derivados de somatostatina y sus productos radiomarcados.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
11 Número de publicación: 2 197 169
51 Int. Cl. : C07K 14/655
7
A61K 51/08
A61K 38/31
ESPAÑA
12
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 94925686.1
86 Fecha de presentación: 21.07.1994
87 Número de presentación de la solicitud: 0804481
87 Fecha de publicación de la solicitud: 05.11.1997
54 Título: Derivados de somatostatina y sus productos radiomarcados.
30 Prioridad: 21.07.1993 US 95760
73 Titular/es: DIATIDE, Inc.
9 Delta Drive
Londonderry, NH 03053, US
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
01.01.2004
72 Inventor/es: Mcbride, William y
Dean, Richard T.
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Lehmann Novo, María Isabel
ES 2 197 169 T3
01.01.2004
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Derivados de somatostatina y sus productos radiomarcados.
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Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
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La presente invención se refiere a agentes y péptidos terapéuticos, a agentes y péptidos radioterapéuticos, a agentes
y péptidos radiodiagnósticos, y a procedimientos para producir dichos agentes radiodiagnósticos y radioterapéuticos
marcados. Específicamente, la invención se refiere a derivados y análogos peptídicos de somatostatina lineales, y a
realizaciones de dichos péptidos marcados con radioisótopos que emiten radiación gamma, tales como tecnecio 99m
(Tc-99m), así como a procedimientos y estuches (kits) para preparar, radiomarcar y utilizar dichos péptidos para la
formación de imágenes médicas de sitios en un cuerpo de mamífero. La invención se refiere asimismo a derivados y
análogos peptídicos de somatostatina marcados con radioisótopos citotóxicos, tales como renio-186 (186 Re) y renio188 (188 Re), y a procedimientos y estuches para preparar, radiomarcar y utilizar dichos péptidos terapéuticamente en
un cuerpo de mamífero.
2. Descripción de la técnica anterior
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La somatostatina es un tetradecapéptido que es producida endógenamente por el hipotálamo y el páncreas en seres
humanos y otros mamíferos. El péptido presenta la fórmula:
Fórmula I
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(Se pueden encontrar abreviaturas de una sola letra para aminoácidos en la publicación Biochemistry, de G. Zubay
(2ª ed.), 1988, (MacMillan Publishing: Nueva York), pág. 33). Este péptido ejerce una amplia diversidad de efectos
biológicos in vivo. Es conocido que actúa fisiológicamente sobre el sistema nervioso central, el hipotálamo, el páncreas
y el tracto gastrointestinal.
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La somatostatina inhibe la liberación de insulina y de glucagón procedentes del páncreas, inhibe la liberación de la
hormona del crecimiento procedente del hipotálamo y reduce las secreciones gástricas. Por lo tanto, la somatostatina
presenta aplicaciones clínicas y terapéuticas para el alivio de cierto número de dolencias y enfermedades, tanto en
seres humanos como en otros animales. La somatostatina nativa presenta una utilidad limitada, sin embargo, debido al
corto tiempo de semidescomposición in vivo, en que es degradada rápidamente por peptidasas. Por esta razón, se han
desarrollado en la técnica anterior análogos de somatostatina que presentan una estabilidad mejorada in vivo.
Freidinger, en la patente de los EE.UU. Nº 4.235.886 da a conocer análogos de somatostatina hexapeptídicos
cíclicos que son útiles en el tratamiento de cierto número de enfermedades en seres humanos.
45
Coy y Murphy, en la patente de los EE.UU. Nº 4.485.101 dan a conocer análogos de somatostatina dodecapeptídicos sintéticos.
50
Freidinger, en la patente de los EE.UU. Nº 4.611.054 da a conocer análogos de somatostatina hexapeptídicos
cíclicos que son útiles en el tratamiento de enfermedades en seres humanos.
Nutt, en la patente de los EE.UU. Nº 4.612.366 da a conocer análogos de somatostatina hexapeptídicos cíclicos
que son útiles en el tratamiento de cierto número de enfermedades en seres humanos.
55
Coy et al., en la patente de los EE.UU. Nº 4.853.371 dan a conocer análogos de somatostatina octapeptídicos
sintéticos.
Coy y Murphy, en la patente de los EE.UU. Nº 4.871.717 dan a conocer análogos de somatostatina heptapeptídicos
sintéticos.
60
Coy et al., en la patente de los EE.UU. Nº 4.904.642 dan a conocer análogos de somatostatina octapeptídicos
sintéticos.
65
Taylor et al., en la patente de los EE.UU. Nº 5.073.541 dan a conocer un procedimiento para el tratamiento del
cáncer de pulmón de células pequeñas.
Brady, en el documento EP-A-0.113.029 da a conocer análogos de somatostatina hexapetídicos dicíclicos que son
útiles en el tratamiento de cierto número de enfermedades en seres humanos.
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Bauer et al., en el documento EP-A-0.187.622 dan a conocer derivados de somatostatina que son útiles en el
tratamiento de cierto número de enfermedades en seres humanos.
5
Eck y Moreau, en el documento EP-A-0.389.180 dan a conocer análogos de somatostatina octapeptídicos terapéuticos.
Coy y Murphy, en el documento EP-A-0.395.417 dan a conocer análogos de somatostatina lineales.
Coy y Murphy, en el documento WO-A-91/09.056 dan a conocer análogos de somatostatina para usos terapéuticos.
10
Schally et al., en el documento EP-A-0.450.480 dan a conocer péptidos cíclicos para uso terapéutico.
Bodgen y Moreau, en el documento WO-A-92/13.554 dan a conocer composiciones y procedimientos para el
tratamiento de enfermedades cutáneas proliferativas.
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La somatostatina ejerce sus efectos uniéndose a receptores específicos expresados en la superficie celular de células
que constituyen el sistema nervioso central, el hipotálamo, el páncreas y el tracto gastrointestinal. Se ha encontrado
que dichos sitios de unión de somatostatina de alta afinidad están abundantemente expresados en la superficie celular
de la mayoría de los tumores con actividad endocrina que surgen a partir de dichos tejidos. La expresión de sitios de
unión de alta afinidad para somatostatina constituye un marcador para dichas células tumorales, y la unión específica
con somatostatina se puede explotar para localizar e identificar células tumorales in vivo.
Son conocidos en la técnica anterior procedimientos para radiomarcar análogos de somatostatina que han sido
modificados con el fin de que contengan un aminoácido tirosina (Tyr o Y).
25
Albert et al., en el documento GB-A-2.225.579 dan a conocer la radio-formación de imágenes médicas utilizando
derivados de somatostatina, tales como octreótido marcado con 123 I.
30
Bakker et al., 1990, en la publicación J. Nucl. Med. 31: 1501-1509 describen la yodación radiactiva de un análogo
de somatostatina y su utilidad en la detección de tumores in vivo.
Bakker et al., 1991, en la publicación J. Nucl. Med. 32: 1184-1189 enseñan la utilidad de somatostatina radiomarcada para la radio-formación de imágenes médicas in vivo.
35
Bomanji et al., 1992, en la publicación J. Nucl. Med. 33: 1121-1124 describen la utilización de octreótido yodado
(Tyr-3) para la formación de imágenes médicas de tumores carcinoides metastásicos.
Alternativamente, se han dado a conocer en la técnica anterior procedimientos para radiomarcar somatostatina
modificando covalentemente el péptido para que contenga un grupo quelante de radionucleidos.
40
Albert et al., en el documento GB-A-2.225.579 dan a conocer la formación de imágenes médicas utilizando derivados de somatostatina, tales como octreótido con 111 In por medio de un grupo quelante unido al terminal amino.
45
Albert et al., en el documento WO 91/01.144 dan a conocer la formación de imágenes médicas utilizando péptidos relacionados con factores de crecimiento, hormonas, interferones y citoquinas y constituidos por un péptido de
reconocimiento específico covalentemente unido a un grupo quelante de radionucleidos.
Albert et al., en el documento EP-A-0.515.313 dan a conocer péptidos de somatostatina que presentan quelantes
unidos al terminal amino.
50
Faglia et al., 1991, en la publicación J. Clin. Endocrinol. Metab. 73: 850-856 describen la detección de receptores
de somatostatina en pacientes.
55
Kwekkeboom et al., 1991, en la publicación J. Nucl. Med. 32: 981 extracto Nº 305, se refiere a la radiomarcación
de análogos de somatostatina con 111 In.
Albert et al., 1991, en el extracto LM10, 12th American Peptide Symposium: 1991, describen los usos de análogos
de somatostatina derivatizados con ácido dietilen-triaminopentaacético, marcados con 111 In.
60
65
Krenning et al., 1992, en la publicación J. Nucl. Med. 33: 652-658 describen una centelleografía clínica utilizando
(111 In)(DTPA)octreótido.
Dichos procedimientos se pueden adaptar fácilmente para hacer posible la detección de células tumorales in vivo
mediante la formación de imágenes médicas, basándose en la expresión de sitios de unión de alta afinidad para somatostatina en células tumorales. Se pueden detectar fácilmente radionucleidos que emiten radiación gamma mediante
centelleografía después de una inyección a un ser humano o a un animal. Es conocida una diversidad de radionucleidos
que son útiles para la formación de imágenes médicas, que incluyen 67 Ga, 68 Ga, 99m Tc (Tc-99m), 111 In, 123 I o 125 I. La
sensibilidad del procedimiento de formación de imágenes médicas utilizando péptidos radiactivamente marcados es
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muy superior a otros procedimientos conocidos en la técnica, ya que la unión específica del péptido radiactivo concentra la señal radiactiva sobre las células de interés, por ejemplo, células tumorales. Esto es particularmente importante
para tumores gastrointestinales con actividad endocrina, que son usualmente pequeños, crecen lentamente y son difíciles de detectar mediante procedimientos convencionales. La marcación con tecnecio-99m (Tc-99m) es ventajosa
debido a que las propiedades nucleares y radiactivas de dicho isótopo lo convierten en un agente ideal formador de
imágenes centelleográficas. El Tc-99m presenta una energía de fotónica simple de 140 keV y un periodo de semidesintegración radiactiva de aproximadamente 6 horas, y está fácilmente disponible a partir de un generador de 99 Mo-99m Tc.
Otros radionucleidos presentan periodos de semidesintegración eficaces que son mucho más prolongados (por ejemplo, 111 In, que presenta un periodo de semidesintegración de 60 a 70 h) o que son tóxicos (por ejemplo,125 I). Aunque
el Tc-99m es un reactivo de radiomarcación ideal, no se ha utilizado ampliamente en la técnica anterior a la presente
invención. (véase, por ejemplo, el artículo de Lamberts, en la publicación J. Nucl. Med. 32: 1189-1191 (1991)).
La somatostatina, y los análogos de somatostatina radiomarcados se pueden utilizar asimismo terapéuticamente.
Para dichas aplicaciones, son ventajosos los radioisótopos citotóxicos, tales como escandio-47, cobre-67, galio-72,
itrio-90, yodo-125, yodo-131, samario-153, gadolinio-159, disprosio-165, holmio-166, iterbio-175, lutecio-177, renio186, renio-188, ástato-211 y bismuto-212. Los isótopos de renio, 186 Re y 188 Re son particularmente ventajosos.
La utilización de agentes quelantes para la radiomarcación de proteínas es conocida en la técnica anterior, y se dan
a conocer procedimientos para la marcación de péptidos con Tc-99m en las patentes de los EE.UU. Nos 5.654.272,
5.225.180, 5.443.815, 6.017.510, 5.965.107, 5.849.260, 5.508.020, 5.979.064, 5.405.597, 5.552.525, 5.645.815, 5.561.
220, 6.017.509, 5,620.675, 5,843.403, 6.248.304, 5.783.170, 5.866.097, 5.830.856 y 5.997.844 y en las solicitudes internacionales según el Tratado del Convenio de Patentes (PCT) WO-A-92/13.572, WO-A-93/10.747, WOA-93/17.719, WO-A-93/21.962, WO-A-93/23.085, WO-A-94/00.489, WO-A-94/07.918, WO-A-94/19.024, WO-A94/28.942 y WO-A-95/00.553.
25
Frizberg, en la patente de los EE.UU. Nº 4.444.690 describe una serie de agentes quelantes de tecnecio basados en
propanoato de 2,3-bis(mercaptoacetamido).
30
Gansow et al., en la patente de los EE.UU. Nº 4.472.509 enseñan procedimientos para la preparación y purificación
de anticuerpos monoclonales conjugados con quelatos de Tc-99m.
Reno y Bottino, en el documento EP-A-0.237.150 dan a conocer la radiomarcación de anticuerpos con Tc-99m.
Pak et al., en el documento WO 88/07.382 dan a conocer un procedimiento para marcar anticuerpos con Tc-99m.
35
Cox, en el documento WO-A-92/21.383 da a conocer derivados de somatostatina radiomarcados que contienen
dos restos de cisteína.
40
Rhodes, 1974, en la publicación Sem. Nucl. Med. 4: 281-293 enseña la marcación de albúmina de suero humano
con tecnecio-99m.
Khaw et al., 1982, en la publicación J. Nucl. Med. 23: 1011-1019 dan a conocer procedimientos para marcar
macromoléculas biológicamente activas con Tc-99m.
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Byrne y Tolman, supra, dan a conocer un agente quelante basado en tiolactona bifuncional para acoplar Tc-99m a
moléculas biológicas.
Cox et al., 1991, extracto, 7th International Symposium on Radiopharmacology, pág. 16, dan a conocer la utilización de análogos de somatostatina marcados con Tc-99m, 131 I y 111 In en la radiolocalización de tumores endocrinos in
vivo mediante una centelleografía.
Se dan a conocer procedimientos para marcar directamente somatostatina, derivados de somatostatina, análogos
de somatostatina o péptidos que se unen al receptor de somatostatina y que contienen por lo menos 2 restos de cisteína
que forman un disulfuro o en los que el disulfuro está reducido a la forma de sulfhidrilo, en la solicitud de patente
de los EE.UU. también en tramitación con número de serie 07/807.062, ahora patente de los EE.UU. Nº 5.225.180,
publicada el 6 de julio de 1993.
Permanece la necesidad de análogos de somatostatina sintéticos (para hacer practicable la preparación rutinaria y
para facilitar la aceptación legislativa) que presenten una estabilidad in vivo aumentada, para ser utilizados terapéuticamente, como agentes centelleográficos cuando son radiomarcados con Tc-99m o con otros radioisótopos detectables
para su utilización en la formación de imágenes médicas de tumores in vivo, y como agentes radioterapéuticos cuando son radiomarcados con un radioisótopo citotóxico, tal como renio-188. Se proporcionan pequeños análogos de
somatostatina sintéticos mediante la presente invención, que satisfacen específicamente dicha necesidad.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona análogos de somatostatina que son péptidos lineales para aplicaciones terapéuticas, incluyendo aplicaciones radioterapéuticas, y aplicaciones diagnósticas, incluyendo aplicaciones radiodiagnósti4
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cas, en particular aplicaciones de formación de imágenes médicas centelleográficas. A diferencia de la somatostatina
nativa y de los análogos de somatostatina conocidos en la técnica anterior, los péptidos lineales de la invención no
están restringidos dentro de una estructura cíclica. La invención proporciona asimismo reactivos peptídicos lineales constituidos por los análogos de somatostatina peptídicos lineales de la invención, en que dichos péptidos están
covalentemente unidos a un resto ligante de radiomarcadores. La invención proporciona dichos péptidos lineales, reactivos peptídicos lineales y reactivos peptídicos lineales radiomarcados que son agentes formadores de imágenes
médicas centelleográficas, agentes radiodiagnósticos y agentes radioterapéuticos. Los agentes formadores de imágenes centelleográficas de la invención comprenden reactivos peptídicos lineales radiomarcados con un radioisótopo,
con preferencia tecnecio-99m. Los agentes radioterapéuticos de la invención comprenden reactivos peptídicos lineales radiomarcados con un radioisótopo citotóxico, con preferencia renio-186 o renio-188. Se proporcionan asimismo
procedimientos para la preparación y utilización de dichos péptidos lineales, reactivos peptídicos lineales y formas de
realización radiomarcadas de los mismos.
La presente invención proporciona asimismo agentes formadores de imágenes médicas centelleográficas constituidos por un péptido lineal que es un análogo de somatostatina y que está marcado con yodo-123, yodo-125 o yodo-131.
De manera similar, la invención proporciona realizaciones alternativas de los análogos peptídicos de somatostatina
lineales radiomarcados con yodo-125, yodo-131 o ástato-211 para su utilización como agentes terapéuticos.
Los análogos de somatostatina proporcionados por la invención son péptidos ligantes de receptores de somatostatina que presentan la siguiente fórmula:
Fórmula II
X1 − A1 A2 − B1 B2 B3 B4 − C1 C2 − X2
25
en la que X1 y X2 son cada uno independientemente restos hidrófilos;
A1 , A2 y C1 son cada uno independientemente un D- o L-aminoácido lipófilo, o cisteína S-alquilada, penicilamina, homocisteína u homohomocisteína;
30
B1 es D- o L-Phe, o D- o L-Tyr, o D- o L-Nal, o Ain;
B2 es D- o L-Trp;
B3 es D- o L-Lys, o Hly, Achxa, Amf, Aec, Apc, Aes o Aps;
35
B4 es D- o L-Thr, Ser, Val, Phe, Ile, Abu, Nle, Leu, Nva, Nal o Aib;
C2 es D- o L-Thr, Ser, Val, Phe, Ile, Abu, Nle, Leu, Nva, Nal o Aib;
40
con la condición de que el reactivo peptídico ligante de receptores de somatostatina no sea GGGFD -Cpa.YWD KTFTamida
covalentemente unida a un resto ligante de radiomarcadores que es capaz de formar un complejo eléctricamente neutro
con un radioisótopo, o no presente ninguna de las siguientes estructuras:
K[BAT]D.Nal.CME YWD KVCMe T.amida; o
45
[DTPA]K[BAT]D-Nal.CME YWD KVCMe T.amida,
siendo dicha materia parte de la descripción del documento WO-A-9.321.962, publicado el 11-11-1993.
50
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En una realización preferida, X1 es un resto hidrófilo que comprende un aminoácido, o un péptido que presenta
una secuencia de aminoácidos no superior a 10 restos, o un monosacárido, o un oligosacárido que comprende 10 o
menos unidades de sacárido, o una poli(N-carboxialquil)amina, o un polioxianión. En otra realización preferida, X2 es
un resto hidrófilo que comprende una poli(N-carboxialquil)-amina o un polioxianión, o un amonoácido, o un péptido
que presenta una secuencia de aminoácidos no superior a 10 restos (incluyendo péptidos en los que el grupo carboxilo
del aminoácido del terminal carboxilo está reducido a alcohol) o un monosacárido o un oligosacárido que comprende
10 o menos unidades de sacárido. En otra realización preferida, B1 es fenilalanina o tirosina, B2 es triptófano, con la
mayor preferencia D-triptófano, B3 es lisina y B4 es treonina o valina.
60
La invención proporciona asimismo reactivos peptídicos lineales que comprenden un péptido lineal de Fórmula II
covalentemente unido a un resto ligante de radiomarcadores, en la que X2 es -COOR9 , CH2 OH, CH2 COOR9 o CON
(R9 )2 en los que cada R9 es H, alilo inferior lineal o cíclico o sustituido con un resto hidrófilo y en la que el resto
ligante de radiomarcadores no está covalentemente unido a los restos B1 , B2 , B3 o B4 .
65
La presente invención proporciona péptidos que son análogos peptídicos de somatostatina lineales tales como
los que se describen en la presente memoria que presentan una estabilidad in vivo aumentada en comparación con
la somatostatina nativa, y que son terapéuticamente útiles en el alivio de enfermedades u otras dolencias en seres
humanos o en otros animales.
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La invención proporciona asimismo agentes formadores de imágenes médicas centelleográficas que comprenden
los reactivos peptídicos lineales de la invención en los que el resto ligante de radiomarcadores está establemente complejado con un radioisótopo. En una de dichas realizaciones se proporciona un agente formador de imágenes médicas
centelleográficas en la que los reactivos análogos peptídicos de somatostatina lineales de la invención están radiomarcados con tecnecio-99m. En otras realizaciones de los agentes formadores de imágenes médicas centelleográficas de la
invención, el radioisótopo es indio-111 o galio-68. En todavía otras realizaciones, los agentes formadores de imágenes
médicas centelleográficas de la invención son péptidos lineales que están radiomarcados con yodo-123 o con yodo125.
15
La invención proporciona asimismo agentes radioterapéuticos que son reactivos peptídicos lineales de la invención
radiomarcados con un radioisótopo citotóxico que se selecciona entre el grupo que consiste en escandio-47, cobre-67,
galio-72, itrio-90, yodo-125, yodo-131, samario-153, gadolinio-159, disprosio-165, holmio-166, iterbio-175, lutecio177, renio-186, renio-188, ástato-211 y bismuto-212. En realizaciones preferidas, el radioisótopo es renio-186 o renio188. En realizaciones preferidas adicionales, los péptidos cíclicos de la invención están radiomarcados con yodo-125,
yodo-131 o ástato-211.
20
En otra realización, la invención proporciona agentes terapéuticos que comprenden los reactivos peptídicos análogos de somatostatina lineales de la invención complejados con un metal no radiactivo, tal como renio. Se proporcionan
asimismo mediante la invención, y se encuentran dentro de su alcance, realizaciones en combinación, en las que dicho
complejo está asimismo radiomarcado, ya sea directamente o por medio de un resto ligante de radiomarcadores.
10
La invención proporciona asimismo composiciones farmacéuticas que comprenden los péptidos ligantes de receptores de somatostatina de la invención en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
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La invención comprende asimismo la utilización de los presentes compuestos/reactivos para la preparación de un
medicamento para el alivio de enfermedades relacionadas con somatostatina en animales, con preferencia en seres
humanos, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de los análogos de somatostatina de la
invención al animal. En realizaciones preferidas, la cantidad del análogo de somatostatina que se administra es de
aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal/día.
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Constituye una ventaja de los análogos de somatostatina proporcionados por la presente invención que los péptidos mantengan una alta afinidad por receptores de somatostatina, aun cuando éstos son péptidos lineales. Como las
realizaciones preferidas carecen de un enlace de disulfuro intramolecular, la característica ventajosa de los análogos
peptídicos de somatostatina lineales de la presente invención consiste en que su estabilidad no depende de la formación
o de la persistencia de enlaces de disulfuro intramoleculares. Dicha característica es a su vez ventajosa debido a que
la alta afinidad de los péptidos de la presente invención por receptores de somatostatina no es por tanto una función
de la integridad de los enlaces de reticulación intramoleculares lábiles, tales como los enlaces de disulfuro. Adicionalmente, los reactivos peptídicos de la invención mantienen su alta afinidad por receptores de somatostatina después de
haber sido sometidos a una radiomarcación por medio de restos ligantes de radiomarcadores covalentemente unidos.
En contraste con ello, por ejemplo la conjugación de Tc-99m con un resto ligante de Tc-99m covalentemente unido a
somatostatina nativa, o a un análogo de somatostatina que presenta un enlace de disulfuro, puede dar como resultado
una reducción del disulfuro acompañada por una pérdida de actividad biológica. Dicha pérdida de actividad biológica
puede tener lugar asimismo in vivo utilizando somatostatina nativa, o cualquier análogo de somatostatina que presente
un enlace de disulfuro. La presente invención no está sometida a pérdidas similares de actividad biológica in vivo
debido a que los análogos de somatostatina de la invención son activos en forma de péptidos lineales.
Un primer aspecto de los reactivos proporcionados por la invención para la preparación de agentes radiomarcados
de la invención se refiere a reactivos, cada uno constituido por un péptido que es un análogo de somatostatina que está
covalentemente unido a un resto ligante de radiomarcadores que presenta la fórmula:
C(pgp)S − (aa) − C(pgp)S
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en la que (pgp)S es H o un grupo protector de tiol y (aa) es cualquier α- o β-aminoácido. En una realización preferida, el aminoácido es glicina. En otra realización preferida, el agente es un agente formador de imágenes médicas
centelleográficas. En todavía otra realización preferida, el agente es un agente radioterapéutico.
En una segunda realización, la invención proporciona reactivos peptídicos susceptibles de ser radiomarcados para su utilización como agentes formadores de imágenes médicas centelleográficas o como agentes radioterapéuticos,
comprendiendo cada uno un análogo de somatostatina que está unido covalentemente a un resto ligante de radiomarcadores, de fórmula:
A − CZ(B) − (C(R0 R00 ))n − X
en la que A es H, HOOC, H2 NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC o R””: B es H, SH
o -NHR”’, -N(R”’)-aminoácido o péptido) o R””; X es SH o -NHR”’. -N(R”’)-(aminoácido o péptido) o R””; Z es
H o R””; R’, R”, R”’ y R”” son independientemente H o alquilo inferior de cadena lineal o ramificada o cíclico; n
es 0, 1 ó 2; y: (1) cuando B es -NHR”’ o -N(R”’)-(aminoácido o péptido), X es SH y n es 1 ó 2; (2) cuando X es
-NHR”’ o -N(R”’)-(aminoácido o péptido), B es SH y n es 1 ó 2; (3) cuando B es H o R””, A es HOOC, H2 NOC,
(aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC, X es SH y n es 0 ó 1: (4) cuando A es H o R””,
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entonces cuando B es SH, X es -NHR”’ o -N(R”’)-(aminoácido o péptido) y cuando X es SH, B es -NHR”’ o -N(R”’)(aminoácido o péptido); (5) cuando X es H o R””, A es HOOC, H2 NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido
o péptido)-OOC y B es SH; (6) cuando Z es metilo, X es metilo, A es HOOC, H2 NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC,
(aminoácido o péptido)-OOC y B es SH y n es 0; y (7) cuando Z es SH y X es SH, n no es 0; y en la que el resto de
tiol se encuentra en forma reducida.
Las realizaciones preferidas del resto ligante de radiomarcadores presentan una fórmula química que es:
R1 − CO − (aminoácido)1 − (aminoácido)2 − Z
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en la que (aminoácido)1 y (aminoácido)2 son cada uno independientemente cualquier α- o β-aminoácido primario que
no comprende un grupo tiol, Z es un resto que contiene tiol que es cisteína, homocisteína, isocisteína, penicilamina,
2-mercaptoetilamina o 3-mercaptopropilamina, y R1 es alquilo inferior (C1 -C4 ), un aminoácido o un péptido que
comprende de 2 a 10 aminoácidos. Cuando Z es cisteína, homocisteína, isocisteína o penicilamina, el grupo carbonilo
de dicho resto está covalentemente unido a un grupo hidroxilo, un grupo NR3 R4 , en el que cada uno de los R3 y R4 son
independientemente H o alquilo inferior (C1 -C4 ), un aminoácido o un péptido que comprende de 2 a 10 aminoácidos;
o
Y − (aminoácido)2 − (aminoácido)1 − NHR2
en la que Y es un resto que contiene tiol que es cisteína, homocisteína, isocisteína, penicilamina, 2-mercaptoacetato o
3-mercaptopropionato, (aminoácido)1 y (aminoácido)2 son cada uno independientemente cualquier α- o β-aminoácido
primario que no comprende un grupo tiol, y R2 es H o alquilo inferior (C1 -C4 ), un aminoácido o un péptido que comprende de 2 a 10 aminoácidos. Cuando Y es cisteína, homocisteína, isocisteína o penicilamina, el grupo aminoácido
de dicho resto está covalentemente unido a -H, un aminoácido o un péptido que comprende de 2 a 10 aminoácido; o
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en las que n, m y p son cada uno números enteros que son independientemente 0 ó 1; cada R’ es independientemente
H, alquilo inferior, hidroxialquilo C2 -C4 , o alcoxialquilo C2 -C4 , y cada R es independientemente H o R”, en que R”
alquilo inferior o fenilo sustituido o no sustituido que no comprende un grupo tiol, y un R o R’ es L, en que L es una
funcionalidad covalentemente unida al péptido ligante de receptores de somatostatina.
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En realizaciones particulares de este aspecto de la invención, el resto ligante de radiomarcadores presenta una
fórmula que es:
-(aminoácido)1 -(aminoácido)2 -{A-CZ(B)-{C(R1 R2 )n -X},
5
-{A-CZ(B)-{C(R1 R2 )}n -X}-(aminoácido)1 -(aminoácido)2 ,
-(un α, ω- o β, ω-diaminoácido primario)-(aminoácido)1 -{A-CZ(B)-{C(R1 R2 )}n -X, o
-{A-CZ(B)-{C(R1 R2 )}n -X}-(aminoácido)1 -(un α, ω- o β, ω-diaminoácido primario)
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en las que (aminoácido)1 y (aminoácido)2 son cada uno independientemente cualquier α- o β-aminoácido de origen
natural, modificado, sustituido o alterado que no contiene un grupo tiol; A es H, HOOC, H2 NOC, (aminoácido o
péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC o R4 ; B es H, SH o -NHR3 , -N(R3 )-(aminoácido o péptido) o R4 ; Z
es H o R4 ; X es SH o -NHR3 , -N(R3 )-(aminoácido o péptido) o R4 ; R1 , R2 , R3 y R4 son independientemente H o un
alquilo inferior de cadena lineal o ramificada o cíclico; n es un número entero que es ya sea 0, 1 ó 2; (péptido) es
un péptido de 2 a aproximadamente 10 aminoácidos; y: (1) cuando B es -NHR3 o -N(R3 )-(aminoácido o péptido), X
es SH y n es 1 ó 2; (2) cuando X es -NHR3 o -N(R3 )-(aminoácido o péptido), B es SH y n es 1 ó 2; (3) cuando B
es H o R4 , A es HOOC, H2 NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC, X es SH y n es 0
ó 1; (4) cuando A es H o R4 , entonces cuando B es SH, X es -NHR3 o -N(R3 )-(aminoácido o péptido) y cuando X
es SH, B es -NHR3 o N(R3 )-(aminoácido o péptido); (5) cuando X es H o R4 , A es HOOC, H2 NOC, (aminoácido o
péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC y B es SH; (6) cuando Z es metilo, X es metilo, A es HOOC, H2 NOC,
(aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC y B es SH y n es 0; y (7) cuando Z es SH y X es SH, n
no es 0; y en las que el grupo tiol se encuentra en forma reducida.
25
Realizaciones preferidas adicionales incluyen restos ligantes de radiomarcadores que presentan la fórmula:
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-Gly-Gly-Cys-, -Cys-Gly-Gly-, Gly-Gly-Cys-, -(ε-Lys)-Gly-Cys-, (δ-Orn)-Gly-Cys-, -(γ-Dab)-Gly-Cys-, y -(βDap)-Gly-Cys-. (En estas fórmulas, se entenderá que ε-Lys representa un resto de lisina en el que el grupo ε-amino, en
lugar del grupo α-amino típico, está covalentemente unido al grupo carboxilo del aminoácido contiguo para formar un
enlace petídico: δ-Orn representa un resto de ornitina en el que el grupo δ-amino, en lugar del grupo α-amino típico,
está covalentemente unido al grupo carboxilo del aminoácido contiguo para formar un enlace peptídico; γ-Dab representa un resto de ácido 2,4-diaminobutírico en el que el grupo γ-amino está covalentemente unido al grupo carboxilo
del aminoácido contiguo para formar un enlace peptídico; y β-Dab representa un resto de ácido 1,3-diaminopropiónico en el que el grupo β-amino está covalentemente unido al grupo carboxilo del aminoácido contiguo para formar un
enlace peptídico).
En otra realización, la invención proporciona reactivos peptídicos susceptibles de ser radiomarcados con un radioisótopo, para radioterapia o para la formación de imágenes médicas de sitios en el interior de un cuerpo de mamífero,
comprendiendo cada uno un análogo de somatostatina que está covalentemente unido a un resto ligante de radiomarcadores de fórmula:
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para los fines de la presente invención, los restos ligantes de radiomarcadores que presentan esta estructura se denominarán restos basados en ácido picolínico (Pic)
o
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en la que X es H o un grupo protector; (aminoácido) es cualquier aminoácido y el resto ligante de radiomarcadores
está covalentemente unido al péptido. Para los fines de la presente invención, los restos ligantes de radiomarcadores
que presentan esta estructura se denominarán restos basados en picolilamina (Pica). En una realización preferida, el
aminoácido es glicina y X es un grupo protector acetamidometilo.
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Todavía otra realización de la invención proporciona reactivos peptídicos susceptibles de ser radiomarcados con
un radioisótopo, para la formación de imágenes médicas de sitios en el interior de un cuerpo de mamífero o para
su utilización como agentes radioterapéuticos, comprendiendo cada uno un análogo de somatostatina que está unido
covalentemente a un resto ligante de radiomarcadores que es un resto ligante de radiomarcadores bisaminotiol. El resto
ligante de radiomarcadores bisaminotiol en esta realización de la invención presenta la fórmula:
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en la que cada R puede ser independientemente H, CH3 o C2 H5 ; cada (pgp)S puede ser independientemente un grupo
protector de tiol o H; m, n y p son independientemente 2 ó 3; A es un alquilo inferior lineal o cíclico, arilo, heterociclilo,
combinaciones o derivados sustituidos de los mismos; y X es péptido; o
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en la que cada R es independientemente H, CH3 o C2 H5 ; m, n y p son independientemente 2 ó 3; A es un alquilo inferior
lineal o cíclico, arilo, heterociclilo, combinaciones o derivados sustituidos de los mismos; V es H o CO-péptido; R’ es
H o péptido; siempre que cuando V es H, R’ sea péptido y cuando R’ es H, V sea péptido. Para los fines de la presente
invención, los restos ligantes de radiomarcadores que presentan estas estructuras se denominarán restos “BAT”.
La presente invención proporciona procedimientos para la preparación de reactivos peptídicos de la invención
mediante una síntesis química in vitro. En una realización preferida, los péptidos se sintetizan mediante una síntesis
de péptidos en fase sólida.
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La presente invención proporciona reactivos para la preparación de un agente ligante de receptores de somatostatina
radiomarcado que comprende los péptidos ligante de receptores de somatostatina de la invención covalentemente
unidos a un resto ligante de radiomarcadores. En una realización preferida, el reactivo está radiactivamente marcado
con Tc-99m. En otra realización preferida, los reactivos están radiactivamente marcados con 186 Re o 188 Re.
55
La invención proporciona asimismo complejos de los reactivos peptídicos lineales de la invención con un radioisótopo, así como procedimientos para la radiomarcación de los reactivos peptídicos de la invención. Por ejemplo, en
una realización, los agentes formadores de imágenes centelleográficas proporcionados por la invención comprenden
complejos marcados con Tc-99m formados haciendo reaccionar los reactivos peptídicos de la invención con Tc-99m
en presencia de un agente reductor. Los agentes reductores preferidos incluyen, pero sin limitarse a ellos, ion ditionito,
ion estannoso y ion ferroso. Dichos complejos con Tc-99m de la invención se forman asimismo marcando los reactivos
peptídicos de la invención con Tc-99m mediante intercambio de ligandos de un complejo con Tc-99m previamente
reducido, tal como se proporciona en la presente memoria.
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La invención proporciona asimismo estuches para la preparación de péptidos análogos de somatostatina lineales
radiomarcados a partir de los reactivos peptídicos de la invención. Los estuches para la radiomarcación de los reactivos peptídicos de la invención están constituidos por un vial herméticamente cerrado que contiene una cantidad
predeterminada de un reactivo peptídico de la invención y una cantidad suficiente de agente reductor para radiomarcar
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el péptido. En una realización preferida, el análogo de somatostatina radiomarcado es un agente formador de imágenes médicas centelleográficas. Se prefiere asimismo radiomarcar los reactivos peptídicos de la invención con Tc-99m.
Se proporcionan asimismo estuches para la preparación de agentes radioterapéuticos, en los que los radioisótopos
preferidos son Renio-186 y renio-188.
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Los reactivos peptídicos radiomarcados de la invención se puede utilizar para fines diagnósticos y terapéuticos, utilizando agentes formadores de imágenes médicas centelleográficas que son reactivos peptídicos marcados con Tc-99m
para la formación de imágenes médicas de sitios en el interior de un cuerpo de mamífero, obteniendo imágenes centelleográficas gamma in vivo. Dichos procedimientos comprenden administrar una cantidad diagnóstica eficaz de reactivos peptídicos marcados con Tc-99m de la invención y detectar la radiación gamma emitida por el marcador Tc-99m
localizada en el sitio en el interior del cuerpo de mamífero.
Los compuestos de la invención se pueden utilizar asimismo en procedimientos para aliviar enfermedades relacionadas con somatostatina en animales, con preferencia en seres humanos, que comprenden administrar una cantidad
terapéuticamente eficaz de los reactivos peptídicos ligante de somatostatina radiomarcados de la invención al animal.
En realizaciones preferidas, el reactivo está radiactivamente marcado con 186 Re o 188 Re.
Los péptidos y reactivos peptídicos de la invención pueden comprender asimismo un resto conector polivalente.
Los restos conectores polivalentes de la invención comprenden por lo menos dos grupos funcionales conectores idénticos capaces de unirse covalentemente a péptidos análogos de somatostatina o a restos ligantes de Tc-99m. Los grupos
funcionales conectores preferidos son aminas primarias o secundarias, grupos hidroxilo, grupos de ácido carboxílico
o grupos reactivos con tiol. En realizaciones preferidas, los restos conectores polivalentes están constituidos por bissuccinimidilmetiléter (BSME), ácido 4-(2,2-dimetilacetil)benzoico (DMBA), N-[2-(N’,N’-bis(2-succinimidoetil)aminoetil)] -N6 ,N9 -bis(2-metil-2-mercapto-propil)-6,9-diazanonanamida (BAT-BS, tris(succinimidil-etil)amina (TSEA),
bis-succinimidohexano (BSH), 4-(O-CH2 CO-Gly-Gly-Cys.amida)-2-metilpropiofenona (ETAC), tris-(acetamidoetil)
amina, éter bis-acetamidometílico, éter bis-acetamidoetílico, α, ε-bis-acetil-lisina, lisina y 1,8-bis-acetamido-3,6-dioxaoctano, o un derivado de los mismos.
Realizaciones preferidas específicas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción más detallada de ciertas realizaciones preferidas y de las reivindicaciones.
Descripción detallada de la invención
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La presente invención proporciona reactivos peptídicos lineales para la preparación de agentes radiomarcados para
usos radiodiagnósticos y radioterapéuticos. La presente invención proporciona péptidos lineales que son análogos de
somatostatina y que no están restringidos en una estructura cíclica. Dichos análogos de somatostatina poseen por lo
tanto una estabilidad in vivo aumentada en comparación con somatostatina nativa. Dichos péptidos lineales son por sí
mismos agentes terapéuticos para aliviar enfermedades y otras dolencias en animales, incluyendo seres humanos.
Se proporcionan asimismo mediante la invención péptidos lineales que se pueden radioyodar o radioastatizar y que
son por lo tanto útiles en aplicaciones radioterapéuticas y radiodiagnósticas.
Otra realización de estos péptidos lineales que es proporcionada por la presente invención consiste en reactivos
peptídicos lineales en los que los péptidos lineales de la invención están covalentemente unidos a un resto ligante
de radiomarcadores. Dichos reactivos peptídicos lineales son susceptibles de ser radiomarcados para proporcionar
agentes radiodiagnósticos o radioterapéuticos. Un ejemplo de una aplicación radiodiagnóstica utilizando los agentes
radiomarcados de la invención es la formación de imágenes médicas centelleográficas, en la que se puede determinar
la localización y la extensión de tumores que llevan receptores de somatostatina.
50
Los reactivos peptídicos lineales de la invención se pueden radiomarcar asimismo ventajosamente con radioisótopos citotóxicos, tales como renio-186 o renio-188 para usos radioterapéuticos. Los reactivos peptídicos lineales de la
invención son asimismo útiles en la preparación de complejos con metales no radiactivos, siendo dichos complejos
terapéuticamente útiles.
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Los compuestos de la invención se pueden utilizar en un procedimiento para aliviar enfermedades u otras dolencias
en animales, con preferencia en seres humanos. Dichas enfermedades y dolencia incluyen, pero sin limitarse a ellas,
diabetes y retinopatía relacionada con diabetes, cirrosis hepática e infección de hepatitis, úlceras sangrantes y otras
hemorragias gastrointestinales, pancreatitis, trastornos del sistema nervioso central, trastornos endocrinos, enfermedad
de Alzheimer, acromegalia y otras enfermedades y trastornos relacionados con la producción de niveles inapropiados
de hormona del crecimiento in vivo, y cáncer, particularmente los cánceres cuyo crecimiento depende o está influenciado por la producción de hormona del crecimiento. Las dosificaciones de los análogos de somatostatina proporcionados
por la invención pueden ser las mismas que las dosificaciones de somatostatina nativa utilizadas rutinariamente para
el tratamiento de las enfermedades anteriormente mencionadas u otras, o se pueden administrar menores cantidades
de los compuestos de la invención debido a su tiempo de semidescomposición más prolongado in vivo.
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En realizaciones de la invención que son útiles como agentes formadores de imágenes médicas centelleográficas, la
marcación con Tc-99m es una ventaja de la presente invención debido a que las propiedades nucleares y radiactivas del
dicho isótopo lo convierten en un agente ideal formador de imágenes médicas centelleográficas. Dicho isótopo presenta
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una energía fotónica simple de 140 keV y un periodo de semidesintegración radiactiva de aproximadamente 6 horas,
y está fácilmente disponible a partir de un generador de 99 Mo-99m Tc. Se pueden utilizar asimismo otros radionucleidos
en la práctica de la invención, tal como se da a conocer en la presente memoria.
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Las realizaciones radioterapéuticas de la invención, por otra parte, se marcan ventajosamente con radioisótopos
citotóxicos que incluyen, pero sin limitarse a ellos, escandio-47, cobre-67, galio-72, itrio-90, yodo-125, yodo-131,
samario-153, gadolinio-159, disprosio-165, holmio-166, iterbio-175, lutecio-177, renio-186, renio-188, ástato-211 y
bismuto-212, con la mayor preferencia 186 Re o 188 Re. Dichas realizaciones son útiles en el tratamiento de enfermedades
u otras dolencias relacionadas con somatostatina en animales, con preferencia en seres humanos, que incluyen, pero
sin estar limitadas a ellas, cáncer y otras enfermedades caracterizadas por el crecimiento de tumores malignos o
benignos capaces de unirse a somatostatina o a análogos de somatostatina por medio de la expresión de receptores de
somatostatina sobre la superficie de las células que constituyen dichos tumores.
En los restos ligantes de radiomarcadores y en los péptidos lineales covalentemente unidos a dichos restos que
contienen un tiol covalentemente unido a grupos protectores de tiol ((pgp)S ) proporcionados por la invención, los
grupos protectores de tiol pueden ser iguales o diferentes y pueden ser, pero sin limitarse a ellos:
-CH2 -arilo, (arilo es fenilo o fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi);
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-CH-(arilo)2 , (arilo es fenilo o fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi);
-C-(arilo)3 , (arilo es fenilo o fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi);
-CH2 -(4-metoxifenilo);
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-CH-(4-piridil)(fenilo)2 ;
-C(CH3 )3 ;
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-9-fenilfluorenilo;
-CH2 NHCOR, (R es alquilo o arilo no sustituido o sustituido);
-CH2 -NHCOOR, (R es alquilo o arilo no sustituido o sustituido);
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-CONHR, ((R es alquilo o arilo no sustituido o sustituido);
-CH2 -S-CH2 -fenilo.
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Los grupos protectores preferidos presentan la fórmula -CH2 -NHCOR en la que R es un alquilo inferior que
tiene de 1 a 8 átomos de carbono, fenilo o fenilo sustituido con alquilo inferior, hidroxilo, alcoxi inferior, carboxi o
alcoxicarbonilo inferior. El grupo protector más preferido es un grupo acetamidometilo.
Cada realización de la invención que contiene un péptido lineal ligante de receptores de somatostatina está constituida por una secuencia de aminoácidos. El término aminoácido tal como se utiliza en la presente invención se
entiende que incluye todos los L - y D -aminoácidos, de origen natural y de otro origen. Los reactivos que comprenden
péptidos ligante de receptores de somatostatina proporcionados por la invención incluyen, pero sin limitarse a ellos,
los siguientes ejemplos ilustrativos de las realizaciones de péptidos de la invención:
CAcm GCAcm GGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida
(DTPA).FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
maGGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida
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Ac.CAcm GCAcm FD .Cpa.YWD KTFT.amida
(DTPA).D-Nal.Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
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AKCGGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida
(DTPA).D-Nal.Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
(DTPA).Aca.FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
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(DTPA).(ε-K)GCFD FYWD KTFT.amida
Ac.CGCFD .Cpa.YWD KTFT.amida
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(DTPA).(D-Nal.CYWD KVCT)2
Ac.FD FYWD YWD KTFT(ε-K)GC.amida
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Ac.FD FYWD KTFTGGG(ε-K)GC.amida
K(BAT).D-Nal.CMe YWD KVCMe T.amida
Ac.FD FYWD KTFGGG(ε-K)KC.amida
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Pic.GCAcm GGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida
(DTPA).D-Nal.CYWD KVCT.amida
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(2-cetogulonil)D-NalFYWD KVCT.amida
(DTPA).K(BAT).D-Nal.CMe YWD KVCMe T.amida
(DTPA).FD FYWD KTFT(ε-K)GC.amida
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(AFD CFWD KTCMe T(CH2 OH)
(DTPA).FD GYWD KTCT(CH2 OH)
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(DTPA).Nal.SYWD KVT.K(BAT).amida
(DTPA).Nal.SYWD KVCT.amida
DDD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
30
Ac.DDD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
Hca.G.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
35
(Trc.imida )2 K.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε- K)GCRR.amida
Trc(Trc.imida )K.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCRR.amida
(Trc.imida)NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCR.amida
40
KD KKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKDKD.amida
KD KKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCDD.amida
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(Trc)2 K.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
Hca.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
(2-cetogulonil)FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
50
KKKK. NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCDDDD.amida
Ac.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
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Ac.KKKKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
(2-cetogulonil)FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
DDDD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKKKK.amida
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(DTPA)NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
(DTPA)NalD .Cpa.YWD KTFTCAcm GCAcm .amida
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Ac.KKKKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
KDKD.NalD.Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKDKD.amida.
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Tal como se utilizan en la presente memoria, los siguientes aminoácidos y análogos de aminoácidos se entiende que
están representados por las siguientes abreviaturas: Ac es un grupo acetilo; ma es un grupo de ácido mercaptoacético; Aca es ácido 6-aminocaproico; Hcy es homocisteína; Hhc es homohomocisteína, que es (3-mercaptopropil)glicina;
Pen es penicilamina; Mob es el grupo protector de sulfhidrilo 4-metoxibencilo; Acm es el grupo protector de sulfhidrilo acetamidometilo; Aib es ácido aminoisobutírico; Nal es 2-naftilalanina; Ain es ácido 2-aminoindan-2-carboxílico;
Hly es homolisina; Achxa es 4-aminociclohexilamina; Amf es 4-aminometilfenilalanina; Aec es S-(2-aminoetil)cisteína; Apc es S-(3-aminopropil)cisteína; Aes es O-(2-aminoetil)serina; Aps es O-(3-aminopropil)serina; Abu es ácido
2-aminobutírico; Nva es norvalina; Aca es ácido 6-aminocaproico; FD es D -fenilalanina; WD es D -triptófano; YD es
D -tirosina; Cpa es L -(4-clorofenil)alanina; Thp es ácido 4-aminotetrahidrotiopiran-4-carboxílico; D -Nal es D -2-naftilalanina; Dpg es dipropilglicina; Abu es ácido α-aminobutírico; Trc es ácido tricarboalquílico; Hca es hexacarboxiciclohexano; y Nle es norleucina. Todos los aminoácidos de origen natural se abrevian utilizando abreviaturas estándares (que se pueden encontrar en la publicación Biochemistry de G. Zubay (2ª ed.), 1988 (MacMillen Publishing:
Nueva York) pág. 33.
Para los fines de la presente invención, los aminoácidos de origen natural son caracterizados como lipófilos (alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina, prolina, triptófano y valina, así como derivados S-alquilados
de cisteína), hidrófilos (asparagina, glutamina, treonina, y serina), ácidos (ácido glutámico y aspártico), y básicos (arginina, histidina y lisina). (T(CH2OH ) representa un resto de treoninol, en el que el grupo carboxilo del aminoácido está
reducido a alcohol primario, que se incorpora en el péptido utilizando el procedimiento de Neugebauer et al. (1990,
Peptides: Proceedings of the 11th American Peptide Symposium, págs. 1020-21). Se entiende que ε-K representa un
enlace covalente por medio del grupo ε-amino en la cadena lateral de un resto de lisina. δ-Orn representa un resto de ornitina en el que el grupo δ-amino, en lugar del grupo α-amino típico, está covalentemente unido al grupo
carboxilo del aminoácido contiguo para formar un enlace peptídico. γ-Dab representa un resto de ácido 2,4-diaminobutírico en el que el grupo γ-amino está covalentemente unido al grupo carboxilo del aminoácido contiguo para
formar un enlace peptídico. β-Dap representa un resto de ácido 1,3-diaminopropiónico en la que el grupo β-amino está
covalentemente unido al grupo carboxilo del aminoácido contiguo para formar un enlace peptídico. Pic es picolinoílo
(piridin-2-carbonilo); Pica es picolilamina (2-(aminometil)piridina); (BAT representa ácido N6 ,N9 -bis(2-mercapto-2metilpropil)-6,9-diazanonanoico; K.(BAT) y Lys.(BAT) representan el aminoácido lisina, acilado en el grupo ε-amino
en la cadena lateral del aminoácido a (BAT); (BAM) es (N1 ,N4 -bis(2-mercapto-2-metilpropil)-1,4,10-triazadecano;
E.(BAM) y Glu.(BAM) representan el aminoácido ácido glutámico que presenta un enlace γ-amídico entre el grupo
ácido carboxílico de la cadena lateral de ácido glutámico y un grupo amino primario derivado de (BAM); (BAT-BM)
es N-(2-(N’,N’-bis(2-maleimidoetil)aminoetil)-N9 - (t-butoxicarbonil)-N6 ,N9 -bis(2-metil-2-trifenilmetiltio- propil)-6,9diazanonanamida; (BAT-BS) es N-(2-(N’,N’-bis(2-succinimidoetil)aminoetil) -N6 N9 -bis(2-mercapto-2-metil-propil)6,9-diazanonanamida; (BMME) es bis-maleimidometil-éter; (BSME) es bis-succinimidometiléter; y (DTPA) es ácido
dietilentriaminopentaacético.
Para los fines de la presente invención, el término “poli(N-carboxialquil)amina” se entiende que describe una
serie de compuestos ejemplificados por ácido nitrilotriacético, ácido iminodiacético, ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA) y ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA).
40
Para los fines de la presente invención, el término “polioxianión” se entiende que comprende sulfatos, fosfatos,
sulfonatos, fosfonatos y otros compuestos similares.
45
Los péptidos análogos de somatostatina lineales de la presente invención se pueden sintetizar químicamente in
vitro. Los péptidos de la presente invención se pueden preparar en general ventajosamente en un sintetizador de
péptidos. Se pueden sintetizar los péptidos de la presente invención en los que el resto ligante de radiomarcadores se
une covalentemente al péptido durante la síntesis química in vitro, utilizando técnicas bien conocidas para las personas
expertas en la materia. Dichos péptidos covalentemente unidos al resto ligante de radiomarcadores durante la síntesis
son ventajosos debido a que se pueden determinar sitios específicos de enlace covalente.
50
55
60
Los restos ligantes de radiomarcadores de la invención se pueden introducir en los péptidos análogos de somatostatina lineales diana durante la síntesis del péptido. Para realizaciones que comprenden ácido picolínico ((Pic-); p.ej.,
Pic-Gly-Cys(grupo protector)), el resto ligante de radiomarcadores se puede sintetizar en forma del último resto (es
decir, el terminal amino) en la síntesis. Además, el resto ligante de radiomarcadores que contiene ácido picolínico se
puede unir covalentemente al grupo ε-amino de lisina para proporcionar, por ejemplo, αN(Fmoc)-Lys-εN(Pic-Gly-Cys
(grupo protector)), que se puede incorporar en cualquier posición apropiada en la cadena peptídica. Dicha secuencia es
particularmente ventajosa, ya que proporciona un modo fácil de incorporación en el péptido análogo de somatostatina
diana.
De manera similar, el resto ligante de radiomarcadores que contiene picolilamina (Pica) (-Cys(grupo protector)Gly-Pica) se puede preparar durante la síntesis del péptido incluyendo la secuencia (-Cys(grupo protector)-Gly-) en el
terminal carboxilo de la cadena peptídica. Después de la escisión del péptido a partir de la resina, el terminal carboxilo
del péptido se activa y se acopla a picolilamina. Esta vía de síntesis requiere que las funcionalidades de la cadena lateral
reactivas permanezcan enmascaradas (protegidas) y que no reaccionen durante la conjugación de la picolilamina.
65
La presente invención proporciona asimismo pequeños péptidos sintéticos lineales que son análogos de somatostatina e incorporan agentes quelantes basados en bisamina-bistiol (BAT) que se pueden marcar con Tc-99m.
13
ES 2 197 169 T3
La presente invención proporciona la incorporación de dichos agentes quelantes en virtualmente cualquier posición
en el péptido, por medio de una unión covalente a cualquier grupo funcional apropiado del péptido, excepto que los
restos quelantes de la invención no están covalentemente unidos a grupos funcionales que comprenden las cadenas
laterales de aminoácidos de los aminoácidos B1 , B2 , B3 o B4 .
5
10
15
20
25
En la formación de un complejo de tecnecio radiactivo con los reactivos de la presente invención, el complejo
de tecnecio, con preferencia una sal de pertecnetato Tc-99m, se hace reaccionar con el reactivo en presencia de un
agente reductor. Los agentes reductores preferidos son iones ditionito, estannoso y ferroso; el agente reductor más
preferido es cloruro estannoso. Se proporcionan convenientemente medios para la preparación de dichos complejos
en forma de un estuche que comprende un vial herméticamente cerrado que contiene una cantidad predeterminada
de un reactivo de la invención que se ha de marcar y una cantidad suficiente de un agente reductor para marcar el
reactivo con Tc-99m. Alternativamente, el complejo se puede formar haciendo reaccionar el reactivo de la presente
invención con un complejo lábil preformado de tecnecio y otro compuesto conocido como ligando de transferencia.
Dicho procedimiento es conocido como intercambio de ligandos y es bien conocido para las personas expertas en la
materia. El complejo lábil se puede formar utilizando ligandos de transferencia tales como tartrato, citrato, gluconato
o manitol, por ejemplo. Entre las sales de pertecnetato Tc-99m que son útiles en la presente invención se incluyen las
sales de metales alcalinos, tales como sal de sodio, sales de amonio o sales de alquilamonio inferior.
En una realización preferida de la invención, se proporciona un estuche para la preparación de péptidos marcados
con tecnecio. Una cantidad apropiada del reactivo peptídico se introduce en un vial que contiene un agente reductor,
tal como cloruro estannoso, en una cantidad suficiente para marcar el péptido con Tc-99m. Se puede incluir asimismo
una cantidad apropiada de un ligando de transferencia como el que se ha descrito (tal como tartrato, citrato, gluconato
o manitol, por ejemplo). El estuche puede contener asimismo materiales auxiliares farmacéuticos convencionales tales
como, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables para ajustar la presión osmótica, soluciones tampones, agentes
de conservación y otros similares. Los componentes del estuche pueden encontrarse en forma líquida, congelada o
seca. En una realización preferida, los componentes del estuche se proporcionan en forma liofilizada.
30
Los reactivos formadores de imágenes médicas marcados con tecnecio-99m de acuerdo con la presente invención
se pueden preparar mediante la adición de una cantidad apropiada de Tc-99m o de complejo de Tc-99m en los viales
y una reacción en las condiciones que se describen en el siguiente Ejemplo 2.
35
Se proporcionan agentes formadores de imágenes médicas centelleográficas radiactivamente marcados proporcionados por la presente invención que presentan una cantidad adecuada de radiactividad. En la formación de complejos
reactivos de Tc-99m, se prefiere generalmente formar complejos radiactivos en soluciones que contienen radiactividad
en concentraciones de aproximadamente 0,01 milicurios (mCi) a 100 mCi por ml.
40
45
50
Los reactivos formadores de imágenes médicas proporcionados por la presente invención se pueden utilizar para
visualizar órganos tales como el riñón, para diagnosticar trastornos en dichos órganos, y tumores, en particular tumores
gastrointestinales, mielomas, carcinoma de pulmón de células pequeñas y otros APUDomas, tumores endocrinos tales
como carcinomas tiroideos medulares y tumores pituitarios, tumores cerebrales tales como meningiomas y astrocitomas, y se pueden formar imágenes médicas asimismo de tumores de la próstata, mama, colon y ovarios. De acuerdo
con la presente invención, los reactivos peptídicos marcados con Tc-99m se administran en una única dosis unitaria
inyectable. Los reactivos peptídicos marcados con Tc-99m proporcionados por la invención se pueden administrar por
vía intravenosa en cualquier medio convencional para una inyección intravenosa, tal como un medio salino acuoso, o
en un medio de plasma sanguíneo. Generalmente, la dosis unitaria que se ha de administrar presenta una radiactividad
de aproximadamente 0,01 mCi a aproximadamente 100 mCi, con preferencia de 1 mCi a 20 mCi. El volumen de la
solución que se ha de inyectar en una dosificación unitaria es de aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 10 ml.
Después de una administración intravenosa puede tener lugar una formación de imágenes médicas in vivo en cuestión
de unos pocos minutos. Sin embargo, puede tener lugar una formación de imágenes médicas, si se desea, en el plazo
de horas o incluso más prolongado, después de que el péptido radiomarcado se ha inyectado a un paciente. En la
mayoría de los casos, una cantidad suficiente de la dosis administrada se acumulará en la zona de la que se han de
formar imágenes médicas en el plazo de aproximadamente 0,1 horas para permitir la toma de fotos de centelleo. Se
puede utilizar cualquier procedimiento convencional de formación de imágenes médicas centelleográficas para fines
diagnósticos de acuerdo con la presente invención.
55
60
65
Los péptidos lineales ligantes de receptores de somatostatina y los complejos de metales no radiactivos de los reactivos peptídicos lineales de la invención se pueden utilizar clínicamente para activar la regresión de ciertos tipos de
tumores, particularmente los que expresan receptores de somatostatina. Los péptidos análogos de somatostatina lineales de la invención se pueden utilizar asimismo para reducir la hipersecreción hormonal que acompaña con frecuencia
a ciertos cánceres, tales como los APUDomas. Los péptidos de la invención utilizados como agentes terapéuticos se
pueden administrar mediante cualquier vía apropiada, incluyendo la vía intravenosa, intramuscular o por boca, y en
cualquier excipiente farmacéuticamente aceptable, en dosis que varían de aproximadamente 0,1 a aproximadamente
49 mg/kg de peso corporal/día.
La presente invención proporciona asimismo péptidos radiomarcados con un radioisótopo citotóxico, tal como
renio-186 o renio-188, que se pueden utilizar para la radioterapia de ciertos tumores, tal como se ha descrito anteriormente. Para este fin, se puede administrar una cantidad de isótopo radiactivo de aproximadamente 10 mCi a
aproximadamente 200 mCi por cualquier vía clínica adecuada, con preferencia mediante una inyección intravenosa.
14
ES 2 197 169 T3
Los procedimientos para preparar y marcar dichos compuestos se ilustran más completamente en los siguientes
ejemplos. Estos Ejemplos ilustran ciertos aspectos del procedimiento anteriormente descrito y los resultados ventajosos, y se muestran a título de ilustración y no de limitación.
5
Ejemplo 1
Síntesis de péptidos en fase sólida
10
Se llevó a cabo una síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) a una escala de 0,25 milimoles (mmol) utilizando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems Modelo 431A y utilizando una protección del terminal amino
con 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), acoplando con diciclohexilcarbodiimida/hidroxibenzo-triazol o hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio/hidroxibenzotriazol (HBTU/HOBT), y utilizando resina
p-hidroximetilfenoxi-metilpoliestireno (HMP) para los ácidos del terminal carboxilo o resina amídica Rink para las
amidas del terminal carboxilo.
15
20
25
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65
En su caso, se sintetizaron los siguientes derivados de aminoácidos. Se preparó homocisteína mediante hidrólisis
alcalina de L -homocisteína-lactona. Se pueden introducir restos de treoninol, en los que el grupo carboxilo del aminoácido está reducido a alcohol primario, en los péptidos de la invención en su caso utilizando el procedimiento de
Neugebauer et al. (1990, Peptides: Proceedings of the 11th American Peptide Symposium, págs. 1020-21). Se prepararon Fmoc.Hcy(Trt) y Fmoc.Pen(Trt) a partir de los aminoácidos apropiados mediante tritilación con trifenilmetanol
en TFA, seguido de una derivatización con Fmoc, tal como se describe por Atherton et al. (1989, Solid Phase Peptide
Synthesis, IRL Press: Oxford). Se preparó Fmoc.homohomo-cisteína(Trt) reduciendo éster α-metílico del ácido N,Nbis-Boc-glutámico con borano-THF, seguido de una mesilación y una reacción con tritil-mercaptida, seguido de la
eliminación de los grupos Boc con BF3 OEt en ácido acético, y a continuación una derivatización con Fmoc como
se ha descrito anteriormente. Se preparó PhCH2 CHBrCOOH tratando fenilalanina (en una solución de agua y TFA/
saturada con NaBr) con nitrito de sodio, seguido de una destilación para recuperar el producto puro.
En su caso, se introdujeron grupos 2-cloroacetilo, 2-bromoacetilo y 2-bromo-3-fenilpropionilo utilizando ya sea
el apropiado ácido 2-hálico como el último resto acoplado durante la SPPS, o tratando el péptido con un aminoácido
exento de terminal N unido a la resina ya sea con ácido 2-hálico/diisopropilcarbodiimida/N-hidroxi-succinimida/NMP
o con anhídrido de ácido 2-hálico/-diisopropiletilamina/NMP.
En su caso, se ciclizaron péptidos 2-haloacilados purificados por HPLC agitando una solución de 0,1 a 1,0 mg/ml en
una solución tampón de fosfato o bicarbonato o en hidróxido de amonio diluido (pH 8,0), que contenía opcionalmente
EDTA de 0,5 a 1,0 mM, o acetonitrilo o THF durante 1 a 48 h seguido opcionalmente de una acidificación con ácido
acético, una liofilización y una purificación por HLPC.
En su caso, se conjugó (BAM) (N1 ,N4 -bis(2-mercapto-2-metilpropil)-1,4,10-triazadecano) con el péptido activando
en primer lugar el carboxilato del péptido con una mezcla de diisopropilcarbodiimida/ N-hidroxisuccinimida o HBTU/HOBt en DMF, NMP o cloruro de metileno, seguido del acoplamiento en presencia de diisopropiletilamina. Después
del acoplamiento, los conjugados se desprotegieron tal como se ha descrito anteriormente.
En su caso, se incorporó (BAT) (ácido N6 ,N9 -bis(2-mercapto-2-metilpropil)-6,9-diazanonanoico) en un péptido en
forma de (Nα(Fmoc)-Nε(N-Boc)-S,S’-bistritil-BAT)lisina (preparada a partir de Nα(Fmoc)-lisina y Nε(N-Boc-S,S’bistritil-BAT durante la síntesis del péptido y a continuación se desprotegió después de una escisión del péptido
completado a partir de la resina sintética.
En su caso, se prepararon aductos de BSME haciendo reaccionar péptidos que contenían un único tiol (5 a 50
mg/ml en DMF tamponado a pH 7 con N-metilmorfolina o N-etilmorfolina, o con una solución tampón de fosfato de
sodio 50 mM, pH 7-8, que contenía opcionalmente EDTA 0,5 mM o DMF o THF o acetonitrilo) con 0,5 equivalentes
molares de BMME (bis-maleimidometiléter) disueltos previamente en acetonitrilo a temperatura ambiente durante
aproximadamente 1 a 18 horas. La solución se concentró y el producto se purificó por HPLC.
En su caso, se prepararon aductos de TSEA haciendo reaccionar un péptido que contenía un único tiol (en concentraciones de 10 a 100 mg/ml de péptido en DMF tamponado a pH 7 con N-metilmorfolina o con N-etilmorfolina, o 5 a
50 mg/ml de péptido en fosfato de sodio 50 mM, pH 7-8, que contenía opcionalmente EDTA 0,5 mM o DMF o THF o
acetonitrilo) con 0,33 equivalentes molares de TMEA (tris(2-maleimidoetil)amina disueltos previamente en acetonitrilo o DMF, con o sin 1 equivalente molar de trietanolamina, a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 18
horas. Dichas mezclas de reacción que contenían aductos se concentraron y los aductos se purificaron a continuación
utilizando una HPLC.
En su caso, se prepararon aductos de BAT-BS (N-(2-(N’,N’-bis(2-succinimidoetil)aminoetil))-N6 ,N9 -bis (2-metil2-mercaptopropil)-6,9-diazanonanamida) haciendo reaccionar un péptido que contenía un único tiol (en concentraciones de 2 a 50 mg/ml de péptido en DMF tamponado a pH 7 con N-metilmorfolina o N-etilmorfolina, o en fosfato
de sodio 50 mM (pH 7-8), que contenía opcionalmente EDTA 0,5 mM o DMF o THF o acetonitrilo) con 0,5 equivalentes molares de BAT-BM (N-(2-(N’,N’-bis(2-maleimidoetil)aminoetil))-N9 -(t-butoxicarbonil) -N6 ,N9 -bis(2-metil2-trifenilmetiltio-propil)-6,9-diazanonanamida) disueltos previamente en acetonitrilo o THF, a temperatura ambiente
durante aproximadamente 1 a 18 h. La solución se evaporó a continuación a sequedad y los conjugados de (BAT-BS)15
ES 2 197 169 T3
péptido se desprotegieron mediante tratamiento con 10 ml de TFA y 0,2 ml de trietilsilano durante 1 h. La solución se
concentró, los aductos producidos se precipitaron con éter, y a continuación se purificaron por HPLC.
5
10
En su caso, se puede introducir el resto (DTPA) utilizando el procedimiento de Bakker et al. (1991, Life Sci. 49:
1583-1591, que se incorpora en la presente memoria como referencia).
Los productos unidos a la resina se escindieron rutinariamente utilizando una solución de ácido trifluoroacético o
de ácido trifluoroacético y cloruro de metileno, que contenía opcionalmente agua, tioanisol, etanoditiol y trietilsilano,
preparada en relaciones de 100 : 5 : 5 : 2,5 : 2 durante 0,5 a 3 h a temperatura ambiente. Los péptidos brutos se
purificaron mediante una cromatografía preparativa líquida de alta presión (HPLC) utilizando una columna Waters
Delta Pak C18 y una elución en gradiente utilizando ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% en agua modificada con
acetonitrilo. El acetonitrilo se evaporó de las fracciones diluidas que se liofilizaron a continuación. La identidad de
cada producto se confirmó mediante una espectroscopia de masas de bombardeo atómico rápido (FABMS) o mediante
una espetroscopia de masas por electropulverización (ESMS).
15
En la siguiente Tabla I se muestran análogos de somatostatina sintetizados tal como se proporciona en la presente
memoria, así como los productos de dicha síntesis identificados por FABMS.
Ejemplo 2
20
Un procedimiento general para la radiomarcación
25
Se disolvieron 0,1 mg de un péptido preparado como en el Ejemplo 1 en 0,1 ml de agua o etanol/agua 50/50
o una solución salina tamponada con fosfato o una solución tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH = 5, 6 ó
7,4). Se preparó gluceptato de Tc-99m reconstituyendo un vial de Glucoscan (E.I. DuPont de Nemours, Inc.) con
1,0 ml de pertecnetato TC-99m de sodio que contenía hasta 200 mCi y se dejó en reposo durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Se añadieron a continuación 25 µl de gluceptato de Tc-99m al péptido y se dejó que la reacción
se desarrollara a temperatura ambiente o a una temperatura de 100ºC durante 15 a 30 min y a continuación se filtró a
través de un filtro de 0,2 µm.
30
35
La pureza del péptido marcado con Tc-99m se determinó por HPLC utilizando las siguientes condiciones: una
columna analítica Waters Delta Pak RP-18, 5 µ, 4,6 mm x 220 mm, se cargó con cada péptido radiomarcado, y los
péptidos se eluyeron con un caudal de disolvente igual a 1 ml/min. Se realizó una elución en gradiente comenzando con
100% de disolvente A (0,1% de CF3 COOH/H2 O) y finalizando con 100% de disolvente B90 (0,1 de CF3 COOH/90%
de CH3 CN/H2 O) durante el transcurso de 10 a 20 min.
40
Los componentes radiactivos se detectaron utilizando un detector radiométrico en línea conectado a un registrador
de integración. El gluceptato de Tc-99m y el pertecnetato Tc-99m de sodio se eluyeron en un periodo de tiempo
comprendido entre 1 y 4 minutos en estas condiciones, mientras que los péptidos marcados con Tc-99m se eluyeron
después de un periodo de tiempo mucho más prolongado, tal como se ilustra en la siguiente Tabla I.
TABLA I
Péptido
MH+
RCY (%)
R; (min)
CAcm GCAcm GGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida
(DTPA).FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
ma.GGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida
Ac.CAcm GCAcm FD .Cpa.YWD YWD KTFT.amida
(DTPA).D-Nal.Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
AKCGGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida
(DTPA).D-Nal.Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
(DTPA).Aca.FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
(DTPA).(ε-K)GCFD .FYWD KTFT.amida
Ac.CGCFD .Cpa.YWD KTFT.amida
(DTPA).(D-Nal.CYWD KVCT)2
Ac.FD .FYWD KTFT(ε-K)GC.amida
Ac.FD .FYWD KTFTGGG(ε-K)GC.amida
KDKD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKDKD.amida
Ac.KKKKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
Ac.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
KKKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCDDDD.amida
(2-cetogulonil)FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
Hca.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
1749
1837
1417
1619
2143
1612
1887
1950
1802
1477
2554
1469
1640
2484
2450
1810
2485
1944
2097
976
977
986
756
N.D.
987
977
973
973
988
978
963
983
996
986
966
986
996
986
15,72
15,52
12,23
17,1, 17,52
N.D.
15-162
16,22
11,53
11,53
18,12
11,8-12,43
12,1, 12,63
11,9 12,43
14,8
14,2
16,8
14,6
16,0
15,8
45
50
55
60
65
16
ES 2 197 169 T3
TABLA I (continuación)
5
10
15
20
25
30
35
Péptido
MH+
RCY (%)
R; (min)
(Trc)2 K.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
KD KKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCDD.amida
KD KKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKDKD.amida
(Trc.imida)NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCR.amida
Trc(Trc.imida )K.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε- K)GCRR.amida
(Trc.imida )2 K.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε- K)GCRR.amida
DDD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
Ac.DDD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
DDDD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K).GCKKKK.amida
(DTPA).NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K).GCKK.amida
(DTPA).NalD .Cpa.YWD KTFTCAcm GCAcm .amida
Ac.KKKKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K).GC.amida
Hca.G.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
(DTPA).FD FYWD KTFT(ε-K)GC.amida
(DTPA).K.(BAT).D-Nal.CMe YWD KVCMe T.amida
(2-cetogulonil)-D-NalFYWD KVCT.amida
(DTPA).D-Nal.CYWD KVCT.amida
Pic.GCAcm GGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida
Ac.FD FYWD KTFGGG(ε-K)KC.amida
K.(BAT).D-Nal.CMe YWD KVCMe T.amida
(DTPA).FD GYWD KTCT(CH2 OH)
(DTPA).Nal.SYWD KVTK.(BAT).amida
(DTPA).Nal.SYWD KVCT.amida
(2−cetogulonil) .FD .Cpa.YWD KTFT.(ε-K).GC.amida
2212
2253
2485
1808
2250
2232
1998
2040
2484
2192
2003
2192
2136
1801
1949
1318
1473
1681
1710
1573
N.D.
1801
1457
1636
986
996
796
996
996
996
995
1005
986
956
937
942
935
975
968
983
978
988
988
978
963
963
958
992
15,7
14,7
14,1
17,3
16,2
16,6
15,63
16,03
15,1
15,83
16,43
14,93
16,03
11,33
12,33
12,4, 13,03
11,03
13,8-16,81
15,92
12,53
10,61
12,03
11,63
15,8
∗ Se utilizaron las siguientes condiciones de marcación con los péptidos apropiados:
1. El péptido se disolvió en una solución tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,4) y se marcó a temperatura
ambiente.
40
2. El péptido se disolvió en agua y se marcó a temperatura ambiente.
3. El péptido se disolvió en agua y se marcó a una temperatura de 100ºC.
45
4. El péptido se disolvió en 50% de etanol/agua y se marcó a una temperatura de 100ºC.
5. El péptido se disolvió en 10% de hidroxipropilciclodextrina y se marcó a temperatura ambiente.
6. El péptido se disolvió en 50% de etanol/agua y se marcó a temperatura ambiente.
50
7. El péptido se disolvió en agua ajustada a pH 9 y se marcó a una temperatura de 100ºC.
8. El péptido se disolvió en agua ajustada a pH 6,5 y se marcó a una temperatura de 100ºC.
55
∗∗ Procedimientos de HPLC
general: disolvente A = 0,1% de CF3 COOH/H2 O
disolvente B90 = 0,1% de CF3 COOH/90% CH3 CN/H2 O
60
caudal de disolvente = 1 ml/min
Columnas:
65
a. columna Vydac = columna analítica Vydac 218TP54 RP-18,
5 µm × 220 mm × 4,6 mm con columna de guarda
b. columna Waters = Waters Delta-Pak C18,
5 µm, 39 x 150 mm
17
ES 2 197 169 T3
Procedimiento 1: columna Vydac
Procedimiento 2: columna Waters
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Procedimiento 3: columna Waters
100% A a 100%
B90 en 10 min
100% A a 100%
B90 en 20 min
100% A a 100%
B90 en 10 min.
Las abreviaturas de una única letra para aminoácidos se pueden encontrar en la publicación Biochemistry (2ª ed.),
de G. Zubay, 1988 (MacMillen Publishing: Nueva York) pág. 33: Ac = acetilo; Acm = acetamidometilo; ma = ácido
mercaptoacético; ; Aca = ácido 6-aminocaproico; Hly = homolisina; Apc = L -(S-(3-aminopropil)cisteína; FD = D -fenilalanina; WD = D -triptófano; YD = D -tirosina; Cpa = L -(4-clorofenil)alanina; D -Nal = D -2-naftilalanina; Nle = norleucina;
Hcy = homocisteína; Hhc = homohomocisteína; Pen = penicilamina; Aib = ácido aminoisobutírico; Nal = 2-naftilalanina; D-Nal = D-2-naftilalanina; Ain = ácido 2-aminoindano-2-carboxílico; Achxa = 4-amino-ciclohexil-alanina; Amf
= 4-aminometil-fenilalanina; Aec = S-(2-aminoetil)cisteína; Apc = S-(3-aminopropil)cisteína; Aes = O-(2-aminoetil)
serina; Aps = O-(3-aminopropil)serina; Abu = Ácido 2-aminobutírico; Trc = ácido tricarboalílico; Hca = hexacarboxiciclohexano; Nva = norvalina; T(CH2OH ) = treoninol (en el que el resto de ácido carboxílico ha sido reducido a alcohol
primario); ε-K = un resto de lisina en un péptido en el que el enlace peptídico implica el grupo ε-amino en la cadena
lateral de lisina en lugar del grupo α-amino; δ-Orn = un resto de ornitina en el que el grupo δ-amino, en lugar del grupo
α-amino típico, está covalentemente unido al grupo carboxilo del aminoácido contiguo para formar un enlace peptídico; γ-Dab = un resto de ácido 2,4-diaminobutírico en el que el grupo γ-amino está covalentemente unido al grupo
carboxilo del aminoácido contiguo para formar un enlace peptídico; β-Dap = un resto de ácido 1,3-diaminopropiónico
en el que el grupo β-amino está covalentemente unido al grupo carboxilo del aminoácido contiguo para formar un enlace peptídico; Pic = picolinoílo (piridin-2-carbonilo); Pica = picolilamina (2-(aminometil)-piridina; BAT = ácido N6 ,N9 bis(2-mercapto-2-metilpropil)-6,9-diazanonanoico; ácido BAT (protegido) = ácido N9 -(t-butoxicarbonil)-N6 ,N9 - bis(2metil-2-trifenilmetiltio-propil)-6,9-diazanonanoico; BAM = (N1 ,N4 -bis(2-mercapto-2-metilpropil)-1,4,10-triazadecano; BAM (protegido) = N1 (t-butoxicarbonil)-N1 ,N4 -bis (2-metil-2-trifenilmetiltio-propil)-1,4,10-triazadecano; (BATBM) = N-(2-(N’,N’-bis(2-maleimidoetil)aminoetil)-N9 - (t-butoxicarbonil)-N6 ,N9 -bis (2-metil-2-trifenilmetiltiopropil)6,9-diazanonanamida, (BAT-BS) = N-[2-(N’,N’-bis(2-succinimidoetil)aminoetil)] -N6 ,N9 -bis(2-mercapto-2-metilpropil)-6,9-diazanonanamida; (BMME) = bis-maleimidometiléter; (BSME) = bis-succinimidilmetiléter; (DTPA) = ácido
dietilentriaminopentaacético. RCY (%) = rendimiento radioquímico determinado por HPLC).
Se prepararon complejos de renio no radiactivo disolviendo conjuntamente cada uno de los reactivos peptídicos de
la invención con aproximadamente un equivalente molar de oxotetra-bromorrenato de tetrabutilamonio (+5), preparado
tal como se describe por Cotton et al. (1996, Inorg. Chem. 5: 9-16) en dimetilformamida o acetonitrilo/agua y se
agitaron durante 0,5 a 5 días. Los complejos de renio se aislaron mediante una HPLC de fase inversa tal como se ha
descrito anteriormente para péptidos marcados con Tc-99m y se caracterizaron por FABMS o ESMS.
Se prepararon complejos de renio radiactivo, utilizando por ejemplo Re-186 o Re-188 a partir de las sales de
perrenato apropiadas utilizando el mismo protocolo que para la marcación con Tc-99m, o añadiendo un agente reductor
a una solución del péptido y el perrenato, u opcionalmente utilizando un agente de transferencia de ligandos tal como
citrato e incubando la mezcla de reacción a una temperatura comprendida entre la temperatura ambiente y 100ºC
durante entre 5 y 60 min.
Ejemplo 3
Inhibición de la unión de (125 I-Tyr11 )somatostatina-14 a membranas de células de tumor pancreático de rata, AR42J
50
55
60
65
Se demostró la capacidad de diversos análogos de somatostatina de la invención para unirse a receptores de somatostatina in vitro, ensayando la capacidad de dichos análogos para inhibir la unión de un análogo de somatostatina
radiomarcado a membranas celulares que contenían receptores de somatostatina. La línea celular de tumor pancreático de rata, AR42J, que expresa el receptor de somatostatina, se cultivó en medios esenciales mínimos de Dulbecco
(DMEM) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y glutamina 8 mM en una atmósfera con el 5% de
CO2 humidificada, a una temperatura de 37ºC en matraces T. Las células recogidas se homogeneizaron en una solución tampón Tris-HCl 50 mM fría (pH 7,4) y el material homogeneizado se centrifugó a continuación a 39.000 g
durante 10 min a una temperatura de 4ºC. Los sedimentos de centrifugación se lavaron una vez con solución tampón
y a continuación se volvieron a suspender en una solución enfriada con hielo de Tris-HCl 10 mM (pH 7,4). Partes
alícuotas iguales de esta preparación de membranas celulares se incubaron con (125 I-Tyr11 )somatostatina-14 (a una
concentración final de 0,5 nM y 750.000 cpm/ml, a una actividad específica de 2.000 Ci/mmol, Amersham, Arlington
Heights, IL) y el péptido a una concentración final de 10−11 M a 10−6 M en una solución de HEPES 50 mM (pH 7,4)
que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA), MgCl2 5 mM, Trasylol (200.000 Unidades Internacionales),
bacitracina (0,02 mg/ml) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (0,02 mg/ml) durante 25 min a una temperatura de 30ºC.
Utilizando un colector de filtración, esta mezcla se filtró a través de un filtro GC/F lavado con polietilenimina (Whatman, Maidstone, Inglaterra), y el residuo que permaneció sobre el filtro se lavó tres veces con 5 ml de solución tampón
HEPES fría. El filtro y una muestra de los líquidos de lavado del filtro se contaron a continuación en un contador
de rayos gamma. Para determinar la unión no específica, el ensayo se realizó en presencia de somatostatina-14 no
marcada, a 200 nM. Los datos de análisis que incluyeron representaciones gráficas de Hill de los datos proporcionaron
constantes de inhibición (véase Bylund & Yamamura, “Methods of receptor binding”, en Methods in Neurotransmitter
18
ES 2 197 169 T3
Receptor Analysis, Yamamura et al., compiladores, Raven Press: Nueva York, 1990).
Estos resultados se presentan en la siguiente tabla. Los datos muestran que los péptidos de la presente invención
presentan una alta afinidad de unión para receptores de somatostatina.
5
TABLA II
10
15
20
25
30
35
Péptido
K; (nM)
CAcm GCAcm GGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida
(DTPA)FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
maGGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida
Ac.CAcm GCAcm FD .Cpa.YWD KTFT.amida
(DTPA)NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
AKCGGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida
(DTPA)NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
(DTPA)NalD .Cpa.YWD KT.Nal.T(ε-K)GCKK.amida
(DTPA).Aca.D .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
KDKD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKDKD.amida
(2-cetogulonil)FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
(DTPA).(ε-K)GCFD .Cpa.YWD KTFT.amida
Ac.CGCFD .Cpa.YWD KTFT.amida
KD KKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKDKD.amida
Ac.KKKKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
KKKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCDDDD.amida
(DTPA)(NalD .CYWD KVCT)2
Ac.KKKKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
Ac.FD .FYWD KTFT(ε-K)GC.amida
Ac.FD .FYWD KTFTGGG(ε-K)GC.ammida
K(BAT).NalD .CMe YWD KVCMe T.amida
<0,01
0,24
0,25
0,73
1,3
1,4
2,0
2,0
2,6
2,6
2,7
3,3
4,4
4,9
6,5
6,9
7,2
7,7
7,9
8,2
9,9
TABLA II (continuación)
Péptidos complejados con (Re=O)
MH+
K; (nM)
Ac.DD FD .Cpa.YWDKTC(ε-K)GCKK.amida
(DTPA)NalD .YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
CAcm GCAcm GGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida
DD DFD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
Ac.KKKKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
(DTPA)NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
AKCGGGFD FYWD KTFT.amida
KKKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCDDDD.amida
maGGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida
Ac.DD DFD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
DDD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
KDKD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKDKD.amida
Ac.FD FY WD KTFT(ε-K)GC.amida
KD KK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCDDD.amida
KD KK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCDD.amida
Ac.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
AKCGGGFD FYWD KTFT.amida
(DTPA)NalD .Cpa.YWD KTFTCAcm GCAcm .amida
(2-cetogulonil)FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
KD KKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKDKD.amida
Ac.CGCFD .Cpa.YWD KTFT.amida
2074
2343
1807
2147
2649
2393
1812
2683
1618
2188
2197
2083
1688
2440
2453
2008
1812
2061
1837
2684
1677
0,20
0,33
0,43
0,50
0,63
0,67
0,76
0,83
0,97
1,4
1,4
1,4
1,5
1,5
1,6
1,9
2,9
3,1
3,7
3,8
4,1
40
45
50
55
60
65
19
ES 2 197 169 T3
TABLA II (continuación)
5
10
15
Péptidos complejados con (Re=O)
MH+
K; (nM)
Ac.KKKKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
(Trc.imida )2 K.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε- K)GCRR.amida
(2-cetogulonil)FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
Ac.DDD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
Ac.FD FYWD KTFTGGG(ε-K)KC.amida
(DTPA).FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
Hca.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida
KD KKK.FD .Cpa.YWD KTF.Nal.(ε-K)GCDDDD.amida
Ac.FD FYWD KTFTGGG(ε-K)GC.amida
(DTPA).Aca.FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
DDDD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKKKK.amida
(DTPA).NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
2394
2432
2143
2239
1911
2036
2298
2730
1840
2149
2674
2085
4,4
4,9
5,2
6,0
6,1
7,9
8,0
8,1
8,1
8,2
9,8
11
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
20
ES 2 197 169 T3
REIVINDICACIONES
1. Un reactivo peptídico ligante de receptores de somatostatina que presenta la fórmula:
5
X1 − A1 A2 − B1 B2 B3 B4 − C1 C2 − X2
en la que
10
X1 y X2 son cada uno independientemente restos hidrófilos;
A1 , A2 y C1 son cada uno independientemente un D- o L-aminoácido lipófilo, o cisteína S-alquilada, penicilamina, homocisteína u homohomocisteína;
15
B1 es D- o L-Phe, o D- o L-Tyr, o D- o L-Nal, o Ain;
B2 es D- o L-Trp;
B3 es D- o L-Lys, o Hly, Achxa, Amf, Aec, Apc, Aes o Aps;
20
B4 es D- o L-Thr, Ser, Val, Phe, Ile, Abu, Nle, Leu, Nva, Nal o Aib;
C2 es D- o L-Thr, Ser, Val, Phe, Ile, Abu, Nle, Leu, Nva, Nal o Aib;
25
con la condición de que el reactivo peptídico ligante de receptores de somatostatina no sea
GGGFD .Cpa.YWD KTFTamida covalentemente unida a un resto ligante de radiomarcadores que es capaz de formar
un complejo eléctricamente neutro con un radioisótopo, o no presente ninguna de las siguientes estructuras:
K[BAT]D.Nal.CME YWD KVCMe T.amida; o
30
35
40
45
50
[DTPA]K[BAT]D-Nal.CME YWD KVCMe T.amida
2. El reactivo según la reivindicación 1, en el que X1 comprende un aminoácido, un péptido que presenta una
secuencia de aminoácidos no superior a 10 restos, un monosacárido, un oligosacárido que comprende 10 o menos
unidades de sacárido, una poli(N-carboxilalquil)amina, o un polioxianión, y X2 comprende una poli(N-carboxilalquil)
amina, un polioxianión, un aminoácodo, un péptido que presenta una secuencia de aminoácidos no superior a 10 restos
(incluyendo péptidos en los que el grupo carboxilo del aminoácido del terminal carboxilo está reducido a alcohol), un
monosacárido y un oligosacárido que comprende 10 o menos unidades de sacárido.
3. El reactivo según las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende adicionalmente un resto conector polivalente que
se une covalentemente a una multiplicidad de los péptidos ligantes de receptores de somatostatina para formar un
agente ligante de receptores de somatostatina polivalente multimérico, en el que el peso molecular del agente ligante
de receptores de somatostatina polivalente multimérico es inferior a aproximadamente 20.000 daltons;
opcionalmente en el que el resto conector polivalente comprende bis-succinimidilmetiléter, ácido 4-(2,2-dimetilacetil)benzoico, N-2-(N’,N’-bis(2-succinimidoetil)-aminoetil)) -N6 ,N9 -bis(2-metil-2-mercaptopropil)-6,9-diaza-nonanamida, tris(succinimidiletil)amina, tris(2-cloro-acetamidoetil)amina, 1,2-bis-(2-(cloroacetamido)etoxi)- etano,
tris(acetamidoetil)amina, éter bis-acetamido-metílico, éter bis-acetamidoetílico, α, ε-bis-acetil-lisina, lisina y 1,8-bisacetamido-3,6-dioxaoctano, o un derivado de los mismos.
4. Un reactivo peptídico ligante de receptores de somatostatina que presenta la fórmula:
X1 − A1 A2 − B1 B2 B3 B4 − C1 C2 − X2
55
en la que
X1 es un resto hidrófilo;
60
A1 , A2 y C1 son cada uno independientemente un D- o L-aminoácido lipófilo, o cisteína S-alquilada, penicilamina, homocisteína u homohomocisteína;
B1 es D- o L-Phe, o D- o L-Tyr, o D- o L-Nal, o Ain;
B2 es D- o L-Trp;
65
B3 es D- o L-Lys, o Hly, Achxa, Amf, Aec, Apc, Aes o Aps;
B4 es D- o L-Thr, Ser, Val, Phe, Ile, Abu, Nle, Leu, Nva, Nal o Aib;
21
ES 2 197 169 T3
C2 es D- o L-Thr, Ser, Val, Phe, Ile, Abu, Nle, Leu, Nva, Nal o Aib;
X2 es -COOR9 , -CH2 OH, CH2 COOR9 , o -ON(R9 )2 , en los que cada R9 es H, alquilo inferior lineal o cíclico o
sustituido con un resto hidrófilo;
5
10
y en el que el péptido ligante de receptores de somatostatina está unido covalentemente a un resto ligante de radiomarcadores, en el que el resto ligante de radiomarcadores no está unido covalentemente a los restos B1 , B2 ,
B3 o B4 del péptido; con la condición de que el reactivo peptídico ligante de receptores de somatostatina no sea
GGGFD .Cpa.YWD KTFTamida covalentemente unida a un resto ligante de radiomarcadores que es capaz de formar un
complejo eléctricamente neutro con un radioisótopo, o no sea ninguna de las siguientes estructuras:
K[BAT]D.Nal.CME YWD KVCMe T.amida; o
[DTPA]K[BAT]D-Nal.CME YWD KVCMe T.amida.
15
20
5. El reactivo según la reivindicación 4, en el que X1 comprende un aminoácido, un péptido que presenta una
secuencia de aminoácidos no superior a 10 restos, un monosacárido, un oligosacárido que comprende 10 o menos
unidades de sacárido, una poli(N-carboxilalquil)amina o un polioxianión, y X2 comprende una poli(N-carboxilalquil)amina, un polioxianión, un aminoácido, un péptido que presenta una secuencia de aminoácidos no superior a 10 restos,
un monosacárido o un oligosacárido que comprende 10 o menos unidades de sacárido.
6. El reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que B1 es fenilalanina o tirosina, B2 es Dtriptófano, B3 es lisina y B4 es treonina o valina.
25
7. El reactivo según una cualquiera de la reivindicaciones 4 a 6, en el que el resto ligante de radiomarcadores
presenta una fórmula seleccionada entre el grupo que consiste en:
i)
C(pgp)S − (aa) − C(pgp)S
30
en la que (pgp)S es H o un grupo protector de tiol y (aa) es cualquier α- o β-aminoácido.
ii) un resto complejante de tecnecio-99m que comprende un único resto de tiol, que presenta la fórmula:
35
A − CZ(B) − [C(R0 R00 )]n − X
en la que
40
A es H, HOOC, H2 NOC, (péptido)-NHOC, (péptido)-OOC o R””;
B es H, SH, -NHR””, -N(R”’)-péptido) o R””;
45
X es H, SH, -NHR””, -N(R”’)-péptido o R””;
Z es H o R””;
R’, R”, R”’ y R”” son independientemente H o un alquilo inferior de cadena lineal o ramificada o cíclica; n es
0,1 ó 2
50
y
cuando B es -NHR”’ o -N(R”’)-(péptido), X es SH y n es 1 ó 2;
55
cuando X es -NHR”’ o -N(R”’)-péptido, B es SH y n es 1 ó 2;
cuando B es H o R””, A es HOOC, H2 NOC, (péptido)-NHOC, (péptido)-OOC, X es SH y n es 0 ó 1;
60
cuando A es H o R””, entonces cuando B es SH, X es -NHR”’ o -N(R”’)-(péptido) y cuando X es SH, B es
-NHR”’ o -N(R”’)-(péptido);
cuando X es H o R””, A es HOOC, H2 NOC, (péptido)-NHOC, (péptido)-OOC y B es SH;
65
cuando Z es metilo, X es metilo, A es HOOC, H2 NOC, (péptido)-NHOC, (péptido)-OOC, B es SH y n es 0;
y en el que el resto de tiol se encuentra en forma reducida;
22
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iii)
5
10
en la que X = H o un grupo protector;
(aminoácido) = cualquier aminoácido;
15
iv)
20
25
en la que X = H o un grupo protector;
30
(aminoácido) = cualquier aminoácido;
v)
35
40
45
50
en la que cada
55
R5 es independientemente H, CH3 o C2 H5 ;
cada (pgp)S es independientemente un grupo protector de tiol o H;
m, n y p son independientemente 2 ó 3;
60
A = alquilo lineal, alquilo inferior cíclico, arilo, heterociclilo, OR, una combinación de los mismos; y
65
23
ES 2 197 169 T3
vi)
5
10
15
en la que cada R5 es independientemente H, CH3 o C2 H5 ;
20
m, n y p son independientemente 2 ó 3;
A = alquilo lineal, alquilo inferior cíclico, arilo heterociclilo o una combinación de los mismos;
V = H o -CO-péptido;
25
R6 = H o péptido;
y
30
35
40
45
en la que cuando V = H, R6 = péptido y cuando R6 = H, V = -CO-péptido.
8. El reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, que comprende adicionalmente un resto conector polivalente covalentemente unido a una multiplicidad de los péptidos ligantes de receptores de somatostatina y asimismo covalentemente unido a una multiplicidad de restos ligantes de radiomarcadores para constituir
un reactivo para la preparación de un reactivo ligante de receptores de somatostatina polivalente multimérico, en
el que el peso molecular del reactivo ligante de receptores de somatostatina polivalente multimérico es inferior a
20.000 daltons; en el que opcionalmente el resto conector polivalente es bis-succinimidilmetiléter, ácido 4-(2,2-dimetilacetil)benzoico, N-2-(N’,N’-bis(2-succinimidoetil)-aminoetil)) -N6 ,N9 -bis(2-metil-2-mercaptopropil)-6,9-diazanonanamida, tris(succinimidiletil)amina, tris(2-cloro-acetamidoetil)amina, 1,2-bis-(2-(cloroacetamido)etoxi)-etano,
tris(acetamidoetil)amina, éter bis-acetamido-metílico, éter bis-acetamidoetílico, α, ε-bis}-acetil-lisina, lisina y 1,8bis-acetamido-3,6-dioxaoctano, o un derivado de los mismos.
9. Un reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que la cisteína del resto ligante de radiomarcadores que presenta la fórmula
C(pgp)S -(aa)-C(pgp)S
presenta un grupo protector de fórmula
50
-CH2 -NH-CO-R
en la que R es un alquilo inferior que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, 2-, 3-, 4-piridilo, fenilo o fenilo sustituido
con alquilo inferior, hidroxi, alcoxi inferior, carboxi, o alcoxicarbonilo inferior.
55
10. El reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que el resto ligante de radiomarcadores C
(pgp)S (aa)-C(pgp)S presenta la fórmula:
60
65
24
ES 2 197 169 T3
5
10
11. Un reactivo que presenta una fórmula seleccionada entre el grupo que consiste en:
15
CAcm GCAcm GGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida;
(DTPA).FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida
maGGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida;
20
Ac.CAcm GCAcm FD .Cpa.YWD KTFT.amida;
(DTPA).D-Nal.Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida;
25
AKCGGGFD .Cpa.YWD KTFT.amida;
(DTPA).D-Nal.Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida;
(DTPA).Aca.FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida;
30
(DTPA).(ε-K)GCFD FYWD KTFT.amida;
Ac.CGCFD .Cpa.YWD KTFT.amida;
35
(DTPA).(D-Nal.CYWD KVCT)2 ;
Ac.FD FYWD YWD KTFT(ε-K)GC.amida;
Ac.FD FYWD KTFTGGG(ε-K)GC.amida;
40
Ac.FD FYWD KTFGGG(ε-K)KC.amida;
(DTPA).D-Nal.CYWD KVCT.amida;
45
(2-cetogulonil)D-NalFYWD KVCT.amida;
(DTPA).FD FYWD KTFT(ε-K)GC.amida;
(DTPA).FD GYWD KTCT(CH2 OH);
50
(DTPA).Nal.SYWD KVT.K(BAT).amida;
(DTPA).Nal.SYWD KVCT.amida;
55
DDD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida;
Ac.DDD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida;
Hca.G.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida;
60
(Trc.imida )2 K.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε- K)GCRR.amida ;
Trc(Trc.imida )K.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCRR.amida ;
65
25
ES 2 197 169 T3
(Trc.imida)NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCR.amida;
KD KKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKDKD.amida;
5
KD KKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCDD.amida;
(Trc)2 K.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida;
Hca.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida;
10
(2-cetogulonil)FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida;
KKKK. NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCDDDD.amida;
15
Ac.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida;
Ac.KKKKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida;
(2-cetogulonil)FD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida;
20
DDDD.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKKKK.amida;
(DTPA)NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKK.amida;
25
(DTPA)NalD .Cpa.YWD KTFTCAcm GCAcm .amida;
Ac.KKKKK.NalD .Cpa.YWD KTFT(ε-K)GC.amida; y
KDKD.NalD.Cpa.YWD KTFT(ε-K)GCKDKD.amida.
30
12. El reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11, radiomarcado con un radioisótopo seleccionado
entre el grupo que consiste en tecnecio-99m, indio-111, galio-67, galio-68, yodo-123, escandio-47, cobre-67, galio72, itrio-90, yodo-125, yodo, 131, samario-153, gadolinio-159, disprosio-165, holmio-166, iterbio-175, lutecio-177,
renio-186, renio-188, bismuto-212 y ástato-211.
35
13. Un reactivo peptídico ligante de receptores de somatostatina según se define en la reivindicación 1, radiomarcado con yodo-123, yodo-125, yodo-131 o ástato-211.
40
14. Una composición que comprende el reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11 y un ion
estannoso.
15. Un procedimiento para la marcación de un reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11, que
comprende hacer reaccionar el reactivo con tecnecio-99m en presencia de un agente reductor, en el que opcionalmente
el agente reductor se selecciona entre el grupo que consiste en ion ditionito, ion estannoso o ion ferroso.
45
16. Un procedimiento para la preparación del reactivo según cualquiera de as reivindicaciones 1 a 3 ó 4 a 11, en
el que el péptido ligante de receptores de somatostatina se sintetiza químicamente in vitro, en el que opcionalmente el
péptido ligante de receptores de somatostatina se sintetiza mediante una síntesis de péptido en fase sólida.
50
17. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que el resto ligante de radiomarcadores se une covalentemente al péptido ligante de receptores de somatostatina durante la síntesis del péptido en fase sólida.
18. Una composición farmacéutica que comprende un reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11
en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
55
19. Un estuche para preparar una preparación radiofarmacéutica, comprendiendo dicho estuche un vial herméticamente cerrado que contiene una cantidad predeterminada del reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a
11 y una cantidad suficiente de un agente reductor para marcar el reactivo con tecnecio-99m, renio-186 o renio-188.
60
20. Un complejo del reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11 y un metal no radiactivo, en el que
opcionalmente el metal es renio.
65
26
ES 2 197 169 T3
21. Utilización del reactivo según las reivindicaciones 1 a 12 para la preparación de un medicamento para aliviar
una enfermedad relacionada con somatostatina en un animal, opcionalmente en un ser humano, o para la preparación
de un medicamento para formar imágenes médicas de un sitio en el interior de un cuerpo de mamífero.
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45
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la
Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del
Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas
antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran
protección a productos químicos y farmacéuticos como tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva.
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