universidad austral de chile facultad de ciencias veterinarias

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
INSTITUTO DE PATOLOGÍA ANIMAL
EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE UNA VACUNA DE DNA PARA EL CONTROL
DEL VIRUS DE LA NECROSIS PANCREÁTICA INFECCIOSA (IPN) EN SALMÓN
DEL ATLÁNTICO (SALMO SALAR).
Memoria de título presentada como parte de los
requisitos para optar al TÍTULO DE
MÉDICO VETERINARIO
JAVIER AUGUSTO SUÁREZ SAN MARTÍN
VALDIVIA-CHILE
2009
PROFESOR PATROCINANTE
Ricardo Enríquez S.
Nombre
Firma
Gabriel Morán R.
Nombre
Firma
Jorge Toro Y.
Nombre
Firma
PROFESORES CALIFICADORES
FECHA DE APROBACIÓN:
5 de enero del 2009
A todos los que han hecho de mí el hombre que soy.
ÍNDICE
Capítulo................................. ............................................................................Página
1. RESUMEN……..........………………....……………………….............................1
2. SUMMARY……...……………………...........…………………............................2
3. INTRODUCCIÓN………………………………………........................................3
4. MATERIAL Y MÉTODO………………………………........................................8
5. RESULTADOS………………………………………..........................................12
6. DISCUSIÓN…………………………………………….......................................19
7. BIBLIOGRAFÍA………………………………………........................................23
8. ANEXOS………………………………………………........................................28
9. AGRADECIMIENTOS…………………………………......................................30
1 1. RESUMEN
Las vacunas de DNA ofrecen una serie de ventajas sobre las tecnologías ya existentes
para la producción de vacunas. Ellas estimulan tanto la respuesta inmune especifica como
inespecífica, la expresión endógena del antígeno dentro de las células del huésped puede
inducir una respuesta inmune completa y duradera.
En el presente estudio se utilizaron 256 ejemplares de salmón del Atlántico (Salmo
salar) de 10 - 15 gramos para evaluar una vacuna DNA experimental en el control de IPNV,
esto se realizó evaluando los parámetros inmunológicos de la respuesta inmune inespecífica,
medidos a través de la expresión del mRNA de interferón y proteína Mx. Mediante
seroneutralización se evaluó la respuesta inmune específica, se determinó la tasa de mortalidad
de peces vacunados y no vacunados, así como la cuantificación a través de titulación viral de
los órganos de peces desafiados con IPNV.
Se demostró que la vacuna DNA tiene un efecto estimulante del sistema inmune de S.
salar, con niveles que alcanzan su máximo a los 15 días y luego decaen. Los anticuerpos de
los peces inoculados con la vacuna DNA, desarrollado de la proteína VP2 de la cápside, son
mayores que los grupos controles, con un rango que va desde los 200 a los 400 títulos
neutralizantes, luego decae el título de inmunoglobulinas específicas para IPNV a un nivel similar
a los grupos control (50 título neutralizante). También se detectó un efecto sobre la cantidad de
virus que pueden replicarse en una proporción de 1:4,57 virus, en peces vacunados y no
vacunados, respectivamente.
Poly I-C utilizado como control positivo por su acción estimulante de la síntesis de INF
demostró poseer características hepatotóxicas para S. salar.
Palabras clave: vacuna DNA, salmón del atlántico, IPNV, poly I-C.
2 2. SUMMARY
“EVALUATION OF THE EFFECTIVENESS OF A DNA VACCINE FOR THE CONTROL
OF INFECTIOUS PANCREATIC NECROSIS VIRUS (IPN) IN ATLANTIC SALMON
(SALMO SALAR).”
The DNA vaccines offer a series of advantages over the already existing technologies
for the production of vaccines, they stimulate as the specific immune answer as the
unnespecific, the endogenous expression of the antigen inside the host cells can induce an
immune complete and lasting response.
In the present study there were used 256 Atlantic salmon specimen (Salmo salar) of 10
- 15 grams to evaluate a experimental DNA vaccine in the ipnv control this was realized
evaluating the inmunologics parameters of the inespecific immune, response measured
through the expression of the mRNA of interferon and protein Mx. through seroneutralization
evaluated the immune specifies response, in addition determined the rate of mortality of
vaccinated and not vaccinated fish, as well as the quantification through viral degree of the
fish organs challenged with IPNV.
It’s demonstrated that the DNA vaccine has a stimulating effect of the S. salar immune
system, with levels that reach it maximum to the 15 days and then they decrease. The
antibodies of the inoculated fish with the DNA vaccine, developed of VP2 capside, are
greater than the groups controls, with a rank that goes from the 200 to the 400 neutralizing
titles and then decrease the title of specific inmunoglobulins for IPNV at a similar level to the
control groups (50 neutralizing title). Also an effect was detected on the amount of virus that
can be talked back in a proportion of 1: 4.57 virus, in vaccinated and not vaccinated fish
respectably.
Used poly IC as positive control by its stimulating action of the INF synthesis
demonstrated to have hepatotoxics characteristics for S. salar.
Key words: DNA vaccines, Atlantic salmon, IPNV, poly I-C.
3 3. INTRODUCCIÓN
El virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) es el agente etiológico de una
enfermedad de distribución mundial que provoca severas pérdidas económicas en varias
especies de peces, principalmente en salmonídeos jóvenes. Los animales que sobreviven a la
enfermedad clínica y los infectados después de los 6 meses de edad se convierten en
portadores asintomáticos, representando riesgo de diseminación del agente a la salmonicultura
y el medio ambiente. Miembro de la familia Aquabirnaviridae (Dobos 1995), también causa
enfermedad en moluscos y crustáceos de agua dulce y salada de varias partes del mundo (Wolf
1988, Reno 1999, OIE 2005).
IPNV penetra a través de branquias y la boca, o a través de los poros sensoriales del
sistema de la línea lateral (Wolf 1988, Novoa y col 1995, Chou y col 1999). La transmisión
vertical se ha comprobado en trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), y trucha café (Salmo
trutta), en otras especies se han observado casos asociados a ovas o fluidos sexuales
infectados, que probablemente correspondan a una infección vertical por contaminación
externa de la ova (Reno 1999). Se ha propuesto que la infección vertical también está asociada
a la concentración de partículas virales (Rodríguez y col 2003).
IPNV posee en su cápside la proteína VP2 que es la principal proteína viral a la cual se
dirigen los anticuerpos neutralizantes tipo específicos, y también actúa como la proteína de
unión a las células (proteína viral de adhesión) lo cual le permite ingresar a la célula por
endocitosis y VP3 es una proteína interna de la cápside y su acción fundamental es en el
ensamblaje de la partícula viral (Granzow y col 1997).
La enfermedad es reconocida por su impacto en el cultivo de salmónidos en la Unión
Europea y Noruega (Roberts y Pearson 2005, Smail y col 2006) y otros países importantes en
el cultivo de salmónidos. Oceanía es considerada la única región libre (OIE 2005). Durante la
enfermedad clínica, la mortalidad es inversamente proporcional a la edad de los animales
afectados (Wolf 1988). El cuadro clínico más característico se presenta en la trucha arco iris
(O. mykiss), trucha de arroyo (Salvelinus fontinales), trucha café (S. trutta), salmón del
Atlántico (Salmo salar) y varias especies de salmón del Pacífico (Roberts y Pearson 2005). En
crías que han completado en forma normal la primera alimentación el brote suele ser menos
explosivo, pudiendo alcanzar pérdidas del 70% o más en un periodo de dos meses. Las
pérdidas en animales más grandes pueden ser de entre el 10 y 20%. Los peces más pequeños
tienden a ser más susceptibles al virus, la única excepción es el salmón Atlántico donde el
IPNV puede causar mortalidad crónica en los peces grandes, particularmente en el estrés de la
transformación a smolts y la introducción al agua salada (Roberts y Pearson 2005).
4 La enfermedad puede ocurrir en un rango amplio de temperaturas pero tiende a ser más
aguda de 10 a 15°C, en algunos casos se ha observado una disminución de la mortalidad
cuando la temperatura del agua se eleva por encima de los 16ºC y desciende a menos de
5,5ºC, los principales problemas ocurren en fase de agua dulce (pisciculturas y lagos).
Típicamente la mortalidad empieza a los 3 a 10 días después de la infección y culmina en 10 a
20 días. La mortalidad total de una infección aguda puede alcanzar un 70% o más en 2 a 4
semanas. Bajo ciertas condiciones el curso de la enfermedad puede hacerse más crónica con
menos mortalidad. Hasta un 90% de los sobrevivientes portan el virus y lo diseminan por las
fecas por el resto de la vida (Wolf 1988).
Externamente los peces afectados por IPN muestran natación errática, con violentos
movimientos rotatorios. Aparecen con una pigmentación oscura, una moderada exoftalmia y
distensión abdominal y algunas veces presentan hemorragias en el área ventral, incluyendo las
aletas ventrales y las branquias están pálidas (Wolf 1988).
Después de un periodo de viremia no detectable, aproximadamente al cuarto día
postinfección (p.i.) se observan áreas de necrosis en páncreas exocrino y otros órganos (Reno
1999), no obstante, la distribución viral puede ser variable en los distintos órganos. Eléouet y
col (2001) observaron que el virus podría ser encontrado en varios órganos a excepción del
páncreas, lo que puede estar asociado a un distinto nivel de tropismo tisular que presenten
diferentes aislados virales.
Al examen post mortem, el hígado y el bazo aparecen pálidos, y el estómago e
intestino con ausencia de alimento pero con fluido mucoide. Hemorragias petequiales son
evidentes en los ciegos pilóricos y tejido pancreático. Las células acinares pancreáticas, y
ocasionalmente la cubierta lipídica muestran una necrosis masiva caracterizada por picnosis,
cariorrexis, e inclusiones intracitoplasmáticas (Stoskopf 1992). La vesícula biliar puede estar
dilatada y repleta de bilis (Quaglio 1989). El epitelio intestinal necrótico se une con el exceso
de mucus para formar un exudado catarral blanquecino (McKnigth y Roberts 1976).
Las lesiones histológicas en juveniles son indicativas de infección viral aguda, con
extensa y progresiva destrucción de células acinares pancreáticas, escaso infiltrado
inflamatorio, el tejido endocrino y células adiposas circundantes se presentan normales o con
escasa necrosis (McKnight y Roberts 1976, Wolf 1988). En estómago e intestino anterior se
producen procesos variables de degeneración y necrosis (Smail y col 2006), desprendimiento
de mucosa (enteritis catarral) hacia el lumen intestinal, en donde se pueden observar células
epiteliales con citoplasma hialino eosinofílico y aumentadas de volumen, con núcleo
generalmente fragmentado, formando acúmulos de material basofílico, distribuido en periferia
celular, indicativas de un proceso de apoptosis (células McKnight) (McKnight y Roberts
1976). En hígado es posible encontrar áreas de necrosis focal o generalizada, las cuales suelen
ser severas en salmón, mientras que en trucha arcoíris son más moderadas o poco
5 significativas. También se observa degeneración y necrosis hematopoyética renal en distinto
grado (Roberts y Pearson 2005).
Los peces responden a infecciones virales a través de inmunidad específica e
inespecífica. La primera, se desarrolla semanas después del inicio de la infección y es influida
por la temperatura, edad o etapa de desarrollo del pez. El sistema inespecífico es una respuesta
más rápida, independiente de la temperatura y es el mecanismo de defensa más importante en
organismos acuáticos (Robertsen 2006).
La respuesta inmune humoral específica contra IPNV se observa como la producción
de anticuerpos neutralizantes específicos tipo IgM contra VP2 y VP3 (Jarp y col 1996). El
interferón (IFN) es una de las primeras líneas de defensa contra algunos virus, es un factor
celular inducido apenas después del establecimiento de la infección, antes que aparezca
cualquier otro mecanismo de defensa, las células bajo influencia de IFN sintetizan proteínas de
actividad GTPasa, conocidas como Mx, de las que se han descrito formas nucleares y
citoplásmicas que inhiben la multiplicación viral (Haller y col 1998). IPNV es inhibido en
células de salmón que expresan altos niveles de proteína Mx después de tratamiento con INF o
poly I-C (ácido poliinosínico-policitidílico) que es un potente inductor de IFN (Jensen y col
2002).
A pesar de la correlación entre inhibición de IPNV y expresión de proteínas Mx en
células tratadas con IFN, el modo de acción no se ha clarificado, se sugiere una interacción
directa de las proteínas Mx y los virus blanco (Goodbourn y col 2000, Jensen y col 2002,
Altmann y col 2003, Caipang y col 2003).
Es ampliamente aceptado que las vacunas constituyen la manera más efectiva que
existe para el combate de las enfermedades infecciosas debido al gran beneficio que brindan a
bajo costo, en comparación con el uso de antibióticos (Reyes y Pinto 2002). En 1990 se
introdujo un nuevo tipo de vacunas mediante un estudio que demostró la inducción de la
expresión de una proteína después de la inoculación de un plásmido de DNA en miocitos
(Ivory y Chadee 2004).
Las vacunas de DNA se basan en la inyección directa en el huésped de DNA
plasmidial que codifica para un antígeno de un patógeno, en lugar del antígeno proteico o del
patógeno atenuado o muerto. El DNA se encuentra inicialmente distribuido en los espacios
extracelulares de la mayor parte del músculo, antes de ser captado rápidamente por células
musculares próximas al sitio de inyección y células mononucleares localizadas entre las fibras
musculares (Dumonteil 2000).
La expresión endógena del antígeno dentro de las células del huésped puede inducir
una respuesta inmune completa y duradera. Esta respuesta incluye anticuerpos, aunque es
6 frecuentemente más débil que la que se puede obtener con vacunas recombinantes, así como
una activación fuerte y duradera de células T cooperadoras y citotóxicas (Dumonteil 2000).
De esta manera, se piensa que las vacunas de DNA pueden inducir la presentación de
antígenos a través de las vías tanto del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de
clase I como del CMH clase II, lo que lleva a la activación de células T cooperadoras CD4+ y
citotóxicas CD8+ (Dumonteil 2000). Este tipo de respuesta inmune es comparable a la
respuesta inducida por vacunas atenuadas, pero resulta muy difícil de inducir con vacunas
recombinantes lo que representa una de las grandes ventajas de las vacunas de DNA (Reyes y
Pinto 2002).
En adición a sus propiedades inmunogénicas, cabe enfatizar que el desarrollo y la
producción de vacunas de DNA son relativamente fáciles y de bajo costo ya que se utiliza un
proceso genérico para su producción. También son muy estables, lo que facilitaría el
almacenamiento y distribución de estas vacunas Estas características explican el gran interés
generado por las vacunas de DNA, las cuales se han probado con éxito contra un número
creciente de enfermedades (Dumonteil 2000).
En cooperación con el Consejo Superior de Investigaciones Científicas de España
(CSIC) se desarrollo el proyecto “Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa, caracterización
molecular de aislados españoles y chilenos, ensayo de una vacuna DNA frente a cepas
virulentas”– con la participación del laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática de la
UACH. Se realizó la construcción de una vacuna DNA experimental con un plásmido que
codifica únicamente la proteína VP2 del virus IPN y los controles que consisten en el
oligonucleótido sintético poly I-C, un plásmido control y solución salina que fueron evaluadas
en s. del Atlántico in vivo por este trabajo.
3.1 Hipótesis
La inyección i.m. de un plásmido de DNA que codifica para la proteína VP2 del
virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) estimula la respuesta inmune especifica e
inespecífica mediante la producción de proteína Mx, interferón tipo I e inmunoglobulinas en
s. del Atlántico (S. salar)
3.2 Objetivo general
El objetivo general es evaluar la eficacia de una vacuna experimental de DNA para el
control del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en s. del Atlántico (S. salar).
7 3.3 Objetivos específicos
Determinar la mortalidad en peces vacunados con una vacuna experimental DNA al
desafío intraperitoneal (i.p.) e intramuscular (i.m.) con IPNV.
Determinar la mortalidad en los peces controles inoculados con poly I-C, plásmido
control y solución salina estéril desafiados con IPNV.
Determinar los niveles de interferón y proteína Mx normalizada y anticuerpos antiIPNV en peces vacunados y no vacunados.
8 4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.1 MATERIALES
4.1.1 Material biológico
Para la realización de este estudio se utilizaron 256 ejemplares de salmón del Atlántico
(S. salar) de 10 - 15 gramos, obtenidos de una piscicultura sin historial de IPN.
Para las inoculaciones experimentales se utilizaron 2 cepas de IPNV (serotipo SP
nacional), proveniente del cepario del Laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática de la
Universidad Austral de Chile denominados p4 y p8.
4.2 MÉTODOS
4.2.1 Recepción de los peces
Antes de la inoculación, los peces fueron mantenidos en un estanque circular con filtro
y aireación constante durante una semana para su aclimatación. Se les realizaron chequeos
sanitarios a una muestra de 30 peces obtenidas al azar según lo estipulado por la Organización
Mundial de Salud Animal (OIE 2005), con el propósito de descartar la presencia de agentes
bacterianos y virales citopatogénicos que pudiesen alterar los resultados de la investigación.
4.2.2 Diseño experimental
Los peces fueron desafiados el día cero mediante inoculación intramuscular (i.m.) con
control positivo de poly I-C para el primer grupo, un control de plásmido vacio para el
segundo grupo, el plásmido que codifica para la proteína VP2 para el tercer grupo y un grupo
control a los cuales se les inocularon 0,1 ml de solución salina estéril (0,8 % NaCl). Se trabajo
los cuatro grupos por duplicado y previo a la inoculación, los peces fueron anestesiados por
inmersión con BZ-20® (Etil p-aminobenzoato) utilizando la dosis de 50mg/lt.
Posterior a la inoculación, los peces fueron distribuidos en 8 estanques de fibra de
vidrio dejando cada grupo por duplicado (cada estanque con 32 peces), en recirculación,
9 aireación constante y debidamente rotulados. La alimentación de los peces consistió en dieta
comercial al 1,5% del peso corporal/día.
Como medida preventiva se utilizó hipoclorito de sodio (6g/l) para la desinfección de
materiales, en el pediluvio y en la desinfección periódica de la sala de acuarios. Todas las
muestras de los peces infectados o no infectados, cultivos microbianos y materiales utilizados
fueron esterilizados en autoclave previo su eliminación, para así evitar la posible diseminación
del agente.
Los estanques fueron revisados diariamente para el control de la temperatura del agua
y mortalidad.
4.2.3 Muestreo de parámetros inmunológicos
Los días 0, 5, 10, 15 y 32 del experimento respectivamente, 3 peces por acuario fueron
sacrificados al azar y se tomaron muestras de sangre para obtener suero y medir
inmunoglobulinas contra IPNV, también se tomaron muestras de riñón para la obtención de
RNA y posteriormente la cuantificación de la concentración de proteína Mx e interferón
normalizados con β actina.
4.2.3.1 Medición de inmunoglobulinas. Se utilizó un pool de sangre de los 3 peces por acuario
mediante aspiración con una jeringa tuberculina desde la vena caudal de los peces y
depositado en un tubo eppendorf estéril, durante media hora reposaron a temperatura
ambiente, luego reposaron durante una hora refrigerados y finalmente fueron centrifugados a
9.503 G a 4 ºC durante 15 minutos, se extrajo el sobrenadante el cual fue depositado en un
nuevo tubo eppendorf estéril y congelado hasta su envio a CSIC-España.
4.2.3.2 Cuantificación de proteína Mx, interferón y β actina. La extracción del RNA se efectuó
según el protocolo de Chomczynski-fenol que al mezclar la muestra con el reactivo
Chomczynski-fenol y distintos alcoholes más los pasos de centrifugación permiten precipitar
el RNA y separarlo del resto de los componentes donde se encuentra (Anexo 1) (Chomczynski
y Sacchi 1987).
La muestra de RNA fue transcrita a cDNA mediante la reacción de Transcripción
reversa de RNA mensajeros eucarioticos (Anexo 2.) (Temin y Mizutani 1970).
Los cDNA fueron enviados a España para su análisis mediante RT-PCR específico
para proteína Mx e interferón (Anexo 3) (de las Heras y Perez 2008).
10 4.2.7 Titulación viral
El título viral se obtuvo a través de diluciones seriadas de la muestra según el método
del punto final 50%, para ello se realizaron diluciones en base 10, luego se agrego 0,1 ml de
cada una de estas diluciones a un pocillo de una microplaca de titulación que contiene una
monocapa de células CHSE-214 (Chinook salmon embryo), de 12-24 horas de incubación;
cada dilución se sembró en duplicado, luego se espero 2 a 3 días con un máximo de 7 días,
para realizar la lectura de la presencia o ausencia de CPE (efecto citopático) y posteriormente
realizar el cálculo del título viral en TCID50/ml (Reed y Müench 1983).
4.2.4 Desafío con IPNV
Los peces fueron desafiados el día 36 post vacunación mediante inoculación
intraperitoneal e intramuscular con 0,1 ml de una suspensión viral en concentraciones
definidas de IPNV con dos tipos de cepas p4 europeo serotipo Sp en una concentración 107,83
TCID50/ml y p8 nacional serotipo Sp en una concentración de 108,93 TCID50/ml.
4.2.6 Confirmación de la mortalidad por IPNV
Con los peces moribundos y/o muertos se efectuó un completo examen de necropsia
siguiendo el procedimiento descrito por la American Fisheries Society, Fish Health Blue Book
(1992). Para la realización del examen externo, se consideraron principalmente estado de la
piel (coloración e integridad), aletas, ojos, branquias y opérculo.
Posterior al examen externo, se realizó el examen interno, que brevemente consiste en
el corte de aleta izquierda por la base mediante el uso de tijeras, introducción de la punta de la
tijera en la base de la aleta, un corte ventral hasta la línea media siguiendo el curso de esta
hasta poco antes del poro anal, luego un corte dorsocraneal siguiendo la línea lateral y luego
caudalmente al opérculo, desprendiendo la pared ventrolateral izquierda y realizando la
observación de los órganos internos, teniendo en consideración rasgos tales como: color y
consistencia, hemorragias, inflamación, presencia de pústulas, nódulos y contenido de
alimento o mucus en el estómago e intestino.
Al finalizar el desafío experimental, los peces vivos fueron sacrificados con una
sobredosis de BZ-20® (Etil p_aminobenzoato) y posteriormente sometidos a exámenes de
necropsia y aislamiento viral.
11 4.2.7 Aislamiento en cultivo celular
Todos los peces sobrevivientes fueron muestreados para medir la actividad viral en sus
organismos. Para este examen, las muestras de tejidos se obtuvieron con la máxima esterilidad
posible. Luego de realizar la necropsia, se obtuvo pequeños trozos de riñón y bazo, estas se
colocaron en un tubo con medio de cultivo MEM al 2% de suero fetal bovino y antibióticos
(400 UI de penicilina /ml y 400 ug de estreptomicina /ml), que posteriormente se maceró en
un mortero con arena esterilizada.
El homogeneizado fue centrifugado a 1.164,12 durante 10 minutos a 4ºC, luego se
recuperó el sobrenadante y se inoculó en una monocapa celular (CHSE-214), una vez
alcanzado el tiempo de absorción del virus (15ºC/1 hora), se añadió en cada pocillo 1 ml de
MEM con 2% de suero fetal bovino. La placa fue mantenida a 15 ºC en cámara de incubación,
y observada diariamente hasta la aparición de efecto citopático (CPE) por 7 días, confirmando
la presencia o ausencia del virus.
4.2.8 Diagnóstico por histología
Se enviaron 5 muestras de hígado pertenecientes al grupo inoculado con poly I-C al
laboratorio de Anatomía patológica de la Universidad Austral de Chile, para su diagnóstico.
4.2.9 Cálculo del Porcentaje Relativo de Sobrevivencia
Con los datos de mortalidad de los peces inoculados con IPNV p4 y p8 se determinó el
Porcentaje Relativo de Sobrevivencia (RPS). Este es un método adecuado para evaluar en
forma objetiva los resultados de una vacuna que consiste en desafiar a dos grupos de
peces (vacunados y no vacunados) con un aislado virulento del patógeno en estudio. Los datos
de mortalidad obtenidos en el estudio son analizados a partir de una fórmula matemática
(RPS) que entrega la sobrevivencia atribuible a la vacunación (Nordmo 1997).
RPS = 1 - % Mortalidad peces vacunados
% Mortalidad peces no vacunados
x 100
12 5. RESULTADOS
Se presentan a continuación los resultados del estudio que evaluó la inoculación
intramuscular de; una vacuna DNA experimental codificante para la proteína VP2 de IPNV,
poly I-C, un plásmido control y solución salina.
5.1 SERONEUTRALIZACION
5.1.1 Título de Neutralización de Suero
Se desprende que se produce un aumento de la respuesta inmune específica, medida
según el aumento de inmunoglobulinas específicas para IPNV, en el grupo inoculado con la
vacuna DNA mayor que los controles entre los 200 a los 400, es importante destacar que al día
32 del experimento todos los peces en el ensayo mostraron títulos entre 20 y 50 como se observa
en la tabla 1, el número de inmunoglobulinas para el grupo vacunado decae a 50.
Tabla 1: Títulos neutralizantes anti IPNV en S. salar vacunados con vacuna DNA (VP2) y
controles con solución salina (SS) y plásmido vacío (PV) según los días post vacunación.
TITULO DE NEUTRALIZACION DE SUEROS
5 Días
10 Días
SS-1
20
20
SS-2
50
50
SS-3
20
20
VP2-1
100
200
VP2-2
200
200
VP2-3
200
200
PV-1
50
20
PV-2
20
50
PV-3
50
100
15 Días
20
20
50
100
200
400
20
20
50
32 Días
20
50
20
50
50
50
50
50
20
13 5.2 ANALISIS DE LA EXPRESIÓN DEL mRNA DE PROTEÍNA Mx, INTERFERÓN
Y β ACTINA
La repuesta inmune inespecífica, medida a través de la concentración de interferón y
proteína Mx normalizados con β actina, muestran un aumento alrededor de los 15 días post
inoculación de la vacuna pero esta respuesta decae en las muestras tomadas el día 32 del
experimento (Gráfico 1).
Gráfico 1: expresión normalizada de proteina Mx a los 5, 10, 15 y 32 días post inoculación en
S. salar inoculados con plásmido vacío (PV), solución salina (S.S) y la vacuna DNA antiIPNV (VP2).
14 Gráfico 2: Expresión de interferón en S. salar inoculado con plásmido vacío (PV) y vacuna
DNA anti-IPNV (VP2)
5.3 TITULACIÓN VIRAL
5.3.1 Cultivo celular
En células CHSE-214 se evidenció presencia de IPNV activo en todos los peces
analizados, presentando una concentración menor de virus los grupos vacunados (316.227,766
partículas virales por ml) a diferencia de los grupos control no vacunados (1.445.439,77
partículas virales por ml).
Los resultados del análisis de muestras de riñón-bazo de s. del Atlántico (S. salar) para
detectar IPNV se presentan en la siguiente gráfico.
15 Gráfico 3: Promedios de la titulación viral de s. del Atlántico (S. salar) sobrevivientes al
desafío inoculados con vacuna DNA anti-IPNV (VP2), solución salina (S.S) y plásmido vacío
(PV).
5.4 MORTALIDAD
Las mortalidades fueron observadas diariamente durante los 64 días que duró el
experimento. El mayor número de mortalidades se produjo antes del desafío, especialmente en
el grupo inoculado con poly I-C en el cual el 100% de los individuos murió antes del desafío,
post desafío solo se observaron mortalidades en los grupos controles.
5.4.1 Mortalidad en S. salar inoculados con vacuna DNA
Las mortalidades fueron de 1 pez en el estanque 1 y 1 en el duplicado, no se registraron
mortalidades después del desafío.
5.4.2 Mortalidad en S. salar inoculados con plásmido vacio
Las mortalidades fueron del orden de 0 para el estanque 1 y 6 para el duplicado las
semanas anteriores al desafió, se registraron mortalidades del orden de 2 para el estanque 1 y 2
para el duplicado después del desafío.
16 5.4.3 Mortalidad en S. salar inoculados con s. salina
Las mortalidades fueron del orden de 4 para el estanque 1 y 0 para el duplicado, las
semanas anteriores al desafió, se registraron mortalidades del orden de 1 para el estanque 1
después del desafío no se presentaron mortalidades el duplicado.
Los peces sobrevivientes fueron sacrificados al final del estudio aislándose el virus en
todos los grupos mediante cultivo celular desde el riñón y bazo y se les realizó un RT-PCR a
tres muestras de riñón e hígado a todos los grupos exceptuando el grupo control inoculado
con Poly I-C.
Las mortalidades ocurridas después del desafío se agruparon en la tabla 2.
Tabla 2: Mortalidad post desafío semanal, total y porcentual (%) en S. salar inoculados con
vacuna anti-IPNV (VP2), plásmido vacio (PV) y s. salina (S.S.).
semana
VP2
%
PV
%
S.S
%
9
0
0%
0
0%
1
3%
10
0
0%
2
7%
0
3%
11
0
0%
1
10%
0
3%
12
0
0%
0
10%
0
3%
13
0
0%
0
10%
0
3%
14
0
0%
1
13%
0
3%
total
0
0%
4
13%
1
3%
5.4.4.1 Mortalidad en s. del Atlántico (S. salar) inoculados con poly I-C
Todas las mortalidades fueron anteriores al desafío, se registraron mortalidades del
100% en ambos grupos por lo que se decidió enviar 5 muestras de hígado al laboratorio de
Anatomía patológica del Instituto de Patología Animal de la Universidad Austral de Chile, el
resultado es el siguiente.
17 5.4.4.2 Descripción histopatológica
Múltiples focos irregulares de necrosis de coagulación aguda, preferiblemente en
ubicación perivascular, marcada degeneración macro y microvacuolar de tipo difuso en
hepatocitos, con amplias zonas en que se ha perdido la estructura histológica. Severa
congestión y hemorragias difusas.
Las conclusiones del especialista fueron: las lesiones encontradas en las muestras de
hígado estudiadas, degeneración y necrosis, se pueden asociar con un origen tóxico,
principalmente por sus características microscópicas, su amplia distribución y la ausencia de
reacción inflamatoria.
Figura 1: Fotografía del hígado de S. salar inoculado con poly I-C nótese los cuadros de
necrosis, la pérdida de la arquitectura celular y la vacuolización de los hepatocitos.
18 5.5 CONFIRMACIÓN DE LA MORTALIDAD POR IPNV
5.5.1 Signología clínica
No se presentó signología alguna ni evidencia de lesiones macroscópicas de IPNV
tanto interna como externamente.
5.6 RESULTADOS DEL PORCENTAJE RELATIVO DE SOBREVIVENCIA (RPS)
A partir de los resultados de mortalidad presentados en la tabla 2 y al aplicar la fórmula
de RPS se determinó lo siguiente:
% mortalidad peces vacunados: 0%
% mortalidad peces inoculados con plásmido vacío: 13%
% mortalidad peces inoculados con s.sal: 3%
RPS peces inoculados con plásmido vacío: 7,69%
RPS peces inoculados con s. sal: 33,33%
19 6. DISCUSIÓN
El objetivo del estudio fue evaluar el nivel de respuesta inmune de s. del Atlántico (S.
salar) vacunados con un vacuna experimental de DNA contra el IPNV. Para esto se
conformaron grupos de 32 peces en duplicado, considerando controles que recibieron inóculos
de plásmido vacío, solución salina estéril y poly I-C, lo que permite fortalecer la validez de los
resultados en este tipo de ensayos (Amend 1981).
En este estudio, se eligió la vía intramuscular e intraperitoneal para reproducir
experimentalmente la enfermedad. Este método de inoculación tiene la ventaja que ya ha sido
probado exitosamente para IPN (Stangeland y col. 1996, Taksdal y col. 1998, San Martín
2001, Bowden y col. 2002, Mansilla 2002) lo cual proporcionó una mayor certeza al
experimento ya que se asegura la infección de cada espécimen en el experimento y el
desarrollo de la enfermedad, importante para efectuar el cálculo de RPS.
Sin embargo, se debe mencionar que la inyección de agentes infecciosos por lo general
no es un método de desafío natural, ya que muchos de los mecanismos de defensa, tanto
específicos como inespecíficos, son artificialmente sobrepasados, por lo tanto es probable que
esta vía artificial de desafío no esté relacionada con los mecanismos naturales de penetración
que utiliza el agente patógeno. Es por esto que posiblemente los resultados obtenidos varíen si
se emplean otras rutas de infección (Amend 1981).
La dosis utilizada de IPNV serotipo Sp fue de 107,83 TCID50/ml para la cepa p4 y una
concentración de 108,93 TCID50/ml para la cepa p8, dosis superiores a la empleada por San
Martín (2001), que con una dosis de IPNV serotipo Sp de 1,5 x 105 TCID50/ml alcanzó durante
el desafío de s. del Atlántico una mortalidad promedio en el grupo control de un 30%, también
superior a la concentración utilizada por Cristi (2003) quien alcanzo durante el desafío una
mortalidad de 25,71% para el grupo control utilizando una concentración de 105,6 TCID50/ml
para el desafío, y también superior a la concentración utilizada por Navarrete (2004) con un
título de 106,5 TCID50/ml que durante el desafío obtuvo una mortalidad promedio en el grupo
control de alrededor de un 17,14%. Mortalidades superiores al comparar el 13% para plásmido
vacío y 3% para solución salina obtenido en este estudio.
El tamaño de los peces utilizados en estos estudios difieren entre sí, los peces más
pequeños tienden a ser más susceptibles al virus y rara vez se producen mortalidades en los
peces de más de 5 gramos (Wolf 1988). El peso de los peces utilizados en el presente estudio
fluctuó entre 10 a 15 gramos lo que disminuye su susceptibilidad a IPNV.
20 La temperatura óptima para la replicación de IPNV es entre 10 y 14 °C (Stoskopf
1992). En el presente experimento la temperatura fluctuó entre 9 y 19,5 °C, lo que pudiera
haber influido en la tasa de replicación viral. Adicionalmente, se utilizaron cepas de virus IPN
provenientes del Laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática de la UACH, que estaban
almacenadas a -80 °C Existe evidencia de que cepas de IPNV almacenadas y subcultivadas
repetidamente en células, generalmente sufren una modificación en su virulencia de forma
negativa, obteniendo virus atenuados o poco virulentos (Park y Reno 2003, Ogut 2004).
Además el uso de líneas familiares de peces que sean susceptibles a la infección con
IPNV es decisivo para el resultado de este tipo de experimentos (Taksdal 1999). Es así como
se ha demostrado que algunas familias de peces pueden ser más resistentes a la infección con
IPNV, característica que puede ser heredable y fortalecida por cruzamientos selectivos
(Stoskopf 1992). Los peces utilizados en el ensayo no fue posible definir su origen familiar,
por lo que la baja mortalidad presentada por los especímenes utilizados durante el desafío,
pudiera estar relacionada con su resistencia a IPNV.
Debido a que los resultados de cada experimento dependen de las condiciones de los
peces (especie, edad, estado de madurez, exposición temprana a agentes infecciosos), del
agente (serotipo, cepa, grado de atenuación durante el cultivo celular, concentración y
virulencia), del método de infección (baño, cohabitación, inyección) y del medio ambiente
(temperatura, calidad del agua, alimentación y otros manejos) no se ha podido estandarizar un
modelo experimental repetible que permita comparar los resultados de diferentes
investigaciones (Taksdal y col. 1998, Taksdal 1999, Bowden y col. 2002), es por esto que en
este estudio se usaron los criterios mas comunes para medir nivel de protección que puede
otorgar una vacuna, porcentaje de mortalidad y porcentaje relativo de sobrevivencia (RPS).
Existen criterios descritos por Nordmo (1997), que utilizando el RPS se puede clasificar una
vacuna en 3 categorías:
• RPS < 70 = Vacunación deficiente.
• RPS > 70 = Vacunación suficiente.
• RPS > 80 = Vacunación exitosa.
Según esta escala la vacuna DNA estudiada ofrecería una protección deficiente, pero la
determinación del RPS para este experimento es sólo referencial, dado que es necesario que
los grupos control hayan tenido mortalidades mínimas del 60% para que sea válido este
análisis (Ellis 1988).
El Servicio Agrícola y Ganadero (SAG), considera como satisfactoria una prueba de
vacunación en salmonídeos, cuando la mortalidad acumulada (%) del grupo control es > 60%
y el RPS del grupo vacunado es > 75%. Según estos parámetros la vacuna DNA estudiada no
21 cumple con los requerimientos ya que la mortalidad acumulada solo alcanzó un 13% para
plásmido vacio y 3% para solución salina y el RPS del grupo vacunado contrastado con peces
inoculados con plásmido vacío fue de 7,69% y del grupo vacunado contrastado con peces
inoculados con solución salina fue de 33,33%.
Las vacunas de DNA ofrecen una serie de ventajas sobre las tecnologías ya existentes
para la producción de vacunas. Estas estimulan tanto la respuesta inmune humoral como la
celular y a diferencia de las vacunas con microorganismos recombinantes, no hay respuesta
inmune hacia el vector lo cual permite su utilización de manera repetida. La vacunación
genética puede considerarse segura, y debido a que no se administran microorganismos vivos
puede emplearse en individuos inmunocomprometidos (Reyes y Pinto 2002).
Se ha observado que en peces de edad susceptible la expresión de Mx es más aguda,
mayor y más prolongada que en los no susceptibles, lo que puede explicarse por la síntesis
viral y presencia de dsRNA que estimula la síntesis de IFN (Lockhart y col. 2004).
Lockhart y col. (2004) indican que la inyección de IPNV en s. del Atlántico post-smolt
induce rápida expresión del mRNA de la proteína Mx desde el día 1 y hasta los 11 días, y que
esta respuesta no elimina la infección. En contraste, peces mayores portadores de IPNV no
expresan transcritos de proteína Mx. Mientras que Acosta y col (2005) describe un pick de
expresión de Mx el día 6 después de la inoculación de una vacuna DNA para VHS que
decrece hasta niveles basales el día 12 p.i. para S. salar y un pick de expresión el día 12 para
O. mykiss con una caída el día 21 p.i.. En este estudio se obtuvo un pick en la expresión de Mx
el día 15 post vacunación, decayendo posteriormente al día 32 post vacunación para la vacuna
DNA experimental contra IPNV. Es interesante destacar la diferencia en la respuesta de la
expresión de proteína Mx para una misma especie (S. salar) inoculada con diferentes vacunas
DNA.
El ácido poliinosínico-policitidílico (poly I-C) es un oligonucleótido sintético que se
usa como control positivo en este tipo de estudios, al ser un dsRNA induce INF, que a su vez,
determina un patrón complejo de cambios fisiológicos que conducen al establecimiento de un
estado anti-viral en las células no infectadas (Trobridge y Leong 1995, Jensen et al. 2002).
Esta sustancia en S. salar, resultó tóxica, provocando severas lesiones en el hígado como
necrosis de coagulación, destrucción de la arquitectura celular y apoptosis, que determinó la
muerte de los peces inoculados. Acosta y col. (2005) describe similares observaciones en uso
de poly I-C como control positivo, por lo tanto no se recomienda su uso como control en s. del
Atlántico.
De lo expuesto anteriormente y considerando los objetivos de este estudio se concluye
que:
22 La vacuna de DNA utilizada en este experimento presenta un efecto estimulante del
sistema inmune inespecífico y específico, medidos a través de la expresión del mRNA de IFN
y proteína Mx con niveles que alcanzan su máximo a los 15 días y luego decaen. Los
anticuerpos producidos por los peces inoculados con la vacuna DNA son mayores que los
controles, con un rango desde los 200 a los 400 títulos neutralizantes, al día 32 del experimento,
decae el número de inmunoglobulinas específicas para IPNV a un nivel similar a los grupos
control (50 títulos neutralizantes), también tiene un efecto sobre la cantidad de virus que pueden
replicarse en una proporción de 1 : 4,57 virus, lo cual parece ayudar a que disminuyan los
peces portadores o carriers para el control de la necrosis pancreática infecciosa (IPN) en
salmón del Atlántico (S. salar).
23 7. BIBLIOGRAFÍA
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28 8. ANEXOS
Anexo N°1: Extracción de RNA método de Chomczynski.
A 0,1 ml de tejido se le agregan 1ml de solución de Chomczynski. Se incuba por 5
minutos a temperatura ambiente y luego se agregan 0,2 ml de cloroformo. Se agita por
inversión (15 segundos en vortex) unas 10 veces y se incuba 2-3 minutos a temperatura
ambiente. Se centrifuga a 12000 g (11300 rpm) durante 15 minutos a 4 ºC. Se transfiere la fase
acuosa ( superior y transparente) a un tubo eppendorf estéril.
A la fase acuosa se añaden 0,5 ml de alcohol isopropílico. Mezclar por inversión (5-10
veces). Incubar a -20 ºC toda la noche. Se centrifuga a 12000 g (11300 rpm) durante 15
minutos a 4 ºC. Se elimina el sobrenadante y se lava el precipitado de RNA con 1 ml de
alcohol etílico al 75%. Se mezcla por inversión (5 a 10 veces) y luego se centrifuga a 7500 g
(9000 rpm) durante 5 minutos a 4 ºC. Elimine el sobrenadante y seque el precipitado al aire
por 10 minutos. Disuelva el precipitado en 100 μl de agua sin nucleasas/DEPC e incube a 5060 ºC durante 5 minutos (si no se disuelve). Cuantificar el RNA extraído. Guardar a -70 ºC.
Anexo N°2: Transcripción reversa para RNA de mensajeros eucariticos
Esta técnica se basa esencialmente en la detección de secuencias de RNA específicas
presentes en el genoma viral de IPNV.
Para ello, en primer lugar se realiza la extracción del RNA viral desde las muestras de
sobrenadante de riñón-bazo de s. del Atlántico (Salmo salar) mantenidas en refrigeración,
luego de lo cual se aplica la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), acoplada
con la reacción de transcriptasa reversa (RT) para así lograr la obtención del DNA
complementario (cDNA) a partir del RNA viral. Para tal reacción, se utilizan primers o
partidores oligonucleotídicos
Anexo N°3 RT- PCR para la identificación de IPNV.
La amplificación fue realizada en Cycler Q Real-Time PCR Detection System (BioRad, Madrid, España) y las sondas TaqMan y los partidores fueron diseñados para amplificar
29 el los RNA mensajeros de MX, e interferón tipo I y como control interno se utilizo el gen de
β actina. (Número de acceso AJ 580911) de trucha.
La amplificación de PCR fue realizada en un volumen final de 20 µL. Un microlitro de
cDNA fue agregado a la mezcla siguiente contenida en pocillos individuales de una placa
óptica de 96 pocillos (bio Rad): 10 μl de mix iQ (bio Rad), 8 μl de dH2O y 1 μl de mezcla 20×
que contiene el partidor forward (18 μM), el partidor revers (18 μM) y la sonda TAqMAN (5
μM) (assay-by design service PE Applied Biosystem). Las condiciones de la reacción fueron
las sig. 50°C por 2 minutos, 95° C por 10 minutos seguidos por 40 ciclos de 95°C para 15s y
60°C para 1min. Se realizo una cuantificación relativa de los transcritos y La eficacia de los
partidores y sondas fueron probadas usando una dilución seriada en base 10 del templado a
una concentración conocida para construir una curva de calibración estándar. Los datos fueron
analizados usando el software iQ5 Optical System (versión 2.0).
Se uso una cuantificación relativa de los productos amplificados el q fue calculado
comparando los respectivos Ct de cada gen en las muestras. El grupo de pescados inyectados
con PBS fue usado como grupo control. Todas las muestras fueron analizadas en triplicado y
los resultados fueron expresados como cambio de la expresión respecto al control.
30 AGRADECIMIENTOS
Mis más sinceros agradecimientos a mi profesor patrocinante Dr. Ricardo
Enríquez por su constante ayuda y buena disposición, a la Sra. Mónica Monrás, Sra. Vania
Quinteros, Dr. Alex Romero, Dr. Enrique Paredez y Sr. Esteban Henríquez por todo su
apoyo, ayuda y confianza entregados durante el desarrollo de este trabajo.
A Sylvia Rodríguez del CSIC de España, que a la distancia colaboro enormemente en
este trabajo.
A mis amigos, esa gran familia que yo escogí, generosa en sentimiento y
sabiduría. Gracias a todos por vuestro apoyo, amor y consejo oportuno.
A la tía Lola, tío Humberto y Camila quienes me acogieron en su casa y brindaron todo
su cariño y apoyo durante mi época estudiantil.
A mi familia, en especial a mi madre. Por todo el sacrificio, apoyo, paciencia y ánimo
difundidos.
A María José por toda su compañía, cariño, comprensión y atenciones. Ella se
llevó lo peor de esto. Gracias por soportarme.
A la innumerables personas que participaron en mi desarrollo personal y profesional
durante mi estadía en la UACH.
A mi padre quien falleció durante la elaboración de este estudio…ojala pudieras verlo
terminado.
… a todos ellos muchas gracias.