Aspectos biogeoquímicos del uso de piretroides en ambientes costeros de la región centro sur de Chile Fernandez Camila, Rain Angel, Jeffrey Wade, Molina, Veronica Camila Fernandez CNRS-Laboratory of Microbial Oceanography -France LIA MORFUN-Dept Oceanography INCAR center for Aquaculture Research Universidad de Concepcion -Chile fernandez@obs-banyuls.fr Para hoy: • • • • • Introduccion Metodos Resultados region de Chiloé Resultados region central Conclusiones preliminares INTRODUCCION Emamectine Benzoate Introduced in the 1990’s Caligus rogercreseyii Deltametrine Introduced in 2007 Efectos de toxicidad de pesticidas han sido estudiados en invertebrados. Pero ¿Que hay mas alla de la Toxicidad? ¿Pueden estos compuestos alterar los fluxos biogeoquimicos? Azametiphos Ntroduced in 2013 Desde 1982 caligidiosis es uno de los mayores problemas de la industria salmonicola, Principalmente en trucha arcoiris y salmon coho. Objetivos : Evaluar efectos de pesticidas en la comunidad microbiana. Evaluar posibles vias de utilizacion microbiana de pesticidas (fuente de C) y las implicancias para la produccion primaria en zonas impactadas por salmonicultura. N2O Chemoautotrophic ativity: nitrification Primary production NH4+ NH4+ NO2- NO2- NO3- NO3NO2- N2 Anammox N2O N2 Denitrification Emamectin Benzoate: 100 mg/1 L H2O Deltamethrin: 250 mg/100 ml 95% Ethanol Dos Experimentos: (I) Produccion bacteriana : Incorporacion de 3H-Leucine 20 nM concentracion final, 4 hr de exposicion PAR+UVR Experimentos en duplicado, submuestreo en triplicado (II) Efecto de Azamethiphos sobre produccion bacteriana 4 h exposicion PAR+UVR Stock solution 250 mg/ 300 ml H2O Data Wade Jeffrey & Maria Kondrat’yev University of West Florida Bacterial Production: Emamectin Benzoate (EMB) I means “irradiated” Bacterial Production: Deltamethrin (DM) and mixture I means “Irradiated” METODOS: Approach biogeoquimico Incubaciones in situ 13C/15NH 4 Light/Dark 13C/15NH + Azametifos 4 13C/15NH + Azametifos + 4 13C/15NH + Deltametrina 4 Llico Region del Bio BIo Deltametrina Incubacion in situ (ciclo solar) Alta frecuencia (2-6h) CMF (Abundancia celular) Nutrientes 13C y 15N en POM filtracion IRMS IRMS QCONTRO Caucahue – Region de CHiloé L Diversidad (DNA; RNA) Q 3 Q 1 Q 1 0 Q 5 Q 2 Q 6 Q 9 Q 7 Q 8 Seguimiento estacional 2014-2016 Estimacion tasas Uptake C y N RESULTADOS: Variabilidad ambiental Canal Caucahue El análisis de componentes principal permitió observar dos grupos de estaciones separadas principalmente por el periodo de muestreo (Inverno 2014 y verano 2015). Se encontraron mayores temperaturas en el verano 2015 en comparación en el inverno 2014. La segunda fuente de variabilidad fue la concentración de nutrientes en la columna de agua, principalmente NO3, registrando mayores concentraciones en invierno (max: 2.98 µmol L-1) comparado con el periodo estival (max: 0.92 µmol L-1). Se observaron también variaciones en la concentración de oxigeno en la columna de agua, con concentraciones que tienden a ser mayores en verano (7.01 ± 1.00 mL L-1) que en invierno (5.72 ± 1.02 mL L-1). RESULTADOS 0 NH4+ µmol L-1 10 copias amo A/ng RNA 20 30 0 5 10 (m) 15 20 Invierno 2014 25 2014 30 2015 35 0 5 (m) 10 15 20 Verano 2015 25 30 Distancia (Km) 35 0 1 copias amo B/ng RNA 2 3 RESULTADOS: Distribución espacial Producción Primaria Neta Invierno 2014 2m 10m 30m Mayores tasas en la capa superficial (2 m) detectadas en la estación Control (21 mg C m-3d-1). Tasas promedio al interior ~10 mg C m-3d-1 Capa superficial: Qcontrol>Q9>Q5>Q6>Q2 PP Integrada Control: 0.398 g m-2 d-1 Q9 :0.192 g m-2 d-1 (max) Q6 0.072 g m-2 d-1 (min) Producción primaria Caucahue 2014 (mg C m-3 d-1) Se realizó una ANOVA de 2 vías (Profundidad y Pesticidas) a las tasas de asimilación de carbono 13 transformadas por logaritmo natural. Los resultados de la ANOVA mostraron que existieron diferencias significativas en las tasas de asimilación de carbono debido a la profundidad (p<0.001) y no con respecto al uso de pesticidas (p=0.999) Df Pesticida 3 Profundidad 2 Pesticida: Profundidad 6 Residuals 52 Sum Sq 0.042 19.197 0.109 18.742 Mean Sq 0.014 9.598 0.018 0.36 F value 0.038 26.631 0.051 P-value 0.99 1.09E-08 0.999 RESULTADOS: Distribución espacial Producción Primaria Neta Verano 2015 2m 10m 30m Distribución espacial Producción Primaria Neta Mayores tasas en la capa superficial (2 m) detectadas en la estación Control (396 mg C m3d-1). Tasas promedio al interior del canal ~200 mg C m-3d-1 Capa superficial: Qcontrol>Q9>Q3>Q2>Q5 PP Integrada Control: 6.66 mg m-2 d-1 Q9 2.8 mg m-2 d-1(max) Q5 :0.524 mg m-2 d-1 (min) Producción primaria Caucahue 2015 (mg C m-3 d-1) Se realizó una ANOVA de 3 vías (Profundidad y Pesticidas) a las tasas de asimilación de carbono 13 transformadas por logaritmo natural. Df Pesticida 1 Profundidad 1 Luz/Oscuridad 1 Pesticida: Profundidad 1 Pesticida: Luz/Oscuridad 1 Profundidad: Luz/Oscuridad 1 Pesticida: Profundidad: Luz/Oscuridad 1 Residuos 66 Sum Sq 0.06 86.84 109.47 0.03 0.03 Mean Sq 0.06 86.84 109.47 0.03 0.03 F value 0.136 192.128 242.211 0.057 0.065 P-value 0.71318 < 2e-16 < 2e-16 0.81264 0.80002 3.6 3.6 7.975 0.00627 0.06 29.83 0.06 0.45 0.134 0.71561 Se realizó una ANOVA de 3 vías (Profundidad y Pesticidas y exposición a luz o oscuridad) a las tasas de asimilación de carbono 13 transformadas por logaritmo natural. Se encontraron diferencias significativas producto de la profundidad y si estuvieron expuestos a luz solar o oscuridad (p<0.001). No se observaron diferencias significativas respecto al uso de pesticidas (Azametifos). Inverno 2014 Bacterioplancton (x 103cel mL-1) Verano 2015 Q8 Q9 Q1 0 Q1 Q2 Q3 Q5 Q6 Bacterioplancton (x 103cel mL-1) RESULTADOS: Invierno 2014 Fijacion de carbono Quimioautotrofica Fijacion de carbono Quimioautotrofica + Azametifos RESULTADOS: Verano 2015 Fijacion de carbono Fotoautotrofica Fijacion de carbono Fotoautotrofica + Azametifos RESULTADOS: Uptake de amonio canal Caucahue Invierno 2014 0 50 Verano 2015 NH4 uptake nmol L-1 d-1 100 150 200 0 2 100 200 300 uptake NH4 nmol L-1 d-1 400 500 (m) (m) 2 10 10 control delta 30 Aza A+D 30 control Aza RESULTADOS: Producción primaria Llico (mg C m-3 d-1) (mg C m-3 d-1) Verano 2014 Profundidad (m) 0 200 BLL1 400 600 800 1000 0 BLL2 200 400 600 800 1000 0 2 2 2 4 4 4 10 13C 13C 13C+A 13C+A 10 13C+D Profundidad (m) 100 BLL1 200 300 400 800 13C+D 13C+A+D 13C+A+D (mg C m-3 d-1) 500 0 100 BLL2 200 300 400 500 0 2 2 4 4 4 13C 13C 13C+A 13C+A 13C+D 13C+A+D 1000 13C+A 2 10 600 10 Invierno 2015 0 400 Verano 2014 BLL1: PP disminuyó un 24% en el tratamiento con Deltametrina, pero aumentó un 19% con Azametifos a los 4 m. BLL2: PP en el tratamiento control fue mayor a todos los tratamientos con pesticidas, el patrón fue inverso con la profundidad. BLL3: PP mostró un incremento de la PP in todos los tratamiento con pesticidas de un 52 % a los 2 m. 13C 13C+D 13C+A+D 200 BLL3 10 13C+D 13C+A+D 100 BLL3 200 300 400 500 PP Invierno 2015 BLL1: PP aumentó en promedio un 10% con la adición de Azametifos y Deltametrina a los 2 m. BLL2: PP aumento con la adición de Azametifos a 2 m. A 4 m PP aumentó un 47% con el tratamiento combinado (A+D). BLL3: PP se incrementó un 6% y 8% en el tratamiento con Deltametrina a los 2 y 4 m, respectivamente. 13C 13C+A 10 13C+D 13C+A+D PP Llico Verano 2014 e Invierno 2015 Pesticida Df Sum Sq Mean Sq 3 53172 17724 F value 0.506 P-value 0.682 Se realizó una ANOVA de 2 vías para las tasas de asimilación de carbono para los 2 metros. Se encontraron diferencias significativas en relación son periodo de muestreo (Mayores tasas en verano que en invierno; p<0.001) Estación del año 1 1208193 1208193 Pesticida: Estación 3 13941 4647 del año Residuos 22 770514 35023 34.497 6.55E-06 0.133 0.94 RESULTADOS Las tasas de fijación de carbono (mg C m-3 h-1) por fotosíntesis y quimiosíntesis durante el experimento realizado en el invierno del 2015 Tabla comparación múltiple de los tratamientos en condiciones de luz. En rojo se presentan los valores significativos (p<0.05). 13C+A 2h 13C 13C+A 13C+B 13C+D 2h 2h 2h 2h 0.000 13C 6h 13C+ A 6h 13C+B 2h 0.000 0.002 13C+D 2h 13C 6h 13C+A 6h 0.675 0.000 0.000 0.003 0.000 0.000 0.000 0.001 0.001 0.000 0.000 1.000 13C+B 6h 0.000 0.000 0.001 0.000 1.000 1.000 13C+D 6h 0.000 0.000 0.001 0.000 1.000 1.000 13C+B 6h 1.000 Las tasas de fijación de carbono se concentraron a las 2h de incubación con diferencias significativas entre tratamientos expuestos a luz solar. Las tasas de pesticidas fueron menores que el control en un 38, 66 y 11 % para Azametifos, Benz. de Emamectina y Deltametrina, respectivamente. Las tasas de fijación de carbono quimiosintetico con pesticidas fueron menores que las del control en un 46, 60, 66 % para Azametifos, Deltametrina y Benz. de Emamectina, respectivamente. CONCLUSIONES La region de caucahue muestra tasas de PP promedio de 15 mg C m-3 d-1 en invierno y 300 mg C m-3 d-1 en verano. Las mayores tasas se registraron en la estacion control, fuera de influencia de centros de cultivo. No se observa efecto claro de pesticidas sobre flujos de PP en terminos de estimulación de la fijacion fotosintética de carbono. Sin embargo tampoco se observa un efecto de toxicidad. Los flujos de fijacion de oscura C son modificados por el uso de pesticidas lo que sugiere un efecto potencial sobre organismos quimioautotroficos. Altas tasas de uptake de NH4 por fitoplancton superando los 300 nM d1 en ambos cruceros. Las mayores tasas llegaron a 350 nM d-1 en Q2 en invierno y casi 600 nM d-1 en Q9 en verano. En general el uso de pesticidas resultó en menores tasas de uptake en la zona de Chiloé. CONCLUSIONES La region de Llico es altamente productiva con tasas de PP entre 200 mg C m-3 d-1 y 1000 mg C m-3 d-1 en verano. En general se observa un aumento de las tasas de fijacion de carbono con tratamientos expuestos a Deltametrina y Azametifos. Las diferencias pueden alcanzar al 50% en superficie. Las tasas de fijación de carbono oscura fueron menores en muestras tratadas con pesticidas con diferencias de 46, 60, 66 % para Azametifos, Deltametrina y Benz. de Emamectina, respectivamente. El efecto de pesticidas en flujos biogeoquimicos es variable dentro de la comunidad microbiana, con posibles efectos en flujos de produccion regenerada y la actividad quimiosintetica en las zonas de Chiloé y Chile central. Proximamente: Analisis de data de diversidad microbiana y actividad especifica. ¡GRACIAS! LIA MORFUN FONDECYT 1150891 Fondap-INCAR Veronica Molina Angel Rain Claudia Rojas Laurence Mejanelle RESULTADOS: Donde poner atencion! Fijacion de carbono Quimioautotrofica Fijacion Quimioautotrofica de carbono + Azametifos Canal Caucahué Enero 2015 En caucahué, se detectaron diferencias significativas en las tasas de fijacion oscura de C en presencia de AZA Llico Invierno 2015 Las tasas de fijación de carbono se concentraron a las 2h de incubación con diferencias significativas entre tratamientos expuestos a luz solar. Las tasas de fijacion con pesticidas fueron menores que el control en un 38, 66 y 11 % para Azametifos, Benz. de Emamectina y Deltametrina, respectivamente. Las tasas de fijación de carbono quimiosintetico con pesticidas fueron también menores que las del control en un 46, 60, 66 % para Azametifos, Deltametrina y Benz. de Emamectina, respectivamente. RESULTADOS NH4 uptake nmol L-1 d-1 0 200 400 600 NH4 uptake nmol L-1 d-1 800 0 0 5 5 10 10 15 15 20 25 Control 25 800 Q2 Q6 Q3 Q5 30 Q5 35 600 20 Q9 30 400 (m) (m) 0 200 Q2 Q9 35 Control Altas tasas de asimilacion de NH4+ en invierno y verano (max. 424 nmol L-1 d-1 en superficie) Sin embargo estacion control << estaciones Q2, Q3 y Q5. Maximas tasas en estaciones del brazo norte del canal Caucahue. INTRODUCCION 1.0e+5 400 8.0e+4 300 3 DEL+AZA21.08.14 300 35 DPM vs 16rRNAgene copy*10^3/mL X Data 30 DPM vs cells*10^3/mL 250 R2=0.51 25 200 20 150 15 Initials 100 10 50 5 0 2.0e+4 0 4.0e+4 6.0e+4 8.0e+4 DPM 1.0e+5 1.2e+5 CFM DEL+EMA21.08.14 AZA21.08.14 AZA+EMA21.08.14 EMA 21.08.14 DELTA21.08.14 Inicial20.08.14 Control21.08.14 DEL+AZA15.08.14 DEL+EMA15.08.14 AZA15.08.14 AZA+EMA15.08.14 2.0e+4 EMA 15.08.14 0 DELTA15.08.14 0 4.0e+4 100 Inicial14.08.14 10 6.0e+4 200 Control15.08.14 20 qPCR 30 500 Puyuhuapi 1.2e+5 DPM 40 600 CFM (cells ^10 /mL) & total RNA ng 3 16 rRNA genes cDNA copy ^10 /mL 50 CFM cells*10^3/mL DPM Active Bacteria (16rRNAgene copy*10^3/mL) total RNA METODOS: Approach experimental Bioensayos y experimentos de toxicidad - 4 concentrationes Azametifos - Positive Control: 10nM PO4 - Negative Control: sin PO4 - 120 h post-inoculación - Conteo inicial : 1millon cel/mL Ostreococcus taurii Sistema robotizado Incubacion (OOB Francia) Photo H. Moreau OOB Banyuls s/Mer Larvas 96h post-fertilizacion Spherechinus granularis Paracentrotus lividus 24h post-fertilizacion Mitilus chilensis Azametifos Deltametrina Benzoato de Emamectina Resultados: Ostreococcus taurii 1200000 ABUNDANCIA Ostreococcus tauri (cel mL-1) 1000000 800000 600000 400000 80000 60000 40000 20000 0 C-P C+P 1 AZA 1 C+P 10 AZA 10 C+P 100 AZA 100 CONCENTRACION DE FOSFATO (nmol L-1) Data tesis Claudia Rojas