Biología Celular

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Biología Celular
La biología celular estudia la estructura, procesos y cambios de estado de las células,
tanto en su medio natural como en la placa de cultivo.
diferenciación
contactos célula-célula
proliferación
contactos célula-matriz
contactos célula-matriz
apoptosis
crecimiento
migración
contactos célula-matriz
contactos célula-matriz
diferenciación
video
... ...
.. .
... ....
Las células en cultivo pueden examinarse vivas mediante microscopía
microscopio invertido
lámpara halógena
cámara calefaccionada
lámpara de mercurio
cámara CCD
mesa
a
datos a la
computadora
ntivib
ratoria
Microscopía multi-dimensional
permite el análisis simultaneo de la localización 3D, dinámica e interacciones de múltiples proteínas
Giepmans et al., Science 2006
Adquisición y procesamiento de
imágenes en 4 dimensiones
serie temporal + varios planos
de foco en el eje z.
En el ejemplo de la derecha se muestra el
esquema de adquisición de los datos y
su posterior procesamiento. Organización
de la cromatina durante mitosis visualizada
mediante transfeccion de la histona 2B-CFP
Gerlich, Nature 2003
El análisis de células vivas es posible mediante la transfección
de proteínas fluorescentes
Transfección de retinas enteras
pistola de helio “gen gun”
para introducir cDNA
codificante de la GFP.
CMV
GFP
Expresión de GFP
en neuronas in situ
Visualización panorámica (b) y mas detallada
(c) neuronas ganglionares que expresan la GFP.
Secuencia temporal ilustrando la remodelación dendrítica
de una neurona ganglionar de retina in situ
Marrs et al., MCN2006
El citoplasma celular esta poblado de
macromoléculas y organelas
Se estima que el citoplasma contiene una concentración de
macromoléculas de ~ 300 mg/ml (Zimmerman & Trach, J. Molec. Biol 1991, 222:599)
La densidad macromolecular del citosol modula la síntesis y dinámica de las proteínas.
Moléculas < 500 daltons difunden libremente en el citosol, la difusión
de grandes macromoléculas, como las proteínas es significativamente
retardada (Seksek et al J Cell. Biol 1997, 138: 131).
Densidad de microtúbulos de interfase en un fibroblasto
inmunofluorescencia
núcleo
C. O. Arregui
Densidad de filamentos de actina en la lamela de un keratinocito
malla de actina
Svitkina et al, JCB 1997
Densidad de túbulos pertenecientes a la red del retículo endoplásmico
C. O. Arregui
Reconstrucción de una porción del citoplasma
de una célula de Dictiostelium discoideum
actina en rojo
ribosomas en gris
membranas en azul
Ellis & Minton, Nature 2004
1
1
8
Eucaryotic cell
David Goodsell, Scripps Res. Inst.
http://mgl.scripps.edu/people/goodsell/
proteínas en azul,
DNA/RNA en rosado
lípidos en amarillo
carbohidratos en verde
ribosomas en magenta
8
La estructura y función de las células depende
fundamentalmente de las proteínas
Alberts et al, MBC 2002
Revisión de algunos conceptos relacionados a las proteínas
• El plegado de las proteínas es asistido por chaperonas y ocurre
en el citosol o en compartimientos específicos (RE, mitocondrias).
• La función de las proteínas depende de su estructura tridimensional.
• La estructura tridimensional es determinada por la secuencia de aminoácidos.
• Cada proteína adopta una estructura tridimensional única o conformación nativa.
• La conformación nativa es la más estable termodinámicamente y se mantiene
por múltiples interacciones no covalentes.
• Los dominios son subestructuras que se pliegan de manera autónoma y
conservan su función cuando se transplantan de una proteína a otra.
• La pérdida de la conformación nativa se denomina desnaturalización.
La función de las proteínas depende
de su estructura tridimensional
Fosfatasa de tirosina PTP1B
Quinasa de tirosina Src
Integrina
Proteína con un único dominio
globular.
Proteína con varios dominios
globulares.
Proteína de transmembrana con
un dominio intracelular, transmembrana y extracelular.
En la célula el plegado de las proteínas es asistido por
chaperonas en reacciones dependientes de ATP
Hsp70-ADP
Hsp70-ATP
Las chaperonas difieren en estructura y
función. Las denominadas chaperonas
moleculares se unen a segmentos
hidrofóbicos de los polipéptidos nacientes
impidiendo su agregación y degradación (ej.
Hsp70, BiP, DnaK). La unión de ATP y su
hidrólisis modulan la afinidad por el
substrato. Las denominadas chaperoninas
son complejos multi-proteicos que
encapsulan y activamente contribuyen al
plegado de los polipéptidos sintetizados en
una manera dependiente de ATP (ej.
Hsp60, GroEL, CCT).
(chaperonina de E. coli)
La elongación de los polipéptidos en eucariotas ocurre a ~ 4 aminoácidos por segundo (Thulasiraman et al EMBOJ 1999).
Las chaperoninas representan entre el 0.1-1% del total de proteínas solubles y ~ 10% del total de ribosomas.
Lodish et al, MCB 2004
En la célula las proteínas defectuosas o que han cumplido su vida útil
se degradan en los proteasomas por procesos dependientes de ATP
A diferencia de los lisosomas, organelas que degradan material
endocitado, los proteasomas degradan proteínas en el citosol.
Los proteosomas son complejos de proteasas
organizados en estructuras con forma de barril.
Las subunidades reguladoras de los extremos
unen a polipéptidos poli-ubiquitinilados, los
despliegan y transfieren a la cámara central
donde son degradados a péptidos cortos.
Lys
Reconstrucción de imágenes
de microscopía electrónica
19S
tapa
cámara
tapa
~ 2,5 MDa
20S
Existen diversos mecanismos de reconocimiento
de los substratos de ubiquitinación
Lodish et al, MCB 2004
Smalle & Vierstra, ARPB 2004
Varias enfermedades humanas resultan de la agregación
intra o extracelular de polipéptidos mal plegados
Soto, Nature Rev Neuro 2003
La presencia de agregados
proteicos puede visualizarse
por histoquímica. Al
microscopio electrónico los
agregados forman
fibras (centro)
Soto, Nature Rev Neuro 2003
Las células exhiben una organización modular
(0.5-1 μm)
Gavin et al, COCB 2003
En las células las proteínas usualmente forman
complejos (ensambles) funcionales
Alberts et al, MBC 2002
Los complejos de señalización dependen de diversos módulos
o dominios proteicos
Pawson & Nash, TICB 2001
Los complejos de señalización son dinámicos
señal1
GEF
PP
GEF
PP
SH3
Crk
SH2
SH3
Crk
SH2
pY pY pY pY pY pY
Cas
PP
SH3
Src kinasa
SH2
pY397
FERM
pY861 pY925
pY576/577
FAT
FAK kinasa
LD LD
PP
SH3
autofosforilación de FAK
unión de Src
fosforilación y max activación de FAK
fosforilación de Cas
unión de Crk y GEFs (C3G, DOCK180)
PP
pax
señal1
GEF
PP
GEF
PP
SH3
Crk
SH2
SH3
Crk
SH2
señal2
Sos
SH3
SH3
pY pY pY pY pY pY
Grb2
Cas
PP
SH3
SH2
Src kinasa
pY397
FERM
SH2
pY861 pY925
pY576/577
FAT
FAK kinasa
LD LD
PP
SH3
unión de Grb2
interacción con Sos
PP
pax
Otros ejemplos de ensambles funcionales multiproteicos
transcripción
eliminación de intrones
degradación de
proteínas
Ejemplos de ensambles funcionales multiproteicos
contracción
distribución de cromosomas
adhesión celular
Ejemplos de ensambles funcionales multiproteicos
transporte núcleo-citoplásmático
Los interactomas describen las interacciones entre proteínas a nivel global
Interactoma de S. cerevisiae
1.870 proteínas
2.240 interacciones
ROBUSTEZ
~73% genes de levadura no son
esenciales; mutaciones al azar no
afectan la topología de la red
(Giaever et al, Nature 2002)
(n=1.572 mutants)
nodo
Jeong et al, Nature 2001
DIP: Database of Interacting Proteins
http://dip.doe-mbi.ucla.edu
P53 es un ejemplo de proteína nodal (hiperconectada)
Vogelstein et al, Nature 2000
Relaciones topológicas entre compartimientos subcelulares
Alberts et al, MBC 2002
Las proteínas no citosólicas poseen motivos
esenciales para su localización subcelular
Lodish et al, MCB 2004
poro nuclear
carioferinas
Ran
otros componentes…
El transporte núcleo-citoplasmático
ocurre a través de los poros nucleares
Alberts et al, MBC 2002
Los poros nucleares son complejos multiproteicos
Los complejos de los poros nucleares de células de vertebrados consisten de
múltiples copias de ~ 30 proteínas diferentes denominadas nucleoporinas.
vista desde el citosol
cara intranuclear
malla de laminas (intranuclear)
microscopía
electrónica
de la envoltura
nuclear de oocitos
de Xenopus
50 nm
FG nucleoporins
proteínas < 50 kDa pueden pasar pasivamente
por los poros nucleares. Proteínas > 50kDa
requieren de un transporte activo.
Lodish et al, MCB 2004
Los complejos del poro nuclear estan anclados a una malla filamentosa
o lámina nuclear en contacto con la membrana nuclear interna
La lámina nuclear esta formada por proteínas de filamentos intermedios denominadas laminas
Alberts et al, MBC 2002
Diversos componentes estan involucrados en el transporte
a través de los poros nucleares
secuencias de localización nuclear (NLS)
entrada al núcleo
secuencias de exportación nuclear (NES)
salida del núcleo
GTPasas: Ran-GDP
Ran-GTP
FG-nucleoporinas
transportadores o carioferinas (importinas, exportinas)
La primera señal NLS se identificó en mutantes de
proteínas (antígeno) T del virus SV40
(A) La proteína T salvaje se localiza
en el núcleo y depende de una NLS
antígeno T dentro
de núcleos
(B) proteínas T con una mutación en
la NLS se localizan en el citoplasma
antígeno T excluído
de núcleos
Alberts et al, MBC 2002
La fusión de la NLS a una proteína citosólica
es suficiente para dirigirla al núcleo
piruvato quinasa
(distribución citosólica)
piruvato quinasa fusionada
a la NLS del SV40
núcleo
núcleo
Lodish et al, MCB 1999
Las NLS denominadas clásicas son de dos tipos:
unipartita, ej. antígeno T de SV40; KKKRK
bipartita, ej. nucleoplasmina; KRPAATKKAGQAKKKK
Demostración de la identificación de una señal NLS
en la proteína nuclear nucleoplasmina
Alberts et al, MBC 2002
Micrografía electrónica mostrando la translocación
de partículas de oro coloidal recubiertas con NLS
Cada núcleo posee
~ 4000 poros nucleares
Alberts et al, MBC 2002
La importación de proteínas al núcleo
requiere de transportadores y de la GTPasa Ran
Las importinas β interaccionan
directamente con la NLS de la
proteína cargo, o indirectamente
a través de las importinas α. Las
importinas β además interaccionan
con las FG nucleoporinas.
Existen ~ 20 importinas β en humanos.
Ran es una GTPasa que se activa
exclusivamente en el núcleo como
consecuencia del intercambio de
GDP por GTP promovido por un GEF.
Ran-GDP (inactivo)

Ran-GTP (activo)
FG nucleoporins
Ran-GTP se une e induce un cambio
conformacional en la importina-β,
provocando la disociación del cargo
en el núcleo.
Lodish et al, MCB 2004
Diversas modificaciones post-traducción regulan la importación al núcleo
*ver clase de señalización,
imagen 86
enmascaramiento
de la NLS
enmascaramiento
de la NLS
Ciertas proteínas que se translocan al núcleo no poseen una NLS
y no interaccionan con importinas (ej. β-catenina, Erk2, SMADs)
Gasiorowski & Dean,
ADDR 2003
Regulación del transporte núcleo-citoplasma de NF-AT
activación de células T,
incremento de calcio,
activación de calcineurina
P
1
2
P
Calcineurina se asocia y
defosforila NF-AT. NF-AT
defosforilado expone una NLS
NF-AT
NLS
tirosin-kinasas
NÚCLEO
+ Crm-1
(exportina)
4
E
E
NES
retorno de calcio a nivel
basal, disociación de
calcineurina, exposición
de una NES en NF-AT.
(NF-AT: Nuclear Factor of Activated T cells)
E
E
CITOSOL
+ αβ importinas
3
NF-AT se une al DNA y
activa la transcripción
activación
de genes (ej. IL-2 & IL-4)
(video disponible)
El transporte de proteínas del núcleo al citosol
requiere de una NES, exportinas y Ran-GTP
Las exportinas median el transporte de
proteínas del núcleo al citosol. La unión
de exportinas a Ran-GTP aumenta
su afinidad por la NES del cargo.
Ran hidroliza el GTP en el
citoplasma, en una reacción
facilitada por la proteína
reguladora GAP.
La hidrólisis del GTP de Ran en
el citosol produce el desensamble
del complejo cargo/exportina/Ran.
La mayoría de las proteínas nucleares, tRNAs
y rRNAs utilizan este mecanismo de exportación.
La exportina-1 o Crm1 reconoce una NES rica en leucinas (L - X(1-3) - L - X(2-4) - L - X – L)
Lodish et al, MCB 2004
Los mRNAs se transportan al citosol independientemente
de Ran y exportinas
* las repeticiones de FG en las nucleoporinas fueron omitidas en la porción inferior de la figura para una mejor claridad.
En eucariotas el mRNA es exportado al citoplasma por el complejo TAP-p15. Este complejo interacciona
directamente o a través de proteínas adaptadoras con el mRNA. Otras regiones del complejo interaccionan
con las FG nucleoporinas.
Lodish et al, MCB 2004
las mitocondrias representan ~20% de la masa total de la célula eucariota
las mitocondrias estan delimitadas por una doble membrana (externa e interna)
mas del 98% de las proteínas mitocondriales son codificadas por genes nucleares
las proteínas mitocondriales codificadas por genes nucleares poseen secuencias de
localización a mitocondrias
las secuencias interaccionan con receptores mitocondriales(TOMs y TIMs)
la secuencia de tránsito a la matriz es clivada en la proteína madura
las proteínas se importan a la matriz en forma desplegada
Ejemplos de proteínas mitocondriales sintetizadas en el citosol
Mitochondrial
Location
Protein*
Matrix
Alcohol dehydrogenase (yeast)
Carbamoyl phosphate synthase (mammals)
Citrate synthase and other citric acid enzymes
DNA polymerase
F1 ATPase subunits α (except in plants), β, γ, and δ (in certain fungi)
Mn2+ -superoxide dismutase
Ornithine aminotransferase (mammals)
Ornithine transcarbamoylase (mammals)
Ribosomal proteins
RNA polymerase
Inner membrane
ADP/ATP antiporter
CoQH2 cytochrome c reductase complex: subunits 1, 2, 5 (Fe-S
protein), 6, 7, and 8
Cytochrome c oxidase subunits 4, 5, 6, and 7
Phosphate/OH antiporter
Proteolipid of F0 ATPase
Thermogenin (brown fat)
Intermembrane space Cytochrome c
Cytochrome c peroxidase
Cytochrome b2 and c1 (subunits of CoQH2 cytochrome c reductase
complex)
Outer membrane
Mitochondrial porin (P70)
*
Most proteins (except the ADP-ATP antiporter, cytochrome c, and porin) are fabricated
as longer precursors.
Las proteínas de la matriz mitocondrial poseen secuencias
de importación en el terminal amino
Las secuencias de importación a la matrix (10-80 aminoácidos) adoptan una estructura
de alfa hélice anfipática. Residuos cargados e hidrofóbicos se orientan en lados
opuestos de la hélice formando una señal conformacional.
Las propiedades anfipáticas de la secuencia señal están
conservadas evolutivamente y pueden predecirse
mediante programas como PSORT II y MITOPROT II
residuos cargados positivamente (rojo)
e hidrofóbicos (amarillo)
Alberts et al, MBC 2002
La translocación de las proteínas mitocondriales
ocurre post-traducción y requiere ATP
Diseño experimental para investigar la importación de proteínas a mitocondrias
importación de
la proteína y
clivado de la
secuencia N-terminal
síntesis in vitro
de la proteína
en estudio
proteína
degradada
la proteína internalizada
es resistente a la tripsina
secuencia de
importación
+ tripsina
1
+ tripsina
2
3
+ mitocondrias
activas y ATP
proteína
mitocondrial
3
1
2
la secuencia de importación
es clivada en la matriz
gel de poliacrilamida
Lodish et al, MCB 1999
Las proteínas mitocondriales se importan en forma desplegada
por canales proteicos de la membrana externa e interna
Experimento que demuestra la importación de proteínas en forma desplegada
microscopía electrónica mostrado las regiones
de contacto entre membrana externa e interna
La proteína citosólica dihidrofolato reductasa (DHFR) fusionada a una secuencia de importación a
mitocondrias (en rojo) a través de un péptido espaciador (en negro) se transloca normalmente a la matriz.
La inducción del plegamiento por el agregado de methotrexato permite visualizar intermediarios de la translocación.
Lodish et al, MCB 2004
La translocación de proteínas a la matriz mitocondrial
involucra tres etapas que requieren energía
1. Hidrólisis de ATP. Requerida por
chaperonas para mantener los
polipéptidos desplegados en el citosol.
2. Gradiente electroquímico. Requerido
para translocar el polipéptido a través de
la membrana interna.
3. Hidrólisis de ATP. Requerida por
chaperonas de la matriz para traccionar
activamente el polipéptido hacia la
matriz y plegarlo.
Tim22/54
Complejos proteicos de la membrana
externa (TOMs) e interna (TIMs), median la
importación de polipéptidos que poseen
la secuencia de tránsito en el terminal
amino. TOM 40 forma el canal (~2 nm) en la
membrana externa; TIM23/17 y TIM22/54
forman los canales en la membrana interna.
en la matriz, la secuencia de importación
N-terminal es removida por una proteasa.
Lodish et al, MCB 1999
La localización submitocondrial requiere de
secuencias adicionales
Señales en proteínas mitocondriales
N
Lodish et al, MCB 2004
Direccionamiento de polipéptidos a la membrana mitocondrial interna
Tres mecanismos principales gobiernan la inserción de proteínas en la membrana interna e involucran
diferentes complejos, TIM 23/17, OXA-1 y TIM22/54, localizados en la membrana interna.
Vía 1: ejemplo
citocromo oxidasa
Vía 2: ejemplo
ATP sintasa, sub 9
Vía 3: ejemplo
intercambiador de ADP/ATP
Lodish et al, MCB 2004
Direccionamiento de polipéptidos al espacio de intermembrana
Vía 1: ejemplo citocromo b2
Vía 2: ejemplo citocromo c heme liasa
Lodish et al, MCB 2004
Génesis de
cloroplastos
mas del 90% de las proteínas de cloroplastos
son codificadas por genes nucleares
los cloroplastos poseen una membrana doble;
la membrana interna delimita el estroma
en el estroma existe un tercer conjunto de
membranas (tilacoides) que delimitan el
lúmen del tilacoide
Mecanismo de importación de proteínas al estroma de cloroplastos
- receptores de la membrana externa (Toc34) se
unen a la secuencia señal de las proteínas de
cloroplastos.
- los precursores se translocan al estroma
en forma desplegada, a través de complejos
multiproteicos de la membrana externa
(Toc75) e interna (Tic110).
Tic110
- la translocación requiere de hidrólisis de ATP.
- no requiere de gradiente electroquímico.
- la secuencia señal es removida en la
proteína madura.
Lodish et al, MCB 1999
Existen varios mecanismos para
importar proteínas al lumen de
tilacoides
- Los precursores poseen dos señales,
una amino terminal para la internalización al
estroma y otra para su importación al tilacoide.
- Unos precursores se internalizan a través de
complejos similares a los OXA de mitocondrias.
- Otros dependen de un complejo proteico
(SRP) que se une a la secuencia de
importación al tilacoide (2).
- Proteínas que unen metales como
cofactores son propulsadas al interior
del tilacoide por un gradiente de pH.
- La cuarta vía descripta requiere de una
proteína similar a SecA de bacterias.
Lodish et al, MCB 2004
Los peroxisomas son organelas pequeñas presentes en la mayoría de las células
eucariotas. Participan en el metabolismo de ácidos grasos.
Son organelas limitadas por una sola membrana.
Todas las proteínas de peroxisomas son importadas desde el citosol post-traducción.
Secuencias cortas del terminal carboxilo y amino dirigen
la importación de proteínas a peroxisomas
- Varias enzimas de peroxisomas
contienen la secuencia de importación a
peroxisoma Ser-Lys-Leu (SKL) en el
terminal carboxilo (PST1).
- Receptores citosólicos (Pex5) se unen
a la secuencia señal y transfieren los
polipéptidos a un receptor en la membrana
del peroxisoma (Pex14).
- El complejo es transferido a un complejo
multiproteico que forma un canal y es
translocado.
- La importación requiere de hidrólisis de ATP,
aunque el mecanismo es desconocido.
- La impoprtación no requiere de gradiente
electroquímico.
- Las proteínas se importan plegadas.
- La secuencia SKL no se remueve en
la proteína madura.
Lodish et al, MCB 1999
Translocación post-traducción de proteínas del citosol al espacio
Periplásmico en bacterias gram-negativas
secΒ
secΒ
El translocon secY es homólogo al translocon sec61 de eucariotas. La chaperona secB une y
mantiene el polipéptido en conformación competente para su translocación. SecB interacciona y
transfiere el polipéptido a la ATPasa citosólica secA, la cual forma un complejo con el translocon.
La translocación del polipéptido requiere de cambios conformacionales de secA propulsados por
hidrólisis de ATP.
lisosomas
ribosoma
retículo
endoplásmico
aparato
de Golgi
transportadores
túbulo-vesículares
membrana
plasmática
las proteínas se insertan o atraviesan la membrana del RE a medida que
emergen del ribosoma (co-traducción).
las proteínas requieren de una secuencia señal hidrofóbica en el terminal amino.
las proteínas se transportan en estructuras tubulo-vesiculares que emergen del
compartimiento donor y se fusionan con el compartimiento aceptor.
Translocación post-traducción de proteínas del citosol al lumen del RE
en eucariotas
Algunas proteínas eucariotas se translocan al lumen del RE post-traducción y no requieren de un
complejo soluble de reconocimiento de la secuencia señal o SRP. Este proceso requiere del
translocon sec61, del complejo sec63, y de la chaperona del RE BiP.
chaperonas
citoplasmáticas
Sec63 forma un complejo con el translocon. (1) La secuencia señal se
inserta en el translocon y movimientos oscilatorios del polipéptido
inician su translocación. (2) Asociación de BiP-ATP al dominio luminal
de sec63, unión de baja afinidad con polipéptidos entrantes e hidrólisis
del ATP. BiP-ADP incrementa la afinidad por el polipéptido y evita su
retrotranslocación. (3, 4) La unión de sucesivas moléculas de BiP-ADP
al polipéptido entrante facilita la translocación. (5, 6) El intercambio de
ADP por ATP induce la disociación de BiP del polipéptido.
Lodish et al, MCB 2004
Translocación de proteínas a través del complejo sec61 o translocon
en la membrana del RE
bisagra
abertura
lateral
citosol
El complejo sec61 consiste de tres subunidades:
αβγ. La subunidad α posee 10 alfa-hélices
organizadas en dos dominios (en rojo y azul)
que forman el canal hidrofílico (~2nm Ø) por donde
se translocan los polipéptidos nacientes. En
reposo, el canal del translocon es obstruído por
una hélice alfa en la cara luminal. Esta alfa hélice
se retrae cuando el ribosoma se asocia al translocon.
lúmen
del RE
para ver estructura entrar en:
http://www.rcsb.org/pdb/explore/images.do?structureId=1RH5
Rappoport et al., TICS 2004
Una secuencia amino terminal hidrofóbica es esencial para
la translocación co-traducción de numerosas proteínas al RE
ejemplos de péptidos señal en tres proteínas de secreción
Protein
Preproalbumin
Pre-IgG light
chain
Prelysozyme
*
Amino Acid Sequence*
Met-Lys-Trp-Val-Thr-Phe-Leu-Leu-Leu-Leu-Phe-Ile-Ser-Gly-SerAla-Phe-Ser ? Arg . . .
Met-Asp-Met-Arg-Ala-Pro-Ala-Gln-Ile-Phe-Gly-Phe-Leu-Leu-LeuLeu-Phe-Pro-Gly- Thr-Arg-Cys ? Asp . . .
Met-Arg-Ser-Leu-Leu-Ile-Leu-Val-Leu-Cys-Phe-Leu-Pro-Leu-AlaAla-Leu-Gly ? Lys . . .
* los residuos hidrofóbicos estan en negrillas;
indica el sitio de corte de la peptidasa de la señal.
La secuencia señal, de aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, posee 8-12 residuos centrales
hidrofóbicos flanqueados por uno o mas residuos básicos. El flanco con más cargas positivas se orienta
hacia el citosol. La secuencia señal N-terminal se remueve en la mayoría de las proteínas de secreción.
Experimento que demuestra la importación
co-traducción de polipéptidos al lúmen del RE
microsomas: pequeñas vesículas del RE
que resultan de la ruptura de las células y
que pueden purificarse por centrifugación.
observación: las proteínas sintetizadas
in vitro y posteriormente mezcladas con
microsomas conservan la secuencia
señal y son degradadas con tripsina.
(proteína de secreción)
*(notar que el mecanismo de importación difiere
del descripto en los precursores mitocondriales).
observación: las proteínas sintetizadas en presencia
de microsomas se importan al lúmen de los
microsomas, la secuencia señal ha sido removida,
y son resistentes al tratamiento con tripsina.
Lodish et al, MCB 2004
Experimento que demuestra la localización
intravesicular de las proteínas de secreción
Marcado radioactivo de
proteínas en células vivas.
Incubación con metionina-35S
~ 24h
Homogeneizado de las células
y purificación de los microsomas
Se separan dos fracciones iguales,
una fracción es incubada con detergente.
Ambas fracciones son incubadas con
proteasa. Luego se analiza la integridad
de las proteínas de secreción radioactivas
por SDS-PAGE/autoradiografia.
Lodish et al, MCB 2004
Un complejo ribonucleoproteico (SRP) es esencial para asociar
al polipéptido naciente a la membrana del RE
El SRP es un complejo de seis proteínas asociadas
a una molécula de RNA (~ 300 nucleótidos). El dominio
Alu interacciona con el ribosoma y detiene la elongación
del polipéptido precursor. El dominio S interacciona con
la secuencia señal, el ribosoma y el receptor SR.
Al formarse el complejo SRP/SP/ribosoma, p54
adopta una conformación que le permite unir GTP.
ER membrane
La interacción del SRP y el receptor SR en el RE es
coordinada por la unión previa de GTP en ambos.
el receptor del SRP
(SR) es un heterodímero
Halic & Beckmann, COSB 2005
Modelo de transferencia y translocación del
polipéptido precursor al RE
La elongación de la cadena polipeptídica en el ribosoma
impulsa su translocación a través del canal del translocon.
La SRP se asocia al ribosoma y al péptido señal (2) y luego transfiere el complejo a un receptor localizado en el RE (3). El
canal del ribosoma es alineado con el canal del translocon y comienza la translocación (4). La hidrólisis del GTP induce la
disociación del SRP y su receptor y libera la secuencia señal, la cual es posicionada en el canal. Comenzada la translocación,
la secuencia señal es clivada por una peptidasa del lumen del RE (5). Concluida la translocación (6), el ribosoma se disocia
del RE (7) y el polipéptido se pliega en el lúmen del RE (8).
Lodish et al, MCB 2004
Resúmen de las características de secuencias proteicas
que confieren localización subcelular
Target Organelle
Usual Signal
Signal
Location
Removal*
within Protein
Endoplasmic
reticulum
N-terminal
(+)
Mitochondrion
N-terminal
(+)
Chloroplast
N-terminal
(+)
Peroxisome
C-terminal
( )
Internal
( )
Nucleus
Nature of Signal
"Core" of 6 12 mostly hydrophobic amino
acids, often preceded by one or more basic
amino acids
3 5 nonconsecutive Arg or Lys residues,
often with Ser and Thr; no Glu or Asp
residues . 25-50 residues long.
No common sequence motifs; generally
rich in Ser, Thr, and small hydrophobic
amino acid residues and poor in Glu and
Asp residues. 25-50 residues long.
Usually Ser-Lys-Leu at extreme Cterminus
One cluster of 5 basic amino acids, or two
smaller clusters of basic residues separated
by ? 10 amino acids
*
Indicates whether signal sequence usually is (+) or is not ( ) removed after a protein
enters its target organelle.
These signals direct the protein from the cytosol into the matrix space of the mitochondrion
or the corresponding stroma of the chloroplast; other signals discussed in the text redirect
proteins into other subcompartments of these organelles.
Lodish et al, MCB 2004
El reconocimiento de las señales de localización puede depender de
características de la secuencia primaria, secundaria o terciaria
NLS, SKL son ejemplos de señales
dependientes de la secuencia primaria.
La secuencia señal de proteínas de
mitocondrias y del RE depende
principalmente de las caracterísitcas
de la estructura secundaria.
Algunas NLS y la secuencia señal de
localización a lisosomas son
conformacionales.
secuencia señal de importación
a mitocondrias
Alberts et al, MBC 2002
Las proteínas de andamiaje o “scaffolding” contribuyen a concentrar
proteínas relacionadas funcionalmente en subcompartimientos del citosol
cAMP
PKA
AKAP79 asocia a las enzimas PKA
y PKC con diferentes receptores en
la membrana plasmática.
la proteína PSD-95 contribuye a concentrar
diversas proteínas en la post-sinapsis.
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