Hacia una nueva generación de vacunas multivalentes basadas en

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INSTITUTO FINLAY
VICEPRESIDENCIA DE PRODUCCIÓN
UNIVERSIDAD DE LA HABANA
INSTITUTO DE FARMACIA Y ALIMENTOS
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGÍA Y CONTROL DE MEDICAMENTOS
Hacia una nueva generación de vacunas multivalentes
basadas en vesículas de membrana externa de
Neisseria meningitidis serogrupo B
Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias
Farmacéuticas
Autor: Lic. Ramón Barberá Morales
Tutores: Dr. Gustavo Sierra González
Dr. Antonio Iraizoz Colarte
Asesora: Dra. Isabel Martínez Motas
La Habana
2008
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“A todos los que hicieron suyo el proyecto MenB bivalente”
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AGRADECIMIENTOS
A todos los trabajadores del Instituto Finlay que dieron su aporte decisivo al proyecto de desarrollo
de la vacuna MenB bivalente entre 1999 y 2003.
A mis tutores Gustavo Sierra y Antonio Iraizoz por todas las enseñanzas en la preparación del
documento.
A mi asesora Isabel Martínez por la revisión paciente y detallada de las versiones del documento.
A Conchita por su confianza y asesoría.
A Domingo González por su participación destacada en todas las etapas del proyecto y por el apoyo
brindado en la preparación y edición del material.
A Aleida Mandariote por su participación en las etapas fundamentales y su disposición de analizar
cualquier detalle con la objetividad de siempre.
A Daniel Cardoso por poner toda su experiencia en la introducción rápida de los sistemas de
filtración tangencial y sus valiosos consejos en el diseño y preparación del documento.
A Lisset Pérez por su participación destacada en la programación y control de las operaciones de
Planta III durante el desarrollo, así como cubrir mis períodos cortos de ausencias para la preparación
del material.
A Lilia Alfalla, Esther Maria Fajardo y Elizabeth Pérez, por garantizar los resultados analíticos y la
realización de los estudios de estabilidad.
A Sosa, Sandelis, Loreta, Carcache, Leonardo Sánchez y tantos otros que garantizaron la
disponibilidad de la instalación y los nuevos requerimientos del mejoramiento del proceso.
Al grupo técnico de Planta III que garantizó la organización, ejecución y control de los procesos, en
especial a Raul Boué, Liliam Nápoles, Sum-Lai Lozada, Kenia Reyes, Isbel González, Mónica
Obaya, Raúl Abreu, Zulma Cepero, Roselyn Martínez, Mario Vieyto y Maria Elsa Tápanes.
Al grupo de dirección del proyecto Finlay – GSK, Conchita, Gustavo, Ricardo, Lily, Franklin y
Panchín por sus recomendaciones oportunas en el desarrollo del producto.
A Pierre Desmons, Jean Smal y Jan Poolman de la firma Glaxo-Smith Kline por su participación en
el diseño de los experimentos y análisis de los resultados
A Liliam Uli, Lázaro Betancourt y Lila Castellanos por la introducción de las técnicas proteómicas en
el análisis del componente proteico de las VME.
A Mayelin Mirabal por su colaboración en los análisis estadísticos.
A Maria Victoria por su apoyo en las actualizaciones biblográficas.
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A Dilene por su asistencia eficiente en las ediciones del documento sin escatimar tiempo.
A todos los que me brindaron su cooperación en esta etapa final y en especial a Yossel, Sussel,
Elizabeth Pérez, Nadia Costa, Yolexis Tamayo, Rosario Dieguez, Matilde Cuevas e Imilsis.
A Dulce por su amor e incondicionalidad de siempre y su comprensión para que lograra este viejo
empeño.
A mis hijos por darle valor a todas mis cosas y en especial a Ariana, que por su especialidad afín me
sacó de apuros muchas veces.
A Judith y Juan Carlos por estar siempre dispuestos a cooperar.
A mis padres por la formación recibida.
A la Revolución cubana por brindarme las posibilidades de formación científica, desarrollo integral y
desempeño en la rama de la Biotecnología.
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SÍNTESIS
Este trabajo se realizó con el objetivo de obtener un nuevo candidato vacunal bivalente de vesículas
de membrana externa (VME) de Neisseria meningitidis serogrupo B con un perfil antigénico más
amplio, mediante el perfeccionamiento de la tecnología existente en el Instituto Finlay. Además, se
incorporó una nueva cepa, tomando en consideración la situación epidemiológica y regulaciones
farmacéuticas existentes en Europa. Se introdujo la microfiltración tangencial, proceso que aumentó
más de dos veces los rendimientos de proteínas. El empleo de la electroforesis bidimensional y
técnicas proteómicas evidenció la consistencia del componente proteico en los lotes de VME,
identificándose 26 nuevas proteínas, la mayoría minoritarias, algunas de las cuales pudiera contribuir
a la inducción de respuesta inmune protectora. El uso de la sacarosa en la purificación y
conservación de las VME redujo como mínimo 10 veces la pirogenicidad intrínseca de las mismas,
sin afectar su inmunogenicidad al adsorberlas previamente en Hidróxido de Aluminio. Se incorporó la
cepa (NZ 98/228) como vacunal y con el mismo proceso de la cubana (CU 385/83), se obtuvieron
VME que presentaron un comportamiento similar respecto a la identidad proteica, niveles de
contaminantes, pirogenicidad, actividad endotóxica e inmunogenicidad. Se obtuvo una nueva vacuna
bivalente mediante combinación de las cepas CU 385/83 con actividad heteróloga demostrada y la
NZ 98/228, representante del clon epidémico prevalente en Europa. La vacuna y sus componentes
no mostraron interferencias inmunológicas, cumplieron las especificaciones de calidad establecidas
y fueron estables en los estudios de vida de estante y estrés. Se realizaron estudios de equivalencia
para demostrar la no afectación de los cambios en el proceso y el producto en relación a los
tradicionales. El proceso perfeccionado redujo el equipamiento y facilitó el cumplimiento de las
Buenas Prácticas de Fabricación.
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TABLA DE CONTENIDO
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INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1
1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................. 5
1.1 Características generales de la enfermedad meningocócica..........................................5
1.2 Estructura antigénica de N. meningitidis..........................................................................6
1.3 Clasificación serológica de N. meningitidis......................................................................6
1.4 Identificación genotípica de N. meningitidis.....................................................................9
1.5 Epidemiología de la enfermedad meningocócica ..........................................................10
1.6 Vacunas de polisacáridos capsulares............................................................................11
1.7 Vacunas basadas en PME contra N. meningitidis serogrupo B ....................................13
1.8 La epidemia de enfermedad meningocócica en Cuba y su control...............................14
1.9 Evaluaciones del post-licenciamiento de VA-MENGOC-BC en otros países................14
1.10 Metodologías para la obtención de vacunas contra el serogrupo B a partir de VME .16
1.10.1 Selección de las cepas vacunales y aplicación del sistema de lotes de siembra ........ 16
1.10.2 Medios de cultivo ......................................................................................................... 16
1.10.3 Condiciones de cultivos ............................................................................................... 17
1.10.4 Criterios de cosecha e inactivación ............................................................................. 18
1.10.5 Métodos de separación de biomasa ............................................................................ 19
1.10.6 Extracción de VME ...................................................................................................... 19
1.10.7 Purificación de las VME............................................................................................... 20
1.10.8 Diseño y formulación de las vacunas .......................................................................... 21
1.11 Controles de calidad de las vacunas de VME .............................................................22
1.12 Caracterización de las VME.........................................................................................23
1.13 Regulaciones Farmacéuticas.......................................................................................24
1.14 Tendencias en el desarrollo de vacunas contra el meningococo serogrupo B ...........26
2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................ 30
2.1 Metodología analítica .....................................................................................................30
2.1.1 Determinación de la densidad óptica de los cultivos ..................................................... 30
2.1.2 Determinación de la pureza microbiana ........................................................................ 30
2.1.2.1 Determinación por observación microscópica ..................................................................... 30
2.1.2.2 Determinación por siembra en medios de cultivo ................................................................ 30
2.1.3 Determinación de las proteínas ..................................................................................... 30
2.1.4 Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS y ß-mercaptoetanol........................ 30
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2.1.5 Determinación del peso seco......................................................................................... 31
2.1.6 Determinación del LPS .................................................................................................. 31
2.1.7 Determinación del polisacárido...................................................................................... 31
2.1.8 Determinación del ácido nucleico .................................................................................. 32
2.1.9 Microscopía electrónica de las VME.............................................................................. 32
2.1.10 Identificación de las proteínas por Western-blot .......................................................... 32
2.1.11 Determinación de la antigenicidad de las VME in vitro por ELISA de inhibición .......... 32
2.1.12 Determinación de la actividad de los anticuerpos IgG antiserogrupo B por ELISA...... 33
2.1.13 Determinación de la actividad bactericida del suero.................................................... 34
2.1.14 Determinación del contenido de endotoxina por LAL .................................................. 35
2.1.15 Electroforesis bidimensional ........................................................................................ 36
2.1.15.1 Geles analíticos de rango pI 3 – 10 ................................................................................... 36
2.1.15.2 Geles analíticos de rango pI 4 – 7 .................................................................................... 36
2.1.15.3 Geles preparativos de rangos de pI 4-7 y 6-11.................................................................. 36
2.1.15.4 Análisis de las imágenes.................................................................................................... 37
2.1.15.5 Digestión proteolítica y extracción de los péptidos ............................................................ 37
2.1.15.6 Análisis de proteínas por espectrometría de masas .......................................................... 37
2.1.15.7 Identificación de las proteínas............................................................................................ 38
2.1.16 Determinación de pirógenos en conejos...................................................................... 38
2.1.17 Determinación del polisacárido capsular serogrupo B................................................. 39
2.1.18 Determinación de ADN ................................................................................................ 39
2.1.19 Determinación de la sacarosa ..................................................................................... 40
2.1.20 Determinación de DOC................................................................................................ 40
2.1.21 Determinación de la osmolalidad................................................................................. 41
2.2 Metodologías generales empleadas en los procesos de obtención de VME................41
2.2.1 Cepas ............................................................................................................................ 41
2.2.2 Medios de cultivo........................................................................................................... 41
2.2.3 Obtención del inóculo .................................................................................................... 42
2.2.4 Cultivo de semilla........................................................................................................... 42
2.2.5 Cultivo a escala industrial .............................................................................................. 42
2.2.6 Separación celular por centrifugación............................................................................ 43
2.2.7 Separación celular por microfiltración tangencial........................................................... 43
2.2.8 Extracción de las VME con DOC ................................................................................... 43
2.2.9 Purificación de las VME hasta la fracción cromatográfica ............................................. 43
2.2.10 Obtención del IFA por precipitación alcohólica ............................................................ 44
2.2.11 Obtención del IFA por diafiltración con sacarosa......................................................... 44
2.3 Evaluación de la MFT en la separación celular de la cepa CU 385/83 .........................45
2.3.1 Comportamiento hidrodinámico del proceso y recobrados celulares............................. 45
2.3.2 Evaluación del impacto de la MFT en las etapas de extracción y purificación de VME. 45
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2.3.3 Evaluación del impacto de la MFT en las VME purificadas como IFA ........................... 46
2.4 Análisis de las proteínas presentes en las VME mediante electroforesis bidimensional
y una plataforma de proteómica...........................................................................................46
2.5 Valoración del efecto de la sacarosa en la etapa de purificación y conservación de las
VME......................................................................................................................................47
2.5.1 Comportamiento hidrodinámico del proceso de diafiltración de VME y recobrado ........ 47
2.5.2 Evaluación del impacto de la diafiltración con sacarosa en las características de las VME
............................................................................................................................................... 48
2.6 Evaluación de las cepas epidémicas de N. meningitidis ...............................................49
2.6.1 Metodologías empleadas a escala piloto....................................................................... 49
2.6.2 Metodologías empleadas a escala industrial ................................................................. 49
2.7 Obtención del nuevo candidato vacunal bivalente a partir de las VME de N.
meningitidis serogrupo B......................................................................................................51
2.7.1 Formulación de los monograneles y de la vacuna MenB bivalente ............................... 51
2.7.2 Controles de calidad de las VME en sacarosa, monograneles y la vacuna MenB
bivalente ................................................................................................................................. 52
2.7.3 Comparación de la respuesta inmune de los monograneles, MenB bivalente y VAMENGOC-BC® ....................................................................................................................... 52
2.7.4 Estudios de estabilidad de los monograneles y de la vacuna MenB bivalente a granel 53
2.8 Análisis estadístico.........................................................................................................53
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................................... 54
3.1 Perfeccionamiento del proceso de separación celular mediante el empleo de la
microfiltración tangencial......................................................................................................54
3.1.1 Comportamiento hidrodinámico del sistema de MFT y recobrados del proceso............ 54
3.1.2 Impacto en el proceso de purificación de las VME ........................................................ 57
3.1.2.1 Contenido e identidad de las proteínas por etapas, rendimiento y recobrado del proceso.. 57
3.1.2.2 Eliminación de los contaminantes en los pasos de purificación de las VME ....................... 58
3.1.3 Cumplimiento de las especificaciones de calidad de las fracciones cromatográficas.... 60
3.1.4 Cumplimiento de las especificaciones de calidad del IFA y evaluaciones
complementarias de antigenicidad, inmunogenicidad y actividad endotóxica ........................ 63
3.1.5 Ventajas de la introducción de la MFT en el proceso de obtención de VME ................. 68
3.1.6 Conclusiones parciales del perfeccionamiento del proceso de separación celular........ 68
3.2 Análisis de los componentes proteicos de las VME purificadas mediante la
electroforesis bidimensional y una plataforma de proteómica.............................................69
3.2.1 Análisis de los componentes proteicos de las VME por electroforesis bidimensional ... 69
3.2.2 Identificación de las proteínas por espectrometría de masas........................................ 72
3.2.3 Conclusiones parciales del análisis de los componentes proteicos en las VME........... 76
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3.3 Valoración del efecto de la sacarosa en la etapa de purificación y conservación de las
VME......................................................................................................................................76
3.3.1 Comportamiento hidrodinámico del sistema de UFT y recobrados ............................... 76
3.3.2 Impacto de la sacarosa en las características de las VME y su pre-estabilidad ............ 77
3.3.2.1 Comportamiento del pH ....................................................................................................... 77
3.3.2.2 Identidad del CPME ............................................................................................................. 79
3.3.2.3 Estructura vesicular ............................................................................................................. 79
3.3.2.4 Contenido de LPS y pirogenicidad....................................................................................... 79
3.3.2.5 Contenido de endotoxinas ................................................................................................... 82
3.3.2.6 Inmunogenicidad.................................................................................................................. 83
3.3.3 Comportamiento general del efecto de la sacarosa en el proceso y conservación de las
VME........................................................................................................................................ 84
3.3.4 Pre-estabilidad de las VME en sacarosa adsorbida en gel de hidróxido de aluminio .... 85
3.3.4.1 Comportamiento del pH ....................................................................................................... 85
3.3.4.2 Actividad endotóxica ............................................................................................................ 85
3.3.4.3 Inmunogenicidad.................................................................................................................. 86
3.3.4.4 Comportamiento general de la conservación de las VME en sacarosa adsorbida en HA
como monograneles ........................................................................................................................ 86
3.3.5 Conclusiones parciales de la introducción de la sacarosa en la etapa de purificación y
conservación de las VME ....................................................................................................... 88
3.4 Evaluación de las cepas epidémicas en el proceso de obtención de las VME.............89
3.4.1 Evaluación de las cepas a escala piloto ........................................................................ 89
3.4.2 Evaluación de las cepas NZ 98/124 y NZ 98/228 por la tecnología tradicional a escala
industrial ................................................................................................................................. 92
3.4.3 Evaluación de la cepa NZ 98/228 .................................................................................. 92
3.4.3.1 Cinética de crecimiento........................................................................................................ 92
3.4.3.2 Comportamiento hidrodinámico en la etapa de concentración y lavado celular .................. 93
3.4.3.3 Rendimiento de biomasa y proteína vesicular purificada..................................................... 95
3.4.3.4 Comportamiento de las proteínas en las etapas de la purificación...................................... 95
3.4.3.5 Eliminación de contaminantes en las etapas de purificación de las VME............................ 97
3.4.3.6 Recobrado de proteínas en el paso de la diafiltración con sacarosa................................... 97
3.4.3.7 Identidad de los CPME en las VME purificadas................................................................... 97
3.4.3.8 Estructura vesicular y pirogenicidad .................................................................................... 97
3.4.4 Estudio de pre-estabilidad de las VME purificadas conservadas como monograneles100
3.4.4.1 Comportamiento del pH ..................................................................................................... 100
3.4.4.2 Actividad endotóxica .......................................................................................................... 100
3.4.4.3 Inmunogenicidad................................................................................................................ 100
3.4.5 Conclusiones parciales de la introducción de la cepa NZ 98/228 al proceso de obtención
de VME................................................................................................................................. 102
3.5 Obtención de un nuevo candidato vacunal bivalente contra N. meningitidis serogrupo B
a partir de VME ..................................................................................................................102
3.5.1 Antecedentes y beneficios esperados de una nueva generación de vacunas multivalente
de VME................................................................................................................................. 102
3.5.2 Bases para el diseño y la composición de un candidato vacunal bivalente................. 105
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3.5.3 Aspectos regulatorios incorporados al proceso de obtención del IFA que facilitan el
cumplimiento de las BPF ...................................................................................................... 107
3.5.4 Inmunogenicidad de los monograneles, Men B bivalente y VA-MENGOC-BC® .......... 108
3.5.5 Comportamiento de los controles de calidad de lotes de VME purificados, monograneles
y vacuna Men B bivalente..................................................................................................... 108
3.5.5.1 Establecimiento y comportamiento de las especificaciones de calidad y caracterización
de las VME purificadas .................................................................................................................. 110
3.5.5.2 Establecimiento y comportamiento de las especificaciones de calidad y ensayos internos
y de caracterización de los monograneles..................................................................................... 111
3.5.5.3 Establecimiento y comportamiento de las especificaciones de calidad, ensayos internos y
de caracterización de la vacuna MenB bivalente........................................................................... 114
3.5.7
Estabilidad de vida de estante y estrés de monograneles de VME de las cepas CU
385/83 y NZ 98/228 ....................................................................................................................... 120
3.5.8
Estabilidad de vida de estante y estrés de la vacuna Men B bivalente a granel ........... 123
3.5.9
Conclusiones parciales de la obtención de un nuevo candidato vacunal bivalente contra
cepas de N. meningitidis serogrupo B: .......................................................................................... 124
CONCLUSIONES ............................................................................................................ 125
RECOMENDACIONES ...................................................................................................... 126
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... I
ANEXOS ............................................................................................................................ I
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Abreviaturas y Acrónimos
1D-E:
Electroforesis unidimensional
2D-E:
Electroforesis bidimensional
ABS:
Actividad bactericida del suero
M/2:
MC.6:
MCC:
AC:
Anticuerpo (s)
MCV4:
AcM:
ACN:
AMH:
AN:
BC:
BCA:
BPF:
CDC:
Anticuerpo (s) monoclonal (es)
Acetonitilo
Agar Müller Hinton
Ácido nucléico
Bandas características
Bicarbonato de Amonio
Buenas Prácticas de Fabricación
Centro de Control de Enfermedades
de los Estados Unidos
Cromatografía gaseosa
Centro de Ingeniería Genética y
Biotecnología
Complejo de proteínas de membrana
externa
Dietanolamina
Densidad óptica
Desoxicolato de Sodio
Dioetriol
ME:
Men B:
MFM:
MFT:
MG:
MLST:
Mm:
MS:
Relación masa/carga
Medio Catlin modificado
Vacuna antimeningocócica
serogrupo C conjugada
Vacuna antimeningocócica
conjugada contra los serogrupos A,
C, Y y W135
Microscopia electrónica
Meningitis B
Medio Frantz modificado
Microfiltración tangencial
Monogranel (es)
Tipos secuenciales de multilocus
Masa molecular
Espectrometría de masas
NT:
NST:
No tipables
No subtipables
NIPH:
Instituto Nacional de Salud Pública
de Noruega
Proteína (s) de membrana externa
Organización Mundial de la Salud
Polisacárido (s) capsular (s)
Polisacárido (s) capsular (es)
serogrupo B
Polisacárido (s) capsular (es)
serogrupo C
Punto isoeléctrico
Proteína (s) de membrana externa
Huella de la (s) masa (s) de péptido
CG:
CIGB:
CPME:
DEA:
DO:
DOC:
DTT:
EDDA:
EDTA
EEM:
ELISA:
Ácido etilendiamino-dihidroxifenil
acético
Ácido etilendiamino tetracético
Elctroforesis de enzima multilocus
Ensayo inmunoenzimático
EM:
Enfermedad meningocócica
ESI:
ET:
FC:
Ionización por electronebulización
Tipo (s) electroforético (s)
Fracción (es) cromatográfica (s)
HA:
IFA:
Hidróxido de aluminio
Ingrediente (s) Farmacéutico (s)
Activo (s)
Gradiente inmovilizado de proteínas
2ceto octanato
Limulus amoebocyte lysate
Lipooligosacáridos (s)
Lipopolisacárido (s)
IPG:
KDO:
LAL:
LOS:
LPS:
OMP:
OMS:
PC:
PC-B:
PC-C:
PI:
PME:
PMF:
(s)
PNO:
Procedimiento (s) Normalizados (s)
de Operación
PRH:
Proteínas reguladas por el hierro
RV:
Región (es) variable (s)
SDS-PAGE: Electroforesis en geles de
poliacrilamida-duodecil sulfato de
sodio
ST:
Tipos secuenciales
Tris:
Tris (hidroximetil) amino metano
UE:
UFT:
VME:
WB:
Unidades endotóxicas
Ultrafiltración tangencial
Vesícula (s) de membrana externa
Western blot
INTRODUCCIÓN
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INTRODUCCIÓN
Neisseria meningitidis es el agente causal de la enfermedad meningocócica (EM), entidad clínica
que constituye aún un importante problema de salud para diversas regiones del mundo, debido a su
elevada tasa de morbimortalidad, sobre todo en la población infantil (Rosentein y col, 2001).
Actualmente, ocurren alrededor de 1,2 millones de casos anuales con un estimado de 135 000
muertes (The Jordan Report, 2006). A pesar de que la incidencia de la EM es relativamente baja en
comparación con otros procesos infecciosos de la infancia y de que existen tratamientos
antimicrobianos efectivos contra la misma, esta entidad se caracteriza por su elevada mortalidad
(10-20%) y las terribles secuelas permanentes que producen entre los sobrevivientes: amputación
de los miembros, sordera y retraso mental, entre otras. (Duke y col, 2003; Offit y Peter, 2003).
El meningococo es un diplococo gramnegativo aerobio, que posee una cápsula polisacarídica. La
superficie del microorganismo está constituida por membranas (internas y externas) y entre ellas se
sitúa una capa de peptidoglicano (Pollard y Frasch, 2001). La externa contiene fosfolípidos,
lipopolisacáridos (LPS) y proteínas (PME). Los LPS y las PME son estructuras de una elevada
complejidad antigénica que, al igual que los polisacáridos capsulares (PC), están involucradas en la
patogenia e inmunidad de la EM. (Bröker, 2003; Perret y Pollard, 2005). Las características
inmunoquímicas de los PC permiten dividir a los meningococos en 13 serogrupos. Los serogrupos A,
B, C, Y y W135, ocasionan más del 90% de los casos notificados en el mundo. La enfermedad
causada por los serogrupos A, C, Y y W135 se controla por vacunas de PC (Rosentein y col, 2001).
Sin embargo, este tipo de vacuna contra el serogrupo B no produce una inmunidad adecuada,
debido a la homología estructural que existe entre el PC del serogrupo B (PC-B) con los gangliósidos
y las glicoproteínas fetales humanas (Jennings y col, 1986; Zollinger, 1998), situación que condujo a
la evaluación de antígenos de superficie no capsulares capaces de estimular la respuesta
bactericida específica, demostrándose que, cuando las PME se obtienen en forma de vesículas de
membrana externa (VME) y se solubilizan con un PC las vacunas son inmunógenas (Zollinger y col,
1979, Helting y col, 1981; Frasch y col, 1982,)
A partir de las VME se desarrolla en Cuba una vacuna contra el meningococo del serogrupo B,
preparado vacunal que muestra una eficacia del 83% en los ensayos clínicos realizados en este país
(Sierra y col, 1991). La aplicación masiva de este inmunógeno a toda la población comprendida
entre los tres meses hasta los 24 años de edad durante el período de 1989 a 1991, fue capaz de
controlar la epidemia de EM que afectó a Cuba en la década de los años 80 (Rico y col, 1994). Esta
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vacuna conocida comercialmente como VA-MENGOC-BC® ha sido utilizada con buenos resultados
para el control de brotes epidémicos ocurridos en Brasil, Colombia, Argentina y Uruguay. Hasta el
presente, la aplicación de casi 60 millones de dosis permitieron el ingreso a Cuba de alrededor de
450 millones de USD.
En el transcurso de las dos décadas posteriores a la introducción de VA-MENGOC-BC®, esta
vacuna se mantiene como la de mayor eficacia luego de su amplia aplicación en América Latina. En
la actualidad no existe ningún candidato vacunal que supere los resultados alcanzados con la
misma, a pesar de los múltiples esfuerzos que realizan diferentes investigadores por obtener nuevas
generaciones vacunales para uso universal, fundamentalmente, aquellas basadas en los procesos
de recombinación genética (Danzig, 2004; Segal y Pollard, 2005; Perret y Pollard, 2005). No
obstante, los resultados obtenidos con la aplicación de VA-MENGOC-BC®, el actual escenario
epidemiológico y regulatorio internacional conducen al perfeccionamiento de la tecnología de
producción establecida y a la búsqueda de una nueva generación de vacunas a partir de las VME
debido a los siguientes aspectos:
¾ La disponibilidad del equipamiento tecnológico en el mercado, que facilita la realización de
procesos productivos más eficientes y el cumplimiento de las Buenas Prácticas de Fabricación.
¾ El incremento de las exigencias regulatorias relacionadas con el conocimiento y la
caracterización de las etapas del proceso y el producto, así como un estricto control para la
introducción de cambios en los mismos.
¾ La situación epidemiológica internacional, luego de la introducción en Europa de una nueva
generación de vacunas antimeningocócicas conjugadas contra el serogrupo C, hecho que
condujo al incremento de la incidencia de EM por el serogrupo B.
¾ La necesidad de nuevas generaciones de vacunas contra el serogrupo B de perfil antigénico
más amplio dada la aparición de nuevos clones epidémicos.
Sobre la base de los antecedentes y problemática descrita anteriormente se postula la siguiente
HIPÓTESIS:
Mediante el perfeccionamiento de la tecnología de obtención de vesículas de membrana
externa y la incorporación de nuevas cepas, es posible obtener candidatos vacunales contra
el meningococo del serogrupo B, con perfiles antigénicos más amplios, acorde a la situación
epidemiológica y regulatoria internacional.
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Para confirmar esta hipótesis; se trazaron los siguientes objetivos:
OBJETIVO GENERAL:
¾ Obtener un nuevo candidato vacunal bivalente contra el meningococo del serogrupo B mediante
el perfeccionamiento de la tecnología existente en el Instituto Finlay.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
¾ Perfeccionar la etapa de separación celular para aumentar la eficiencia del proceso y facilitar el
cumplimiento de las Buenas Prácticas de Fabricación.
¾ Analizar los componentes proteicos de las VME purificadas mediante la electroforesis
bidimensional y una plataforma de proteómica.
¾ Valorar el efecto de la sacarosa en la etapa de purificación y conservación de las VME.
¾ Seleccionar una cepa epidémica (B:4:P1.7-2,4) representativa del actual clon predominante en
Europa que posibilite desarrollar el proceso de obtención de VME.
¾ Obtener un candidato vacunal a partir de la combinación de VME de la cepa de N. meningitidis
cubana (B:4:P1.19,15) de reactividad cruzada demostrada y la cepa B:4:P1.7-2,4.
El presente trabajo contiene el siguiente VALOR TEÓRICO – PRÁCTICO:
¾ La evaluación de los cambios al proceso y la demostración de equivalencia de las VME
obtenidas con relación a la tecnología tradicional constituyó el ejercicio de comparabilidad más
integral realizado en el Instituto Finlay, lo cual sirvió de base para establecer una política
institucional en este sentido.
¾ El desarrollo y la aplicación de una metodología analítica de alta resolución como la
electroforesis bidimensional y la combinación con la espectrometría de masas resultó la
investigación mas profunda realizada en Cuba y el mundo para el análisis y la identificación de
los componentes proteicos de las VME utilizadas como antígenos vacunales.
¾ La propiedad intelectual del concepto de una nueva generación de vacunas multivalentes contra
el serogrupo B, basado en la utilización de VME, al menos una con actividad heteróloga como
las obtenidas a partir de la cepa cubana CU 385/83 y otras VME de cepas prevalentes en
epidemias de EM fueron reconocidas internacionalmente a través del otorgamiento de patentes
en Europa y otros países.
El presente trabajo contiene el siguiente VALOR ECONÓMICO Y SOCIAL:
¾ Los cambios introducidos en el proceso de obtención de VME posibilitaron la reducción del costo
material en divisas de las VME empleadas como ingrediente farmacéutico activo (IFA) en un
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48% y la disminución del presupuesto estimado para la remodelación de las instalaciones para
la producción de la vacuna MenB bivalente en 750 000 USD.
¾ El desarrollo de la vacuna MenB bivalente y su aprobación para ensayos clínicos por las
autoridades regulatorias europeas, posibilitó la primera introducción de un producto de la
Biotecnología cubana en ese continente.
¾ Se estimó que una aplicación masiva de la vacuna MenB bivalente en Europa a los grupos
susceptibles reduciría como mínimo un 70% de la incidencia de la EM por el serogrupo B. En el
caso del Reino Unido se evitarían alrededor de 910 casos anuales.
¾ La futura introducción de la vacuna MenB en Europa traería un balance económico favorable al
país, debido al relativamente bajo costo en divisas de los componentes empleados y el alto valor
agregado de este tipo de producto.
El presente trabajo contiene los siguientes aspectos que constituyen NOVEDAD CIENTÍFICA:
¾ Se desarrolló un nuevo y apropiado sistema de caracterización para la evaluación de las etapas
principales del proceso de producción y el control de los cambios de mejoramiento,
demostrándose que no hubo afectación en las características definitorias de las VME.
¾ Se presentó, por primera vez en el mundo, un análisis detallado de las proteínas presentes en
las VME de N. meningitis del serogrupo B, mediante el uso de técnicas proteómicas.
¾ Se introdujo el concepto de conservación de las VME en sacarosa como monogranel adsorbido
en Hidróxido de Aluminio (HA) concentrado para garantizar la estabilidad inmunogénica del IFA.
¾ Se desarrolló una metodología novedosa para la evaluación y caracterización de cepas
epidémicas del serogrupo B, útil para la selección de nuevos candidatos vacunales, y se
determinó sus posibilidades de introducción en los procesos de obtención de las VME ya
establecidos.
¾ Se introdujo por primera vez en el mundo, el concepto de una nueva generación de vacunas
basadas en VME de perfil antigénico más amplio, a partir de la combinación de una cepa
epidémica de interés para un país o región con otra de actividad bactericida heteróloga
demostrada, como la cepa vacunal cubana.
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REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
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1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1 Características generales de la enfermedad meningocócica
N. meningitidis, denominada también como meningococo, es el agente causal de la EM, proceso
infeccioso que, por afectar principalmente a los niños pequeños, por la gravedad de su cuadro
clínico, evolución severa, así como la elevada morbimortalidad que produce (Rosentein y col, 2001;
Kvalsvig y col, 2003), constituye aún un problema de salud en diversas regiones del mundo. Se
notifican alrededor de 1,2 millones de casos anuales y un promedio de 135 000 muertes (The Jordan
Report, 2006).
A pesar de que la incidencia de EM es relativamente baja cuando se compara con otras
enfermedades infecciosas de la infancia, esta entidad clínica se caracteriza por su elevada
mortalidad (10 – 20%) y el número considerable de individuos que pueden quedar con secuelas
invalidantes: amputación de miembros, sordera, apoplejía, retraso mental, entre otras (Duke y col,
2003; Offit y Peter, 2003).
La patogenia de la EM está muy relacionada con la colonización de la nasofaringe humana por el
meningococo, situación que conduce al estado de portador asintomático y ocasionalmente, estos
portadores pueden desarrollar un proceso clínico invasivo. Cuando N. meningitidis invade al
huésped, atraviesa la mucosa de la nasofaringe y penetra al torrente sanguíneo, lugar donde se
multiplica y disemina, por todo el organismo, originando una septicemia o meningococemia.
Posteriormente, este microorganismo interactúa con las células endoteliales de los microvasos
cerebrales, cruza la barrera hematoencefálica y ocasiona una meningitis o meningoencefalitis
(Nassif y col, 2002; Taha y col, 2002). Sin embargo, a pesar de existir actualmente tratamientos
efectivos con diversos agentes antimicrobianos para contrarrestar la gravedad clínica de los casos
invasivos, en ocasiones, no es posible impedir la evolución fatal de algunos casos ni las temibles
secuelas propias de la EM (Rosenstein y col, 2001).
Las características de la EM obligan a tomar medidas coordinadas para evitar y controlar la
diseminación de brotes y epidemias. Para lograr lo anteriormente expuesto es importante disponer,
en primer lugar, de una rápida y certera capacidad diagnóstica sobre la base de una identificación
primaria del agente causal, medidas que permitirán tomar acciones inmediatas y en segundo lugar, y
con la misma prioridad, la caracterización de las cepas de N. meningitidis sobre la base de sus
marcadores epidemiológicos es imprescindible para trazar una política adecuada de prevención,
donde la vacunación ocupa un lugar predominante (Pollard y Frasch, 2001; Vázquez, 2002).
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1.2 Estructura antigénica de N. meningitidis
N. meningitidis es un diplococo gramnegativo, aerobio y con cápsula polisacarídica. Su superficie
está constituida por dos membranas (interna y externa) y una capa de péptidoglicano (Pollard y
Frasch, 2001) (anexo 1). El PC protege al meningococo de la acción del complemento e interfiere
también la opsonización, mecanismos que evitan la fagocitosis y la lisis mediada por el
complemento. La membrana externa cuenta entre sus componentes con fosfolípidos, LPS y PME.
Las estructuras superficiales de N. meningitidis son decisivas en los mecanismos de adhesión,
colonización, invasión y patogenia de la EM. Algunas de estas estructuras muestran una gran
variabilidad de fases y permiten al meningococo no ser detectado por el sistema inmune del
hospedero (Segal y Pollard, 2004).
Durante su crecimiento, N. meningitidis libera fracciones intactas de su estructura superficial en
forma de VME, éstas juegan un papel importante en la patogenia de la EM, son responsables de la
variación de fase y de la mímica antigénica, así como se unen a los anticuerpos e intervienen en la
inducción de la endotoxina mediadora de schock séptico (Poolman y col, 1995). Todas estas
estructuras superficiales son inmunogénicas y constituyen la base para la selección de los antígenos
vacunales (Bröker, 2003; Perret y Pollard, 2005)
1.3 Clasificación serológica de N. meningitidis
Tomando en cuenta las características inmunoquímicas y antigénicas de sus PC, N. meningitidis se
clasifica en 13 serogrupos. Los serogrupos se denominan con letra mayúscula (A, B, C, D, 29E, H, I,
K, L, W135, X, Y y Z) y pueden identificarse por la técnica de aglutinación en lámina portaobjetos con
antisueros serogrupos específicos (Joklik y col, 1998). Los serogrupos A, B, C, Y y W135 son los
responsables de más del 90% de los casos de EM invasiva que se notifican en el mundo
(Rosenstein y col, 2001).
La diversidad antigénica de las PME de clase 2/3 (PorB) permiten la identificación de los serotipos.
Estas proteínas tienen pesos moleculares de 40– 42 kDa y de 37– 39 kDa, respectivamente, son
codificadas por el gen porB y están fuertemente representadas en la membrana externa, tienen
función de porinas y se encuentran en todas las cepas de N. meningitidis donde son mutuamente
excluyentes. Las PorB expresan 8 lazos variables que se exponen en la superficie celular y algunos
se involucran en la formación de epítopes. Los lazos II y III son prácticamente invariables y la
diversidad epitópica se encuentra en los lazos I y del IV al VIII (Poolman y col, 1995).
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Los serotipos se identifican mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA) con anticuerpos
monoclonales (AcM), designándose con un número arábigo. Las cepas que no reaccionan con los
AcM disponibles en los paneles comerciales se denominan “no tipables” (NT) (Joklik y col, 1998).
Hasta la fecha, se describen alrededor de 22 serotipos diferentes, entre los que se encuentran el 2, 4
y 15, serotipos vinculados principalmente con brotes y epidemias de EM (Caugant y col, 1998;
Jensen y col, 2003). Se detectan anticuerpos contra las proteínas de clase 3 en pacientes y
convalecientes de meningitis meningocócica, anticuerpos que alcanzan concentraciones máximas a
las dos semanas del inicio de la infección y que luego declinan rápidamente (Guttormsen y col,
1993).
La diversidad antigénica de la proteína de clase 1 (PorA), permite la clasificación de N. meningitidis
en subtipos. Esta proteína es codificada por el gen porA y tienen pesos moleculares entre 43–47
kDa. La secuenciación genética de PorA brinda la información necesaria para establecer su modelo
de organización dentro de la membrana externa. El modelo propone que esta proteína presenta una
serie de plegamientos ß-anfipáticos que atraviesan la membrana externa y generan ocho lazos
hidrofílicos expuestos en la superficie bacteriana. Las PorA presentan dos regiones variables (RV1)
y (RV2), ubicadas en los lazos superficiales 1 y 4 del modelo propuesto (Poolman y col, 1995;
Peeters y col. 1999). Cada región variable determina un subtipo, definido por reacciones específicas
mediante ELISA con AcM y se designan también con un número arábigo, aunque precedido por el
prefijo P1. Los serotipos más frecuentes en brotes y epidemias son los siguientes: P1.4, P1.16,
P1.15 y P1.2 (Mastroniano y col, 2003). Estos epítopes inducen la producción de anticuerpos
bactericidas en los humanos (Martin y col, 2000) y prevalecen en la respuesta inmune frente a las
vacunas obtenidas a partir de VME (Zollinger, 1998). Es por esto que, vacunas que se encuentran
en desarrollo y otras ya establecidas, incluyen a PorA como uno de sus componentes fundamentales
(Sierra y col, 1991; Jodar y col, 2002).
El panel de los AcM empleados para la sero/subtipificación es insuficiente y frecuentemente, las
PorA no pueden ser identificadas y un número creciente de las mismas se clasifican como no
subtipables (NST), ya sea porque esa variante no es reconocida, o porque no expresa PorA. Este
grupo heterogéneo de aislamientos puede ser caracterizado tomando como base las secuencias
aminoacídicas de las RV1 y RV2, por lo que se propone incluir en la nomenclatura del meningococo
no sólo el resultado de la reacción de epítopes con AcM, sino también la secuenciación de las RV de
PorA, resultado que puede compartirse entre todos los laboratorios a través de la página web para
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Neisseria. Este método proporciona una información más confiable para el diseño de las vacunas
basadas en las secuencias de PorA, que los análisis apoyados en las reacciones con AcM. Existen
varias nomenclaturas propuestas que mantienen la designación convencional de la familia seguida
de una identificación correspondiente a la nueva secuencia nucleotídica encontrada (por ejemplo:
PorA RV2 P1.7-2 se describe en la literatura de manera variable como P1.7h y P1.7b) ( Suker y col,
1994;Sacchi y col, 1998; Maiden y col, 1999; Russell y col, 2004).
La variabilidad antigénica de los LPS constituye la base del inmunotipaje. Se ha podido determinar
que los LPS muestran un grupo de epítopes conservados con reactividad cruzada; mientras que
otros son variables desde el punto de vista antigénico. Estos epítopes pueden variar en dependencia
de las condiciones del cultivo, la expresión cuantitativa y cualitativa, no sólo entre cepas, sino
también entre las diferentes bacterias de un mismo cultivo (Poolman y col, 1995). Los inmunotipos
se designan con un número arábigo precedido por el prefijo L. Cada cepa de N. meningitidis expresa
más de un epítope inmunotipo específico en su lipooligosacárido (LOS). Existen 13 determinantes
diferentes de inmunotipo, estructuras que radican en la parte oligosacarídica de la molécula. Los
determinantes de LOS identificados como L1,8,10 se expresan más en las cepas de portadores,
mientras que la combinación L3,7,9 se detecta principalmente en los aislamientos de casos clínicos
(Jennings y col, 1999).
Los anticuerpos contra LOS son bactericidas, capaces de causar lisis celular y median la protección
en las ratas durante los modelos experimentales de infección (Estabrook y col, 2004).
Basado en las diferencias antigénicas de las estructuras superficiales (PC, PME y LOS) de
N. meningitidis se utilizó un sistema de nomenclatura uniforme, semejante al esquema O:K:H
empleado para Escherichia coli, donde el PC identifica a los serogrupos, las PME clase 2/3 a los
serotipos, las PME clase 1 a los subtipos y los LOS a los inmunotipos. Un ejemplo de esta
nomenclatura es la del fenotipo B:4:P1.19,15:L3,7,9 (Frasch y col, 1985). Durante muchos años las
investigaciones epidemiológicas se basan sólo en la caracterización serológica como marcadores
fenotípicos (Frasch, 2005), sin embargo a pesar de la ventaja de poder tipificar los microorganismos
aislados, este método de clasificación muestra inconvenientes debido al gran número de cepas NT y
la alta diversidad de PorA y PorB existentes, así como por las limitaciones con el panel de ACM
disponibles (Feavers y col, 1999). Otra dificultad encontrada es la fuerte selección supuestamente
impuesta por la respuesta inmune del huésped y la posibilidad de intercambio del ADN por la
transformación de N. meningitidis (Maiden y Frosch, 2001). Estos factores suponen que la
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caracterización serológica es un indicador poco confiable de las relaciones genéticas (Caugant,
2002), por lo que a los marcadores fenotípicos deben incluírseles también el análisis del ADN
(Vázquez y Berron, 2004).
1.4 Identificación genotípica de N. meningitidis
Con el transcurso de los años, un clon de meningococo puede cambiar de serotipo o subtipo como
consecuencia del frecuente intercambio genético entre ellos. La existencia de estas recombinaciones
lleva a definir el concepto de complejos clonales, éstos representan grupos de clones distintos,
aunque lo suficientemente próximos genéticamente para permitir el reconocimiento de un origen
común. La tipificación de cepas de N. meningitidis por métodos moleculares es imprescindible en los
estudios epidemiológicos de la EM (Caugant y col, 1987; Maiden, 1998; Jolley y col, 2002). Para la
identificación genotípica se utilizan diferentes métodos y entre los más empleados se encuentran la
“electroforesis de enzima multilocus” (EEM), técnica que reconoce los diferentes tipos
electroforéticos (ET) sobre la base de una matriz completa de relaciones entre la diferente movilidad
electroforética de un grupo de enzimas citoplasmáticas que se relacionan de manera directa con la
variación de sus respectivos genes estructurales (Caugant y col, 1986) y la técnica de “multilocus
sequence types” (MLST) (Maiden y col, 1998), método donde las variaciones en los diferentes locus
se detectan de forma directa, por la secuenciación del ADN en los fragmentos de los genes
seleccionados, permitiendo la identificación de los grupos de microorganismos con genotipos
idénticos (clones) o altamente relacionados (líneas clonales), denominados tipos secuenciales (ST).
El MLST muestra una alta correlación con los resultados obtenidos por la EEM, aunque presenta un
mayor poder de discriminación.
Estudios poblacionales, empleando la EEM y el MLST identifican grupos equivalentes de genotipos
relacionados con un complejo clonal (Maiden y col, 1998), denominándoseles con las siglas ET o
ST, respectivamente. Cada complejo clonal incluye todos los aislamientos que comparten los ET o
alelos idénticos para cuatro o más locus MLST. Colecciones de cepas de N. meningitidis aisladas de
portadores asintomáticos muestran una gran diversidad genética, mientras que, la mayoría de los
meningococos asociados con los casos invasivos de EM, pertenecen a un limitado número de
complejos clonales conocidos como linajes hiperinvasivos (Caugant y col, 1998; Maiden y col, 1998;
Jolley y col, 2002). Los principales clones vinculados con casos de EM se clasifican como: complejo
ST-1, complejo ST-4, complejo ST-5, complejo ST-8, complejo ST-11, complejo ST-32 y complejo
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ST-41/44 (Urwin y col, 2004). Este conocimiento pudiera simplificar el número de los antígenos
requeridos para la obtención de una vacuna que brinde una protección cruzada contra todos los
linajes hiperinvasivos (Perret y Pollard, 2005).
La combinación de estas técnicas genómicas brinda información para un mejor entendimiento de la
estructura poblacional y la epidemiología del meningococo del serogrupo B, así como para el
desarrollo de vacunas con un perfil de protección cruzada más amplio (Perret y Pollard, 2005)
1.5 Epidemiología de la enfermedad meningocócica
La EM se describe por Vieusseux en 1805, después de una epidemia que ocurre en Ginebra, Suiza.
Sin embargo, no es hasta 1887, que Anton Weichselbaum observa los típicos diplococos
gramnegativos de N. meningitidis en el fluido cerebroespinal de los casos clínicos y los designa
como “Diplococcus intracellularis”. Posteriormente, en todos los continentes se notifican numerosas
epidemias durante los últimos 200 años (Pollard y Maiden, 2004). La incidencia de EM varía de
acuerdo con las diferentes regiones geográficas. Las mayores epidemias se presentan en el llamado
“cinturón de la meningitis” del África subsahariana, zona donde prevalece el serogrupo A y el número
de enfermos sobrepasa la cifra de 1 000/100 000 habitantes (Pollard y col, 2003). La EM tiene un
comportamiento endémico en la mayoría de los países desarrollados con una prevalencia de los
serogrupos B y C, mostrando una incidencia entre 1—5/100 000 habitantes. No obstante, en los
países en vías de desarrollo, el número de casos notificados aumenta (10-25/100 000 habitantes),
debido a la naturaleza endémica de la EM, donde ha existido una amplia variabilidad de la incidencia
en el tiempo y en las diferentes regiones geográficas (Pollard y Maiden, 2004).
El serogrupo A, principal agente etiológico de EM en Europa y Estados Unidos a principios del
siglo XX se asocia con picos epidémicos ocurridos durante la I y II Guerra Mundial, pero después del
año 1945, desaparece prácticamente de esas regiones (Rosenstein y col, 2001). Sin embargo,
ocasiona la mayoría de los casos de EM de Asia y África, aunque, recientemente, en la región
subsahariana se incrementan los casos producidos por N. meningitidis W135 (Pollard y col, 2003).
Mientras que, el serogrupo Y asciende en Estados Unidos (9 al 34%) en la segunda mitad de la
década de los años 90 (Rosenstein y col, 2001; Balmer y col, 2002) y en estos momentos, los
serogrupos B y C se notifican principalmente en regiones de Europa, América y Oceanía (Balmer y
col, 2002) (tabla 1).
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Tabla 1. Distribución de los serogrupos aislados de casos de EM en algunas regiones del mundo, a
finales de la década de los años 90.
Región
Inglaterra y Wales
Nueva Zelanda
Canadá
Estados Unidos
B
(%)
54
87
48
33
C
(%)
38
11
30
28
Serogrupos
Y
(%)
2
1
11
34
W135
(%)
3
0
4
2
Otros
(%)
3
1
7
3
Se conoce que, según el agente etiológico de una epidemia de EM, su tiempo de duración varía. Las
epidemias causadas por los serogrupos A y C se mantienen en una determinada región entre uno a
tres años, pero las producidas por meningococos del serogrupo B, persisten entre cinco a 10 años o
más. Al igual que sucede con otros serogrupos son los niños y adultos jóvenes la población más
afectada durante las epidemias por N. meningitidis serogrupo B. En las últimas décadas se notifican
epidemias por este serogrupo en Cuba, Noruega, Holanda, Irlanda, Reino Unido, Nueva Zelanda,
Chile, Brasil y Uruguay (Perret y Pollard, 2005).
Los datos epidemiológicos sugieren que la ecología natural de la EM trae aparejado variaciones en
su incidencia a través del mundo, diferencias en la distribución de los serogrupos entre las regiones
geográficas, así como cambios en la distribución de los mismos con el tiempo (Pollard y col, 2003).
1.6 Vacunas de polisacáridos capsulares
La era moderna en el desarrollo de las vacunas antimeningocócicas se inicia a finales de los años
60, etapa donde los intentos para lograr vacunas de PC efectivas habían fallado porque esta
estructura era depolimerizada durante los largos periodos de cultivo y de concentración de los caldos
durante el proceso de purificación. Este fallo se resuelve con la incorporación de un detergente
catiónico (cetrimida), compuesto que precipita rápidamente al polisacárido polianiónico en los caldos
de cultivo de 12 a 15 h. de fermentación. Está bien documentado que las vacunas de PC de
N. meningitidis de los serogrupos A y C, confieren protección contra la EM y se asocian con una
inmunidad humoral, específicamente vinculada con la presencia de anticuerpos bactericidas
presentes en el suero (Gotschlich y col, 1969).
En la década de los años 80 estas vacunas se utilizan en todo el mundo, sobre todo en la esfera
militar, mostrando su efectividad para el control de los brotes y epidemias. Posteriormente, se
demuestra que los PC de los serogrupos Y y W135 son inmunológicamente similares a los
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serogrupos A y C (Cadoz, 1985). Sin embargo, el PC de N. meningitidis serogrupo B es pobre desde
el punto de vista inmunogénico, por ser un polímero con enlace alfa 2-8 del ácido N-acetil
neuroamínico (ácido siálico), tiene una marcada similitud con estructuras presentes en las células
neuronales (N-CAM) de los tejidos cerebrales fetales y en los tejidos de los adultos, aunque en una
menor cantidad (Jennings y col, 1986; Zollinger, 1998).
Los polisacáridos bacterianos son antígenos timo independiente que producen su respuesta inmune
a través de la estimulación de los linfocitos B maduros, propiedad que provoca una baja respuesta
inmunológica entre los niños menores de dos años, ausencia de una respuesta de memoria, no
confiere inmunidad duradera después de las vacunaciones sucesivas y no reduce el estado de
portador nasofaríngeo en la población inmunizada (Ruggeberg y Pollard, 2004). Las vacunas que
ofrecen una potente respuesta inmune en los niños pequeños son las compuestas por antígenos
proteicos, inmunógenos capaces de inducir una respuesta timo dependiente (Baltimore, 2006).
Los PC unidos de manera covalente con proteínas portadoras originan una nueva generación de
vacunas, conocidas como “vacunas conjugadas”. La unión de ambas estructuras proporciona una
respuesta inmune timo dependiente, ocasionando así una mejor respuesta primaria y anamnésica
después de las sucesivas aplicaciones del antígeno (Baltimore, 2006). Además, por la inmunidad de
rebaño que producen, disminuyen la colonización nasofaríngea por N. meningitidis (Segal y Pollard,
2004; Snape y Pollard, 2005; Baltimore, 2006; Keyserling, 2006)
En el Reino Unido se licencia la primera vacuna conjugada de N. meningitidis preparada a partir del
PC del serogrupo C (MCC). Este inmunógeno induce la producción de anticuerpos bactericidas que
se correlacionan con los niveles de protección alcanzados en la población vacunada (Borrows y col,
2001; Andrews y col 2003). La MCC disminuye la proporción de portadores de N. meningitidis
serogrupo C; posibilitando así una inmunidad de rebaño. La vacuna se aplica también en otros
países de Europa y muestra similares resultados (Segal y Pollard, 2004; Trotter y col, 2004). Su
aplicación cambió la situación presentada anteriormente en la tabla 1 y en la actualidad, la incidencia
de EM ocasionada por N. meningitidis B es del 86% (Pollard, 2007).
En el 2005, la FDA aprueba en los Estados Unidos, una vacuna antimeningocócica que incluye los
PC de los serogrupos A, C, Y y W135 conjugados al toxoide diftérico. Este preparado vacunal se
recomienda y emplea en la inmunización activa de los adolescentes y adultos de 11 a 55 años de
edad (Pichichero, 2005; Kimmel, 2005; Baltimore, 2006).
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Una vacuna de PC conjugado y adsorbido en HA contra el serogrupo B y que mostró una respuesta
inmunogénica elevada en ratones (Fusco, 1997), no evidenció una adecuada inmunogenicidad en
humanos (adultos). La respuesta se midió a través de anticuerpos funcionales (actividad bactericida,
opsonofagocitosis y protección pasiva en animales) (Bruge y col, 2004). Además, por el temor que
se desarrolle una posible autoinmunidad debido a la similitud del PC del serogrupo B con las
estructuras presentes en las células humanas, es poco probable que las autoridades regulatorias
autoricen la realización de ensayos clínicos en los adolescentes y niños pequeños, grupos
poblacionales más afectados por la EM (Perret y Pollard, 2005)
1.7 Vacunas basadas en PME contra N. meningitidis serogrupo B
Se demuestra que en los convalecientes de las infecciones causadas por N. meningitidis serogrupo
B se producen anticuerpos contra los antígenos de superficie no capsulares, principalmente contra
las PME, en especial hacia PorA. Este comportamiento hizo pensar que las vacunas basadas en
estos antígenos de superficie, capaces de estimular una actividad bactericida, podrían ser
inmunógenos efectivos en el control de la EM causada por el serogrupo B (Frasch y Chapman, 1973;
Jones y Eldrige, 1979). Los primeros intentos de obtener preparados inmunogénicos a partir de PME
fallaron, comportamiento atribuido a la presentación de los antígenos en forma particulada debido a
la agregación de las PME.
Cuando las PME se obtienen en forma de VME y se solubilizan con un PC de meningococo, las
vacunas son inmunogénicas en humanos y provocan el incremento de la respuesta inmune luego de
aplicar la segunda dosis, transcurridas seis a ocho semanas después de aplicar la primera (Zollinger
y col, 1979; Helting y col, 1981; Frasch y Peppler, 1982). La adsorción del complejo de VME-PC del
serogrupo C con el Hidróxido o Fosfato de Aluminio, incrementa de manera significativa la respuesta
bactericida de los ratones contra las PME (Hang y Frasch, 1984).
En la segunda mitad de la década de los años 80, se desarrolla en Cuba una tecnología de
producción basada en los principios mencionados anteriormente. La vacuna antimeningocócica
cubana se prepara a partir de VME de una cepa de N. meningitidis serogrupo B, clasificada
fenotípicamente como B:4:P1.19,15, cepa que predomina y constituye el principal agente etiológico
de la epidemia de EM de Cuba ocurrida en la década del 80. Las VME purificadas se solubilizan con
PC del serogrupo C (PC-C) y el complejo así obtenido, se adsorbe en un gel de HA. Cada dosis de
0,5 mL contiene: 50 μg de proteínas de VME, 50 μg de PC-C y 2 mg de HA. Este candidato vacunal
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se administra en un ensayo clínico Fase 3 a los escolares con edades comprendidas entre 10 y 14
años. La vacuna fue segura y alcanzó 83% de eficacia (Sierra y col, 1991). Se demuestra por
primera vez en el mundo, que los anticuerpos inducidos por antígenos de superficie (no capsulares)
protegen contra la EM (Frasch, 1995).
Paralelamente al ensayo cubano se valoran otros candidatos en Chile y Noruega, pero a partir de
VME obtenidas de las cepas epidémicas de esas regiones. Sin embargo, los resultados alcanzados
en esos países fueron inferiores a los obtenidos en Cuba (Zollinger, 1991; Bjune, 1991).
1.8 La epidemia de enfermedad meningocócica en Cuba y su control
La epidemia de EM que afecta a Cuba durante la década de los años 80 se inicia en 1976, situación
epidemiológica que se convierte en el principal problema de salud durante esa década y alcanza su
pico máximo de incidencia (14,4/100 000 habitantes) en el año 1983 a expensa del serogrupo B
(Valcárcel, 1991). El comportamiento fenotípico predominante de la epidemia de Cuba estuvo
integrado por los siguientes marcadores epidemiológicos: serogrupo B (96,8%); serotipo 4 (85,7%);
subtipo 19,15 (78,5%) y el inmunotipo 3,7,9 (85,7%) (Martínez, 2004). La cepa predominante se
asocia con los complejos hipervirulentos ET-5 y ST-32 (Urwin y col, 2003, Urwin y col, 2004). La
situación epidémica del país se controla por la campaña de inmunización masiva con la vacuna
antimeningocócica cubana (VA-MENGOC-BC®), campaña realizada entre 1989 – 1991 en toda la
población con edades comprendidas entre los tres meses y 24 años. En los estudios realizados a los
niños con edades entre los tres meses y cinco años se constata una efectividad del 90% (Rico y col,
1992). Posteriormente, en 1991 VA-MENGOC-BC® se incorpora al Programa Nacional de
Inmunizaciones y se logra reducir en unos pocos años la incidencia de EM, notificándose cifras
inferiores a las descritas en la etapa pre-epidémica (Pérez y col, 2003).
1.9 Evaluaciones del post-licenciamiento de VA-MENGOC-BC en otros países
La vacuna contra N. meningitidis serogrupo B, registrada con la marca VA-MENGOC-BC® es el
producto líder de la Biotecnología de Cuba. Cuenta con Registro Médico Sanitario en 15 países y
hasta la fecha, se han aplicado casi 60 millones de dosis, proporcionando al país ingresos
superiores a los 450 millones de USD. Después de su licenciamiento en Cuba se utiliza para el
control de brotes de EM en Brasil, Colombia, Argentina y Uruguay. También se ha sometido a
diferentes estudios de seguridad, eficacia e inmunogenicidad con la participación del Centro de
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Control de Enfermedades de los Estados Unidos (CDC) y la Organización Mundial de la Salud
(OMS).
VA-MENGOC-BC® es segura y bien tolerada. Los efectos adversos que se presentan después de su
aplicación no son graves y los síntomas locales más frecuentes son: dolor, eritema e induración
(Sierra y col, 1991; Perkins y col, 1998; Tappero y col, 1999).
Los estudios clínicos demuestran que VA-MENGOC-BC® es efectiva para el control de brotes y
epidemias de EM ocasionados por cepas homólogas y heterólogas. En Colombia, luego de su
aplicación para controlar un brote epidémico por una cepa B:4:P1.19,15, se señala una efectividad
del 95%, (Galeano, 1995) y en Brasil se demuestra igual eficacia contra cepas de N. meningitidis
homólogas y heterólogas, aunque los resultados estuvieron relacionados con la edad, obteniéndose
una mejor respuesta en los niños con más de cuatro años (De Moraes y col, 1992).
Está bien documentado que VA-MENGOC-BC® induce una respuesta inmune protectora y que los
anticuerpos bactericidas están dirigidos principalmente contra PorA, porina responsable de una
inmunidad específica, pero por los resultados obtenidos en diferentes estudios se infiere que en esa
protección participan también anticuerpos dirigidos contra otros antígenos presentes en las VME
(diferentes PME no identificadas y LPS) (Milagres y col, 1994; Zollinger, 1998).
Diferentes ensayos clínicos demuestran que en todas las edades de las poblaciones inmunizadas
con dos dosis, VAMENGOC-BC® es inmunogénica y que la aplicación de una tercera dosis
potencializa la respuesta inmune contra cepas homólogas. Frente a las diferentes cepas epidémicas
heterólogas se observa un comportamiento similar en los niños y adultos, no así entre los lactantes
(Tappero y col, 1999). En esos estudios, la inmunidad se evalúa a través de la actividad bactericida
del suero (ABS) y se basan en los valores de corte establecidos (≥ 4) para las vacunas
polisacarídicas. Sin embargo, en el caso de las vacunas de VME no está aún definido el nivel de
corte, situación quizás relacionada con la no disponibilidad de un método estandarizado para medir
la ABS (Holst y col, 2003), así como por la complejidad de las VME como antígeno multicomponente,
la respuesta inmune dependiente de la edad y la situación epidemiológica del lugar donde se realiza
el ensayo clínico (Balmer y col, 2004; Borrow y col, 2005), por todos esos inconvenientes, se
considera como un sujeto respondedor, a todo individuo que incremente su título de ABS cuatro
veces antes y después de la vacunación (Borrow y col, 2005).
Otros métodos como la opsonofagocitosis y los modelos animales están en estudio con el objetivo
de proponer posibles correlatos de protección (Perret y Pollard, 2005).
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1.10 Metodologías para la obtención de vacunas contra el serogrupo B a partir de VME
1.10.1 Selección de las cepas vacunales y aplicación del sistema de lotes de siembra
Dada las características inmunogénicas de las vacunas de VME, en su producción se deben utilizar
cepas de N. meningitidis aisladas de epidemias, denominadas como “tipo salvaje”. Entre las cepas
predominantes se seleccionan alrededor de cinco y todas deben tener los mismos marcadores
epidemiológicos de serotipo y serosubtipo del clon epidémico predominante, evaluándose su
potencialidad de crecimiento y capacidad para la expresión de los antígenos de interés tales como:
PorA, PorB y la PME de clase 5 (Opc), proteínas de alto peso molecular reguladas por hierro y LPS
(L-3,7,9). Cuando se cuenta con una tecnología de producción establecida, lo ideal sería seleccionar
al microorganismo que mejor se adapte a las condiciones del proceso (Frasch y col, 2001).
En la producción de vacunas es importante mantener las características genéticas de la cepa para
garantizar la consistencia de expresión de los antígenos de interés, en este sentido se establece la
aplicación del sistema de lotes de siembra; procedimiento donde los cultivos de producción
mantienen las mismas características de la cepa de origen, cepa que se emplea para el lote de
siembra de referencia y a partir del mismo, se obtiene el lote de siembra de trabajo, utilizado para
iniciar cada proceso. Este sistema garantiza un número de pases fijos entre el lote de referencia y
los cultivos de producción (EC, 2007).
1.10.2 Medios de cultivo
N. meningitidis es exigente en sus requerimientos nutricionales y requiere de medios de cultivo
enriquecidos (Joklik y col, 1998).
Para las vacunas de polisacáridos meningocócicos se recomienda el medio Agar Müller-Hinton
(AMH) como el medio sólido a emplear en los primeros pasos de la producción (WHO Technical
Reports Series, 1976). Otros autores refieren también el uso del Caldo Triptona Soya enriquecido
con Extracto de Levadura (Frasch, 1990).
Como medio líquido para la producción de inóculos y la fermentación de N. meningitidis, se
recomienda el medio Frantz suplementado con un 2% de Extracto de Levadura dializado (WHO
Technical Reports Series, 1976). Este medio se emplea por el Instituto Nacional de Salud Pública de
Noruega en la producción de alrededor de 360 000 dosis de vacunas para los ensayos clínicos y el
Instituto Finlay ha producido más de 60 millones de dosis.
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Posteriormente, científicos de la firma Merck proponen el medio Catlin modificado (MC.6) para
producir las VME empleadas como proteínas portadoras en la producción de la vacuna conjugada
contra Haemophilus influenzae tipo b (Fu y col, 1995). El medio Catlin modificado tiene la ventaja de
ser químicamente definido, diferenciándose así del medio Frantz, medio que por su origen biológico
(contiene Extracto de Levadura), puede presentar algunas variaciones entre los lotes, sobre todo en
cuanto a la potencialidad del crecimiento de N. meningitidis (Fu y col, 1995). El medio MC.6 es
adecuado para el crecimiento de las diferentes cepas de meningococos y sus concentraciones de
hierro pueden ajustarse para la expresión de las proteínas reguladas por el hierro (PRH)
(Fu y col, 1995).
Los meningococos requieren pequeñas cantidades de hierro para crecer, proporciones que pueden
encontrarse en los medios de cultivo procedentes del agua y trazas presentes en algunos de los
componentes de los mismos (Frasch y col, 2001). Debido a que las PRH constituyen antígenos de
interés vacunal, se evalúa el Desferral y el ácido etilendiamino-dihidroxi-fenil acético (EDDA) como
agentes quelantes del hierro soluble en los medios de cultivos, sustancias que favorecen su
expresión. Sin embargo, en el caso del Desferral, se observa que este compuesto afecta el
crecimiento normal de N. meningitidis. Su uso implica primero hacer crecer al meningococo en un
medio con hierro y posteriormente dar un pase a medios desferrados, cultivos donde no se produce
un
crecimiento
bacteriano
detectable,
pero
se
logra
la
expresión
de
las
PRH
(Brandileone y col, 1994). Los estudios mencionados se realizan a escala del laboratorio y en
zarandas orbitales, desconociéndose hasta el presente, la factibilidad de su uso en los procesos a
gran escala.
Algunos autores demuestran que los cambios en la composición de las PME pueden ocurrir por
modificaciones en los medios de cultivo. Así en el medio Frantz modificado, donde se substituye el
ácido L glutámico y la L cisteína por el D glutámico y la D cisteína, respectivamente, se obtiene una
mayor expresión de la proteína de 28 kDa con respecto a la de 41 kDa, proteína que se expresa en
el medio original (Frasch y col, 1976).
1.10.3 Condiciones de cultivos
Existen pocas referencias sobre las condiciones de crecimiento del meningococo serogrupo B en la
obtención de los cultivos con fines vacunales. No obstante, la literatura especializada refiere que
N. meningitidis se cultiva dentro de limites estrechos de temperatura (35 – 37 ºC) y pH (7,2 – 7,4).
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Los cultivos en medio sólido precisan de una humedad elevada y una concentración de CO2 entre un
5 – 10% (Guibourdenche y Riou, 1997).
Estudios preliminares realizados a escala de laboratorio comprueban que los cambios en la
composición de las PME son cepa específica, aún dentro del mismo serotipo. Aunque, una misma
cepa en diferentes condiciones de cultivo puede presentar variaciones en la composición de algunos
de sus componentes de membrana (Frasch y col, 1972).
Se señala que cuando en una misma cepa se emplea una alta aeración, el tiempo de duplicación es
inferior y se incrementan ligeramente los rendimientos de la biomasa. Los cultivos con alta
oxigenación producen una disminución menos brusca del pH, que aquellos que se cultivan con baja
aeración, evidenciándose las diferentes rutas metabólicas involucradas en la degradación de la
glucosa. Por otra parte, en los cultivos con una oxigenación elevada se favorece la expresión de las
proteínas de 28 – 29 kDa, mientras que, en los cultivos con concentraciones bajas de oxígeno
predominan las de 37 kDa (Frasch y col, 1976). En general, las condiciones óptimas del cultivo y la
expresión de las PME son diferentes para cada cepa y deben determinarse experimentalmente
(Frasch y col, 2001).
Para los cultivos de N. meningitidis se recomiendan valores del 25% de oxígeno disuelto (Fu y col,
1995; Frasch y col, 2001).
1.10.4 Criterios de cosecha e inactivación
Existe un criterio generalizado de realizar las cosechas del cultivo de N. meningitidis al final de la
fase logarítmica del crecimiento o al inicio de la fase estacionaria (Campa y col, 1989; Fredriksen y
col, 1991; Frasch y col, 2001). Con este criterio se logra una mayor uniformidad en los componentes
de la membrana, pues en este estadío fisiológico, la mayoría de las células son viables. Las
cosechas en los estadíos más avanzados de la fase estacionaria favorecerían la lisis celular y
dificultarían la extracción de las VME, así como los posteriores procesos de purificación
(Campa y col, 1989).
De igual forma a la inactivación de otros meningococos, en el caso del serogrupo B se propone la
inactivación a 56 ºC durante 30 minutos al final del cultivo y antes de realizar la extracción de las
VME (Poolman, 1990; Frasch y col, 2001). Este criterio no es utilizado de manera uniforme, otros
autores consideran más beneficioso realizar la cosecha y extracción de las VME a partir de los
microorganismos vivos, preservando así la conformación nativa de los componentes de la
membrana externa (Campa y col, 1989; Rosenqvist y col, 2001). En este caso se necesita demostrar
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que la inactivación de los cultivos se produce durante la etapa de extracción de las VME con
Desoxicolato de Sodio (DOC) al 0,5% y se asegura que el producto esté inactivado antes de
comenzar la etapa de purificación.
1.10.5 Métodos de separación de biomasa
En la etapa de la cosecha de N. meningitidis serogrupo B y durante el desarrollo de las vacunas de
VME, se emplea la centrifugación (Campa y col, 1989; Fredriksen y col, 1991), método que introduce
el Instituto Finlay en la producción industrial de las vacunas. La centrifugación permite procesar
grandes volúmenes de cultivo, aunque tiene la tendencia de formar espuma y atrapar aire,
generando gran cantidad de aerosoles, situación que resulta peligrosa cuando se trabaja con
materiales infecciosos.
En la última década, la MFT se hace cada vez más atractiva para la separación sólido-líquido. Los
procesos de MFT se basan en la constante recirculación de una suspensión celular a través de una
membrana porosa, el filtrado pasa por los poros del filtro, dando como resultado neto, la
concentración del material celular y la eliminación de los componentes solubles del medio (Carreré y
col, 1996). En estos momentos, esta tecnología se convierte en una importante herramienta para la
separación de las suspensiones biológicas y por las ventajas que presenta, desplaza a los métodos
de separación convencional, destacándose entre los beneficios que aporta, la posibilidad de realizar
operaciones asépticas sin la generación de aerosoles a través de un método validable desde el
punto de vista de limpieza y proceso (PDA, 1992).
1.10.6 Extracción de VME
N. meningitidis, al igual que otras bacterias gramnegativas, tiene la capacidad de liberar VME
durante su crecimiento en los medios de cultivo, importante observación en el desarrollo de las
vacunas, puesto que las VME pueden separarse de los caldos de cultivos y servir como material de
partida para la obtención de los antígenos vacunales. Por otra parte, las VME pueden extraerse de la
membrana externa con el uso de detergentes, maniobra que se facilita por la naturaleza débil de los
enlaces presentes en la unión de las membranas (Frasch y col, 2001).
Las cepas epidémicas evaluadas en el desarrollo de las vacunas contienen generalmente PC de alto
peso molecular y alrededor de 500 μg de LPS por mg de PME. Con el objetivo de obtener vacunas,
el contenido de LPS debe disminuirse para reducir la actividad endotóxica de los mismos, condición
que puede lograrse mediante el tratamiento con detergentes, aunque para mantener la conformación
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bicapa de la membrana, tiene que retenerse en la misma, una cantidad mínima de LPS. Estas
estructuras cuando se enlazan con la membrana son 100 veces menos tóxicas que los LPS libres.
Su cantidad en la membrana puede reducirse hasta aproximadamente el 5% relativo a la proteína,
sin afectar la estructura vesicular mediante la solubilización con el detergente DOC y aunque se
podrían emplear otros detergentes, el DOC constituye una buena opción, por su efectividad y origen
natural (obtenido del metabolismo de la bilis) (Frasch y col, 2001).
El proceso de extracción de las VME debe realizarse con valores de pH cercanos a ocho, valores
superiores muestran tendencia a la agregación. Por otra parte, si el pH baja a 7,5 ocurre una
transición de forma y el número de agregados se incrementa rápidamente, formándose una
gelificación durante la extracción. El tampón utilizado debe tener un pH que garantice elevar el de la
suspensión celular desde los valores ligeramente ácidos a un pH entre 8,1 y 8,3 (Rosenqvist y col,
2001). Con este objetivo se recomienda un tampón Tris – EDTA para realizar la extracción con DOC
al 0,5% en una relación 5:1 (V/P) (Helting y col, 1981). Luego de la extracción de las VME, los restos
celulares se eliminan por la centrifugación.
1.10.7 Purificación de las VME
Los métodos empleados para la purificación de las VME son la ultracentrifugación, la cromatografía
y si el proceso lo requiere, se utilizan también enzimas (neuroaminidasa, benzonasa, DNAasa y
RNAasa). Previamente se recomienda concentrar y diafiltrar el extracto para facilitar los pasos de la
purificación (Campa y col, 1989; Frasch y col, 2001).
En Cuba se utiliza la ultracentrifugación y la cromatografía de forma consecutiva, obteniendo VME
purificadas con las características deseadas respecto a los contaminantes y su conformación
vesicular (Campa y col, 1989). Mientras que, en Noruega, se utiliza la doble ultracentrifugación sobre
un lecho de sacarosa al 20% (Fredriksen y col, 1991). Otros recomiendan utilizar el lecho de
sacarosa al 60% (Poolman, 1990), método que se justifica para evitar las agregaciones de las VME
durante este paso (Frasch y col, 2001). Luego del proceso de ultracentrifugación, las VME deben
dispersarse nuevamente en un tampón apropiado. En el caso de la cromatografía se recomienda la
exclusión molecular con una matriz de Sephacryl de los tipos S 300 Y S 400 (Campa y col, 1989;
Frasch y col, 2001)
Finalmente, en el proceso de purificación se debe eliminar el detergente y aunque, al inicio se utiliza
la precipitación alcohólica de las VME en diferentes etapas del proceso, en la actualidad se teme
que este método pueda desnaturalizar y afectar la conformación de las proteínas, sugiriéndose el
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cambio del tampón que contiene DOC, por sacarosa al 3% mediante un sistema de ultrafiltración
tangencial (Frasch y col, 2001), método descrito por el NIPH de Noruega (Fredriksen y col, 1991).
Durante el proceso de purificación es importante evitar la agregación para facilitar la filtración final de
las VME (Campa y col, 1989; Frasch y col, 2001).
1.10.8 Diseño y formulación de las vacunas
Hasta estos momentos, todas las vacunas de VME obtenidas y evaluadas en los principales ensayos
clínicos contra N. meningitidis serogrupo B contienen HA (Sierra y col, 1991; Fredriksen y col, 1991),
compuesto que se emplea como adyuvante de vacunas, por su demostrada seguridad en los
humanos. La FDA de Estados Unidos acepta una cantidad máxima de hasta 0,85 mg de
Aluminio/dosis.
Las VME son buenas como inmunógenos e inducen la formación de anticuerpos bactericidas.
Cuando estas VME se adsorben, se observa en los humanos un pequeño aumento de la
inmunogenicidad. En la variante adsorbida con HA, la respuesta pirogénica de los conejos disminuye
entre cuatro a 10 veces y también desciende la actividad endotóxica medida a través del “Limulus
amoebocyte lysate” (LAL). Sin embargo, con la variante adsorbida se observan mayores efectos
locales en los humanos, principalmente la sensibilización en el sitio de la inyección (Rosenqvist y col,
1998).
La forma de HA que se utiliza como adyuvante es un gel compuesto por pequeñas partículas de un
material microcristalino conocido como bohemita y que tiene una fórmula empírica de Al(O)(OH)
(Hem y White, 1984). El adyuvante de HA tiene un punto isoeléctrico de 11,6, mostrando una carga
positiva bajo condiciones fisiológicas y como las VME tienen carga negativa se adsorben
satisfactoriamente al HA (Frasch y col, 2001).
Las vacunas de uso parenteral empleadas en los ensayos clínicos contienen 25 ó 50 μg de proteína
por dosis. La obtenida en Noruega (Folkehelsa) tienen una composición diferente a la de
VA-MENGOC-BC®, diferencia que estriba principalmente en que no tiene PC y las VME se
estabilizan en la formulación con sacarosa al 3% (Fredriksen, 1991). Mientras que, la concentración
de HA es de 4 mg.mL-1 para VA-MENGOC-BC® y 3,33 mg.mL-1 para Folkehelsa (Campa y col, 1991;
Fredriksen y col, 1991). Ambas vacunas utilizan una preparación comercial de HA (Alhydrogel
Superfos, Biosector, Dinamarca), recomendada para minimizar las variaciones y evitar la ausencia
de reproducibilidad de las diferentes preparaciones. El HA se puede esterilizar en autoclave, sin
afectar su estabilidad (Burell y col, 1999).
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1.11 Controles de calidad de las vacunas de VME
La compleja naturaleza de las vacunas de VME hace difícil el control de calidad de las mismas
(Frasch y col, 2001). Hasta estos momentos, están caracterizados los antígenos mayoritarios que
conforman las vacunas de VME más conocidas (Frasch y col, 2001; Martínez, 2002).
No existen requisitos oficiales que establezcan las especificaciones de estas vacunas, pero el
conocimiento brindado por el estudio de algunas, así como el consenso de una reunión de
estandarización de vacunas de VME de N. meningitidis serogrupo B (OMS, 2000), permiten
establecer criterios generales para facilitar la demostración de la consistencia productiva (Frasch, y
col., 2001).
Durante la etapa de fermentación, el cultivo se sigue a través de la densidad óptica (DO) u otra
medida del crecimiento bacteriano. Debe también monitorearse la saturación del oxígeno (pO2) y el
pH. Además, al final del crecimiento hay que chequear la pureza microbiana en los medios de cultivo
enriquecidos y la composición antigénica a través del perfil electroforético de las PME por SDSPAGE e inmuno-blotting con el uso de monoclonales relevantes. Mientras que, en la etapa de
inactivación se valida la eficacia del método utilizado, por siembra en los medios sólidos
enriquecidos, con el objetivo de garantizar la ausencia de viables durante la purificación (Frasch, y
col, 2001).
Al final de la purificación se almacenan los sub-lotes y se realizan algunos métodos de control,
indicativos de la eficiencia del proceso, tales como: la concentración de proteína y el patrón
antigénico, así como el contenido relativo de LPS y PC (Campa y col., 1989; Fredriksen y col., 1991;
Frasch y col., 2001).
A partir de la mezcla de los sub-lotes se elimina el detergente y se obtiene el lote del IFA,
generalmente precipitado en alcohol (Campa y col, 1989; Frasch y col, 1990) o estabilizado en
sacarosa al 3% (Fredriksen y col, 1991). En dependencia del método utilizado en el paso final de la
purificación, ciertos controles indicativos de las características definitorias de calidad de las VME del
IFA son comunes (concentración de proteínas y su perfil electroforético, el patrón antigénico por
inmunoblot, el contenido relativo de LPS, PC, ácidos nucleicos (AN) y (DOC). Además, se realizan
métodos específicos que estarán en dependencia de la tecnología de producción empleada
(concentración de sacarosa, esterilidad, y otros), según proceda. A la vacuna adsorbida en HA se le
determinará el contenido de proteína, el porcentaje de adsorción y aluminio, así como el patrón
antigénico, la inmunogenicidad, pH, esterilidad y la potencia (Frasch y col, 2001).
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El lote final se ensayará referente a la concentración de proteínas, perfil electroforético y patrón
antigénico de las proteínas, contenido de endotoxinas, esterilidad, toxicidad inespecífica, pH y
osmolalidad (Frasch y col, 2001).
Al final, cada productor establecerá sus especificaciones de calidad, los controles de los procesos y
los productos intermediarios acorde con las características de calidad diseñadas y evaluadas para
su producto en los ensayos clínicos correspondientes (OMS, 2000).
1.12 Caracterización de las VME
Debido a la complejidad de las VME respecto a su composición proteica se necesita ampliar la
caracterización del producto con vistas a profundizar en el conocimiento de la consistencia
productiva y en la respuesta inmune de estas vacunas, por las características de los antígenos
multicomponentes que la conforman (Balmer y col, 2004; Borrow y col, 2005); donde además de las
respuestas inmunoespecíficas a las proteínas mayoritarias que caracterizan la respuesta inmune a
las mismas, se evidencian también respuestas heterólogas, que se incrementan cuando se emplean
dosis repetidas del producto, aspecto relacionado con la presencia de componentes minoritarios no
identificados hasta el presente, por los métodos convencionales utilizados en el control de las
vacunas (Perkins y col, 1998; Tappero y col, 1999).
En la última década, el rápido desarrollo de la Genómica facilita una mejor información sobre varias
secuencias genómicas de N. meningitidis (Tettlein y col, 2000; Parkhill y col, 2000; Tettlein y col,
2004), recientemente, la aplicación de la electroforesis bidimensional (2DE) y la espectrometría de
masas (MS) dan a conocer los proteomas de N. meningitidis de los serogrupos A y B (Bernardine y
col, 2004; Mignogna y col, l2005). El mejoramiento de la solubilidad de las proteínas permite conocer
los proteomas de la membrana de varias especies bacterianas, tales como: Staphylococcus aureus
(Nandakunar, 2005), Leptospira interrogans (Nally y col, 2005), Helicobacter pylori (Baik y col, 2004),
Synechocystis (Huang y col, 2004), Acinetobacter radioresistents (Pessione y col, 2003),
Caulobacter crescentus (Molloy y col, 2002), E. coli (Molloy y col, 2001) y N. meningitidis (Sánchez y
col, 2005).
Los trabajos referidos anteriormente demuestran que existen herramientas disponibles para
caracterizar los componentes proteicos de las VME.
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La microscopía electrónica (ME) de transmisión es una técnica empleada para corroborar la
presencia de las VME durante los procesos del desarrollo y producción de una vacuna (Campa y
col., 1989; Frasch y col., 1990; Fredriksen, 1991).
1.13 Regulaciones Farmacéuticas
Dentro de las regulaciones farmacéuticas, las Buenas Prácticas de Fabricación (BPF) establecen un
conjunto de lineamientos que garantizan las características de la calidad, seguridad y eficacia de los
productos farmacéuticos (WHO Technical Report Series, 2003; CECMED, 2006).
Asimismo, en la producción de biológicos, dada su variabilidad intrínseca, cada etapa del proceso
estará bien caracterizada y se establecerán también los controles rutinarios para cada una de ellas,
sobre todo los de los pasos críticos, éstos permitirán evidenciar que los procesos establecidos son
reproducibles y consistentes, en tal sentido los parámetros de las operaciones críticas serán
monitoreados. Por otra parte, los trabajos de calificación y validación demostrarán que los aspectos
críticos de las operaciones de producción cumplen con las especificaciones de diseño (CECMED,
2006; EC, 2007).
En la esfera de producción de los medicamentos pueden concebirse cambios en su fabricación con
el propósito de mejorar la calidad, el rendimiento y elevar la eficiencia del mismo. Sin embargo, estos
cambios pueden incidir en la calidad, seguridad y eficacia del producto (CECMED, 2003; EMEA,
2006a).
Cuando se evalúa un cambio en una etapa del proceso, éste se debe comparar con el establecido
durante la fabricación del producto, así como con las diferencias observadas en los atributos de
calidad causadas por el cambio y su relación con la seguridad y la potencia, evaluación que se
conoce como “ejercicio de comparabilidad”. La demostración de este ejercicio no significa que los
atributos de calidad sean idénticos, pero sí que deben ser muy similares para asegurar que cualquier
diferencia ocurrida no impacte negativamente en la seguridad y eficacia del producto. La
comparabilidad debe realizarse en el IFA y en el producto terminado, a través de los atributos de
calidad, análisis de los estadíos intermedios y los estudios de estabilidad de vida de estante, estrés y
acelerada (EMEA, 2006a).
Hasta hace poco tiempo, un cambio importante en la fabricación de un producto biológico requería
invariablemente la realización de ensayos clínicos extensos para determinar que el mismo mantenía
los atributos de seguridad y eficacia característicos (CECMED, 2003). Actualmente, se considera la
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realización de ensayos clínicos cuando en los estudios de comparabilidad no queda claro que se
mantuvieron las características de seguridad y eficacia del producto (EMEA, 2006a).
En la evaluación de los cambios se empleará un producto de referencia, denominado como
“innovador o líder”. Este producto fue el primero en autorizarse para su comercialización
(generalmente como producto patentado) sobre la base de los estudios de eficacia, seguridad y
calidad (CECMED, 2003).
Para confirmar la calidad de los IFA y el producto terminado se establecen especificaciones de
calidad, detalles que se focalizan en las características moleculares y biológicas encontradas y que
resulten útiles para certificar la seguridad y eficacia del producto. La racionalidad usada para
establecer los rangos de especificación se debe escribir y los ensayos empleados son un producto
específico. Los criterios de aceptación se establecen y justifican de acuerdo con en los datos
obtenidos en los lotes usados en los ensayos preclínicos o clínicos, así como en los datos de los
lotes de consistencia, los estudios de estabilidad y otros datos relevantes del desarrollo. En las
especificaciones se deben incluir criterios tales como: apariencia, descripción, identidad, pureza e
impurezas, potencia y cantidad. Generalmente, algunos métodos referidos en las farmacopeas son
aplicables como: esterilidad, endotoxina y volumen del contenido (EMEA, 1999).
Hasta hace poco tiempo el tema de la estabilidad de las vacunas sólo estaba contenido dentro de las
regulaciones establecidas para los productos Biológicos/Biotecnológicos. En tal sentido, la
información que avala el tiempo y las condiciones de almacenamiento debe partir de estudios de
estabilidad realizados a largo plazo y con las condiciones reales. Se deben realizar estudios de
estabilidad a tres lotes de IFA y a igual número del producto en su envase final, sobre la base de un
perfil indicativo de la estabilidad, que brinde la seguridad de que los cambios en la identidad, pureza
y potencia serán detectados. Se recomienda la realización de ensayos acelerados y de estrés ya
que los primeros aportan una valiosa información en la evaluación preliminar de cambios en la
producción, la formulación, el escalado y los perfiles de degradación; por otra parte los ensayos de
estrés brindan información del comportamiento del producto ante períodos cortos fuera de las
condiciones de almacenamiento establecidas, lo que ayudaría a la predicción de sus afectaciones
ante fallos durante la transportación (ICH, 1995; CECMED, 2000).
Recientemente la OMS publica una guía sobre la evaluación de la estabilidad de vacunas y en ella
se consideraron las ya existentes para la evaluación de la estabilidad de productos biológicos, guías
generadas por la Conferencia Internacional de Armonización (ICH), así como otros documentos de la
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OMS en este campo. El documento no intenta establecer conflictos con algunos de las regulaciones
existentes, sino que las complementa con las consideraciones específicas pero dirigidas a las
vacunas (WHO, 2006).
La nueva guía OMS crea expectaciones regulatorias para conducir los estudios de estabilidad de las
vacunas en las diferentes etapas de desarrollo tales como: aprobación de ensayos clínicos,
licenciamiento, liberación de lotes y monitoreo post-licenciamiento. El documento posibilita a los
productores utilizar el método tradicional basado en el cumplimiento de los criterios de aceptación de
las especificaciones en un estudio de estabilidad de vida de estante en condiciones reales que avale
el tiempo y las condiciones de almacenamiento, proponiendo un nuevo método a través de las
evaluaciones estadísticas para definir un tiempo de expiración a través de la extrapolación de datos.
El productor es alentado analizar con las autoridades regulatorias desde los inicios del proceso de
desarrollo de la vacuna, el diseño y los datos para el análisis que más se ajuste al producto en
cuestión, para avalar la estabilidad de la vacuna (WHO, 2006).
Los productos en desarrollo para poder utilizarse en los ensayos clínicos deben producirse de
acuerdo a los principios y las guías detalladas de BPF de medicamentos, donde se tenga en
consideración una justificación de que el producto es seguro de acuerdo con el uso previsto (EMEA,
2006b).
1.14 Tendencias en el desarrollo de vacunas contra el meningococo serogrupo B
Las vacunas de N. meningitidis serogrupo B basadas en las VME, contienen muchos componentes
de la membrana externa tales como: PorA (clase 1), PorB (clase 3), RmpM (PME clase 4), Opc
(PME clase 5), Opa (proteína de opacidad), FetA (FrpB, proteína regulada por hierro) y LPS (Campa
y col, 1989; Martínez, 2002; Holst y col, 2005), cada uno de estos antígenos necesita estudiarse con
profundidad, puesto que, dentro de ellos existen diferentes grados de variabilidad antigénica y se
hace difícil una comprensión adecuada de sus diferentes mecanismos de protección (Frasch y col,
2001).
Está bien demostrado que las vacunas de VME muestran mejores resultados que las obtenidas por
ingeniería genética, al parecer, este comportamiento está vinculado con el mantenimiento de la
estructura conformacional nativa de las PME (Danzig, 2004; Segal y Pollard, 2005; Perret y Pollard,
2005).
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Vacunas recombinantes basadas en seis y nueve subtipos de PorA, presentada en forma de VME y
obtenidas a partir de dos o tres cepas de N. meningitidis serogrupo B, compuesto donde se
eliminaron los genes porB y rmpm, muestran una inmunogenicidad débil y variable a los diferentes
subtipos que conforman las vacunas en los ensayos clínicos realizados después de la aplicación de
tres dosis con refuerzo en el segundo año de vida (Bröker, 2003; Perret y Pollard, 2005).
Otras PME menos variables que PorA y PorB, la lipoproteína de unión a la transferrina B (tbpB) y la
conocida como la proteína A de la superficie de Neisseria (NspA), con función desconocida, han sido
también estudiadas. Estas PME se expresan de forma minoritaria durante el crecimiento del
meningococo serogrupo B pero se han obtenido por ingeniería genética y se han evaluado en
modelos animales y ensayos clínicos en humanos. Los resultados de estos ensayos evidencian que
la tbpB recombinante logra inducir anticuerpos bactericidas en los modelos animales, pero al
evaluarse en humanos, muestra una respuesta débil de anticuerpos (Danzig, 2004; Perret y Pollard.,
2005). La NspA recombinante, por su parte, produjo anticuerpos en animales, aunque éstos fueron
bactericidas contra sólo el 50% de las cepas de meningococo serogrupo B, tan diversos
genéticamente (Danzig, 2004). Estudios clínicos de la proteína recombinante notificados
recientemente, no señalan anticuerpos bactericidas en los vacunados (Halpering y col, 2007).
La variabilidad en las proteínas de superficie de N. meningitidis, resultante de su alta recombinación
espontánea, la velocidad de mutación y la presión inmunológica sobre los epítopes expuestos, hace
pensar que una sola proteína purificada no es capaz de inducir una vacuna con reactividad cruzada
(Segal y Pollard, 2005).
N. lactámica, una especie comensal de la familia Neisseriaceae y perteneciente al género Neisseria,
se asocia con una inmunidad natural contra la EM. Actualmente, existe la hipótesis que sus
antígenos son útiles para el desarrollo de vacunas contra N. meningitidis serogrupo B y con este
criterio se evalúan candidatos vacunales en los animales (Li y col, 2006).
Una nueva vacuna desarrollada a partir de las VME de una cepa del serogrupo B (B:4:P1.7-2,4),
aislada en Nueva Zelanda, se aplica para controlar una epidemia de carácter clonal que existe en
ese país, región donde predomina el fenotipo B:4:P1.7-2,4. La vacuna demuestra inmunogenicidad
en los lactantes, niños y adultos jóvenes (Wong y col, 2007; Oster y col, 2007) y se espera que
ofrezca una protección cruzada limitada, aunque no existen evidencias que apoyen el uso de esta
vacuna en otras regiones (Segal y Pollard, 2005).
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Existe un nuevo enfoque para obtener una vacuna universal contra todos los serogrupos de
N. meningitidis basado en las VME que contengan las estructuras antigénicas de PorA, PorB y FetA,
proteínas observadas con mayor frecuencia en los linajes hipervirulentos causantes de epidemias.
Se describe un trabajo de diseño con una combinación de VME procedentes de cepas con seis PorA
y cinco FetA diferentes, antígenos que podrían generar una respuesta inmune homóloga frente a 78
aislamientos examinados (Urwin y col, 2004), aunque no existen aún reportes experimentales de
este posible candidato. También se trabaja para introducir en FetA, por ingeniería genética epítopes
conservados con actividad bactericida (Kortekaas, 2007).
En estos momentos se explora también la obtención de vacunas basadas en el genoma, sitio donde,
determinando las secuencias genómicas del microorganismo, se identifican las secuencias de
proteínas candidatas como antígenos vacunales, método que se conoce como vacunología inversa
(Poolman y Berthetty, 2001; Pizza y col, 2007).
Aunque, muchas nuevas proteínas se describen desde un enfoque genómico, no está claro todavía
cuáles de las identificadas por esta vía, provocarían una ventaja significativa sobre las proteínas
descritas con la aplicación de los métodos convencionales y obtenidas en la década de los años 80
(Danzig, 2004; Perret y Pollard, 2005).
Luego de analizar la situación actual del desarrollo de vacunas contra N. meningitidis serogrupo B,
se puede concluir que, a corto y mediano plazo no se vislumbra el antígeno universal para el control
de la EM causada por este serogrupo. Después de la obtención de las vacunas de VME, éstas
continúan como la única opción disponible para los controlar brotes y epidemias de EM ocasionadas
por el N. meningitidis serogrupo B. Sin embargo, en los próximos años se espera que una nueva
generación de vacunas de VME mejoradas continúen evaluándose en los estudios clínicos de Fase
II ó III (Perret y Pollard, 2005).
Dentro de estas vacunas, VA-MENGOC-BC® es la única utilizada ampliamente en el control de
varios brotes epidémicos, mostrando una respuesta inmune heteróloga superior a la vacuna de
Noruega (Folkehelsa) (Perkins y col, 1998; Tappero y col, 1999). La adecuación de la vacuna
cubana a las condiciones epidemiológicas y regulatorias internacionales, podría ampliar su uso
global.
La filosofía de diseño explicada anteriormente, no está en contra del criterio de otros autores,
quienes piensan que dado el carácter clonal prolongado de las epidemias, las vacunas que
contengan VME procedentes de una o dos cepas, pueden brindar una amplia cobertura para una
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región y momento determinado, pero como estos clones cambian en el tiempo y las regiones, se
considera oportuno que los procesos de producción sean lo suficientemente robustos para ser
usados por varias cepas epidémicas del serogrupo B, con el objetivo de convencer a las autoridades
regulatorias de licenciar un proceso en general, no para una cepa específica. Este concepto es
análogo al de la vacuna del virus de la influenza, donde la cepa de producción puede cambiarse
todos los años, en dependencia de la situación epidemiológica (Frasch y col, 2001).
Luego de la inmunización masiva con las vacunas conjugadas del serogrupo C en Europa y la
ACYW135, en Estados Unidos con la consiguiente disminución de los portadores, existe la
preocupación de que el meningococo serogrupo B ocupe los nichos ecológicos dejados por los otros
serogrupos (Segal y Pollard, 2004). Se conoce que los meningococos intercambian alelos y pueden
cambiar de serogrupos. Se describe que, posterior a una campaña de vacunación contra el
serogrupo C, donde se administró una vacuna plana de PC en una epidemia de MenC por el clon
ST-11, se constató el efecto “switch” capsular de las cepas, y a partir de esa aplicación comienza
una mayor circulación de cepas pertenecientes al serogrupo B (Segal y Pollard, 2004). Estas dos
observaciones hacen aún más evidente la necesidad de contar con vacunas que puedan combatir
las nuevas epidemias.
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MATERIALES Y MÉTODOS
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2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Metodología analítica
2.1.1 Determinación de la densidad óptica de los cultivos
La DO de los cultivos se midió a una longitud de onda de 530 nm Las muestras se diluyeron hasta
lograr valores menores o iguales a 0,3.
2.1.2 Determinación de la pureza microbiana
2.1.2.1 Determinación por observación microscópica
La pureza de los cultivos se determinó por extensiones de los mismos en láminas portaobjetos
coloreadas por la tinción de Gram, utilizando Safranina al 1% como colorante de contraste.
Posteriormente, las láminas se observaron al microscopio óptico y N. meningitidis se presentó en
forma de diplococos arriñonados gramnegativos. Se observaron como mínimo, 100 campos por
muestra.
2.1.2.2 Determinación por siembra en medios de cultivo
Se realizó por siembra del cultivo por duplicado en el medio Agar Triptona Soya incubándose a
32 ± 2 ºC y 23 ± 2 ºC por un período de 72 horas.
2.1.3 Determinación de las proteínas
La concentración de las proteínas se determinó por el método espectrofotométrico de Lowry (1951)
acorde a los Procedimientos Normalizados de Operación (PNO) 12-004 y 12-223, a una longitud de
onda de 750 nm La curva patrón se realizó a partir de una solución de albúmina de suero bovino
(BSA) 0,2 mg.mL-1.
2.1.4 Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS y ß-mercaptoetanol
El procedimiento se realizó según lo sugerido por Laemmli (1970), y aplicado para la identificación
del CPME de N. meningitidis por Tsai y Frasch (1980) acorde a los PNO 12-114 y 12-225. Se utilizó
un sistema de geles discontinuo con un gel separador al 12,5% y un gel concentrador al 5,0%. Antes
de aplicarse, las muestras se ajustaron a una concentración cercana a 1mg.mL-1 y posteriormente se
trataron con un agente reductor (ß-mercaptoetanol), compuesto que provocó la disociación de las
proteínas en subunidades polipeptídicas. La solución de tratamiento contenía: Tris-HCl 0,1 mol.L-1
(pH = 6,8), ß-mercaptoetanol (1%), SDS (2%), Glicerol (0,1%), Bromofenol Azul (0,1%). La relación
muestra solución de tratamiento fue de 1:1.
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Se emplearon patrones de masas moleculares (14,4 kDa hasta 94 kDa) de la firma Pharmacia o
patrones de referencia interno, éstos recibieron el mismo tratamiento que las muestras.
Las muestras se calentaron a 100 ºC durante cinco minutos y se aplicaron 10 μL de cada una. La
corrida se realizó a 220 V, 35 mA, 60 Watt.
La tinción de las bandas se realizó durante una hora con una solución colorante que contenía: Azul
Coomassie (0,1%), Metanol (40%) y Ácido Acético (10%). Posteriormente, se decoloraron con una
solución de Metanol (40 %) y Ácido Acético (10%).
2.1.5 Determinación del peso seco
Esta determinación se realizó luego de tres lavados sucesivos de la muestra con agua destilada, y la
masa entre los lavados se separó por centrifugación a 10 000 r. p. m. por 20 minutos a 4 ºC. Las
muestras lavadas se resuspendieron a su volumen inicial con agua destilada y se aplicaron a una
balanza de peso seco Sartorius, MA 30, donde se secaron a una temperatura de 130 ºC durante
30 - 40 minutos.
2.1.6 Determinación del LPS
La concentración de LPS se determinó por el método de Osborn (1963) acorde al PNO 12-056,
mediante la cuantificación del KDO, compuesto que representó el 5% de su composición total. Las
muestras se sometieron a una hidrólisis ácida con calentamiento, proceso que generó la liberación
de sus unidades de KDO, los que reaccionaron con Periodato de Sodio y se oxidaron.
Posteriormente, se produjo una reacción entre el KDO y el Ácido Tiobarbitúrico, generándose
cromóforos de color rosado que absorbe a 548 nm. Como estándar se utilizó el
2 Keto-octanato.
2.1.7 Determinación del polisacárido
La concentración del polisacárido se determinó por el método de Svennerholm (1957) de acuerdo al
PNO 12-319, basado en que los PC de los serogrupo B y C son polímeros del ácido N acetil
neuroamínico (ácido siálico) y este compuesto en medio ácido y calor sufre una hidrólisis, donde los
monómeros del mismo y el resorcinol en presencia del Sulfato Cúprico, forman un complejo azul con
máxima absorbancia de 580 nm. Se utilizó como estándar un polisacárido C (PC-C), ajustado
previamente con ácido N acetil neuramínico.
Materiales y Métodos
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2.1.8 Determinación del ácido nucleico
La presencia de los anillos purínicos y pirimidínicos en la estructura de los ácidos nucleicos permite
la absorción en la zona ultravioleta del espectro con un máximo a 260 nm. Se empleó una solución
de referencia de ácido ribobonucleico (WHO Technical Report Series, 1976) de acuerdo al PNO
12-065. En la presencia de proteínas las muestras deben ser previamente desproteinizadas.
2.1.9 Microscopía electrónica de las VME
Se empleó la técnica de tinción negativa con Acetato de Uranilo al 2% en una rejilla de membrana
formvar. Se utilizó un microscopio electrónico de transmisión Yeol-Yem 2000EX. Las
microfotografías se realizaron con una ampliación de 40K.
2.1.10 Identificación de las proteínas por Western-blot
El método se realizó según Estrada (1995) como se refiere en los PNO 12-149 y 12-201, método
que combina la alta resolución del SDS – PAGE para separar las proteínas de acuerdo a sus pesos
moleculares con la especificidad de la detección inmunoquímica de anticuerpos específicos
presentes en los sueros en contacto con ellas. Se detectaron las bandas para cada anticuerpo
específico contra cada una de las proteínas separadas electroforéticamente, con el uso de una
gamma globulina (material de referencia interno) y un sistema revelador compuesto de un conjugado
anti IgG-enzima humana peroxidasa y la Diamino-benzidina como sustrato específico. Cuando se
utilizaron los AcM las bandas se visualizaron a través de la reacción con un sistema anti IgG de
ratón peroxidasa y la Diamino-benzidina como sustrato.
2.1.11 Determinación de la antigenicidad de las VME in vitro por ELISA de inhibición
El ensayo de ELISA por inhibición se diseñó para evaluar si los cambios del proceso afectaban el
reconocimiento del antígeno vacunal proteico, por los anticuerpos específicos de la especie a quien
iba destinada la vacuna. El método se llevó a cabo a partir de una preparación de las VME de
referencia, la que se diluyó con tampón carbonato-bicarbonato 0,05 M pH, = 9.6 para una
concentración final de 20 μg.mL-1. Se adicionó 100 μL de las VME diluidas a cada uno de los
pocillos de una placa de poliestireno (Nunc, Maxisorp) y se incubó toda la noche de 2 – 8 ºC. Las
VME a evaluar se prepararon a una concentración de 100 μg.mL-1, se le realizaron diluciones con
factor 2, desde 1:16 hasta 1:512, en tampón fosfato salino (PBS, sin Tween 20) y la inmunoglobulina
antimeningocócica humana de referencia se diluyó 1:100 en el mismo tampón. Se tomaron 200 μL
de cada dilución de la vacuna y se mezclaron con 200 μL de la inmunoglobulina diluida, y se incubó
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durante toda la noche a una temperatura de 20 - 25 0C, para que los anticuerpos específicos se
unieran a los antígenos presentes en las VME; al día siguiente los 400 μL de cada mezcla del
antígeno-inmunoglobulina se diluyeron con 400 μL de leche descremada (6%) en PBS-Tween 20. La
solución de inmunoglobulina (1:100) se diluyó 1:200 con el mismo diluyente y posteriormente, se le
realizaran diluciones seriadas con factor 2 hasta 1:6 400, con leche descremada (3%) en PBSTween 20. En todos los pasos donde procedió, se realizaron cuatro lavados con agua destiladaTween 20 (0,05%). A la placa de reacción se le adicionó, por duplicado, 100μL de cada dilución de
las VME y de la inmunoglobulina de referencia, luego se incubó a 37 ºC durante una hora. Después
se añadió conjugado anti IgG humana cadena gamma específica-fosfatasa alcalina (Sigma) diluido
1:2 y se incubó de igual manera que las muestras. Posteriormente, se añadió el sustrato p-nitrofenilfosfato (Sigma), 1 mg.mL-1 en solución de dietanolamina (pH = 9,8), el cual se incubó
aproximadamente 30 minutos a la temperatura del laboratorio (20 - 25 ºC), de modo que el punto
máximo de la curva de la inmunoglobulina de referencia alcanzara un valor de absorbancia de 1,3 a
1,6 cuando la placa se leyera a 405 nm. Posteriormente, se calculó el porcentaje de la actividad antiproteínas B para cada dilución de la vacuna con relación a la inmunoglobulina de referencia, a la
cual se le adjudicó el 100% de la actividad. El porcentaje de inhibición de cada dilución de la vacuna
se calculó mediante la resta a 100, valor del porcentaje de la actividad de los anticuerpos
correspondientes. El ensayo se consideró satisfactorio cuando las curvas de inhibición de las
formulaciones paralelas (producidas a partir de lotes de las VME obtenidos por la tecnología
tradicional y después del cambio a evaluar), presentaron el mismo comportamiento y el 50% de
inhibición estuvo incluido entre las mismas.
2.1.12 Determinación de la actividad de los anticuerpos IgG antiserogrupo B por ELISA
Se empleó el método de Peppler y Frasch (1982), según los PNO 12-045 y 12-219, con la utilización
de IgG purificadas de ratón antimeningococo B, utilizadas como material de referencia en el rango
de 0,39 a 25 UIgG.
Se aplicó la dosis a evaluar del preparado vacunal a 10 ratones BALB/c hembras con un peso entre
17 y 22 g y se realizó la medición de la respuesta inmunogénica 21 días después, se utilizaron como
controles del ensayo una cantidad igual de animales. Los resultados se expresaron como UIgG.mL-1
o a través del porcentaje de animales respondedores.
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Para la determinación de los anticuerpos se distribuyeron, en todos los pocillos de una placa de
microtitulación, 100 μL de una solución de sensibilización (VME purificadas del meningococo B,
diluidas con solución reguladora de carbonato-bicarbonato 0.005 mol.L-1) y la placa se mantuvo toda
la noche en cámara húmeda (2 – 8 ºC). Luego se atemperó 30 minutos y se realizaron cuatro
lavados durante 10 segundos, cada vez, con 300 μL por pocillo de Tween 20 (0,05%), tal como se
describió anteriormente.
Se añadió, por duplicado, 100 μL de las muestras diluidas previamente con la solución reguladora
de fosfatos y leche descremada (3%) y se incubó a 37 ± 1 ºC, durante una hora en cámara húmeda.
Se realizaron cuatro lavados con Tween 20 (0,05%) como se describió anteriormente. Se añadieron
100 μL del conjugado anti IgG de ratón, cadena gamma específica (Sigma), con fosfata alcalina,
diluido previamente con solución reguladora de fosfatos y leche descremada al 3% y se incubó
nuevamente a 37 ± 1 ºC durante una hora. La placa se lavó como ya se describió. Se añadieron 100
μL del sustrato (p-nintrofenilfosfato 1 mg.mL-1) y se incubó en la oscuridad en cámara húmeda a
temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción enzimática se detuvo con 50 μL de la
solución de NaOH 2N y se leyó a 405 nm en un lector de placas (Multiskan, Labysisten).
2.1.13 Determinación de la actividad bactericida del suero
El ensayo se realizó por el método de Frasch y Robbins (1978) según los PNO 12-044 y 12-226, con
ligeras modificaciones descritas por Sotolongo (1991).
Se aplicaron esquemas de inmunización de una y dos dosis de proteínas del preparado vacunal a 10
ratones BALB/c, con un peso entre 18 y 20 g. En el caso del esquema con una dosis la medición de
la respuesta inmunogénica se realizó 21 días después, momento en que se aplicó la segunda dosis
cuando se empleó un esquema de dos dosis. En este caso la respuesta de anticuerpo fue medida 14
días posteriores a la última inmunización.
En una placa de microtitulación, se añadieron 25 μL de solución de Hanks desde la columna 2 hasta
la 12. Posteriormente, se adicionaron 50 μL del suero problema en el primer pocillo de cada fila (un
suero diferente para cada fila, desde la A1 hasta la F1). Luego se añadió 50 μL del suero control
positivo en G-1 y se realizaron diluciones seriadas dobles en cada fila. Se transfirieron 25 μL de los
pocillos de la columna 1 a la 2 y así consecutivamente hasta la columna 7.
Se eliminaron 25 μL de los pocillos de la columna 7 y la columna 8 quedó como control de los
organismos viables de la suspensión bacteriana ajustada a una concentración de
Materiales y Métodos
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50 ± 10 UFC.25 μL-1. La suspensión bacteriana fue obtenida a partir de lotes de siembra
crioconservados de la cepa de N. meningitidis serogrupo B a emplear en el ensayo, la que fue
sembrada en placa de medio Agar Infusión Cerebro Corazón (BHIA) e incubada a 36,5 ± 0,5 ºC en
una atmósfera 5-10% de CO2 por un período de 12 a 16 horas, a partir del cual se realizó una
resiembra en placas de BHIA, las que se incubaron como se describió anteriormente por un período
de
cuatro
horas.
El
crecimiento
fue
recogido
en
solución
Hanks
y
se
ajustó
espectrofotométricamente a una concentración de 4 x 107 UFC.mL-1 en comparación con un patrón
de opacidad.
Se adicionaron 25 μL de la suspensión bacteriana a todos los pocillos (para corroborar la viabilidad
de la cepa al inicio, 25 μL de la suspensión fue sembrada en una placa Petri con BHIA). Se
agregaron 25 μL de la fuente de complemento (suero de conejo recién nacido de la firma Perfreez),
desde la columna 1 hasta la 11 y 25 μL, en todos los pocillos de la fila H, que constituyó el control
negativo. Las placas se incubaron (37 ± 1) ºC con atmósfera de 5-10% de CO2 durante 18 a 24
horas. Después de la incubación y mediante el uso de un microscopio estereoscopio, se realizó el
conteo de las UFC en todos los pocillos de la placa.
El título de la ABS se definió como la dilución del suero que correspondió con el 50 % de las células
muertas calculadas por regresión.
2.1.14 Determinación del contenido de endotoxina por LAL
La determinación del LAL se realizó mediante un ensayo cromogénico cinético, para el cual se utilizó
el Kit “Kinetic-QLC 1000” (Biowhittaker) que emplea el patrón de endotoxina de E. coli 055:B5 en el
rango de 0,005 a 50 unidades endotóxicas (UE).mL-1, éste y la solución reactiva se prepararon
según lo sugerido por el fabricante. Se efectuó el ensayo de inhibición/potenciación, descrito por la
USP 30; seleccionándose como dilución de trabajo, la correspondiente a 1/20 000, después de ser
ajustada la muestra 100 μg.mL-1, ya que con estas concentraciones se recuperaba el patrón añadido
(5 UE.mL-1) en un porcentaje aceptable (50 -150%) según los PNO 12-175 y 12-220.
Para la realización del ensayo, se distribuyeron en placas de microtitulación, 100 μL por duplicado
de cada muestra (blanco de agua del Kit, patrones de endotoxina, controles y muestras a analizar).
La placa se colocó en la cámara de incubación del lector cinético a 37 °C durante 10 minutos
Posteriormente, la placa se retiró del incubador/lector y se le añadió con una pipeta multicanal,
100 μL de la solución reactiva compuesta por el lisado de amebocitos del Limulus y el sustrato
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cromogénico. La placa se colocó de nuevo en el lector durante una hora para la lectura de la
respuesta. El ensayo y el procesamiento de los datos se realizaron de forma automatizada, versión
1.2. El resultado fue expresado como UE.mL-1, UE.dosis-1 ó UE.50μg de proteína-1.
2.1.15 Electroforesis bidimensional
2.1.15.1 Geles analíticos de rango pI 3 – 10
A 15 μL (30 μg) de cada lote previamente deslipidado, como se refiere en 2.1.10, se le adicionó una
solución de rehidratación (7,5 M Urea, 1,5 M Tiourea, 2% CHAPS, 0,5% ASB-14, 20 mM Tris, 1%
DTT, 1% anfolinas portadoras pI 3,5 -10 para un volumen final de 200 μL). A continuación se
procedió a la rehidratación del gel de estas muestras en tiras de gradiente inmovilizado de pH (IPG)
(Biosciences, Amersham,) de 11 cm. durante toda la noche. La primera dimensión (focalización
isoeléctrica) se realizó en un Multiphor II (Amersham). El voltaje se programó como sigue: 220 V (15
minutos), 1 750 V (50 minutos), 2 600 V (38 minutos), 3 500 V (45 minutos), continuando con
3 500 V hasta alcanzar 13,5 kVh. La reducción y alquilación de las muestras se realizó entre la
primera y la segunda dimensión, por incubación de las tiras en solución de equilibrio (6 M Urea, 30%
Glicerol, 2% SDS, 50 mM Tris pH = 8,8) con DTT al 2% y a continuación se incubaron las tiras en
solución de equilibrio con iodoacetamida al 2,5%. Los tiempos de incubación en ambos pasos fue de
15 minutos. La segunda dimensión (electroforesis en gel de poliacrilamida al 16%, SDS-PAGE) se
efectuó en una cámara Protean II (BioRad) en geles de 16 x 20 cm. El revelado de los geles se
realizó con plata – glutaraldeído (Heukesshoven y Dernick, 1985).
2.1.15.2 Geles analíticos de rango pI 4 – 7
Los geles analíticos de pI 4 - 7 se procesaron con la misma metodología de los geles anteriores,
pero con una carga de 50 μg de proteína en las tiras de pI 4 - 7 y con un aumento en el parámetro
de focalización isoeléctrica hasta alcanzar 15.5 kVh.
2.1.15.3 Geles preparativos de rangos de pI 4-7 y 6-11
La focalización isoeléctrica se llevó a cabo en tiras de gradiente inmovilizados de proteínas (IPG)
(Amersham) de 18 cm (pI 4 - 7 y pI 6 - 11), previamente rehidratados durante toda la noche en
solución que contenía: Urea (7,5 M), Tiourea (1,5 M) CHAPS (2%), ASB-14,20 mM Tris (0,5%), DTT
(1%), anfolinas 3,5-10 (1%). Una carga de 500 μg de proteínas de VME se solubilizaron en 150 μL
de solución de lisis (7 M Urea, 2 M Tiourea, 4% CHAPS, 1% DTT, 1% anfolinas portadoras
Pharmacia pH 3.5-10) y se aplicaron en las tiras de papel (Sabounchi-Schϋtt y col, 2000). En ambos
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casos la focalización se llevó a cabo hasta alcanzar 40 kVh, en un Multiphor II (Pharmacia). La
electroforesis en gel de poliacrilamida (16.6% SDS-PAGE, 20 x 20 cm) se efectuó en una cámara
Protean II (BioRad) y los geles se revelaron con una tinción de plata sin glutaraldehído
(Jensen y col, 1999). Luego del análisis de las imágenes, se procedió a recortar las bandas de
interés de estos geles, conservándose en tubos a -34 0C hasta ser digeridos
2.1.15.4 Análisis de las imágenes
Las imágenes en los geles teñidos se registraron con el uso del equipo ScanJet 6300C (Hewlet
Packard), la tinción de los mismos se realizó al mismo tiempo y con un sólo lote de solución
colorante.
Las imágenes en los geles bidimensionales se procesaron y analizaron con el software Melanie III
(GeneBio). Las manchas se detectaron automáticamente, sin previo enriquecimiento de contraste y
con una edición manual, cuando fue necesario.
2.1.15.5 Digestión proteolítica y extracción de los péptidos
La plata se removió de las manchas con el reactivo de Farmer (Gharahdaghi y col, 1999) y luego se
le adicionó Bicarbonato de Amonio (BCA) 250 mM hasta decolorar las manchas. Las manchas se
cortaron en cubos de 1 mm3 y se desecaron con Acetonitrilo (ACN) 90%, rehidratándose a
continuación con un volumen mínimo de BCA 50 mM que contenía la enzima Tripsina (Promega) a
una concentración de 12,5 ng.μL-1. La digestión se realizó a 37 ºC por 18 horas.
Los péptidos proteolíticos generados durante la digestión con Tripsina de las bandas de proteína se
extrajeron de la solución con el uso de microcolumnas de fase reversa, “ZipTips” C18 (Millipore). Los
péptidos adsorbidos al “Zip-Tips” se lavaron con abundante Ácido Fórmico (5% v/v), posteriormente
se extrajeron de la columna con la aplicación sucesiva de 1,5 μL de una solución de ACN al 60% y
1% de Ácido Fórmico, seguido de igual cantidad de una solución con Isopropanol (50%) y Ácido
Fórmico (5%). Finalmente, ambas soluciones se mezclaron y se aplicaron en un nanodescargador
de borosilicato recubierto de oro para aplicar en el espectrofotómetro de masas.
2.1.15.6 Análisis de proteínas por espectrometría de masas
Los espectros de baja energía ESI-MS y MS/MS se realizaron en un espectrómetro de masas
híbrido con cuadrupolo y tiempo de vuelo (QTof-2TM) (Micromass), equipado con una fuente de
nanoESI. Los espectros de masas se obtuvieron en un rango de m/z desde 400 hasta 2 000 en 0,98
segundos y la utilización de 0,02 segundos entre cada uno de los barridos. El espectrómetro se
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calibró con una solución salina compuesta por una mezcla de Yoduro de Sodio y Cesio. Los voltajes
empleados en el cono y el capilar fueron de 900 y 35, respectivamente.
Para adquirir los espectros MS/MS el primer cuadrupolo se usó para seleccionar a los iones
precursores en una ventana de aproximadamente 2 Th. La presión de gas Argón en la celda de
colisiones fue de ≈5 x 10-2 Pa. y se seleccionó una apropiada energía de colisión (20 - 50 eV), hasta
lograr un espectro de masas con suficiente información estructural que permitiese una secuenciación
confiable de los péptidos.
2.1.15.7 Identificación de las proteínas
La identificación de proteínas basada en los espectros ESI-MS se realizó mediante el método
denominado huella de masas de los péptidos, conocido en ingles por las siglas PMF. Se emplearon
los programas ProFound (Zhang y Chait, 2000) y MASCOT (Perkins y col, 1999) disponibles en
Internet. La búsqueda se limitó a las secuencias de genes y proteínas de bacterias, contenidas en
las bases de datos SwissProt y NCBI y se consideró a la oxidación de metioninas, la desamidación y
la carboxiamidometilación de cisteínas como posibles modificaciones presentes.
La identificación de las proteínas basada en los espectros MS/MS se realizó a través de
interpretación manual o usando la versión del programa MASCOT disponible en internet (Matrix
Science Ltd, UK) (Perkins y col, 1999). Entre los parámetros de búsqueda se incluyó la modificación
de cisteínas, así como las posibles oxidaciones y desamidaciones. También se empleó el programa
Pepsea (Protana, Dinamarca), disponible en Internet, que utiliza como base de datos el Swissprot.
2.1.16 Determinación de pirógenos en conejos
Esta prueba se realizó según las recomendaciones de la Farmacopea Europea (Eur. Ph, 2004)
acorde los PNO 12-198 y 12-239.
Las muestras fueron preparadas como sigue: los IFA obtenidos, según la variante alcohólica se
resuspendieron en solución 0,7 mmol.L-1 de fosfatos y Cloruro de Sodio 0,9% (pH = 7,2) a una
concentración de 100 μg.mL-1. Las VME en sacarosa, se diluyeron a 100 μg.mL-1 con sacarosa
(3%), fosfatos 0,7mmol.L-1, (pH = 7,9).
Ambas variantes se diluyeron a 100 y 1000 μg.mL-1 con solución salina fisiológica apirogénica. Los
preparados vacunales se diluyeron a 500 μg.mL-1.
Se utilizaron tres conejos entre 1,5 y 2,5 kg a los que se les aplicó 1 mL de la muestra por kg de
peso corporal por vía intravenosa. A los animales se les determinó la temperatura continuamente
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durante tres horas con la utilización del equipo Probox 45 (Letica). Los resultados fueron evaluados
a partir de la sumatoria encontrada en cada conejo, de la diferencia entre el valor de temperatura
mas alto observado en la prueba en relación al valor de temperatura inicial. Se consideró que la
prueba fue pasada satisfactoriamente, cuando la suma de las diferencias fue menor que 1,15. En
los casos en que esto no ocurrió se siguieron los criterios de la Eur. Ph, 2004 para decidir la
realización de repruebas o declarar que el lote no pasó la prueba a la concentración de proteínas
evaluada.
2.1.17 Determinación del polisacárido capsular serogrupo B
En las VME que contenían sacarosa las trazas de PC-B se determinaron por HPLC (Anamula, 1994)
según PNO 12-243. El método está basado en que el PC-B contiene unidades repetitivas de ácido
siálico (ácido N. acetil neuroamínico) el cual es derivatizado con o-fenildiamina para formar un
complejo quinoxalina fluorescente estable, el cual es separado del exceso de reactivo mediante una
columna de fase reversa C18.
Los derivados fluorescentes fueron detectados a longitudes de ondas de excitación de 230 nm y de
emisión e 425 nm.
La cuantificación se realizó a partir de una curva de calibración preparada con ácido colomínico
como material de referencia. El método detecta 0,1 pmol de polisacárido.
2.1.18 Determinación de ADN
Para determinar ADN en las VME purificadas que contienen sacarosa se utilizó el método conocido
como Theshold (Kuang y col, 1990) el que facilita una medición rápida, sensible y específica de DNA
total en niveles de picogramos (pg) mediante un ensayo de inmunoligando. El ensayo se basa en la
formación de un complejo que involucra el analito, en el cual participa una proteína de alta afinidad
conjugada con biotina y la estreptavidina y un monoclonal anti-DNA conjugado con ureasa. El
complejo es filtrado por una membrana de nitrocelulosa recubierta con biotina y estrectavidina,
membrana que retiene el complejo. Mediante un lavado rápido se eliminan todas las enzimas no
específicas. La membrana se coloca en el lector que contiene un sustrato de urea. La reacción
enzimática de esta con la ureasa, provoca la hidrólisis de la urea y un cambio de pH, cambio
detectado por un censor de silicona. La velocidad del cambio de pH en la superficie fue proporcional
a la cantidad de DNA. El rango de detección fue de 2 - 200 pg. Las determinaciones se realizaron en
el equipo Treshold System (Molecular Devices Corporation).
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2.1.19 Determinación de la sacarosa
La concentración de la sacarosa se determinó por el método del fenol-sulfúrico (Dubois y col, 1956)
según PNO 12-214, basado en la deshidratación que produce el ácido sulfúrico con el anillo de las
hexosas, donde se originan derivados del fulfural que al reaccionar con el fenol, desarrollan un
complejo coloreado que absorbe a 490 nm.
2.1.20 Determinación de DOC
La determinación de DOC se realizó por un método combinado de cromatografía gaseosa (CG) y
MS desarrollado por la firma GSK para medir este residuo en vacunas.
El principio del método se basó en que primeramente el DOC es convertido en Ácido Deoxicólico y
entonces es extraído con un solvente orgánico. Posteriormente las muestras son secadas y
derivatizadas. EL método empleó el Ácido Cólico como referencia interna. La CG permite la
separación del Ácido Deoxícolico y el Ácido Cólico. Finalmente ambos son detectados por MS en
cuanto a sus tiempos de retención relativos y sus valores específicos de m/z. Se obtiene una curva
de calibración mediante el ploteo del área bajo la curva en el espectro del DOC contra diferentes
concentraciones del mismo, usadas como estándar. El contenido de DOC se calcula a través de la
recta de regresión.
Para la determinación se usó el sistema de CG-MS modelo HP6890 de la firma Hewlett Packard
acoplado a un detector selectivo de masa modelo 5973.
La preparación de la muestra se realizó como sigue: 400 μL de la muestra se introdujeron en un
tubo Eppendorf y se añadieron 100 μL de la solución estándar interna de Ácido Cólico de
200 μg.mL-1. Luego se adicionaron 10 μL de Ácido Sulfúrico concentrado y 500 μL de Acetato de
Etilo y se agita. La solución anterior se centrifugó a 14 000 r.p.m durante 10 minutos y el
sobrenadante se transfirió a otro tubo Eppendorf que contenía aproximadamente 100 mg de Sulfato
de Sodio anhidro. Luego de homogeneizar se centrifugó como se refirió anteriormente. El
sobrenadante de esta etapa se secó en un evaporador rotatorio durante 30 minutos.
Finalmente se adicionaron 75 μL de N,O bis-Trimetil silifluoroacetamida a la muestra seca, se agitó y
se colocó en un termomezclador a 80 ºC durante una hora. La solución preparada se enfrió para
realizar el análisis cromatográfico.
De igual forma se prepararon los nueve puntos del estándar de DOC para la curva de calibración
con concentraciones entre 5 y 200 μg.ml-1.
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Las muestras y los estándares son inyectados por duplicado en el sistema de CG-MS con la
aplicación del modo Scan. A través de la identificación de los picos cromatográficos se registraron
los espectros correspondientes a los compuestos analizados de acuerdo a los valores específicos de
m/z para el DOC (428 y 345) y para la sal sódica del Ácido Cólico (516 y 426).
La cantidad de DOC se determinó a través de la recta de regresión ya referida.
2.1.21 Determinación de la osmolalidad
Las determinaciones de la osmolalidad se realizaron de acuerdo con la Farmacopea Británica
(British Pharmacopoeia, 2002) según PNO 12-194 en un Auto Osmometor Osmostat® modelo OM6020 (Kyoto Daichi, Kagaku Ltd).
La osmolalidad es una manera práctica de medir la contribución de varios solutos presentes en una
solución a la presión osmótica que esta genera. El método para determinar la osmolalidad se basa
en medir la depresión al punto de congelación de la solución con relación al agua destilada y la
calibración del equipo se realiza con soluciones de referencia de osmolalidad conocida.
2.2 Metodologías generales empleadas en los procesos de obtención de VME
2.2.1 Cepas
Se utilizó la cepa de N. meningitidis serogrupo B CU 385/83 (B:4:P1.19,15) aislada en Cuba durante
la epidemia de los años 80, seleccionada como la cepa vacunal desde 1985. A partir de ese
aislamiento se obtuvo el lote de siembra de referencia, y a partir de éste se elaboraron los lotes de
siembra de trabajo, confeccionados con alícuotas de cultivo líquido en Skim Milk al 10%,
conservándose posteriormente en viales a -70 ± 5 ºC. La estabilidad de los lotes de siembra se
chequeó periódicamente, según el programa establecido.
Se utilizaron cinco cepas de N. meningitidis clasificadas como (B:4:P1.7-2,4), aisladas en la
epidemia de Nueva Zelanda de los años 90 y cuyos aislamientos se identificaron como: NZ 98/018,
NZ 98/124, NZ 98/153, NZ 98/223 y NZ 98/228; con estas cepas se prepararon los lotes de siembra,
de referencia y de trabajo, siguiendo la misma metodología empleada para la cepa CU 385/83.
2.2.2 Medios de cultivo
Medio sólido: La multiplicación en medio sólido se realizó en AMH, suplementado con un 10% de
suero bovino sin calostro.
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Medio líquido: Para los cultivos en medio líquido se empleó el medio Frantz suplementado con
Extracto de Levadura dializado (MFM), recomendado por la OMS (Serie de Informes Técnicos, 1976)
(anexo 2).
Todos los componentes de los medios de cultivo utilizados están reconocidos, como mínimo, por
una Farmacopea. Los mismos se evaluaron previamente a través de las pruebas tecnológicas con el
objetivo de asegurar su potencialidad para el crecimiento y la expresión del CPME.
2.2.3 Obtención del inóculo
A partir de un tubo correspondiente al lote de siembra de trabajo de la cepa de N. meningitidis a
evaluar, se realizaron cultivos en AMH, a la temperatura de 36,5 ± 0,5 ºC, en atmósfera con 5,5% de
CO2, por un período de 18 horas; con la biomasa obtenida se inocularon erlenmeyers que contenían
MFM. Los cultivos se agitaron a 160 r. p. m. en una zaranda orbital a la temperatura de 36,5 ± 5 ºC
entre cuatro y cinco horas. La pureza de los cultivos se determinó según lo descrito en 2.1.2.1.
2.2.4 Cultivo de semilla
Se utilizó un fermentador Chemap de 75 L (modelo CH-8604), con 46 L de MFM en el que se
sembró un volumen de inóculo obtenido según la metodología descrita en 2.2.3. Este inóculo
garantizó una DO inicial entre 0,2 y 0,25. Las condiciones de cultivo empleadas fueron:
pH (inicial) =7, ±0,2; temperatura =36,5±0,5ºC, pO2=25% de oxígeno disuelto, agitación=244 r. p. m.
Durante la fermentación, los parámetros de los procesos se monitorearon a través del panel de
control del equipo.
Cuando el cultivo alcanzó una DO entre 1 y 1,5 en la fase exponencial, se verificó su pureza, según
se detalló en 2.1.2.1 y se procedió posteriormente a inocular los fermentadores de 300 L.
2.2.5 Cultivo a escala industrial
Se utilizaron dos fermentadores Chemap de 300 L (modelo 9 – 712) con 230 L de MFM. Cada
fermentador se inoculó con aproximadamente 23 L, procedentes de la fermentación de la semilla. La
DO inicial se ajustó entre 0,2 y 0,25 y las condiciones de cultivo fueron: pH (inicial) = 7,4 ± 0,2;
temperatura = 36,5 ± 0,5 ºC, pO2 = 25% de oxígeno disuelto y una agitación = 187 r. p. m.
Los parámetros del proceso se monitorearon a través del panel de control del equipo durante la
fermentación. Al final de la fermentación se determinó la DO según se refiere en 2.1.1 y la pureza
microbiana se constató por observación microscópica y siembra en medio de cultivo, igual que como
se describe en 2.1.2.1 y 2.1.2.2
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2.2.6 Separación celular por centrifugación
Al final de la fermentación industrial, el cultivo se concentró en una centrífuga Westfalia - Separator
con un flujo de 350 L.h-1. Posteriormente, la biomasa se separó por centrifugación a 17 000 x g
durante dos horas en centrífugas Beckman (modelo J221). La biomasa compactada se resuspendió
en el tampón de proceso Tris-HCl 0,37%, EDTA 0,074%, pH = 8,5 (Tris-EDTA) a 4 ºC con ayuda de
perlas de vidrio y se trasladó a un reactor de 35 L para realizar el proceso de extracción de las VME.
2.2.7 Separación celular por microfiltración tangencial.
Se utilizó el sistema de MFT Sartocom 3 de la firma Sartorius con 10 membranas planas Hidrosart
de 0,2 μm para un área de filtración total de 6 m2, para realizar la etapa de la concentración y lavado
celular, a partir de cultivos de 460 L obtenidos según se expresó en 2.2.5. Los cultivos empleados
tuvieron una DO entre 3,1 y 3,4, equivalente a un peso seco de alrededor de 1,2 g.L-1.
El proceso de MFT se definió como se señala a continuación:
¾ Concentración celular inicial: 15,3 veces.
¾ Diafiltración celular: Tres lavados de forma continúa a volumen constante con el tampón de
proceso (Tris-EDTA).
¾ Concentración celular final: 25-35 veces del volumen inicial.
Las presiones de trabajo utilizadas fueron:
o
Alimentación = 1 Bar
o
Retorno = 0 Bar
o
Filtrado = 0 Bar
2.2.8 Extracción de las VME con DOC
En el reactor de 35 L la biomasa resuspendida en el tampón (Tris- EDTA) se le añadió DOC al 10%
para garantizar en el momento de la extracción una concentración final de 0,5%, para una relación
de 5 mL de tampón por gramo de masa húmeda. Las VME se extrajeron con agitación mecánica
baja durante dos horas a 4 ºC. Los restos celulares se separaron por centrifugación a 17 000 x g
durante dos horas a 4 ºC.
EL sobrenadante de esta etapa constituyó el material de partida para el proceso de purificación.
2.2.9 Purificación de las VME hasta la fracción cromatográfica
El sobrenadante obtenido de la etapa de extracción y que contenía las VME, se sometió a un
tratamiento enzimático con nucleasas a 37 ºC, durante dos horas. Posteriormente, se concentró en
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un sistema de filtración tangencial de fibra hueca (modelo 5469), empleando cartuchos filtrantes de
100 kDA. Se realizaron tres lavados a un volumen constante con el tampón de proceso Tris-HCl 0,37
%, EDTA 0,074%, DOC 0,5%, pH = 8,5 (Tris-EDTA-DOC).
Luego se ultracentrifugó a 186 000 x g durante ocho horas a 4 0C, utilizando una ultracentrífuga
Beckman (modelo L755). Las VME ya sedimentadas se resuspendieron con una solución tampón
que contenía Dietanolamina (DEA) 0,52%; DOC 5%; pH = 9,0, mediante agitación orbital a
160 r. p. m., durante 16 a 24 horas a 4 ºC.
Después de solubilizar las VME, la concentración de las proteínas se ajustó entre 10 - 12 mg.mL-1.
Posteriormente, la solución con la concentración ajustada se sometió a un paso cromatográfico de
filtración en gel, para lo cual se utilizó una matriz de Sephacryl S-300 HR (Pharmacia) y un sistema
de corrida de escala preparativa con columnas BPG 200 (Pharmacia). Se aplicó un volumen de 4%
con relación al volumen total de la columna. El tampón de proceso Tris-EDTA-DOC se utilizó como
solución de elución con un flujo de trabajo de 30 cm.h-1. La corrida cromatográfíca se monitoreó de
forma continua mediante espectrofotometría a 280 nm y se colectó la primera fracción
cromatográfica (FC), donde se encuentran las VME purificadas en el tampón de proceso.
2.2.10 Obtención del IFA por precipitación alcohólica
Para eliminar el tampón de proceso, las FC se filtraron por una membrana de 0,2 μm y se
precipitaron las VME con alcohol al 80% por un período de 16 a 24 horas a -20 ºC.
Posteriormente el precipitado se lavó tres veces de manera sucesiva con alcohol al 80%, con
centrifugaciones intermedias. Las VME precipitadas como torta alcohólica se conservaron a -70 ºC.
2.2.11 Obtención del IFA por diafiltración con sacarosa
Para eliminar el tampón de proceso las VME fueron diafiltradas con sacarosa al 3%, el proceso se
realizó en un sistema de ultrafiltración tangencial (UFT) de fibra hueca de la firma Amicom (Modelo
54169) con cartuchos filtrantes de 100 kDA como sigue: a partir de la FC se realizaron 10 lavados a
volumen constante con sacarosa al 3% en tampón fosfato, pH = 7,8 ± 0,2. La presión de
alimentación fue de 1 Bar y la de retorno de filtrado 0 Bar. Las VME en sacarosa a una
concentración entre 1 y 2 mg.mL-1 de proteína se filtraron por una membrana de 0,2 μm y luego se
conservaron entre 2 - 8 ºC.
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2.3 Evaluación de la MFT en la separación celular de la cepa CU 385/83
2.3.1 Comportamiento hidrodinámico del proceso y recobrados celulares
Se procesaron 12 cultivos de cinco horas de fermentación como se refiere en 2.2.5, los que se
encontraban en el final de la fase logarítmica de crecimiento con una DO entre 3,1 y 3,4, equivalente
a un peso seco de alrededor de 1,2 g.L-1 con una pureza satisfactoria de acuerdo a 2.1.2.1. El
proceso de MFT se realizó como se señala en 2.2.7.
El comportamiento hidrodinámico del sistema se evaluó a través de la medición del flujo de filtrado
en la zona de permeado a diferentes tiempos de filtración, con el uso de un cilindro graduado. Los
flujos obtenidos se normalizaron teniendo en cuenta el área total de filtrado. Con estos datos se
obtuvieron las curvas de filtrado.
EL proceso de MFT se realizó a través de un reactor de 35 L donde la biomasa se concentró, lavó y
resuspendió en el tampón de proceso Tris – EDTA y posteriormente, las VME se extrajeron de la
misma forma que aparee descrito en 2.2.8.
Los resultados de la MFT (tecnología en evaluación) se compararon con igual número de proceso
donde los cultivos presentaron las mismas características referidas anteriormente, pero la biomasa
se obtuvo por centrifugación, según 2.2.6 (tecnología tradicional) y las VME se extrajeron como se
refiere en 2.2.8. El anexo 3 muestra las etapas del proceso donde se comparan las dos variantes
tecnológicas.
Las evaluaciones de la eficiencia del proceso en cuanto al recobrado de la biomasa se realizó a
partir de la determinación de peso seco, según se describe en 2.1.5.
Para evaluar el impacto del método de separación celular en la etapa de extracción, las VME
presentes en el extracto obtenida por las dos variantes, se separaron por ultracentrifugación a
186 000 x g durante ocho horas a 4 ºC. Las VME sedimentadas se resuspendieron en el tampón de
proceso Tris – EDTA – DOC y se determinó el contenido de proteínas como se refirió en 2.1.3.
2.3.2 Evaluación del impacto de la MFT en las etapas de extracción y purificación de VME
A partir de seis procesos de obtención de VME donde la separación celular se realizó por MFT
(tecnología en evaluación), según se refirió en 2.2.7, se evaluó el impacto del cambio en las etapas
de extracción y purificación (concentración, ultracentrifugación y cromatografía) descritas en 2.2.8 y
2.2.9, respectivamente, a través de la cuantificación e identificación de las proteínas presentes con
el empleo de los ensayos referidos en 2.1.3 y 2.1.4. Se determinó, además, el contenido de LPS y
PC-B como se refirió en 2.1.6 y 2.1.7, respectivamente.
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Versión: 3
Los resultados obtenidos se compararon con las mismas etapas del proceso y la misma metodología
analítica obtenidos en igual número de procesos realizado por la tecnología tradicional, donde la
separación celular se realizó por centrifugación.
Los resultados del control de calidad de seis FC de VME obtenida por la tecnología en evaluación se
compararon con los de igual número de procesos procedentes de la tecnología tradicional en cuanto
al cumplimiento de las especificaciones de calidad de éstos, referidas en el anexo 4. Además, en la
comparación de las FC se verificó la presencia de estructuras vesiculares por microscopia
electrónica, según se refiere en 2.1.9.
2.3.3 Evaluación del impacto de la MFT en las VME purificadas como IFA
Para medir el impacto en las características definitorias de las VME debido a la introducción de la
MFT en la etapa de separación celular seis lotes de IFA en torta alcohólica procedentes de la
tecnología en evaluación, se compararon con la misma cantidad de lotes obtenidos por la tecnología
tradicional en cuanto al cumplimiento de las especificaciones de calidad referidas en el anexo 5.
Se
realizaron
adicionalmente
otras
comparaciones
complementarias
de
antigenicidad,
inmunogenicidad y actividad endotóxica. Para evaluar la antigenicidad se utilizó una gamma
globulina de referencia obtenida a partir de los sujetos vacunados con lotes de VA-MENGOC-BC®
obtenidos a partir de las VME tradicionales, empleándose los siguientes métodos: Western – blot
(WB) según se refiere en 2.1.10 y la antigenicidad in vitro, por un ensayo inmunoenzimático (ELISA)
acorde a 2.1.11. La inmunogenicidad y la endotoxicidad se midieron en preparados vacunales donde
las VME fueron solubilizadas en PC-C y adsorbidas en gel de HA, según la composición de
VA-MENGOC-BC® referida en 1.7. Para medir la respuesta inmune en ratones se utilizó el método
de ELISA y la funcionabilidad de los anticuerpos se determinó por la ABS, para lo cual se aplicó una
dosis de 50 μg de proteína y se procedió como se describe en 2.1.12 y 2.1.13, respectivamente. La
actividad endotóxica se evaluó por el método de LAL, acorde a lo descrito en 2.1.14.
2.4 Análisis de las proteínas presentes en las VME mediante electroforesis bidimensional y
una plataforma de proteómica
En el Departamento de Proteómica del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB), se
evaluaron tres lotes de IFA obtenidos a escala industrial a partir de la cepa CU 385/83 luego de la
introducción de la MFT al proceso de obtención de VME, lotes que se identificaron como A, B y C.
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Inicialmente, las muestras de IFA en solución acuosa fueron delipidadas con éter etílico de la
siguiente forma: a 100 μL de la muestra se le adicionaron 400 μL de éter etílico y se agitó durante 10
minutos. A continuación se centrifugó a 11 000 r. p. m. por cinco minutos y se aspiró la fase superior
(orgánica), fase que fue descartada, repitiéndose el procedimiento descrito dos veces más con la
fase acuosa. Esta última se secó por evaporación centrífuga y el sedimento se resuspendió en una
solución de lisis (7,5 M Urea, 2 M Tiourea, 4 % CHAPS) para obtener una concentración de proteína
de 2 μg.μL-1.
Para estudiar la composición proteica de las VME y comparar la reproducibilidad del patrón de
proteínas entre los lotes, se utilizaron geles analíticos de puntos isoeléctricos (pI) entre los rangos
de pI 3 – 10 y pI 4 – 7. Parar identificar las proteínas presentes se utilizaron geles preparativos entre
los rangos de pI 4 – 7 y pI 6 - 11.
Las metodologías empleadas para realizar las 2DE analíticas y preparativas, el análisis de imágenes
y la identificación de las proteínas por espectrometría de masas se describen en 2.1.15.1; 2.1.15.2;
2.1.15.3; 2.1.15.4; 2.1.15.5; 2.1.15.6 y 2.1.15.7.
Se realizaron análisis de imágenes para cada gel donde la detección automática, la edición de la
mancha y el cálculo del área se realizó dos veces y los valores se compararon para evaluar la
consistencia de la producción. La reproducibilidad lote a lote del gel se evaluó con el uso de los
informes pareados y el análisis del diagrama de dispersión.
2.5 Valoración del efecto de la sacarosa en la etapa de purificación y conservación de las VME
2.5.1 Comportamiento hidrodinámico del proceso de diafiltración de VME y recobrado
Se evaluó la diafiltración con sacarosa como paso final de la purificación de las VME, para eliminar
el tampón de proceso mediante un estudio comparativo con la precipitación alcohólica empleada
para este fin, para lo cual se realizaron seis procesos de obtención de las VME purificadas a partir
de la cepa CU 385/83 hasta el paso de FC. El volumen de cada FC se dividió a partes iguales, y
para cada variante se procedió de acuerdo al diagrama de flujo que se presenta en el anexo 6.
En la variante de diafiltración con sacarosa se procedió como sigue: el comportamiento
hidrodinámico del sistema se evaluó a través de la medición del flujo de filtrado a diferentes tiempos
de filtración y se procedió como se refiere en 2.1.11. La eliminación de DOC durante la diafiltración
fue seguida mediante la determinación de la absorbancia a 213 nm.
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En la variante de precipitación alcohólica: se procedió a partir del paso de FC como se refiere en
2.1.10.
Los recobrados del proceso se evaluaron mediante la determinación de las proteínas, según se
describe en 2.1.3.
2.5.2 Evaluación del impacto de la diafiltración con sacarosa en las características de las VME
La evaluación del impacto de la diafiltración con sacarosa en el proceso y las características de las
VME se analizó a partir de los seis lotes de IFA obtenidos, por la variante de diafiltración con
sacarosa y que se evaluaron de forma comparativa con igual cantidad de lotes de IFA, obtenidos por
precipitación alcohólica en un estudio de pre-estabilidad (37 ºC por 7 días), en cuanto a las
características definitorias de las VME, tales como: identidad, estructura vesicular, endotoxicidad,
pirógenos e inmunogenicidad. Los métodos analíticos empleados se presentan en el anexo 7. Las
características de endotoxicidad, pirógenos e inmunogenicidad se evaluaron en preparados
vacunales obtenidos a partir de los IFA en comparación y que contenían 50 μg.mL-1 de proteína,
4mg.mL-1 de gel de HA, 0,7mM de fosfatos. En los lotes correspondientes a la variante alcohólica la
isotonicidad se logró con 0,85% de Cloruro de Sodio, mientras que, en los lotes de la variante en
sacarosa esto se logró con un 3% de sacarosa y 0,62% de Cloruro de Sodio.
Para determinar la inmunogenicidad en ratones por ELISA se aplicó una dosis de 25 μg y se
procedió como se describe en 2.1.11. En el caso de la determinación de anticuerpos funcionales
mediante la determinación de la ABS en ratones, se aplicaron dos dosis de 25 μg y se procedió,
según fue descrito en 2.1.12.
A partir de tres lotes de VME en sacarosa se obtuvo igual número de lotes de monograneles (MG)
concentrados a pH = 6,5 y 7,5. Los mismos contenían 400 μg.mL-1 de proteína, 16 mg.mL-1 de gel
de HA en un tampón fosfato 0,7 mM para los MG de pH = 6,5. En el caso de los correspondientes a
pH = 7,5 se utilizó un tampón fosfato 2,8 mM.
Los MG se compararon entre sí en un estudio de pre-estabilidad a la temperatura de
37 ºC durante 7 días, observándose el comportamiento del pH, inmunogenicidad por ELISA, la
funcionabilidad de anticuerpos por la ABS y la actividad endotóxica de acuerdo a los ensayos
reportados en 2.1.12, 2.1.13 y 2.1.14, respectivamente.
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La actividad endotóxica y la inmunogenicidad de los MG se midió a través de los preparados
vacunales correspondientes a la variante de sacarosa, cuya composición fue descrita anteriormente
en este acápite.
2.6 Evaluación de las cepas epidémicas de N. meningitidis
2.6.1 Metodologías empleadas a escala piloto
Se evaluaron cinco cepas de N. meningitidis serogrupo B como posibles candidatos vacunales,
todas correspondían al fenotipo B:4:P1.7-2,4 y se compararon bajo las mismas condiciones del
proceso con la cepa vacunal CU 385/83, en las etapas de fermentación y extracción como sigue: a
cada cepa se les realizó, como mínimo, tres cultivos de seis horas en un fermentador Chemap de
35 L (modelo FZ-3 000) con 23 de MFM, sembrado con un volumen de inóculo suficiente que
garantizara una DO inicial entre 0,2 y 0,25. El inóculo se obtuvo según se refiere en 2.2.3. Se
emplearon las siguientes condiciones de cultivo: pH (inicial) = 7,4 ± 0,2; temperatura = 36,5 ± 0,5 ºC;
pO2 = 25% de oxígeno disuelto; agitación = 400 r. p. m.
La DO de los cultivos y su pureza se midió cada una hora según se refiere en 2.1.1 y 2.1.2.1,
respectivamente. Se evaluó la expresión del CPME en los diferentes pasos del proceso, mediante la
extracción de éstos con Cloruro de Litio, de acuerdo a la metodología referida por Frasch (1994). La
identificación de los CPME se realizó por SDS – PAGE, según aparece descrito en 2.1.4.
Al final de la fermentación, se separó la biomasa por centrifugación a 17 000 x g durante dos horas a
4 ºC y se resuspendió en el tampón de proceso Tris-EDTA. Para extraer las VME se añadió DOC al
10%, para una concentración final de DOC = 0,5%, de forma tal que, en el momento de la
extracción, la relación tampón–biomasa fue de 5 mL.g-1 de peso húmedo. Las VME se extrajeron con
agitación magnética durante dos horas a 4 ºC. Los restos celulares se separaron por centrifugación a
17 000 x g durante dos horas a 4 ºC. Para evaluar la identidad del CPME las VME extraídas
presentes en el sobrenadante se separaron por ultracentrifugación a 186 000 x g por ocho horas. La
evaluación se realizó por SDS-PAGE como se describe en 2.1.4 a partir de las VME resuspendidas
en el tampón de proceso Tris-EDTA – DOC.
2.6.2 Metodologías empleadas a escala industrial
Inicialmente, por la metodología tradicional, a partir de las cepas NZ 98/124 y NZ 98/228 se
realizaron tres procesos de obtención de VME purificadas de acuerdo a los pasos que están
descritos en los acápites 2.2.3, 2.2.4, 2.2.5, 2.2.6, 2.2.8, 2.2.9 y 2.2.10 hasta la obtención del IFA
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como torta alcohólica. Se evaluó comparativamente el comportamiento de las cepas en la etapa de
fermentación mediante la determinación de la DO, según se refiere en 2.1.1 y la presencia del CPME
por SDS-PAGE como se describe en 2.1.4, previamente estos habían sido extraídos con Cloruro de
Litio, según Frasch (1994) durante las etapas de cultivo o con DOC en la extracción y durante la
purificación. Los rendimientos de la proteína purificada en FC se determinaron según se refiere en
2.1.3. Así como, la capacidad inmunogénica de cada una en ratones por el método de ABS con la
aplicación de una dosis de 50μg de un preparado vacunal que contenía la misma composición de
VA-MENGOC-BC® referida en el acápite 1.7, donde las VME se sustituyeron por las obtenidas de las
cepas antes referidas. La ABS se evaluó mediante la metodología referida en 2.1.13. La capacidad
bactericida alcanzada por cada preparado vacunal se evaluó frente a las cepas NZ 98/124 y
NZ 98/228, respectivamente.
Posteriormente, la cepa NZ 98/228 se evaluó con la metodología establecida, luego de la
introducción del sistema de MFT en la etapa de separación celular y la diafiltración con sacarosa en
la etapa final de la purificación para lo cual se realizaron seis procesos de obtención de las VME,
acorde al diagrama de flujo presentado en el anexo 8. Los pasos del proceso involucrado se refieren
en los acápites 2.2.3, 2.2.4, 2.2.5, 2.2.7, 2.2.8, 2.2.9 y 2.2.11.
Los procesos de obtención de las VME se compararon con un igual número de procesos realizados
a partir de la cepa CU 385/83 en cuanto a la cinética del crecimiento, el comportamiento
hidrodinámico de la MFT, los recobrados celulares, el rendimiento de las proteínas y la eliminación
de los contaminantes por etapas. Las VME purificadas se compararon, tomando en cuenta la
identidad de las proteínas y la estructura vesicular. Los controles de calidad y las metodologías
analíticas empleadas y su referencia, realizadas en las diferentes etapas del proceso, se describen
en el anexo 9.
A partir de las VME en sacarosa obtenidas de la cepa NZ 98/228 adsorbidas en gel de HA como MG
se realizó un estudio de pre-estabilidad (37 ºC-7 días) donde se evaluó el comportamiento del pH, el
contenido de endotoxina y la inmunogenicidad, la medición de las dos últimas características se
realizó a partir de preparados vacunales cuya composición se refiere en 2.5.2 para la variante en
sacarosa. En la determinación de la inmunogenicidad en los ratones, medida por ELISA se aplicó
una dosis de 25μg y se procedió según se refiere en 2.1.12. Para determinar la ABS se aplicaron
dos dosis de 25μg y se siguió la metodología descrita en 2.1.13.
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El estudio se realizó de forma comparativa con igual número de MG obtenidos a partir de las VME
de la cepa CU 385/83 y se evaluaron paralelamente bajo los mismos principios referidos en este
acápite.
En el anexo 10 se presentan los controles de calidad, los métodos analíticos utilizados y su
referencia.
2.7 Obtención del nuevo candidato vacunal bivalente a partir de las VME de N. meningitidis
serogrupo B
2.7.1 Formulación de los monograneles y de la vacuna MenB bivalente
A partir de las VME en sacarosa al 3%, provenientes de las cepas obtenidas acorde con el diagrama
de flujo presentado en el anexo 8, se prepararon MG de forma independiente para cada VME bajo
un mismo principio de composición y formulación. El proceso se basó en la adsorción de las VME
purificadas en el gel de HA.
Las VME en sacarosa se esterilizaron por filtración y el gel concentrado de HA, por calor. El proceso
se realizó en condiciones asépticas.
Inicialmente, al gel de HA concentrado se le adicionó cantidades suficientes de sacarosa y fosfato
para garantizar concentraciones finales de 0,3% de sacarosa y 0,7 mM, respectivamente.
Posteriormente, las VME se diluyeron y adsorbieron para lograr una concentración de proteínas en
HA, en ocho y cuatro veces superiores respectivamente, con relación a la composición diseñada
para la vacuna MenB bivalente (anexo 11a).
El gel de HA empleado se produjo por Brenntag Biosector, contenía 30 mg.mL-1 en presentación
estéril.
Los MG fueron formulados en botellones de vidrio, calidad hidrolítica tipo I con capacidad de 5 L con
tapa roscada de resina de melanina y junta de teflón, que puede ser esterilizada a 200 ºC.
Finalmente, la composición del MG formulado contenía: 400 µg.mL-1 de proteínas,
16 mg. mL-1 de HA, 0,3% de sacarosa y 0,7 mM de fosfatos con un pH=6.5±0,2.
La vacuna bivalente se obtuvo por la unión aséptica a partes iguales de los MG estériles
correspondientes a cada una de las cepas. La mezcla en cuestión estaba cuatro veces más
concentrada con relación a la composición establecida para la vacuna final, por lo que este
preparado se diluyó con soluciones de fosfatos, sacarosa y Cloruro de Sodio, añadidas de forma
estéril, por filtración microbiológica, lográndose alcanzar la composición diseñada para la vacuna
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bivalente como sigue: 100 µg.mL-1 de proteínas, 4 mg.mL-1 de HA, 3% de sacarosa, 0,62% de
cloruro de sodio y 0,7 mM de fosfatos con un pH=6.5 ± 0,2 (anexo 11b)
En las formulaciones todas las mediciones de los componentes se realizaron por pesadas y
transferencias cerradas bajo flujo laminar Clase A.
La vacuna se formuló en botellones 20 L de cristal, con las características anteriormente señaladas.
El producto a granel se llenó en las instalaciones de GSK en Bélgica.
2.7.2 Controles de calidad de las VME en sacarosa, monograneles y la vacuna MenB bivalente
Se realizaron controles de calidad a cinco lotes de VME de cada cepa en sacarosa proveniente de
las cepas vacunales (CU 385/83 y NZ 98/228). En el anexo 12 se presentan los controles de calidad;
límites de especificación o valores esperados, los métodos de ensayo empleados y sus referencias.
A cuatro lotes de MG provenientes de las VME de cada una de esas cepas se le realizaron controles
de calidad. En el anexo 13 se presentan los límites de la especificación o los valores esperados, los
métodos de ensayo empleados y sus referencias.
Se realizaron controles de calidad a cuatro lotes de la vacuna MenB bivalente. En el anexo 14 se
presentan los límites de la especificación o valores esperados, los métodos de ensayo empleados y
sus referencias.
2.7.3 Comparación de la respuesta inmune de los monograneles, MenB bivalente y
VA-MENGOC-BC®
A partir de los tres lotes del MG de las cepas CU 385/83 y NZ 98/228 se obtuvieron también tres
lotes de vacuna MenB bivalente, éstos se compararon entre sí tomando en cuenta la respuesta
inmune funcional por la ABS para cada uno de los lotes de vacuna con los MG que le dieron origen.
El estudio se realizó en tres grupos de 10 ratones BALB/c de seis a ocho semanas cada uno, a los
dos grupos correspondientes a los MG se les aplicó dos dosis de 5 μg de proteínas separadas con
un intervalo de 14 días. La vacuna MenB bivalente se evaluó de igual forma pero con la aplicación
de 10 μg de proteínas.
Se evaluó la respuesta inmune funcional por la ABS de tres lotes de la vacuna bivalente en
comparación con igual cantidad de lotes de VA-MENGOC-BC® con la aplicación de dos dosis de 10
μg de proteínas en un esquema similar al referido anteriormente.
Materiales y Métodos
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2.7.4 Estudios de estabilidad de los monograneles y de la vacuna MenB bivalente a granel
Se realizaron estudios de estabilidad de vida de estante y estrés a tres lotes de MG provenientes de
las VME de cada una de las cepas vacunales CU 385/83 y NZ 298/228, e igual número de lotes de
la vacuna MenB bivalente a granel de acuerdo con los protocolos resumidos y referidos en los
anexos 15 y 16. En el estudio se utilizaron métodos analíticos validados.
Cada muestra del estudio se analizó por triplicado. Se realizaron análisis estadísticos de los
resultados de acuerdo a los criterios referidos en 2.1.18.
2.8 Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el uso del paquete SPSS versión 11.5 para Windows. Los
gráficos que permiten visualizar los resultados se confeccionaron en STATISTICA versión 7.0. Un
nivel de significación del 5% fue usado para las comparaciones. En caso de comparaciones
múltiples que requirieron de un ajuste en el nivel de significación se usó el criterio de Fonferroni.
Para cada comparación se aplicó la prueba de hipótesis que mejor se ajustó. Se analizó el
cumplimiento de los supuestos de homogeneidad de varianza (prueba de Levene) y de normalidad
(prueba de Kolmogorov Smirnov). En caso de cumplirse estos supuestos se usó ANOVA de un
factor (a la prueba t de Student) para muestras pareadas o no pareadas, dependiendo de la
comparación de interés. Se usaron, además, pruebas no paramétricas en caso de no verificarse los
supuestos antes mencionados: la prueba de Mann-Whitney para la comparación de dos muestras no
pareadas, la prueba de Wilcoxon para dos muestras pareadas, la prueba de Kruskal Wallis para
comparar más de dos muestras no pareadas y la prueba de Friedman para más de dos muestras
pareadas.
Materiales y Métodos
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
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3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Perfeccionamiento del proceso de separación celular mediante el empleo de la
microfiltración tangencial
3.1.1 Comportamiento hidrodinámico del sistema de MFT y recobrados del proceso
Los resultados obtenidos muestran un flujo inicial de 120 L.h-1m-2, proceso que se estabilizó a partir
de los 35 minutos con flujos medios entre 62 y 67 L.h-1m-2. Estos resultados permitieron concentrar
el cultivo de 460 hasta 30 L entre 45 ó 50 minutos, equivalente a una concentración de 15,3 veces
(figura 1a).
Concluida la etapa de concentración, se comenzó un proceso de lavado celular a volumen
constante, con la utilización del tampón de proceso Tris-EDTA a pH = 8,5, con el objetivo de eliminar
restos de los medios de cultivos y otros productos del metabolismo excretado durante el crecimiento
bacteriano. Lo anterior facilitó la preparación de la biomasa para la posterior extracción de las VME.
En esta etapa los flujos de filtrado disminuyeron ligeramente con relación a la etapa de
concentración, comportamiento que pudo estar relacionado con los cambios hidrodinámicos del
sistema, introducidos por el tampón, encontrándose flujos entre 56 y 71 L.h-1m-2. En un tiempo de
operación de 30 minutos, luego de tres volúmenes de diafiltración se alcanzó el pH = 8,5 del tampón
de proceso (figura1b).
Para realizar el proceso de extracción se necesitó ajustar la concentración final de la biomasa en
relación con el volumen del cultivo inicial en una concentración de 25 a 35 veces, para mantener la
proporción de 5 mL de tampón por gramo de peso húmedo. Esta relación tampón-biomasa está
descrita por diferentes autores y es la utilizada en la tecnología tradicional (Campa y col, 1989;
Fredriksen y col, 1991; Frasch y col, 2001).
El recobrado celular medio (base peso seco) fue 87,2%, considerado alto para las operaciones que
utilizan membranas, lo que indicó una baja interacción entre N. meningitidis y la membrana
Hydrosart empleada en la separación, otras aplicaciones de este sistema, como en la separación de
lisados de células del Clostridium tetani, Corynebacterium diphteriae y Bordetella pertussis,
muestran una menor eficacia, comportamiento que pudiera estar asociado con las diferencias de
talla, forma y estructura química de la pared celular bacteriana (Cardoso, 2001). Los recobrados
fueron 1,6 veces superiores a los de la tecnología tradicional donde se recupera como promedio el
54,2%, cifra que resultó estadísticamente significativa (p=0.000002) (figura 2a).
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Este comportamiento posibilitó contar con una mayor masa celular para realizar la extracción por
proceso de fermentación de 460 L; lo que se tradujo en un mayor rendimiento de proteína vesicular
media extraída, la que fue de 14 g por proceso a diferencia de los 6,5 g extraídas como promedio en
las condiciones de la tecnología tradicional (figura 2b), lográndose un incremento de 2,15 veces,
diferencia que resultó estadísticamente significativa (p=0.000000). Es conveniente aclarar que los
rendimientos de la proteína vesicular referidos en esta etapa del proceso se calcularon a través de la
separación de éstas en muestras del sobrenadante del "debris" celular obtenido posterior a la
extracción de las VME.
En el extracto de las VME existieron por proceso de 460 L, un promedio de 98,3 g de proteínas
totales provenientes de la tecnología propuesta y 69,03 g de la tecnología tradicional, lo que
representó un 30% de incremento. Sin embargo, su composición fue diferente, en cuanto a las
proteínas vesiculares presentes, las que representaron 14,2% para la tecnología que incorporó la
microfiltración tangencial y 9,4% para la tradicional.
La extracción constituye una etapa crítica del proceso donde la acción detergente del DOC al 0,5%
en presencia del tampón de proceso Tris-EDTA garantiza la disociación de las estructuras de
membrana en las VME, la solubilización del LPS libre y la inactivación de la bacteria, así como la
cantidad de proteínas que entran al proceso y su adecuada relación con los LPS para asegurar la
estructura vesicular durante todo el proceso posterior y en las VME purificadas (Frasch y col, 2001;
Rosenqvist y col, 2001).
El proceso propuesto para el cambio en la etapa de separación – resuspensión trajo resultados
positivos en la etapa de extracción, al parecer no sólo por el alto recobrado celular obtenido durante
la separación, sino además porque la centrifugación y la consecuente resuspensión celular que
utiliza la tecnología tradicional, hace difícil lograr una buena resuspensión a partir de una torta
compacta. Por otra parte, el proceso de concentración – diafiltración evaluado, siempre garantizó
una suspensión fluida con pocas posibilidades de agregación celular, lo que posibilita un mejor
contacto célula – detergente durante la extracción de las VME.
Cuando se intentó comparar los resultados obtenidos en esta tesis respecto a la eficiencia obtenida
con la introducción de la MFT en la etapa de separación celular no se encontró en la literatura
revisada, resultados descritos por otros autores que pudieran servir de comparación en este acápite.
Sin embargo la aplicación de este método en la separación de la biomasa de N. meningitidis se
describe por Frasch y colaboradores (2001) quienes recomiendan la utilización de membranas de
Resultados y Discusión
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Flujo (L.h-1m-2)
120
80
40
9,0
80
8,5
60
8,0
40
7,5
pH
Flujo Normalizado
160
b) 100
Flujo (L.h-1m-2)
a) 200
Flujo Normalizado
pH del filtrado
20
0
0
10
20
30
40 50 60
Tiempo (min)
7,0
6,5
0
0V
1V
2V
3V
Lavados
Fig. 1. Comportamiento hidrodinámico del sistema de MFT en las etapas de concentración y lavado celular con tampón Tris-EDTA, pH
8,5: a) Flujo de filtrado normalizado en el tiempo para la etapa de concentración; b) Flujo del filtrado normalizado y pH por número o
volumen de lavado en la etapa de diafiltración.
Fig. 2. Recobrado celular y rendimiento de proteína vesicular extraída en el proceso de obtención de VME purificadas luego de la
concentración y lavado celular por MFT en comparación con la tecnología tradicional: a) Media del recobrado celular en base a peso
seco de la tecnología evaluada y la tradicional; b) Masa de proteína vesicular extraída por ambas tecnologías.
Resultados y Discusión
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0,2μm, coincidiendo con la porosidad de las membranas empleadas en este estudio. Por otra parte
Rosenqvist y colaboradores (2001), refieren el uso de sistemas comerciales de MFT para la
separación celular de este microorganismo, mediante un proceso de concentración entre cinco y 20
veces a partir de 50 L de cultivo, escala que puede ser considerada piloto. En el presente trabajo se
procesaron 460 L, los que fueron concentrados y lavados finalmente entre 25 y 35 veces en el propio
reactor de extracción, con la utilización del tampón de proceso Tris-EDTA y posteriormente se
añadió el DOC para realizar el proceso de extracción. En el trabajo de Rosenqvist y colaboradores
(2001) a la biomasa concentrada y sin lavar se le añade el tampón Tris-EDTA-DOC.
EL estudio aquí presentado constituye una aplicación de la MFT en la separación de N. meningitidis
serogrupo B a escala industrial mediante un proceso que garantiza condiciones más limpias para la
extracción de las VME ya que previamente se eliminaron todos los restos del medio y del
metabolismo celular presentes en el cultivo.
3.1.2 Impacto en el proceso de purificación de las VME
3.1.2.1 Contenido e identidad de las proteínas por etapas, rendimiento y recobrado del
proceso
Como ya se explicó anteriormente, el contenido de las proteínas totales y vesiculares que entró al
proceso de purificación fue mayor con la tecnología evaluada en este trabajo, no obstante existió un
comportamiento similar en las salidas de las proteínas obtenidas en los diferentes pasos del proceso
de purificación (figura 3).
Los rendimientos promedios obtenidos al final del proceso de purificación fueron de 7,6 y 3,8 g para
las tecnologías en evaluación y la tradicional, respectivamente, con rendimientos superiores en 2,05
veces a favor de la variante en estudio (figura 4), diferencia que fue estadísticamente significativa
(p=0.000 000). El resultado anterior estuvo en correspondencia con el contenido de la proteína
vesicular que entró al proceso, la que, en este caso fue 2,15 veces mayor.
Al comparar los recobrados finales de la proteína vesicular purificada, para cada tecnología se
apreció que ambos fueron similares (57 y 59%). Los resultados anteriores demostraron que el
proceso de purificación de las VME establecido tuvo la capacidad de asimilar los nuevos
rendimientos de la proteína total y vesicular en el extracto, sin cambiar su comportamiento habitual
durante la etapa de purificación.
La composición cualitativa relativa de las proteínas en la etapa de la extracción y en cada una de las
fases del proceso de purificación de las VME para la variante tecnológica en evaluación y la
Resultados y Discusión
57
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
tecnología tradicional fue similar (figura 5). Así, como era de esperar, en el SDS-PAGE las líneas 2 y
8 correspondientes a la etapa de extracción, estuvieron presentes las proteínas que forman
mayoritariamente el CPME de las VME: PorA (clase 1), PorB (clase 3), RmpM (clase 4), Opc (clase
5) y las proteínas de 70 y 80 kDa, pero pudieron identificarse también claramente otras proteínas
con una intensidad relativa similar a las ya mencionadas, que al parecer no forman parte de las VME
o se encuentran débilmente unidas a las mismas y son eliminadas o disminuidas durante las etapas
de concentración y el lavado del extracto (líneas 3 y 9), aunque después de la ultracentrifugación la
presencia de las proteínas características en las VME fue más marcada (líneas 4 y 10). Estos
resultados permitieron evidenciar que existió un comportamiento similar en la identidad de las
proteínas para ambas variantes tecnológicas durante las etapas de extracción y purificación de las
VME.
3.1.2.2 Eliminación de los contaminantes en los pasos de purificación de las VME
Los contaminantes celulares de mayor interés presentes en las VME son los LPS y los PC. Los LPS
a pesar de considerarse un contaminante que debe disminuirse por su carácter endotóxico, está
demostrado que su presencia en una concentración de alrededor del 5%, garantiza la estructura
vesicular de las proteínas, y en esta forma es 100 veces menos tóxico que cuando se encuentra libre
(Frasch y col, 2001).
En la tecnología de purificación, la ultracentrifugación constituyó la etapa fundamental para disminuir
el contenido de LPS con relación a las proteínas, es en el proceso de ultracentrifugación donde las
VME precipitan y se separan mayoritariamente de los LPS y PC-B que se solubilizaron con DOC
durante la etapa de extracción y no forman parte de las VME (figura 6a y 6b).
En la tecnología tradicional, al finalizar la etapa de ultracentrifugación, el contenido medio de LPS
fue del 10% con relación a la proteína, sin embargo en la tecnología propuesta, el contenido medio
se elevó a 14.4% (figura 6a). Los resultados señalados anteriormente pudieran estar relacionados
con los cambios propuestos para la concentración, el lavado y resuspensión celular, que al ser un
proceso más delicado favorece la formación de VME con un mayor contenido de LPS.
Para alcanzar los niveles de LPS establecidos en la especificación (2–6%) las VME se
resuspendieron en un tampón que contiene DOC al 5%, concentración que facilitó la resuspensión
de las mismas y la depletación parcial de los LPS presentes en las vesículas, compuestos que se
separan luego de una etapa de cromatografía de exclusión molecular. Cuando se compararon los
resultados obtenidos al concluir la etapa en cuestión se observó un comportamiento similar respecto
Resultados y Discusión
58
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Proteína total (g)
160
Tecnología evaluada
Tecnología tradicional
120
Fig. 3. Comportamiento medio del contenido de proteína
de VME extraídas con DOC, luego de la concentración y
lavado celular por MFT en comparación con la tecnología
tradicional. Etapas: PE (Proteínas extraídas); CP
(Concentrado
de
proteínas);
VUC
(Vesículas
ultracentrifugadas) y FC (Fracción cromatográfica).
80
40
0
PE
CP
VUC
FC
Etapa de Proceso
Fig. 4. Rendimiento de proteína vesicular en FC de VME
purificadas luego de la concentración y lavado celular por
MFT, en comparación con la tecnología tradicional.
-
-
Leyenda:
Líneas 1 y 7: VME separadas por
ultracentrifugación del extracto
con fines analíticos.
Líneas 2 y 8: Extracto de
proteínas
Líneas 3 y 9: Concentrado de
proteínas
Líneas 4 y 10: VME
ultracentrifugadas
Líneas 5 y 11: FC de VME
PPM: Patrón de peso moleculares
Fig. 5. SDS-PAGE de las proteínas presentes en las etapas de extracción y purificación de VME luego de la concentración y lavado
celular por MFT (Líneas 1 - 5) en comparación con la tecnología tradicional (Líneas 7 - 10).
Resultados y Discusión
59
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
a la disminución del contenido de LPS con relación a las proteínas, que fue del 65% para la variante
propuesta y del 66% para la tradicional. Sin embargo, como los valores iniciales de entrada en esta
etapa fueron diferentes, el contenido final medio de los LPS con relación a la proteína en las FC fue
del 5,3 y 4,1%, respectivamente. Al parecer, la diferencia encontrada en el contenido de LPS no
dependió de la capacidad del proceso de purificación sino de la diferencia de las condiciones
empleadas en la separación y el lavado celular, comportamiento que se explicó anteriormente.
El PC-B como contaminante debe también disminuirse con el objetivo de evitar el riesgo de
desencadenar reacciones autoinmunes, por la similitud de ese PC con las estructuras presentes en
los tejidos humanos (Jennings, 1986; Zollinger, 1987).
A pesar de comenzar el proceso de la tecnología tradicional con un contenido superior de PC con
relación a la tecnología propuesta, el paso de la ultracentrifugación, para ambas tecnologías, fue
capaz de disminuir su contenido en más del 90%, con valores medios de 0,58% en relación con la
proteína para la variante en evaluación y 0,51% para la tecnología tradicional. En el paso
cromatográfico se disminuyó aún más el contenido de PC, encontrándose valores medios similares
(0,33%) para la variante evaluada y 0,34% en relación a las proteínas para la tecnología tradicional
(figura 6b).
Los resultados alcanzados pusieron en evidencia que los pasos del proceso establecidos tuvieron la
capacidad de purificar las VME obtenidas luego de la introducción de los cambios que generó la
variante en evaluación y aunque, los métodos de purificación empleados en este trabajo coincidieron
con los recomendados por otros autores (Frasch y col, 2001; Rosenqvist y col, 2001), no fue posible
hacer comparaciones, por la ausencia de estudios publicados al respecto.
3.1.3 Cumplimiento de las especificaciones de calidad de las fracciones cromatográficas
Los resultados de los controles de calidad de las FC obtenidas por las variantes en estudio y la
tradicional demostraron que ambos procesos fueron consistentes y cumplieron con las
especificaciones de calidad establecidos. No obstante, a continuación se compararon el
comportamiento de cada requisito de calidad y su posible impacto en el proceso.
El perfil electroforético de los CPME que conformaron las VME, presentó uniformidad entre los lotes
procedentes de las variantes tecnológicas comparadas entre sí, así como entre los lotes en cada
una de ellas, donde se detectó la presencia de las proteínas PorA, PorB, RmpM, Opc y las de 70 y
80 kDa (figura 7).
Resultados y Discusión
60
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Versión: 3
240
150
-1
180
120
Tecnología evaluada
Tecnología tradicional
60
0
PE
CP
VUC
FC
Etapa de Proceso
PC-B (ug.mg-1)
b) 180
LPS (ug.mg )
a) 300
Tecnología evaluada
Tecnología tradicional
120
90
60
30
0
PE
CP
VUC
FC
Etapa de Proceso
Fig. 6. Comportamiento medio del contenido de contaminantes en la purificación de VME extraídas con DOC, luego de la
concentración y lavado celular por MFT en comparación con la tecnología tradicional. Etapas: PE (Proteínas extraídas); CP
(Concentrado de proteínas; VUC (Vesículas ultracentrifugadas) y FC (Fracción cromatográfica): a) Contenido de LPS en base a
proteína total; b) Contenido de PC-B en base a proteína total.
Leyenda:
- Líneas 1 a 4: Lotes de
FC de la tecnología en
evaluación.
- Líneas 5: Patrón de
VME purificada (Tec.
Tradicional).
- Líneas 6: Patrón de
peso molecular
- Líneas 7 a 10: FC de la
tecnología tradicional.
Fig. 7. SDS-PAGE del CPME en FC de VME obtenidas luego de la concentración y lavado celular por MFT en comparación con la
variante tradicional.
Resultados y Discusión
61
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Versión: 3
En relación a los contaminantes, el contenido medio de LPS con relación a la proteína aumentó de
4,1 a 5,3%, diferencia que resultó estadísticamente significativa (p=0,006), sin embargo ambos
cumplieron la especificación (tabla 2a y 2b). En el caso de la vacuna Folkehelsa los límites de
especificación para esta característica están entre 4 y 10% relativo a la proteína, por otra parte, se
recomienda un 5% para garantizar una estructura vesicular adecuada (Frasch y col, 2001).
Al parecer el ligero aumento del contenido de LPS en las VME trajo como consecuencia una
disminución de los valores medios de tramitancia (6,61) para el cambio en evaluación, cifras que
resultaron muy inferiores a los obtenidos como promedio en la tecnología tradicional (17,4),
resultado donde se observó una diferencia estadísticamente significativa (p=0.006) (tabla 2a y 2b).
Esta observación está a favor de la presencia de las VME intactas, estructuras que aumentan la
opalescencia de las fracciones cromatográficas. La tramitancia es a su vez una medición inversa de
esta característica.
Tabla 2. Cumplimiento de las especificaciones de calidad de FC de VME de N. meningitidis serogrupo B obtenida luego
de la introducción de la MFT en comparación con la tecnología tradicional. a) Proceso en evaluación, b) Procesos
tradicionales.
a)
Proceso en
evaluación
PE38B
PE39B
PE40B I
PE40B II
PE41B
PE42B I
Concentración de
Proteína
(1,6-6,0 mg.ml-1)
2,24
2,78
3,65
3,54
2,91
3,34
Contenido de
LPS
(20-60 µg.mg-1)
44,29
59,36
57,19
49,19
53,03
54,12
3,076
52,86
2,80
15,0
5,1
3,2
3,8
5,3
7,3
6,61
0,53
5,47
0,74
4,34
Concentración de
Proteína
(1,6-6,0 mg.ml-1)
3,43
2,80
3,01
3,65
2,75
3,6
Contenido de
LPS
(20-60 µg.mg-1)
35,04
43,15
45,40
39,20
41,05
39,04
-Contenido
de ácido siálico
<10 µg.mg-1
3,08
3,10
2,30
2,10
2,94
2,71
3,21
40,48
2,71
20
15,1
17,2
21,5
18,3
12,4
17,42
0,40
3,60
0,42
3,31
Media
DE
Contenido
de ácido siálico
<10 µg.mg-1
3,38
3,09
2,25
2,00
3,83
2,26
Tramitancia
<32
b)
Procesos
tradicionales
P0001
P0002
P0003
P0004
P0005
P0006
Media
DE
Tramitancia
<32
La medición de la tramitancia como criterio de la opalescencia y en última instancia de la
presentación vesicular, se estableció desde el inicio de la producción, basado en los estudios
Resultados y Discusión
62
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Ejemplar No. _____
previos, donde se relacionaron los valores de tramitancia con la presencia de las VME, por
microscopía electrónica, resultados no mostrados en este trabajo.
Las microfotografías electrónicas de las FC de las VME obtenidas por las dos variantes, muestran
una mayor presencia de vesículas intactas a favor de la variante en evaluación. Las VME mostraron
un tamaño entre 50 y 90 nm (figuras 8a y 8b).
Se recomendó la presencia de las proteínas en forma de VME, con el objetivo de garantizar la
presentación nativa de estas dentro de la membrana y facilitar el proceso de purificación. Por otra
parte, el LPS en las VME es menos tóxico que el LPS libre (Frasch y col, 2001).
Por todo lo expuesto anteriormente se consideró que los cambios que generó la introducción de la
MFT en el proceso de obtención de las VME fueron favorables no sólo en relación con los
rendimientos sino también con una mayor presencia de VME intactas en la FC.
3.1.4 Cumplimiento de las especificaciones de calidad del IFA y evaluaciones
complementarias de antigenicidad, inmunogenicidad y actividad endotóxica
Las VME de N. meningitidis serogrupo B, se presentaron como una torta alcohólica, producto que se
mantuvo congelado (-70 0C) hasta su uso.
Los IFA obtenidos por ambas tecnologías cumplieron de forma consistente todas las
especificaciones de calidad establecidas, no obstante, el contenido de LPS en la variante en
evaluación aumentó en 1% y mostró diferencia estadísticamente significativa(p=0.006)(tabla3a y 3b).
La identidad de las proteínas presentes mostraron uniformidad entre los lotes y variantes, donde
pueden apreciarse las proteínas: PorA, PorB, RmpM, Opc y las de 70 y 80 kDa (figura 9a).
Para demostrar la equivalencia de identidad antigénica se realizaron evaluaciones inmunoquímicas
complementarias, donde se utilizó una gamma globulina de referencia interna obtenida a partir del
suero de vacunados con lotes de VA-MENGOC-BC®, que contenían como IFA, VME obtenida por la
tecnología tradicional. En el WB se evidenció que los anticuerpos reconocieron las mismas proteínas
en ambas variantes tecnológicas, donde se destacan las PorA, PorB, Opc y 70 kDa (figura 9b).Por
otra parte, el ELISA mostró que los porcentajes de inhibición de la actividad de los anticuerpos
obtenidos en las diferentes diluciones de los IFA provenientes de ambas variantes tecnológicas,
presentaron un comportamiento similar, demostrándose la equivalencia de los antígenos presentes
en las mismas (figura 10).
La inmunogenicidad y la actividad endotóxica de los IFA de ambas variantes tecnológicas se evaluó
a través de la formulación de preparados vacunales con la composición de VA-MENGOC-BC®. Se
Resultados y Discusión
63
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
a)
b)
Fig. 8. Microfotografía electrónica de FC de VME obtenidas luego de la concentración y lavado celular por
MFT en comparación con la tecnología tradicional: a) Tecnología evaluada; b) Tecnología tradicional.
Resultados y Discusión
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Versión: 3
Fig. 9. SDS-PAGE y Western blot del CPME del IFA, obtenidas luego de la concentración y lavado celular por MFT en
comparación con la variante tradicional: Líneas 1, 5 y 6 (Lotes de IFA obtenidos por la tecnología tradicional); Líneas 2 a 4
(Lotes de IFA obtenidos por la tecnología en evaluación); Líneas 7 (Patrón de VME purificada por la tecnología tradicional).
100
Inhibición (%)
80
60
40
Tec. Tradicional
Tec. Evaluada
20
0
1
2
3
4
5
6
Log2 (Dilución)
Fig. 10. Porcentaje de inhibición de la actividad de anticuerpos contra VME de N. meningitidis serogrupo B para diferentes
diluciones del IFA, luego de la concentración y lavado celular por MFT en comparación con la tecnología tradicional.
Resultados y Discusión
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Versión: 3
pudo evidenciar que las dos variantes tecnológicas cumplieron las especificaciones de calidad de la
vacuna para los parámetros anteriormente señalados donde se observó que la inducción de
anticuerpos medidos por el método de ELISA fue similar (figura 11) (p=0.748774), igual al
comportamiento que mostró la ABS (figura 12) (p=0.074 792). La actividad endotóxica no evidenció
diferencias (figura 13) (p=0.420071)
Tabla 3. Cumplimiento de especificaciones de calidad del IFA de VME de N. meningitidis serogrupo B obtenida luego de
la introducción de la MFT en comparación con la tecnología tradicional. A) Lote en evaluación, b) Lotes
tradicionales.
a)
Contenido de
Contenido de
Contenido
proteínas/gramo
Contenido de LPS
Lote en
de
ácido
siálico
ácido
nucleico
peso húmedo
evaluación
(20-60 µg.mg-1)
-1
-1
<10
µg.mg
<10
µg.mg
≥ 30mg.g-1
LE38B
30,38
48,03
2,81
2,02
LE39B
50,29
44,59
1,67
2,02
LE40B I
42,79
49,57
2,30
2,73
LE40B II
43,04
55,58
2,23
2,43
LE41B
40,25
56,68
2,34
1,61
LE42B I
39,53
50,49
2,08
1,40
Media
41,05
50,82
2,24
2,04
DE
6,47
4,59
0,37
0,49
b)
L0001
L0002
L0003
L0004
L0005
L0006
Contenido de
proteínas/gramo
peso húmedo
≥ 30mg.g-1
39,5
45,3
42,9
39,8
44,5
47,4
Media
43,23
40,48
2,33
1,90
1,53
,2,02
2,02
1,43
1,19
1,61
DE
3,13
3,62
0,41
0,34
Lotes
tradicionales
Contenido de LPS
(20-60 µg.mg-1)
Contenido
de ácido siálico
<10 µg.mg-1
Contenido de
ácido nucleico
<10 µg.mg-1
42,03
37,05
41,20
46,18
40,18
36,21
2,93
1,84
2,35
2,43
2,5
1,9
El método de LAL no detectó el incremento del 1% en el contenido del LPS en relación a las
proteínas en las VME, aspecto que pudo estar relacionado con los límites de especificación del
contenido de proteína en VA-MENGOC-BC® en un rango superior e inferior del 30%, lo cual
introduce una variación en el contenido de LPS total presente.
Por otra parte el método de LAL presenta su propia variabilidad, por ejemplo se considera aceptable
para el método una recuperación del patrón añadido de 5 UE.mL-1 en la prueba entre un 50-150%.
Los resultados anteriores demuestran que los IFA obtenidos con el cambio en la etapa de
separación celular referido a la MFT fueron equivalentes a los obtenidos por la tecnología tradicional
Resultados y Discusión
66
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
Fig. 11. Contenido de UIgG.mL-1 en ratones inmunizados con
50 ug de proteína del IFA obtenido luego de la concentración
y lavado por MFT en comparación con la tecnología
tradicional
Fig. 12. Actividad bactericida de ratones inmunizados con
una dosis de 50 ug de proteína del IFA obtenido luego de la
concentración y lavado por MFT en comparación con la
tecnología tradicional
Fig. 13 Actividad endotóxica del IFA a una concentración de
proteínas de 100 ug de proteínas por mL-1, obtenido luego de
la concentración y lavado por MFT en comparación con la
tecnología tradicional
Resultados y Discusión
67
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
en cuanto a: identidad, antigenicidad, inmunogenicidad, funcionabilidad de anticuerpos y
endotoxicidad, requisitos de calidad muy relacionados con la eficacia y seguridad de las vacunas. Se
demostró también la equivalencia en las etapas del proceso posterior al cambio y los productos
intermedios que se generaron.
Esta demostración de la equivalencia estuvo en correspondencia con los lineamientos de la guía
para el control de cambios de productos biotecnológicos/ biológicos, vigente en la Unión Europea
(EMEA, 2006a).
3.1.5 Ventajas de la introducción de la MFT en el proceso de obtención de VME
¾ La MFT facilitó la demostración del cumplimiento de las BPF, permitiendo la creación de un
sistema integrado, cerrado y validable para todas las operaciones con el microorganismo vivo
hasta su inactivación, procedimiento que redujo considerablemente los riesgos para el personal
y el medio ambiente, así como una mayor seguridad para el producto. Además, posibilitó los
procesos de descontaminación y limpieza, así como su validación.
¾ La MFT permitió la salida del proceso de dos centrífugas de flujo continuo, ocho centrífugas de
alta velocidad, tres flujos laminares y un reactor. La salida de estos equipos redujo las áreas de
producción necesarias en 100 m2.
¾ La MFT posibilitó la reducción del costo de producción de las VME como IFA en un 48% debido
a la disminución del consumo material, por duplicar los rendimientos de proteínas y la salida del
proceso de áreas y equipos.
¾ La MFT disminuyó el presupuesto para la remodelación de una planta de obtención de IFA en
450 000 USD, por la reducción de las áreas clasificadas y el equipamiento tecnológico.
3.1.6 Conclusiones parciales del perfeccionamiento del proceso de separación celular
¾ La separación celular de la cepa CU 385/83 por MFT permitió aumentar el recobrado celular en
un 33% y de las VME purificadas en más de dos veces; así como una disminución del tiempo del
proceso de obtención de las mismas en tres horas.
¾ Se garantizó el cumplimiento de las BPF en cuanto al trabajo con microorganismos patógenos
en un sistema cerrado, método que facilitó la demostración del cumplimiento de las BPF y una
disminución apreciable del número de equipos y áreas utilizados.
¾ El proceso evaluado presentó un comportamiento equivalente en las etapas de extracción y
purificación de las VME con relación al tradicional.
Resultados y Discusión
68
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
¾ Las VME purificadas fueron equivalentes a las obtenidas por la tecnología tradicional en cuanto
a su identidad, antigenicidad, inmunogenicidad y endotoxicidad, requisitos de calidad muy
relacionados con la eficacia y seguridad de las vacunas.
¾ El cambio evaluado, posibilitó la reducción del costo de obtención del IFA en un 48% y el
presupuesto de inversión de la remodelación de la planta para su producción en 450 000 USD.
3.2 Análisis de los componentes proteicos de las VME purificadas mediante la electroforesis
bidimensional y una plataforma de proteómica
Las VME de N. meningitidis serogrupo B utilizadas como IFA en VA-MENGOC-BC® están
constituidas fundamentalmente por dos tipos de compuestos: proteínas y lípidos, ambos se ubican y
forman una parte importante de la membrana externa de esta bacteria gramnegativa. Las proteínas
mayoritarias se identifican bien con el uso de AcM específicos contra las PME individuales. Así, en
estudios previos se evidencia la presencia de las proteínas de clase 1 (PorA), clase 3 (PorB), clase 4
(RmpM), clase 5 (opc) y proteínas de alto peso molecular (Campa y col, 1989, Estrada, 1995;
Martínez, 2002). A pesar de lo referido anteriormente, se necesitan identificar otras proteínas
minoritarias que pudieran tener un impacto importante en la demostración de la consistencia
productiva y en la posible justificación de la respuesta inmune heteróloga de la vacuna cubana.
3.2.1 Análisis de los componentes proteicos de las VME por electroforesis bidimensional
Los mapas bidimensionales de los tres lotes de producción estudiados evidenciaron una presencia
proteica compleja con más de 260 manchas en los geles analíticos con rango de pI 3 – 10. El
número de manchas se incrementó en más de dos veces, en los geles con rango de pI 4 – 7 debido
a una mayor carga de proteína aplicada y al aumento de la resolución (figura 14).
La consistencia de los tres lotes de producción del IFA se evaluó mediante la estimación del
volumen correspondiente de mancha a los cinco componentes mayoritarios (tabla 4) y por la opción
de diagramas de dispersión del software Melanie III (figura 15).
El lote A se seleccionó como referencia para hacer las comparaciones, ya que en ambos sistemas
mostró el mayor número de manchas.
Resultados y Discusión
69
CONFIDENCIAL
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Ejemplar No. _____
Versión: 3
Tabla 4. Evaluación de la reproducibilidad lote a lote: número de manchas en los tres lotes y
contribución de las proteínas mayoritarias en el IFA.
Número de manchas y proteínas mayoritarias
A
297
630
9,0%
18,8%
13,9%
9,0%
7,5%
Lotes
B
282
623
9,1%
19,8%
15,8%
10,7%
8,5%
C
264
628
9,2%
21,8%
18,7%
8,3%
7,5%
Número de manchas. Gel pI 3-10
Número de manchas. Gel pI 4-7
FrpB
PorA
PorB
RmpM
Opa + Opc
Contribución de proteínas mayoritarias para el
58,2%
69,3%
65,6%
contenido total de proteínas
En el rango de separación pI 3 – 10 se evidenciaron 241 manchas comunes en los tres lotes
comparados y 16 estuvieron presentes en uno ó dos de los mapas confrontados. Cuando se
compararon sólo las manchas intensas cuya contribución al contenido total fue igual o mayor que
0,1% del total del volumen, 78 manchas se identificaron como comunes en todos los geles y siete
estuvieron ausentes en uno ó dos de los mismos.
Los geles analíticos 2D de pI 4 - 7 también se investigaron con el programa de edición de imágenes
y en éstos se obtuvieron 512 manchas comunes y 47 no estuvieron presentes en uno ó dos geles.
Mientras que, cuando se consideró sólo la contribución de las manchas que representaban igual o
más del 0,1% del volumen total, se evidenciaron 275 manchas y se redujo a nueve la cantidad de
manchas no pareadas.
Para analizar las similitudes existentes entre los geles de interés se realizaron gráficos de dispersión
con la ayuda del programa Melanie III, gráficos que mostraron la distribución obtenida al comparar
los valores del porcentaje de volumen de las manchas pareadas en cada gel analizado con respecto
al gel de referencia (Lote A) y la línea de ajuste. En la figura 15 aparecen estos gráficos para los
geles analíticos de rango de pI 3-10 y pI 4-7, respectivamente.
Al comparar los gráficos de cada figura entre sí, se apreció una distribución similar de los valores. En
todos los casos se obtuvieron relaciones lineales con coeficientes de correlación cercanos a la
unidad, indicando un buen ajuste de la recta obtenida y sin corrimientos de los valores de cada gel
con respecto al empleado como referencia (apreciable en la ecuación de la recta).
Resultados y Discusión
70
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
120 kDa
15 kDa
A
A
120 kDa
15 kDa
B
B
120 kDa
15 kDa
pI: 10.0
C
pI: 3.0
pI: 7.0
C
pI: 4.0
Fig. 14. Electroforesis bidimensionales analíticas de tres lotes de producción de IFA. Izquierda: Rango de separación pI 3-10.
Derecha: Rango de separación pI 4-7.
Resultados y Discusión
71
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
El lote B y el A (referencia) tuvieron 269 pares de manchas y un coeficiente de correlación para la
recta de 0.99, al igual que la figura correspondiente al lote C con respecto al A (con igual coeficiente)
y 248 manchas pareadas (figura 15a y 15b). En las figura 15c y 15d se aprecia el mayor número de
manchas pareadas, 540 y 550 pares entre los lotes B y C y el lote A, respectivamente (por la
expansión en el rango de separación, como se explicó anteriormente), donde se mantuvo un alto
coeficiente de correlación cercano a 0,96. En ambos casos la ecuación de la recta obtenida indicó
que, en el gel de referencia, el valor del porcentaje de volumen de la mayoría de las manchas
pareadas varió ligeramente en relación con los geles analizados. Existió un 3% menos en el gel A
(referencia) que en el B y un 10% más en el gel A en comparación con el C, comportamiento que
pudo deberse a pequeñas variaciones experimentales como a las variaciones en la intensidad de la
tinción.
3.2.2 Identificación de las proteínas por espectrometría de masas
A partir de los geles bidimensionales preparativos de los rangos de pI 4-7 y pI 6-11 se extrajeron las
manchas de proteínas y se digirieron con tripsina. Los péptidos obtenidos fueron analizados por
espectrometría de masas (ESI-MS y ESI-MS/MS).
Las proteínas se identificaron a través de la huella de la molécula de los péptidos, método que se
conoce por su sigla en inglés PMF (Peptide Mass Finger), bajo los siguientes criterios: a) la
identificación de los PMF obtenidos con el uso de los programas de búsqueda (ProFound y
MASCOT) y las bases de datos (NCBI y Swiss-Prot) y en bacterias como categoría taxonómica,
donde se consideró a las proteínas de N. meningitidis como el candidato más probable; b)
secuencias de coberturas (≥20%); c) las señales más intensas del espectro son explicadas desde
un punto de vista secuencial; d) un mínimo de cinco péptidos coincidentes con una exactitud de
masa menor que 0.05 Da.
Cuando no se cumplieron los criterios mencionados, la identificación se confirmó mediante el análisis
de los espectros MS/MS, a través de la información estructural y la reconstrucción de la secuencia
aminoacídica de los péptidos con el uso del programa MASCOT.
Algunas proteínas, generalmente los componentes mayoritarios de las VME, se identificaron
repetidamente en varias localizaciones (figura 16 y anexo 18), lo que evidenció la presencia de
fragmentos con diferente migración en los valores de pI y de masa impredecibles. La PME clase 3
se identificó en 12 manchas y constituyó la entidad más frecuente. Se detectaron también algunos
componentes minoritarios como la proteína citoplasmática conocida como factor G de elongación,
Resultados y Discusión
72
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
proteína que se identificó en cuatro manchas (anexo 18). En sentido general, la heterogeneidad no
sólo correspondió a los valores de pI (patrón horizontal) sino también con la masa.
a)
c)
b)
d)
Fig. 15. Gráfico de dispersión del volumen de mancha (%) de electroforesis bidimensionales analíticas de tres lotes A, B y C del IFA.
Izquierda: Rango de separación pI 3-10. Derecha: Rango de separación pI 4-7. a y c) Comparación lote B y lote A. b y d) Comparación Lote
C y Lote A.
Resultados y Discusión
73
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
La presencia de mezcla de proteínas se detectó en la mancha 29. Mediante la identificación por
PMF, la proteína más abundante fue la L9 (50S ribosomal) y por el análisis ESI-MS/MS se identificó
un sólo péptido de la PME clase 3.
Entre las 78 manchas seleccionadas (figura 16), 65 se caracterizaron satisfactoriamente y entre
ellas, 31 correspondieron a las proteínas específicas, mientras que las otras 34 pertenecieron a
componentes minoritarios de los cuales no se obtuvo información alguna. El resumen de las
proteínas identificadas se presenta en el anexo 18.
En este trabajo se identificaron 11 PME (anexo 18); cinco correspondieron a las PME mayoritarias,
representando entre el 58 y 65% del total de proteínas presentes.
De acuerdo a las predicciones genómicas (Tetlein y col, 2000; Parkhill, y col, 2000; y Tettlein y col,
2004), se esperaba identificar un mayor número de PME, resultado que pudo estar influenciado por
las dificultades señaladas en la solubilización de la membrana, lo que constituye un factor limitante
en la resolución de la electroforesis bidimensional (Churward y col, 2005). Otro factor que pudo influir
en los resultados fue la ausencia de algunas PME en las VME, debido a su baja expresión durante
los cultivos in vitro, así como a su pérdida o disminución en los procesos de purificación, aspecto
que pudiera estar relacionado con lo discutido en el acápite 3.1.2.1.
Además de las PME ya analizadas en el presente trabajo, se identificaron otras 20 proteínas
citoplasmáticas como componentes minoritarias de las VME (anexo 18). De éstas, 11 pertenecieron
a pequeñas moléculas metabólicas, grupo donde se incluyen las clases funcionales relacionadas
con la energía y la biosíntesis de los aminoácidos. Las nueve proteínas restantes se identificaron
como macromoléculas metabólicas, estructuras vinculadas con la síntesis y modificación de las
mismas. Dentro de estas últimas se encontró una enzima amino peptidasa, compuesto que pudiera
tener alguna participación en la degradación de las proteínas mayoritarias, lo que dada su
importancia debe ser objeto de estudios posteriores.
La evidencia de un gran número de PME y otras proteínas citoplasmáticas que pudieran estar
asociadas con éstas y no estudiadas hasta el presente respecto a su contribución con la inmunidad,
pudiera explicar el comportamiento referente a la protección, mecanismo relacionado hasta la fecha
sólo con las proteínas mayoritarias y sobretodo con la PorA, porina que por su gran variabilidad
antigénica induce una respuesta serotipo específica. (Perret y Pollard, 2005; Mukhopadhyay y col,
2005). Sin embargo, diferentes estudios clínicos realizados con VA-MENGOC-BC® demuestran
también su actividad heteróloga (de Moraes y col, 1992; Zollinger, 1998), respuesta inmunogénica
Resultados y Discusión
74
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
Fig. 16. Electroforesis bidimensionales preparativas del IFA. Imagen integradas a partir de geles en el rango de separación pI 4-7 y
pI 6-11. Los números mostrados corresponden a las proteínas identificadas en el anexo 18.
Resultados y Discusión
75
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
que se incrementa con la aplicación de una tercera dosis (Perkins y col, 1998; Tappero y col, 1999) y
que pudiera estar relacionado con la presencia de componentes minoritarios en las VME (Boutriau y
col, 2006).
En este estudio se evidenciaron componentes minoritarios como la “OMP 85”, proteína que se
identificó en la mancha 6, conservada en la especie y otras bacterias gramnegativas que es esencial
para la viabilidad. Se evidenció también la NspA, otra proteína conservada y de gran interés por
poseer actividad bactericida (Danzing, 2004). Las proteínas ribosomales están asociadas con las
membranas y son cruciales en la biogénesis y translocación de las membranas. Existen varios
estudios que indican para las proteínas ribosomales de los patógenos una alta actividad
inmunogénica (Matsuoka y col, 1997; Iborra y col, 2003). Lo anterior pudiera estar relacionado con el
hecho de que los ribosomas constituyen alrededor del 25% del peso seco de las bacterias y por otra
parte, existe una alta identidad secuencial (>85%) entre las proteínas ribosomales S2, L6, L9 y L25
de varias bacterias (Lecompte y col, 2002). En este trabajo se evidenció la presencia en las VME de
las proteínas ribosomales S2, L6, L9, L11 y L25.
3.2.3 Conclusiones parciales del análisis de los componentes proteicos en las VME
¾ Se evidenció la utilidad de la electroforesis bidimensional para la demostración de la
consistencia en la presencia de proteínas constituyentes de las VME, estructuras que por su
compleja composición resultan difíciles de analizar por los métodos utilizados tradicionalmente.
¾ La combinación de la electroforesis bidimensional con la espectrometría de masas mostró la
presencia de otros componentes minoritarios de la membrana externa, así como de otras
estructuras celulares relacionadas; componentes que pudieran resultar útiles para profundizar en
el conocimiento de los mecanismos de la inmunidad de VA-MENGOC-BC®, aspecto que aún no
está esclarecido totalmente.
¾ La caracterización realizada da respuesta al escenario regulatorio actual, con un conocimiento
mas profundo de la composición de las VME, aspecto que puede servir de base para el
desarrollo de nuevas generaciones de vacunas antimeningocócicas contra el serogrupo B.
3.3 Valoración del efecto de la sacarosa en la etapa de purificación y conservación de las VME
3.3.1 Comportamiento hidrodinámico del sistema de UFT y recobrados
Se realizó la diafiltración con sacarosa al 3% a un volumen constante, con un flujo inicial de
47 L.h-1 m-2, flujo que se mantuvo sin alteración hasta el final del proceso. La diafiltración se realizó
Resultados y Discusión
76
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
con 10 lavados en 30 minutos (figura 17). El comportamiento anterior evidenció que el proceso de
diafiltración de las VME en sacarosa fue eficiente debido a una baja interacción del producto con la
membrana filtrante. Esto resulta poco común cuando se utilizan los sistemas de filtración tangencial,
métodos donde generalmente se disminuyen los flujos de filtrado durante los procesos debido a la
interacción entre los materiales filtrantes y el producto (Cardoso, 2001).
La eliminación del DOC se siguió a través de la medición de la absorbancia a 213 nm, donde este
producto tiene un máximo de absorción. La presencia del DOC disminuyó en mayor magnitud en los
primeros tres lavados, no detectándose a partir del sexto lavado. Determinaciones posteriores
mostraron un contenido menor al 2% de DOC en relación con la proteína y con la utilización de un
método que combina la CG y MS.
En algunos trabajos previos se refieren al uso de la sacarosa al 3% como un estabilizador de las
VME (Fredricksen y col, 1991; Frasch y col, 1995; Rosenqvist y col, 2001; Frasch y col, 2001),
aunque no se hace referencia al valor del pH de la solución de sacarosa durante el proceso de
diafiltración.
Está bien documentado que las VME purificadas y obtenidas a partir de la cepa CU 385/83 poseen
un punto isoeléctrico con valores que fluctúan en el rango de pH que oscila desde 4,23 a 4,54
(Martínez, 2002). Sin embargo, en las condiciones del proceso de este estudio fue necesario
garantizar un pH ≥ 7,5 para evitar la precipitación de las VME durante la diafiltración (datos no
mostrados). Basado en lo expresado anteriormente, el proceso de diafiltración se realizó en un
tampón fosfato que garantizó un pH de 7,8 ± 0,2.
Los recobrados medios para la variante de diafiltración con sacarosa fueron de 80,58% y de 69,25%
para la variante de precipitación alcohólica establecida en el proceso tradicional. No se detectaron
diferencias estadísticamente significativas entre los recobrados obtenidos en las variantes
tecnológicas (p=0.248) (figura 18).
3.3.2 Impacto de la sacarosa en las características de las VME y su pre-estabilidad
3.3.2.1 Comportamiento del pH
Los IFA en sacarosa mostraron una tendencia a la disminución del pH en el estudio de preestabilidad, aunque en ningún caso se alcanzó un pH < 7,5, valor donde las VME precipitan (figura
19a). Este resultado presentó diferencias estadísticamente significativas (p=0.023), lo que evidenció
Resultados y Discusión
77
CONFIDENCIAL
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Versión: 3
un posible signo de inestabilidad, debido a lo crítico que resulta este parámetro para mantener las
VME en suspensión.
100
1,0
Flujo Normalizado
0,8
DO (Media)
60
0,6
40
0,4
20
0,2
0
0,0
DO213nm
-1
-2
Flujo (L.h m )
80
0
1
2
3
4 5 6 7
No. Lavados
8
9 10 11
Fig. 17. Comportamiento hidrodinámico medio y cinética de eliminación de DOC del lavado con sacarosa por UFT.
Fig. 18. Recobrado de proteínas en el paso final de la purificación de VME por diafiltración con sacarosa en
comparación con la tecnología tradicional.
Resultados y Discusión
78
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
3.3.2.2 Identidad del CPME
Las VME obtenidas por diafiltración con sacarosa presentaron los mismos perfiles electroforéticos
por SDS – PAGE y WB del CPME que aquellas obtenidas por la precipitación alcohólica en el
estudio de pre-estabilidad, comportamiento que puso de manifiesto una estabilidad antigénica para
las bandas de proteínas presentes en el CPME y para el reconocimiento de los anticuerpos
presentes en la gamma globulina de referencia (figuras 19b1 y 19b2).
Estos resultados demostraron la equivalencia existente entre los CPME comparados y el
reconocimiento de la variante en estudio de los anticuerpos presentes en la gamma globulina de
referencia obtenida de humanos vacunados con lotes de VA-MENGOC-BC®, formulados a partir de
las VME procedentes de la tecnología tradicional.
3.3.2.3 Estructura vesicular
Las microfotografías electrónicas realizadas a la FC y al IFA obtenido por diafiltración con sacarosa
mostraron mayoritariamente a las VME intactas y con un tamaño que osciló entre 50 y 90 nm
(figuras 20a y 20c). Sin embargo, en el proceso precipitado con alcohol se observaron
principalmente las vesículas rotas (20b).
Los resultados referidos anteriormente evidenciaron que la precipitación alcohólica de las VME,
afectó su estructura vesicular, no así la diafiltración con sacarosa que las conservó mayoritariamente
intactas. Esta observación pudiera relacionarse con los criterios expresados por Frasch y
colaboradores (2001), artículo donde se refiere que la precipitación alcohólica utilizada
tradicionalmente en la purificación de VME, resulta drástica al proceso, recomendándose el uso de la
sacarosa para eliminar el DOC en el paso final de la purificación.
Las VME en sacarosa, en el estudio de pre-estabilidad, se mantuvieron mayoritariamente intactas, lo
que demostró su estabilidad estructural (figura 20d).
3.3.2.4 Contenido de LPS y pirogenicidad
El contenido de LPS en las VME purificadas, obtenidas luego de la diafiltración con sacarosa y de la
precipitación alcohólica (figura 21a), no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre
si, ni con relación a la FC que les dio origen (p=0.588).
Los resultados de los ensayos de pirógenos evidenciaron que las VME obtenidas por la variante
sacarosa pasaron las pruebas satisfactoriamente a una concentración de 1000 ng de proteínas.Kg-1
de peso, máxima concentración usada en la prueba, mientras que las VME obtenidas por la variante
alcohólica pasaron la prueba a la concentración de 100 ng de proteínas.Kg-1de peso.
Resultados y Discusión
79
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
a)
b1)
b2)
Fig. 19. Pre-estabilidad de VME en sacarosa comparada con las VME precipitadas con alcohol; a) Pre-estabilidad
del pH; b) Pre-estabilidad de la identidad; b1) SDS-PAGE; b2) Western-blot.
Leyenda: Líneas 1, 5 y 9 (Lotes de VME precipitadas con alcohol, t=0); Líneas 2, 6 y 10 (Lotes de VME
precipitadas con alcohol, t=37ºC- 7d); Líneas 3, 7 y 11 (Lotes de VME en sacarosa, t=0); Líneas 4, 8 y 12 (Lotes de
VME en sacarosa t=37ºC- 7d).
Resultados y Discusión
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Ejemplar No. _____
Versión: 3
a)
b)
c)
d)
Fig. 20. Microfotografías electrónicas de VME; a) Fracción cromatográfica; b) VME precipitadas con alcohol. Pre-estabilidad de la
estructura vesicular en sacarosa; c) VME (t=0); d) VME (t=37ºC- 7d).
Resultados y Discusión
81
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
Los resultados anteriores demostraron que la pirogenicidad en el conejo estuvo principalmente
asociada con la presentación del LPS dentro de la estructura vesicular, más que con el contenido
absoluto del mismo. Ya en investigaciones previas (Frasch y col, 2001) se señala que el LPS libre es
100 veces más tóxico que cuando está asociado con las VME, pero no refiere el comportamiento de
éste en vesículas con afectación estructural. En este trabajo de tesis, el LPS asociado con las VME
mayoritariamente intactas fue 10 veces menos pirogénico, como mínimo, que aquel asociado con las
VME afectadas estructuralmente, luego del proceso de precipitación alcohólica.
Los IFA correspondientes a la variante en sacarosa en el estudio de pre-estabilidad pasaron
satisfactoriamente la prueba de pirógeno a una concentración de 1000 ng de proteína. Mientras que,
los IFA procedentes de la variante alcohólica pasaron la prueba satisfactoriamente a una
concentración de 100 ng. El comportamiento en ambas variantes fue similar al encontrado al inicio,
demostrándose que la actividad pirogénica de los preparados se mantuvo estable.
3.3.2.5 Contenido de endotoxinas
Cuando se comparó el contenido de endotoxina en los preparados experimentales que contenían las
VME procedentes de ambas tecnologías se observó que se cumplieron la especificación establecida
(10000 UE.50μg-1 de proteínas), resultado que no se correspondió con los de pirogenicidad en los
conejos, donde los preparados vacunales obtenidos por la variante alcohólica no pasaron las
pruebas a una concentración de 500 ng de proteínas.Kg-1 de peso, mientras que los preparados
logrados por la variante en sacarosa pasaron la prueba a una concentración de 1000 ng.Kg-1 de
peso.
En este acápite se refuerza el criterio de que la pirogenicidad en los conejos está más asociada con
la conformación del LPS en las VME, que con el contenido de éste, no así la actividad endotóxica,
observación que no está esclarecida en la bibliografía consultada.
La actividad endotóxica aumentó en el estudio de pre-estabilidad de los preparados vacunales
obtenidos a partir de ambas variantes, aunque no sobrepasó el límite de 10000 UE por 50 μg de
proteína recomendado por Frasch y colaboradores (2001), para vacunas de VME del serogrupo B
(figura 21b), detectándose diferencias globales (p=0.004, ANOVA de un factor). Al realizar los
análisis post hoc se obtuvo que el grupo con alcohol en tiempo cero difiere del alcohol detectado
luego del tratamiento térmico (p=0.008).
Resultados y Discusión
82
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Versión: 3
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3.3.2.6 Inmunogenicidad
La respuesta inmune de los ratones inoculados con los preparados vacunales formulados con las
VME purificadas, procedentes de ambas variantes en comparación y evaluados por el método de
ELISA fueron similares, sin embargo, el estudio de pre-estabilidad mostró que en los preparados
vacunales obtenidos por la variante en sacarosa, se observó una tendencia a la disminución de los
valores de UIgG.mL-1. En la variante alcohólica el comportamiento fue diferente y no se evidenció
esta tendencia, a pesar de que en esta variante constituyó una condición mucho más severa, si se
tiene en cuenta que las VME precipitadas en alcohol se conservaron a -70 0C, a diferencia de las
VME en sacarosa que se mantuvieron entre 2-8 ºC (figura 21c).
El análisis estadístico realizado detectó diferencias significativas globales (p=0.008, ANOVA de un
factor). Al realizar el análisis post hoc, se obtuvo que el grupo de la variante en sacarosa del estudio
de pre-estabilidad difiere de la variante alcohólica en esta misma condición (p=0.005). El resto de las
diferencias no fueron estadísticamente significativas (p>0.05). Este comportamiento puso de
manifiesto un signo de inestabilidad de las VME en sacarosa, aspecto no referido por otros autores.
Luego de la aplicación de una y dos dosis, los anticuerpos funcionales medidos por la ABS de los
ratones inmunizados con los preparados vacunales formulados a partir de las VME purificadas y
procedentes de las variantes comparadas fueron similares. Es de destacar que después de aplicar la
segunda dosis, la ABS se incrementó entre cuatro y cinco logaritmos. En el estudio de preestabilidad la ABS para ambas variantes mantuvo un comportamiento similar en cuanto a la
respuesta inmune observada después de administrar la primera dosis, resultado que no fue
estadísticamente significativo (p>0.05). Sin embargo, la respuesta inmunogénica de los ratones tras
aplicar una segunda dosis del preparado vacunal, se afectó en cuatro logaritmos como promedio
(figura 21d). Este comportamiento resultó estadísticamente significativo para ambas variantes
(p<0.05) y predice que durante la conservación pueden afectarse epítopes antigénicos vinculados
con la producción de anticuerpos con actividad bactericida, comportamiento que no está descrito
para vacunas de VME conservadas en sacarosa.
Resultados y Discusión
83
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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3.3.3 Comportamiento general del efecto de la sacarosa en el proceso y conservación de las
VME
Las VME conservadas en sacarosa mostraron una actividad pirogénica 10 veces menor (como
mínimo) que las tortas obtenidas por precipitación alcohólica, con un comportamiento similar en
relación a la respuesta inmune por ELISA así como mediante la determinación de anticuerpos
Fig. 21. Contenido de LPS y pre-estabilidad de la actividad endotóxica e inmunogenicidad de VME en sacarosa comparadas con VME
precipitadas con alcohol; a) Contenido de LPS en FC y VME purificadas; b) Pre-estabilidad de la actividad endotóxica; c) Preestabilidad del contenido de UIgG.mL-1 en ratones inmunizados con 25 µg de proteínas; d) Pre-estabilidad de la ABS en ratones
inmunizados con una y dos dosis de 25µg de proteínas.
Resultados y Discusión
84
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
funcionales por ABS, en un proceso que requiere 27 horas menos necesarias para realizar la
precipitación y los lavados alcohólicos y permite la salida de 14 centrífugas preparativas con una
reducción de las áreas de producción en 100 m2.(anexo 19).
Los estudios de pre-estabilidad de las VME en sacarosa mostraron que la estructura vesicular no se
afectó y mantuvo estable su pirogenicidad. Sin embargo, la potencia inmunogénica de la variante en
sacarosa se afectó luego de la aplicación de una y dos dosis tanto en la respuesta de anticuerpos
tipo IgG (ELISA) como en la respuesta de anticuperpos funcionales (ABS).
Esta evidencia de inestabilidad antigénica hizo imposible seleccionar la variante en sacarosa como
método de eliminación del DOC en el paso final de la purificación de las VME. No obstante, los
resultados obtenidos en cuanto a la disminución apreciable de la pirogenicidad de esta variante y las
otras ventajas referidas, hacen pensar en la búsqueda de una solución tecnológica que permita su
estabilidad antigénica.
Teniendo en cuenta lo anteriormente señalado se decidió evaluar la conservación de las VME como
MG en sacarosa adsorbidas en HA concentrado a pH = 6,5 y 7,5. El valor inferior seleccionado
correspondió a la especificación de la vacuna antimeningocócica BC, utilizada como referencia en
este estudio. Se incorporó la evaluación de la conservación a un pH superior debido al conocimiento
previo de que las VME en sacarosa a pH = 6,5 precipitan y no se ha evaluado sí este
comportamiento pudiera afectar la estabilidad de esta forma de conservación.
3.3.4 Pre-estabilidad de las VME en sacarosa adsorbida en gel de hidróxido de aluminio
3.3.4.1 Comportamiento del pH
En el estudio de pre-estabilidad los valores de pH para las variantes 6,5 y 7,5 de los IFA aumentaron
ligeramente (figuras 22a1 y 22a2). En ambos casos no se detectaron diferencias significativas con
respecto a los valores iniciales de pH y se obtuvo la misma significación estadística (p=0.109). Este
comportamiento fue diferente al analizado para las VME conservadas en sacarosa, donde en los
estudios de pre-estabilidad se observó una disminución del pH, resultado que mostró diferencia
estadísticamente significativa (figura 19a).
3.3.4.2 Actividad endotóxica
La actividad endotóxica de los preparados vacunales obtenidos tuvo un comportamiento similar para
las variantes en estudio, tanto al inicio como en el estudio de pre-estabilidad, donde se observó una
tendencia a su disminución (figura 22b). Esta diferencia no fue significativa para un mismo pH entre
los diferentes tiempos (p=0.285 y p=0.109).
Resultados y Discusión
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La tendencia observada fue diferente a la que se presentó para las VME conservadas en sacarosa o
precipitadas con alcohol, donde los contenidos de endotoxinas tuvieron la tendencia de aumentar en
los estudios de pre-estabilidad del IFA (figura 21b).
3.3.4.3 Inmunogenicidad
Los preparados vacunales obtenidos con los IFA en el estudio de pre-estabilidad de las dos
variantes evaluadas, presentaron un comportamiento similar referente a la respuesta inmune por
ELISA (figura 22c), no detectándose diferencias significativas en ninguna de las comparaciones
(p>0.05) lo que fue diferente al comportamiento observado para los preparados obtenidos a partir de
las VME en sacarosa sin adyuvar (figura 21c), donde se evidenció una tendencia a la disminución de
los valores de UIgG.mL-1.
Al analizar los preparados vacunales obtenidos de los IFA en el estudio de pre-estabilidad se
observó un comportamiento similar en cuanto a la respuesta por el ABS después de aplicar ambas
dosis (primera y segunda) y aunque, no se detectaron diferencias estadísticas significativas (p>0.05)
se observó una tendencia al incremento de los títulos de anticuerpos después de aplicar la segunda
dosis (figura 22d).
El comportamiento observado en la evaluación de los MG fue diferente al obtenido en el ensayo
correspondiente a la conservación de los IFA en sacarosa sin adyuvar o en las tortas alcohólicas, las
que en los estudios de pre-estabilidad referidos en la figura 21d, mostraron una afectación de la
respuesta inmune en la ABS, sobre todo después de administrar la segunda dosis.
3.3.4.4 Comportamiento general de la conservación de las VME en sacarosa adsorbida en HA
como monograneles
En los estudios de pre-estabilidad se evidenció que el HA evitó afectaciones en las características de
las VME conservadas en sacarosa al 3% referente al pH, actividad endotóxica e inmunogenicidad. El
efecto protector del HA en la conservación de los epítopes antigénicos y el cambio de tendencia con
relación a la actividad endotóxica fue independiente del valor del pH de los MG. De esta forma se
superó el inconveniente presentado en la variante de conservación en sacarosa, situación donde se
evidenció una tendencia a la disminución del pH, el aumento de la actividad endotóxica y la
disminución de la respuesta inmune en los estudios de pre-estabilidad, lo que hizo inferir una posible
inestabilidad en las condiciones de almacenamiento previstos entre 2 y 8 ºC.
Resultados y Discusión
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Fig. 22. Pre-estabilidad de VME en sacarosa adsorbidas en HA conservadas como monograneles a pH = 6.5 y 7.5; a) PH = 6.5;
b) PH = 7.5; c) Actividad endotóxica; d) Contenido de UIgG.mL-1 en ratones inmunizados con una dosis de 25 µg de proteínas; e)
ABS de ratones inmunizados con una y dos dosis de 25 µg de proteínas.
Resultados y Discusión
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La tendencia observada respecto a la estabilidad general de las VME conservadas como MG unido a
la considerable reducción de la pirogenicidad de las VME en sacarosa demostrada con relación a la
variante alcohólica, hace atractiva esta forma de presentación de las VME.
La variante de las VME en sacarosa adsorbida como MG facilita la producción de vacunas que no
contengan PC, ya que la sacarosa estabiliza las VME, evita su agregación y la presencia de
partículas, aspectos que pueden afectar la inmunogenicidad de los preparados vacunales (Frasch,
1995 y Frasch y col, 2001).
Los resultados obtenidos evidenciaron la posibilidad de conservar las VME en sacarosa a pH = 6,5
cuando las mismas están adsorbidas en gel de HA, a diferencia de las VME en sacarosa que
precipitan con este valor de pH. Al parecer, la interacción electrostática fuerte entre proteína – HA,
basado en la diferencia de los puntos de carga cero, para las VME y el HA facilitó su unión, evitó la
agregación y su precipitación. Estos resultados por su originalidad no han podido ser discutidos con
los de otros autores, ya que no existen referencias de este tipo de enfoque tecnológico para
garantizar la estabilidad de las VME en sacarosa.
Por todo lo anteriormente expuesto se decidió continuar los trabajos con las VME adsorbidas a
pH = 6,5 y utilizar este valor en los preparados vacunales obtenidos a partir de esta variante
tecnológica, similar a las ya establecidas para la vacuna antimeningocócica BC tradicional,
compuesto que mantiene una alta estabilidad.
3.3.5 Conclusiones parciales de la introducción de la sacarosa en la etapa de purificación y
conservación de las VME
¾ La introducción de la sacarosa en el proceso y conservación de las VME permitió reducir, como
mínimo, 10 veces la pirogenicidad, en relación con las VME precipitadas en alcohol, con una
identidad proteica y actividad endotóxica equivalente, sin afectación de la potencia
inmunogénica al ser adsorbidas previamente en HA.
¾ El proceso con sacarosa resultó más eficiente debido a la considerable disminución de los
tiempos del proceso, del equipamiento y las áreas necesarias, posibilitando la reducción de
350 000 USD del presupuesto previsto para la remodelación de esta etapa del proceso
¾ Las VME en sacarosa y adsorbidas en HA se mantuvieron estables bajo las condiciones de
estrés.
Resultados y Discusión
88
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
3.4 Evaluación de las cepas epidémicas en el proceso de obtención de las VME
3.4.1 Evaluación de las cepas a escala piloto
Las cinéticas del crecimiento y el pH de cinco cepas epidémicas clasificadas como B:4:P1.7,2-4, en
comparación con la cepa vacunal CU 385/83 mostraron potencialidad para el crecimiento con
cinéticas características de cultivos a partir de los inóculos en fase logarítmica (figura 23). El
crecimiento a las seis horas de cultivo no evidenció diferencias significativas (p=0.068).
En los cultivos de todas las cepas se observó una disminución del pH a las tres primeras horas, con
un aumento progresivo del mismo hasta la sexta hora, comportamiento característico de la cepa
vacunal cubana y de otras cepas del serogrupo B, aspecto relacionado con el metabolismo de la
glucosa y descrito también por Fu y colaboradores (1995). Este comportamiento hace que no sea
necesario el ajuste del pH en los cultivos, procedimiento que también se señala por otros autores,
generalmente para el serogrupo B (Frasch y col, 2001).
Las cepas NZ 98/153, NZ 98/223, NZ 98/228 y NZ 98/124 presentaron un perfil electroforético similar
a la cepa CU 385/83 en las diferentes etapas de cultivo cuando se extrajeron los CPME con Cloruro
de Litio, etapa donde se demostró la presencia de las proteínas mayoritarias de clase 1, 3, 4 y 5 con
igual focalización. En la etapa de fermentación, también se observó la presencia de proteínas de alto
peso molecular, en especial la de 70 kDa. La cepa NZ 98/018 tuvo un comportamiento diferente y no
expresó las proteínas de alto peso molecular (figuras 24, 25 y 26).
Las cepas NZ 98/124 y NZ 98/228 mostraron perfiles electroforéticos similares a la cepa vacunal
cuando las VME se extrajeron con DOC y se separaron por ultracentrifugación, etapa donde se
evidenciaron las proteínas mayoritarias de clase 1, 3, 4 y 5, así como una marcada presencia de la
proteína de alto peso molecular de 70 kDa. Las cepas NZ 98/153, NZ 98/018 y NZ 98/223,
mostraron perfiles electroforéticos diferentes a los de la cepa CU 385/83 con un aparente
desdoblamiento de las proteínas de clase 1 y 3 y la ausencia de la proteína de 70 kDa, antígenos
que son fundamentales en la composición de las vacunas de VME, por su capacidad de inducir
anticuerpos con actividad bactericida (Zollinger, 1998; Frasch y col, 2001; Urwin, 2003; Holst, 2005).
De acuerdo a los resultados descritos anteriormente se decidió descartar estas cepas como
candidatas para la cepa vacunal.
Los resultados hasta aquí presentados a escala piloto muestran la conveniencia de continuar las
evaluaciones con las cepas NZ 98/124 y NZ 98/228 a escala de producción y con las condiciones
previamente establecidas para la cepa CU 385/83.
Resultados y Discusión
89
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
10
8
7.8
7.6
7.4
7.2
7
6.8
6.6
6.4
6.2
6
pH
DO530nm
1
DO
pH
Tiempo (h)
0.1
0
1
2
3
4
5
6
DO
pH
Tiempo (h)
0.1
2
3
4
5
6
10
2
3
4
5
6
7
8
7.8
7.6
7.4
7.2
7
6.8
6.6
6.4
6.2
6
pH
DO530nm
1
DO
pH
Tiempo (h)
0.1
0
8
7.8
7.6
7.4
7.2
7
6.8
6.6
6.4
6.2
6
pH
1
DO
pH
Tiempo (h)
0.1
1
1
1
2
3
4
5
6
7
d) Cepa NZ98/223
DO530nm
0
0.1
7
c) Cepa NZ98/153
10
pH
Tiempo (h)
0
8
7.8
7.6
7.4
7.2
7
6.8
6.6
6.4
6.2
6
pH
1
1
DO
b) Cepa NZ98/124
DO530nm
0
8
7.8
7.6
7.4
7.2
7
6.8
6.6
6.4
6.2
6
pH
DO530nm
1
7
a) Cepa NZ98/018
10
10
2
3
c) Cepa NZ98/228
4
5
6
7
10
8
7,8
7,6
7,4
7,2
7
6,8
6,6
6,4
6,2
6
pH
DO530nm
1
DO
pH
Tiempo (h)
0,1
0
1
2
3
4
5
6
7
d) Cepa CU385/83
Fig. 23. Cinéticas medias de crecimiento y pH en MFM de cinco cepas de N. meningitidis serogrupo B aisladas durante la
epidemia de Nueva Zelanda y la cepa CU385/83.
Resultados y Discusión
90
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
Líneas 1 y 8: Patrón de VME purificada
Línea 2: CPME de la cepa CU385/83 extraído con
Cloruro de Litio al inóculo
Línea 3: CPME de la cepa CU385/83 extraído con
Cloruro de Litio al final de la fermentación
Línea 4: CPME de la cepa CU385/83 extraído con
DOC al final de la fermentación
Línea 5: CPME de la cepa NZ98/153 extraído con
Cloruro de Litio al inóculo
Línea 6: CPME de la cepa NZ98/153 extraído con
Cloruro de Litio al final de la fermentación
Línea 7: CPME de la cepa NZ98/153 extraído con DOC
al final de la fermentación
Fig. 24. SDS-PAGE de los CPME extraídos con Cloruro de Litio durante el proceso de cultivo y con DOC al final de la
fermentación de las cepas CU385/83 y NZ98/153 cultivadas en MFM a escala piloto.
Línea 1: CPME de la cepa NZ98/223 extraído con Cloruro de
Litio al inóculo
Línea 2: CPME de la cepa NZ98/223 extraído con Cloruro de
Litio al final de la fermentación
Línea 3: CPME de la cepa NZ98/223 extraído con DOC al final
de la fermentación
Líneas 4: Patrón de VME purificada
Línea 5: CPME de la cepa NZ98/018 extraído con Cloruro de
Litio al inóculo
Línea 6: CPME de la cepa NZ98/018 extraído con Cloruro de
Litio al final de la fermentación
Línea 7: CPME de la cepa NZ98/018 extraído con DOC al final
de la fermentación
Fig. 25. SDS-PAGE de los CPME extraídos con Cloruro de Litio durante el proceso de cultivo y con DOC al final de la
fermentación de las cepas NZ98/223 y NZ98/018 cultivadas en MFM a escala piloto.
Línea 1: Patrón de VME purificada
Línea 2: CPME de la cepa NZ98/228 extraído con Cloruro de
Litio al inóculo
Línea 3: CPME de la cepa NZ98/228 extraído con Cloruro de
Litio al final de la fermentación
Línea 4: CPME de la cepa NZ98/228 extraído con DOC al final
de la fermentación
Línea 5: CPME de la cepa NZ98/124 extraído con Cloruro de
Litio al inóculo
Línea 6: CPME de la cepa NZ98/124 extraído con Cloruro de
Litio al final de la fermentación
Línea 7: CPME de la cepa NZ98/124 extraído con DOC al final
de la fermentación
Fig. 26. SDS-PAGE de los CPME extraídos con Cloruro de Litio durante el proceso de cultivo y con DOC al final de la
fermentación de las cepas NZ98/228 y NZ98/124 cultivadas en MFM a escala piloto.
Resultados y Discusión
91
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
3.4.2 Evaluación de las cepas NZ 98/124 y NZ 98/228 por la tecnología tradicional a escala
industrial
El crecimiento bacteriano de las cepas NZ 98/124 y NZ 98/228 en los medios y condiciones de
cultivo establecidos para la cepa CU 385/83, mostraron la potencialidad de crecimiento de ambas
cepas a esta escala (figura 27).
La identidad de los CPME por SDS-PAGE en las diferentes etapas del proceso fue muy similar para
ambas cepas. En las FC obtenidas se evidenció la presencia de un perfil electroforético similar a las
logradas a partir de la cepa CU 385/83 (figuras 28a y 28b)
Los rendimientos obtenidos de proteína total vacunal en las FC de las VME, fueron
significativamente superiores (p=0.012) para la cepa NZ 98/228 (figura 29).
La respuesta de anticuerpos funcionales medidas por la ABS de los preparados vacunales logrados
a partir de las cepas NZ 98/124 y NZ 98/228, formulados con la misma composición de
VA-MENGOC-BC® mostraron la misma respuesta frente a la cepa NZ 98/228. Sin embargo, el
preparado obtenido a partir de la cepa NZ 98/228 presentó una mayor actividad frente a la cepa
NZ 98/124 que el alcanzado a partir de esta propia cepa, aspecto que está a favor de la capacidad
inmunogénica funcional de la cepa NZ 98/228 (figura 30).
Tomando en consideración los resultados obtenidos se decidió continuar las evaluaciones de
proceso con la cepa NZ 98/228 en la tecnología perfeccionada previamente para la cepa CU 385/83
(anexo 8), con el objetivo de seleccionar una cepa epidémica como vacunal, para emplearla en la
obtención de una vacuna bivalente de mayor espectro antigénico.
3.4.3 Evaluación de la cepa NZ 98/228
3.4.3.1 Cinética de crecimiento
La cepa NZ 98/228 mostró un comportamiento similar a la cepa CU 385/83 hasta la cuarta hora de
cultivo, sin embargo entre esta última y la quinta hora existió una tendencia diferente, NZ 98/228
continuó su crecimiento con una potencialidad mayor respecto a la cepa CU 385/83 y basado en el
resultado anterior se estableció su cultivo hasta la séptima hora, con el objetivo de igualar las
condiciones fisiológicas de los mismos y buscar un mayor rendimiento de las proteínas vesiculares
(figura 31).
Resultados y Discusión
92
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
3.4.3.2 Comportamiento hidrodinámico en la etapa de concentración y lavado celular
El comportamiento hidrodinámico en la etapa de concentración celular fue característico para ambas
cepas; con flujos iniciales entre 105 y 120 L.h-1.m-2, comenzando a estabilizarse a partir de los 20
DO530nm
10
1
NZ98/228
NZ98/124
Fig. 27. Cinéticas medias de crecimiento de las cepas
NZ98/228 y la NZ98/124 en MFM a escala industrial.
0,1
0
1
2
3
4
5
Tiempo (h)
6
Línea 1: Inóculo
Línea 2: Fermentación semilla
Líneas 3 – 5: Fermentación, horas de cultivo 2, 4 y 5
respectivamente
Línea 6: VME extraída
Línea 7: Concentrado de VME
Línea 8: Ultracentrifugación
Línea 9: Fracción cromatográfica
Fig. 28. SDS-PAGE de los CPME extraídos con Cloruro de Litio durante las etapas de obtención de inóculo y fermentación y con DOC
desde la etapa de extracción de VME a partir de las cepas NZ98/228 y NZ98/124 a escala industrial.
Resultados y Discusión
93
CONFIDENCIAL
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Ejemplar No. _____
Versión: 3
Fig. 29. Rendimiento de proteínas en FC de VME a partir de las cepas NZ98/124 y NZ98/228 a escala
industrial.
ABS(log2(tit,)-1)
8
6
VME-NZ98/124
VME-NZ98/228
4,00
4
2,00
2
2,00
2,00
0
Cepa-NZ98/124
Cepa-NZ98/228
Fig. 30. ABS de ratones inmunizados con una dosis de 50 ug de proteínas de los preparados
vacunales que contienen VME obtenida a partir de las cepas NZ98/228 y NZ98/124 frente a estas
mismas cepas homólogas y heterólogas.
Resultados y Discusión
94
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
minutos de la operación, con flujos aproximados de 50 y 70 L.h-1.m-2 para la cepa NZ 98/228 y CU
385/83, respectivamente. El menor valor de flujo estabilizado para la cepa NZ 98/228 puede
relacionarse con la mayor concentración de la biomasa celular a procesar. No obstante, la diferencia
en el tiempo de procesamiento no superó los 5 minutos (figura 32a)
En la etapa del lavado celular los flujos de filtrados se correspondieron con los obtenidos en la etapa
de concentración, momento donde la cepa NZ 98/228 mostró flujos de filtrados iniciales de
38 L.h-1.m-2, algo inferiores a los obtenidos para la cepa cubana, disminuyendo ligeramente durante
los lavados para ambas cepas (figura 32b). El proceso se completó en 30 minutos, alcanzándose,
luego de tres volúmenes de diafiltración, el pH = 8,5 del tampón de proceso.
El proceso de concentración y lavado de la cepa NZ 98/228 se consideró eficiente, evidenciándose
una baja interacción de la misma con la membrana, aspecto ya analizado para la cepa CU 385/83.
3.4.3.3 Rendimiento de biomasa y proteína vesicular purificada
La biomasa húmeda media concentrada a partir de la cepa NZ 98/228 fue de 14,10 g.L-1, cifra
superior a los 8,68 g.L-1 obtenidos a partir de la cepa CU 385/83, resultado esperado debido al
mayor crecimiento de NZ 98/228 (figura 33a). Existió diferencia estadísticamente significativa
(p<0.0001) entre las variantes.
A partir de las biomasas referidas se obtuvieron rendimientos de proteínas medias en el IFA de 9,0 y
12,0 mg.L-1 de cultivo para NZ 98/228 y CU 385/83, respectivamente, resultado con diferencias
estadísticamente significativas (p=0.001). A pesar de que los rendimientos obtenidos fueron
inferiores en la cepa evaluada, esta cumplió con el mínimo aceptado de 3,45 mg.L-1 de cultivo para
la cepa cubana, por lo que los rendimientos obtenidos se consideraron satisfactorios para la etapa
de desarrollo del producto (figura 33b).
3.4.3.4 Comportamiento de las proteínas en las etapas de la purificación
La cepa NZ 98/228 presentó un contenido de proteína inicial extraída tres veces superior a la cepa
cubana. Este contenido superior fue equivalente con CU 385/83 en la etapa de concentración del
extracto, evidenciándose que el mismo no estuvo asociado con las VME, ya que estas proteínas se
eliminaron por ultrafiltración tangencial con una membrana de porosidad de 100 kDa. En los pasos
restantes de la purificación, el comportamiento fue similar con la máxima eliminación de proteínas
durante la etapa de ultracentrifugación donde las VME se separaron del extracto (figura 34).
Resultados y Discusión
95
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
DO530nm
10
1
NZ98/228
CU385/83
0,1
0
1
2
3
4
5 6 7
Tiempo (h)
8
Fig. 31. Cinéticas medias de crecimiento de las cepas NZ98/228 y
CU385/83 a escala industrial.
a) 150
70
NZ98/228
CU385/83
NZ98/228
CU385/83
60
50
Flujo (L.h m )
-2
90
-1
Flujo (L.h-1m-2)
120
60
30
40
30
20
10
0
0
0
10
20
30
40
50
Tiempo (min)
60
0V
b)
1V
2V
3V
No. Lavados
Fig. 32. Comportamiento hidrodinámico medio de la concentración y lavado celular con tampón Tris-EDTA, pH 8,5 NZ98/228 y
CU385/83 a escala industrial: a) Flujo de filtrado normalizado en el tiempo en la etapa de concentración celular; b) Flujo del filtrado
normalizado por número o volumen de lavado en la etapa de diafiltración.
Fig. 33. Comparación de los rendimientos de biomasa y proteico de las VME purificadas para las cepas CU385/83 y NZ98/228. a)
Media del rendimiento de biomasa en base a peso húmedo por litro de cultivo. b) Media del rendimiento de proteínas por litro de cultivo.
Resultados y Discusión
96
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
3.4.3.5 Eliminación de contaminantes en las etapas de purificación de las VME
El contenido de LPS y el PCB respecto a las proteínas durante las etapas de extracción y
purificación mostraron comportamientos similares en ambas cepas, con aumentos durante la
concentración del extracto y una máxima disminución durante la etapa de ultracentrifugación (figuras
35a y 35b).
Es de destacar que, el contenido de LPS con relación a las proteínas presentes fue menor en las
diferentes etapas del proceso para la cepa NZ 98/228 (figura 35b).
Las FC obtenidas fueron similares en cuanto al contenido de contaminantes, demostrándose que el
proceso de purificación establecido para la cepa CU 385/83 tuvo la capacidad de obtener VME
purificadas procedentes de la cepa NZ 98/228 que cumplieron con las especificaciones de calidad
establecidas para la primera (figuras 35a y 35b).
3.4.3.6 Recobrado de proteínas en el paso de la diafiltración con sacarosa
La cepa NZ 98/228 mostró recobrados medios de proteínas (66,6%), algo inferiores a los obtenidos
con CU 385/83 (80,5%) (figura 36). Al comparar los resultados obtenidos no se detectó diferencia
estadísticamente significativa (p=0.262).
3.4.3.7 Identidad de los CPME en las VME purificadas
El perfil electroforético de los CPME presentes en las VME purificadas, procedentes de la cepa
NZ 98/228 mostró uniformidad lote a lote respecto a la composición relativa de las proteínas
presentes, demostrándose que en las condiciones del proceso establecido para la cepa CU 385/83,
las proteínas de alto peso molecular (reguladas por el hierro) se expresaron y se mantuvieron
consistentemente durante el proceso de purificación. La presencia de estas proteínas garantizó la
uniformidad del CPME. Otros candidatos vacunales demuestran inestabilidad en la presencia de
estas proteínas, aspecto considerado como una debilidad para las vacunas basadas en VME
(Corbel, 1994). Los perfiles obtenidos de la cepa NZ 98/228 fueron similares a los de la cepa CU
385/83, con una prevalencia de las proteínas de clase 1 y 3, así como las de 70 kDa y 80 kDa. Otras
proteínas (clase 4 y clase 5) se evidenciaron, aunque en una menor magnitud (figura 38).
3.4.3.8 Estructura vesicular y pirogenicidad
Las VME purificadas y obtenidas a partir de la cepa NZ 98/228 se presentaron mayoritariamente
intactas de tamaño (50 a 90 nm), similares a las VME obtenidas de la cepa CU 385/83. Este
resultado corroboró la capacidad del proceso tecnológico para garantizar que la mayoría de estas
estructuras vesiculares permanecieran intactas, estructuras que pasaron la prueba de pirógenos en
Resultados y Discusión
97
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Proteínas totales (g)
280
240
CU385/83
200
NZ98/228
160
Fig. 34. Comportamiento del contenido total de
proteínas por etapas de proceso de las cepas NZ98/228
y CU385/83. Etapas: PE (Proteínas extraídas); CP
(Concentrado
de
proteínas);
VUC
(VME
ultracentrifugadas) y FC (Fracción cromatográfica)
120
80
40
0
PE
a)
CP
300
CU385/83
NZ98/228
b)
125
200
150
100
CU385/83
NZ98/228
100
PC-B (ug/mg)
250
LPS (ug/mg)
VUC
FC
Etapa de Proceso
75
50
25
50
0
0
PE
CP
VUC
FC
Etapa de Proceso
PE
CP
VUC
FC
Etapa de Proceso
Fig. 35. Comportamiento del contenido de contaminantes en etapas de proceso de las cepas CU385/83 y NZ98/228 evaluada a
escala industrial. Etapas: PE (Proteínas extraídas); CP (Concentrado de proteínas); VUC (Vesículas ultracentrifugadas) y FC (fracción
cromatográfica): a) Contenido de LPS en base a proteína total; b) Contenido de PCB en base a proteína total.
Resultados y Discusión
98
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
Fig. 36. Recobrado de proteínas en el paso final de la
purificación de VME obtenida a partir de las cepas
CU385/83 y NZ98/228 por diafiltración con sacarosa
Fig. 37. SDS-PAGE de los CPME de lotes de VME purificadas en sacarosa: Líneas 1-6 (Lotes correspondientes a la cepa CU385/83;
Líneas 7-12 (Lotes correspondientes a la cepa NZ98/228)
Resultados y Discusión
99
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
conejos a 1000ng de proteínas.kg-1 de peso de forma consistente al igual que las VME en sacarosa
obtenidas de la cepa CU 385/83 a pesar de contener como promedio 5% de LPS respecto a la
proteína (figura 38).
3.4.4 Estudio de pre-estabilidad de las VME purificadas conservadas como monograneles
3.4.4.1 Comportamiento del pH
Las VME obtenidas a partir de la cepa NZ 98/228, conservadas como MG mostraron una ligera
tendencia al aumento del valor de pH en el estudio de pre-estabilidad. Este comportamiento fue
similar para las VME obtenidas de la cepa CU 385/83 (figura 39a). No existió diferencias
estadísticamente significativas entre los tiempos ni entre las cepas (p>0,05).
3.4.4.2 Actividad endotóxica
La actividad m, para la cepa CU 385/83, a pesar de que disminuyó su actividad endotóxica (figura
39b), los análisis estadísticos no evidenciaron diferencia significativa (p>0,05). Otro tipo de
diferencia no fue detectada (p>0,05).
3.4.4.3 Inmunogenicidad
Los preparados vacunales obtenidos a partir de las VME de la cepa NZ 98/228, mostraron una
actividad inmunógena tipo IgG en ratones, determinada por el método de ELISA. Esta actividad se
mantuvo de forma similar en los preparados obtenidos en el estudio de pre-estabilidad del
monogranel, no detectándose diferencias significativas entre los tiempos (p=0.285). Igual
comportamiento se observó con los preparados obtenidos de las VME a partir de la cepa CU 385/83
(figura 39c), donde tampoco se observaron diferencias entre los tiempos (p=0.109).
Los preparados vacunales obtenidos de las VME de los MG de la cepa NZ 98/228 mostraron
actividad bactericida, respuesta que se manifestó de igual forma cuando los preparados vacunales
se obtuvieron a partir de MG sometidos a 37 °C por 7 días, comportamiento donde no se observaron
diferencias estadísticamente significativas (p>0,05). Como cepa diana para la determinación de la
ABS se empleó la cepa NZ 98/124, la que mostró en estudios previos, una sensibilidad media
relativa a la muerte en la determinación de la ABS, en comparación con otras nueve cepas
epidémicas del mismo origen y clasificación que tienen grados de resistencia en diferentes
magnitudes (datos no mostrados). La selección de la cepa diana resultó importante en la
Resultados y Discusión
100
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
a)
b)
Fig. 38. Microfotografía electrónica de VME purificadas de N. meningitidis serogrupo B en sacarosa al 3% a partir de las cepas en
comparación: a) Cepa CU385/83; b) Cepa NZ98/228.
Resultados y Discusión
101
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
estandarización de este método, resultados similares a los obtenidos en este trabajo de tesis se
señala también por Holst y colaboradores (2005).
Un comportamiento similar de la ABS se obtuvo para el preparado de VME a partir de la cepa
CU 385/83, donde tampoco se observaron diferencias significativas (p>0,05) en el estudio de preestabilidad del MG (figura 39d).
3.4.5 Conclusiones parciales de la introducción de la cepa NZ 98/228 al proceso de obtención
de VME
¾ La cepa NZ 98/228 presentó una adecuada potencialidad de crecimiento con un perfil
electroforético del CPME similar a la cepa CU 385/83, en las etapas de producción de cultivos.
¾ Las VME purificadas de la cepa NZ 98/228 se obtuvieron con niveles de contaminantes y
composición del CPME similares a los logrados con la cepa cubana.
¾ Los rendimientos de las proteínas purificadas de la cepa NZ 98/228 fueron inferiores a los
obtenidos con la cepa cubana, aunque cumplieron con la especificación establecida para esta
cepa.
¾ Las VME obtenidas de la cepa NZ 98/228 mostraron una estructura vesicular mayoritariamente
intacta, con una actividad endotóxica y pirogénica similar a la cepa cubana.
¾ Las VME obtenidas de la cepa NZ 98/228 fueron inmunogénicas en ratones produciendo
anticuerpos tipo IgG (ELISA) y anticuerpos funcionales con actividad bactericida (ABS).
¾ Las VME adsorbidas en HA como MG fueron estables en las condiciones de estrés.
Por todo lo antes señalado la cepa NZ 98/228 se seleccionó como cepa vacunal para obtener una
vacuna bivalente en combinación con la cepa CU 385/83.
3.5 Obtención de un nuevo candidato vacunal bivalente contra N. meningitidis serogrupo B a
partir de VME
3.5.1 Antecedentes y beneficios esperados de una nueva generación de vacunas multivalente
de VME
Los estudios de eficacia realizados en Cuba y Noruega con vacunas monovalentes obtenidas a partir
de las VME de dos cepas epidémicas (4:P1.15 y 15:P1.16, respectivamente) con una prevalencia
elevada muestran resultados satisfactorios en ambos países (Sierra y col, 1991; Bjune y col, 1991).
En los últimos años se aplica en Nueva Zelanda un esquema de tres dosis con una vacuna de VME
monovalente obtenida a partir de una cepa epidémica (4:P1.4), el programa de inmunización
Resultados y Discusión
102
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
Fig. 39. Pre-estabilidad de VME en sacarosa adsorbida en HA como monogranel a pH = 6.5 procedentes de la cepa NZ98/228. a) pH;
b) Contenido de endotoxina; c) Contenido de UIgG en ratones inmunizados con 25 ug de proteínas; d) ABS de ratones inmunizados
con dos dosis de 25 ug de proteínas.
Resultados y Discusión
103
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
realizado pone de manifiesto unos resultados de inmunogenicidad y efectividad satisfactorios ante
una epidemia clonal con alta prevalencia del sero/subtipo en cuestión (Oster y col, 2007). La
respuesta inmune de estas vacunas se dirigió fundamentalmente hacia PorA, porina que se
comporta como un buen inmunógeno (Zolinger, 1998), pero muy variable en cuanto a la secuencia
de los aminoácidos expuestos en sus lazos epitópicos (Peeters y col, 1999). Los estudios de eficacia
realizados con estas vacunas no brindaron información sobre la actividad bactericida cruzada
existente entre las mismas.
En los estudios clínicos comparativos que se realizan con las vacunas VA-MENGOC-BC® y
Folkehelsa, muestran que la cubana alcanzó niveles de actividad bactericida cruzada superior,
mientras que la vacuna noruega presentó una mayor actividad frente a la cepa homóloga (Perkins y
col, 1998; Tappero y col, 1999).
En el caso de VA-MENGOC-BC® la observación anterior se refuerza con los resultados obtenidos en
Brasil durante varias campañas de vacunación con la participación de millones de personas,
concluyéndose que esta vacuna mostró la misma eficacia frente a las cepas homólogas y
heterólogas en una epidemia ocasionada por varios sero/subtipos de N. meningitidis (de Moraes y
col, 1992; Milagres y col, 1994).
Los resultados anteriores sugirieron que en VA-MENGOC-BC® están presentes otros antígenos
minoritarios conservados en la especie que le permiten este comportamiento (Zollinger, 1998).
Basado en lo anteriormente expuesto, se consideró que una vacuna que contenga al menos VME de
un sero/subtipo prevalente en el país o región donde se aplique, logrará una actividad bactericida
homóloga, pero además, si está presente en dicha vacuna una VME con actividad bactericida
heteróloga, la aplicación será óptima, ya que la misma protegería contra las cepas epidémicas
prevalentes, pero también lograría protección contra otras cepas menos representadas del
serogrupo B, cepas que pudieran emerger luego que desciendan las epidémicas predominantes,
situación que puede presentarse después de realizar campañas masivas de vacunación (Desmons y
col, 2006)
Una vacuna óptima para Europa, región donde existe una situación endémica con la circulación de
varias cepas del serogrupo B, deberá incorporar VME del sero/subtipo P1.4, perteneciente al clon ST
41/44, linaje 3, como representante de la cepa homóloga predominante y al sero/subtipo P1.15, con
actividad heteróloga bactericida demostrada, como la obtenida por la cepa CU 385/83, usada en la
Resultados y Discusión
104
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
producción de lotes comerciales de VA-MENGOC-BC® (Desmons y col, 2006). Por otra parte, estos
dos sero/subtipos representan el 68,3% de las cepas circulantes en Europa (Noah y col, 1999).
En el caso del Reino Unido, el complejo ST-41/44, linaje 3, clon al cual pertenece el subtipo P1.7-2,4
es prevalente y causa el 41,6% de los casos clínicos de ese país. El segundo lugar de prevalencia lo
ocupa el clon ST-32/ET-5, que incluye al subtipo P1.15 presente en las VME de la cepa cubana con
un 29%, por lo que una vacuna bivalente de ambos subtipos y complejos clonales cubriría el 70% de
los clones circulantes en ese país. Se espera que esta combinación evite como mínimo la ocurrencia
de 910 casos anuales de los 1 300 que notifican en el Reino Unido (Pollard, 2007).
Para otros países como Estados Unidos, región que presenta una situación endémica causada por
el serogrupo B, se podría incluir la VME del subtipo P1.7.16 como homólogo, aunque opcionalmente
de acuerdo a la circulación existente pudieran utilizarse también los subtipos: P1.1.7; P1.5,2;
P1.22a,14 y P1.14. Siempre será recomendable la inclusión de VME con actividad bactericida
heteróloga, preferiblemente derivada de la cepa CU 385/83, por los motivos ya analizados en los
párrafos anteriores (Desmons y col, 2006).
Se espera que las vacunas de VME continuarán ocupando un papel principal en el control de la EM
sobre la base de la incorporación de nuevas PorA que cubran la circulación, en condiciones
endémicas, de varios subtipos que requieran la intervención de vacunas, ya que aún no está bien
definido si las preparadas sobre bases recombinantes podrían superar algún día los resultados
alcanzados por las vacunas convencionales de VME que, aunque con limitaciones para un uso
global, logran contener epidemias causadas por el serogrupo B (Segal y Pollard, 2004; Perret y
Pollard, 2005).
3.5.2 Bases para el diseño y la composición de un candidato vacunal bivalente
Para el diseño de un candidato vacunal bivalente se consideró la situación epidemiológica de
Europa, tomándose como base a VA-MENGOC-BC®, producto de referencia, y considerado como
líder en las vacunas de VME, por haber sido la primera que se patenta y autoriza para su
comercialización desde 1987, sobre la base de los resultados satisfactorios de eficacia, seguridad y
calidad demostrados.
Esta vacuna es la única que se ha comercializado ampliamente y muestra, luego de la aplicación
masiva en Cuba y diferentes países de América Latina, ser inmunógena, efectiva y presentar un
perfil aceptable de reactogenicidad, propio de las vacunas de VME adsorbidas en un gel de HA.
Resultados y Discusión
105
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
El diseño de la vacuna bivalente, además de considerar a VA-MENGOC-BC® como producto de
referencia, tomó en consideración los siguientes criterios:
¾ Utilizar como VME con actividad bactericida heteróloga, los preparados vacunales obtenidos a
partir de la cepa CU 385/83, estructuras que se conservan en sacarosa como estabilizador y se
adsorben en HA para garantizar su estabilidad. Estas VME resultaron ser equivalentes a las
tradicionalmente utilizadas en los lotes comerciales de VA-MENGOC-BC®, en cuanto a su
identidad e inmunogenicidad, pero superiores en cuanto a la estabilidad de la actividad
endotóxica y con una disminución apreciable de la actividad pirogénica, aspecto relacionado con
la preservación de la estructura vesicular en el proceso, las que mostraron resultados
satisfactorios en los estudios de pre-estabilidad.
¾ Utilizar como VME con actividad bactericida homóloga las obtenidas a partir de la cepa
NZ 98/224, con clasificación de subtipo P1.7-2,4 y perteneciente al clon epidémico ST 41/44,
linaje 3. Estas VME se obtuvieron en las condiciones del proceso ya mejoradas para la cepa
CU 385/83, donde las VME mostraron ser buenas inmunógenas en los ratones, y presentaron un
comportamiento equivalente a las VME obtenidas a partir de la cepa vacunal cubana en cuanto
al perfil electroforético de las proteínas mayoritarias presentes, la actividad endotóxica, la
estructura vesicular y pirogenicidad, así como los resultados satisfactorios obtenidos en los
estudios de pre-estabilidad.
¾ Mantener el contenido total de proteínas de 50 µg por dosis al igual que VA-MENGOC-BC®,
pero en la nueva formulación utilizar 25 µg procedente de cada cepa. La vacuna noruega
monovalente utiliza 25 µg por dosis, así como la vacuna derivada de ella y aplicada en Nueva
Zelanda.
¾ No utilizar el PC-C como antígeno vacunal debido a que no es posible justificar su aplicación en
Europa, luego de la introducción de la vacunación masiva con MCC en los países europeos
desde hace varios años.
¾ Eliminar el uso de tiomersal como preservante debido a la tendencia de reducir o eliminar los
preservos mercuriales, principalmente en las presentaciones de monodosis. Estudios previos
realizados con VA-MENGOC-BC® demostraron que la eliminación del tiomersal de la
formulación no afecta la estabilidad del producto (datos no mostrados)
¾ Mantener la capacidad reguladora del pH de la vacuna de referencia con el empleo de un
tampón fosfato 0,7 mM.
Resultados y Discusión
106
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
¾ Ajustar en la nueva formulación las concentraciones de sacarosa al 3% con el objetivo de
estabilizar las VME y ajustar el contenido del Cloruro de Sodio necesario para garantizar una
tonicidad adecuada.
En la tabla 5 se presenta la composición por dosis de VA-MENGOC-BC® y la vacuna MenB
bivalente.
Tabla 5: Composición por dosis de VA-MENGOC-BC® y MenB bivalente
Componente
VME-B (B:4:P1.19,15)
VME-B (B:4:P1.7-2,4)
PC-C
Sacarosa
Hidrógeno Fosfato de Disodio
Dihidrógeno Fosfato de Sodio
Cloruro de Sodio
Tiomersal
Hidróxido de Aluminio
Agua para inyección
VA-MENGOC-BC®
(dosis de 0,5 mL)
50 μg
--50 μg
----0,03 mg
0,02 mg
4,25 mg
50 μg
2 mg
csp 0,5 mL
Vacuna bivalente
(dosis de 0,5 mL)
25 μg
25 μg
--15 mg
0,03 mg
0,02 mg
3,10 mg
---2 mg
csp 0,5 mL
Función
Antígeno vacunal
Antígeno vacunal
Antígeno vacunal
Estabilizador
Regulador de pH
Regulador de pH
Tonicidad
Preservo
Adyuvante
Vehículo
3.5.3 Aspectos regulatorios incorporados al proceso de obtención del IFA que facilitan el
cumplimiento de las BPF
Las VME purificadas de la cepa CU 385/83 y NZ 98/228 se obtuvieron bajo un mismo proceso
tecnológico, según el diagrama de flujo presentado en el anexo 8, diagrama que tiene incorporado
los dos cambios evaluados en este trabajo, en cuanto al perfeccionamiento de la etapa de
separación celular con la introducción de un sistema de microfiltración tangencial y la introducción de
la sacarosa en el proceso de purificación y como estabilizador de las VME. Ambos aspectos
constituían una limitante para la presentación del candidato vacunal a las autoridades regulatorias
europeas.
El primer cambio fue necesario para demostrar que esta etapa del proceso era cerrada, aséptica y
validable, y que desde el punto de vista de seguridad biológica, no implicaba riesgos para el
trabajador y el medio ambiente, al facilitarse los procesos de inactivación del sistema y del
permeado, acorde a las BPF (WHO Technical Report Series, 2003; EC, 2007). El cambio al proceso
se justificó a través de los estudios de caracterización y la demostración de su consistencia.
El segundo cambio fue necesario para disminuir los niveles de pirogenicidad recomendados para las
vacunas que contiene LPS objetivo que no se lograba alcanzar cuando las VME eran precipitadas en
Resultados y Discusión
107
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
alcohol. Se demostró que este cambio en el proceso posibilitó cumplir con los niveles de pirógenos
recomendados de pasar la prueba con la aplicación de 1000 ng.Kg-1 de peso de conejo en la IFA y
de 500 ng en la vacuna bivalente. Se demostró que la introducción de la sacarosa en el proceso no
afectó la inmunogenicidad de las VME (OMS, 2000).
La incorporación de una cepa epidémica (NZ 98/228) al proceso de obtención del IFA establecido
para la cepa CU 385/83 demostró la robustez de la tecnología utilizada, lo que servirá de base en el
futuro para que las autoridades regulatorias otorguen a las vacunas desarrolladas contra el
serogrupo B las licencias de operación farmacéutica a una tecnología establecida, donde las cepas a
emplear puedan cambiarse acorde con la situación epidemiológica, tal como ocurre anualmente con
los virus que se emplean para incorporar en las vacunas contra la gripe (Frasch y col, 2001).
3.5.4 Inmunogenicidad de los monograneles, Men B bivalente y VA-MENGOC-BC®
La actividad bactericida funcional generada por las monovacunas independientes obtenidas a partir
de las VME de las cepas CU 385/83 y NZ 98/228 fue similar a la que se observó para cada una de
ellas, luego de su unión en la vacuna bivalente (figura 40). Los resultados de esta comparación no
fueron estadísticamente significativos (p=0.197), comportamiento que ratificó que en la vacuna
bivalente no existieron interferencias inmunológicas.
Por otra parte, se evidenció que las VME procedentes de la cepa CU 385/83 en la vacuna bivalente
mostró una actividad bactericida similar a la notificada en VA-MENGOC-BC® (p=0.104), observación
que resultó valiosa porque se pudo demostrar que la nueva vacuna (Men B) mantuvo la potencia
inmunogénica de la vacuna de referencia (VA-MENGOC-BC®) y se pudo ampliar esta respuesta
hacia otra cepa epidémica predominante en la región hacia donde la vacuna va dirigida y donde la
otra cepa muestra una incidencia similar.
3.5.5 Comportamiento de los controles de calidad de lotes de VME purificados, monograneles
y vacuna Men B bivalente.
Para la selección del lote del ensayo clínico Fase III de la vacuna Men B bivalente se prepararon
varios lotes de los productos intermedios (VME purificadas y MG) y se formularon diferentes lotes de
la vacuna bivalente, para facilitar la selección del lote a emplear, y disponer además, de los datos del
comportamiento de este producto para las comparaciones requeridas con los futuros lotes de
consistencia clínica e industrial.
Resultados y Discusión
108
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
Fig. 40. ABS de ratones inmunizados con dosis de 5µg de proteínas de monovacunas de VME
de las cepas CU385/83 y NZ98/228 y con 10µg de MenB bivalente en igual número de dosis.
Fig. 41. ABS de ratones inmunizados con dos dosis de 10µg de proteínas en VME de MenB
bivalente y VA-MENGOC-BC
Resultados y Discusión
109
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
3.5.5.1 Establecimiento y comportamiento de las especificaciones de calidad y
caracterización de las VME purificadas
Se establecieron las especificaciones de calidad en cuanto a los contaminantes, considerando las
vigentes para los contaminantes de origen biológico presentes en las VME empleadas en
VA-MENGOC-BC®, tales como: contenido de LPS, PC-B y AN, además se introdujeron, para los dos
últimos compuestos, métodos más sensibles y específicos.
Se incorporaron otras determinaciones cuantitativas de acuerdo con las nuevas características de
presentación de las VME, tales como: pH, contenido de DOC y sacarosa, también se incorporó la
identidad del subtipo.
Los resultados del comportamiento de los parámetros de calidad evaluados para ambas VME
mostraron que los valores del pH se mantuvieron dentro de los límites establecidos (7,6 - 8,0) con
una tendencia al valor medio de la especificación. Esta observación resultó importante ya que para
valores de pH<7,5, precipitan las VME (figura 42a y 43a).
La concentración de las proteínas se estableció entre 1 y 2 mg.mL-1, desde el paso de diafiltración
con sacarosa. Todos los lotes cumplieron la especificación, pero un 30% de los valores se acercaron
al límite inferior (figuras 42b y 43b).
El contenido de LPS mostró un comportamiento adecuado con una tendencia a los valores medios
de la especificación (figuras 42c y 43c).
Todos los lotes cumplieron con el contenido de PC-B, aspecto que debe observarse en procesos
futuros, no obstante el 30% de los mismos se acercaron al límite de especificación establecido,
aspecto que debe cuidarse para procesos futuros (figuras 42d y 43d).
El contenido de ADN fue extremadamente bajo para las VME purificadas obtenidas a partir de
ambas cepas (figuras 42e y 43e).
En el caso del contenido de DOC, la mayoría de los valores estuvieron alrededor de 1,0% en
relación con la proteína, lo que equivale a una cifra inferior a 1 μg de DOC por dosis (figuras 42f y
43f) y aunque no se fijó un límite de especificación en esta etapa del desarrollo, se esperaban
valores inferiores al 2%, de acuerdo a lo obtenido en el proceso de diafiltración con sacarosa, tal
como se presentó en el acápite 3.3.1. Los valores obtenidos son bajos cuando se compararon con
otras vacunas licenciadas por la FDA contra la influenza (Fluarix y FluLaval), las que contienen
50 μg de DOC por dosis (FDA, 2006). La vacuna Men B Folkehelsa contiene 30% de DOC en
relación con el contenido de proteínas (7,5 μg de DOC, por dosis) (Frasch y col, 2001) y
Resultados y Discusión
110
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
para la Men B-NZ se señala una cifra del 16%, porcentaje equivalente a 4 μg de DOC por dosis
(Beakley, 2006).
Todos los lotes cumplieron la especificación del contenido de sacarosa, no obstante cuatro de ellos
estuvieron en el límite superior (figura 42g y 43g).
Se realizaron evaluaciones cualitativas de los requisitos de calidad, tales como: la identidad de los
subtipos específicos P1.4 y P1.15 que fueron satisfactorios en todos los lotes correspondientes a
cada una de las VME de acuerdo a su subtipo y se establecieron ensayos de caracterización para
verificar por microscopia electrónica, la presencia de estructuras vesiculares mayoritariamente
intactas, así como el perfil característico de las proteínas presentes en el SDS-PAGE. Todos los
lotes cumplieron con los resultados esperados.
3.5.5.2 Establecimiento y comportamiento de las especificaciones de calidad y ensayos
internos y de caracterización de los monograneles.
Se establecieron especificaciones de calidad en los monograneles acorde con las principales
características de la formulación, tales como: pH, esterilidad, contenidos y adsorción de proteínas y
aluminio. También se establecieron especificaciones, considerando los parámetros intrínsecos de las
VME como identidad de subtipo, pirógenos y potencia inmunogénica por ELISA.
Con relación al método de ELISA se incorporaron nuevos criterios de evaluación con el objetivo de
poder evidenciar mejor las diferencias entre los lotes, para lo cual se disminuyó el contenido de
proteínas a inmunizar (10 µg) y se estableció la medición de la respuesta individual de cada animal
sobre un nivel de corte de UIgG.mL-1 previamente establecido (2000 para MG-CU y 5000 para
MG-NZ). Los resultados se expresaron en función del número de animales respondedores, en lugar
de las unidades relativas de UIgG.mL-1, calculadas a partir de una mezcla representativa del suero
de los animales. Los nuevos criterios se establecieron sobre la base de un estudio previo de relación
dosis-respuesta, partiendo de las cantidades utilizadas en la evaluación de VA-MENGOC-BC®
(50 µg) hasta 10 µg (datos no mostrados).
Se caracterizaron el perfil electroforético de las proteínas presentes en las VME y la medición de la
ABS.
En el caso de la evaluación de anticuerpos funcionales por la ABS se incorporó el criterio de aplicar
dos dosis de 10 µg, y se expresó el resultado como media geométrica de la dilución donde se
produjo el 50% de la muerte bacteriana a partir de las respuestas en los sueros individuales. La
aplicación de una segunda dosis se introdujo basado en los resultados de los estudios de
Resultados y Discusión
111
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
a)
b)
Proteína (mg.mL-1)
8,2
pH
8,0
7,8
7,6
7,4
7,2
1
c)
2
3
4
d)
PC-B (ug.mg-1)
LPS (ug.mg-1)
60
40
20
0
2
3
4
f)
8
DOC (%)
ADN (ug.mg-1)
1.5
1.0
0.5
0.0
6
4
2
0
1
2
3
4
5
Lotes
1
2
3
4
5
Lotes
1
2
3
4
5
Lotes
14
12
10
8
6
4
2
0
2.0
10
1.5
1.0
0.5
0.0
1
Sacarosa (mg.mL-1)
2.0
5
Lotes
e)
g)
2.5
5
Lotes
80
1
3.0
2
3
4
5
Lotes
Fig. 42: Comportamiento de las especificaciones de
calidad en lotes de VME purificadas obtenidas a partir de
la cepa NZ98/228: a) pH; b) Contenido de proteína; c)
Contenido de LPS en base a proteína total; d) Contenido
de PC-B en base a proteína total; e) Contenido de ADN en
base a proteína total; f) Porcentaje de DOC referido a la
proteína total; g) Contenido de sacarosa.
50
40
30
20
10
1
2
Resultados y Discusión
3
4
5
Lotes
Las líneas continuas representan la media de los valores.
Las líneas discontinuas representan los límites de
especificación.
112
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
a)
b)
Proteína (mg.mL-1)
8,2
pH
8,0
7,8
7,6
7,4
7,2
1
c)
2
3
4
d)
PC-B (ug.mg-1)
-1
LPS (ug.mg )
60
40
20
0
2
3
4
f)
8
DOC (%)
ADN (ug.mg-1)
1.5
1.0
0.5
0.0
6
4
2
0
1
2
3
4
5
Lotes
1
2
3
4
5
Lotes
1
2
3
4
5
Lotes
14
12
10
8
6
4
2
0
2.0
10
1.5
1.0
0.5
0.0
1
Sacarosa (mg.mL-1)
2.0
5
Lotes
e)
g)
2.5
5
Lotes
80
1
3.0
2
3
4
5
Lotes
Fig. 43: Comportamiento de las especificaciones de
calidad en lotes de VME purificadas obtenidas a partir de
la cepa CU 385/83: a) pH; b) Contenido de proteína; c)
Contenido de LPS en base a proteína total; d) Contenido
de PC-B en base a proteína total; e) Contenido de ADN en
base a proteína total; f) Porcentaje de DOC referido a la
proteína total; g) Contenido de sacarosa.
50
40
30
20
10
1
2
Resultados y Discusión
3
4
5
Lotes
Las líneas continuas representan la media de los valores.
Las líneas discontinuas representan los límites de
especificación.
113
CONFIDENCIAL
Versión: 3
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Ejemplar No. _____
caracterización de las VME en sacarosa, comportamiento donde se apreció que con una dosis de
refuerzo se amplificó la respuesta, cuando el producto no fue sometido a condiciones de estrés,
resultado de interés para la evaluación de los lotes. No se establecieron los límites del ensayo para
este requisito de calidad, debido a no contarse con suficientes datos para fijarlas.
Los requisitos de calidad de los MG obtenidos a partir de las VME de ambas cepas referente a los
parámetros cuantitativos, estuvieron dentro de los límites de especificación establecidos, en un
análisis detallado de cada uno de ellos se constató que los valores de pH y el contenido de proteínas
en la mayoría de los lotes se acercaron al límite inferior de la especificación (figuras 44a, 44b, 45a y
45b). El contenido de aluminio en todos los lotes se mantuvo en el centro del rango de la
especificación (figuras 44c y 45c).
La actividad endotóxica mostró para ambos MG, valores medios de alrededor de 5 000
UE.50µg.proteína-1, sin observarse tendencias al límite superior (figuras 44d y 45d). La adsorción de
las proteínas en todos los lotes se mantuvo en valores muy cercanos al 90%, lo que se consideró un
comportamiento adecuado para este parámetro (figuras 44e y 45e). La potencia inmunogénica
mostró un 100% de respondedores para todos los lotes (figuras 44f y 45f), por otra parte, los títulos
de anticuerpos bactericidas expresados como el inverso del log2 del título bactericida, tuvieron
consistencia con valores alrededor de 14 para los MG provenientes de la cepa NZ 98/228 y nueve
para la cepa CU 385/83 (figuras 44g y 45g).
Los parámetros cualitativos analizados fueron la esterilidad y la identidad de las proteínas presentes
y las de subtipo así como la pirogenicidad, donde todos los lotes mostraron el comportamiento
esperado según las especificaciones.
3.5.5.3 Establecimiento y comportamiento de las especificaciones de calidad, ensayos
internos y de caracterización de la vacuna MenB bivalente
Se establecieron especificaciones de calidad de la vacuna bivalente, teniendo en cuenta las
principales características de la formulación (en particular) y los inyectables (en general) tales como:
pH, esterilidad, toxicidad inespecífica y contenido de proteínas y aluminio. En todos los casos se
mantuvieron las especificaciones de calidad ya establecidas para VA-MENGOC-BC®. Otros, como el
contenido de sacarosa, también se establecieron.
Además, se determinaron las especificaciones de calidad relacionadas con las características
intrínsecas de las VME de ambas cepas en la formulación, tales como: la identidad de los subtipos
P1.15 y P1.4, la actividad endotóxica, la pirogenicidad y la potencia inmunogénica por ELISA ante
Resultados y Discusión
114
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
a)
b)
6,8
pH
600
Proteína(mg.mL-1)
7,0
6,6
6,4
6,2
6,0
1
2
3
500
400
300
200
1
4
2
3
4
Lotes
3
4
Lotes
3
4
Lotes
Lotes
c)
d)
UE.50ug-1proteína
Al3+ (mg.mL-1)
8
7
6
5
4
3
1
100
90
80
70
3
4
Lotes
4000
2000
0
2
110
100
90
80
70
60
50
1
2
Fig. 44: Comportamiento de las especificaciones de
calidad, ensayos internos de caracterización de lotes de
monograneles (VME purificadas adsorbidas en HA, (cepa
NZ98/228): a) pH; b) Contenido de proteína; c) Contenido
de aluminio; d) Actividad endotóxica; e) Adsorciónde
proteínas; f) porcentaje de respondedores (ELISA); g)
Títulos por ABS.
20
ABS(log2tit.-1)
6000
1
f)
2
8000
4
Lotes
110
1
g)
3
Respondedores (%)
Adsorción Proteína
(%)
e)
2
10000
15
10
5
0
1
2
Resultados y Discusión
3
4
Lotes
Las líneas continuas representan la media de los valores.
Las líneas discontinuas representan los límites de
especificación.
115
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
a)
b)
Proteína (mg.mL-1)
7,0
pH
6,8
6,6
6,4
6,2
6,0
1
2
3
600
500
400
300
200
1
4
2
3
4
Lotes
3
4
Lotes
3
4
Lotes
Lotes
c)
d)
UE.50ug-1proteína
Al3+ (mg.mL-1)
8
7
6
5
4
3
1
100
90
80
70
3
4
Lotes
4000
2000
0
2
110
100
90
80
70
60
50
1
2
Fig. 45: Comportamiento de las especificaciones de
calidad, ensayos internos de caracterización de lotes de
monograneles (VME purificadas adsorbidas en HA, (cepa
CU385/83): a) pH; b) Contenido de proteína; c) Contenido
de aluminio; d) Actividad endotóxica; e) Adsorción de
proteínas; f) porcentaje de respondedores (ELISA); g)
Títulos por ABS.
15
ABS(log2tit.-1)
6000
1
f)
2
8000
4
Lotes
110
1
g)
3
Respondedores(%)
Adsorción Proteína
(%)
e)
2
10000
10
5
0
1
2
Resultados y Discusión
3
4
Lotes
Las líneas continuas representan la media de los valores.
Las líneas discontinuas representan los límites de
especificación.
116
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
ambos subtipos; en este caso, bajo los mismos principios analizados para los MG se establecieron
niveles de corte que consideraran a un animal como respondedor y estos niveles fueron: 500
UIgG.mL-1 para el componente CU y 1000 UIgG.mL-1 para el componente NZ.
Como ensayo interno y de caracterización se establecieron la adsorción de proteínas al HA, la
osmolalidad y la medición de la ABS frente a las cepas CU 385/83 y NZ 98/124; en la que se
siguieron los mismos criterios para el ensayo y los resultados referidos para los MG en 3.5.5.2.
Los lotes de las vacunas bivalentes desarrollados para seleccionar el lote de ensayo clínico
mostraron un comportamiento muy similar en cuanto al cumplimiento de los requisitos de calidad,
con muy poca variación entre ellos y una distribución muy cercana a la media, sin manifestar
tendencia hacia algún límite del ensayo y con una mayor homogeneidad en todos los ensayos en
relación con las VME purificadas y los MG, productos intermedios en la obtención de la vacuna
bivalente. Esta afirmación es válida en cuanto a la determinación del pH, contenido de proteínas,
aluminio, endotoxicidad y sacarosa (figura 46a, 46b, 46c , 46d y 46f).
Es de destacar que la adsorción de las proteínas fue mayor al 90% en todos los lotes analizados,
parámetro que resultó de gran importancia, por su relación con la estabilidad de la actividad
endotóxica y la respuesta inmune de la vacuna (figura 46e).
La osmolalidad presentó un comportamiento uniforme y todos los valores se distribuyeron muy
cercanos a la media, la que correspondió a 300mOsmol.kg-1 (figura 46g).
Este preparado bivalente mostró una inmunogenicidad alta con 100% de respondedores por el
método de ELISA frente a las VME de ambas cepas vacunales (figura 47a y 47b); similar a los
resultados obtenidos por los MG independientes. La respuesta de la ABS expresada como el
logaritmo inverso del título fue 14 para el componente P1.4 y de 10 para el componente P1.15 (figura
47c y 47d). Estos resultados coincidieron con los obtenidos a partir de los respectivos MG.
Los resultados obtenidos en las evaluaciones inmunológicas reafirmaron el criterio de que la
combinación de las VME no manifiesta interferencias.
El resto de los requisitos de calidad evaluados como la identidad de subtipos, esterilidad, toxicidad
inespecífica en curieles y ratones así como la pirogenicidad, mostraron resultados satisfactorios en
el cumplimiento de los límites establecidos para cada ensayo.
Los resultados anteriores indicaron que la producción de lotes de vacuna bivalente a granel para
ensayos clínicos fue consistente, por lo que, cualquiera de los lotes analizados pudo ser
seleccionado como el lote a utilizar en el ensayo clínico.
Resultados y Discusión
117
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
a)
b)
Proteína (ug.dosis-1)
7,5
pH
7,0
6,5
6,0
5,5
1
2
3
80
70
60
50
40
30
20
1
4
2
3
Lotes
c)
d)
Al3+ (mg.dosis-1)
1.0
10000
-1
0.9
UE.dosis
0.8
0.7
0.6
8000
6000
4000
2000
0.5
0.4
0
1
3
f)
100
90
80
70
2
3
4
Lotes
2
3
4
Lotes
45
40
35
30
25
20
15
1
2
3
4
Lotes
Fig. 46: Comportamiento de las especificaciones de
calidad, ensayos internos de caracterización de lotes de
MenB bivalente: a) pH; b) Contenido de proteínas; c)
Contenido de aluminio; d) Actividad endotóxica; e) % de
adsorción de proteínas; f) Contenido de sacarosa; g)
Osmolalidad.
400
(mOsmol.Kg-1)
1
4
Lotes
110
1
g)
2
Sacarosa (mg.mL-1)
Adsorción Proteína
(%)
e)
4
Lotes
350
300
250
Las líneas continuas representan la media de los valores.
Las líneas discontinuas representan los límites de
especificación.
200
1
Resultados y Discusión
2
3
4
Lotes
118
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
a)
b)
110
100
100
Respondedores
(%)
Respondedores
(%)
110
90
80
70
60
c)
1
2
3
Lotes
4
60
15
10
5
0
1
2
3
Lotes
4
15
ABS (log2tit.-1)
ABS (log2tit. )
70
CU (P1.15)
d)
20
-1
80
50
50
NZ (P1.4)
90
10
5
0
1
NZ (P1.4)
2
3
4
Lotes
1
CU (P1.15)
2
3
4
Lotes
Fig. 47: Comportamiento de las especificaciones de calidad, ensayos internos y caracterización de MenB bivalente: a) Porcentaje
de ratones respondedores (ELISA) inmunizados con 10µg de proteína frente VME del serosubtipo P1.4; b) Porcentaje de ratones
respondedores (ELISA) inmunizados con 10µg de proteína frente a VME del serosubtipo P1.15; c) ABS de ratones inmunizados
con dos dosis de 10µg frente a la cepa NZ 98/124; d) ABS de ratones inmunizados con dos dosis de 10µg frente a la cepa CU
385/83.
Resultados y Discusión
119
CONFIDENCIAL
Versión: 3
3.5.7
Página ____
Ejemplar No. _____
Estabilidad de vida de estante y estrés de monograneles de VME de las cepas
CU 385/83 y NZ 98/228
El estudio de la estabilidad de los MG de ambas cepas de vida de estante y de estrés mostró que
ambos MG cumplieron todos los requisitos de calidad cualitativos durante todos los tiempos y
condiciones del estudio tales como: descripción, identidad de los antígenos de serosubtipo (P1.4 ó
P1.15), así como la presencia de las bandas proteicas características (PorA, PorB, RmpM, Opc y las
de 70 y 80 kDa. También la pirogenicidad y esterilidad (anexos 20 y 21).
El pH en ambos MG se mantuvo entre los límites establecidos durante los 12 meses (anexos 20 y
21) del estudio, no mostrando diferencias estadísticamente significativas (p>0,05).
La adsorción de las proteínas en los dos MG mantuvieron valores que oscilaron entre el 91 y 95 %
durante los ensayos realizados, resultados que no mostraron diferencias significativas para las
cepas por separado (p>0,05) en los diferentes tiempos y condiciones de la investigación (figuras 48a
y 49a).
La actividad endotóxica se mantuvo estable para los MG con resultados donde no se observó
diferencia estadísticamente significativa de los estudios en ambos casos independientes, ni una
tendencia al aumento de esta característica (p>0,05).
El porcentaje de respondedores determinado por ELISA para los MG de ambas cepas se mantuvo
entre el 87 y 100% durante toda la investigación, sin mostrar una tendencia a la disminución, un
comportamiento similar se evidenció en la estabilidad del estrés. Estos resultados no fueron
significativos estadísticamente (p>0,05).
La ABS de los MG procedentes de la cepa NZ 98/228 se mantuvo en valores medios cercanos a 14
(inverso del logaritmo de la dilución), mientras que para los de la cepa CU 385/83 los valores medios
fueron cercanos a 9. El análisis estadístico no evidenció diferencia significativa para el
comportamiento de ambos MG por separado en los diferentes tiempos y condiciones del estudio
(p>0,05). Aunque se observó una ligera disminución en la última muestra analizada del MG
correspondiente a la cepa CU 385/83, lo que pudo ser debido a la variabilidad propia de los métodos
biológicos.
Los resultados obtenidos en la estabilidad de los MG en vida de estante evidenciaron que los
mismos pueden conservarse entre 2 - 8 ºC por un año, sin afectarse su identidad, pureza y potencia,
los estudios de estrés (37 ºC – 7 días) mostraron que el producto fue estable en estas condiciones,
Resultados y Discusión
120
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
lo que garantiza su estabilidad en períodos cortos fuera de las condiciones de almacenamiento
establecidas.
Fig. 48. Estabilidad de vida de estante y estrés de monograneles (VME purificadas adsorbidas en HA, (cepa NZ98/228): a)
Comportamiento de la adsorción de proteínas; b) Comportamiento de la actividad endotóxica; c) Comportamiento del
porcentaje de respondedores (ELISA); d) Comportamiento de los títulos de la ABS.
Resultados y Discusión
121
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
Fig. 49: Estabilidad de vida de estante y estrés de monograneles (VME purificadas adsorbidas en HA, (cepa CU385/83):
a) Comportamiento de la adsorción de proteínas; b) Comportamiento de la actividad endotóxica; c) Comportamiento del porcentaje de
respondedores (ELISA); d)Comportamiento de los títulos de la ABS.
Resultados y Discusión
122
CONFIDENCIAL
Versión: 3
3.5.8
Página ____
Ejemplar No. _____
Estabilidad de vida de estante y estrés de la vacuna Men B bivalente a granel
El estudio de la estabilidad de vida de estante y estrés mostró que la vacuna cumplió sus requisitos
de calidad cualitativos durante todos los tiempos y condiciones del estudio, tales como: descripción,
toxicidad específica en ratones y curieles, identidad de los antígenos de serosubtipos (P1.4 y P1.15),
pirogenicidad y esterilidad (anexo 22).
El pH se mantuvo dentro de los límites establecidos sin una tendencia marcada en su
comportamiento (anexo 22), lo que no resultó estadísticamente significativa (p>0,05).
La adsorción de proteínas se mantuvo entre el 91 y 96 % durante los diferentes tiempos y
condiciones de la investigación (figura 50a), resultados que no mostraron diferencias significativas
(p>0,05).
La actividad endotóxica se mantuvo por debajo del límite de especificación en todo el estudio, sin
mostrar tendencia (figura 50b), lo que resultó estadísticamente no significativa (p>0,05).
La inmunogenicidad de la vacuna MenB bivalente evaluada por el método de ELISA mostró un
comportamiento similar para sus dos componentes, donde el porcentaje de animales con respuesta
de anticuerpos sobre los niveles de corte establecidos se mantuvo entre el 93 y 100 % (figura 50c),
resultado que no mostró diferencias estadísticamente significativas para ambos componentes
(p>0,05).
El comportamiento de la ABS en relación al componente CU evidenció que a los nueve meses del
estudio los títulos bactericidas bajaron ligeramente con relación a los valores iniciales, lo cual no se
evidenció a los 18 meses del estudio (figura 50d). El análisis estadístico que incluyó todos los
tiempos y condiciones del estudio, no mostró diferencias estadísticas significativas (p=0,091).
La ABS del componente NZ dentro de la vacuna MenB bivalente, mostró un comportamiento similar
al referido para el componente CU, donde se observa una caída del título bactericida a los nueve
meses del estudio, los que posteriormente se incrementan a los 12 meses y más aún a los 18 meses
(figura 50e). El análisis estadístico detectó diferencias significativas en el comportamiento anterior
(p=0,1957). Cuando se realizó un análisis “post hoc” por la prueba de Conover, se observa que el
tiempo nueve meses difiere de los tiempos inicial y final y la muestra tratada a 37 ºC por 7 días
(estrés) (p<0,01), en el resto de los tiempos no se detectaron diferencias significativas entre sí
(p>0,05).
Resultados y Discusión
123
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
En general para ambos componentes se observa que los valores de actividad bactericida más bajos
en el estudio se observaron a los nueve y 12 meses, lo que pudo estar relacionado con la
variabilidad que introducen los animales en la prueba en un estudio a largo plazo, más que con una
pérdida de la capacidad del producto para producir anticuerpos funcionales con actividad bactericida.
En esta etapa del desarrollo no se fijó un límite de especificación para la ABS debido a la
introducción de un nuevo esquema de doble inmunización con 10 μg de proteínas provenientes de
5 μg de cada subtipo (P1.4 y P1.15) y no contarse con datos previos del comportamiento de este
requisito de calidad.
El estudio de la estabilidad de vida de estante del candidato vacunal Men B bivalente a granel,
demostró que la vacuna fue estable durante los 18 meses del estudio. Los resultados satisfactorios
en los estudios de estrés garantizan la estabilidad del producto en períodos cortos fuera de las
condiciones de almacenamiento establecido.
3.5.9
Conclusiones parciales de la obtención de un nuevo candidato vacunal bivalente
contra cepas de N. meningitidis serogrupo B:
¾ Se diseño una nueva vacuna bivalente basada en la combinación de VME de la cepa CU 385/83
con actividad heteróloga demostrada y de la cepa NZ 98/228 con el subtipo P1.4 prevalente en
Europa.
¾ Para el desarrollo de la vacuna bivalente se tomó como producto de referencia a
VA-MENGOC-BC®, preparado líder en el campo de las vacunas basadas en las VME contra
cepas de N. meningitidis del serogrupo B.
¾ La nueva vacuna mantuvo el contenido total de proteínas, HA y fosfatos; incorporó la sacarosa;
ajustó el contenido de Cloruro de Sodio y eliminó el uso del PC-C y el tiomersal.
¾ Los dos IFA que contiene la vacuna se obtuvieron por una misma tecnología, ambos IFA y la
vacuna bivalente desarrollados, no mostraron interferencias inmunogénicas en la combinación,
cumplieron las especificaciones de calidad establecidas y fueron estables en estudios de vida,
de estante y de estrés.
Resultados y Discusión
124
CONCLUSIONES
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
CONCLUSIONES
¾ Se perfeccionó la etapa de separación celular con el empleo de la MFT logrando aumentos en
los rendimientos de las VME, una reducción apreciable del equipamiento y áreas a utilizar y se
demostró el cumplimiento de las BPF.
¾ Se evidenció la consistencia de producción en cuanto a la presencia de proteínas en las VME
con el empleo de la 2DE de alta resolución.
¾ Se identificaron por proteómica 26 nuevos componentes en las VME, algunos de ellos con
potencial contribución a la respuesta inmune.
¾ La sacarosa redujo considerablemente la pirogenicidad de las VME y la adsorción de éstas al
HA garantizó su estabilidad como IFA.
¾ La introducción de la sacarosa al proceso de purificación disminuyó considerablemente el
número de equipos y áreas a emplear.
¾ La cepa NZ 98/228 se seleccionó como vacunal ya que bajo el mismo proceso de la cepa
cubana, se obtuvieron VME equivalentes en cuanto a su perfil de identidad, seguridad y
potencia.
¾ El nuevo candidato vacunal bivalente obtenido de la combinación de las VME de las cepas CU
385/83 y NZ 98/228 al igual que los IFA que lo componen cumplieron las especificaciones de
calidad y fueron estables en vida de estante y estrés.
125
RECOMENDACIONES
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
RECOMENDACIONES
¾ Continuar la ejecución de ensayos clínicos de la vacuna de MenB bivalente en diferentes grupos
etáreos.
¾ Remodelar las instalaciones productivas, acorde a la tecnología perfeccionada y con las
regulaciones farmacéuticas europeas.
¾ Completar el estudio de validación de procesos.
¾ Realizar la identificación de las proteínas presentes en las VME en sacarosa mediante técnicas
proteómicas.
126
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
ANEXOS
Anexo1. Estructura antigénica de Neisseria meningitidis tomado de “N England J Med 2001: 344: 1380.
http://www.nejm.org
Componente
Concentración (g/L)
Glucosa
5,00
Extracto de levadura
2,00
Fosfato de Sodio dibásico
1,99
Cloruro de Potasio
0,99
Cloruro de Sodio
6,00
Cloruro de amonio
1,25
Sulfato de Magnesio
1,23
L-Cisteína HCl
0,03
Acido. L-Glutámico
1,39
Anexo 2. Composición del medio Frantz modificado
Anexos
I
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Lote de siembra de referencia
Ð
Lote de siembra de trabajo
Ð
Obtención de Inóculo
Ð
Fermentación semilla
Ð
Fermentación
Ð
Concentración celular centrifugación continua
Ð
Obtención de biomasa por centrifugación
preparativa
Ð
Resuspensión celular
Ð
Extracción de vesículas
Ð
Clarificación del extracto
Ð
Filtración microbiológica (0.22 um)
Ð
Tratamiento enzimático con nucleasas
Ð
Lavado - concentración
Ð
Ultracentrifugación
Ð
Resuspensión del sedimento
Ð
Cromatografía de exclusión molecular
Ð
Filtración esterilizante (0.22 um)
Ð
Precipitación – lavado con alcohol
Ð
VME en torta alcohólica (IFA)
Página ____
Ejemplar No. _____
Ð
Concentración – lavado celular
por microfiltración tangencial
Ð
Anexo 3. Diagrama de flujo tradicional e identificación del cambio evaluado con la introducción de la MFT en los
procesos de obtención del IFA, VME purificadas de N. meningitidis serogrupo B
Anexos
II
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Requisito de Calidad
Concentración de
Proteínas
Contenido de LPS
Límite de Aceptación
Método de Ensayo
Referencia
1,6-6,0 mg.ml-1
Espectrofotométrico
2.1.3
20-60 μg.mg-1 de proteínas
Espectrofotométrico
2.1.6
Espectrofotométrico
2.1.7
SDS-PAGE
2.1.4
μg.mg-1 de
Contenido de PC
<10
Identidad
El perfil cromatográfico deberá
mostrar:
• Dos bandas mayoritarias en el
rango de 36 - 46 kD
• Dos bandas de alto peso
molecular en el rango de
70 - 80 kD
Tramitancia
< 32
proteínas
Espectrofotométrico
(λ = 530 nm)
Anexo 4. Especificaciones de calidad de fracciones cromatográficas de VME
Requisito de Calidad
Concentración de Proteínas
Contenido de Proteínas por
Gramo de Peso Húmedo
Contenido de LPS
Identidad
Pureza
• Contenido de AN
•
Contenido de PC
Límite de Aceptación
≥ 1,6 mg.mL-1
Método de Ensayo
Espectrofotométrico
≥ 30 mg.g-1 de peso húmedo
Espectrofotométrico
2.1.3
(20-60) μg.mg-1 de proteínas
El perfil cromatográfico deberá
mostrar:
• Dos bandas mayoritarias en el
rango de 36 - 46 kD
• Dos bandas de alto peso
molecular en el rango de
70 - 80 kD
Espectrofotométrico
2.1.7
SDS-PAGE
2.1.4
Espectrofotométrico
2.1.8
<10 μg.mg-1 de proteínas
<10 μg.mg-1 de proteínas
Espectrofotométrico
Anexo 5. Especificaciones de calidad del IFA, VME purificada de N. meningitidis serogrupo B
Anexos
Referencia
2.1.3
2.1.7
III
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Lote de siembra de referencia
Ð
Lote de siembra de trabajo
Ð
Obtención de Inóculo
Ð
Fermentación semilla
Ð
Fermentación
Ð
Concentración – lavado celular por
microfiltración tangencial
Ð
Extracción de vesículas
Ð
Clarificación del extracto
Ð
Filtración microbiológica (0.22 um)
Ð
Tratamiento enzimático con nucleasas
Ð
Lavado - concentración
Ð
Ultracentrifugación
Ð
Resuspensión del sedimento
Ð
Cromatografía de exclusión molecular
Ð
Filtración esterilizante (0.22 um)
Ð
Precipitación – lavado con alcohol
Ð
VME en torta alcohólica (IFA)
Página ____
Ejemplar No. _____
Ð
Diafiltración con sacarosa
Ð
Filtración esterilizante
(0.22 um)
Ð
VME en sacarosa 3% (IFA)
Anexo 6. Diagrama de flujo establecido con la introducción de la MFT e identificación del cambio evaluado con
la introducción de la UFT en el último paso de la purificación del IFA, VME purificadas de
N. meningitidis serogrupo B
Anexos
IV
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Requisitos de Calidad
Límite de aceptación
Método de ensayo
Referencia
Identidad de proteínas
Bandas características
Inmunogenicidad
• Contenido de IgG
• Actividad bactericida
SDS – PAGE
WB
2.1.4
2.1.10
≥ 7000 UIgG.mL-1
≥ 1/4
ELISA
ABS
2.1.12
2.1.13
≤ 10 000 UE.50mg -1 de proteína
Pasa la prueba a 1000ng.Kg-1 de
peso del conejo
Presencia mayoritaria de VME
intactas
LAL
2.1.14
Biológico
2.2.16
Microscopía
electrónica
2.1.9
Contenido de endotoxina
Pirógeno
Estructura vesicular
Anexo 7. Requisitos de calidad y metodología analítica empleadas en los estudios de pre-estabilidad de
VME obtenidas por diafiltración con sacarosa en comparación con la precipitación alcohólica como
paso final del proceso de purificación
Anexos
V
CONFIDENCIAL
Versión: 3
Página ____
Ejemplar No. _____
Lote de siembra de referencia
Ð
Lote de siembra de trabajo
Ð
Obtención de Inóculo
Ð
Fermentación semilla
Ð
Fermentación
Ð
Concentración – lavado celular por
microfiltración tangencial
Ð
Extracción de vesículas
Ð
Clarificación del extracto
Ð
Filtración microbiológica (0.22 um)
Ð
Tratamiento enzimático con nucleasas
Ð
Lavado - concentración
Ð
Ultracentrifugación
Ð
Resuspensión del sedimento
Ð
Cromatografía de exclusión molecular
Ð
Diafiltración con sacarosa
Ð
Filtración esterilizante (0.22 um)
Ð
VME en sacarosa 3% (IFA)
Anexo 8. Diagrama de flujo establecido luego de la introducción de los dos cambios al proceso
tradicional (MFT y UFT con sacarosa) en el proceso de obtención del IFA, VME
purificadas de N. meningitidis serogrupo B
Anexos
VI
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Etapa
Fermentación
Requisitos de Calidad
Cinética de crecimiento
Método de ensayo
DO
Referencia
2.1.1
Separación
Recobrado celular
Peso seco
2.1.5
Purificación
Rendimiento de proteína
Espectrofotométrico
2.1.3
Purificación
Contenido de LPS
Espectrofotométrico
2.1.6
Purificación
Contenido de PC
Espectrofotométrico
2.1.7
VME Purificada
Identidad
SDS-PAGE
2.1.4
VME purificada
Estructura vesicular
Microscopía
electrónica
2.1.9
Anexo 9. Etapas, controles de calidad y metodología analítica empleadas en la evaluación de los
procesos de obtención y VME purificada de la cepa NZ98/228.
Requisitos de Calidad
Límite de aceptación
Método de ensayo
Referencia
pH
6,3 – 6,7
Potenciométrico
Contenido de endotoxina
≤ 10 000 UE.50mg-1 de
proteína
LAL
2.1.14
ELISA
ABS
2.1.12
2.1.13
Inmunogenicidad
• Contenido de IgG
• Actividad bactericida
≥ 7000 UIgG. mL-1
≥ 1/4
USP-30
Anexo 10. Requisitos de calidad y metodología analítica empleadas en los estudios de pre-estabilidad
de MG de la cepa NZ 98/228
Anexos
VII
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Gel de hidróxido
de aluminio
Ð
Esterilización por calor
Ð
a)
Tampón fosfato + sacarosa Æ
VME en sacarosa al 3% Æ
Agua para inyección Æ
Esterilización
por filtración
Î
Adsorción
Ð
Monogranel
b)
Monogranel CU
Monogranel NZ
Ó
Ô
Tampón fosfato + sacarosa + Cloruro de Sodio Î Formulación
Ð
Vacuna Men B
Bivalente
Anexo 11. Diagrama de flujo para la obtención de MG y el candidato vacunal de MenB bivalente.
a) Obtención del MG b) Formulación de la vacuna bivalente
Anexos
VIII
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Especificación
Requisitos de Calidad
pH
Límite de aceptación
7.6 - 8.0
Método de ensayo
Potenciométrico
Identidad de subtipo
Positivo a (P1.15 ó P1.4)
WB
Esterilidad
Ausencia de crecimiento
Contenido de proteínas
Referencia
USP-30
2.1.10
USP-30
Entre 1 y 2 mg.mL-1
Filtración por membrana
Espectrofotométrico
2.1.3
Contenido de LPS
(20-60)µg.mg-1 de proteína
Espectrofotométrico
2.1.6
Contenido de PC-B
< 10 µg.mg-1 de proteína
HPLC
2.1.17
Contenido de ADN
< 10 µg.mg-1 de proteína
Treshold
2.1.18
Contenido de DOC
% a ser cuantificado
Sacarosa
24 - 36 mg.mL-1
Caracterización
Requisitos de Calidad
Estructura vesicular
Identidad del perfil de
proteínas
Esperado
Deben observarse VME
mayoritariamente intactas
Dos bandas mayoritarias en el
rango de 36–46 kDa
Dos bandas de alto peso
molecular en el rango de
70-80kDa
CG y MS
Espectrofotométrico
Método de ensayo
Microscopía
electrónica
SDS-PAGE
2.1.20
2.1.19
Referencia
2.1.9
2.1.4
Anexo 12. Especificaciones de calidad y ensayos de caracterización de VME en sacarosa a partir de las
cepas CU385/83 ó NZ98/228
Anexos
IX
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Especificación
Requisito de Calidad
Límite de aceptación
Método de ensayo
Referencia
pH
6.3 - 6.7
Potenciométrico
USP-30
Identidad del subtipo
Positivo a subtipo específico
(P1.15 ó P1.4)
WB
2.1.10
Esterilidad
Ausencia de crecimiento
Filtración por
membrana
USP-30
Concentración de Proteínas
320-480 µg.mL-1
Espectrofotométrico
2.1.3
Complexométrico
BLG/UNDP/
82.1. Rev.1,
OMS
mg.mL-1
Concentración de aluminio
4,4-6.8
Pirogenicidad
No pirogénico a 0.5 µg.kg-1
conejo
Biológico
2.1.16
Adsorción de proteínas
Mínimo 80%
Espectrofotométrico
2.1.3
Inmunogenicidad
(subtipos P1.4 ó P1.15)
Inducción de anticuerpos
como mínimo a un 80% de los
ratones inmunizados
ELISA
2.1.12
Caracterización
Requisito de Calidad
Identidad del perfil proteínas
Actividad bactericida
Esperado
Dos bandas mayoritarias en el
rango de 36-46 kDa.
Dos bandas de proteína de
alto peso molecular en el
rango de 70 - 80 kDa
Títulos bactericidas de
ratones frente a la cepa
específica. CU 385/83 ó NZ
98/124
Método de ensayo
Referencia
SDS-PAGE
2.1.4
ABS
2.1.13
Anexo 13. Especificaciones de calidad, ensayos internos y de caracterización de MG a partir de las cepas
CU 385/83 ó NZ 98/228
Anexos
X
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Especificación
Requisito de Calidad
Descripción
pH
Límite de especificación
Método de ensayo
Suspensión blanco opalescente, que lentamente tiende a formar un depósito
blanco.
Referencia
-
6,3-6,7
Potenciométrico
USP-30
Identidad de MenB subtipo
P1.15
Positivo
WB
2.1.10
Identidad de MenB subtipo
P1.4
Positivo
Esterilidad
Ausencia de crecimiento
Contenido de endotoxina
No más que 10 000UE.dosis-1
LAL
Toxicidad inespecífica en
curieles
No pérdida de peso ni comportamiento
anormal de los animales
Biológico
BLG/UNDP/82.1
Rev.1, OMS
Toxicidad inespecífica en
ratones
No pérdida de peso ni comportamiento
anormal de los animales
Biológico
BLG/UNDP/82.1
Rev.1, OMS
Inmunogenicidad
(subtipo P1.4)
Inducción de anticuerpos como mínimo
a un 80% los ratones inoculados
ELISA
2.1.12
Inmunogenicidad
(subtipo P1.15)
Inducción de anticuerpos como mínimo
a un 80% los ratones inoculados
ELISA
2.1.12
Contenido de proteína
40-60 µg.dosis-1
Espectrofotométrico
Contenido de aluminio
0,55-0,85mg. dosis-1
Complexométrico
Contenido de sacarosa
Osmolalidad
Adsorción de proteína
24-36 mg.mL-1
266-345mOms.kg-1
Mínimo 80%
Fenol - sulfúrico
Físico - Químico
Espectrofotométrico
Caracterización
Requisito de Calidad
Actividad bactericida
(subtipo P1.4)
Esperado
Títulos bactericidas frente a la cepa
NZ98/228
Método de ensayo
ABS
Actividad bactericida
(subtipo P1.15)
Títulos bactericidas frente a la cepa
CU385/83
ABS
WB
Filtración por
membrana
2.1.10
USP-30
2.1.14
2.1.3
BLG/UNDP/82.1
Rev.1, OMS
2.1.19
2.1.20
2.1. 3
Referencia
2.1.13
Anexo 14. Especificaciones de calidad y ensayos internos de caracterización del candidato vacunal MenB
bivalente a granel
Anexos
XI
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Sistema Envase-Cierre
Tamaño del lote
L-NZ-1
L-NZ-2
L-NZ-3
L-CU-1
L-CU-2
LCU-3
Botellón de 5L, calidad hidrolítica I, con tapa roscada de melanina y junta de teflón
5L
Diseño del estudio
Vida de estante y estrés
Tiempos de exposición
Vida de estante: 2-8 ºC (0, 3, 6 y 12 meses)
Estrés: 37 ºC (7 días)
Lotes en estudios:
Requisitos de Calidad
Límites de Aceptación
Método de ensayo
Referencia
Descripción
Suspensión blanco opalescente, que
lentamente tiende a formar un
depósito blanco.
-
-
pH
6,3 – 6,7
Potenciométrico
USP 30
Adsorción de proteínas
≥ 80%
Espectrofotométrico
2.1.3
Identidad del subtipo
Identidad del perfil de
proteínas
Positivo a subtipo específico
(P1.15 ó P1.4)
WB
2.1.10
SDS-PAGE
2.1.4
Contenido de endotoxina
Dos bandas mayoritarias en el rango
de 36–46 kDa
Dos bandas de alto peso molecular en
el rango de 70-80kDa
No más de 10 000UE.dosis-1
LAL
2.2.14
Pirogenicidad
No pirogénico a 500 ng.Kg-1 conejo
Biológico
2.1.16
Inmunogenicidad
(subtipo P1.4)
Inducción de anticuerpos como
mínimo a un 80% los ratones
inoculados
ELISA
2.1.12
Inmunogenicidad
(subtipo P1.15)
Inducción de anticuerpos como
mínimo a un 80% los ratones
inoculados
ELISA
2.1.12
Actividad bactericida
(subtipo P1.4)
Títulos bactericidas de ratones frente a
la cepa NZ98/228
ABS
2.1.13
Actividad bactericida
(subtipo P1.15)
Títulos bactericidas de ratones frente a
la cepa CU385/83
ABS
2.1.13
Esterilidad
Pasa la prueba
Filtración por
membrana
USP-30
Anexo 15. Protocolo resumido del estudio de estabilidad de vida de estante y estrés de MG de VME en
sacarosa adsorbidas en HA obtenidas de las cepas NZ 98/228 y CU385/83
Anexos
XII
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Lotes en estudios:
Sistema Envase-Cierre
Tamaño del lote
Diseño del estudio
Tiempos de exposición
L-CU/NZ-1
L-CU/NZ-2
L-CU/NZ-3
Botellón de 20L calidad hidrolítica I, con tapa roscada de melanina y junta de
teflón
20L
Vida de estante y estrés
Vida de estante: 2-8 ºC (0, 9, 12 y 18 meses)
Estrés: 37 ºC (7 días)
Requisitos de Calidad
Descripción
Límites de Aceptación
Suspensión blanco opalescente,
que lentamente tiende a formar un
depósito blanco.
Método de ensayo
-
Referencia
-
pH
6,0 - 7,2
Potenciométrico
USP 30
Adsorción de proteínas
≥ 80%
Espectrofotométrico
2.1.3
Identidad de proteínas
Positivo a subtipos específicos
(P1. 4 y P1.15)
WB
2.1.10
Contenido de endotoxina
No más de 10 000UE.dosis-1
LAL
2.1.14
Inmunogenicidad
(subtipo P1.4)
Inducción de anticuerpos como
mínimo a un 80% los ratones
inoculados
ELISA
2.1.12
Inmunogenicidad
(subtipo P1.15)
Inducción de anticuerpos como
mínimo a un 80% los ratones
inoculados
ELISA
2.1.12
Actividad bactericida
(subtipo P1.4)
Títulos bactericidas de ratones
frente a la cepa NZ98/228
ABS
2.1.13
Actividad bactericida
(subtipo P1.15)
Títulos bactericidas de ratones
frente a la cepa CU385/83
ABS
2.1.13
Pirogenicidad
No pirogénico a 0.5µg.kg-1 conejo
Biológico
2.2.16
Esterilidad
Pasa la prueba
USP-30
Toxicidad inespecífica en
curieles
No pérdida de peso ni
comportamiento anormal de los
animales
Filtración por
membrana
Toxicidad inespecífica en
ratones
No pérdida de peso ni
comportamiento anormal de los
animales
Biológico
BLG/UNDP/82.1
Rev.1, OMS
Biológico
BLG/UNDP/82.1
Rev.1, OMS
Anexo 16. Protocolo resumido del estudio de estabilidad de vida de estante y estrés del candidato vacunal
Men B bivalente a granel
Anexos
XIII
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Concentración celular
centrifugación
continua
Obtención de
inóculos
Centrifugación
Resuspensión
Tecnología Evaluada
Obtención de
inóculos
Concentración lavado
celular por microfiltración
tangencial
Extracción celular
Etapas Modificadas
Anexo 17. Diagrama de flujo de proceso con representación del equipamiento involucrado en el cambio tecnológico de la introducción de la MFT en la
etapa de concentración – lavado celular
Anexos
XIV
Extracción celular
Etapas a Modificar
Tecnología Tradicional
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Anexos
XV
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Anexos
XVI
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Anexos
XVII
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Anexos
XVIII
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Anexos
XIX
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Anexos
XX
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Anexos
XXI
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Anexos
XXII
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Anexos
XXIII
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Anexos
XXIV
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Anexos
XXV
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Anexos
XXVI
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Anexos
XXVII
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Anexos
XXVIII
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Tecnología Tradicional. Precipitación alcohólica
Tecnología Evaluada. Diafiltración con sacarosa al 3%
Anexo 19. Diagrama de flujo de proceso con representación del equipamiento involucrado en el cambio tecnológico de la introducción de la diafiltración
con sacarosa en el paso final de la purificación de VME
Anexos
XXIX
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Requisitos de Calidad
Límites de Aceptación
Lotes
Descripción
Suspensión blanco opalescente, que
lentamente tiende a formar un depósito
blanco.
pH
6.5 ± 0.2
Adsorción de proteínas
(%)
≥ 80 %
Identidad de subtipo
(P1.4)
Positiva
Identidad del perfil de
proteínas (BC)
Bandas características
Esterilidad
Ausencia de crecimiento
Contenido de Endotoxinas
< 10000 EU.50µg-1 de proteína
Pirógenos en conejo
No pirogénico a
0.5 µg.Kg-1 de conejo
Inmunogenicidad
≥ 80 %
Actividad bactericida
-
NZ-1
NZ-2
NZ-3
NZ-1
NZ-2
NZ-3
NZ-1
NZ-2
NZ-3
NZ-1
NZ-2
NZ-3
NZ-1
NZ-2
NZ-3
NZ-1
NZ-2
NZ-3
NZ-1
NZ-2
NZ-3
NZ-1
NZ-2
NZ-3
NZ-1
NZ-2
NZ-3
NZ-1
NZ-2
NZ-3
NZ-1
NZ-2
Toxicidad inespecífica en
curieles
Toxicidad inespecífica en
ratones
No pérdida de peso ni comportamiento
anormal de los animales
No pérdida de peso ni comportamiento
anormal de los animales
T= 0
2-8 º C
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
6.5
6.4
6.4
95
94
93
Positiva
Positiva
Positiva
BC
BC
BC
Pasa
Pasa
Pasa
5055
5473
4383
Pasa
Pasa
Pasa
100
100
100
1/16384
1/32768
1/16384
Pasa
Pasa
T= 7 días
37 º C
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
98
96
92
Positiva
Positiva
Positiva
BC
BC
BC
3489
4170
2062
100
100
100
1/16384
1/16384
1/16384
-
T= 3 meses
2-8 º C
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
6.4
6.3
6.3
96
97
94
Positiva
Positiva
Positiva
BC
BC
BC
Pasa
Pasa
Pasa
2917
9752
5992
Pasa
Pasa
Pasa
100
100
90
1/16384
1/32768
1/16384
Pasa
Pasa
T= 6 meses
2-8 º C
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
6.4
6.3
6.3
90
96
90
Positiva
Positiva
Positiva
BC
BC
BC
5426
5713
3765
Pasa
Pasa
Pasa
100
80
80
1/16384
1/16384
1/32768
Pasa
Pasa
NZ-3
Pasa
-
Pasa
Pasa
Pasa
NZ-1
NZ-2
NZ-3
Pasa
Pasa
Pasa
-
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Anexo 20: Estudio de estabilidad de vida de estante y en condiciones de estrés del MG (Cepa NZ 98/228)
Anexos
T= 12 meses
2-8 º C
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
6.3
6.4
6.3
91
95
94
Positiva
Positiva
Positiva
BC
BC
BC
Pasa
Pasa
Pasa
1483
1169
1613
Pasa
Pasa
Pasa
90
90
100
1/32768
1/16384
1/32768
Pasa
Pasa
XXX
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Requisitos de Calidad
Descripción
CU-1
T= 0
2-8 º C
Satisfactorio
T= 7 días
37 º C
Satisfactorio
T= 3 meses
2-8 º C
Satisfactorio
T= 6 meses
2-8 º C
Satisfactorio
T= 12 meses
2-8 º C
Satisfactorio
CU-2
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
CU-3
CU-1
CU-2
CU-3
CU-1
CU-2
CU-3
CU-1
CU-2
CU-3
CU-1
CU-2
CU-3
CU-1
CU-2
CU-3
CU-1
CU-2
CU-3
CU-1
CU-2
CU-3
CU-1
CU-2
CU-3
CU-1
CU-2
CU-3
CU-1
CU-2
CU-3
CU-1
CU-2
CU-3
Satisfactorio
6.3
6.3
6.3
95
91
92
Positiva
Positiva
Positiva
BC
BC
BC
Pasa
Pasa
Pasa
2011
2421
5509
Pasa
Pasa
Pasa
100
100
100
1/512
1/1024
1/1024
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Satisfactorio
94
94
94
Positiva
Positiva
Positiva
BC
BC
BC
1054
1575
2787
100
100
100
1/256
1/1024
1/1024
-
Satisfactorio
6.5
6.5
6.5
94
95
95
Positiva
Positiva
Positiva
BC
BC
BC
Pasa
Pasa
Pasa
4910
5535
4682
Pasa
Pasa
Pasa
100
100
100
1/1024
1/1024
1/1024
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Satisfactorio
6.3
6.3
6.3
94
94
97
Positiva
Positiva
Positiva
BC
BC
BC
2523
3006
3408
Pasa
Pasa
Pasa
90
90
100
1/512
1/2048
1/512
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Satisfactorio
6.3
6.3
6.3
92
92
98
Positiva
Positiva
Positiva
BC
BC
BC
Pasa
Pasa
Pasa
4858
3224
3224
Pasa
Pasa
Pasa
100
100
100
512
256
512
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Pasa
Límites de Aceptación
Lotes
Suspensión blanco opalescente, que
lentamente tiende a formar un depósito
blanco.
pH
6.5 ± 0.2
Adsorción de proteínas (%)
≥ 80 %
Identidad de subtipo (P1.4)
Positiva
Identidad del perfil de proteínas (BC)
Bandas características
Esterilidad
Ausencia de crecimiento
Contenido de Endotoxinas
< 10000 EU.50µg-1 de proteína
Pirógenos en conejo
No pirogénico a
0.5 µg.Kg-1 de conejo
Inmunogenicidad
≥ 80 %
Actividad bactericida
-
Toxicidad inespecífica en curieles
No pérdida de peso ni comportamiento
anormal de los animales
Toxicidad inespecífica en ratones
No pérdida de peso ni comportamiento
anormal de los animales
Anexo 21: Estudio de estabilidad de vida de estante y en condiciones de estrés del MG (Cepa CU 385/83)
Anexos
XXXI
CONFIDENCIAL
Página ____
Ejemplar No. _____
Versión: 3
Ensayo
Límites de Aceptación
Lote
Descripción
Suspensión blanco opalescente, que
lentamente tiende a formar un depósito
blanco.
pH
6.0 – 7.2
Concentración de proteínas
80 - 120 µg.mL-1
Adsorción de proteínas (%)
≥ 80 %
Identidad a Men B P1.4 (WB)
Positiva
Identidad a Men B P1.15 (WB)
Positiva
Esterilidad
Ausencia de crecimiento
Contenido de Endotoxinas
< 10000 EU.dosis-1
Pirógenos en conejo
No pirogénico a 0.5 µg.Kg-1.conejo
ELISA. Men B P1.4
≥ 80 % de respondedores
ELISA. Men B P1.15
≥ 80 % de respondedores
Bactericida. Men B P1.4
-
Bactericida. Men B P1.15
-
CU/NZ -1
CU/NZ-2
CU/NZ-3
CU/NZ -1
CU/NZ-2
CU/NZ-3
CU/NZ -1
CU/NZ-2
CU/NZ-3
CU/NZ -1
CU/NZ-2
CU/NZ-3
CU/NZ -1
CU/NZ-2
CU/NZ-3
CU/NZ -1
CU/NZ-2
CU/NZ-3
CU/NZ -1
CU/NZ-2
CU/NZ-3
CU/NZ -1
CU/NZ-2
CU/NZ-3
CU/NZ -1
CU/NZ-2
CU/NZ-3
CU/NZ -1
CU/NZ-2
CU/NZ-3
CU/NZ -1
CU/NZ-2
CU/NZ-3
CU/NZ -1
CU/NZ-2
CU/NZ-3
CU/NZ -1
CU/NZ-2
CU/NZ-3
T= 0
2-8 º C
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
6.3
6.3
6.3
100
99
94
95
94
90
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Pasa
Pasa
Pasa
6275
7720
7940
Pasa
Pasa
Pasa
100
100
100
100
100
100
1/16384
1/32768
1/32768
1/2048
1/1024
1/2048
T= 7 días
37 º C
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
6.4
6.4
6.5
94
91
90
94
97
97
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
2673
2446
2372
Pasa
Pasa
Pasa
100
80
100
100
80
100
1/16384
1/16384
1/32768
1/1024
1/2048
1/2048
T= 9 meses
2-8 º C
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
6.4
6.4
6.4
91
111
117
89
92
87
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Pasa
Pasa
Pasa
8320
8160
6500
Pasa
Pasa
Pasa
100
100
100
100
100
100
1/2048
1/1024
1/1024
1/512
1/1024
1/1024
T= 12 meses
2-8 º C
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
6.4
6.3
6.3
83
82
89
97
96
96
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Pasa
Pasa
Pasa
2701
3470
3897
Pasa
Pasa
Pasa
100
100
100
100
100
100
1/2048
1/4096
1/2048
1/256
1/512
1/1024
Anexo 22: Estudio de estabilidad de vida de estante y en condiciones de estrés de la vacuna Men B bivalente
Anexos
XXXII
T= 18 meses
2-8 º C
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
6.4
6.5
6.5
94
91
89
94
92
88
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Pasa
Pasa
Pasa
7587
5678
8140
Pasa
Pasa
Pasa
90
100
100
80
100
100
1/8192
1/8192
1/4096
1/1024
1/1024
1/512