caso de BMV que dirige la replicación del RNA,
22
la transcripción del RNAsg y el ensamblaje de viriones en levaduras, para lo que
requiere de la traducción de una RNA helicasa celular que está asociada a la regulación
de la traducción de la RNA polimerasa viral (Ahlquist, et al, 2003). También se sabe de
interacciones directas entre las proteínas virales y celulares para la formación de los
complejos replicativos, en el caso de BMV y del virus del mosaico del tabaco (TMV), se
ha visto la asociación del factor de iniciación de la traducción eIF3 con la RNA
polimerasa viral (Ahlquist, 2003).
En varios virus de RNAcs+ se ha demostrado que, una vez que se han sintetizado los
factores de replicación, realizan un “switch” entre la traducción y la replicación. Por
ejemplo, en poliovirus, la traducción y síntesis de la cadena negativa de RNA está
coordinada por la interacción entre factores celulares y virales y el RNA viral, incluyendo
una estructura multifuncional con forma de trébol en el extremo 5’; además, durante la
infección con este virus se ha observado la relocalización del núcleo al citoplasma de
ciertas proteínas celulares implicadas en la replicación viral, como la proteína nucleolina
(Ahlquist, et al, 2003). En el virus BMV, para que se dé el cambio de la traducción a la
replicación, el RNAg es reclutado de la traducción a la replicación por la proteína viral
1a, un factor de replicación similar a la helicasa, que actúa en cis sobre elementos de
reconocimiento (REs) en el RNA viral. De manera similar a la estructura en forma de
trébol en el extremo 5’ de poliovirus, RE está localizado en el extremo 5’ del RNA1 y 2
de BMV; sin embargo, el RNA3 contiene un RE interno que al parecer interactúa con el
extremo 5’ (Ahlquist, et al, 2003).
Por otro lado, se ha visto que la relocalización de proteínas hacia las membranas
celulares es importante para la replicación viral. Esta relocalización está dada por la
23
participación de proteínas virales, como en el caso de Alphavirus, donde la proteína
nsP1 dirige a las proteínas nsP2, -3, y -4 hacia las membranas endosomales. En el caso
del virus de la hepatitis C, la proteína NS4A dirige a la proteasa-helicasa viral NS3 a la
región perinuclear del retículo endoplásmico (Ahlquist, et al, 2003).
IMPORTANCIA DE LAS REGIONES NO TRADUCIDAS
Es bien sabido que las RNTs presentes en varios virus de RNAcs+ juegan un papel
importante en la regulación de la replicación y traducción virales, en la estabilidad del
RNA (Monceyron, et al, 1997) y sirven como “blanco” para la unión de proteínas virales y
celulares para el inicio de la replicación, transcripción y ensamblaje viral (Anwar, et al,
2009) y en algunos casos, se ha visto la circularización del genoma mediado por la
complementariedad de secuencias entre las dos RNTs (Khromykh, et al, 2001). Esta
circularización ya se ha descrito en diversos virus como en el bacteriófago Qβ, poliovirus
y flavivirus, por mencionar solo algunos (Herold, et al, 2001; Álvarez, et al, 2008).
En los astrovirus aún no se ha reportado qué estrategia siguen para su replicación y
traducción. Estudios in silico han demostrado que la RNT 3’ está altamente conservada
entre los ocho serotipos que infectan a humanos (Monceyron, et al, 1997; Finkbeiner, et
al, 2008) la cual, al parecer, posee señales requeridas para el reconocimiento por la
polimerasa para la replicación del virus (Willcocks, et al, 1992) lo que permite suponer
que esta región participa de manera importante en estos procesos. En nuestro grupo de
trabajo se modeló la RNT 3’ de HAstV-8 para determinar la posible estructura secundaria
y buscar sitios potenciales de unión a proteínas que pudieran estar involucradas en la
replicación y/o traducción del virus. La predicción mostró una estructura formada por un
24
bucle central conectado a través de dos tallos largos con otros dos bucles más
pequeños en los cuales se encontraron posibles sitios de unión para distintas proteínas
a través de un análisis in silico, entre ellas la proteína celular PTB. Este hallazgo se
convirtió en el blanco a buscar inicialmente por nuestro grupo de trabajo por lo que sé
validó el análisis In silico entrecruzando el RNA de la RNT 3’ marcado radiactivamente y
proteínas de la línea celular CaCo-2, los resultados revelaron la interacción de cinco
proteínas, una de ellas con un peso molecular de 57/60 kDa principalmente en extractos
citoplásmicos de células infectadas que podría corresponder por el peso molecular a
PTB (Espinosa-Hernández, 2012).
PROTEÍNA PTB
La proteína de unión al tracto de polipirimidinas (PTB por sus siglas en inglés) es
conocida también como ribonucleoproteína heterogénea nuclear I (hnRPN I) y se trata
de una proteína celular de unión a RNA implicada en procesos como: splicing, poliadenilación, estabilidad del RNA mensajero (mRNA) e iniciación de la traducción celular
(Kafasla, et al, 2010; Auweter, et al, 2007; Sawicka, et al, 2008). La secuencia consenso
a la cual se une PTB es UCUUC o UUCU/C dentro de un tracto largo de polipirimidinas
(Ashiya y Grabowski, 1997; Pérez, et al, 1997).
Es una proteína de 57 kDa con cuatro sitios de reconocimiento al RNA separados por
tres conectores (RRM1-4) que le permiten interactuar con éste y reestructurarlo (Fig. 4)
promoviendo o inhibiendo así la unión de otros factores, por lo que además de actuar
como chaperona del RNA, puede activar o reprimir el metabolismo de éste; posee una
señal de localización nuclear (NLS) y una señal de exportación nuclear (NES) que le
25
permite translocarse de este compartimento al citoplasma celular en condiciones de
estrés celular tales como infecciones virales, apoptosis, alteraciones en la permeabilidad
del poro nuclear, fosforilación de la proteína cinasa A (PKA) y exposición a agentes
genotóxicos (Auweter, et al, 2007; Sawicka, et al, 2008; Karakasiliotis, et al, 2010).
Asimismo, PTB puede regular la expresión génica en linajes de tejidos específicos
durante el desarrollo (Davis, et al, 2002) y es requerida para la expresión de ciertos
RNAs virales que contienen un sitio de unión interna al ribosoma (Southby, et al, 1999).
Figura 4. Modelo de la estructura de PTB y de su interacción con el RNA. Arreglo espacial de los
cuatro dominios RRM de PTB. La conformación del RNA unido a cada domino RMM se muestra con la
linea sólida azul. La línea punteada indica la posible conexión entre dichos motivos y los giros que da el
RNA para estructurarse.( Tomada de Sawicka, et al, 2008).
El mRNA de PTB, después de ser procesado por “splicing” alternativo, genera 3
isoformas;
la PTB1 está formada por 531 aminoácidos, siendo la isoforma más
pequeña, mientras que PTB2 y PTB4 poseen 19 o 26 aminoácidos más, localizados
entre RRM2 y RRM3, respectivamente. Estas isoformas se expresan a diferentes niveles
de acuerdo al tipo de célula y a pesar de su similitud, se ha demostrado que poseen
actividades diferentes en el “splicing” y en la traducción mediada por IRES virales y
26
celulares. Existe una cuarta isoforma que carece de RRM1 y RRM2 (Auweter, et al,
2007; Sawicka, et al, 2008; Kafasla, et al, 2010).
PTB participa en la traducción de los mRNA virales como en los miembros de la familia
Picornaviridae, donde el reclutamiento del ribosoma ocurre de manera interna a través
de elementos altamente estructurados localizados en el extremo 5’ conocidos como
IRES (Sitio interno de entrada al ribosoma). La interacción entre el IRES y la subunidad
ribosomal 40S es mediada por factores trans e IRES trans-acting factors (ITAFs), siendo
PTB uno de los ITAFs más frecuentes, el cual se ha visto asociado a la traducción por
IRES de mensajeros celulares y virales, como en el virus de la hepatitis A y C, virus de la
encefalomiocarditis (EMCV) y el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV)
(Auweter, et al, 2007; Sawicka, et al, 2008; Anwar et al, 2009).
Se ha descrito que la participación de PTB en la replicación del RNA del virus de la
hepatitis de ratón es necesaria ya que induce cambios conformacionales en el RNA al
unirse a la cadena complementaria de polaridad negativa (Anwar, et al, 2009).
El hecho de que distintos virus de RNAcs+ posean sitios de unión para PTB y cuya unión
sea relevante para regular diversas funciones virales se ha demostrado mediante el
silenciamiento de dicha proteína durante la infección viral. Ensayos realizados con el
virus del dengue serotipo 4 (DENV4) en células Vero, revelaron que la depleción de PTB
mediante siRNAs, reducía los niveles de esta proteína junto con los niveles de partículas
virales sin afectar la traducción del RNA viral, y que su interacción con la proteína no
estructural de DENV4 NS4A, componente de los complejos replicativos, hacían suponer
que PTB forma parte de estos complejos en DENV y que actúa a nivel de la replicación
27
del RNA viral (Anwar, et al, 2009). Por otro lado, Agis-Juárez y colaboradores (2009),
demostraron la participación de PTB como regulador positivo en la replicación y
traducción de DENV en células Vero, ya que al silenciar a esta proteína observaron que
ambos procesos disminuían (Fig. 5).
Figura 5. Silenciamiento de PTB en células Vero disminuye la traducción y replicación de DENV. A)
Células Vero fueron transfectadas con un siRNA específico para PTB o un siRNA irrelevante. B) Células
Vero control o silenciadas en PTB fueron re-transfectadas a las 48 h.p.t. con un replicón DENV-GFP. A las
2 y 96 h.p.t. se evaluó la expresión de GFP mediante microscopía confocal para observar el efecto del
silenciamiento de PTB en la traducción y replicación virales, respectivamente y se encontró una reducción
del 75% en ambos procesos en células Vero transfectadas con el siRNA para PTB (barras grises)
comparadas contra los resultados obtenidos de las células transfectadas con el siRNA irrelevante (barras
blancas). Tomado de Agis-Juárez, 2009.
Hepatitis C (HCV) es otro ejemplo en el cual se ha visto que PTB es capaz de unirse a
ambas RNTs y regular la traducción viral, formando parte del complejo de replicación y
participando en la síntesis del RNA viral, ya que al silenciar PTB, se observó una
reducción en los niveles de RNA viral de un 40-50% (Aizaki, et al, 2006). Estudios
realizados por Chang y colaboradores (2006) en células Huh7 infectadas con HCV,
mostraron que el silenciamiento de PTB provocaba una disminución, tanto en la
producción de proteínas como de RNA virales, y que sólo la forma fosforilada de PTB se
28
asociaba a las proteínas NS3, NS5A y NS5B, las cuales forman el complejo de
replicación.
En 2010, Karakasiliotis y su grupo de trabajo demostraron que PTB interactúa con al
menos dos sitios de unión dentro del extremo 5’ del genoma de calicivirus felino (FCV),
encontrándose que PTB funciona como regulador negativo del inicio de la traducción del
RNA viral, sin embargo, PTB es además requerida para la replicación del genoma viral,
ya que al silenciarla, se observó una disminución en la replicación de FCV. Por otro
lado, se observó la relocalización de PTB del núcleo al citoplasma durante la infección
de FCV en células de riñón felino (CRFK), localizándose parcialmente en los complejos
de replicación viral, lo que sugiere que la unión de PTB puede estar involucrada en el
“switch” de la traducción a la replicación (Karakasiliotis, et al, 2010).
Sola y colaboradores (2011) observaron que la infección con el Coronavirus de la
gastroenteritis transmisible (TGEV) muestra un incremento en los niveles citoplasmáticos
de PTB, el cual provoca un efecto represor sobre la traducción y replicación de este
virus; mientras que al silenciar PTB en dos líneas celulares (Huh7 y 239T), observaron
un incremento de los niveles de RNA y títulos virales, lo que sugiere una represión por
parte de esta proteína en el ciclo replicativo de TGEV (Sola, et al, 2011).
Debido a que no existen antecedentes en la literatura de que PTB esté participando en
la regulación del ciclo replicativo de HAstV-8 y a resultados encontrados en nuestro
laboratorio, decidimos estudiar el papel que tiene PTB en el proceso de replicación viral
silenciando dicha proteína en el contexto de células infectadas con astrovirus humano
tipo 8.
29
JUSTIFICACIÓN
Diversos estudios han demostrado la interacción entre proteínas celulares y virales con
las regiones no traducidas de los virus de RNAcs+. Entre las proteínas celulares está
PTB, proteína chaperona del RNA implicada en el metabolismo de ésta molécula, tanto
de eucariotas como de virus, además de que participa de manera importante en la
replicación y traducción de virus de RNAcs+, como PV, HCV o DENV. En el caso de
astrovirus, no han sido reportadas aún las proteínas celulares y virales que interaccionan
con sus regiones no traducidas, tampoco se sabe con certidumbre cómo se llevan a
cabo los procesos de replicación y traducción y los sitios intracelulares donde se dan
estos mecanismos. Por estudios previos, se ha propuesto que se llevan a cabo en el
citoplasma (Guix, et al, 2004; 2007), cerca de la región perinuclear, donde se han
observado las señales fluorescentes bajo la infección con estos virus.
Dado que en nuestro laboratorio, los estudios in silico, revelaron un posible sitio de unión
para PTB dentro de la RNT 3’ de HAstV-8, y considerando que la circularización del
genoma viral es un evento importante para la replicación, pensamos que estudiar la
participación de PTB en el ciclo replicativo nos permitirá entender mejor la biología del
virus.
30
OBJETIVO GENERAL:
Evaluar la participación de la proteína PTB en la replicación de HAstV- 8
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Silenciamiento de la proteína PTB mediante siRNAs en células CaCo 2 infectadas
con HAstV-8.
Analizar el efecto del silenciamiento de PTB en la replicación de HAstV-8.
31
ESQUEMA DE TRABAJO
Para alcanzar los objetivos planteados anteriormente, se diseñó la siguiente estrategia
experimental.
Cultivo de células CaCo2
siRNA PTB/ siRNA GAPDH/ siScramble
Infectadas con HAstV-8
No infectadas
Extracción de
RNA total
Extracción de
Proteínas Totales
RT-PCR
WB
Inmunolocalización
de PTB
32
MATERIALES Y MÉTODOS
Células y Virus: La línea celular CaCo-2 (adenocarcinoma colo-rectal humano) [ATCC
HTB-37] se mantuvo en cultivos adherentes en medio Advanced-DMEM (medio Eagle
modificado por Dulbecco) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suplementado con 2mM de Lglutamina, 5% de suero fetal bovino (PAA Laboratories, Vélizy-Villacoublay, Fra.) y
antibióticos a 37°C, 5% CO2. Las monocapas se infectaron con la cepa viral Yuc 8
(HAstV-8) donada por el Dr. Ernesto Méndez Salinas (IBT, UNAM) para la obtención de
semillas virales.
Infección Viral: La infección de células CaCo-2 se llevó a cabo en frascos de 75cm2
(Corning) a una confluencia del 80% para la obtención de semillas virales. Previo a la
adsorción del virus a las células, éste se activó con tripsina (100µg/ml) (Invitrogen)
durante una hora a 37°C, posteriormente se agregó inhibidor de tripsina (Sigma-Aldrich
Co,
St.
Louis,
MO,
http://www.sigmaaldrich.com)
(100µg/ml)
para
evitar
el
desprendimiento de la monocapa celular durante la adsorción del virus. Una vez
terminada la adsorción, se retiró el inoculo viral, se lavó la monocapa y se adicionó
medio MEM (medio mínimo esencial) (Invitrogen) sin suero suplementado con
antibióticos. Se incubaron las células durante 18 horas a 37ºC en 5% CO2. Transcurrido
el tiempo, los frascos se sometieron a 3 ciclos de congelación-descongelación y se
recuperó el sobrenadante en alícuotas de 200µl y 500µl, las cuales se almacenaron a 70°C.
Inmunofluorescencia: Para el monitoreo de la infección mediante inmunofluorescencia,
se sembraron 0.4x105 células CaCo-2 por pozo en una placa tipo portaobjetos de cultivo
33
(Chamber Slide System, Nunc), se incubaron a 37ºC, 5% CO 2 y 72 horas después se
infectó con HAstV-8. 18 horas post-infección se eliminó el medio y se lavaron las células
con PBS 1X (NaH2PO4 1.92mM; Na2HPO4 8.1mM; NaCl 154mM; pH 7)- NH4Cl 50mM.
Posteriormente las células se fijaron con paraformaldehído (Sigma) al 2.5% durante 40
minutos a temperatura ambiente, se lavaron 4 veces con PBS 1X- NH4Cl 50mM y se
permeabilizaron con Tritón X-100 al 0.5% en PBS 1X- BSA 1%- NH4Cl 50mM durante 15
minutos a temperatura ambiente, se lavaron nuevamente con el mismo buffer. Las
células permeabilizadas se bloquearon con 1% BSA preparada en el mismo buffer de
lavado (PBS 1X- NH4Cl 50mM) durante una hora a temperatura ambiente y una vez
transcurrido este tiempo se incubó con los anticuerpos α-HAstV AHP1361, α-HAstV
MCA2716 y como control se agregó el anticuerpo TYVD durante 1 hora a temperatura
ambiente (Tabla 1). Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS 1X-1% BSA- 50mM
NH4Cl. Enseguida las células se lavaron 7 veces con PBS 1X, 50mM NH 4Cl, se agregó
el anticuerpo secundario correspondiente: cabra α-conejo acoplado a Alexa-Fluor 568
IgG (H+L) 2mg/ml (Invitrogen) dilución 1:500 en PBS 1X, 1%BSA, 50mM NH 4Cl para los
anticuerpos TYVD y α-HAstV policlonal AHP1361 y el anticuerpo secundario cabra αratón IgG (H+L) acoplado a FITC (Invitrogen) para el anticuerpo α-HAstV monoclonal
MCA2716, se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron 7 veces. Se
retiró el soporte plástico de los portaobjetos de cultivo y se cubrió la monocapa con un
cubreobjetos en presencia de medio de montaje para fluorescencia VECTASHIELD
(Vector
Laboratories,
Inc.,
Burlingame,
CA,
USA,
http://www.vectorlabs.com)
conteniendo 4’,6-diamino-2-fenilindol (DAPI), se selló con barniz y se observaron en un
microscopio de fluorescencia OLYMPUS IX70.
34
En los ensayos en los que se evaluó el nivel de silenciamiento de PTB sobre las células
CaCo-2 transfectadas y posteriormente infectadas con HAstV-8, se siguió el mismo
protocolo y las células se incubaron con el anticuerpo policlonal anti-hnRNPI (Invitrogen)
a las 15 horas y media post-infección.
35
Anticuerpos utilizados:
Tabla 1. DESCRIPCIÓN DE ANTICUERPOS PRIMARIOS.
Conejo α-HAstV
No. Referencia
AHP1361
CQFG
TYVD
Casa comercial
AbD Serotec
Méndez , et al, 2004
Méndez, et al, 2004
Especificidad
Todo los HAstV
Proteínas de la cápside
Proteínas de la cápside
Tipo
Policlonal
Policlonal
Policlonal
Clona
----
----
----
Isotipo
IgG policlonal
Inmunógeno
Pool de HAstV 1, 2 y 4
Dilución
IF: 1:50
IF: 1:50
IP: 1:100
IF: 1:50
IP: 1:100
* Los anticuerpos TYVD y CQFG fueron donados por el Dr. Ernesto Méndez Salinas (IBT, UNAM)
Tabla 1. DESCRIPCIÓN DE ANTICUERPOS PRIMARIOS. (Continuación).
Ratón α-HAstV
α-PTB
No. Referencia
MCA2716
32-5000
Casa comercial
AbD Serotec
Invitrogen
Especificidad
Epítope 8E7 del
ORF 2 de HAstV
Extremo carboxilo
de PTB humana
Tipo
Monoclonal
Clona
α-hnRNPI
α-Actina
sc-16547
sc-7210
Santa Cruz
Biotechnology
Péptido de la región
N-terminal de
hnRPNI humana
Santa Cruz
Biotechnology
Aminoácidos
180-375 de
actina humana
Monoclonal
Policlonal
Policlonal
8E7
7
----
----
Isotipo
IgG1
IgG1 murino
igG
IgG
Inmunógeno
HAstV 2
PTB humana
recombinante
hnRPNI humana
recombinante
Dilución
IF: 1:100
IP: 1:100
WB: 1:1000
IF: 1:75
WB: 1:1000
36
RT-PCR de células CaCo2 infectadas y/o transfectadas con siRNA: A partir de
células CaCo-2 no infectadas e infectadas con HastV-8 y transfectadas con los
siGAPDH, siScramble y siPTB se extrajo RNA total por el método de TRIzol (Invitrogen)
siguiendo las especificaciones del proveedor. Con el RNA obtenido se realizaron
ensayos de RT-PCR con el kit One-Step RT-PCR (Qiagen, Düsseldorf, Ger,
http://www.qiagen.com) en presencia de los oligonucleótidos Mon 269 y Mon 270 que
amplifican una región altamente conservada del ORF2 de astrovirus (nucleótidos 4526 a
4974) generando un fragmento de 449 pares de bases (pb) (Noel, 1995), la amplificación
de este fragmento nos permitió confirmar la infección; para monitorear la integridad del
RNA se utilizaron los oligonucleótidos para GAPDH que amplifican un producto de 300
pb.
Secuencias de los oligonucleótidos utilizados:
Mon 269: 5’- CAA CTC AGG AAA CAG GGT GT -3’
Mon 270: 5’- TCA GAT GCA TTG TCA TTG GT -3’
GAPDH (Forward): 5’- CAT CTC TGC CCC CTC TGC TGA -3’
GAPDH (Reverso): 5’- GGA TGA CCT TGC CCA CAG CCT -3’
La mezcla de reacción se preparó como sigue: Buffer 5X (Qiagen), dNTP´s (10mM c/u)
(Qiagen), 10 µM de cada oligonucleótido Mon/269- Mon/270 y GAPDH (forward y
reverso), 1µl de enzima (Qiagen), 20 U de RNasin (Promega, Madison, WI, USA,
http://www.promega.com), 1µg de RNA total (5µl) y se llevó a un volumen final de 25µl
con agua libre de nucleasas.
La amplificación se realizó bajo las siguientes condiciones: un ciclo de desnaturalización
del RNA en agua libre de nucleasas a 70ºC durante 5 minutos y después 3 minutos en
hielo, se adicionó la mezcla de reacción. Se incubó a 50ºC 30 minutos (RT), seguido de
37
un ciclo de 94°C 15 minutos para desnaturalizar los híbridos cDNA-RNA. La
amplificación se continuó a 94°C 30 segundos, 55°C 30 segundos, para ORF2 y 68°C
para GAPDH, 72°C 1 minuto durante 35 ciclos para el monitoreo de infección y 25 ciclos
para el análisis de la transfección, y un ciclo de extensión de 72°C 5 minutos y un ciclo
final a 4 °C. La reacción de amplificación se realizó en un Mastercycler personal
(Eppendorf) y los productos resultantes se analizaron en un gel de agarosa al 0.8%
utilizando como amortiguador TBE 0.5X (Tris base, ácido bórico, EDTA, pH 8.3) y teñido
con bromuro de etidio.
Para la obtención de RNA y proteínas totales a partir de células transfectadas se utilizó
el kit AllPrep DNA/RNA/Protein (Qiagen). Para la estandarización de los ensayos de
transfección, se utilizó el RNA obtenido con este método y se sintetizó cDNA
(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit, Roche, Basel, SUI, http://www.roche.com)
el cual sirvió como templado en ensayos de PCR en presencia de los oligonucleótidos
GAPDH-F y GAPDH-R. Como controles se utilizó el RNA extraído de células
transfectadas con el siRNA Scramble.
La síntesis de cDNA se llevó a cabo con un ciclo de desnaturalización a 80°C durante 5
minutos con 1µg de RNA total, random primer (60µM) a un volumen final de 13µL en
agua libre de nucleasas. Posteriormente se agregó la mezcla de reacción que contiene:
buffer de reacción 5x (Roche), inhibidor de RNasa, dNTP’s a 10 mM (Roche), enzima RT
(Roche). La mezcla se incubó a 50°C durante una hora y enseguida se sometió a un
ciclo de 10 minutos a 85°C para inactivar los dúplex de DNA-RNA. El cDNA obtenido se
guardó a 4°C hasta su utilización.
38
Para la PCR, la mezcla de reacción se realizó como sigue: buffer de PCR 10X, dNTP’s
10 mM (Roche), MgCl2 20 x 30mM, 10µM de cada oligonucleótido, 5 µL de cDNA, 0.2µL
de amplificasa (Taq polimerasa) y se llevó a un volumen de 25µl.
La amplificación se sometió a las siguientes condiciones: un ciclo de 5 minutos a 94°C,
25 ciclos de 94°C por 30 segundos, 68°C durante 30 segundos y 72°C 30 segundos,
luego se sometió a un ciclo de extensión de 72°C 5 minutos y finalmente un ciclo de 4°C.
Los productos se analizaron en un gel de agarosa al 1% corrido en TBE 0.5% (Tris base
44.5mM; Ác. bórico 44.5 mM; EDTA 1.25mM) y teñido con bromuro de etidio.
Una vez obtenidos los amplificados de PCR, se midió su concentración por
densitometría y se normalizó utilizando como referencia el resultado obtenido a partir de
RNA total de células transfectadas con el siRNA irrelevante.
Ensayos de transfección con siPTB, siGAPDH y siScramble: Se transfectaron 5 x
105 células siguiendo el protocolo diseñado especialmente para células CaCo-2 y las
especificaciones del kit Amaxa (Lonza; www.lonza.com/nucleofection-citations) para
asegurar una eficiencia de transfección de hasta 60%, ya que se ha reportado que esta
línea celular tiene la característica de ser difícil de transfectar (Clayburgh y Turner. 2005;
Uduehi, et al, 1999). Para la estandarización se utilizó un siGAPDH, como control para la
normalización un siScramble, y el de interés el siPTB (secuencia diseñada por Ambion);
los siRNA para GAPDH y PTB fueron obtenidos de Ambion (Texas, USA), se probaron
dos siRNAs con secuencias aleatorias uno de Ambion y el siScramble (Scramble High
Stealth RNA, Invitrogen) donado por la Dra. Cristina Vélez del Valle. Los siRNA se
resuspendieron en agua libre de nucleasas a una concentración de 100µM, se dividieron
en alícuotas y se conservaron a -70ºC.
39
Para la transfección, se tomaron las células a una confluencia del 60-75% después del
subcultivo en frascos de 75 cm2 (2-3 días). Para ello, se cosecharon las células por
tripsinización, se contaron y se centrifugaron 5 x 105 células a 90 xg por 10 min a
temperatura ambiente, se removió por completo el sobrenadante y se resuspendió el
botón celular cuidadosamente en 100µl de solución Nucleofector a temperatura
ambiente. Se agregó el siRNA correspondiente a las células (siScramble, siGAPDH y
siPTB) (160nM, 2.5µM y 5µM). La solución células/siRNA se transfirió a cubetas
certificadas y se electroporó con el programa Nucleofector B-024. Una vez
electroporadas las células, se agregó inmediatamente 500µl de medio de cultivo preequilibrado a 37°C, se tomaron 10µl y se realizó una dilución 1:10 con azul de tripano
0.4% (Gibco) para contar las células vivas en hemocitómetro; de este conteo se
sembraron 1.9x105 células en placas de 24 pozos y 0.8 x 105 en un portaobjetos de
cultivo (Chamber Slide System, Nunc), las cuales se incubaron a 37°C, 5% CO2, se
monitorearon a las 24 h y se cambió el medio a las 48h. De la multiplaca de 24 pozos se
extrajo RNA total y proteínas totales después de 48 y 72h para el análisis del
silenciamiento mediante ensayos de RT-PCR y Western Blot mientras que el
portaobjetos de cultivo se utilizó para los ensayos de inmunofluorescencia para evaluar
el silenciamiento de PTB.
Obtención de proteínas totales de células CaCo-2 transfectadas: Para evaluar la
eficiencia de transfección y silenciamiento con los diferentes siRNAs, se obtuvieron
extractos totales de proteína con el kit AllPrep DNA/RNA/Protein (Qiagen) siguiendo las
especificaciones del proveedor. Los extractos obtenidos se cuantificaron con ácido
bicinconínico (660nm Protein Assay) (Pierce, Rockford, IL USA) y la integridad de las
40
proteínas se verificó en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 10% (SDS-PAGE)
los cuales fueron teñidos con azul de coomassie. Los extractos se guardaron a -20°C
hasta su uso.
Ensayo tipo western blot: Se utilizaron 10-20 μg de las proteínas obtenidas de los
ensayos de transfección par el análisis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al
10% y se separaron a 120 volts en buffer de corrida para proteínas (192mM de Glicina,
0.1% de SDS, 25mM Tris-base). Al término de la electroforesis, el gel y la membrana de
nitrocelulosa se equilibraron durante 20 minutos en buffer de transferencia (25mM TrisBase, 192mM de Glicina, 20% de metanol). Posteriormente, el gel se transfirió en una
cámara de transferencia semi-seca (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) durante 45 minutos a
25V. La membrana se tiñó con rojo de Ponceau (1% de rojo de Ponceau, 1% de ácido
acético glacial) para verificar la eficiencia de transferencia. La membrana se bloqueó con
leche Casec (Nestle Nutrition) al 5% en PBS1X-0.5%Tween-20 durante 2h a
temperatura ambiente, se lavó 6 veces con PBS1X-0.5%Tween-20, enseguida la
membrana se incubó con el anticuerpo α-PTB, (Tabla 1) diluido en PBS 1X-0.5%Tween20, toda la noche a 4°C en agitación suave. Al día siguiente se lavó la membrana 6
veces con PBS1X-0.5%Tween-20 y se incubó con el anticuerpo cabra anti-ratón
IgG+A+M (H+L) (1:5000) acoplado a peroxidasa de rábano (Santa Cruz Biotechnology,
Santa Cruz, CA, USA) por 2 horas a temperatura ambiente, se lavó 6 veces con PBS1X0.5%Tween-20 y se reveló por quimioluminiscencia (Super Signal West Pico
Chemiluminescent Substrate, Pierce).
41
Remoción de anticuerpos: Después del revelado de la membrana con el anticuerpo αPTB, se incubó la membrana por 30 minutos con el buffer de lavado (100 mM 2βMercaptoetanol; 2% SDS, 62.5mM Tris-HCl pH 6.7) a 50°C en agitación para eliminar
ambos anticuerpos, al término de la incubación se realizaron dos lavados con PBS 1xTween 20 0.5% durante 10 minutos y la membrana se bloqueó nuevamente con leche
Casec (Nestle Nutrition) al 5% en PBS1X-0.5%Tween-20 por dos horas a temperatura
ambiente, se lavó 6 veces con PBS1X-0.5%Tween-20 e inmediatamente se incubó con
el anticuerpo α-Actina (Tabla 1) diluido en PBS 1X-0.5%Tween-20, toda la noche a 4°C
en agitación suave. Al día siguiente se lavó la membrana 6 veces con PBS1X0.5%Tween-20 y se incubó con el anticuerpo cabra anti-conejo IgG (H+L) (1:5000)
acoplado a peroxidasa de rábano (ZYMED) por 2 horas a temperatura ambiente, se lavó
6 veces con PBS1X-0.5%Tween-20 y se reveló por quimioluminiscencia (Super Signal
West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce).
Ensayo de titulación viral: Para evaluar el efecto del silenciamiento de PTB sobre la
producción de virus, 72h post- transfección con los siRNAs: Scramble y PTB, se
infectaron estas células con un pool de las semillas virales generadas con el protocolo
de infección descrito previamente. A las 15 horas y media post-infección se recolectó el
sobrenadante de las células transfectadas e infectadas y se guardó a -70°C hasta su uso
para la titulación de virus medida como focos infecciosos.
Para la titulación de los virus obtenidos después de infectar las células transfectadas, se
sembraron 2X104 células CaCo-2 en una placa de 96 pozos de fondo plano, se
incubaron 3-4 días a 37°C, 5% CO2 hasta llegar a confluencia. Se prepararon diluciones
en base 10, desde 100 hasta 107, por duplicado con el sobrenadante obtenido de células
42
transfectadas e infectadas en una placa de 96 pozos con fondo en “U” siguiendo el
esquema de la figura 6. Estas diluciones se activaron con tripsina (200µg/µl) y se
incubaron 1 h a 37°C, posteriormente se agregó el inhibidor de tripsina de soya 1%.
FIGURA 6. Esquema del ensayo para titulación viral.
La monocapa celular se lavó dos veces con medio MEM sin suero, se retiró el medio de
la multiplaca escurriendo sobre papel absorbente y se agregaron 50 µl en cada pozo de
la dilución viral según el esquema antes mencionado y se incubó durante 1 h a 37, 5%
CO2. Transcurrido el tiempo de infección, se retiró la dilución y se agregó medio MEM sin
suero y con antibióticos y la multiplaca se incubó 15 horas y media a 37°C, 5% CO2.
Transcurrido el tiempo, se fijó la monocapa celular con de 50 µl de paraformaildehido al
4% durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron las monocapas con PBS 1x
y se bloqueó con BSA 1%-PBS 1X durante una hora a temperatura ambiente,
posteriormente se agregó el anticuerpo α-HAstV MCA2716 (Tabla 1) diluido en BSA1%PBS1x (1:100), se incubó 90 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se lavó 5
veces con 30 µl de PBS 1X-NP40 0.1% y se agregó el anticuerpo cabra α-ratón
acoplado a peroxidasa de rábano (Santa Cruz Biotechnology) dilución 1:500 y se incubó
43
90 minutos a 37ºC, al finalizar la incubación se lavó con PBS 1X-NP40 0.1% 5 veces y
se adicionó la solución de tinción de diaminobencidina (DAB) al 0.05% (Tris-HCl 0.05 M
pH 7.4, H2O2 0.015%) y se incubaron durante toda la noche en oscuridad a temperatura
ambiente para permitir la formación de un precipitado de color marrón en el fondo de
cada pozo. La presencia del precipitado marrón indicó que el ensayo transcurrió sin
problemas, las monocapas se lavaron con PBS 1X y para detener la reacción, la
multiplaca de 96 pozos se lavó con agua corriente y después con agua destilada, el
exceso de agua se retiró sobre papel absorbente. Los núcleos se contratiñeron durante
15 minutos con hematoxilina de Harris recién filtrada, se enjuagó con agua corriente y
se agregó hidróxido de amonio a una dilución 1:1000 durante 10 segundos, se lavó con
agua destilada y se contaron las células infectadas con la dilución 107 y teñidas en cada
pozo por duplicado en un microscopio óptico Eclipse TS 100 (Nikon).
El titulo viral se obtuvo aplicando la siguiente fórmula: UFF/µl = [(UFF*10*DILUCIÓN) *
1000 /Volumen de dilución] / Células sembradas, en donde UFF/µl corresponde a las
unidades formadoras de focos infecciosos por microlitro. El título viral se expresó en
UFF/ml.
44
RESULTADOS
Infección de células CaCo-2 con HAstV-8
Para evaluar la participación de la proteína celular PTB en la replicación de HAstV-8, se
generaron seis semillas virales de la cepa Yuc 8 (HAstV-8) las cuales se usaron para los
ensayos de infección de las células transfectadas con los diferentes siRNAs.
Dicha producción se evaluó por RT-PCR a partir de la extracción de RNA total de las
células CaCo2 infectadas con HAstV-8 (18 hpi); como control se obtuvo RNA total de
células no infectadas. Lo primero que se hizo fue verificar la integridad del RNA extraído
de las dos condiciones experimentales seleccionadas amplificando un fragmento de 300
pb que corresponde al gen para GAPDH (Fig. 7, panel A, carriles 3 a 5). Con este
mismo RNA se realizó el ensayo de RT-PCR en presencia de los oligonucleótidos que
amplifican un fragmento de 449pb del ORF2 de astrovirus, el cual se observó
únicamente en el RNA que proviene de las células infectadas (Fig. 7, panel B, carril 4)
como se esperaba y no se observó ningún fragmento en el ensayo realizado con el RNA
de las células no infectadas (carril 3). Los carriles 2 de ambos paneles corresponden a
los controles negativos de la reacción de RT-PCR (Fig. 7).
45
A)
B)
Figura 7. Infección de células CaCo-2 con HAstV-8. A) A partir del RNA total de células no infectadas
(carril 3) e infectadas (carriles 4 y 5) se realizó un ensayo de RT-PCR en presencia de oligonucleótidos
específicos para GAPDH (carriles 3-5). Carril 2, control negativo de la RT-PCR. B) RT-PCR a partir de
RNA total proveniente de células no infectadas (carril 3) e infectadas (carril 4) con los oligonucleótidos
Mon269 y Mon270; carril 2 control negativo de la reacción. Los productos amplificados correspondientes
se indican con flechas en el lado derecho de cada gel. El carril 1 corresponde al marcador 100pb DNA
Ladder (BioLabs). Los productos obtenidos se analizaron en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro
de etidio.
Inmunofluorescencia
Aun cuando en laboratorio se disponía de dos sueros hiperinmunes específicos para
HAstV-8 que reconocen a la cápside del virus (CQFG y TYDV), ambos probados
previamente en el laboratorio (Acosta, 2011), su cantidad no iba a ser suficiente para
llevar a cabo los ensayos de inmunofluorescencia con las células transfectadas e
46
infectadas para evaluar el silenciamiento de PTB; por ello decidimos evaluar la
inmunoreactividad de dos anticuerpos comerciales dirigidos contra otros serotipos de
astrovirus que infectan a humanos por ensayos de inmunofluorescencia y de esta
manera encontrar la dilución adecuada para los ensayos posteriores (Tabla 1).
Se partió de 0.4x105 células CaCo-2 por pozo las cuales se infectaron a las 72 horas de
la siembra. Al siguiente día se incubaron, tanto células no infectadas como infectadas,
con el anticuerpo correspondiente (TYVD, 1:50; AHP1361, 1:100; MCA2716, 1:60) y el
anticuerpo secundario adecuado (1:500) para realizar la inmunofluorescencia.
Para validar los resultados de los anticuerpos comerciales probados, se usó el suero
TYVD como control positivo, con el cual se observó el típico marcaje perinuclear
característico de la infección con el virus (Fig. 8, panel inferior derecho) y ninguna señal
en las células no infectadas que fueron incubadas sólo con el anticuerpo secundario,
como se esperaba (Fig. 8A).
Cuando se analizó el resultado de la inmunofluorescencia realizada con el anticuerpo
policlonal AHP1361 (Fig. 8, panel B), se observó marcaje alrededor de los núcleos
ligeramente disperso en el citoplasma solamente en las células infectadas sugiriendo
que este anticuerpo policlonal parece reconocer a las células infectadas con HAstV-8.
Mientras que el anticuerpo monoclonal MCA2716 (Fig. 8, panel C), mostró un patrón de
“agregados” discretos en el citoplasma en las células infectadas similares a los
observados con el anti -TYDV (panel A) indicándonos que éste también parece
reconocer a HAstV-8.
Al comparar los resultados con ambos anticuerpos comerciales (paneles B y C), se
determinó que la señal marcadamente perinuclear del anticuerpo MCA2716 fue más
47
clara y parecida al del anti-TYVD que se usó como control positivo por lo que decidimos
usar este anticuerpo para los ensayos de titulación viral.
A)
B)
48
C)
Figura 8. Inmunofluorescencia de células CaCo-2 infectadas con HAstV8. A) Células CaCo-2 no
infectadas e infectadas fueron incubadas con los anticuerpos α-TYVD (1:50); B) α-HAstV AHP1361
(1:100), ambos con cabra α-conejo acoplado a Alexa-Fluor 568 (1:500); C) α-HAstV MCA2716 (1:100) y
cabra α-ratón acoplado a Alexa-Fluor 568 (1:500). Los núcleos se tiñeron con DAPI y las laminillas se
observaron en un microscopio de epifluorescencia OLYMPUS IX70.
49
Transfección de células CaCo-2 no infectadas
La participación de la proteína PTB en la replicación de HAstV-8 la evaluamos
silenciando la expresión de la proteína en el contexto de células infectadas usando un
siRNA específico para el gen de PTB, usamos además un siRNA Scramble como control
no relacionado y para normalizar los resultados obtenidos. Para ello, estandarizamos las
condiciones de transfección sin la condición de infección, tomando en cuenta que la
eficiencia es baja en células CaCo2 según lo reportado en la literatura (Clayburgh y
Turner, 2005; Uduehi, et al, 1999). Probamos diferentes concentraciones de dos siRNAs
(según recomendaciones del proveedor), uno para GAPDH y un siRNA Scramble
evaluando la eficiencia de transfección mediante RT-PCR. Para ello se extrajo RNA
total a las 48 y 72 horas post-transfección, se cuantificó y se usó 1µg de RNA para una
reacción de RT-PCR con oligonucleótidos específicos para un fragmento de 300 pb del
gen de GAPDH. Como control negativo de la RT-PCR se preparó la mezcla de reacción
sin RNA.
Para determinar el porcentaje de silenciamiento de GAPDH
se realizó el análisis
densitométrico de cada banda con el software GelQuant Express DNR BIO (Imaging
Systems Ltd), normalizando el valor del amplificado a partir de RNA de células
transfectadas con siGAPDH con respecto al control no relacionado que corresponde al
siRNA Scramble. El resultado obtenido reveló que las células transfectadas con 2.5 µM
para el siGAPDH a las 72 h post-transfección
mostró una reducción del 33% del
producto de RT-PCR con respecto al valor obtenido
para el siRNA irrelevante
considerándose este como el 100% (160nM), por lo que utilizamos estas condiciones
para el silenciamiento de PTB (Gráfica 1).
50
S IL E N C IA M IE N T O G A P D H
U n id a d e s A r b it r a r ia s
50000
s iS c r a m b le
s iG A P D H
40000
30000
33%
20000
10000
0
s iS c r a m b le
s iG A P D H
Gráfica 1. Densitometría de las bandas obtenidas por RT-PCR de células CaCo2 transfectadas. A
partir de los fragmentos amplificados mediante RT-PCR, las bandas se analizaron por densitometría con el
software GelQuant Express DNR BIO (Imaging Systems Ltd). Los valores obtenidos están dados en
unidades arbitrarias y el porcentaje de silenciamiento de GAPDH se muestra sobre las barras.
Silenciamiento de PTB en células no infectadas
Una vez definida la concentración de siRNA y tiempo para evaluar el nivel de
silenciamiento, se transfectaron células CaCo-2 con 2.5 y 5 µM del siRNA para PTB y
160nM del siRNA Scramble. Sin embargo, para el primer ensayo, se utilizó la
concentración de 5µM para el siRNA Scramble ya que se realizó en paralelo a la
estandarización con el siRNA GAPDH. A las 72 horas post-transfección se extrajeron
RNA total y proteínas de las mismas muestras y se evaluó el silenciamiento de PTB por
western blot (Fig. 9); el RNA obtenido se guardó a -70°C. El resultado de western blot
en presencia de un anticuerpo monoclonal α-PTB reveló la presencia de una banda muy
intensa de 57kDa en los extractos de las células transfectadas con el siRNA irrelevante
(5µM) (carril 1) y otra banda de aproximadamente 60kDa y que podría corresponder a
una de las isoformas reportadas para PTB (Wollerton, M, et al, 2004; Jin, W, et al, 2000;
51
Bothwell, A. L. M, et al, 1991; Johnson, 1998). En el caso de las células transfectadas
con 2.5µM del siPTB se observó una disminución en la intensidad de ambas bandas 57
y 60kDa (carril 2); mientras que las células transfectadas con 5 µM del siPTB, no se
observó ninguna de las dos isoformas de PTB (carril 3) sugiriendo el silenciamiento de
PTB con ambas concentraciones de siPTB (2.5 y 5µM).
Para validar el resultado anterior, la misma membrana se incubó con el anticuerpo αActina como un control de carga interno, previa remoción del anticuerpo α-PTB. El
resultado reveló la presencia de una banda de 43 kDa en todos los carriles
correspondiente al tamaño esperado (Fig. 9, panel inferior).
Figura 9. Silenciamiento de PTB en células CaCo-2. Extractos totales de proteínas obtenidos de células
CaCo-2 transfectadas con 5µM de siScramble (carril1); 2.5µM y 5µM de siPTB (carriles 2 y 3
respectivamente) se incubaron con un anticuerpo monoclonal α-PTB (panel superior) y con el anticuerpo
policlonal α-Actina (panel inferior). Los valores mostrados debajo de cada panel corresponden al análisis
densitométrico para cada banda. Se normalizó usando las bandas de las células transfectadas con el
siScramble.
Para obtener el porcentaje de silenciamiento de PTB, las bandas se analizaron por
densitometría con el software GelQuant Express DNR BIO (Imaging Systems Ltd) y los
datos mostraron un silenciamiento del 51% con el siPTB a 2.5µM y del 92% con el siPTB
a 5µM del gen para PTB (Gráfica 2).
52
S IL E N C IA M IE N T O P T B
U n id a d e s A r b it r a r ia s
100
s iS c r a m b le
s iP T B 2 .5  M
80
s iP T B 5  M
60
51%
40
20
92%
0
s iS c r a m b le
s iP T B 2 .5  M
s iP T B 5  M
Gráfica 2. Densitometría de las bandas obtenidas por western blot de células CaCo2 transfectadas.
A partir de los resultados de western-blot mostrados en la figura 12, las bandas proteicas se analizaron por
densitometría con el software GelQuant Express DNR BIO (Imaging Systems Ltd). Los valores obtenidos
están expresados en unidades arbitrarias y el porcentaje de silenciamiento de PTB se muestra sobre las
barras.
Por otro lado, se analizó el silenciamiento de la proteína PTB por inmunofluorescencia,
transfectándose células CaCo-2 con los siRNAs correspondientes: Scramble (160nM) o
PTB (2.5 o 5 µM) y 72 h.p.t. las células se incubaron con el anticuerpo α-hn RNP I (1:50)
y el anticuerpo secundario acoplado a FITC (1:50).
El resultado mostró una señal intensa en el núcleo de las células transfectadas con el
siRNA irrelevante (Fig. 10, panel superior) mientras que en las células transfectadas con
las dos concentraciones del siRNA para PTB (2.5 y 5µM) puede verse la señal nuclear,
sin embargo ésta se encuentra notablemente disminuida en ambos casos (Fig. 10,
paneles medio e inferior) corroborando de esta manera el silenciamiento de PTB
evaluado por western blot.
53
Figura 10. Inmunofluorescencia de células CaCo-2 transfectadas. Panel superior, células
transfectadas con un siRNA irrelevante; panel medio, células transfectadas con 2.5 µM de siRNA para
PTB, panel inferior, células transfectadas con 5µM de siPTB. Todas las células fueron incubadas con los
anticuerpos α-hn RNP I (1:50) y burro-α-cabra acoplado a FITC (1:50). Los núcleos se tiñeron con DAPI y
las laminillas se observaron en un microscopio de epifluorescencia OLYMPUS IX70.
54
Silenciamiento de PTB en células infectadas
Una vez establecidas las condiciones de silenciamiento para PTB en células CaCo-2 no
infectadas, se realizaron los ensayos de infección en un contexto de silenciamiento para
observar su efecto sobre la replicación de HAstV-8. Para ello se transfectaron células
CaCo-2 con 160nM de siRNA irrelevante,
2.5 y 5µM de siPTB y a las 72h post-
transfección se infectaron las células con un “pool” de virus. Transcurridas 15 horas y
media post-infección, se colectó el sobrenadante de cada condición experimental y se
cuantificó la producción de virus mediante un ensayo de titulación.
De las monocapas de células transfectadas e infectadas se extrajeron RNA y proteínas
totales; el RNA fue almacenado a -70°C y las proteínas fueron analizadas por western
blot (Fig. 11).
El resultado mostró la presencia de la banda de 57kDa en los extractos de células
transfectadas con el siRNA irrelevante e infectadas que corresponde a PTB (carril 1), así
como la disminución de la señal para PTB en ambas condiciones de silenciamiento (2.5
y 5 µM de siPTB); sin embargo esta disminución fue mayor en los extractos obtenidos de
células transfectadas con 2.5µM de siPTB que con 5µM (carriles 2 y 3), este resultado
posiblemente se debe a que el efecto del silenciamiento de PTB a la concentración
mayor del siRNA disminuyó debido al tiempo post-transfección (96 h aproximadamente)
en comparación con las 72 horas a las cuales se evaluó el silenciamiento en los ensayos
previos. Esta posibilidad de “perder” el silenciamiento, se ha observado en otros
sistemas, en los cuales se ha reportado que las células necesitan re-transfectarse para
mantener el efecto del siRNA según sea el caso (Agis-Juárez, et al, 2009).
55
Figura 11. Silenciamiento de PTB en células CaCo-2 transfectadas e infectadas con HAstV-8.
Extractos totales de proteínas de células CaCo-2 transfectadas e infectadas con HAstV-8 se analizaron
por western blot con el anticuerpo monoclonal α-PTB (panel superior) y con el anticuerpo policlonal αActina (panel inferior). Carril 1, células transfectadas con 160nM de siScramble; carril 2, células
transfectadas con 2.5µM de siPTB; carril 3, células transfectadas con 5µM de siPTB. Los valores
mostrados debajo del panel superior corresponden al análisis densitométrico para cada banda. Se
normalizó con el resultado de células transfectadas con el siScramble.
Este ensayo también se analizó por densitometría normalizando con el resultado de
células transfectadas con el siRNA Scramble. Los datos mostraron una reducción en la
expresión de PTB del 90% en células transfectadas con 2.5µM de siPTB y del 72% para
las transfectadas con 5µM, todas ellas infectadas con HAstV-8 (Gráfica 2).
S IL E N C IA M IE N T O P T B
U n id a d e s A r b it r a r ia s
80
s iS c r a m b le
s iP T B 2 .5  M
60
s iP T B 5  M
40
72%
20
90%
0
s iS c r a m b le
s iP T B 2 .5  M
s iP T B 5  M
Gráfica 3. Densitometría de las bandas obtenidas por western blot de células CaCo-2 transfectadas
e infectadas con HAstV-8. A partir de los resultados de western-blot mostrados en la figura 13, las
bandas proteicas se analizaron por densitometría con el software GelQuant Express DNR BIO (Imaging
Systems Ltd). Los valores obtenidos están dados en unidades arbitrarias y el porcentaje de silenciamiento
de PTB se muestra sobre las barras.
56
Titulación de virus en células CaCo-2 transfectadas e infectadas con HAstV-8.
El efecto del silenciamiento de PTB en la replicación de HAstV-8 se evaluó
cuantificando la producción de partículas virales por titulación. Se infectaron células
CaCo-2 con distintas diluciones preparadas con el sobrenadante recuperado de las
células transfectadas e infectadas. Se consideró la señal de infección como positiva por
la formación de un precipitado marrón en el fondo de la multiplaca de 96 pozos y que
corresponde a un foco infeccioso, ya que astrovirus no lisa las células. El esquema de
titulación que se siguió se muestra en la figura 12.
Figura 12. Titulación de sobrenadantes de células CaCo-2 transfectadas e infectadas con HAstV-8.
Se infectaron células CaCo-2 con diferentes diluciones del sobrenadante de células transfectadas con
siRNA Scramble (SN Scramble) y siRNA para PTB a 2.5 y 5µM (SN PTB) infectadas con HAstV-8, las
cuales se incubaron con el anticuerpo α-HAstV MCA2716. El control negativo corresponde a células no
infectadas incubadas con los dos anticuerpos (Células NI).
La formación del precipitado marrón se obtuvo con el anticuerpo α-HAstV MCA 2716
(Tabla 1), y el anticuerpo cabra α-ratón IgG+A+M (H+L) (1:500) acoplado a peroxidasa
de rábano (Santa Cruz Biotechnology). Este complejo se reveló con Diaminobencidina
57
(DAB). Las monocapas se contratiñeron con hematoxilina y se contaron las células
infectadas con la dilución 107 en un microscopio óptico Eclipse TS 100 (Nikon) (Figura
13). Se tomaron 50 campos de cada pozo y se cuantificaron los focos infecciosos con
los cuales se calculó el título viral siguiendo la fórmula {[(UFF*10*DILUCIÓN) * 1000
/Volumen de dilución] / Células sembradas}. Los resultados se graficaron (Gráfica 4).
58
Figura 13. Titulación de HAstV-8. A partir de sobrenadante de células CaCo-2 transfectadas e infectadas
con HAstV-8, se prepararon distintas diluciones y se infectaron nuevamente monocapas de células CaCo2. A las 15 hpi las células se incubaron con los anticuerpos α-HAstV MCA2716 (1:100) y α-ratón-HRP
(1:500); el inmunocomplejo se tiñó con DAB. Las monocapas se contratiñeron con hematoxilina. Células
no infectadas (A y B) como control negativo. Células infectadas con sobrenadante de células
transfectadas con siScramble (C y D). Células infectadas con sobrenadante de células transfectadas con
2.5µM (E y F) y 5µM de siPTB (G y H).Las monocapas celulares fueron fotografiadas a dos aumentos (4x
y 20x) en un microscopio óptico Eclipse TS 100 (Nikon). Los precipitados marrón corresponden a células
positivas a la infección por HAstV-8.
59
T IT U L A C IÓ N V IR A L
3 .0  1 0
7
T ít u lo V ir a l ( U F F / m l )
s iS c r a m b le
s iP T B 2 .5  M
2 .0  1 0
7
1 .0  1 0
7
s iP T B 5  M
0
s iS c r a m b le
s iP T B 2 .5  M
s iP T B 5  M
Grafica 4. Producción de virus en células CaCo2 transfectadas e infectadas con HAstV-8. A partir
del ensayo de titulación por DAB, se contaron los focos infecciosos para cada condición experimental
(siScramble y 2.5µM / 5µM siPTB) y se obtuvo el título viral para cada uno de estos Los resultados se
graficaron y corresponden a un ensayo realizado por duplicado.
Los resultados mostraron una disminución considerable en la producción viral en
aquellas células que fueron infectadas con el sobrenadante obtenido de las células
transfectadas con el siPTB a dos diferentes concentraciones (2.5µM y 5µM), el título viral
obtenido fue de ~ 7x106 UFF/ml y ~ 8x106 UFF/ml, respectivamente comparados con el
título viral de las células infectadas con el sobrenadante de células transfectadas con el
siRNA irrelevante (~ 1.8x107UFF/ml). Los resultados de la reducción en el título viral
debido al silenciamiento de PTB en células CaCo-2 sugiere la posible participación de la
proteína en la replicación de HAstV-8.
El efecto del silenciamiento de PTB en la infección por astrovirus también fue valorado
por inmunofluorescencia. Para ello se sembraron 0.8x105 células CaCo-2 por pozo en un
portaobjeto de cultivo y se infectaron con diferentes diluciones del sobrenadante de
células transfectadas e infectadas. A las 15 horas y media post-infección, las células
fueron incubadas con el anticuerpo α-HAstV MCA 2716 (1:100) (Tabla 1) y como
anticuerpo secundario se utilizó el cabra α-ratón acoplado a Alexa-Fluor 568 (1:500).
60
En todas las condiciones experimentales se observó el marcaje perinuclear
característico de la infección por HAstV, sin embargo, en aquellas células que fueron
infectadas con el sobrenadante proveniente de células transfectadas con el siPTB a 2.5
µM e infectadas, se observó disminución en el número de células marcadas en un 57%
(Fig. 14, panel medio), esto mismo se observó en aquellas células infectadas con el
sobrenadante de células transfectadas con 5µM del siPTB, la disminución fue de 43%
con respecto a las células control (Fig. 14,panel inferior) que
corresponden a
las
células infectadas con el sobrenadante de células transfectadas con el siRNA Scramble
(Fig. 14, panel superior). Con estos resultados corroboramos los resultados de la
titulación de focos infecciosos con DAB, lo que apunta fuertemente a que la proteína
PTB tiene un papel importante en la replicación de HAstV-8.
61
Figura 14. Inmunofluorescencia de células CaCo-2 infectadas. A partir de sobrenadante proveniente
de células CaCo-2 transfectadas e infectadas con HAstV-8, se infectaron monocapas de células CaCo-2.
A las 15h.p.i. las células se incubaron con los anticuerpos α-HAstV MCA2716 (1:100) y α-ratón acoplado a
Alexa-Fluor 568 (1:500). Panel superior, células infectadas con sobrenadante de células transfectadas con
un siRNA irrelevante, panel medio, células infectadas con sobrenadante de células transfectadas con 2.5
µM de siRNA para PTB, panel inferior, células infectadas con sobrenadante de células transfectadas con
5µM de siPTB. Los núcleos se tiñeron con DAPI y las laminillas se observaron en un microscopio de
epifluorescencia OLYMPUS IX70.
62
DISCUSIÓN
Los virus de RNAcs+ y polaridad positiva tienen la habilidad de formar estructuras
secundarias altamente ordenadas que contribuyen a su estabilidad y a la participación
en interacciones inter e intramoleculares. Estas estructuras, llamadas elementos de RNA
que actúan en cis, se encuentran involucradas tanto en interacciones RNA/RNA como
en la unión con proteínas virales y celulares durante los procesos de traducción,
replicación del RNA y encapsidación. Muchos de los elementos de RNA que actúan en
cis se localizan en las regiones no traducidas 5’ y 3’ (Liu, et al, 2009) como en poliovirus
el cual posee una estructura de trébol en la región 5’ requerida para el inicio de la
síntesis de las cadenas negativas de RNA (Barton, et al, 2001) o los flavivirus, en los
que permiten la circularización del genoma por complementaridad de las secuencias
entre ambas RNTs (Khromykh, et al, 2001).
Por otro lado, también se requieren elementos en trans como factores celulares y virales
que permiten la modulación de la interacción entre las RNTs, reportado en varios virus
de RNA (Lai, 1998). Uno de estos elementos en trans es la proteína celular PTB, la cual
se une al RNA y se encuentra involucrada en el metabolismo de esta molécula, como el
“splicing” alternativo, estabilidad del mRNA e iniciación de la traducción celular (Kafasla,
et al, 2010; Auweter, et al, 2007; Sawicka, et al, 2008). Esta proteína se ha encontrado
involucrada en el ciclo de replicación de diferentes virus de RNAcs+, como PV, DENV,
FCV, entre otros (Auweter, et al, 2007; Sawicka, et al, 2008; Anwar et al, 2009).
63
Astrovirus, es un virus de RNAcs+, del cual se conoce muy poco acerca del mecanismo
que sigue para replicarse dentro de su célula blanco, el enterocito. Las evidencias
experimentales apuntan a que, al igual que sucede con otros virus, su replicación se
lleva a cabo en el citoplasma, muy probablemente asociado a complejos membranales
cercanos al retículo endoplásmico rugoso, lo que hace pensar que no sólo los
mecanismos que utiliza son semejantes a los descritos para otros virus, sino que los
componentes celulares podrían ser similares.
Al respecto, se desconocen qué elementos en trans participan en la replicación viral de
astrovirus por lo que para responder esta pregunta, en nuestro grupo de trabajo, se
realizaron estudios in silico de las regiones que se consideran el blanco para el
reconocimiento de factores celulares y/o virales indispensables para la replicación,
encontrándose un sitio de unión para la proteína celular PTB en la RNT 3’ de astrovirus
8 (Espinosa, 2010), por lo que decidimos evaluar la participación de esta proteína en su
ciclo replicativo. Para ello, se silenció el gen que codifica para PTB mediante un siRNA
específico en células CaCo-2 infectadas y se evaluó el efecto del silenciamiento en el
ciclo replicativo, cuantificando la producción de virus cuando PTB se encuentra
disminuida en las células infectadas con HAstV-8.
Para lograr nuestro objetivo, fue necesario estandarizar las condiciones de transfección
para las células CaCo2 debido a que está bien establecido en la literatura que esta línea
celular tiene una baja eficiencia de transfección (Clayburgh y Turner, 2005; Uduehi, et al,
1999). Después de probar distintas condiciones experimentales con los siRNAs
seleccionados, tales como probar diferentes concentraciones de siRNAs, distinta
64
cantidad de células por ensayo y distintos tiempos post-transfección, se logró un buen
nivel de silenciamiento para PTB evaluado mediante western blot en células CaCo-2 a
las 72 horas post-transfección con 2.5 M del siRNA específico para PTB en las dos
condiciones experimentales probadas, es decir, en el contexto de células no infectadas e
infectadas. Sin embargo en los ensayos en donde se evaluó el silenciamiento de PTB a
5M en el contexto de células infectadas (Fig.11, gráfica 3), se observó que la
interferencia de PTB se disminuyó, es decir, el análisis densitométrico de las bandas
obtenidas mediante
western blot con el anticuerpo α-PTB
mostró un menor
silenciamiento de esta proteína (72%) en comparación al valor encontrado con la
concentración de 2.5 M (90%). Creemos que este comportamiento se debe a que las
células tras haber sido transfectadas (72h) y después infectadas (15 hpi), comenzaron a
perder el silenciamiento del siPTB y por ello se observó una “recuperación” de la
expresión de PTB; este comportamiento se ha observado en otros sistemas en donde se
silencian genes a través de siRNAs y para mantener su efecto las células son retransfectadas (Agis-Juárez, et al, 2009). Para las células CaCo-2 no fue posible hacer
esto debido a que el daño provocado por el impulso eléctrico al que fueron sometidas
para la entrada de los siRNA fue demasiado agresivo y el porcentaje de células muertas
después del pulso fue muy alto como para considerar la posibilidad de re-transfectarlas.
Una vez silenciada PTB e infectadas las células con HAstV-8, se titularon los virus para
evaluar la participación de PTB en el ciclo viral de astrovirus y lo que se observó fue que
aquellas células en las que se silenció PTB, la producción de virus se redujo de manera
considerable con ambas concentraciones de siPTB seleccionadas, es decir, la reducción
fue de un orden de magnitud (~ 7x106 UFF/ml y ~ 8x106 UFF/ml, respectivamente)
65
comparado con el título calculado para las células transfectadas con un siRNA
irrelevante (~ 1.8x107UFF/ml).
La
confirmación
de
estos
resultados
la
observamos
en
los
ensayos
de
inmunofluorescencia (Fig. 14), los cuales mostraron la disminución en el número de
células infectadas al utilizar tanto el sobrenadante de las células transfectadas con
2.5µM del siRNA para PTB como el sobrenadante de células transfectadas con 5µM de
siRNA PTB con respecto a aquellas infectadas con el sobrenadante provenientes de las
células control.
En diversos estudios realizados en virus de RNAcs+ se ha demostrado la participación
de la proteína celular PTB en el ciclo replicativo viral, ya sea en la replicación del RNA,
en la traducción o en ambos procesos, como lo demostraron Agis-Juárez y
colaboradores (2009) en DENV, donde al silenciar a esta proteína en células Vero
lograron observar una disminución en ambos procesos, es decir, la interferencia de PTB
en la infección por dengue reduce tanto la traducción como la replicación de este. Otro
ejemplo es lo observado en FCV, donde al silenciar PTB en células CRFK la replicación
viral se redujo de manera importante (Karakasiliotis, et al, 2006); posteriormente este
mismo grupo encontró que PTB funciona como un regulador negativo de la traducción
de FCV (Karakasiliotis, et al, 2010), proponiendo un modelo en el que postulan que la
traducción de las proteínas virales comienza al inicio de la infección hasta que PTB se
transloca hacia el citoplasma, con lo que se disminuye la traducción y da inicio la
replicación del genoma viral.
Los resultados obtenidos en los ensayos de silenciamiento de PTB e infección con
HAstV-8 en células CaCo-2 realizados en este trabajo, apuntan a la participación de
dicha proteína en el ciclo replicativo de HAstV-8, principalmente a nivel de replicación del
66
RNA viral. Esto podría deberse a que, al unirse PTB a la RNT 3’ de astrovirus humano 8,
el genoma viral adquiere una conformación que le permite interactuar con otras
proteínas virales y celulares, permitiendo el inicio de los procesos antes mencionados o
permitiendo el “switch” entre la traducción y la replicación del RNA viral, como se ha
visto ocurre en otros virus de RNAcs+.
Por otro lado, datos del laboratorio no publicados, han permitido establecer la unión de
PTB a la RNT 5' y análisis in silico realizado con las dos RNTs, mostró que estas
regiones reguladoras son complementarias y los sitios de unión para PTB se ubican uno
frente al otro a cada lado del genoma viral, sugiriendo fuertemente que PTB podría estar
funcionando como chaperona para el reclutamiento del complejo replicativo para
modular el “switch” entre la traducción y la replicación de este virus, esta posibilidad se
está explorando en nuestro laboratorio.
67
CONCLUSIONES
Utilizando el siRNA comercial, se logró el silenciamiento específico de la proteína PTB
en un 71% tanto en células CaCo-2 no infectadas e infectadas con HAstV-8.
El silenciamiento de la proteína PTB en células infectadas con HAstV-8, redujo en un
orden de magnitud la producción de virus comparada con las células transfectadas con
un siRNA irrelevante
La interferencia de PTB en células CaCo-2, apunta a que esta proteína participa como
regulador positivo en el ciclo de replicación de astrovirus 8.
PERSPECTIVAS
Evaluar a qué nivel del ciclo replicativo de astrovirus 8 se encuentra participando PTB.
Analizar mediante RT-PCR la síntesis de cadenas negativas virales
en células
transfectadas con el siRNA para PTB para evaluar si el silenciamiento tiene un efecto a
nivel de la replicación del RNA viral.
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