universidad nacional autónoma de méxico
Anuncio
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Material didáctico en apoyo a la asignatura de Bacteriología - Virología Coordinadores M. en C. Gloria Zita Padilla M. en C. Marcos Espadas Reséndiz Autores M. en C. Gloria Zita Padilla M. en C. Marcos Espadas Reséndiz Ing. Asunción Martínez Vázquez Con la colaboración de: Biól. Javier Hernández Estrada F. E. S. CUAUTITLÁN SEMESTRE 2007 – 1 INDICE PROGRAMA DEL CURSO DE BACTERIOLOGÍA – VIROLOGÍA ……..………………………………. 4 MANUAL DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGÍA …………………………….…………..…..…………25 IDENTIFICACIÓN INICIAL DE GÉNEROS COMUNES DE BACTERIAS FITOPATÓGENAS ……… 46 DIAPOSITIVAS UTILIZADAS EN CLASE …………………………………………………………..………58 NORMAS OFICIALES MEXICANAS DE IMPORTANCIA FITOBACTERIOLÓGICA ………………….. 85 2 AGRADECIMIENTOS A Lorena, Diana, Rogerio y Alejandro por su invaluable apoyo para la elaboración de este trabajo Los Autores 3 FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AGRICOLAS PROGRAMA DEL CURSO DE BACTERIOLOGÍA - VIROLOGÍA PROFESORES: M.C. MARCOS ESPADAS RESENDIZ M.C. BIOL. GLORIA ZITA PADILLA ING. ASUNCIÓN MARTÍNEZ VÁZQUEZ SEMESTRE 2007-I 4 PERFIL: El curso de Bacteriología - Virología corresponde al Módulo de Tecnología Agrícola, de la Orientación de Agroecosistemas, en el área de Protección Vegetal de la carrera de Ingeniería Agrícola. Se imparte en el noveno semestre y proporciona 3 créditos, con tres horas de teoría y prácticas semanales y tiene como prerrequisitos haber acreditado Seminario V (Fitopatología). INTRODUCCION: El curso de Bacteriología-Virología Agrícola profundizará en diferentes aspectos de estas áreas, como son: Importancia e Historia, Morfología y Fisiología, Purificación e Identificación, Sintomatología, Epifitiología y Control. El curso se complementará con prácticas de Laboratorio y Campo; tratándose de integrar el aspecto teórico-práctico tanto en virus como en bacterias. OBJETIVOS GENERALES: - El alumno profundizará en las áreas de Virología y Bacteriología en los siguientes aspectos: - Comprenderá adecuadamente las técnicas más comunes en la purificación e identificación de este grupo de patógenos. - Diferenciará los daños ocasionados por estos grupos de patógenos. - Diferenciará adecuadamente el ciclo de estas enfermedades. - Discriminará entre los mecanismos de control más efectivos para este grupo de patógenos. EVALUACION: El curso es teórico práctico y cada una de sus partes tiene el siguiente valor: Seminario de bacterias 30% Seminario de virus 30% Prácticas 40% 5 TEMA No. 1 Generalidades de Microorganismos B A C T E R I O L O G I A TEMA No. 2 INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA OBJETIVOS PARTICULARES: - Se documentará en estadísticas de las pérdidas ocasionadas por bacterias. - Describirá el desarrollo histórico de la bacteriología - Agrupará a estos patógenos según diferentes criterios establecidos. CONTENIDO: Importancia: en la ciencia, en la naturaleza, en la agricultura (ejemplos de pérdidas originadas por enfermedades bacterianas a nivel nacional e internacional). Definición. Historia. Distribución. Clasificación. Nomenclatura. BIBLIOGRAFIA: 1. Bigee, D.C. 1993. Bacterial plant pathology cell and, molecular aspects. 322 p. 2. Dawson, W.J. 1970. Plant Diseases due to Bacteria. Cambridge Univ. Press. 232 p. 3. Fucikovsky, Z.L. 1981. Curso de Bacterias Fitopatógenas. C.P. y U.A.Ch. Chapingo, Méx. 6 4. López Fuentes Ma. Cristina. 1994. Los caminos de la Fitobacteriologia. Universidad Autónoma Chapingo. Mexico. TEMA No. 3 MORFOLOGIA y ECOFISIOLOGIA OBJETIVOS PARTICULARES: - Reconocerá la morfología y estructura de las bacterias. - Relacionará las características morfológicas y fisiológicas de estos patógenos con la capacidad de causar enfermedades en las plantas. CONTENIDO: Forma, agrupamiento y tamaño. Estructura: cápsula, pared celular, membrana, flagelos, fimbras, mesosomas, ribosomas, material nuclear, vacuolas e inclusiones. Fisiología: nutrición. Medios de cultivo. Respiración. Reproducción. Factores ecológicos: humedad, temperatura, luz, pH, presencia de otros organismos. BIBLIOGRAFIA: 1. Bradbury J.F. 1986. Guide to Plant Pathogenic Bacteria. CAB International Mycological Institute. England. 2. Clewell D.B. 1993. Bacterial Conjugation. Plenum Press. New York. 3. Dawson, W.J. 1970. Plant Disease to bacteria. Cambridge Univ. Press. 232 p. 4. Fucikovsky, Z.L. 1981.Curso de Bacterias Fitopatógenas. C.P. y U.A.Ch. Chapingo, Méx. 5. Salle, A.J. 1961. Fundamentals Principles of Bacteriology. Mc. Graw-Hill. N. Y. 6. Sarasola, A.A., Roca de Sarasola, M.A. 1975. Fitopatolgía. Vol. II. Hemisferio Sur, Buenos Aires. 7 7. Sigee, David C. 1993. Bacterial plant pathology cell and molecular aspects. Cambridge University press. Great Britain. 8. Stapp, C. 1981. Bacterial Plant Pathogens. Oxford Univ. Press. Cambridge, England. 292 p. 9. Williams P., Ketley J., Salmond G. 1999. Bacterial Pathogenesis Methods in microbiology. V. 27. Academic Press. Great Britain. TEMA No. 4 AISLAMIENTO E IDENTIFICACION OBJETIVOS PARTICULARES: - Diferenciará los diversos métodos en el aislamiento de las bacterias fitopatógenas. - Diferenciará los diversos métodos usados en la identificación de bacterias fitopatógenas. CONTENIDO: Aislamiento: medios de cultivo, técnicas de aislamiento. Determinación: pruebas de hipersensibilidad, sintomatología, morfología celular, tinción de Gram, pruebas bioquímicas, características culturales, uso de medios selectivos, serología, bacteriófagos, uso de técnicas especiales. BIBLIOGRAFIA: 1. Bradbury, J. F. 1970. Isolation and Preliminary studies of Bacteria from Plants. Rev. Pl.Pathol. 49:213-217. 2. Bradbury J.F. 1986. Guide to Plant Pathogenic Bacteria. CAB Iternational Mycological Institute. England. 3. Billing, E. 1970. Furter studies on the fage sensivity and determination of phytopathogenic Pseudomonas spp. J. Appl. Bact. 33:478-491. 4. Dawson, W.J.. 1970. Plant Disease due to Bacteria, Cambridge Univ. Press. 232 p. 5. Friedman, B.A. 1953. Serological Test with some Phytopathogenic species of PseudomonaPhytopathology. 43(8):412-414. 8 6. Holt, J.G. 1977. The shorter Bergeylls manual of determinative Bacterology. 8 Ed. Baltimore, M.D. Williams and Willkin 7. Kado, C.I.; Heskett, M.G. 1970. Selective medium for isolation of Agrobacterium, Corynebacterium, Erwina Pseudomonas and Xantomonas. Phytopathology. 60:969-976. 8. Kado C.I., Crosa J.H. 1994. Molecular Mechanisms of Bacterial Virulence. Developments in Plant Pathology V.3. Kluwer Academic Publishers. U.S.A. 9. Klement, Z. 1963. Rapid detection of pathogenicity of pathogenetic Pseudomonas. Nature: 199:209-300. 10. Konrmmam, F.W. et al. 1998. Diagnostic Microbiology. 3ª. Ed. Lippicott Company. Philadelphia. pp. 840. 11. Lelliot, R.A.; Stead, D.E. 1987 Methods for the Diagnosis of bacterial Diseases of plants. Plant phathology, V. 2. British Society for Plant Phatology by Blackwell Scientific Publication. Great Britain. Pp 216. 12. Rodríguez Mejía M. 2001. Manual para la identificación de Bacterias fitopatógenas. UACH. México. Pp 119. 13. Romeiro, R.S. 1970. Bacterias Fitopatogénicas. Universidad UVF Vicosa M.G. Brasil. 43 p. 14. Sigee, David C. 1993. Bacterial plant pathology cell and molecular aspects. Cambridge University press. Great Britain. 15. Society of American Bacteriologist. 1957. Manual of Microbiological Methods. Mc. Graw-Hill Books Cp. N.Y. 315 p. 16. Stapp, C, 1981. Bacterial Plant Pathogens. Oxford Univ. Press Cambridge, England. 292 p. 17. Starr, M.P. 1959. Bacteria as Plant Pathogens. Ann Rev. Microbiol. 52:502-504. 18. Tuite, j. 1969. Plant Pathological Methods: Fungi and Bacteria. Minneapolis, Minn. Burges Publishing. 239 p. 19. Williams P., Ketley J., Salmond G. 1999. Bacterial Pathogenesis Methods in microbiology. V. 27. Academic Press. Great Britain. TEMA No. 5 EPIFITIOLOGIA OBJETIVOS PARTICULARES: 9 - Describirá las diferentes etapas del ciclo de la enfermedad. - Diferenciará los diversos tipos de relación Huésped-Patógeno. - Relacionará a las enfermedades con los factores ambientales que la regulan. - Diferenciará los tipos de epifitia. CONTENIDO: Ciclos de la enfermedad: ciclo primario y ciclo secundario. Diseminación, inoculación, penetración. Relación Huesped-Patógeno. (Infección, colonización, síntomas y resistencia a la enfermedad). Producción de sustancias patógenicas: enzimas, toxinas y reguladores del crecimiento. Reacción de hipersensibilidad. Efectos ambientales en la incidencia de enfermedades bacterianas. Progreso de Epifitias. BIBLIOGRAFIA: 1. Bradbury, J.F. 1986. Guide to Plant Pathogenic Bacteria. C.A.B. International Mycological Institute. Pp 332. 2. Civerolo E.L., Collmer A., Davis R.E., Gillaspie A.G. 1987. Current plant Science and Biotechnology in Agriculture. Plant pathogenic Bacteria. Martinus nijhoff Publishers. U.S.A. 3. Chatterjee, A.K. 1986. Advances in plant pathology. Vol.4 Genetics of Applications to Phytopathogenic Bacteria. 4. Lovelock, D.W. 1979. Plant pathogens. Academic Press, N.Y. 11 p. 5. Rhodes, M.R.; Skiner. F.A. 1982. Bacterial and Plants. Academic Press. N.Y. 264 p. 6. Roberts, M.R.; Skiner, F.A. 1982. Bacterial and plants Academic Press, N.Y. 278 p. 7. Rodríguez Leyva, M. 1975. Relación Huesped-Parásito Mecanismos de Patogenecidad de los Microorganismos. O.E.A. Washington D.C. 83 p. 8. Sarasola, A.A.; Roca de Sarasola, M.A. 1975. Fitopatología Vol. 11 Hemisferio Sur Buenos Aires. 9. Srivastava. S.K.; Patel, P.N. 1978. Epidemiological relations of bacteria plant pathogens. Printed at Dagowal. Printing Press. India. 143 pp. 10 10. Vanderplank. J.E. 1982. Host-Pathogen Interactions in Plants Diseases. Academic Press. N.Y. 202 p. TEMA No.6 SINTOMATOLOGIA OBJETIVO PARTICULAR: - Diferenciará la amplia gama de síntomas que provocan las bacterias en las enfermedades de las plantas. CONTENIDO: Síntomas. Definición y clases (síndrome, primarios, secundarios, complejos). Necróticos: plesionecrosis, holonecrosis. Hipoplasias. Hapoplasias. BIBLIOGRAFIA: 1. Agrios, G.N. 1988. Plant Pathology, Academic Press. N.Y. 629 p. 2. Billing, E. 1987. Bacteria as Plant Pathogenic Bacteria. Cambridge Univ. Press. 232 p. 3. Bradbury, J.F. 1986. Guide to plant Pathogenic Bacteria. C.A.b. International Mycological Institute, pp 332. 4. Dawson, W.J. 1970. Plant Disease due to Bacteria. Cambridge Univ. Press. 232 p. 5. Romeiro, R.S. 1970. Bacterias Fitopatogénicas. Universidad UVF Vicosa M.G. Brasil. 43 p. 6. Stapp, C. 1981. Bacterial Plant Pathogens. Oxford Univ. Press. Cambridge, England. 292 p. TEMA No. 7 CONTROL OBJETIVOS PARTICULARES: - Identificará los principales métodos de control. 11 - Diferenciará las prácticas contenidas en cada uno de los métodos de control. - Discriminará los mecanismos de control óptimos para las enfermedades virales. CONTENIDO: Exclusión: cuarentena, inspecciones, certificación decomisos. Erradicación: eliminación de huéspedes espontáneos, plantas enfermas, rotación de cultivos, medidas sanitarias. Protección de productos vegetales, control de insectos vectores. Terapia: quimioterapia y fisioterapia. Resistencia y control biológico. BIBLIOGRAFIA: 1. Billing, E. 1987. Bacteria as Plant, Chapman & Hall. 2. Costa, J.J. et, all. Introducción a la terapéutica vegetal, Hemisferio Sur, Buenos Aires, 533 p. 3. Fucikovsky, Z.L. 1981.; Curso de Bacterias Fitopatógenas. C.P. y U.A.Ch. Chapingo, Méx. 4. Lelliott, R.A.; Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial Diseases of Plant. British Society for Plant Phatology by Blackwell Scientific Publication, pp 216 5. Maloy, D.C. 1993. Plant diseases control. John Wiley & Sons, Inc. 346 pp. 6. Mukerji/Gory, 1988. Biocontrol of plant disease. Vol. 1 y 11. C.R.C. Press. 7. Srivastava, S.K.; Patel, P.N. 1978. Epidemological relations of bacteria plant pathogens. Printed at Dagowal Printing Press. India. 143 pp. 8. Sarasola, A.A.; Roca de Sarasola, M.A. 1975. Fitopatología. Vol. 11. Hemisferio Sur. Buenos Aires. 9. Sharvelle, E.G. 1979. Plants disease control. A.U.I. Westport. Conecticut. 331 p. 10. Vanderplank, J. 1969. Disease resistente in plant. Academic Press. London. 206 p. TEMA No. 8 12 BACTERIOSIS DE IMPORTANCIA EN MEXICO OBJETIVO PARTICULAR: - Integrar los conocimientos previos para lograr la descripción y control de las principales enfermedades vírales en México. CONTENIDO: Bacteriosis en hortalizas, bacteriosis de frutales, bacteriosis en cereales, bacteriosis en cultivos industriales, bacteriosis en especies forestales. BIBLIOGRAFIA: 1. Bradbury, J.F. 1986. Guide to Plant Pathogenic Bacteria. C.A.B. International Mycological Institute. Pp 332. 2. Blancard, Dominique. 1990. Enfermedades del Tomate: Observar, Identificar, Luchar. MundiPrensa. España. 3. Blancard, Dominique. 1991. Enfermedades de Cucurbitaceas: Observar, Identificar, Luchar. Mundi-Prensa. España. 4. Civerolo E.L., Collmer A., Davis R.E., Gillaspie A.G. 1987. Current plant Science and Biotechnology in Agriculture. Plant pathogenic Bacteria. Martinus nijhoff Publishers. U.S.A. 5. Stapp, C. 1981. Bacterial plant Pathogens, Oxford Univ. Press. Cambridge, England 292 p. 6. Nyvail, R.F. 1989. Field Crop Diseases Handbook. In: AVI Book. 817 pp. 7. Orozco Santos Mario. 1995. Enfermedades presentes y potenciales de los citricos en México. Universidad Autónoma Chapingo. México. 8. Shew H.D. and G.B. Lucas 1991. Compendium of tobacco diseases. St. Paul Minnesota American Philosophical Society. U.S.A. 9. The diseases compedium series of the American Phythological Society. A.P.S. Press. The American Phytopathological Society. 10. Zitter th. A., D.L. Hopkins, C.E. Thomas. 1996. Compendium of cucurbit diseases. APS Press. St Paul, Minn 13 V I R O L O GI A TEMA No. 9 INTRODUCCION A LA VIROLOGIA OBJETIVOS PARTICULARES: - Se documentará en estadísticas de las pérdidas ocasionadas por virus y bacterias. - Describirá el desarrollo histórico de la virología. - Agrupará a estos patógenos, según los diferentes criterios establecidos. CONTENIDO: Consideraciones económicas.- Introducción, tipos de pérdidas, ejemplos de pérdidas causadas por los virus en cultivos de importancia agrícola, costos económicos de las medidas de control en enfermedades virales. Importancia de la Virología en la Ciencia. Definición. Historia. Distribución. Clasificación y Nomenclatura. BIBLIOGRAFIA: 1. Agrios, G. N. 1990. Economic considerations. In: Plant Viruses. Vol. II Pathology. Mandaharm C. L. Ed. C.R.C. PRESS. Boca Raton Ann Arber Boston. pp 1-22. 2. Bos, A. 1962. Crop losses caused by viruses. Plant Protection 1: 263-282. 3. Chirappa. 1981. Man-Made Epidemiological Hazards in Major Crops of Developing Countries. In: Plant Diseases and Vectors, Ecology and Epidemiology, Maramorosch, K and Harris, KF. Ed. Academic Press New York, London, Toronto, Sydney, S. Francisco. pp.320-339 4. Francki, R.I.B.; Milne, R.G.; Hatta, T. 1985. Atlas of plant viruses, Vol. 1 C.R.C. Press, Inc. Boca Rato, Florida 222 pp. 5. Francki, R.I.B.; Milne, R.G.; Hatta, T. 1985. Atlas of plant viruses, Vol. 2 C.R.C. Press, Inc. Boca Rato, Florida 286 pp. 14 6. Hughes, S.S. 1997. The virus: A History of the concept. Heinemann Educational Books. London 140 pp. 7. Matthews, R.E.F. 1991. Plant Virology. Academic Press. New York, London 140 pp. 8. Mattehews, R.E.F. 1982. Clasification and nomenclature of viruses. Intervirology 17: 1-99. 9. Matthews, R.E.F. 1985. Viral Taxonomy, Microbiol. Sci. 2:74-76. 10. Van Regenmortel et al 2000. Virus taxonomy Clasification and Nomenclatura of Viruses .Academic Press. 1126 pp. 11. Waterson, A.P.; Wilkinson, L. 1978. An Introduction to the of Virology. Cambridge University Press.London 237 pp. TEMA No. 10 MORFOLOGIA Y FISIOLOGIA OBJETIVOS PARTICULARES: - Reconocerá la morfología y composición de los virus. - Relacionará las características morfológicas y fisiológicas de estos patógenos, con la capacidad de causar enfermedades en las plantas. - Describirá el origen de los virus. CONTENIDO: - Morfología: formas, tamaño. Composición: virus de RNA, virus de DNA, virus con envoltura, virus sin envoltura, virus con genomas divididos. Composición de la estructura proteica. - Replicación de los virus con RNA y DNA y ensamblaje. Estrategias para la expresión genética del virus de RNA. - Estrategias para la expresión genética del virus de DNA. - Ensamblaje: nucleación y elongación. 15 - Origen y evolución de los virus. BIBLIOGRAFIA: 1. Bos, L. 1983. Introduction to plant virology. Longman, London-New York.160. 2. Brunt, Alan; Crabtree K., Gibbs A. 1990. Viruses of Tropical plants. Descriptions and List from the VIDE Database. CAB International Australian Center for International Agricultural Research (ACIAR). U.K. Redwood Press Ltd. London. 3. Casjens S. 1985. Virus Structure and Assembly. 1985 Jones and Bartlet Publishers Inc. 295 pp. 4. Cornuet, P. 1992. Elementos de virología vegetal. I.N.R.A. Ediciones Mundi-Prensa. España 218 pp. 5. Davies J.W. 1985 . Molecular Plant. Virology. Vol. I y Vol. II. CRC Press. 230 y 229 pp. 6. Dijkstra, Jeanne; Ceesp de Jager. 1998. Practical Plant Virology: Protocols and exercises. Serie Spinger lab manual. Berlin. 7. Francki, R.I.B. (ed) 1985. The plant viruses. Vol. 1 Poliedrical Virions with tripartite genomes. Plenum Press. New York and London, 310 p. 8. Francki, R.I.B.; Milne, R.G.; Hatta, T. 1985. Atlas of plant viruses. Vol. 1. C.R.C. Press. Inc. Boca Rato, Florida 222 pp. 9. Gibbs, A.; Harrison, B. 1976. Plant Virology. The principles. Edwards Arnold. London. 292 p. 10. Hull, R.; Maule, A.J. 1985. Virus multiplication. In: Francki, R.I.B. ed. Plenum. Press New York and London. 85-116 pp. 11. Foffrey, W.D. 1985. Molecular plant virology. Vol. I y II. C.R.C. Press, Inc. Boca Rato, Florida. pp. 229 and 230 12. Johnson, J.E.; Argos P. 1985. Virus Particle Stability. London. 19-27 p. 13. Matthews, R.E.F. 1991. Plant Virology. Academic Press. New York, London, Toronto, Sydney, S. Francisco. 897 pp. 14. Matthews, R.E.F. 1992. Fundamental of plant virology. Academic Press, Inc. San Diego, New York, Boston, London, Sydney, Tokio, Toronto. Pp. 403. 15. Van Reyenmortel, M.H.V., Heinz-Fraenkel-Conrat (eds). 1985. The plant viruses. Vol.2. the rodshaped plant viruses, Pleum Press. New York, London. 324 pp. 16. Van Reyenmortel, M.H.V., Heinz Frankl- Conrat. 1986. The plant viruses. Plenum Press. New York and London. 424 p. 16 TEMA No. 11 PURIFICACION E IDENTIFICACION OBJETIVOS PARTICULARES: - Diferenciará los diversos métodos de purificación en virus vegetales. - Diferenciará los diversos métodos usados en la identificación viral. CONTENIDO: Purificación: Obtención de alta concentración. Extracción. Clasificación. Centrifugación: Diferencial, en gradientes. Punto isoeléctrico. Columna de Gel. Filtración. Serología. Identificación: - Propiedades biológicas. Rango de hospedantes, sintomatología, plantas indicadoras, protección cruzada. Formas de transmisión: con savia y a través de contacto, por semilla y polen, por suelo (nemátodos y hongos), por insectos o ácaros, por injertos y por cúscuta. Propiedades infectivas de la savia (punto de inactivación terminal, punto final de dilución, envejecimiento in vitro, tolerancia en tejidos secos). Inclusiones celulares. - Propiedades intrínsecas. 1. Propiedades fisicoquímicas: número y tipo de partículas (virus de genomas multipartidos o únicos), densidad boyante, coeficiente de sedimentación. Coeficiente de difusión, peso molecular, movilidad electroforética y punto isoeléctrico, absorción ultravioleta. Cubierta proteica (proporción relativa, número y tipo de proteínas, composición individual de las proteínas), Acidos nucleicos (proporción relativa, de uno o dos filamentos, genoma dividido RNA o DNA, secuencia). Otros componentes, envoltura (presente o ausente). 2. Microscopía electrónica: forma de la partícula, tamaño de la partícula y sitios de acumulación. 3. Especificidad serológica: técnicas serológicas 17 BIBLIOGRAFIA: 1. Bar-Joseph, M. and S.M 1981. Enzyme-Linked Immunosorbent, Assay (Elisa): Principles for Diagnosis of plant Viruses, In: Maramorosch, K. And Hattis, K.F. Eds. Plant Diseases and Vectors: Ecology and Epidemiology. Academic Press. New York, London, Toronto, Sydney, S. Francisco, 369 p. 2. Brunt, Alan; Crabtree K., Gibbs A. 1990. Viruses of Tropical plants. Descriptions and List from the VIDE Database. CAB International Australian Center for International Agricultural Research (ACIAR). U.K. Redwood Press Ltd. London. 3. Cornuet, P. 1992. Elementos de virología vegetal. I.N.R.A. Ediciones Mundi-Prensa. España 218 pp. 4. Dijkstra, Jeanne; Ceesp de Jager. 1998. Practical Plant Virology: Protocols and exercises. Serie Spinger lab manual. Berlin. 5. French, E.R.; Herbert, T.T. 1980 Métodos de investigación fitopatológico, I.I.C.A. San José, Costa Rica. 6. Kado, C.I.; Agrawal, H.O. (eds.) 1972. Principles and Techniques in Plant virology. Van Nostrand Reinhold Co. New York. 688 pp. 7. Mahy, B.W.J. 1985. Virology a Practical Approach. IRL Press. England. 8. Maramorosch, K.; Koproniski, H.(eds.) 1967-1984, Methods in virology, Vol.1, 1967: 640 pp.; Vol.2 1975, 682 pp.; Vol.3, l967: 677 pp.; Vol. 4, 1968: 764 pp.; Vol. 5, 1971:530 pp., Vol.6, 1977: Vol. 7,1984: 396 pp., Academic Press, New York. 9. Matthews, R.E.F. 1991. Plant Virology, Academic Press. New York, London, Toronto, Sydney, S. Francisco. 897 pp. 10. Matthews, R.E.F.(ed.) 1993. Diagnosis of plant virus diseases. C.R.C. Press. U.S.A. 11. Noordam, P. 1973. Identification of plant viruses methods and experiments. Pudoc Wagenieng 207 pp. 12. Pinto, C.B. 1981. Virología agrícola. Departamento de Parasitología Agrícola, U.A.CH. Chapingo, Méx. 13. Sanidad Vegetal.. Elisa.Guía ilustrada de la prueba de inmunoadsorción con enzimas ligadas para la detección de fitopatógenos. 14. Smith, K.M. 1972. A. Textbook of plant diseases. Longman, London. 18 TEMA No. 12 EPIFITIOLOGIA OBJETIVOS PARTICULARES: - Describirá las diferentes etapas del ciclo de la enfermedad. - Diferenciará los diversos tipos de transmisión. - Diferenciará los diversos tipos de relación H-P. - Relacionará a las enfermedades con los factores ambientales que las regulan. - Diferenciará los tipos de epifitias. CONTENIDO: Ciclos de la enfermedad: ciclo primario, ciclo secundario. Diseminación, inoculación. (Transmisión: mecánica, por semilla, por injerto, insectos, ácaros, hongos, nemátodos). Penetración. Infección. Colonización. Relación huésped patógeno: hospedero susceptible y hospedero resistente. Efectos del ambiente. Progreso de epifitias: ciclo simple, ciclo múltiple. BIBLIOGRAFIA: 1. Bos, L. 1981. Wild plants in the ecology of virus diseases. In: Maramorosch, K. And Harris, K.F. 1981 (eds) Academic Press, New York, London, Toronto, Sydney, S. Francisco, 1-34 p. 2. Bos, L. 1983. Introduction to plant virology. Longman. London- New York.160. 3. Cornuet, P. 1992. Elementos de virología vegetal. I.N.R.A. Ediciones Mundi-Prensa. España 218 pp. 4. Fracer, P. S. S. ed. 1990. Recognition and response in plant-virus interactions. 5. Francki, R.I.B. (ed) 1985. The plant viruses. Vol. 1. Poliedrical Virions with tripartite genomes. Plenum Press. New York and London, 310 p. 6. Harris, Kerry F. Maramorosch Karl. 1980. Vectors of Plant Phathogens. Academic Press. USA. 7. Kurstak, Edouard. 1981. Handbook of plant Virus infections comparative diagnosis. El Sevier/North-Holland biomedical Press. Amsterdam. 19 8. Lloyd N. Chykowski. 1981. Epidemiology of diseases caused by leafhopper-borne pathogens. In: Maramorosch, K and Harris Diseases and Vectors: Ecology and Epidemiology. Academic Press. New York, London, Toronto, Sydney, S. Francisco. 106-161 p. 9. Mandahar, C.L. 1981. Virus transmission through seed and polen. In: Maramorosch, K and Harris, K.F. (eds).1981. Plant Diseases and Vectors: Ecology and Epidemiology. Academic Press. New York, London, Toronto, Sydney, S. Francisco. 241-792 p. 10. Maramorosch, K and Harris, K.F. (eds). 1981. Plant Diseases and Vectors: Ecology and epidemiology. Academic Press. 11. Maramorosch, Karl; Sherman K.E. 1985. Viral insecticides for biological Control. Academic Press USA. 12. Matthews, R.E.F. 1991. Plant Virology. Academic Press. New York, London, Toronto, Sydney, S. Francisco. 13. Matthews, T.E.F.(ed.) 1993. Diagnosis of plant virus diseases. C.R.C. Press. U.S.A. 14. Mclean, G.D.; Garret, R.G.; Ruesink, W.G. ed. 1986. Plant virus epidemic, monitoring, modeling and predicting out breacks, Ed. Academic Press. Australia.550 p. 15. Orozco Santos Mario. 1995. Enfermedades presentes y potenciales de los cítricos en México. Universidad Autónoma Chapingo. México. 16. Sreenivasolo, P.; Naido, R. A.; Nayado, M.V. 1989. Physiology of virus infected plants. South Asian Publishers. New Delhi. Pp. 164. 17. Urias M. Carlos, Rodriguez M.R., Alejandre A.T. 1992. Contribución a la ecología y control de áfidos en México. Universidad Autónoma de Chapingo. C.P. Centro de Fitopatología. 18. Urias M. Carlos, Rodriguez M.R., Alejandre A.T. 1992. Identificación de áfidos de importancia agrícola. Universidad Autónoma de Chapingo. C.P. Centro de Fitopatología. 19. Walkey D.G.A. 1991. Applied Plant virology. 2 nd edition. Edit. Chapman and Hall. Great Britain. 20. Zoeten, G.A. Early events in plant virus injection, In: Maramorosch, K and Harris, K.F. (eds). 1981. Plant Diseases and Vectors: Ecology and Epidemiology. Academic Press. New York, London, Sydney, S. Francisco. 221-234 p. 20 TEMA No.13 SINTOMATOLOGIA. OBJETIVO PARTICULAR: Diferenciará la amplia gama de síntomas (necrosis, hipoplasias, hapoplasias) que provocan los virus, en las enfermedades de las plantas. CONTENIDO: Síntomas. Definición y clases (síndrome, primarios, secundarios, complejos, enmascarados). Necróticos: plesionecrosis, holonecrosis. Hipoplasias: enanismo, arrosetado, blanqueo, clorosis, mosaico, supresión. Hapoplasias: gigantismo, hipercromia, metaplasias, prolepsis. BIBLIOGRAFIA: 1. Bos, L. 1978. Sytoms of virus diseases in plant. Purdor Walgeninyen. 230 pp. 2. Brunt, A. 1990. Viruses of tropical plants. C.A.B. International. 3. Gibbs, A., Harrison, B. 1976. Plant Virology. The Principles. Edwards Arnold. London. 292 p. 4. Mattehews, R.E.F. 1991. Plant Virology. Academic Press. New York, London, Toronto, Sydney, S. Francisco 897 pp. 5. Matthews, R.E.F. 1993. Diagnosis of plant virus disease, Ed. C.R.C. Press. U.S.A. 374 pp. 6. Walkey, D.G.A. 1991. Applied plant virology. Ed. Chapman and Hall. U.S.A. 338 pp. TEMA No.14 CONTROL. OBJETIVOS PARTICULARES: - Identificará los métodos de control. - Diferenciará las prácticas o medidas contenidas en cada uno de estos métodos. 21 - Discriminará los mecanismos de control óptimos para las enfermedades vírales. CONTENIDO: Exclusión: cuarentenas, inspecciones, certificaciones, decomisos. Erradicación: eliminación de hospederos alternantes, especies espontáneas, restos vegetales, medidas sanitarias, rotación de cultivos, eliminación de insectos vectores. Protección: desinfección, tratamientos al suelo, eliminación de insectos vectores. Inmunización: resistencia natural, morfología y química pasiva mecánica, protección cruzada, cultivo de tejidos meristemáticos. Terapia: Fisioterapia y quimioterapia. BIBLIOGRAFIA: 1. Bos, L. 1983. Introduction to plant virology. Longman, London-New York, 160. 2. Evered, O. Sara Harinett. 1987. Plant resistence to viruses. Johon Wilwy f sons p. 215 3. Gibbs, A.; Harrison, B. 1976. Plant-Virology. The principles. Edwards Arnold. London. 292 p. 4. Harris K.F. and Karl. Maramorosh, 1982. Pathogens vector and plant diseases: approaches to control. Academic Press, New York, London. 310 pp. 5. Kurstak, E. 1988. Handbook of plant Press. virus infections. Elselvier/North-Holland. Biomedical 6. Matthews. R.E.F. 1991. Plant Virology. Academic Press. New York,London, Toronto, Sydney, S. Francisco, 897 pp. 7. Matthews, R.E.F. 1992. Diagnosis of Plant Virus Diseases, Ed. C.R.C. Press, USA, 374 pp. 8. Walkey, D.G.A. 1991. Applied plant virology. Ed. Chapman and Hall. USA. 338 pp. 22 TEMA No.15 VIROSIS DE IMPORTANCIA ECONOMICA OBJETIVO PARTICULAR: Integrar los conocimientos previos para lograr la descripción y control de las principales enfermedades vírales en México. CONTENIDO: FRIJOL: Virus del mosaico común del frijol, v. del mosaico amarillo del frijol, v. del mosaico dorado del frijol. PAPA: Virus "Y" de la papa, virus de la hoja enrollada de la papa. Virus del mosaico de la lechuga. Virus del mosaico de la calabaza. Mosaico de la caña de azúcar. Virus del mosaico del Tabaco. Virus de la alfalfa. Algunas virosis en frutales. Patógenos afines: viroides cadag-cadag en cocotero, viroides de la exocortis de los cítricos y T.P.F. BIBLIOGRAFIA: 1. Blancard, Dominique. 1990. Enfermedades del Tomate: Observar, Identificar, Luchar. MundiPrensa. España. 2. Blancard, Dominique. 1991. Enfermedades de Cucurbitaceas: Observar, Identificar, Luchar. Mundi-Prensa. España. 3. Brunt, A. 1990. Viruses of tropical plants. C.A.B. International. 4. Shew H.D. and G.B. Lucas 1991. Compendium of tobacco diseases. St. Paul Minnesota American Philosophical Society. U.S.A. 5. Kurstak, R.E.F. 1991. Plant virus infections. Elselvier/North-Holland. Biomedical Press. 6. Matthews, R.E.F. 1991. Plant Virology. Aademic Press. New York. London, Toronto, Sydeney, S. Francisco. 897 pp. 23 7. Matthews, R.E.F. 1992. Diagnosis of Plant Virus Diseases, Ed. c.R.C. Press. USA. 374 pp. 8. Schwartz, H:F.; E. Galves (eds). 1980. Bean production problems: diseases, insect, soil climatic contraints of Phaseolus vulgaris, Centro Internacional de Agricultura Tropical Ciaticali Columbia. 424 p. 11. Zitter th. A., D.L. Hopkins, C.E. Thomas. 1996. Compendium of cucurbit diseases. APS Press. St Paul, Minn. U.S.A. U.S.A. 24 MANUAL DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGÍA 25 PRACTICA 1. EL MICROSCOPIO INTRODUCCIÓN El microscopio es un instrumento óptico que amplifica imágenes mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación que hacen posible la observación de objetos muy pequeños. Los microscopios pueden aumentar de cien a cientos de miles de veces el tamaño original de la muestra a observar. Los dos tipos de microscopios más comunes según la fuente de iluminación son el óptico y el electrónico. En el caso del microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. En cambio, el microscopio electrónico emplea un haz de electrones controlado por un campo magnético. Historia. El interés del hombre por explicar su medio lo ha llevado a desarrollar nuevas tecnologías. Una de ellas fue la Microscopio, cuyo pionero, por allá del siglo XVII, fue el holandés Anton van Leeuwenhoek quien tallaba sus lupas en esferitas de cristal con las que conseguía 275 aumentos. Leeuwenhoek se llevó sus métodos a la tumba pero sus aparatos fueron donados a la Royal Society de Londres. En el siglo XIX al descubrirse que la dispersión y la refracción se podían modificar con combinaciones adecuadas, se lanzaron al mercado objetivos acromáticos excelentes. Durante el siglo pasado Ernst Ruska y Max Knoll desarrollaron el primer microscopio electrónico, basándose en los últimos estudios sobre las propiedades ondulatorias de los electrones. El microscopio electrónico permitió una capacidad de aumento mucho mayor debido a que se usaron electrones en lugar de fotones, y la longitud de onda de los primeros es mucho menor que la de los fotones. Microscopio Optico. Los microscopios de este tipo generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamaño original y por lo general el límite lo tienen en unas 2000 veces. Las lentes que integran un microscopio óptico son el condensador, el objetivo y el ocular; y funcionan de la siguiente manera: la luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y 26 elegirse una posición que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final. Los microscopios que se usan normalmente en microbiología están equipados con tres objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersión. Estos objetivos están montados sobre una pieza que se llama revolver y puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el condensador. La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular. Además del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder resolutivo; esto es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos. Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor será la definición de un objeto. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda utilizada y de una propiedad óptica de la lente conocida como apertura numérica. Como los microscopios ópticos utilizan luz visible, la longitud de onda está prefijada y es por esto que la resolución de un objeto está en función de la apertura numérica; cuanto mayor sea la apertura, el objeto resuelto será más pequeño. 0.5 l d = ---------------N sen a d: poder resolutivo l: longitud de onda a: mitad del ángulo de la lente objetivo N: índice de refracción del medio N sen a: apertura numérica. Un factor que afecta a la apertura numérica, además de la construcción de la lente, es el medio a través del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo esté separado del objeto por el aire, su apertura numérica nunca será mayor de 1,0; para conseguir aperturas numéricas mayores que ésta, el objetivo debe estar inmerso en un líquido de mayor índice de refracción que el aire. A estos líquidos se les denomina aceites de inmersión. Sin embargo, estos microscopios llegan a tener un poder de resolución de aproximadamente 0,25 µm, lo que significa que las partículas con un tamaño menor a ésta longitud, no pueden distinguirse unas de otras. 27 Microscopio Electrónico. Los microscopios electrónicos utilizan haces de electrones en lugar de luz visible, lo que les permite tener un poder de resolución muy elevado. La longitud de onda de los rayos de electrones es de 0,005 - 0,0003 nm; muy corta comparada con la de la luz visible (426 - 750 nm; violeta - rojo). Con el microscopio electrónico es posible distinguir objetos separados por una distancia de 0,003 µm, comparado con los 0,25 µm de uno óptico, con lo cual, los aumentos pueden llegar a ser de un millón de veces. A causa de la naturaleza de este instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados; incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por lo tanto, para preparar las muestras se necesitan técnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las células primero deben ser fijadas y deshidratadas (etanol o acetona). Después de la deshidratación, la muestra se incluye en una resina y es aquí donde se realizan cortes finos con un ultramicrotomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola célula bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas. Si sólo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas, por lo que se montan células enteras que se recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). El haz de electrones es dirigido sobre la preparación y los electrones dispersados por el metal pesado activan una pantalla de observación produciendo una imagen. A la primera técnica se la denomina Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) y a la segunda Microscopía Electrónica de Barrido (MEB). Otros Tipos De Microscopia Óptica. Microscopio de campo claro: usa como fuente de luz directa bien una bombilla bien la luz solar. Ya que los microorganismos son transparentes es difícil distinguirlos con este tipo de microscopía y es por lo que se suelen teñir. Microscopio de campo oscuro: usa un microscopio óptico equipado con un condensador y objetivo especial que iluminan los microorganismos en la muestra frente a un fondo oscuro. Este método se utiliza para visualizar microorganismos vivos sin teñir. Microscopio de fluorescencia: la muestra se tiñe con una sustancia fluorescente que absorbe la energía de las ondas cortas de la luz (azul) y emite la luz de longitudes de ondas más largas (verde). Se utiliza en inmunofluorescencia, técnica en la cual una sustancia fluorescente se une a un anticuerpo específico de ciertos microorganismos. Si el anticuerpo fluorescente se une al microorganismo, este microorganismo emite fluorescencia y se puede identificar. Microscopio de contraste de fases: es un microscopio óptico modificado que permite contrastar sustancias de diferente grosor o densidad. Mediante un condensador y un objetivo especial se controla la iluminación de tal manera que vaya en diferentes rutas a través de las distintas partes de una célula. El resultado 28 es una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad. Con este método, el material denso aparece brillante, mientras que las partes de la célula que tienen una densidad cercana al H2O (citoplasma) aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos. OBSERVACION DE MICROORGANISMOS. Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante microscopios ópticos, por lo que nos vamos a limitar a describir las técnicas más comúnmente usadas para realizar preparaciones para microscopios ópticos. Preparación en fresco: para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso que no esté fijado. Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y cubriéndola, sin formar burbujas de aire, con un portaobjetos se observa al microscopio de contraste de fases. Técnicas de tinción: En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensión, fijación, tratamiento con colorantes y observación. 1.- Extensión: se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de H2O. 2.- Fijación: tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del mechero. 3.- Tinción: se realiza añadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a los procesos anteriores. Negativa: Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina). Simple: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tinción negativa, sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células. 29 Diferencial: Intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia una estructura. El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero, denominándose colorante de contraste. PARTES DEL MICROSCOPIO Sistema OCULAR OBJETIVO CONDENSADOR DIAFRAGMA FOCO óptico Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo. Lente situada cerca del la preparaciónAmplía la imagen de ésta. Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. Dirige los rayos luminosos hacia el condensador . Sistema SOPORTE TUBO REVÓLVER TORNILLOS DE ENFOQUE mecánico Mantiene la parte Lugar donde óptica. Tiene dos se deposita la partes: el pie y la preparación. columna. Contiene los sistemas de lentes Permite, al girar, cambiar los objetivos. PLATINA macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto. NORMAS DE MANEJO DEL MICROSCOPIO Para transportar el microscopio agárralo con las dos manos, con una se sujeta el brazo y con la palma de la otra se sostiene el pie, no se deben tocar las lentes con los dedos, para enfocar se debe hacer lo siguiente: 1. Girar el revolver para seleccionar el objetivo menor. 2. Colocar la preparación en la platina y centrarla . 3. Observando por el ocular elevamos la platina con el macrométrico. 4. Sin dejar de observar, gira el micrométrico hasta conseguir la máxima nitidez. 5. Cuando ya hemos observado la imagen con el menor objetivo, cambiamos a los superiores sucesivamente, ajustando con el micrométrico. 6. El aumento conseguido es el producto del aumento del ocular y el aumento del objetivo. 30 METODOLOGIA Identifica las diferentes partes del microscopio y escribiendo los nombres correspondientes. 31 PRACTICA 2. ESTERILIZACIÓN Las investigaciones que requieren del cultivo de microorganismos in vitro, precisan de condiciones que no permitan el desarrollo de organismos ajenos o extraños para lo cual es necesario contar con un local adecuado donde no hay corrientes de aire, así como de material y equipo que puede ser sometido a algún tratamiento que elimine las formas de vida existentes. Principios de esterilización 1.- Cualquier método de esterilización debe matar o remover todas las formas de vida presente. 2.- El tratamiento no debe alterar la composición física o química del medio. 3.- Al esterilizar medios de cultivo no debe haber pérdida de agua. La asignación debe hacerse en base a la calidad del material de que esta hecho el equipo. La esterilización se lleva a cabo por métodos físicos como son calor, filtración y radiaciones ionizantes. ESTERILIZACIÓN CON CALOR. Es ampliamente utilizado y hay diferentes formas de empleo, pero es necesario tomar en consideración que la muerte de los microorganismos esta influenciada por varios factores: a) temperatura b) tiempo de exposición c) presencia o ausencia de humedad A mayor temperatura se requiere de un menor tiempo de exposición y la presencia de humedad acelera considerablemente el proceso de esterilización con calor seco requiere de una exposición de 60 min. a 160° C y empleando humedad, solo 15 min. a 121°C. INCINERACIÓN. La incineración es el método más eficaz de esterilización, pero su aplicación es muy limitada. FLAMEADO. Este método es uno de los más comúnmente utilizados en el laboratorio microbiológico, para objetos de vidrio o metal y consiste en pasar por la flama del mechero el material en cuestión. CALOR SECO. En el laboratorio el aire caliente frecuentemente es usado como una parte de la esterilización del equipo, siendo el mejor método para material de vidrio como son tubos de ensaye, matracas, cejas de petri, e instrumentos metálicos. La temperatura comúnmente usada es de 160°C/1hra. 32 El calor húmedo es más dañino a los microorganismos por que el agua induce más rápido la coagulación de las proteínas, y se utiliza para la esterilización de sustancias termolábiles como medios de cultivo, gelatina, leche, etc. La ebullición es un método satisfactorio de esterilización cuando se sabe que las bacterias esporógenas no constituirán problemas y cuando el material a esterilizar puede ser sumergido en el agua sin ningún problema. Para los medios de cultivo, se recomienda una exposición a 100°C/90min. Ebullición intermitente se utiliza para medios delicados que pueden ser dañados por una prolongada exposición, esta puede hacerse por el método de tindalización el cual es un proceso intermitente que incluye exposiciones por 20-45 min. durante 3 días consecutivos. El aparato utilizado se conoce como “Vaporizador” de Arnold” pero también se puede utilizar un autoclave con vapor libre. El vapor a presión es el agente de esterilización más empleado en hospitales y laboratorios, y el aparato que emplea es el autoclave, que consiste de un recipiente en el cual se adiciona agua, y al hervir ésta saturará el recipiente cerrado (Figura 2) y dependiendo de la presión alcanzará temperaturas superiores a los 100°C. Para la mayoría de los propósitos, se utilizan presiones por arriba de las 15 lb./pulg² y si no hay aire se alcanzará una temperatura de 121°C, completándose el proceso en 15 min., o en 30 min. si la temperatura es de 115°C. Muchas autoclaves están hechas en forma tal que el vapor entra a la cámara superior y expulsa el aire; conviene cerrar la válvula solamente cuando sale en forma interrumpida vapor puro. FILTRACIÓN. La filtración no solo es un proceso mecánico de cribado dependiente únicamente de la porosidad y espesor del filtro, sino que es un proceso fisicoquímico complejo que comprende la carga del filtro y del organismo, así como la naturaleza y pH del fluido. Este método es recomendable para aquellas sustancias termolábiles, particularmente fluidos biológicos, como sueros, vitaminas, enzimas, antibióticos, reguladores del crecimiento y azucares. Los filtros se caracterizan por una alta uniformidad, distribución regular de las perforaciones y una alta capacidad de selección de partículas. 33 PRACTICA 3. MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCION. Para el cultivo in vitro de bacterias se requiere la elaboración de un medio que proporcione todos los requerimientos nutricionales que permitan su reproducción, los cuales se les conoce como medios de cultivo. Los medios de cultivo contienen cuatro componentes esenciales: fuentes de carbono, nitrógeno, minerales y vitaminas. Existe una gran variedad de fuentes de carbono que se pueden emplear en los medios de cultivo como son: alcoholes, pentosas, hexosas, disacáridos, trisacáridos, glicoles, glucósidos, ácidos e hidroxiácidos ya sean solos o en combinación. En cuanto a las fuentes de nitrógeno también existe una gran diversidad. 1. Sales inorgánicas bien definidas, aminoácidos y péptidos. 2. Hidrolizados de proteína ya sea de origen animal o vegetal, (soya, malta o levadura) LAS VITAMINAS. Hasta la fecha se ha encontrado que las vitaminas requeridas para el crecimiento de las bacterias, pertenecen al grupo B y se adicionan al medio de cultivo ya sea como componentes individuales o como mezcla en la forma de extracto de levadura. Los minerales se requieren en cantidades muy pequeñas y en la mayoría de los casos, vienen como contaminantes de otras sustancias. Hoy en día existe una gran diversidad de medios de cultivo y el empleo de ellos depende del tipo de microorganismo deseado y sobre todo de la disponibilidad de reactivos. De una manera general, los medios de cultivo, se pueden clasificar en cuanto a su: I. Consistencia 1. Líquidos (caldo nutritivo) 2. Semisólidas 3. Sólidos (PDA, CPG) II. Función 1. Aislamiento (PDA) 2. Diferenciales (B de King) 34 3. Selectivos e inhibitorios (SX) 4. Enriquecimiento 5. Caracterización 6. Mantenimiento MEDIOS LÍQUIDOS. Son caldos nutritivos que se emplean cuando se requiere de crecimiento abundante. Sin embargo en ellos no se puede determinar si existe contaminación con otro microorganismo Los medios sólidos facilitan la separación de mezclas de microorganismos y básicamente están compuestos de dos partes: Una base gelificante y los nutrientes. Para la base gelificante se puede emplear gelatina, agar o silical gel. MEDIOS DIFERENCIALES. La adición de ciertos reactivos o compuestos químicos, dentro de un medio, puede dar como resultado, la inhibición o cambios en el crecimiento de ciertos microorganismos, lo cual permite una diferenciación entre algunas bacterias. MEDIOS SELECTIVOS E INHIBITORIOS. La adición de ciertas sustancias químicas al agar nutritivo, evita el crecimiento de un grupo de bacterias sin inhibir el crecimiento de otras. Por ejemplo el cristal violeta a una concentración específica previene el crecimiento de bacterias gram positivas sin afectar a las negativas. En principio uno puede seleccionar bacterias que puedan crecer sobre un compuesto orgánico poco usual simplemente por la adición de éste compuesto al medio y omitiendo cualquier otro tipo de compuestos de carbono. MEDIOS DE MANTENIMIENTO. Son medios de cultivo simples que no estimulan el crecimiento abundante, de esta manera no se alteran las propiedades fisiológicas o sexológicas de las bacterias. MEDIOS PARA CARACTERIZACIÓN. Consisten de una fase simple (pero nutricionalmente adecuada) a la cual, se le agrega el sustrato a probar. En la mayoría de las ocasiones se les añade un indicado para mostrar que ha ocurrido un cambio en la reacción; en otros los reactivos se adicionan después del periodo de incubación y el efecto se determina como un cambio de color o formación de un precipitado. MEDIOS PARA AISLAMIENTO. Los medios de cultivo para aislamiento deben favorecer el crecimiento de cualquier tipo de microorganismo por lo que al prepararse deben contener todos los constituyentes esenciales. Como por ejemplo el agar nutritivo, complementado con extracto de levadura y dextrosa. MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO. Pueden ser tanto medios selectivos como inhibitorios pero sin sustancias gelificantes, de tal manera que enriquezcan el crecimiento del microorganismo deseado. 35 PRACTICA 4. METODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS El cultivo puro, es una condición artificial en el crecimiento de bacterias bajo condiciones de laboratorio. Para determinar las características de una especie bacteriana en particular, es imperativo que el organismo sea aislado y multiplicado en el laboratorio en cultivo puro. Existe una variedad de técnicas para el aislamiento y desarrollo de cultivos puros como son: técnicas de estría cruzada y la de vaciado en placa. TÉCNICA DE ESTRÍA CRUZADA. Con una bacteriológica previamente flameada y enfriada, se toma una gota de la suspensión bacteriana inicial o del tejido vegetal afectado, y sobre la superficie del medio se realizan 3 o 4 estrías, las cuales no deberán estar muy separadas. El asa se vuelve a flamear y enfriar para trazar y otras 3 ó 4 estrías a partir de la ultima estría trazada en la tapa 1. Esta operación se repite 2 ó 3 veces más. Es importante señalar que para lograr mejores resultados al iniciar las etapas 2,3 y 4, la última estría solo debe ser tocada con la primera de la etapa siguiente, y así después de la incubación se obtendrán colonias aisladas en las etapas 3 ó 4. Teóricamente, cada colonia aislada es la progenie de una simple célula y por lo tanto un cultivo puro. TÉCNICA DE VACIADO EN PLACA. Para lograr tener colonias separadas por esta técnica, primeramente se debe hacer una suspensión (que se puede lograr al suspender el material vegetal enfermo en agua esterilizada o en medio de cultivo líquido). De esta suspensión se toma una gota ó 0.5 ml y se transfieren a otro tubo o matraz con medio de cultivo con agar líquido. Esta operación se repite 2 ó 3 veces más teniendo cuidado de agitar los tubos antes de hacer la transferencia. Inmediatamente después de cada dilución, el contenido de cada uno de los tubos se traslada a una caja petri esterilizada y después del periodo de incubación se obtendrán colonias separadas. 36 PRACTICA 5. AISLAMIENTO Y PURIFICACION INTRODUCCION. Uno de los requisitos para considerar a una bacteria como el agente inductor de una enfermedad, es el aislarla y purificarla a partir del tejido enfermo. Para llevar a cabo esta etapa existen diferentes metodologías y la elección de cualquiera de ellas dependerá del tipo de síntoma, órgano afectado, grado de avance de la enfermedad y del material y equipo disponible. Entre las técnicas de aislamiento más comunes, se encuentras las siguientes: I. MACERACIÓN DEL TEJIDO a) Manchas b) Tizones c) Sobrecrecimientos d) Roñas e) Cancros II. PUNCIÓN DIRECTA a) Pudriciones b) Marchitez III. INMERSIÓN DEL TEJIDO EN AGUA ESTERILIZADA a) Manchas b) Tizones c) Pudriciones d) Marchitez e) Sobrecrecimiento f) Roñas g) Cancros IV. SIEMBRA DIRECTA DEL TEJIDO ENFERMO a) Manchas foliares El aislamiento de los patógenos por cualquiera de estas técnicas puede ser exitosa, siempre y cuando las muestras presenten zonas de avance de la enfermedad y sean frescas, lográndose obtener al o los patógenos en cultivo puro. Sin embargo en algunas ocasiones las muestras tienen un estado muy avanzado o son muy viejas, dificultándose el aislamiento de los 37 patógenos, por la proliferación de organismos saprófitos. En este caso si no se cuenta con medios selectivos, se puede recurrir primeramente a la reproducción de síntomas para que una vez que se hayan manifestado, el patógeno se aísle de estas muestras, por ejemplo, para aislar a Pseudomonas solanacearum de tubérculos de papa en estado avanzado de descomposición, se toman unas tijeras de punta fina, se flamean y se introducen en el renglón vascular del tubérculo con movimientos de abrir y cerrar, con estas tijeras se seleccionan las hojas cotiledonarias de plantas de tomate y en unos 5 a 6 días se presentará la marchitez, de donde podrá ser aislado al patógeno a partir de los haces vasculares (Nieto, R. 1984). 5.A. AISLAMIENTO DIRECTO (Para muestras con marchitez) 1. Con una navaja flameada y enfriada haga un corte transversal, el tallo que presente flacidez incipiente, de preferencia cerca del nivel del suelo. 2. Haga una ligera presión y espere unos segundos para que salga de las heces vasculares un exudado blanco lechoso. 3. Con el asa previamente flameada y enfriada, tome del exudado y transfiéralo a un tubo con agua destilada esterilizada. 4. Agite el tubo para homogeneizar. 5. Con el asa flameada tome una gota de la suspensión y siempre una caja con medio de cultivo por el método estría cruzada. 6. Incube a 28°C por 24-48 hrs. 7. De las colonias que se desarrollen después de las 48 hrs. Y cuya morfología las transfiere a otra caja con medio de cultivo. 5.B. INMERSION DEL TEJIDO EN AGUA ESTERILIZADA (Para muestras con manchas o tizones) 1. Al microscopio estereoscopico observe los tejidos afectados, para detectar la presencia de exudados o escamas bacterianas, micelio u otras estructuras fungosas. 2. De la zona de avance de la enfermedad haga una preparación en fresco, y observe el microscopio compuesto. 38 3. Si en estas preparaciones observa únicamente células bacterianas, esto le indica que el síntoma se puede deber a bacterias, por el contrario, si observa micelio, lo mas seguro es que el síntoma sea ocasionado por un hongo. 4. Seleccione un tejido enfermo y lávelo con agua esterilizada 5. Corte pequeños trocitos y desinféctelos con una solución de hipoclorito de sodio al 1% durante 1 a 2 minutos. 6. Decante el hipoclorito y lave 3 veces con agua esterilizada. 7. Coloque los trocitos en un tubo con agua destilada esterilizada y déjelos por 5-10 minutos. 8. Una vez transcurridos los 5 ó 10 minutos, tome una gota de la suspensión con el asa bacteriológica y con ella siembre por estría cruzada una caja con medio de cultivo. 9. Después del período de incubación seleccione las colonias bacterianas que se asemejen a las del agente causal, y siémbrelas en una nueva caja con medio de cultivo para obtener así, suficiente cultivo puro y continuar con las pruebas de patógenicidad. 5.C. INMERSION DEL TEJIDO EN AGUA ESTERILIZADA (Muestra con sobrecrecimientos) 1. Con un cepillo pequeño y cerdas suaves lave al chorro del agua el tejido afectado (si se trata de fasciación, estos se harán de la base de las hojas). 2. Coloque los cortes en un tubo con 3ml de agua destilada esterilizada manténgalos así durante unos 10-20 min. 3. Pase 3 asadas de la suspensión anterior a otro tubo con 3ml de agua destilada esterilizada. 4. Siembre 2 cajas con medio de cultivo por estría cruzada. 5. Incube a 22-28°C durante 2-4 días. 6. Seleccione las colonias bacterianas con características del posible patógeno y transfiera a otras cajas con medio de cultivo. NOTA: Cuando el síntoma se sospecha, ser cruzado por Agrobacterium las colonias se hacen visibles a las 36-48 hrs. Si se espera el desarrollo de Rhodococcus las colonias aparecen a los 2 ó 4 días 39 PRÁCTICA 6. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD INTRODUCCION. Para realizar la prueba de patogenicidad, es necesario seleccionar un método de inoculación adecuado al hospedante, y dependerá del tipo de síntoma, órgano o tejido afectado y la vía de entrada del patógeno, además, para tratar de reproducir los síntomas típicos, a nivel de invernadero, también se deben de considerar las condiciones ambientales que permitan la manifestación de los síntomas en el campo. Es preciso señalar que para realizar estas pruebas es necesario que los cultivos bacterianos estén puros y no tengan mucho tiempo de haberse sembrado en medios de cultivo ya que se podría correr el riesgo de perder virulencia. La penetración de las bacterias, a sus hospedantes generalmente es pasiva, esto es, entra a través de heridas o aberturas naturales, por lo que al hacer la inoculación artificial se debe de favoreces su penetración, por este motivo se han ideado diferentes métodos de inoculación entre los que se tienen los siguientes: I. Aspersión a) Manual b) Con presión II. Inyección III. Punción IV. Inmersión en suspensión bacteriana ASPERSIÓN. Esta técnica es recomendable para aquellas bacterias que causan manchas foliares o tizones, porque penetran principalmente por los estomas, también se puede realizar para aquellas bacterias que penetran a través de los nectarios y estigmas como es el caso de Erwinia amylovora, agente causal del tizón de fuego de las rosáceas. La aspersión puede hacerse manual (usando atomizadores De Vilbiss a alta presión, aplicando la suspensión bacteriana a 1.5kg/cm², de esta manera la suspensión entra a través de los estomas a los espacios intercelulares. Las plantas a inocular se deben de mantener en cámara húmeda por lo menos 24 hrs., antes de la inoculación y hasta después de la aparición de síntomas. Cuando se sospecha o se sabe que la bacteria es una pseudomona se recomienda 5 emplear una suspensión bacteriana con 10³ a 10 unidades formadores de colonias por mililitro 6-7 (UFC/ml.), en cambio si se trata de una de xantomona, la suspensión deberá contener 10 UFC/ml., si se emplean dosis mas altas se corre el riesgo de que los síntomas desarrollados no sean los característicos. La aspersión también se puede utilizar para probar aislamientos de Agrobacterium tumefaciens, para esto se pueden utilizar plántulas de tomate, Datura, girasol, caléndula o crisantemo, a las cuales se les hacen unas pequeñas heridas en el tallo, e inmediatamente se 8 asperjan con la suspensión bacteriana 10 UFC/ml. Los tumores se manifiestan después de 2-4 semanas, dependiendo del hospedante empleado. 40 PUNCIÓN. El método más apropiado de inoculación artificial de bacterias causantes de marchitez o pudriciones blandas, es la punción del tallo o tejido carnosos de la planta. Con esta técnica se pueden obtener los síntomas típicos, independientemente del número de células bacterianas. Los tallos u órganos carnosos se pinchan con una aguja, navaja o palillos sumergidos previamente en una suspensión bacteriana. Para el caso de marchitez las plántulas se hieren en el área entre el cotiledón y la primera hoja verdadera, o en la axila. La suspensión bacteriana también puede ser inducida con una jeringa hipodérmica. 6.A. PRUEBAS RÁPIDAS DE PATOGENICIDAD INTRODUCCIÓN. La demostración de la patogenicidad de una cepa bacteriana es un procedimiento complicado que requiere mucho tiempo para que aparezcan los síntomas típicos de la enfermedad en la planta homóloga. En la mayoría de las ocasiones no siempre se dispone de este material, siendo más difícil aún, cuando se trata de árboles. Debido a estos problemas, se ha venido investigando la forma de determinar en un tiempo corto la patogenicidad de un aislamiento bacteriano. A la fecha se tiene la reacción de hipersensibilidad (Kelman), pudrición del tubérculo de papa, inoculación a frutos verdes de peral o manzano (Zwet, et al.,). 6.B. REACCIÓN DE HIPERSENSIBILIDAD INTRODUCCIÓN. La reacción de hipersensibilidad es una prueba muy útil dentro de la fitobacteriología, por que con ella se puede determinar fácil y rápidamente si una bacteria es o no fitopatógena, sobre todo para aquellas bacterias aisladas de muestras con manchas foliares y tizones, aunque también algunas que causan pudriciones pueden dar la reacción positiva. Esta prueba también es útil para la identificación de especies del grupo fluorescente. Metodología. Para llevar a cabo esta prueba, primeramente se prepara una suspensión bacteriana con 7 10 UFC/ml y por medio de una jeringa esterilizada se infiltra a los espacios intercelulares de una hoja de tabaco (Nicotiana tabacum) ya sea a través de la nervadura central o de la lámina foliar. Las plantas tratadas se mantienen a temperatura ambiente de 26 a 30 °C. Si dentro de las 24 horas posteriores a la inoculación la zona infiltrada presenta, pérdida de turgencia o necrosis la prueba se considera positiva. 41 PRÁCTICA 7. MÉTODOS DE CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE FITOBACTERIAS Un prerrequisito indispensable para el control de las enfermedades bacterianas, es la identificación exacta de ellas. La mayoría de las bacterias que afectan a las plantas se pueden identificar fácilmente a nivel de género, pero las especies o patovares son más difíciles de determinar. Actualmente existen métodos muy sofisticados para la identificación, que incluyen la determinación de la composición y homología del DNA, el análisis de los lípidos de la pared celular, y la taxonomía numérica, los cuales no se pueden realizar en todos los laboratorios, por tal razón se debe recurrir a otras pruebas mas sencillas como son las características culturales, fisiológicas o bioquímicas y sexológicas. Las características culturales, determinan los requerimientos nutricionales, así como las condiciones físicas del medio que favorecen el desarrollo de una bacteria en particular. En forma general, las características fisiológicas y bioquímicas se determinan cuando la bacteria a identificar, se hace crecer en la presencia de una sustancia nutritiva específica y después de cierto tiempo, el cultivo se examina para determinar los cambios químicos que se llevaron a cabo. En algunas ocasiones estas pruebas son suficientes para identificar un patógeno. Sin embargo no son enteramente satisfactorias ya que son complicadas y en algunas ocasiones difíciles de interpretar y requieren semanas o meses para completarse, también, no todas las especies de un organismo dan siempre loas mismos resultados. Esto ha impulsado al desarrollo de otro tipo de métodos de identificación que sean más rápidos y fáciles de interpretar, pero esto no se ha logrado totalmente a pesar de los intentos. Uno de estos métodos son los sexológicos. Cuando se introduce parenteralmete un antígeno a un animal este reacciona después de cierto tiempo con la producción de anticuerpos. Los anticuerpos son globulinas, producidas por células mesenquimatosas activas. El suero que contiene los anticuerpos se conoce como suero inmune o antisuero. Una propiedad de los anticuerpos en su habilidad a reaccionar con los antígenos que indujeron su formación pero también son capaces de reaccionar con antígenos similares. La demostración de la reacción entre antígenos y anticuerpo es una prueba extraordinariamente sensible y específica, la cual es la base de los métodos sexológicos. Los antígenos pueden ser proteínas o complejos de proteínas y polisacáridos. La célula bacteriana esta compuesta de muchos antígenos formado el llamado “mosaico antigénico” y se pueden encontrar en la célula (ribosomas, enzimas, proteínas, etc.), pared celular, cápsula y falegelos. Existen diferentes técnicas sexológicas con las cuales se pueden poner de manifiesto la reacción entre antígeno y anticuerpo, las fundamentales son: 42 LA AGLUTINACIÓN. Es el resultado de la reacción entre el suero inmune específico y la bacteria completa por identificar. LA PRECIPITACIÓN. Cuando el suero inmune se mezcla con un antígeno (por ejemplo extractos celulares). Existen otras pruebas como la de doble precipitación en gel, inmunofluorecencia, ELISA, las cuales se basan en la reacción de precipitación. 7.A. MORFOLOGÍA COLONIAL INTRODUCCIÓN. El aspecto general del crecimiento bacteriano en medio de cultivo, con frecuencia nos de una idea acerca de su identidad por eso es conveniente tomar muy en cuenta las características de las colonias bacterianas, sobre todo al realizar aislamientos de patógenos a partir de material enfermo; ya que de esta manera se pueden descartar todas aquellas colonias que no presentan las características del patógeno o patógenos separados.diámetro oscila entre 1-5 mm. Entre las características de morfología colonial que se toman en cuenta están: I. II. III. IV. V. VI. VII. El color Tamaño Forma a. Punteada b. Circular c. Filamentosa d. Irregular e. Rizoide Borde a. Liso b. Desgastado c. Ondulado d. Lobulado e. Filamentoso f. Estriado Elevación a. Plana b. Elevada c. Convexa d. Pulvinada e. Umbilicada Aspecto o consistencia a. Seco. Cuando al tocarlo con el asa se desmorona como si fuera gis b. Húmedo. Fácilmente se separa del medio de cultivo c. Mucoide. Se levanta un hilo al tocarla con el asa y a veces es difícil desprenderla del medio. Características a la luz 1. Luz reflejada a) Si refleja la luz – brillante b) No refleja la luz – mate 2. Luz transimitida a) Deja pasar la luz – traslúcida 43 b) No dejar pasar la luz . opaca. 7. B. CARACTERÍSTICAS DE MORFOLOGÍA CELULAR INTRODUCCIÓN. Entre las principales características de las células bacterianas están su tamaño, formas, arreglo y estructuras, las cuales constituyen la morfología de la célula. Dependiendo de la especie en particular, las células individuales pueden ser: 1) Esféricas, con un diámetro aproximado de 1-2 micras. Otras bacterias, mas alargadas, son los bacilos y pueden observarse muy delgados o gruesos, cortos o largos y curvas o en vírgula. Así mismo, la agrupación de estas bacterias también es variable: bacilos aislados, agrupados en pares o cadenas, unidos en empalizadas o en manojos. 3) por último algunas bacterias son espiraladas, espirilos, espiroquetas y treponemas. Es importante reconocer estos patrones de formas y arreglos porque son características de grupo taxonómico; por ejemplo, las bacterias fitopatógenas, solo presentan la forma de bacilo y dentro de éstos en el género Rhodococcus, sus células presentan una agrupación de empalizada. 7.C. TÉCNICAS DE TINCION PARA DETERMINAR FORMA, TAMAÑO Y AGRUPACIÓN CELULAR Como las células bacterianas son incoloras, se requiere del empleo de colorantes para hacerlas más nítidas al microscopio, para lo cual se pueden emplear técnicas de coloración simples, o diferenciales. TINCIÓN SIMPLE. El azul de metileno de Loeffler es uno de los reactivos más valiosos que se tiene para la tinción de bacterias. Es excelente para las bacterias del género Curtobacterium donde puede demostrarse el perlado y los gránulos. En los bacilos esporulados teñidos con este reactivo, las esporas aparecen como cuerpos no teñidos dentro de células azules. Procedimiento tinción simple 1. Hacer un frote de su bacteria 2. Fijar el aire 3. Teñir con azul de metileno de Loeffler, durante 1 min. 4. Lavar con agua 5. Escurrir y secar 6. Observar al microscopio TINCIÓN DIFERENCIAL. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas es la “Tinción de Gram”, por que no sólo permite determinar la forma y agrupación de las bacterias, sino también es de considerable valor en la identificación y clasificación, al separar a las bacterias en gram negativas y gram positivas. Procedimiento. Tinción diferencial 7. Haga un frote en un porta objetos limpio, séquelo y fíjelo a la flama 8. Adicione a inundar, la solución de cristal violeta, y déjela actuar por un minuto. 9. Decante el colorante y adicione la solución de lugol dejándola también durante un minuto. 10. Decante el lugol 11. Decolore con etanol, hasta que no salga más colorante (30 seg. aproximadamente) 12. Lave al chorro del agua 13. Adicione solución de safranina y déjala actuar durante 30 segundos. 44 14. Decante el colorante y lave con agua 15. Dejar secar al aire y observe al microscopio Las bacterias que retienen el primer colorante, es decir el cristal violeta son gram positivas y las que son decoloradas por el alcohol y adquieren una coloración roja o parda según el colorante de contraste empleado, son gram negativas. 45 IDENTIFICACIÓN INICIAL DE GÉNEROS COMUNES DE BACTERIAS FITOPATÓGENAS A PARTIR DE SCHAAD (2002) Traducida por: M. en C. Gloria Zita Padilla Biól. Javier Hernández Estrada Rogerio Espadas Zita 46 I.- Identificación Inicial de Géneros Comunes. N. W. Schaad A. Introducción Relativamente, son pocas las características diferenciales requeridas para identificar a los géneros de bacterias predominantemente fitopatógenas. Convenientemente, éstas pueden ser divididas en: 1) aquellas que son fácilmente aisladas sobre un medio estándar bacteriológico (tabla 1) y aquéllas las que no lo son (tabla 2). Tabla 1.- Características usadas para diferenciar géneros de procariontes fitopatógenos que crecen sobre un medio estándar. E r w i n i a P a n t o e a A c i d o v o r a x P s e u d o m o n a s R a l s t o n i a B u r k h o l d e r i a X a n t h o m o n a s X y l o p h i l u s A g r o b a c t e r i u m C l a v i b a c t e r C l o s t r i d i u m B a c i l l u s S t r e p t o m y c e s Gram positivas Crecen anaeróbicamente Crecen aeróbicamente Colonias amarillas o naranjas sobre YDC o NBY Colonias mucoides sobre YDC a 30ºC + + - + + +a - + + + - + + + - + +b + + +c - + + + + +d + + + - + + + - N D N D + + - Pigmentos fluorescente sobre KB Pigmentos difusibles no fluorescentes sobre KB Ureasa -c - - + - - - - + + - + V - + - - - - - N D N D N D Oxidasa Crecen a 40ºC Más de cuatro flagelos peritricos Crecimiento sobre agar DIM Forman esporas Micelio aéreo + - V + - + + - +f +g - - - + + - - + V + - V + V + - + + Características - + - N D +, Linajes positivos en un 80% o más, después de cinco días; V, linajes positivos entre 21 a 79%; -, linajes negativos en un 80% o más; ND, no determinado. a- Las colonias de Pantoea citrea y algunos linajes de P. agglomerans son generalmente blancas. b- Las colonias de X. campestres patovares manihotis y mangiferaeindicae son blancas c- Xylophilus crece muy lentamente sobre este medio, pero algunas veces mejor sobre agar nutritivo Difco. d- Las colonias de Clavibacter michiganensis sepedonicus son generalmente blancas. e- Erwinia nigrifluens es positivo. f- Burkholderia andropogodis es negativo a la oxidasa. g. Burkholderia andropogodis y B. glumae pv., agricola son negativas. Los géneros del primer grupo son relativamente fáciles de diferenciar uno de otro, sobre la base de las características presentadas en la Tabla 1 y el diagrama de flujo simplificado, presentado en la figura 1. La reacción Gram está relacionada a las propiedades estructurales y químicas de la pared celular, esta característica sirve como un paso muy básico y rápido en la identificación inicial de bacterias fitopatógenas desconocidas. Esto es importante, la reacción Gram se usa cuando las células están creciendo rápidamente y recién preparadas La prueba anaerobica es una prueba clave para la identificación de los géneros Erwinia, Pantoea y Clostridium. También la presencia de esporas es una prueba clave para la diferenciar a las bacterias Gram positivas. La morfología y pigmentación de la colonia, creciendo a 40ºC y la reacción de oxidasa son pruebas clave para la diferenciación de Acidovorax, burkholderia, Ralstonia y Pseudomonas. Siempre es 47 seguro incluir cultivos conocidos como controles positivos y negativos para cada una de las pruebas. Cuando la identificación en una bacteria no es conocida, es absolutamente esencial que se use un cultivo puro del organismo que se va identificar. Podrían ser clonadas al menos dos veces por rayado sobre un medio de agar no selectivo. Estando seguro que la colonia seleccionada esta bien aislada, dejar crecer por 4 ó 5 días, para asegurar que otras colonias no aparezcan. Las técnicas comerciales automatizadas más rápidas tal como los kits de los análisis de ácidos grasos, biológico y ELISA son usadas para la identificación presuntiva de un gran número de bacterias aisladas del suelo o de las hojas de las plantas; sin embargo, ellas deben estar respaldadas por la identificación final. Miembros del segundo grupo (tabla 2) son relativamente nuevos para los fitopatólogos y están inicialmente identificados sobre la base de: 1. Crecimiento en medio S 2. Crecimiento sobre PW 3. Presencia o ausencia de pared celular 4. Morfología helicoidal Si el crecimiento ocurre en cualquiera de estos tres medio de cultivo, es aconsejable preparar muestras para el microscopio electrónico, y el uso de serología y/o técnicas basadas en PCR . Tabla 2. Caracteres usados para diferenciar bacteria fitopatógenas fastidiosas y no cultivables. Carácter Rhizomonas Xyella fastidiosa Spiroplasma Similar a Fito plasma FloemaLimitada Crecimiento en Medio S + - - - - Crecimiento en Agar PW - + - - - Posesión de pared celular + + - - + Crecimiento en Suero-Agar - - + - - Morfología Helicoidal - - + - - B. Técnicas de aislamiento usando medios semiselectivos y diferenciales. 1. Material vegetal. Cuando se aísla una bacteria fitopatógena desconocida es una buena práctica el uso de varios medios de cultivo a base de agar diferentes. La mayoría de Erwinia, Xanthomonas, Acidovorax, Burkholdera, Ralstonia y Agrobacterium spp. crecen bien y producen colonias características en medio NBY o en YDC. Sin experiencia, es aconsejable el cultivo en estrías, lo que permite comparar las diferentes características coloniales. Unas pocas especies o pathovares no crecen adecuadamente en YDC. Por ejemplo P. Stewartii, X. oryzae, X. albilineans y X. fragariae crecen pobremente en YDC pero en cambio muy bien sobre NBY. Xylophilus ampelinus crece pobremente sobre YDC o sobre NBY pero mucho mejor en Agar nutritivo. La mayoria de los pseudomonadales y diversas especies de Clavibacter spp. crecen bien y son muy características del medio de King (KB) (6) y NBY agar, respectivamente. Si hay sospecha de la existencia de Bacillus o Clostridium, debería emplearse el medio Agar – caseína más glucosa. Uno de los platos debe ser incubado en una cámara anaerobia. Si se sospecha de la existencia de Streptomyces, incluir agua agar. Para el aislamiento, hay que remover una pequeña cantidad de tejido de una porción donde la lesión haya avanzado utilizando un bisturí estéril. El tejido debe ser lavado con agua estéril o esterilizado en superficie por medio de una dilución de 1 a 10 de clarasol doméstico durante 3 minutos. Después de enjuagar en agua 48 estéril, el tejido debe de ser triturado con un bisturí estéril en una con una gota de agua en una caja de petri desechable. Si el tejido es difícil de cortar, se puede usar n mortero estéril. Después de reposar por dos o tres minutos, el macerado es sembrado en estrías con un asa bacteriológica. Si se sospecha que una especie en particular puede ser el agente causal, se deben seguir las técnicas de aislamiento sugeridas para el organismo en particular, las estrías deben de ser hechas en cuatro direcciones en ángulos rectos. Flameando el asa después de cada una de las cuatro direcciones de las estrías. Una colonia individual (bien especiada de las demás), deberá ser resembrada en estrías en uno de los medios para estar seguro que la población bacteriana es pura. Si no hay colonias resultantes de ésta siembra en estrías en medios de cultivo comunes, se debe de determinar si el agente causal es un organismo anaeróbico (Clostridium spp.), un organismo fastidioso (tal como Xylella fastidiosa o Rhizomonas), o a una bacteria no cultivable por tener crecimiento específico en el floema tal como el reverdecimiento de los cítricos (Liberobacter). Por último, los organismos pueden ser identificados mediante el uso de técnicas de PCR 2. Recetas para medios comunes y semiselectivos a. Agar nutritivo (NA) y Caldo nutritivo (NB) Extracto de carne Peptona Agar 3.0 g 5.0 g por Litro 15.0 g Ambos, Agar y Caldo nutritivo, pueden ser adquiridos en forma deshidratada de Difco No agregar Agar si se desea el caldo nutritivo. b. Extracto de levadura-dextrosa-CaCO3 ((YDC) (16)) Extracto de Levadura Dextrosa (glucosa) Carbonato de calcio USP Agar 10.0 g 20.0 g Por Litro 20.0 g 15.0 g Para obtener un medio blanco lechoso, el CaCO3 debe estar macerado finamente, de otro modo, éste se precipitará hacia el fondo. El autoclave se pondrá a 10 PSI por una hora. O bien esterilizar la dextrosa en 100 ml de agua separadamente. El medio, una vez pasado por el autoclave, será refrescado hasta 50° a baño maría y la solución de agua y CaCO3 debe ser suspendido agitándolo antes de ser vertido en las cajas de petri. Para tubos, debe ser usado un vortex, para diluir el CaCO3 en los tubos después del baño maría. c. Caldo nutritivo - extracto de levadura - agar (NBY) (15) Caldo nutritivo (Difco) Extracto de levadura K2HPO4 KH2PO4 Glucosa Agar 2.0 g 15.0 g por litro 8.0 g 2.0 g 0.5 g 2.5 g Después de esterilizar en autoclave, agregar 1.0 ml de una solución estéril de de MgSO4*7H2O 1M d. Medio de Agar B por King et al.’s [(KB(6)] Proteosa peptona #3 (Difco) 20.0 g por litro 49 K2HPO4 MgSO4*7H2O Glycerol Agar e. 1.5 g 1.5 g 15.0 ml 15.0 g Agar caseína más glucosa Caseína ácida hidrolizada Extracto de levadura Glucosa K2HPO4 Agar f. 10.0 g 5.0 g por litro 5.0 g 4.0 g 17.0 g Agua agar por litro 20.0 g Agar g. Agar PW (3) Peptona de soya (Soytona) Tryptona Cloroporfirina (C34H32ClFeN4O4) Rojo fenol (0.2% acuoso) MgSO4*7H2O K2HPO4 KH2HPO4 L – glutamina Agar Suero bovino albúmina V 4.0 g por litro 1.0 g 10.0 mg* 10.0 ml 0.4 g 1.2 g 1.0 g 4.0 g 15.0 g 30.0 ml** *O agregar 10 ml de una solución de NaOH al 0.1% ** Aregar un 20% de solución stock estéril después del proceso de autoclave h. Medio S (14) Rhizomonas es aislada del suelo y del tejido vegetal utilizando este medio Caseína ácida hidrolizada Glucosa K2HPO4 * 3H2O KNO3 MgSO4 * 7H2O Ca(NO3) * 4H2O Sulfato de estreptomicina Agar Noble 5.0 g 10 ml* 11.0 g por litro 2.5 g 1.3 g 0.5 g 0.5 g 60.0 mg * El sulfato de estreptomicina (acuoso, esterilizado, y en solución 15 mg/ml) se agrega al medio después del proceso de autoclave y de haber sido enfriado a 50°C 50 C.- Diferenciación de los géneros más comúnmente aislados. El siguiente diagrama de flujo se puede usar como una guía rápida para una identificación particular de una especie o patovar: │ – Reacción Gram + │ Erwinia, Pantoea, Xylophilus Acidovorax, Burkholderia, Ralstonia Pseudomonas, Xanthomonas Agrobacterium Coryneform Bacillus Clostridium Streptomyces │ + Crecimiento anaerobio – │ │ Erwiniaa Pantoea Agrobacterium Acidovorax Burkholderia Ralstonia Pseudomonas Xanthomonas Xylophilus │ Colonias +Amarillas en YDC– ↓ ↓ Pantoea Erwinia │ + Formación de Endosporas – │ │ Bacillus Clostridiumb │ + Crecimiento anaerobio – ↓ Clostridium ↓ Bacillus │ + Micelio aereo – ↓ Streptomyces ↓ Corneyform │ + Pigmento Fluorescente en KB – ↓ ↓ Pseudomonas + ↓ Agrobacterium, Xanthomonas, Xylophilus, Burkholderia, Acidovorax, Ralstonia. │ Colonias amarillas en YDC/NA Xanthomonasc Xylophilus + Ureasa – ↓ ↓ Coryneform Streptomyces │ + Crece a 33ºC en YDC – ↓ ↓ Xylophilus Xanthomonas Xanthomonas Xylophilus – ↓ Agrobacterium, Acidovorax Burkholderia, Ralstonia │ + Crece en Agar DIM – ↓ ↓ Agrobacterium Acidovorax Burkholderia Ralstonia │ + Utiliza Arginina y Betaina – ↓ Burkholderiad ↓ Ralstonia Acidovorax │ + Crece a 40ºC – ↓ ↓ Acidovorax Ralstonia a Las colonias de pantoea citrae y algunas razas de P.agglomerans son generalmente blancas. b Las células de Clostridia con esporas están abultadas, mientras que Bacillus no lo esta. c Colonias de Xanthomonas cassavae y dos patovares de X. campestres son blancas. d Burkholderia andropogonis es negativa para arginina y betaina. Sin embargo, es negativa a oxidasa, mientras Ralstonia y Acidovorax son positivas. 51 Pruebas y medios de diagnostico. 1.- Reacción Gram. Esta prueba es esencial para la diferenciación de las bacterias fitopatógenas entre dos grupos amplios: Las Gram positivas y las Gram negativas. La técnica sencilla de KOH puede ser usada como una prueba rápida para una identificación presuntiva (13). Sin embargo, la tinción Gram es muy importante cuando se esta identificando una nueva descripción bacterial y no podría ser omitida. a.- Prueba del KOH (13) Mezclar cuidadosamente secreción bacterial con dos gotas de KOH al 3%. Las bacterias Gram negativas llegan a ser pegajosas dentro de este mezclado formándose un hilo pegajoso en un tiempo corto, en las bacterias Gram positivas no sucede esto. b.- La tinción Gram (1, 4, 11, A. Vidaver, Comunicación personal). Las bacterias Gram positivas retienen la tintura primaria, dando una apariencia púrpura o azul oscuro. Las bacterias Gram negativas toman el color de la tinción contraria. Solo unas pocas bacterias no pueden ser fácilmente agrupadas entre una u otra categoría. Los puntos principales en una tinción exitosa son como sigue: a.- Usar reactivos nuevos menores a un año de vigencia. Es necesario atención particular a la solución de yodo. Si la solución no es puesta en una botella café oscura o guardada en la oscuridad, podría decolorarse y ser inefectiva. Los reactivos podrían también vencerse. b.- Usar bacterias de desarrollo reciente, idealmente cultivadas en fase exponencial durante la noche. Las células más viejas de la fase estacionaria pueden tener una reacción Gram variable. c.- Usar controles, un positivo conocido y un negativo conocido. d.- Las manchas bacteriales podrían mostrar algunos grupos bien separados de bacterias. Amontonadas son eludidas. Proceso de tinción: a.- Sobre un portaobjetos limpio y seco extender una capa bacterial delgada al ambiente, sin calor. Luego, flamear ligeramente por debajo del portaobjetos para fijar a las bacterias al portaobjetos. b.- Inundar la mancha con la solución cristal violeta por un minuto. c.- Lavar por goteo con agua unos cuantos segundos. Drenar el exceso de agua y secar ligeramente con un papel secante. d.- Inundar la mancha con solución de yodo por un minuto. e.- Lavar por goteo con agua unos cuantos segundos; secar. f.- Decolorar con un solvente, ejemplo alcohol etílico al 95% , hasta que el flujo del solvente sea descolorido desde el portaobjetos (alrededor de 30 segundos), secar. (Si se decolora con exceso, las bacterias Gram positivas podrían perder color). g.- Enjuagar por goteo con agua, por dos segundos. h.- Contrateñir, por alrededor de 10 segundos, con solución de safranina. i.- Lavar brevemente, por goteo con agua. Secar y examinar. 52 Resultados: Bacterias Gram positivas teñidas de púrpura a azul oscuro. Bacterias Gram negativas teñidas de rojo (lamina 1, Figura 1). Soluciones: a) Cristal Violeta de Oxalato de Amonio. Solución A. Cristal Violeta Alcohol Etilico (95%) 20.0 ml Solución B Oxalato de amonio Agua Destilada 80.0 ml por L. 2.0 g 0.8 g Mezclar las soluciones A y B. Guardar por 24 horas antes de usar. Filtrar a través de de papel al embotellar. b) Solución Lugol de modificación de Gram Yodo Yoduro de Potasio Agua destilada 300.0 ml Por L 1.0 g 2.0 g Permitir que la solución de yodo que se disuelva por varias horas en un lugar oscuro o durante la noche. Alternativamente, moler el yodo seco y el KI en un mortero, añadir agua lentamente. Continuar moliendo hasta que el I y el KI estén en solución. Aclarar la solución con el agua restante, envasar en una botella oscura. c) Decolorantes. 1.- Alcohol Etílico, el agente más lento 2.- Acetona, el agente más rápido. 3.- Acetona-alcohol: intermedio (100 ml de alcohol etílico al 95%; 100 ml de acetona). Con practica, cualquiera de los tres agentes decolorantes pueden rendir resultados buenos. Contrateñido Solución Stock Safranina 0 Alcohol Etílico 95% Solución de Trabajo Solución Stock Agua destilada por L. 2.5 g 100.0 ml 10.0 ml 90.0 ml 2.- Determinación de Esporas (4) . Suspender colonias de bacterias, crecidas sobre un medio de agar, en una gota de agua sobre un portaobjetos en aire seco. Inundar el portaobjetos con malaquita verde acuosa al 5% (p/V) y teñir por 10 minutos. Enjuagar completamente bajo agua corriente y secar ligeramente. Contrateñir por inundamiento del portaobjetos con safranina acuosa al 0.5% (p/V) por 15 segundos. Enjuagar completamente con agua y secar con papel. Observar células a 40X. Las células bacteriales teñidas de rojo y las esporas de verde. 3.- Crecimiento anaerobio (Hugh y Leifson [5]). 53 Peptona NaCl KH2PO4 Agar Bromotimol azul (Solución acuosa 1%) 2.0 g 0.3 g 3.0 g Por L. 5.0 g 3.0 g Disolver los ingredientes y ajustar el pH a 7.1. Adicionar 5 ml del medio basal a tubos de ensaye de 13 cm de diámetro y esterilizar a 121 ºC por 20 minutos. Preparar una solución acuosa de glucosa al 10% y esterilizar por filtración. Adicionar 0.5 ml de glucosa estéril asépticamente a cada tubo de medio basal. Inocular, con organismos, a dos tubos con colorante para hacer pruebas. Cubrir un tubo con una capa de vaselina o parafina derretida estéril de una profundidad de 5 mm. Un color que cambia de azul a amarillo, en ambos tubos, es marcado como positiva para crecimiento anaerobio (ferementación). 4.- Crecimiento sobre agar DIM Celobiosa NH4Cl NaH2PO4 K2HPO4 MgSO4•7H2O Malaquita verde Agar 1.0 g 10.0 mg Por L. 5.0 g 1.0 g 1.0 g 3.0 g 15.O g El medio es ajustado al pH 7.0 antes de meterlo a la autoclave. Útil para la diferenciación de Agrobacterium de Acidovorax, Burkholderia y Ralstonia. 5.- Crecimiento a 33 o 40 º C. Crece en cultivo durante la noche en 5 a 10 ml de líquido NBY en un tubo de ensaye de 25 cm de diámetro sobre un agitador giratorio a 25 -27 ºC. Remover 50 µl y adicionar a un nuevo tubo de NYB e incubar a 40 ºC sobre un agitador rotatorio. Marcar el crecimiento después de 15 y 24 horas. 6.- Ureasa 7.- Prueba de Oxidasa (7). Para el inoculo usar cultivos de 24 horas de crecimiento sobre NGA (podrían resultar negativos falsos si es usada glucosa a mas de 0.25%. Frotar una pequeña asa del inoculo sobre un papel filtro impregnado con una solución acuosa de tetrametil-p-fenilenediamina dihidrocloro al 1% (recién hecha). La raza es clasificada positiva, a la oxidasa, si desarrolla un color púrpura en 10 segundos. (placa 1, figura 2), positiva retardada, si la coloración se desarrolla entre 10 a 60 segundos; y negativo si no desarrolla color después de 60 segundos. Una asa de platino o de plástico o palillo de dientes es recomendado de una de hierro ya puede catalizar la oxidación del compuesto fenilenediamina. Comercialmente las tiras de oxidasa están disponibles en Disco; algunos investigadores prefieren dimetil a tetrametil. 8.- Coloración y Consistencia de colonias sobre agar YDC. Rayar sobre placas de agar e incubar a 30º C. 9.- Pigmentos difusibles fluorescentes y no fluorescentes sobre KB. Rayar sonbre placa de agar e inocular a 25 ºC. Después de 48 horas, observe con iluminación normal para pigmentos no fluorescentes y en la oscuridad con luz de longitud de onda uv (366 nm) para pigmentos fluorescentes. 10. Flagelos. 54 a. Impregnación en plata (de acuerdo a Blenden y Goldberg 1965) Preparación de la bacteria y precauciones: 1. Cultivar las bacterias sobre placas de Agar de medio estándar tal como YDC a 27°C durante 24 a 48 horas. 2. Use como testigos de comparación especies peritricas conocidas tales como E. carotovora o especies polares tales como P. marginalis. 3. Prepare una solución ligeramente turbia y agregue cuidadosamente 1.0 ml de agua destilada inclinando el tubo. 4. No agite mecánicamente el tubo 5. Coloque una gota de agua destilada sobre un portaobjetos limpiado con alcohol. 6. Una alícuota de la suspensión bacteriana es colocada apenas tocando el agua destilada 7. Permita que el portaobjetos se seque al aire Procedimiento de tinción 1. Cubra la preparación con el reactivo A durante 2 a 4 minutos y enjuague con agua destilada 2. Agregue el reactivo B (a pH 10) por cerca de 30 segundos e inmediatamente lave en agua destilada 3. Seque al aire y observe bajo inmersión Resultados Las bacterias y los flagelos estarán teñidos de un color café oscuro a negro con una luz de fondo dorado. Reactivos A. Solución de ácido tánico Ácido tánico Cloruro Férrico Formalina (15%) Hidróxido de sodio (1%) por litro 1.5 g 2.0 ml 1.0 ml 5.0 g Afórese a 100 ml con agua destilada B. Solución de Nitrato de plata amoniacal Nitrato de plata 100.0 ml Separe y guarde 10 ml del nitrato de plata. Entonces agregue Hidróxido de amonio a los 90 ml restantes hasta obtener una fuerte precipitación. Continúe agregando hidróxido de amonio hasta que el precipitado se disuelva. De los 10 ml de nitrato de plata guardados reviértalos en la solución anterior hasta que se ponga ligeramente turbia y se mantenga así. Ajuste el pH a 10 con hidróxido de amonio y nitrato de plata. Úsese este reactivo durante las siguientes 4 horas. b. Microscopía electrónica Prepare un cultivo inclinado en un tubo de ensaye del organismo en prueba en un medio de crecimiento óptimo. Se debe tomar una muestra del cultivo cuando está en la fase logarítmica de crecimiento (15 72h). Sin embargo tambien es útil incubar el cultivo a una temperatura de 2 a 3°C debajo de lo óptimo para el crecimiento. Prepare el cultivo de la siguiente manera: 55 1. Enjuague la base del agar inclinado más o menos 5 veces con agua doblemente destilada y desechar el agua. Esto es para acumular las células que se acumulan en la base del tubo inclinado. 2. Suavemente enjuagar la bacteria de la superficie con aproximadamente 1 ml de agua destilada. 3. Prepare una serie de diluciones empleando una suspensión de cerca de 109 células como concentración inicial. Mezcle las diluciones con cuidado para evitar la pérdida de flagelos. Diluir la suspensión a razón de ½, ¼, 1/16 y 1/32; y después poner una pequeña gota de cada una en diferentes cuadros. Para un avistamiento óptimo la concentración final debería ser 5 células por cuadro en una matriz de 200 cuadros. El uso de agente difusor (detergente) normalmente no es necesario. 4. Sombreo o tinción negativa a) Para ensombrecer, hay que congelar cuadros secos a -10°C en un disecador toda la noche y sombrear con carbon-platinum en un ángulo de 8°. b) Para teñir, coloque la muestra sobre una gota de solucion acuosa de acetato de uranilo por espacio de uno a dos minutos o en fosotugstanato de potasio al 2% de pH 6.5 por 30 segundos. Remueva el colorante tocando el extremo de la gota con un papel filtro. 5. Observe bajo microscopio electrónico. 11. Suero agar (Medio de Liao y Chen) Base PPLO Sacarosa Suero de caballo Rojo fenol Agar 20.2 g por litro 1.5 g 12.0 g 2.5 mg 1.5 g 12.- Determinación de la pared celular. Esta prueba es necesaria para identificar microorganismos tales como micoplasmas o espiroplasmas y debe ser ensayada por un experto en microscopia electrónica. Literatura citada: 1. Annette, E., H. A. Bazows, W. J. Hausller and H. J. Shadomy. 1985. Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology, Washington, D. C. Fourth edition. 2. Blenden, D. C. and H. S. Goldberg. 1965. Silver impregnation stain for leptospira and flagella. J. Bacteriol. 89:899-900. 3. Davis, M. J., W. J. French and N. W. Schaad. 1981. Axenic culture of the bacteria associated with phony disease of peach and plum leaf scald. Curr. Microciol. 6:309-314. 4. Gerhardt; P, (Ed.) 1981. Manual of Methods of General Bacteriology. Am. Soc. Microbiol. Washington, D. C. 5. Hugh, R and Leifson. 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various Gram negative bacteria. J. Bacteriol. 66:24-26 6. King. E. O., M. K. Ward and D. E. Raney. 1954. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescein. J. Lab. Clin. Med. 44:301-307. 7. Kovacs, N. 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178:703. 8. Liao, C. H. and T. A. Chen. 1977. Culture of corn stunt spiroplasma in a simple medium. Phytopathology 67:802-807. 9. Luft, J. H. 1961. Improvements in epoxy resin embedding methods. J. Biophys. Biochem. Cytol. 9:409-414. 10. Menzies, J. D. and C. E. Dade. 1959. A selective indicator medium for isolating Streptomyces scabies from potato tubers or soil. Phytopathology 49: 457-458. 56 11. Meynell, G. G. and E. Meynell. 1970. Theory and practice in experimental bacteriology. 2nd ed. Cambridge University Press, London. 12. Perry, K. L. and C. I. Kado. 1982. Characteristics of Ti plasmids from broad-host-range and ecologically specific biotype 2 and 3 strains for agrobacterium tumefaciens. Bacteriol. 151: 917-918. 13. Suslow, T. V., M. N. Schroth and M. Isaka. 1982. Application of a rapid method for Gram differentiation of plant pathogenic and saprophytic bacteria without staining. Phytopathology 72:917-918. 14. van Bruggen, A. H. C., R. G. Grogan, C. P. Bogdanoff and C. M. Waters. 1988. Corky root of lettuce in California caused by Gram-negative bacterium. Phytopathology 78:1139-1145. 15. Vidaver, A. K. 1967. Synthetic and complex media for rapid detection of fluorescence of phytopathogenic pseudomonads: Effect of the carbon source. Appl. Microbiol. 15:1523-1524. 16. Wilson, E. F., F. M. Zeitoun and D. L. Fredrickson. 1967. Bacterial phloem canker, a new disease of Persan walnut trees. Phytopathology 57:618-621.a 57 DIAPOSITIVAS UTILIZADAS EN CLASE 58 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Base m o lecu la r de la h erenc ia ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Base m o e l cu a l r de la he renc a i • F rie d rich M e i sche r (1869 ). • Jam es W atson ,F ranc s i C ric k y Rosa lin d F rank lin (1953 ). ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Base m o e l cu a l r de la he renc a i • G enes: son un d i ades he red ita ria s que se transm iten de una gene rac ó in a o tra , es tos con tie nen n i fo rm ac ó in cod ificada pa ra na ca rac te rís tica . ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 59 C rom osom as • Estructu ras de va ria s fo rm as y tam años fo rm ada po r nuc leop ro te ín as . • Nucleop ro te ín as – com b n i ac ó i n de ác d io nuc é l ico y p ro te ín as (h is to nas) • Form ada po runa ó dos crom á tid as (he rm anas), un d i as po run cen tróm ero (DNA no está con tra íd o ). ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Ac d i o N uc é l ico • Po lím ero de nuc e l ó tid os . – RNA – DNA • M olécu a l a l rga filam en to sa , es tab e l y con capac d i ad de au to rep licac ó i n. ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 60 Nuc e l ó tid os • La un d i ad bás c i a de DNA y RNA m ole cu a l r. • Con tie ne : – G rupo fos fa to - un d i o a la zúca r po ren a l ce (cova e l n te ) fos fod é i s te r. – Azúcar – P en to sa (C HO de 5 C ). • DNA – D esox ir ib osa • RNA – R b i osa *(la d ife renc a i es la pé rd d i a de l g rupo O H de a l pos c i ó i n #2 ) – Base n itrogenada – • Purin as : (A den n i a y G uan n i a) • P irm i d i n i as : (C itoc n i a ,T m i n i a=DNA y U rac ilo =RNA ) ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Base N itrogenada • Purin as : (A ,G ) – Fo rm adas po rdos an illo s • P ir m i d i n i as: (T ,C ,U ) – Fo rm adas po run an illo bás c i o que con tie ne dos m olé cu a l s de n itrógeno . ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 61 Base N itrogenada • Se unen en tre s im ed a i n te puen te s de h d i rógeno (¿ su func ió n? ) • Só o l una pu rin a con una p ir m i d i n i a , p roduc e i ndo una dob le hé lice sm i étrica . – Aden n i a=Tm i n i a (DNA ) – Aden n i a = U rac ilo (R NA ) – G uan n i a = C ito c n ia ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Estructura de DNA ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 62 O tras p rop e i dades de lD NA • Reg a l de A pa ream e i n to de C ha rga ff – Dc i e que la s bases n itrogenadas se apa rean de ta lm ane ra que e lnúm ero to ta l de pu rinas es g i ua la lnúm ero to ta lde p ir m i d i n i as . S n i em ba rgo , la can tid ad de A +T no es necesa riam en te g i ua la la can tid ad de C +G . A +G /C +T = 1 (P u rin as) (P ir m i d i n i as) E j. 5 ’AAATTTCGGCGT 3 ’ 3 ’T TTAAAGCCGCA 5 ’ 7 + 5 /5 + 7 = 1 A +T= 14 C +G = 10 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ S ín te s is de DNA ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ • Au to rep licac ó i n sem c i onse rva tiva – Luego de a l rep licac ó i n cada una de a l s dos nuevas hé lices va a posee runa heb ra o rig n i a l y una cop a i . S ín te s is de DNA • DNA g irasa – D esen al za ol s nudos o al zos en al cadena de DNA . • • • • • DNA he licasa – sepa ra al s dos heb ras . SSBP – E v ita que se unan al s heb ras . RNA p rim asa – S ni te tiza e l “p rim er”. DNA po lim erasa III – S ni te tiza la nueva heb ra . DNA po lim erasa I– E lim ni a al s bases m a l pa readas (3 ’– 5 ’) y e lim n iao l s “p rim ers” (5 ’– 3 ’) . • DNA lig asa – U ne ol s te rm ni a el s 3 O ’ H con los 5 P ’ O4 de o l s fragm en to s de O kasak i(fragm en to s de D NA de a l heb ra d iscon tin ua ) ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 63 Rep licac ó i n de DNA ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ DNA po lim erasa III – A ñade nuc le o tid es a l ex trem o 3 ’ lib re para fo rm aruna nueva heb ra . DNA po lim erasa I – T iene va rias func io nes: Exonuc leasa – saca lo s p rim ers Endonuc la esa – co lo ca nuc le ó tid os donde es taban lo s p rim ers Ed ito ra – C o rrig e e rro res en e l apa ream ien to Rep licac ó i n de DNA ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 64 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 65 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 66 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 67 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 68 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 69 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 70 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 71 ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ D IFERENC A I C IÓ N DE LO S GÉNEROS DE BACTER A I S F ITO PATÓGENAS M ÁS COMUNES UNAM -FESC Bacte rio o l ga i y V iro o l ga i 2006 - II ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 72 ___________________________________ Reacc ó i n de G ram • Negativ as • Pos itivas • • • • • • • • • • • • • E rw n i a i Pan to ea Xylo ph ilu s Acid ovo rax Bu rkho d l e ria Ra s l to n a i Pseudom onas Xan th om onas Agrobacte rium Coryne fo rm Bac illu s Co l s trid u im S trep tom yces ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ C rec m i e i n to anae rob o i? • SI • E rw n i a i • Pan toeae • NO • • • • • • • Agrobacte rium Ac d i ovo rax Burkho d l e ria Ra s l to n a i Pseudom onas Xan th om onas Xy o l ph ilu s ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Pg i m en to s flu o rescen te s? • SI • P seudom onas • NO • • • • • • Agrobacte rium Ac d i ovo rax Burkho d l e ria Ra s l to n a i Xan th om onas Xy o l ph ilu s ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 73 ___________________________________ Co o l na i s am arilla s en Y CA /N A • SI • NO • Xan th om onas • Xylo ph ilu s • • • • • • Agrobacte rium Ac d i ovo rax Burkho d l e ria Ra s l to n a i Xan th om onas Xy o l ph ilu s ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Co o l na i s am arilla s en Y CA /N A • Xan thom onas • Xyloph ilu s ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Sn i co o l na i s am arilla s en Y CA /N A . • C rece en M ed o i D IM • (con m a a l qu ita ) • Agrobac te rium • No crecen en m ed o i D IM • Acidovo rax • Burkho d l e ria • Ra s l to n a i ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 74 ___________________________________ No crecen en m ed o i D IM • U tiliz a A rg n i n i ay Be ta n i a: • Burkho d l e ria • NO U tiliz an A rg n i n i ay Be ta n i a: • Acidovo rax • C rece a m as de 40°C • Ra s l to n a i • No crece a m as de 40°C ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ G ram Pos itivas • Fo rm an E ndospo ras • NO Fo rm an endospo ras • Bac illu s • Co l strid u im • Coryne fo rm • S trep tom yces ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Con crec m i e i n to anae rob o i? ___________________________________ • SI • NO ___________________________________ • Co l strid u im • Bac illu s ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 75 ___________________________________ Con m c i e lio aé reo? ___________________________________ • SI • NO ___________________________________ • S trep tom yces • Coryne fo rm ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ E rw n i a i • E .ca ro to vo ra ___________________________________ E . am y o l vo ra E .agapan thus ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Pan to ea • P .ag o l m erans ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 76 ___________________________________ Pantoea stewartii ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Pantoea stewartii (Erwinia stewrrtii) ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Pantoea stewartii ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 77 ___________________________________ Agrobac te rium tum e fa sc iens ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Agrobac te rium tum e fa sc iens ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Acid ovo rax avenae (P seudom onas avenae ) ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 78 ___________________________________ Bacterial leaf stripe Acidovorax avenae subsp. avenae (Pseudomonas rubrilieneans) ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Burkho d l e ria (P seudom onas) cepac a i ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Ra ls ton ia so a l nacea rum ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 79 ___________________________________ Pseudom onas syrin gae ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Xyloph ilu s • X .am pe lin us (an te s X an th om onas am pe lin a es a l ún c i a espec e i fitopa tó gena y se p resen ta so o l en v id en Eu ropa ) ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Bac illu s m ega te rium ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 80 ___________________________________ Co l s trid ium ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Coryne fo rm • Este té rm n i o se re fie re a un d ive rso g rupo de bac te ria s po lim órficas .E n m ed ios com p e l jo s es tas bac te ria s tie nen crec m i e i n to s de fo rm as redondas pe ro irregu a l res que va rían am p liam en te en fo rm ,a y tam año , in c u l ye fo rm as rec ta s , cu rveadas… N o fo rm an endospo ras ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Coryne fo rm • Inc u l ye : – A rth robac te r ilis is –Ca l vb i ac te r spp . – Curto bacte rium fla ccum fac e i ns – pv be ta e , p v fla ccum fac e i ns , p v oo rtii, p v po n i se ttia e – Rhodococcus fasc a i ns ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 81 Rhodococcus fasc a i ns en ge ran o i ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Rhodococcus fasc a i ns en ge ran o i ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Ca l vb i ac te rm c i hg i anens s i subsp . sepedon c i us • Pud ric ió n anu a l r de la papa (SENAS IC A ) ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 82 ___________________________________ ___________________________________ Goss’s wilt Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Clavibacter michiganensis ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ Curto bac te rium fla ccum fa c e i ns • Norm a O fic ia lM ex icana PROY -NOM 029 -F ITO -2002 • S011AUSFR IJO L (P haseo u l s vu g l a ris )C u rtobac te rium fla ccum fa c e i ns pv. fla ccum fa c e i ns (=C o rynebac te rium fla ccum fa c e i ns)T ra tam e i n to ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 83 ___________________________________ Coryne fo rm • Este té rm n i o se re fie re a un d ive rso g rupo de bac te ria s po lim órficas .E n m ed ios com p e l jo s es tas bac te ria s tie nen crec m i e i n to s de fo rm as redondas pe ro irregu a l res que va rían am p liam en te en fo rm a y tam año , in c u l ye fo rm as rec tas , cu rveadas… N o fo rm an endospo ras ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ S trep tom yces scab e is ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 1999 ,M igue lA .A ltie r ___________________________________ ___________________________________ S trep tom yces scab e is ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ 84 NORMAS OFICIALES MEXICANAS DE IMPORTANCIA FITOBACTERIOLÓGICA 85 NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-067-FITO-1999, POR LA QUE SE ESTABLECEN LOS PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCION Y CERTIFICACION FITOSANITARIA DE SEMILLA HIBRIDA DE COCOTERO RESISTENTE AL AMARILLAMIENTO LETAL. CONTENIDO 1. Objeto y campo de aplicación 2. Referencias 3. Definiciones 4. Especificaciones 5. Observancia de la norma 6. Sanciones 7. Bibliografía 8. Concordancia con normas internacionales 9. Disposiciones transitorias 1. Objeto y campo de aplicación Esta Norma Oficial Mexicana tiene por objeto establecer los lineamientos para la producción de semilla, polen y planta híbrida de cocotero resistente al amarillamiento letal y alta producción de copra, para el establecimiento de huertas comerciales y planta ornamental. Esta Norma Oficial Mexicana es aplicable a: a) Material reproductivo del cocotero: Frutos para semilla Plántulas Polen b) Areas de producción y desarrollo: Huertas madre Semilleros Viveros 2. Referencias Para la correcta aplicación de esta Norma Oficial Mexicana se debe consultar lo siguiente: Norma Oficial Mexicana NOM-003-FITO-1995, Por la que se establece la campaña contra el amarillamiento letal del cocotero, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 8 de enero de 1997. Norma Oficial Mexicana NOM-015-FITO-1995, Por la que se establece la cuarentena exterior para evitar la introducción de plagas del cocotero, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 22 de abril de 1997. Norma Oficial Mexicana NOM-035-FITO-1995, Por la que se establecen los requisitos y especificaciones fitosanitarias para la aprobación de personas físicas como unidades de verificación, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 16 de enero de 1997. 3. Definiciones 3.1. Aislamiento: Separación espacial entre la huerta madre y otros grupos de palmeras indeseables que pueden ocasionar contaminación genética; 3.2. Amarillamiento letal del cocotero: Enfermedad incurable causada por un fitoplasma, transmitido por el insecto vector Myndus crudus Van Duzze; ataca a la palma de coco (Cocos nucifera) y otras especies de palmáceas; 3.3. Apéndice técnico: Medio o instrumento de información en el que se consignan en forma metódica y específica los procedimientos que deben seguirse para las actividades técnicas y operativas cuyo título es apéndice técnico para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal del cocotero; 3.4. Banco oficial de germoplasma: Huerta de cocotero en el que se conservan las reservas de semillas originales de las variedades mejoradas o formadas por la propia dependencia o por otras personas, de acuerdo con lo dispuesto por la Ley sobre Producción, Certificación y Comercio de Semillas; 3.5. Calidad fitosanitaria: Condición que adquieren los vegetales, sus productos o subproductos por no ser portadores de plagas que los afecten o bien, la presencia de éstas no rebasa los niveles de tolerancia; 3.6. Catálogo de Variedades Factibles de Certificación: En él se inscribirán las variedades de plantas mejoradas o formadas por la propia Secretaría o por particulares, de acuerdo con su descripción varietal, la Ley sobre Producción, Certificación y Comercio de Semillas, su Reglamento y la Ley Federal de Variedades Vegetales; 3.7. Certificación de semillas: Procedimiento que asegura que las semillas cumplen con los lineamientos establecidos en la Ley sobre Producción, Certificación y Comercio de Semillas y su Reglamento, así como el cumplimiento de los lineamientos fitosanitarios establecidos en la Ley Federal de Sanidad Vegetal; 3.8. Contaminación genética: Presencia de polen extraño a los tipos de cocotero que se están usando en los cruzamientos y que da origen a cruzas indeseables; 3.9. Copra: Parte sólida del endospermo del fruto del cocotero (coco), deshidratado y reducido a trozos, que sirve para la extracción de aceites; 86 3.10. Emasculación: Proceso en el que se realiza la eliminación de flores masculinas, un día antes de que emerjan de la espata y de que liberen polen; 3.11. Huerta madre: Lote de palmas de cocotero que ha sido establecida o seleccionada por sus características deseables para la producción de semillas, y/o la realización de cruzas por polinización manual controlada; 3.12. INIFAP: Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias; 3.13. Material vegetativo: Parte de una planta que sirve para multiplicarla asexualmente; 3.14. Muestreo: Actividad que tiene por objeto la obtención de una muestra, de la cual se desea conocer sus características; 3.15. Planta fuera de tipo: Plantas de cocotero detectada en vivero y huertas madre, con características fenotípicas que no se ajustan o difieren de la variedad o ecotipo originalmente planeada; 3.16. Plántula: Etapa fenológica posterior a la germinación que culmina con la individualización de la primera hoja en foliolos; 3.17. Polinización: Transferencia del polen de las anteras a los estigmas; 3.18. Polinización artificial (P. manual controlada): Técnica de transferencia manual del polen a un lote o grupo de palmas de una variedad plenamente identificada, donde el polen proviene de un ecotipo distinto y/o con características particulares que interesa transmitir a la progenie; 3.19. Polinización libre controlada: Técnica de transferencia de polen que se presenta en un lote o grupo de palmeras donde existen dos ecotipos plenamente identificados, con un arreglo topológico que permita la libre polinización del progenitor femenino por el masculino; 3.20. Progenitor femenino: Variedad o ecotipo destinado a recibir, por cualquier técnica, el polen de una variedad o ecotipo generalmente distinto. El Enano Amarillo Malayo es el progenitor femenino más ampliamente usado; 3.21. Progenitor masculino: Variedad o ecotipo seleccionado para producir y donar el polen destinado al progenitor femenino. Los criollos Altos del Pacífico debidamente seleccionados, son los progenitores masculinos más ampliamente usados; 3.22. Secretaría: Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural; 3.23. Semilla: Frutos o partes de éstos, así como las partes vegetales o vegetales completos que pueden utilizarse para la reproducción y propagación de las diferentes especies vegetales; 3.24. Semillas originales: Las resultantes de los trabajos de investigación, formación y mejoramiento de variedades que permanezcan bajo el control de su formador o mejorador, y que constituirán la fuente inicial para la producción de semillas de la siguiente categoría en escala comercial; 3.25. Semillas básicas: Las resultantes de la reproducción de las semillas originales que conserven el más alto grado de identidad genética y pureza varietal; 3.26. Semillas certificadas: Las que desciendan de las semillas básicas o de las registradas cuyo proceso de certificación sea realizado conforme a la Ley sobre Producción, Certificación y Comercio de Semillas; 3.27. Semillas registradas: Las que descienden de las semillas básicas o de las mismas registradas que conservan satisfactoriamente su identidad genética y pureza varietal; 3.28. Semilla híbrida: La que proviene de cruzas simples realizadas en huertas madres por el sistema de polinización manual controlada o por el sistema de polinización libre controlada y donde se pueden certificar los progenitores que intervinieron; 3.29. Semillero o almácigo: Area donde se proporcionan las condiciones requeridas a las semillas, para que éstas sean capaces de germinar y que sus primeras etapas de desarrollo ocurran bajo condiciones óptimas; 3.30. Servicios fitosanitarios: La certificación y verificación de normas oficiales que realizan la Secretaría o las personas físicas o morales aprobadas; 3.31. SNICS: Servicio Nacional de Inspección y Certificación de Semillas; 3.32. Unidad de certificación de acuerdo con la Ley de Producción, Comercio y Certificación de Semillas: Superficie inscrita (unidad de inscripción) o aquella que después de la última inspección de campo, es aceptada por la Delegación del SNICS. Pueden eliminarse de la unidad de inscripción porciones bien definidas de terreno que por causas imprevistas (fenómenos meteorológicos, enfermedades y ataque de plagas, etc.), no satisfagan la normatividad de campo de SNICS. 3.33. Unidad de inscripción: Superficie correspondiente al cultivo de una especie determinada, de una o más variedades, perfectamente identificadas que son de la misma categoría e independientemente proceden del mismo origen, y cuya ubicación no representa problemas de posible contaminación genética en el proceso de polinización; 3.34. Vivero: Sitio donde las plántulas extraídas del semillero continuarán su desarrollo bajo un nuevo manejo consistente en la colocación de cada una de ellas en bolsas de polietileno negro, perforadas y con un sustrato especial. La fase del vivero termina con la individualización de la primera hoja palmeada en foliolos. 4. Especificaciones 87 En este punto se establecen los lineamientos generales para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal de cocotero, los lineamientos técnicos específicos para la producción de este material genético se establecen en el apéndice que contiene los requerimientos técnicos para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal del cocotero. 4.1. Comprobación del origen genético de la semilla. 4.1.1. De la semilla para el establecimiento de la huerta madre. La semilla que se utilice para el establecimiento de huertas madre para producción de cruzas por polinización artificial y para la polinización de cruzas por polinización libre controlada, deben provenir de huertas madre plenamente identificadas e inscritas en el Catálogo de Variedades Factibles de Certificación de la Secretaría (SNICS), para asegurar su pureza genética. Para el caso de huertas madre destinadas a producir polen, la semilla debe provenir de plantaciones plenamente identificadas y autorizadas por la Secretaría a través de las instituciones de investigación. Para el establecimiento de huertas madre, debe preferirse semilla de cocotero inscrita en el Catálogo de Variedades Factibles de Certificación y resistente al amarillamiento letal, como la variedad Enano Amarillo Malayo que servirá de progenitor femenino para la producción de cruzas por polinización artificial y libre controlada. La semilla que dará origen al progenitor masculino productor de polen destinado a la producción de cruzas, debe ser del ecotipo Alto del Pacífico, con resistencia al amarillamiento letal, y provenir de selecciones realizada por el INIFAP y por otras instituciones u organismos, debidamente autorizados por la Secretaría. El material producido en el país deberá contar con el registro de inscripción al Catálogo de Variedades Factibles de Certificación, las etiquetas de certificación de semillas y el Certificado Fitosanitario para la Movilización Nacional correspondiente. Para los fines de producción de material genético híbrido resistente al amarillamiento letal del cocotero, únicamente se permite la importación de nueces y polen que cumplan con las disposiciones establecidas en la presente Norma y en la NOM-015-FITO-1995, por la que se establece la cuarentena exterior para evitar la introducción de plagas del cocotero. 4.1.2. De la semilla certificada. La categoría de la semilla o material vegetativo será certificada por personal oficial de la Secretaría (SNICS) o por el personal fitosanitario aprobado por la misma como unidad de verificación, con base en los descriptores varietales, que permitan la identificación de los materiales y se encuentren en el Catálogo de Variedades Factibles de Certificación de acuerdo con la Ley sobre Producción, Certificación y Comercio de Semillas y su Reglamento. La comprobación del origen de la semilla certificada se efectuará mediante la entrega del Certificado Fitosanitario para la Movilización Nacional que especifique el origen de la semilla y la(s) etiqueta(s) de certificación. La Secretaría puede verificar mediante toma de muestra el estado fitosanitario del lote correspondiente. 4.1.3. Del polen. La comprobación del origen del polen se efectuará mediante la entrega del certificado de origen. 4.2. Unidad de inscripción. Toda persona física o moral que desee producir material de propagación de cocotero debe inscribirse en el Directorio de Productores y Comercializadores de Semillas de la Secretaría (SNICS) y las variedades deben estar insertas en el Catálogo de Variedades Factibles de Certificación (SNICS). 4.2.1. Del aviso de inicio de funcionamiento. Los propietarios o encargados de las huertas, semilleros y/o viveros destinados a la producción de material de propagación de cocotero, resistente al amarillamiento letal del cocotero, deben presentar ante la Secretaría (en las oficinas del SNICS), directamente o a través de las unidades de verificación, el aviso de inicio de funcionamiento, de conformidad con el formato SV-01. Dependiendo del tipo de huerta madre que se registre, se tienen que acatar las disposiciones de manejo, establecidas en el Apéndice que contiene los requerimientos técnicos para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal del cocotero; por lo anterior, las huertas madre se clasifican en dos tipos: a) Para producción de cruzas por polinización manual controlada, y b) Para producción de cruzas por polinización libre controlada. 4.2.2. Requisitos para la instalación o declaración de una huerta madre. Para obtener el número de inscripción de la huerta madre, se deben verificar y certificar que anexo al formato SV-02, se cumpla con los siguientes requisitos: a) Nombre o razón social del solicitante; b) Plano y croquis que detalle la ubicación; c) Superficie en hectáreas y/o número de plantas; d) Procedencia del material vegetativo a utilizar; e) Nombre y registro de los materiales vegetativos que se utilizan como progenitores; f) Fecha de establecimiento o edad de la huerta madre; g) Tipo de huerta madre; 88 h) i) j) k) l) Tipo de material genético a producir; Arreglo topológico de la huerta; Nombre y curriculum vitae del responsable técnico; Cédula de Aprobación del responsable técnico, y Programa de trabajo de acuerdo con el apéndice que contiene los requerimientos técnicos para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal del cocotero. 4.2.3. Semilleros y/o viveros: Toda persona física o moral que desee producir material vegetativo de cocotero debe inscribirse en el Catálogo de Variedades Factibles de Certificación (SNICS) y en el Directorio de Productores y Comercializadores de la Secretaría (SNICS), 30 días antes de su establecimiento. Para la instalación o declaración de un semillero o vivero, además de ajustarse al procedimiento que se señala en el punto 4.2.1. y cumplir los requisitos que se indican en los incisos a, b, c, d, e, f, h, j, k y l del punto 4.2.2. de esta Norma, deben anexarse los siguientes datos: a) Persona o empresa del cual se adquirió la semilla. En caso de no ser propia, exhibir la factura de la compra de la semilla, en la cual se debe incluir la fecha de cosecha de la misma; b) Infraestructura con que se cuenta, y c) Producción estimada de planta terminada. 4.3. Requisitos de los terrenos. El establecimiento de huertas madre, semilleros y/o viveros para producción de híbridos por cualquier método de polinización está sujeto a la autorización de la Secretaría y debe localizarse en áreas donde las condiciones agroecológicas reúnan los requisitos mínimos recomendables para el desarrollo del cultivo del cocotero, de acuerdo con las disposiciones establecidas en el apéndice que contiene los requerimientos técnicos para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal del cocotero. 4.4. Inspección de campo. Los propietarios o encargados de huertas madre, semilleros y/o viveros deberán permitir en cualquier momento el acceso a los profesionales fitosanitarios aprobados como unidades de verificación o a la Secretaría, con la finalidad de llevar a cabo la verificación y certificación del cumplimiento de la presente norma y de los requerimientos técnicos para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal del cocotero contenidos en el apéndice anexo. 4.4.1. En la huerta madre. Al dar aviso de inicio de funcionamiento de la huerta madre, el personal oficial de la Secretaría o personal aprobado por la misma como unidad de verificación, realizará una primer visita en la que se determinará las condiciones de la misma de acuerdo a lo declarado en el aviso de inicio de funcionamiento. 4.4.2. En semilleros y/o viveros. La semilla que se utilice para el establecimiento de semilleros y/o viveros debe ser certificada por la Secretaría a través del SNICS, organismos de certificación o unidades de verificación aprobados por la misma. 4.5. Del manejo del material de propagación. 4.5.1. Manejo de la semilla. El manejo de la semilla obtenida como híbrida, debe ser mediante selección previa para uniformizar características físicas y conservarse en un buen estado fitosanitario antes de ser instalada en el semillero, de acuerdo a lo que se establece en el apéndice que contiene los requerimientos para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal del cocotero. 4.5.2. Manejo de plántulas. Posterior a la germinación de las semillas, las unidades de verificación u organismo de certificación supervisarán los semilleros, para verificar el estado fitosanitario de las plántulas y así poder eliminar plantas que no cumplan con las características requeridas de calidad. Para el establecimiento de viveros y dependiendo de los objetivos de cada uno en particular, sólo se utilizarán las plántulas sanas y típicas del híbrido obtenido de la cruza de cocoteros de progenitores masculinos y femeninos determinados por la Secretaría, o bien plántulas típicas de progenitores femeninos o masculinos y se removerá inmediatamente cualquier planta fuera de tipo. 4.5.3. Manejo en la huerta madre, semilleros y/o viveros. El manejo de la huerta madre, semilleros y/o viveros será estrictamente bajo la supervisión del personal oficial de la Secretaría y/o profesionales fitosanitarios aprobados por la misma como unidades de verificación, contratados por los productores en forma directa o a través de los organismos auxiliares de Sanidad Vegetal, previo cumplimiento de las disposiciones establecidas en los puntos 4.1., 4.2., 4.3. y 4.4. de esta Norma y en el apéndice que contiene los requerimientos técnicos para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal del cocotero. 4.5.4. Recolección y manejo del polen. La obtención de polen debe ser de variedades que demuestren resistencia al amarillamiento letal del cocotero, debidamente identificadas e inscritas en el Catálogo de Variedades Factibles de Certificación, para la obtención de híbridos resistentes al amarillamiento letal se realizará única y exclusivamente con polen de 89 cocotero de aquellas variedades que demuestren la característica de resistencia, de acuerdo a su descripción varietal y con base en lo siguiente: a) De ecotipos de Altos del Pacífico recomendados por la Secretaría. b) De material que se reconozca como mejorado y genéticamente resistente a la enfermedad, seleccionado y recomendado por la Secretaría o por otras instituciones de investigación reconocidas por la misma dependencia. La recolección y el manejo de polen se llevarán a cabo con unidades de verificación contratadas por los productores directamente o a través de los organismos auxiliares de sanidad vegetal o personas físicas interesadas, ajustándose a las recomendaciones establecidas en el Apéndice que contiene los requerimientos técnicos para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal del cocotero, de acuerdo a la técnica de polinización a utilizarse. 4.5.5. Emasculación. El proceso de emasculación y destrucción de flores masculinas para evitar fuentes de contaminación genética debe llevarse a cabo por personal especializado, o bien por técnicos y productores previamente capacitados al respecto, de acuerdo con lo establecido en el apéndice que contiene los requerimientos técnicos para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal del cocotero, bajo la verificación de profesionales fitosanitarios aprobados por la Secretaría como unidades de verificación. 4.5.6. Polinización. Cada inflorescencia femenina sólo debe polinizarse con polen de una sola variedad, previa verificación por la Secretaría directamente o a través de unidades de verificación, de viabilidad y porcentaje de germinación, de acuerdo con el Apéndice que contiene los requerimientos técnicos para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal del cocotero. Previo informe y autorización de la Secretaría, se permitirá el cambio de progenitor masculino a quienes lo soliciten. Las polinizaciones con el nuevo progenitor o variedad deben identificarse claramente en las inflorescencias polinizadas y en las semillas obtenidas. 4.6. Categoría de la semilla a producir. Se certificará toda la semilla de cocoteros Enano Amarillo Malayo, Altos del Pacífico; o bien, híbridos provenientes de cruzas simples realizadas en huertas madre por el sistema de polinización manual controlada o por polinización libre controlada, que posean las características de calidad genética y fitosanitaria especificadas en la presente Norma. La producción de plantas híbridas o típicas de progenitores femeninos y/o masculinos, con categoría de certificadas será supervisada por personal oficial de la Secretaría o profesionales fitosanitarios aprobados por la misma como unidades de verificación, mediante el formato SV-02. La semilla y planta híbrida o típicas de progenitores femeninos y/o masculinos certificada, se identificará de acuerdo a la normatividad vigente en materia de certificación de semillas. 4.7. Unidad de certificación. Una Unidad de Certificación del material vegetativo debe cumplir con las Normas Técnicas del SNICS y con la Certificación Fitosanitaria de los requisitos estipulados por la DGSV (SV-02), para ser aceptada dentro del programa de producción de semillas y material propagativo del SNICS. La Secretaría cancelará total o parcialmente aquella superficie de inscripción que no cumpla los requisitos establecidos en la presente Norma y ponga en riesgo la calidad genética y fitosanitaria de la semilla de toda la unidad. 4.8. Verificación y certificación durante la cosecha y almacenamiento de semillas. Para fines de certificación sólo se permite la cosecha de semillas de palmas que hayan sido verificadas por personal oficial de la Secretaría o aprobado como unidades de verificación por la misma. La semilla cosechada se debe agrupar en lotes bajo supervisión e identificada por el personal oficial de la Secretaría (SNICS) o personal aprobado por la misma como unidades de verificación, quienes verificarán nombre de la variedad o cruza, fecha de inicio y final de cosecha. En semilleros y/o viveros, la selección se realizará con base en las características y al desarrollo de las plántulas, para lo cual, cada lote en el semillero debe estar integrado por semillas de la misma variedad. 4.9. Beneficio de la semilla. En la obtención de semilla a partir de los frutos de una huerta madre para producción de palmas resistentes al amarillamiento letal, debe darse el siguiente beneficio: Lavado, homogeneizado de tamaños, formas y almacenamiento de acuerdo a lo señalado en el Apéndice que contiene los requerimientos técnicos para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal del cocotero. Se debe permitir la inspección o verificación de personal oficial de la Secretaría (SNICS) o por las unidades de verificación, durante todo el proceso de beneficio, para verificar el cumplimiento de la presente Norma y del Apéndice que contiene los requerimientos técnicos para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal del cocotero. El manejo de semilla en huertas madre que se polinicen con dos o más tipos de polen, debe realizarse bajo la supervisión del personal oficial de la Secretaría o por las unidades de verificación, para verificar que no haya riesgo de mezclas, manteniendo la identidad de la semilla. 4.10. Muestreo de la semilla y planta para certificación. 90 La Secretaría (SNICS) o las unidades de verificación realizarán muestreos en huertas madre, semilleros y/o viveros inscritos, para verificar la pureza genética y la fitosanidad de la semilla, de acuerdo con el Apéndice que contiene los requerimientos técnicos para la producción de híbridos resistentes al amarillamiento letal del cocotero. 4.11. Certificación de la calidad. Todo el material de propagación que reúna los requisitos del SNICS y se comercialice en el territorio nacional, debe contar con el certificado de calidad (etiqueta) que avale su certificación; este certificado será otorgado por la Secretaría a través del SNICS o por organismos de certificación aprobados por la misma, de acuerdo a las disposiciones aplicables y supervisadas en los puntos de verificación interna. El envase utilizado en la movilización del material de propagación, debe ser verificado y aceptado por personal oficial de la Secretaría (SNICS) o por las unidades de verificación; con el etiquetado de acuerdo a las disposiciones legales vigentes, conteniendo como mínimo los datos siguientes: a) Cultivo; b) Descripción del producto (semilla o plántula); c) Material (variedad y edad); d) Producida en; e) Producida por; f) Lugar y fecha de Certificación; g) Fecha de producción; h) Con la leyenda “Producto Natural de México, Resistente al Amarillamiento Letal del Cocotero”, y Contenido neto: Semillas, piezas o equivalentes. 4.12. Envase y embalaje. Los envases utilizados en el proceso de certificación y la movilización de semillas deben asegurar su calidad, ser de fácil manejo y asegurar que no sean portadores de la plaga y de su vector u otras plagas. El envase de semilla y planta para su movilización dentro de zonas cuarentenadas por el amarillamiento letal, deberá someterse al tratamiento químico especificado en el punto 4.5.3. de la Norma Oficial Mexicana NOM-003-FITO-1995, Por la que se establece la Campaña contra el Amarillamiento Letal del Cocotero. 4.13. De la Movilización. La movilización de otros productos y subproductos vegetales diferentes a semillas y plantas, así como maquinaria, equipo, envases, embalajes, vehículos y transportes utilizados en la producción de híbridos en zonas bajo control fitosanitario, queda sujeta a las disposiciones establecidas en el punto 4.5. de la NOM-003FITO-1995. Queda estrictamente prohibida la movilización de semillas y/o plantas para uso comercial u ornamental de las huertas madre, semilleros y/o viveros ubicados en zonas afectadas por amarillamiento letal del cocotero, hacia zonas libres de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NOM-003-FITO-1995, Por la que se establece la campaña contra el amarillamiento letal del cocotero. La movilización de semillas y/o plantas o plántulas que se produzcan en una zona bajo control fitosanitario, sólo podrá autorizarse cuando se movilicen hacia una zona bajo control fitosanitario, y aquellas producidas en las zonas libres, podrán movilizarse en todo el territorio nacional. Las semillas o nueces de cocotero, sean de variedades híbridas, de Enano Amarillo Malayo o de ecotipos Altos del Pacífico, pueden movilizarse previo tratamiento con una solución de detergente a una dosis de 10 gramos por litro de agua. Cuando las semillas o nueces se movilicen en costales, éstos deben ser nuevos. En el caso de utilizar costales usados, éstos deben tratarse mediante una aspersión con una solución de diazinón a razón de 1 litro por cada 250 litros de agua y señalar este tratamiento cuarentenario en el Certificado Fitosanitario para la Movilización Nacional. 4.14. Organización de productores. Los productores de semilla y planta híbridas pueden constituirse en Organismos Auxiliares de Sanidad Vegetal, con el fin de: a) Proporcionar recursos económicos para la creación de fondos de contingencia para realizar con agilidad las acciones del programa de certificación. b) Promover la aprobación de su personal técnico por la Secretaría, para el mejor manejo y aprovechamiento del material certificado. 4.15. De los convenios. Para la producción y certificación de semilla y planta híbridas de cocotero resistente al amarillamiento letal, se promoverán convenios como un instrumento por el que la Secretaría, Gobiernos de los Estados y organismos auxiliares de Sanidad Vegetal convienen en conjuntar acciones y recursos, en el que se contemplen programas de trabajo, de investigación, de inspección, de supervisión y de procedimientos de evaluación. 4.16. De la verificación y certificación. Una vez que se ha presentado el aviso de inicio de funcionamiento de una huerta madre, semillero y/o vivero, la Secretaría a través del SNICS, previa verificación en un plazo de 30 días, directamente o a través de 91 las unidades de verificación, contratadas por los organismos auxiliares de sanidad vegetal o persona(s) interesada(s), certificará el cumplimiento de las disposiciones en esta Norma y el aviso de inicio de funcionamiento será devuelto al interesado, con la autorización y el número de inscripción correspondiente, cuando sea presentado por primera vez. Asimismo, cada 180 días de cada año, los propietarios o encargados de la huerta madre, semilleros y/o viveros deben solicitar a las unidades de verificación o a la Secretaría que se verifique y certifique el cumplimiento de las disposiciones establecidas en la presente Norma, debiendo éstas emitir el dictamen correspondiente a través del formato SV-02, del cual se remitirá una copia del mismo a la Secretaría. Este dictamen debe presentarse ante SNICS como un requisito para la obtención de los certificados de calidad del material genético que se produzca. En el caso de la inspección en campo de huertas madre, en un plazo de 15 días después de una visita de verificación, se emitirá el dictamen de certificación mediante el formato SV-02, a través de los profesionales fitosanitarios aprobados como unidades de verificación o por la Secretaría. Para el caso de la producción de semillas que cumplan con las especificaciones técnicas de la certificación del SNICS y de la presente Norma, se emitirá un dictamen de certificación (SV-02) y se entregarán certificados de calidad (etiquetas). Para la movilización de semillas y plántulas de variedades híbridas, de enanos amarillos malayos o altos del pacífico, se requiere la presentación del Certificado Fitosanitario para la Movilización Nacional. Los tratamientos cuarentenarios aplicados a las semillas de variedades híbridas o progenitores femenino o masculino, deben anotarse en el Certificado Fitosanitario para la Movilización Nacional de la Producción de huertas, semilleros y/o viveros, el propietario, responsable o interesado, debe presentar la Certificación correspondiente del SNICS y de cumplimiento de la Norma (SV-02). El Certificado Fitosanitario para la Movilización Nacional debe ser expedido en el lugar de origen, previa verificación por profesionales fitosanitarios aprobados como unidades de verificación o por la Secretaría, en el que se deben señalar el nombre del vendedor, número de inscripción, el registro de la palma, cantidades de semilla de cada una, nombre del comprador, destino final y estado sanitario del material donador. Asimismo, los costos generados por los tratamientos cuarentenarios para la movilización de semillas serán a cargo del interesado. Los gastos que generen los servicios de las personas físicas o morales aprobadas o acreditadas, por concepto de verificación y/o certificación deberán ser cubiertos por los interesados en producir materiales genéticos de cocotero, resistentes al amarillamiento letal. 4.17. Del apéndice técnico. A la entrada en vigor de la presente Norma, la Secretaría pondrá a disposición del público en general, en las oficinas de la Comisión Nacional de Sanidad Agropecuaria a nivel central, en las delegaciones estatales, Distritos de Desarrollo Rural, Centros de Apoyo al Desarrollo Rural y Organismos Auxiliares de Sanidad Vegetal, el apéndice técnico que forma parte integral de esta Norma y que establecerá la descripción y actualización de los procesos, métodos de prueba, mecanismos, procedimientos, tecnologías, materiales y equipos científicamente sustentables para la aplicación de medidas fitosanitarias contempladas en esta Norma. De igual manera, los interesados podrán solicitar la autorización a la Secretaría para utilizar alternativas de los preceptos antes citados, para lo cual deberán acompañar la evidencia científica u objetiva; debiendo evaluarse por la Secretaría con especialistas en la materia y en caso de ser aprobada se incorporará al apéndice técnico. 5. Observancia de la Norma Corresponde a la Secretaría vigilar y hacer cumplir las disposiciones establecidas en esta Norma Oficial Mexicana. 6. Sanciones El incumplimiento a las disposiciones contenidas en la presente Norma será sancionado conforme a lo establecido en la Ley Federal de Sanidad Vegetal, la Ley sobre Metrología y Normalización y la Ley sobre Producción, Certificación y Comercio de Semillas y su Reglamento. 7. Bibliografía Carrillo, R.H. y M. Cortázar R. 1996. Guía Ilustrada para la formación de Híbridos de Cocotero. INIFAPCIRS-Campo Experimental Chetumal. Xul - Ha, Q. Roo. Ruiz, B., P.; Domínguez C., E. y J.I. López A. 1995. Polinización manual para obtener híbridos de cocotero resistentes al amarillamiento letal. INIFAP-CIRS-Campo Experimental Huimanguillo. Publicación técnica No. 1. Cárdenas, Tab. SAGAR. 1997. Manual Operativo de la Campaña contra el Amarillamiento Letal del Cocotero. CONASAGDGSV. México, D.F. SAGAR. 1996. Ley Federal de Variedades Vegetales, publicada el 25 de octubre de 1996 en el Diario Oficial de la Federación. SARH. 1991. Ley sobre Producción, Certificación y Comercio de Semillas, publicada el 15 de julio de 1991 en el Diario Oficial de la Federación. 92 SARH. 1993. Manual para el establecimiento y manejo de huertas madre de cocotero. Chetumal, Q. Roo. SARH. 1993. Propuesta para la Reglamentación de la Producción y Certificación de Semilla Híbrida de Cocotero. INIFAP-CIRS-Campo Experimental Comalcalco. Comalcalco, Tab. SARH. 1993. Reglamento de la Ley sobre Producción, Certificación y Comercio de Semillas, publicado el 26 de mayo de 1993 en el Diario Oficial de la Federación. SARH. 1964. Sugestiones para el mejoramiento y conservación de las plantaciones de cocotero. DGSV. México, D.F. SARH. 1996. Técnicas y normas para la producción y certificación de material genético de cocotero tolerante al amarillamiento letal. INIFAP-CIRS. Mérida, Yuc. 8. Concordancia con normas internacionales Esta Norma no tiene concordancia con ninguna norma internacional por no existir referencia alguna en el momento de su elaboración. 9. Disposiciones transitorias La presente Norma Oficial entrará en vigor a los 60 días después de su publicación en el Diario Oficial de la Federación. Sufragio Efectivo No Reelección. México, D.F., a 12 de Mayo de 1999.- El Director General Jurídico de la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural, Jorge Moreno Collado.- Rúbrica. 93 SV-01 SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA Y DESARROLLO RURAL DELEGACION ESTATAL EN AVISO DE INICIO DE FUNCIONAMIENTO USO EXCLUSIVO DE LA SECRETARIA NUMERO DE INSCRIPCION: _ _ _ _ _ / _ _ / _ _ _ / _ ___ C. JEFE DEL CENTRO DE APOYO AL DESARROLLO RURAL. EN CUMPLIMIENTO A LO DISPUESTO EN LOS ARTICULOS 19, FRACCION I, INCISO f, g Y 44 DE LA LEY FEDERAL DE SANIDAD VEGETAL Y A LA NORMA OFICIAL MEXICANA _______________________________________ DAMOS AVISO DE INICIO DE FUNCIONAMIENTO DEL (LA)__________________________________ PRODUCTOR(A) DE COCOTERO RESISTENTE AL AMARILLAMIENTO, CUYOS DATOS SE MENCIONAN A CONTINUACION: NOMBRE O RAZON SOCIAL: UBICACION: NOMBRE DEL PROPIETARIO O RESPONSABLE: DIRECCION Y TELEFONO: ESPECIES Y VARIEDADES DE LOS PROGENITORES A UTILIZAR: ORIGEN: AREA, SUPERFICIE O CAPACIDAD: TIPO DE MATERIAL POR PRODUCIR: POLEN SEMILLA PLANTA MEDIDAS FITOSANITARIAS APLICADAS: __________________________________ NOMBRE Y FIRMA DEL PROPIETARIO O ENCARGADO LUGAR Y FECHA AUTORIZACION __________________________________ NOMBRE, CARGO, FIRMA Y SELLO EL CROQUIS DE UBICACION AL REVERSO DE LA HOJA ORIGINAL INTERESADO C.C.P JEFE DEL PROGRAMA DE SANIDAD VEGETAL C.C.P JEFE DE PROGRAMA DE SANIDAD VEGETAL SV-02 94 SAGAR SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA Y DESARROLLO RURAL DELEGACION ESTATAL EN CERTIFICACION DE NORMA OFICIAL MEXICANA C. JEFE DEL CENTRO DE APOYO AL DESARROLLO RURAL. EN CUMPLIMIENTO A LO DISPUESTO EN LOS ARTICULOS 19, FRACCION I, INCISO f Y g; 27 Y 44 DE LA LEY FEDERAL DE SANIDAD VEGETAL, A LA NORMA OFICIAL MEXICANA ___________________________________________ Y A LA SOLICITUD DE CERTIFICACION____________, INFORMO A USTED QUE SE HA VERIFICADO LA APLICACION DE LA NORMATIVIDAD FITOSANITARIA EN (LA) ________________________________________________________________________________________ ___________ NOMBRE O RAZON SOCIAL: NUMERO DE INSCRIPCION: __ __ __ __ __ / __ __ / __ __ __ / __ __ __ __ UBICACION: PROPIETARIO O RESPONSABLE (CEDULA PROFESIONAL): DOMICILIO: ESPECIES Y VARIEDADES: AREA, SUPERFICIE O CAPACIDAD: PROBLEMAS FITOSANITARIOS DETECTADOS: MEDIDAS FITOSANITARIAS APLICADAS: POR LO ANTERIOR SE DICTAMINA QUE: ____________________________________ NOMBRE Y FIRMA DEL ORGANISMO DE CERTIFICACION O UNIDAD DE VERIFICACION NUMERO Y VIGENCIA DE LA CEDULA DE APROBACION ___________________________ __________________________________ NOMBRE Y FIRMA DEL PROPIETARIO O ENCARGADO LUGAR Y FECHA C.C.P JEFE DE PROGRAMA DE SANIDAD VEGETAL. 95 SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA, DESARROLLO RURAL, PESCA Y ALIMENTACION NORMA Oficial Mexicana NOM-079-FITO-2002, Requisitos fitosanitarios para la producción y movilización de material propagativo libre de virus tristeza y otros patógenos asociados a cítricos. Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación. LILIA ISABEL OCHOA MUÑOZ, Coordinadora General Jurídica de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, con fundamento en los artículos 35 fracción IV de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 1o., 2o., 3o., 6o., 7o. fracciones XIII, XIX y XXI, 19 fracciones I inciso e) y II; 22, 30, 31, 32, 33, 54, 55 y 60 de la Ley Federal de Sanidad Vegetal; 38 fracción II, 40, 41, 43 y 47 fracción IV de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización y 15 fracciones XXX y XXXI del Reglamento Interior de esta dependencia, y CONSIDERANDO Que la citricultura es una actividad de gran importancia dentro de la fruticultura nacional, por ser fuente de divisas y empleo en los procesos de producción, cosecha, empaque, comercialización e industrialización. Que dentro de los problemas fitosanitarios que atacan a los cítricos, las enfermedades virales constituyen una seria amenaza para la citricultura mexicana, ya que pueden disminuir gradualmente la calidad y rendimiento de los cítricos y matar árboles en un corto periodo, asimismo, la presencia de este tipo de problemas fitosanitarios, generalmente está asociada a restricciones en el comercio de material propagativo. Que la introducción, establecimiento y diseminación de enfermedades provocadas por virus en las diferentes zonas citrícolas del país, provocaría pérdidas considerables en la producción citrícola. Que la calidad fitosanitaria del material propagativo de cítricos, es determinante en la sanidad del cultivo durante las diferentes fases fenológicas, por lo cual se requiere la instrumentación de un programa de registro y certificación de cítricos que tenga como objetivo principal el de fortalecer y fomentar la producción y uso de material propagativo, libre de virus. Que sólo mediante el esfuerzo conjunto y la participación de los productores, viveristas, transportistas, comerciantes, autoridades federales, estatales y municipales y de toda la población en general, se puede llevar a cabo un control fitosanitario efectivo de las enfermedades virales y, de esa manera, evitar su diseminación y establecimiento en las zonas citrícolas del territorio nacional. Que para alcanzar los objetivos señalados en los párrafos anteriores, con fecha 12 de julio de 2001 se publicó en el Diario Oficial de la Federación el Proyecto de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-079-FITO-2000, denominada “requisitos y especificaciones fitosanitarias para la producción y movilización de material propagativo libre de virus tristeza y otras virosis asociadas a cítricos”, iniciando con ello el trámite a que se refieren los artículos 45, 46 y 47 de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; razón por la que con fecha 9 de abril de 2002 se publicaron las respuestas a los comentarios recibidos con relación a dicho proyecto. Que en virtud del resultado del procedimiento legal antes indicado, se modificaron los diversos puntos que resultaron procedentes y por lo cual, se expide la presente NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-079-FITO-2002, REQUISITOS FITOSANITARIOS PARA LA PRODUCCION Y MOVILIZACION DE MATERIAL PROPAGATIVO LIBRE DE VIRUS TRISTEZA Y OTROS PATOGENOS ASOCIADOS A CITRICOS INDICE 1. Objetivo y campo de aplicación 2. Referencias 3. Definiciones 4. Especificaciones 5. Vigilancia de la Norma 6. Sanciones 96 7. Bibliografía 8. Concordancia con normas internacionales 9. Disposiciones transitorias 1. Objetivo y campo de aplicación La presente Norma Oficial Mexicana tiene por objeto establecer la regulación fitosanitaria para la producción y movilización de material propagativo libre de virus tristeza y otros patógenos asociados a cítricos. Las disposiciones de la presente Norma son aplicables a lo siguiente: a) Material propagativo de cítricos - Plantas - Portainjertos - Semillas - Varetas - Yemas - Material in vitro b) Areas de producción de cítricos - Huertos - Viveros - Bancos de germoplasma - Laboratorios de biotecnología - Lotes fundación - Huertas productoras de semilla - Lotes productores de yema - Laboratorios de cultivo de tejidos c) Medios de transporte - Contenedores - Vehículos d) Instalaciones comerciales - Expendios de plantas de ornato o jardinería - Expendios ambulantes e) Otros que la Secretaría determine 2. Referencias Para la correcta aplicación de esta Norma deben considerarse los siguientes ordenamientos legales: Norma Oficial Mexicana NOM-031-FITO-2000, Por la que se establece la campaña contra el virus tristeza de los cítricos, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 10 de agosto de 2001. Norma Oficial Mexicana NOM-011-FITO-1995, Por la que se establece la cuarentena exterior para prevenir la introducción de plagas de los cítricos, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 24 de septiembre de 1996. Norma Oficial Mexicana NOM-007-FITO-1995, Por la que se establecen los requisitos fitosanitarios y especificaciones para la importación de material vegetal propagativo, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 30 de noviembre de 1998. Así como otras que la Secretaría emita con relación a la materia. 3. Definiciones Para efectos de la presente Norma se entiende por: 97 3.1. Agente patogénico: microorganismo capaz de causar enfermedades a los vegetales; 3.2. Apéndice técnico: medio o instrumento de información en el que se consignan en forma metódica y específica, los procedimientos que deben seguirse para las actividades técnicas y operativas, para este caso el título es Manual para la producción y movilización de material propagativo libre de virus tristeza y otros patógenos asociados a cítricos; 3.3. Aprobación: acto por el que la Secretaría reconoce a personas físicas o morales como aptas para operar como organismos nacionales de normalización, organismos de certificación, unidades de verificación o laboratorios de prueba; 3.4. Banco de germoplasma: lote de árboles establecido con material genético de pureza varietal y de calidad fitosanitaria, con fines de investigación, mejoramiento, propagación o conservación; 3.5. Calidad fitosanitaria: condición que adquieren los vegetales, sus productos o subproductos por no ser portadores de plagas que los afecten, o bien, la presencia de éstas no rebasa los niveles de tolerancia; 3.6. Carta garantía: documento expedido por el propietario o representante legal de la unidad de producción, mediante el cual le garantiza al comprador que la yema, semilla o planta que le está vendiendo, pertenece a la variedad o especie de interés; 3.7. Certificación: procedimiento por el que se comprueba que un producto, sistema o servicio vegetal fitosanitario cumple con las normas oficiales, lineamientos o recomendaciones emitidas por los organismos de normalización, tanto nacionales como internacionales; 3.8. Certificado fitosanitario: documento oficial expedido por la Secretaría o las personas aprobadas o acreditadas para tal efecto, que constata el cumplimiento de las disposiciones fitosanitarias a que se sujetan la movilización, importación o exportación de vegetales, sus productos o subproductos; 3.9. Cítricos: plantas y sus partes pertenecientes a la familia Rutaceae, de los géneros Citrus sp., Fortunella sp., Poncirus sp., sus híbridos y variedades; 3.10. Directorio fitosanitario: catálogo de información básica de las unidades de verificación para que constaten las normas oficiales que le son aplicables; 3.11. ELISA: técnica serológica de diagnóstico masivo que consiste en la adsorción de anticuerpos específicos a una placa de poliestireno, seguida de la adición de los antígenos o fitopatógenos los cuales reaccionan con los anticuerpos adheridos a la placa; 3.12. Estación cuarentenaria: instalación fitosanitaria en donde se mantienen temporalmente los vegetales de importación, sus productos o subproductos, y envases que impliquen un riesgo fitosanitario, para confirmación de diagnóstico y, en su caso, saneamiento, tratamiento profiláctico, destrucción o retorno a su país de origen; 3.13. Huerta productora de semilla: huerta que se establece con plantas provenientes de semillas producidas por árboles de huerta productora de semillas, las cuales están injertadas con yemas provenientes de banco de germoplasma, lotes fundación o lotes productores de yema, y que han sido seleccionadas por sus características deseables para la producción de semillas; 3.14. Indexación: comprobación del estado fitosanitario de una planta respecto a enfermedades virosas, mediante la inoculación por injerto de una yema de la misma planta o cualquier otro tejido, sobre una planta indicadora; 3.15. Inspección: acto que practica la Secretaría para constatar mediante verificación, el cumplimiento de las disposiciones fitosanitarias y, en caso de incumplimiento, aplicar las medidas fitosanitarias e imponer las sanciones administrativas correspondientes, expresándose a través de un acta; 3.16. Laboratorio de pruebas: persona moral aprobada por la Secretaría para realizar diagnósticos fitosanitarios, análisis de residuos y calidad de plaguicidas, así como evaluaciones de efectividad biológica de los insumos, en los términos establecidos en la Ley Federal de Sanidad Vegetal y la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 3.17. Lote fundación: grupo de plantas procedentes de semillas producidas por árboles de huerta productora de semillas, las cuales están injertadas con yemas originarias de bancos de germoplasma, de las cuales se tiene interés de obtener semilla o yemas, manteniendo la calidad fitosanitaria y pureza varietal. En este caso, también es posible realizar investigación del comportamiento varietal y agronómico del material; 98 3.18. Lote productor de yema: grupo de plantas procedentes de semilla originaria de huertas productoras de semillas, injertadas con yemas procedentes de banco de germoplasma o lote fundación, de las cuales se tiene interés de obtener yemas, manteniendo la calidad fitosanitaria y pureza varietal; 3.19. Material propagativo: planta o sus partes, que sirve para reproducirla sexual o asexualmente; 3.20. Medidas fitosanitarias: las establecidas en normas oficiales para conservar y proteger los vegetales, sus productos o subproductos de cualquier tipo de daño producido por las plagas que los afecten; 3.21. Movilización: transportar, llevar o trasladar de un lugar a otro con fines de comercialización o distribución, el material propagativo de cítricos libre de VTC, Psorosis, Exocortis, Cachexia y otros patógenos asociados a cítricos que determine la Secretaría. 3.22. Muestreo: actividad que tiene por objeto la obtención de una muestra, de la cual se desea conocer sus características, para determinar niveles de infección por la plaga; 3.23. Patógenos asociados: se considera al virus de la Psorosis, a los viroides de la Cachexia (Xyloporosis) y Exocortis, y a las bacterias Xylella fastidiosa, Xanthomonas axonopodis p.v. citri y Huanglongbing (ex-Greening). Así como aquellos que determine la Secretaría mediante un análisis de riesgo; 3.24. Portainjerto: Planta en la que se injerta otro material vegetativo, de la misma familia o géneros afines; 3.25. PCR (RT-PCR): técnica molecular de diagnóstico que consiste en copiar las cadenas individuales del material genético mediante un termociclador, hasta producir millones de copias. Los resultados se conocen mediante el transiluminador, en el cual se observan los tamaños y distancias de bandas y se comparan con patrones ya establecidos; 3.26. Plaga: forma de vida vegetal o animal o agente patogénico, dañino o potencialmente dañino a los vegetales; 3.27. Secretaría: Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación; 3.28. Tapete fitosanitario: recipiente o poza que contiene una solución desinfectante, que se coloca en la antesala de doble puerta del banco de germoplasma, lote fundación y lote productor de yema para desinfectar el calzado de las personas o las ruedas del equipo que tienen acceso a las instalaciones; 3.29. Termoterapia: técnica que consiste en someter las plantas infectadas, durante periodos comprendidos entre semanas y meses, a temperaturas elevadas a las que se inactivan los patógenos termosensibles. Asimismo, se utiliza en combinación con microinjerto al elevar la temperatura a la que se desarrollan los brotes para eliminar algunos patógenos; 3.30. Tipo varietal: conjunto de características utilizadas comúnmente para identificar cierta especie, variedad o híbrido de cítricos; 3.31. Tratamiento: procedimiento de naturaleza química, física o de otra índole para eliminar, remover o inducir esterilidad a las plagas que afectan a los vegetales; 3.32. Unidad de producción: los bancos de germoplasma, lotes fundación, huertas productoras de semilla, lotes productores de yema y viveros productores de planta sujetos a certificación; 3.33. Unidad de verificación: persona física o moral aprobada por la Secretaría, para prestar servicios de verificación de normas oficiales de acuerdo a lo establecido en la Ley Federal de Sanidad Vegetal y en la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 3.34. Unidad integral: grupo de dos o más unidades de producción certificadas propiedad de una persona física o moral y que se ubican en un mismo lugar; 3.35. Verificación: constatación ocular o comprobación mediante muestreo y análisis de laboratorio, del cumplimiento de las normas oficiales, expresándose a través de un dictamen; 3.36. Viroide: pequeñas moléculas de ácido ribonucleico (RNA) de bajo peso molecular que infectan a las células vegetales, se autoduplican y causan enfermedades; 3.37. Virus: parásito obligado y submicroscópico compuesto por ácido nucleico y proteínas; 99 3.38. Virus tristeza de los cítricos (VTC): patógeno de origen viral del grupo de los closterovirus, que afecta a los cítricos causando entre otros síntomas la declinación de las plantas, disminución de la producción y la muerte de los árboles; 3.39. Vivero: instalaciones dedicadas a la producción de planta sujetas a certificación. 4. Especificaciones La información contenida en este punto es ampliada en el Apéndice técnico denominado “Manual para la producción y movilización de material propagativo libre de virus tristeza y otros patógenos asociados a cítricos”. 4.1 Del aviso de inicio de funcionamiento e inscripción de las unidades de producción. 4.1.1 Las personas físicas o morales interesadas en producir y movilizar material propagativo de cítricos certificado como libre de VTC y otros patógenos asociados a cítricos, deben presentar a la Secretaría, directamente o a través de las unidades de verificación aprobadas en la campaña contra el VTC, el aviso de inicio de funcionamiento para cada una de las unidades de producción de interés, de conformidad con el formato anexo SV-01. 4.1.2 El formato SV-01, debidamente requisitado y por duplicado, debe ser entregado por el interesado o a través de las unidades de verificación, a la Secretaría, directamente en las oficinas de la Jefatura de Programa de Sanidad Vegetal que corresponda, acompañado de la siguiente documentación: a) Solicitud de verificación de cumplimiento de norma conforme al formato anexo SV-03 (original); b) Registro Federal de Contribuyentes con cédula de identificación fiscal (copia); c) En caso de persona moral, copia del testimonio notarial de designación del representante legal (copia); d) Curriculum vitae resumido del responsable técnico, incluyendo copia de la cédula de aprobación vigente en la campaña contra el VTC; e) Comprobante de pago de derechos bajo la tarifa establecida en la Ley Federal de Derechos (original); f) Plano de ubicación de la unidad de producción, así como un croquis interno señalando la distribución de las especies vegetales y fotografías de las instalaciones; 4.2 De la certificación y cumplimiento de Norma. 4.2.1 Una vez que la unidad de producción presenta el aviso de inicio de funcionamiento y documentación solicitada, una unidad de verificación, a petición de parte o la Secretaría, a costo del interesado, verificará en un plazo no mayor de 60 días naturales que la unidad de producción cumple lo estipulado en la presente Norma y en su Apéndice técnico, lo cual deberá asentarse en un dictamen o acta de verificación. Si al realizar la verificación se cumple con lo estipulado en esta Norma, la Secretaría a través de la Dirección General de Sanidad Vegetal otorgará en un plazo no mayor a 10 días hábiles el certificado de cumplimiento de norma, de acuerdo al formato anexo SV-02, quedando la unidad de producción inscrita en el Directorio Fitosanitario. La vigencia de certificación es de un año a partir de emitida ésta. Asimismo, el propietario o representante legal según sea el caso, firmará la carta compromiso de acuerdo al formato anexo SV-04. 4.2.2 Si del resultado de verificación se desprende que no se cumple con las disposiciones de esta Norma, el interesado en un plazo no mayor a 60 días, deberá solicitar otra verificación a través de la Delegación Estatal de la Secretaría, utilizando el formato anexo SV-03. En caso de incumplimiento deberá iniciar el proceso. 4.2.3 El propietario o representante legal de la unidad de producción, 60 días antes del término de la vigencia de la certificación, deberá solicitar directamente a la Secretaría o a través de las unidades de verificación, la verificación y certificación del cumplimiento de esta Norma, de acuerdo al formato anexo SV-03. 4.2.4 Cualquier modificación a las condiciones iniciales bajo las cuales se presentó el aviso de inicio de funcionamiento o se certificó el cumplimiento de la norma, deberá notificarse inmediatamente, directamente en las oficinas de la Jefatura de Programa de Sanidad Vegetal de la Delegación Estatal correspondiente. 4.2.5 El propietario o representante legal de la unidad de producción queda obligado a notificar directamente en las oficinas de la Jefatura de Programa de Sanidad Vegetal de la Delegación Estatal 100 correspondiente, la terminación definitiva de sus actividades, por lo menos 20 días naturales antes de finalizar las actividades. 4.2.6 Las unidades de verificación serán responsables de reproducir la documentación necesaria para realizar la verificación del cumplimiento de norma. 4.2.7 Para la selección de unidades de verificación, los representantes o propietarios de las unidades de producción, deberán consultar el directorio fitosanitario, disponible en la Jefatura de Programa de Sanidad Vegetal de la Delegación Estatal. 4.2.8. La Secretaría o la unidad de verificación, a petición de parte, verificará anualmente el cumplimiento de los requisitos establecidos en la presente Norma para cada unidad de producción. La Secretaría podrá realizar visitas de inspección de cumplimiento de Norma en cualquier fecha del año. 4.2.9 Los gastos que representen los servicios de verificación y/o certificación serán cubiertos por el propietario o representante legal de la unidad de producción. 4.3 De los requisitos y especificaciones de las unidades de producción de cítricos libres de virus. 4.3.1 Banco de germoplasma. Los interesados en certificar o renovar la certificación de un banco de germoplasma deberán cumplir con los siguientes requisitos: a) Todo material genético nacional o de importación que se desee forme parte de un banco de germoplasma, deberá provenir de otro banco de germoplasma nacional certificado o extranjero autorizado por la Secretaría, y comprobar que pasó por un proceso de limpiado que involucre microinjerto y termoterapia; posterior a esto, deberá presentar resultados negativos a VTC, Psorosis, Exocortis, Cachexia y demás plagas que determine la Secretaría, mismos que deben ser obtenidos por un laboratorio de pruebas o por una estación cuarentenaria aprobada. Simultáneamente, deben presentar pruebas negativas a estos virus y viroides por el proceso de indexación. Para el caso de material genético regional, se deberá comprobar que pasó por un proceso de limpiado que involucre microinjerto y termoterapia; posterior a esto, deberá presentar resultados negativos a VTC, Psorosis, Exocortis, Cachexia y demás plagas que determine la Secretaría, mismos que deben ser obtenidos por un laboratorio de pruebas o por una estación cuarentenaria aprobada por la Secretaría. Simultáneamente, deben presentar pruebas negativas a estos virus y viroides por el proceso de indexación. b) El material genético ya establecido debe presentar el registro fitosanitario del último año y el registro de producción de fruta durante los tres últimos ciclos, si está en producción. c) El banco de germoplasma estará formado por lo menos de dos plantas por cada variedad, plantadas dentro de una estructura con malla que impida la introducción de áfidos (malla antiáfidos), antesala de doble puerta y con tapete fitosanitario. Se deberá contar con una réplica a cielo abierto con un mínimo de 4 plantas por cada variedad. d) Todo árbol tendrá un número de registro mediante una etiqueta permanente, según lo indica el Apéndice técnico. e) Presentar un plano de ubicación del banco de germoplasma, así como un croquis interno señalando la ubicación de los árboles, según lo indica el Apéndice técnico. f) Contar con un manual de los procesos de producción y manejo, en el que se describan detalladamente las actividades indicadas en el Apéndice técnico para esta unidad, el cual será revisado en la visita de verificación. g) Contar con un libro de registro de la producción y movilización de material propagativo en el que se asiente la información señalada en el Apéndice técnico. h) Contar con una bitácora de actividades técnicas realizadas, con las características indicadas en el Apéndice técnico. Asimismo, una bitácora en la antesala de la estructura, para el registro de entradas y salidas. i) Contar con un responsable técnico aprobado en la campaña contra el VTC. j) Los árboles deberán ser marcados conforme lo señala el punto 4.6. 101 k) Después de obtener el registro, para cada planta se verificará la fitosanidad por indexado para Exocortis y Psorosis cada 3 años, para Cachexia cada 8 años y para VTC cada 2 años. Además, para confirmación del indexado deberá realizarse una prueba de laboratorio para cada patógeno. En el caso de indexación, se realizará bajo la supervisión de unidades de verificación o personal oficial, de acuerdo a lo señalado en el Apéndice técnico. l) El propietario o representante legal del banco de germoplasma deberá solicitar anualmente la verificación y certificación del cumplimiento de norma. m) Debe llevarse un seguimiento de producción y fitosanidad por planta. 4.3.1.1 Los árboles tendrán una vigencia indeterminada, en tanto no presenten diferencias con sus características originales. 4.3.1.2 Para cosechar y movilizar yemas, éstas deben ser obtenidas, empacadas y etiquetadas según lo indica el Apéndice técnico. 4.3.1.3 Los gastos que representen los servicios de verificación y/o certificación, serán cubiertos por el propietario o representante legal de la unidad de producción. 4.3.2 Lote fundación. Los interesados en certificar o renovar la certificación de un lote fundación, deben cumplir con los siguientes requisitos: a) Los portainjertos deben provenir de semillas de huertas productoras de semilla autorizadas por la Secretaría cuando se trate de material de importación, o de huertas productoras de semilla establecidas en el país, que estén certificadas por la Secretaría. b) Las yemas deben provenir de bancos de germoplasma autorizados por la Secretaría cuando se trate de material de importación, o de bancos de germoplasma establecidos en el país, que estén certificados por la Secretaría. c) Presentar copia de los resultados negativos de las pruebas de verificación de sanidad, para VTC, Psorosis, Exocortis, Cachexia y demás plagas que determine la Secretaría, efectuado por un laboratorio de pruebas o por una estación cuarentenaria aprobada. d) Estar formado al menos por dos plantas de cada variedad bajo protección de malla antiáfidos, antesala de doble puerta y tapete fitosanitario. e) Presentar un plano de ubicación del Lote fundación, así como un croquis interno señalando la ubicación de los árboles, según lo indica el Apéndice técnico. f) Asignar a todo árbol que forme parte del Lote fundación, un número de registro mediante una etiqueta permanente según lo indica el Apéndice técnico. g) Contar con un manual de los procesos de producción y manejo, en el que se describan detalladamente las actividades indicadas en el Apéndice técnico para esta unidad, el cual será revisado en la visita de verificación. h) Contar con un libro de registro de la producción y movilización del material propagativo, donde se asiente la información indicada en el Apéndice técnico. i) Contar con una bitácora de actividades técnicas realizadas, con las características indicadas en el Apéndice técnico. Asimismo, una bitácora en la antesala de la estructura, para el registro de entradas y salidas. j) Después de obtener el registro, para cada planta se verificará la fitosanidad por indexado para Exocortis y Psorosis cada 3 años, para Cachexia cada 8 años y para VTC cada 2 años. Además, para confirmación del indexado deberá realizarse una prueba de laboratorio para cada patógeno. En el caso de indexación, se realizará bajo la supervisión de unidades de verificación o personal oficial, de acuerdo a lo señalado en el Apéndice técnico. k) Los árboles deberán ser marcados conforme lo señala el punto 4.6. l) Contar con un responsable técnico aprobado en la campaña contra el VTC. m) El propietario o representante legal del lote fundación, deberá solicitar anualmente la verificación y certificación del cumplimiento de norma. n) Debe llevarse un seguimiento de producción y fitosanidad por planta. 102 4.3.2.1 La vigencia de producción de cada planta será de 15 años, en tanto no presenten diferencias con sus características originales, al cumplir este periodo deberá ser sustituida. 4.3.2.2 Para cosechar y movilizar yemas, éstas deben ser obtenidas, empacadas y etiquetadas según lo indica el Apéndice técnico. 4.3.2.3 Los gastos que representen los servicios de verificación y/o certificación, serán cubiertos por el propietario o representante legal de la unidad de producción. 4.3.3 Huerta productora de semilla. Los interesados en certificar o renovar la certificación de una huerta productora de semilla, deben cumplir con los siguientes requisitos: a) Los portainjertos utilizados deben ser tolerantes al VTC y provenir de semillas de huertas productoras de semillas autorizadas por la Secretaría cuando se trate de material de importación, o de huertas productoras de semilla establecidas en el país, que estén certificadas por la Secretaría. b) Las yemas para injertar los portainjertos a utilizar en la huerta productora de semilla, deben provenir de árboles establecidos en lotes fundación o bancos de germoplasma autorizados por la Secretaría cuando se trate de material de importación, o de lotes fundación o bancos de germoplasma establecidos en el país, que estén certificados por la Secretaría. c) Deberán establecerse bajo un diseño comercial de acuerdo a los requerimientos de la variedad. d) Las huertas productoras de semilla ya establecidas que nunca han estado certificadas, deberán presentar documentación que compruebe el origen de la planta (portainjerto y variedad) y la calidad fitosanitaria de 100% de las plantas (dictamen negativo a Psorosis). e) Después de obtener el registro, cada 3 años se verificará la fitosanidad para Psorosis en el 10% de las plantas de cada variedad o especie (en cada ocasión deben ser plantas diferentes). f) Presentar un plano de ubicación de la huerta productora de semilla y un croquis interno con la ubicación de los árboles, según lo indica el Apéndice técnico. g) No se permite la plantación intercalada de variedades de cítricos que no tengan como objetivo la producción de semillas. h) Asignar a todo árbol que forme parte de la huerta, un número de registro mediante una etiqueta permanente, según lo indica el Apéndice técnico. i) Contar con un manual de los procesos de producción y manejo, en el que se describan detalladamente las actividades indicadas en el Apéndice técnico para esta unidad, el cual será revisado en la visita de verificación. j) Contar con un libro de registro de producción y comercialización de semilla con las características indicadas en el Apéndice técnico. k) Contar con una bitácora de actividades técnicas realizadas, con las características indicadas en el Apéndice técnico. l) Contar con un responsable técnico aprobado en la campaña contra el VTC. m) Los árboles deberán ser marcados conforme lo señala el punto 4.6. n) El propietario o representante legal de la huerta productora de semilla, deberá solicitar anualmente la verificación y certificación de cumplimiento de norma. o) Presentar una estimación anual de producción de semillas. 4.3.3.1 Pueden formar parte de la huerta productora de semilla, las plantas con vigencia vencida en un lote productor de yema o lote fundación. 4.3.3.2 Los árboles tendrán una vigencia indeterminada. 4.3.3.3 Para cosechar y movilizar semillas, éstas deben ser obtenidas, empacadas y etiquetadas según lo indica el Apéndice técnico. 4.3.3.4 Los gastos que representen los servicios de verificación y/o certificación, serán cubiertos por el propietario o representante legal de la unidad de producción. 103 4.3.4 Lote productor de yemas. Los interesados en certificar o renovar la certificación de un lote productor de yemas deben cumplir con los siguientes requisitos: a) Contar con estructura que tenga malla antiáfidos, antesala de doble puerta y tapete fitosanitario. b) Presentar un plano de ubicación del lote productor de yema y un croquis interno con la ubicación de los árboles, según lo indica el Apéndice técnico. c) Los portainjertos deben provenir de semillas de especies tolerantes al VTC, producidas en huertas productoras de semillas autorizadas por la Secretaría cuando se trate de material de importación, o de huertas productoras de semillas certificadas en el país por la Secretaría, injertados con yemas de las variedades de interés provenientes de un lote fundación o banco de germoplasma autorizados por la Secretaría cuando se trate de material de importación, o de un lote fundación o banco de germoplasma establecidos en el país y que estén certificados por la Secretaría. Para el caso de material genético regional, comprobar que pasó por un proceso de limpiado que involucre microinjerto y termoterapia; posterior a esto, deberá presentar resultados negativos a VTC, Psorosis, Exocortis, Cachexia y demás plagas que determine la Secretaría, mismos que deben ser obtenidos por un laboratorio de pruebas o por una estación cuarentenaria aprobada por la Secretaría. Simultáneamente, deben presentar pruebas negativas a estos virus y viroides por el proceso de indexación. d) Para recertificación, se presentará para el total de las plantas el diagnóstico negativo a VTC (anual), así como para Cachexia, Exocortis y Psorosis (cada tres años). e) Asignar a todo árbol que forme parte del lote productor de yemas, un número de registro mediante una etiqueta permanente con las características indicadas en el Apéndice técnico. f) Contar con un manual de los procesos de producción y manejo, en el que se describan detalladamente las actividades indicadas en el Apéndice técnico para esta unidad, el cual será revisado al momento de realizar la verificación. g) Contar con un libro de registro de producción y movilización de yemas en el que se asiente la información señalada en el Apéndice técnico. h) Contar con una bitácora de actividades técnicas realizadas, con las características indicadas en el Apéndice técnico. Asimismo, una bitácora en la antesala de la estructura, para el registro de entradas y salidas. i) Presentar una estimación anual de producción de yema. j) Contar con un responsable técnico aprobado en la campaña contra el VTC. k) Los árboles deberán ser marcados conforme lo señala el punto 4.6. l) El propietario o representante legal del lote productor de yemas deberá solicitar anualmente la verificación y certificación de cumplimiento de norma. 4.3.4.1 Las plantas tendrán una vigencia de 5 años a partir de la primera cosecha de yemas, después de este tiempo ya no se consideran aptas para producir yemas. 4.3.4.2 Para cosechar y movilizar yemas, éstas deben ser obtenidas, empacadas y etiquetadas según lo indica el Apéndice técnico. 4.3.4.3 Los gastos que representen los servicios de verificación y/o certificación serán cubiertos por el propietario o representante legal de la unidad de producción. 4.3.5 Vivero. Los interesados en certificar o renovar la certificación de un vivero deben cumplir con los siguientes requisitos: a) Presentar un plano de ubicación del vivero y un croquis interno en el que se señale la ubicación de las áreas y plantas, según lo indica el Apéndice técnico. 104 b) Presentar información que avale que los portainjertos utilizados provienen de semilla de una huerta productora de semilla autorizada por la Secretaría cuando se trate de material de importación, o de huertas establecidas en el país, que estén certificadas. c) Los portainjertos utilizados deben ser tolerantes al VTC, a excepción de aquellos que sean injertados con limón mexicano (Citrus aurantifolia) y limón verdadero (Citrus limon) donde se podrá utilizar cualquier portainjerto, siempre y cuando se cuente con diagnósticos negativos a virus y demás plagas que determine la Secretaría. d) Presentar información que avale que las yemas utilizadas para injertar los portainjertos provienen de lotes productores de yemas autorizados por la Secretaría cuando se trate de material de importación, o de lotes productores de yema establecidos en el país, que estén certificados. e) Identificar por bloques de plantas mediante letreros que indiquen la variedad comercial y el portainjerto utilizado. f) Contar con un manual de producción en el que se describan detalladamente las actividades indicadas en el Apéndice técnico para esta unidad. g) Contar con un libro de registro de la producción y movilización, en el que se asiente la información indicada en el Apéndice técnico. h) Contar con una bitácora de actividades técnicas realizadas, con las características indicadas en el Apéndice técnico. i) Contar con un responsable técnico aprobado en la campaña contra el VTC. j) El propietario o representante legal del vivero productor de planta, deberá solicitar anualmente la verificación y certificación de cumplimiento de norma. k) Presentar un estimado de producción anual de plantas. 4.3.5.1 A fin de verificar y comprobar la fitosanidad del vivero a VTC, se deberán remitir muestras de 2% de las plantas que se van a movilizar con fines comerciales, a un laboratorio de pruebas aprobado por la Secretaría. Dichas muestras se deberán tomar bajo la supervisión de una unidad de verificación. 4.3.5.2 La planta producida sólo se autorizará para establecimiento de huertos y no para reproducir material propagativo. 4.3.5.3 Los gastos que representen los servicios de verificación y/o certificación, serán cubiertos por el propietario o representante legal de la unidad de producción. 4.4 Del diagnóstico. 4.4.1 Para realizar análisis de VTC por la técnica de diagnóstico ELISA, se podrán mezclar 5 muestras simples para formar una muestra compuesta. En el caso de Cachexia, Exocortis y Psorosis, cada muestra compuesta estará formada por 20 muestras simples, y éstas se diagnosticarán por la técnica de PCR. La Secretaría podrá validar y autorizar el uso de otras técnicas de diagnóstico, lo cual se dará a conocer mediante oficio circular emitido por la Dirección General de Sanidad Vegetal. 4.4.2 Para el caso único de unidades integrales formadas por banco de germoplasma, lote fundación y lote productor de yema, y específicamente para el material nacional obtenido por microinjerto y sometido a pruebas de indexación para formar el banco de germoplasma, el diagnóstico serológico y molecular para obtener la certificación será de la siguiente manera: se analizará el 100% del material del banco de germoplasma y lote fundación para diagnóstico de Cachexia, Exocortis, Psorosis y VTC mediante muestras compuestas, y 10% del material del lote productor de yema para diagnóstico de VTC (10% por especie y variedad) mediante muestras compuestas. 4.5 De la movilización. 4.5.1 Para la movilización de plántulas, semillas y yemas de unidades certificadas, no se requerirá de diagnóstico fitosanitario. En el caso de plantas, se deberán analizar para VTC el 2% de las que se van a movilizar, además de lo anterior, las que se movilicen en cepellón deben recibir un tratamiento al suelo con un 105 insecticida registrado ante la Comisión Intersecretarial para el Control del Proceso y uso de Plaguicidas, Fertilizantes y Sustancias Tóxicas (CICOPLAFEST). 4.5.2 La autorización de movilización de material propagativo de unidades certificadas, será otorgada por la Delegación Estatal de la Secretaría, dicha autorización es requisito para que la unidad de verificación o el personal oficial emita el certificado fitosanitario para la movilización nacional. 4.5.3 Cada embarque de material propagativo de las unidades de producción certificadas que se movilice hacia cualquier parte del país, deberá contar con el certificado fitosanitario para la movilización nacional, el cual deberá ser expedido por unidades de verificación ajenas a las unidades, o en caso de no existir unidades de verificación en la materia, será expedido por personal oficial, a petición de parte. Dicho certificado se entregará al momento de embarcar el material propagativo. 4.5.4 Para el caso de movilización de plántulas, éstas deberán proceder de semilla de huertas productoras de semillas certificadas, y ser producidas en semilleros que se localicen en áreas libres del pulgón café de los cítricos. 4.5.5 Para la movilización de material propagativo con fines comerciales, el vendedor deberá entregar una carta garantía del tipo varietal. 4.5.6 La Delegación Estatal de la Secretaría, deberá informar mensualmente a la Dirección General de Sanidad Vegetal de las autorizaciones emitidas para cada unidad de producción. 4.6 De la clasificación. Para identificar los portainjertos utilizados en bancos de germoplasma, lotes fundación, huertas productoras de semilla y lotes productores de yema, se marcarán con una o dos bandas de pintura indeleble de 2.5 cm de ancho cada una, usando los siguientes colores: Portainjerto Primera banda Café Café Café Rojo Amarillo Café Azul Café Azul Café Rojo Anaranjado Amarillo Blanco Morado Verde Segunda banda Amarillo Azul Verde Rojo Amarillo Anaranjado Verde Blanco Citrange Carrizo Citremon 1449 Citrumelo Swingle Mandarina Cleopatra Limón Rugoso Savage Citrange Taiwanica Citrange Troyer Volkameriana Yuma C. amblycarpa Flying Dragon Sunki C. macrophylla C-35 Beneke Los portainjertos y colores podrán ser incrementados según lo determine la Secretaría. 5. Vigilancia de la Norma Corresponde a la Secretaría vigilar las disposiciones establecidas en la presente Norma Oficial Mexicana. 6. Sanciones El incumplimiento a las disposiciones contenidas en la presente Norma será sancionado conforme a lo establecido en la Ley Federal de Sanidad Vegetal y la Ley Federal sobre Metrología y Normalización. 7. Bibliografía 106 Agrios, N.G. Fitopatología. 1991. Limusa, México. pp. 648-651. Cavazos-Aguirre, A.J. y Peña del Río, M.A. 1987. Sistema de registro y certificación. Campo Experimental General Terán. INIFAP/SAGAR. México. Inédito. Frison, E.A. and Taher, M.M. (Eds.) 1991. FAO/IBPGR Technical Guideline for the safe movement of citrus germplasm. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome/International Board for Plant Genetic Resources, Rome. INIFAP-DGSV.1993. Programa Mexicano de Registro y Certificación de Cítricos, México. Rocha-Peña. et al. 1992. El Virus de la Tristeza y sus insectos vectores: Amenaza potencial para la citricultura en México (Publicación Especial No. 1). SAGAR-INIFAP, 48 pp. Roistacher, C.N. 1992. Graft transmissible diseases of citrus: handbook for detection and diagnosis. Food and Agricultural Organization. Rome, Italy. 8. Concordancia con normas internacionales Esta Norma no tiene concordancia con ninguna norma o recomendación internacional, por no existir referencia al momento de elaborar la presente. 9. Disposiciones transitorias Primera. La presente Norma Oficial Mexicana entrará en vigor al día siguiente al de su publicación en el Diario Oficial de la Federación. Segunda. En tanto no existan unidades de verificación aprobadas en la materia, personal oficial realizará las actividades de las mismas. Tercera. En tanto no se cuente con los descriptores varietales, se utilizará la carta garantía, misma que será proporcionada por el propietario o representante legal de la unidad de producción. En la Ciudad de México, Distrito Federal, a trece de mayo de dos mil dos.- La Coordinadora General Jurídica de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, Lilia Isabel Ochoa Muñoz.- Rúbrica. 107 SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD, INOCUIDAD Y SV-01 CALIDAD DIRECCION GENERAL DE SANIDAD VEGETAL AGROALIMENTARIA PROGRAMA DE CERTIFICACION DE MATERIAL PROPAGATIVO DE CITRICOS LIBRE DE VIRUS AVISO DE INICIO DE FUNCIONAMIENTO C. JEFE DE PROGRAMA DE SANIDAD VEGETAL EN CUMPLIMIENTO A LO DISPUESTO EN LOS ARTICULOS 7 FRACCIONES XIII, XIX, Y XXI; 19 FRACCION I INCISOS f, g, i y l; y 44 DE LA LEY FEDERAL DE SANIDAD VEGETAL Y A LA NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-079-FITO-2002, REQUISITOS FITOSANITARIOS PARA LA PRODUCCION Y MOVILIZACION DE MATERIAL PROPAGATIVO LIBRE DE VIRUS TRISTEZA Y OTROS PATOGENOS ASOCIADOS A CITRICOS, DAMOS AVISO DE INICIO DE FUNCIONAMIENTO DEL (LA)___________________________________________________ CUYOS DATOS SE MENCIONAN A CONTINUACION: NOMBRE O RAZON SOCIAL: UBICACION: NOMBRE DEL PROPIETARIO Y/O REPRESENTANTE LEGAL: DIRECCION Y TELEFONO: MATERIAL PROPAGATIVO DE CITRICOS QUE PRODUCE Y/O COMERCIALICE: AREA, SUPERFICIE O CAPACIDAD: PROCEDENCIA DEL MATERIAL (anexar comprobantes): _______________________________________________ NOMBRE Y FIRMA DEL PROPIETARIO O REP. LEGAL LUGAR Y FECHA EL CROQUIS DE UBICACION AL REVERSO DE LA HOJA ORIGINAL INTERESADO C.C.P. DIRECCION GENERAL DE SANIDAD VEGETAL. 108 SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD, INOCUIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA DIRECCION GENERAL DE SANIDAD VEGETAL PROGRAMA DE CERTIFICACION DE MATERIAL PROPAGATIVO DE CITRICOS LIBRE DE VIRUS SV-02 CERTIFICADO DE CUMPLIMIENTO DE NORMA En cumplimiento a lo dispuesto en los artículos 7 fracciones XIII, XIX, y XXI; 19 fracción I incisos d, f, g, i y l; y 44 de la Ley Federal de Sanidad Vegetal y a la NOM-079-FITO-2002, Requisitos fitosanitarios para la producción y movilización de material propagativo libre de virus tristeza y otros patógenos asociados a cítricos, y a la orden o solicitud de certificación o verificación No. ____________________ de fecha __________________________ expedida por ________________________________________, esta Secretaría informa que la empresa ___________________________________________ha quedado inscrita en el directorio fitosanitario como: Número de inscripción:__ __ __ ___/ __ __ / __ __ __ / __ __ __ __con vigencia del:_______________ _____________ al ____________________ ubicado en:___________________________________ ________________________________________________________________________________ Que la faculta para llevar a cabo la producción y/o comercialización de ________________________ certificadas de cítricos. La empresa asume la responsabilidad del uso debido de la facultad conferida y de la documentación oficial a su cargo, en caso contrario se hará acreedor a las sanciones estipuladas en la legislación vigente. Nota: Esta carta debe ser colocada en un lugar visible del establecimiento y tiene validez hasta el vencimiento de la vigencia de la aprobación. ATENTAMENTE ____________________________ EL DIRECTOR GENERAL DE SANIDAD VEGETAL México, D.F., a de de SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD, INOCUIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA DIRECCION GENERAL DE SANIDAD VEGETAL SV-03 109 PROGRAMA DE CERTIFICACION DE MATERIAL PROPAGATIVO DE CITRICOS LIBRE DE VIRUS NUMERO DE ENTRADA Y SELLO DE RECEPCION SOLICITUD PARA LA VERIFICACION Y/O CERTIFICACION DEL CUMPLIMIENTO DE LA NORMA LUGAR Y FECHA C. JEFE DE PROGRAMA DE SANIDAD VEGETAL O UNIDAD DE VERIFICACION RAZON SOCIAL, DOMICILIO, TELEFONO Y FAX. CON FUNDAMENTO EN EL ARTICULO 44 DE LA LEY FEDERAL DE SANIDAD VEGETAL, COMPAREZCO ANTE USTED PARA SOLICITAR LA DEL CUMPLIMIENTO DE LA NORMA OFICIAL NOM-079-FITO-2002, REQUISITOS FITOSANITARIOS PARA LA PRODUCCION Y MOVILIZACION DE MATERIAL PROPAGATIVO LIBRE DE VIRUS TRISTEZA Y OTROS PATOGENOS ASOCIADOS A CITRICOS, MANIFESTANDO CONOCER LO ESTABLECIDO EN ESTA. ATENTAMENTE PROTESTO DECIR VERDAD ___________________________ NOMBRE, FIRMA Y DOMICILIO PARTICULAR DEL PROPIETARIO O REPRESENTANTE LEGAL C.C.P. DIRECCION GENERAL DE SANIDAD VEGETAL. 110 SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD, INOCUIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA DIRECCION GENERAL DE SANIDAD VEGETAL PROGRAMA DE CERTIFICACION DE MATERIAL PROPAGATIVO DE CITRICOS LIBRE DE VIRUS SV-04 CARTA COMPROMISO Con fundamento en lo dispuesto en la NOM-079-FITO-2002, requisitos fitosanitarios para la producción y movilización de material propagativo libre de virus tristeza y otros patógenos asociados a cítricos. La empresa_________________________________________________________________ Con certificado fitosanitario de cumplimiento No.___________________ de la NOM-079-FITO-2002, requisitos fitosanitarios para la producción y movilización de material propagativo libre de virus tristeza y otros patógenos asociados a cítricos. Se compromete ante la Secretaría a: 1.- Cumplir con las normas oficiales, procedimientos y requisitos que establezca la Secretaría, para la operación de la unidad de producción, bajo su responsabilidad. 2.- Acatar y no influir en la certificación de los tratamientos que emita el personal aprobado. 3.- No emitir dictámenes para beneficio propio. 4.- Presentar y enviar a la Secretaría, informes sobre la producción y comercialización de yemas, semilla y/o plantas certificadas. 5.- Cooperar con la Secretaría en los casos en que se requiera y en situaciones de emergencia fitosanitaria. 6.- Cumplir con las obligaciones a su cargo. El incumplimiento de estos compromisos o el uso indebido de la facultad será objeto de la aplicación de las sanciones que marca la Ley Federal de Sanidad Vegetal. México, D.F., a _____ de __________ de_____ DE ACUERDO __________________________________ REPRESENTANTE LEGAL 111
