XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico “Evaluación de la participación del canal catiónico TRPV4 en la diferenciación de células epiteliales” Vidal López Eva María, Universidad de Sonora, eviid@hotmail.com, Asesora Dra. María del Refugio García Villegas, Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias CINVESTAVIPN rgarciav@fisio.cinvestav.mx. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La familia de canales catiónicos TRP forman parte del grupo de proteínas que confieren termosensación. Uno de estos canales el TRPV4 participa en la transportación de calcio y está ligado a la transducción del dolor. En este proyecto se ha estudiado la participación y comportamiento de este canal catiónico en la diferenciación de células y se ha observado que durante las primeras 24 horas de su cultivo de la línea celular MDCK, este canal se presenta en el núcleo y después sale para posicionarse en la membrana, lo cual ha dado origen a una de las preguntas de este proyecto, ¿Qué hace en el núcleo? METODOLOGIA Previamente en el laboratorio ya se habían hecho estudios para localizar las secuencias correspondientes a las regiones transmembranales del canal y de igual forma se ha encontrado una señal de localización nuclear (NLS) en el dominio amino citoplasmático del TRPV4. Se cuenta ya con una construcción del canal TRPV4 en donde el dominio amino del canal tiene mutada la NLS, por lo que la estrategia a seguir es clonar solamente la región amino citoplasmática del canal TRPV4 mutado (MutNLS) en el vector pEYFP N1, el cual contiene la secuencia de la proteína amarilla fluorescente para hacer una proteína de fusión y evidenciar si la señal NLS del dominio amino es la encargada de dirigir al canal del núcleo celular. Durante mi estancia lo que hice fue una amplificación por PCR del fragmento amino citoplasmático de TRPV4 mutado y su clonación en el vector pGEM-T easy. El fragmento de PCR se amplifico, se limpió, se le agregaron adeninas en los extremos, se ligó en el vector pGEM-T easy y se transformó en las bacterias competentes. Después se intentará fusionar este fragmento con la proteína amarilla fluorescente NV4-EYFP. Por lo tanto lo que seguiría seria secuenciarlo para corroborar la construcción, luego se deberá transfectar en la línea celular NG108-15 para localizar el fragmento de TRPV4 usando microscopia de epifluorescencia, lo que se espera es que esta proteína de fusión no se encuentre en el núcleo ya que se trabajó con la NLS mutada, si esto ocurre confirmaría que la NLS del canal silvestre es la responsable de enviar al canal al núcleo celular. CONCLUSIONES Podemos decir que hasta lo que va del proyecto que es la clonación del fragmento de PCR del fragmento amino del canal TRPV4 se está haciendo la digestión del plásmido para ver si la construcción es correcta en el pGEM-T easy, solo faltaría proseguir con el siguiente paso que sería intentar fusionar ese fragmento con la proteína amarilla fluorescente EYFP NV4-EYFP. © Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del Pacífico Agosto 2014