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Recibido 11/08/2010, Aceptado 25/08/2010, Disponible online 02/05/2011
VI. BACTERIAS ACIDO LÁCTICAS (BAL) COMO ALTERNATIVA DE
CONSERVACIÓN DE LA CARNE DE RES EMPACADA EN
ATMÓSFERA MODIFICADA
María Consuelo Vanegas Lopez1*, Juliana Andrea Ossa Canencio 2, Paula Andrea
Gardeazábal Acuña3, Adriana Coral Durango4
1,2,3
Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos, LEMA. Departamento de Ciencias
Biológicas, Universidad de los Andes.
Cra 1 No. 18A-10. J-209. Teléfono: 3394949 ext. 2792. Bogotá, Colombia.
4
Carulla Vivero S.A. Bogotá-Colombia.
*mvanegas@uniandes.edu.co, ja.ossa907@uniandes.edu.co
RESUMEN
La temperatura es uno de los factores que más influye en el período de vida útil, ya que
si no se mantiene en un rango ente 0-4 °C, se puede alterar el producto y generar
pérdidas económicas. Una nueva alternativa para minimizar esta problemática es el uso
de preservantes naturales que incrementan el periodo de comercialización, como el uso
de metabolitos antimicrobianos producidos por bacterias ácido lácticas (BAL) como los
Lactobacillus.
El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de metabolitos solubles en el extracto crudo
de LAC 231 sobre la microbiota presente en la carne de res empacada en atmósfera
modificada (ATM); utilizando diferentes tratamientos; control, extracto crudo de
metabolitos e inóculo de Lactobacillus nativos. Se tomaron filetes finos de posta de res,
almacenados durante 17 días a 5 ± 0,2 ºC. Se realizaron recuentos de psicrófilos,
mesófilos, Pseudomonas spp, BAL, búsqueda de patógenos como Salmonella spp. y
Listeria monocytogenes por microbiología tradicional, evaluación del pH y análisis
sensoriales.
El extracto de metabolitos de Lactobacillus, comparado con el inóculo de Lactobacillus
nativos. y el control, mostró que es capaz de prolongar el periodo de vida útil de la carne
de res empacada en atmosfera modificada por aproximadamente 2 días. Disminuye en
dos unidades logarítmicas respecto al control, los recuentos de la microbiota
acompañante, de microorganismos causantes de deterioro como Pseudomonas, BAL,
mesófilos y psicrófilos, además de mantener el pH y las características sensoriales en un
rango aceptable.
Se determinó la inocuidad de la carne de res cruda y se propone el posible uso de
cepas nativas de Lactobacillus y sus metabolitos como preservante natural para disminuir
el desarrollo de microorganismos responsables del deterioro del producto en la industria
cárnica nacional.
Palabras clave: Carne de res, empacada en atmosfera modificada (ATM), metabolitos
antimicrobianos, Lactobacillus.
Vol 20, No 22 (2011), Revista Alimentos Hoy - 18
ABSTRACT
Temperature is one of the factors that most influence the food´s lifespan, because if it is
not kept in the range between 0-4 °C, it can alter the product and generate economic
losses. A new alternative to minimize this problem is the use of natural preservatives that
increase the marketing period, as the use of antimicrobial metabolites produced by lactic
acid bacteria (LAB) such as Lactobacillus.
The aim of this study was to evaluate the effect of soluble metabolites in the crude
extract of LAC 231 on the microbiot present in beef in a modified atmosphere packaging
(MAP); using different treatments: control, crude extract of metabolites and inoculum
native Lactobacillus. Thin fillets of post of beef were taken, stored for 17 days at 5 ± 0.2
°C. Cell counts of psychrophiles, mesophiles, Pseudomonas spp., LAB were done as well
as search for pathogens such as Salmonella spp. and Listeria monocytogenes by
traditional microbiology, evaluation of pH and sensory analysis.
The extract of metabolites of Lactobacillus compared with control inoculum showed that
it was possible to extend the life span of beef packaged in modified atmosphere for about
two days, since it decreased by two log units the microbial counts of some concurrent
microrganisms as well as some potential spoilage organisms such as Pseudomonas, BAL,
mesophiles and psychrophiles, while maintaining the pH and sensory characteristics in an
acceptable range.
The safety of raw beef was evaluated the possible use of native strains of Lactobacillus
and its metabolites as a natural preservative to reduce the growth of microorganisms
responsible for spoilage in the meat industry nationwide is proposed.
Keywords: Beef, modified atmosphere packaging (MAP), antimicrobial metabolites,
Lactobacillus.
I.
INTRODUCCIÓN
Dadas las características fisicoquímicas
de la carne fresca y del proceso de
producción se puede tener una carga
microbiana inicial en la cual se pueden
encontrar microorganismos deteriorantes y
patógenos.
Dentro de la microbiota natural de la
carne
de
res
se
han
reportado
Pseudomonas
spp.,
Enterobacterias,
algunos Micrococcus, bacterias ácido
lácticas
(BAL)
como
Enterococcus,
Lactobacillus (Nychas y otros 2008). En el
grupo de las bacterias causantes de
deterioro de la carne se han reportado las
Brochothrix
thermosphacta;
Enterobacterias, Pseudomonas spp. y
algunos
géneros
de
BAL,
como
Enterococcus, Lactobacillus, Weissella,
Leuconostoc. Además se pueden encontrar
patógenos para el hombre como Listeria
monocytogenes, Salmonella spp., E.coli,
Staphylococcus aureus y bacterias sulfito
reductoras. Debido a la gran variedad de
microorganismos reportados en la carne y el
papel que juegan éstos en el deterioro del
producto, es importante tener unas buenas
prácticas de manufactura (BPM), un
excelente manejo en la cadena de frio para
disminuir y controlar la población microbiana
durante etapas de almacenamiento y
transporte (FAO/WHO, 1997; E.U, 1998).
Vol 20, No 22 (2011), Revista Alimentos Hoy -19
Por lo anterior se hace necesario
investigar en el desarrollado de nuevas
alternativas como la bioconservación que
con un empaque y refrigeración adecuados,
garantice la calidad e inocuidad de la carne
fresca.
restringida la comercialización de cultivos o
cepas productoras de bacteriocinas para
bioconservación de alimentos. Por lo
anterior que se hace necesario investigar
sobre cepas de BAL nativas con posible
potencial de bioconservación.
La biopreservación es un método de
conservación que utiliza microorganismos y
sus productos con el fin de extender la vida
útil y aumentar la inocuidad de los
alimentos. Diferentes estudios han aplicado
la biopreservación mediante el uso de BAL,
utilizando las propiedades antibacterianas
de metabolitos, como ácido láctico, acético,
peróxido de hidrógeno, di- acetaldehído,
reuterina y gran variedad de bacteriocinas
(Cleveland y otros 2001; Chen Hower 2003;
Gálvez y otros 2007; Vasquéz y otros 2009).
Las cepas que tienen la capacidad de
producir sustancias inhibitorias, reducen el
uso de preservantes químicos en la
industria de alimentos y puedan prolongar la
vida útil de los productos así como
colaboran con la reducción los casos de
ETAs (enfermedades transmitidas por
alimentos).
En consecuencia, el objetivo del estudio
fue evaluar el efecto de metabolitos solubles
en el extracto crudo de LAC 231 sobre la
microbiota presente en la carne de res
empacada en atmosfera modificada (ATM).
Los Lactobacillus pueden producir
cambios cualitativos como consecuencia de
la fermentación láctica de azúcares que
aumentan la acidez y contribuyen a la
formación del color, estabilidad del producto
desde el punto de vista microbiológico
durante los primeros días de refrigeración
favoreciendo
la
bioconservación,
posiblemente debido al antagonismo con
bacterias
deteriorantes
y
patógenos
presentes en los productos cárnicos
(Lissette y otros 1991, Hugas 1998; Castillo
1998; Galindez 1999; López 1999; Fiorentini
y otros 2001; Quintero y otros 2001;
Signorini y otros 2006; Rivas y otros 2008;
Suarez y otros 2008; Vásquez y otros 2009;
Ercolini y otros 2010).
Actualmente se utilizan diferentes cepas
de BAL provenientes de colecciones
internacionales, para probioticos o como
bioconservantes en la industria nacional. En
la industria cárnica nacional es muy
II. MATERIALES Y METODOS
Muestreo.
Para cada experimento se utilizó una
posta de res cortada en filetes de 300 g
aplicando los siguientes tratamientos:
Control (T1), inoculo de la cepa nativa de
Lactobacillus (LAC 231) 107 UFC/mL (T2),
extracto crudo de metabolitos de Lac 231
(T3); Cada tratamiento fue aplicado por
aspersión, adicionando 1 mL en cada una
de las muestras de carne. Las muestras de
carne fueron empacadas en bandejas en
atmosfera modificada (20% dióxido de
carbono- 80% oxigeno), almacenadas 5 ±
0,2 °C, las mediciones fueron realizadas
durante los días 0, 2, 4, 6, 8, 10, 13 y 17.
(Galíndez 1999; López 1999).
Estandarización del inóculo.
Lactobacillus spp. (Lac 231) utilizado en
este estudio, fue una cepa nativa aislada de
leche materna (Gonzales y otros 2008);
perteneciente al cepario de BAL del
Laboratorio de Ecología Microbiana y de
Alimentos (LEMA). El inoculo fue preparado
a partir de la cepa Lac 231 en solución
salina al 0.85% en una concentración de
107 UFC/mL.
Producción del extracto crudo de
metabolitos.
Un inoculo de Lac 231 de 10 7 UFC/mL se
cultivó en 20 mL de caldo MRS (Man,
Rogosa y Sharpe) a 30 ºC por 24 horas a
150 rpm en un agitador horizontal (Incubator
Shaker, Innova), en condiciones de
aerobiosis. Posteriormente se centrifugó a
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4800 rpm durante 15 minutos. El
sobrenadante fue esterilizado por filtración
por membrana (Milipore, poro 0,45
µm/diámetro 47 mm) y luego fue sometido a
80° C durante 10 minutos y sumergido a 4
°C durante 5 minutos (Botina, 2008).
Evaluación de la actividad antimicro
biana del ECM y de Lac 231.
La determinación de la actividad
antimicrobiana del extracto crudo (ECM) y
de cepa Lac 231, se realizó por el método
de difusión por disco o prueba directa de
antagonismo, contra Staphylococcus aureus
ATCC 2593, Escherichia coli ATCC 25922,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 y
Listeria monocytogenes ATCC 19115.
La actividad inhibidora del ECM se
cuantificó midiendo las zonas de inhibición
de los patógenos. (Ammor y otros 2006;
Suarez y otros 2008; Botina, 2008)
Recuentos microbiológicos de la
carne.
Se adicionó 25g de carne de res a 225
mL de agua peptonada al 0.1%. Se
realizaron diluciones seriadas y se sembró
en cada medio de cultivo selectivo y
diferencial. Después de dejar incubando
cada medio de cultivo a condiciones
optimas, se realizan recuentos de colonias
características; según las Normas del
Instituto Nacional de Vigilancia de
Medicamentos y Alimentos (INVIMA, 1998).
Recuentos en placa:
Para Mesófilos aerobios en medio PCA
(30 ºC) (Plate Count Agar, Sharlau-España),
Psicrófilos en PCA incubados a 8 ºC
durante 7 dias, Bacterias acido lácticas
(BAL) en agar MRS, condiciones aerobias
(30 ºC) (Man Rogosa sharpe, SharlauEspaña).
Para
la
confirmación
de
Lactobacillus spp., se realizó PCR con
primer específicos de 250 pb, fragmento
que corresponde a la región rADN 16-23S,
LbLMA1-Rev: 5´-CTC AAA ACT AAA CAA
AGT TTC-3´, R16-1: 5´-CTT GTA CAC ACC
GCC CGT CA-3´ (Dubernet y otros 2002);
Pseudomonas aeruginosa en placas con
medio Cetrimide-Difco incubadas a 30 ºC
durante 48h. Adicionalmente se realizó
búsqueda de Salmonella spp. y Listeria
monocytogenes (INVIMA, 1998). Las cepas
obtenidas fueron clasificadas y agrupadas
por
diferencias
macroscópicas,
microscópicas, se confirmaron por pruebas
bioquímicas especificas de cada especie, y
métodos rápidos como ID System/BD BBL®
Crystal™ (USA) y API (Biomerieux,
Colombia). (Boone y otros 2005).
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La carne no presentó contaminación con
patógenos como Listeria monocytogenes y
Salmonella spp (este último reglamentado
en el Decreto 1500/2007) resultados que
demuestran la inocuidad del proceso y la
efectividad del programa de limpieza y
desinfección de la línea de producción.
Debido a que L.monocytogenes es un
patógeno que en nuestro país no es de
notificación obligatoria es importante su
búsqueda en alimentos de alto consumo y
su ausencia en la matriz evaluada
demuestra la eficiencia de los métodos de
control.
Existen varios factores asociados al
deterioro de la carne de res empacada en
atmósfera modificada, como lo son la
manipulación y la pérdida de la cadena de
frío. Como resultado se altera la calidad
sensorial y fisicoquímica del producto
disminuyendo la vida útil. Por lo anterior es
indispensable la verificación de las buenas
prácticas de manufactura (BPM), para
disminuir la población alterante y cumplir
con los estándares de calidad exigidos por
la industria de alimentos.
Las
Pseudomonas
spp,
algunas
Enterobacterias y Enterococcus spp, entre
otros, han sido reportados como microbiota
alterante, responsables de causar mal olor,
sabor, decoloración y producción de
sinéresis en la carne de res (Oliete y otros
2006). En este estudio se determinó la
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microbiota presente en carne de res cruda
sin ningún tratamiento (T1) durante los 17
días de refrigeración y se identificaron
diferentes especies pertenecientes al grupo
de las BAL, como Lactobacillus spp. usando
los primers específicos para este género
(LbLMA1- R16-1) (Figura I), Enterococcus
faecalis, Enterococcus faecium; dentro del
grupo de cocos Gram positivos, M.
sedentarius, M. halobius, M. varians, M.
lylae y S. saprophyticus. Enterobacterias
como Cedecea spp., Hafnia alvei y Yersinia
spp. Bacilos Gram negativos oxidadores
como Ps. aeruginosa, Ps. putida, Ps.
lundensis, Ps. belearica, Ps. alcaligenes,
Ps. Fluorescens. Bacilos Gram positivos no
esporulados como Corynebacterium spp.,
Kurthia spp.,y levaduras (Jay y otros 2003;
Nychas y otros 2008). Por tal razón, es
importante evaluar el comportamiento de
estas bacterias en la carne para poder
predecir o evitar que el producto se
deteriore.
Figura I. Electroforesis del género Lactobacillus y determinación del peso molecular de los amplicones.
Pozo 1: Marcador de peso molecular (DNA Ladder de 50 pb. BioRad) Pozo 2: Control Positivo
Lactobacillus plantarum donada por el Instituto Ziel de Alemania. Pozo 3-7: Cepas Lactobacillus spp.
aisladas en el estudio (amplicones de 250pb). Pozo 8: Mastermix sin ADN.
En general, el tratamiento T1 (control) y
el T2 (inóculo LAC 231) presentaron un
mayor recuento de Pseudomonas spp.,
mesófilos, psicrófilos y BAL respecto al T3
(Extracto crudo de LAC 231) en el último día
de evaluación (Figura II). A pesar del
incremento en UFC/mL desde el inicio, no
se evidencia una tendencia exponencial
continua en los tres tratamientos, pero es
evidente que el T3 se mantiene por debajo
de los recuentos respecto a los demás. Al
comparar el día 0 con el 17, se observó que
mientras que T3 incrementa el recuento en
2 unidades logarítmicas, T1 y T2 aumentan
4 aproximadamente, respecto a mesófilos y
psicrófilos. Según, Ercolini y otros 2006; los
mesófilos y psicrófilos en carne de res
empacada en ATM (60%O2 - 40%CO2)
incrementan los recuentos 4 unidades
logarítmicas durante dos días (Figura II).
En cuanto a los recuentos de
Pseudomonas spp., el T3 aumento 4-5
UFC/g comparando el día 0 con el 17,
mostrando un recuento final de 10 4 UFC/g,
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mientras que el T1 y T2, 10 5 y 106 UFC/g,
respectivamente (Figura II).
Para BAL, el T3 incremento los
recuentos de BAL en 6 UFC/g, en el T1 y T2
el incremento fue de 4 unidades
logarítmicas. Según, Ercolini y otros 2006;
los recuento para Pseudomonas después
de 7 días es mayor a 10 7UFC/g (Figura II).
Figura II. Recuentos de Pseudomonas spp. BAL, Mesófilos y Psicrófilos durante los 17 días de
refrigeración de carne de res empacada en ATM entre 5 ± 0.2 °C.
Acorde con nuestro diseño experimental
el T3 fue el mejor tratamiento, ya que el
extracto crudo con metabolitos de LAC 231,
fue capaz de disminuir la carga de
microbiota
acompañante
o
posibles
alterantes; por ende el producto conservó
las propiedades sensoriales y fisicoquímicas
por más tiempo en comparación con los
demás tratamientos. El T2 presentó mayor
sinéresis y la aparición de un color verdoso
intenso dos días antes de que apareciera en
T3.
Debido a las características intrínsecas
de las muestras empleadas (humedad
relativa, pH, gramaje, Aw) no es posible
extrapolar los resultados a otros estudios ya
que las múltiples variables a tener en
cuenta son difíciles de controlar en cada
sub-muestra y por lo tanto el ensayo no es
reproducible al 100%. Sin embargo, los
resultados de este estudio permiten
proponer como alternativa para la
conservación del producto extractos crudos
con metabolitos de BAL. Lo que ha sido
reportado en múltiples estudios anteriores.
(Lissette y otros1991; Hugas 1998; Castillo
1998; Galindez, 1999; López 1999;
Fiorentini y otros 2001; Quintero y otros
2001; Signorini y otros 2006; Jones y otros
2008; Herman y otros 2008; Rivas y otros
2008; Suarez y otros 2008; Vásquez y otros
2009; Castellano y otros 2008; Vásquez y
otros2009).
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Al evaluar el perfil microbiológico de la
carne de res, Jay y otros, 2003; reportó que
el recuento microbiano está entre 1x10 7 y
1x1010 UFC/g lo anterior concuerda con lo
reportado en este estudio. También
demostró que las únicas especies que
persisten en la carne sin inocular durante un
periodo de 17 días son Pseudomonas spp.
y BAL, y que para determinar si estas cepas
ácido lácticas corresponden a las mismas
que se inocularon o son originarias de la
carne
deben
realizarse
pruebas
moleculares.
variable importante para la industria de
alimentos. El aumento de dos días en la
vida útil de la carne medida en condiciones
aceleradas implicaría una extensión mayor
en condiciones no aceleradas (2±0.2 °C).
Los
resultados
de
los
análisis
fisicoquímicos mostraron que a un pH entre
5.4 y 5.9., la carne de res fresca es
aceptable, el estándar para los análisis
sensoriales
como
color,
aroma
y
presentación
del
producto
están
determinados por los parámetros internos
de la empresa privada que suministró las
muestras (Tabla I).
Las muestras del estudio fueron
manejadas en condiciones aceleradas
debido a que se almacenaron a una
temperatura de refrigeración que simula las
condiciones de mantenimiento de producto
en el hogar (5± 0.2 °C), lo cual demuestra
que la temperatura es un factor importante
en el desarrollo acelerado de los
microorganismos deteriorantes y una
Día
T1 y T2 mostraron aceptabilidad
fisicoquímica hasta el día 7, mientras que
T3 presentó aceptabilidad hasta el día 9. En
los días fuera de especificación las
muestras presentaron valores de pH de 5.15.2 para el T1/ T2 y 4.93-4.94 para el T3
(Tabla I).
T1
pH
T2
Calidad
pH
T3
Calidad
pH
Calidad
0
A
A
A
A
A
A
2
A
A
A
A
A
A
4
A
A
A
A
A
A
6
A
NA
A
NA
A
A
8
NA
NA
NA
NA
A
NA
10
NA
NA
NA
NA
NA
NA
13
NA
NA
NA
NA
NA
NA
Tabla 1: Análisis organolépticos de la carne de res empacada en ATM con cada tratamiento evaluado
durante 13 días de refrigeración a 5± 0.2 °C
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Teniendo en cuenta los resultados
sensoriales y la apariencia del producto,
T1 y T2 fueron aceptables hasta el día 5,
días después la carne presentó áreas
con tonalidades marrón, verde oscuro y
un aroma ácido. El T3 fue aceptable
hasta el día 7 (Tabla I).
El tratamiento (T3) con extracto de los
metabolitos producidos por LAC 231,
mantiene un estándar de calidad
aceptable, según los rangos de la
empresa (pH, color, apariencia y olor),
dos días más comparado con los demás
tratamientos.
Es preciso, continuar con el estudio
de alternativas que permitan prolongar el
periodo de vida útil del producto,
utilizando mecanismos de conservación
que disminuyan la microbiota alterante,
ya que esto trae beneficios económicos
para la industria de alimentos y aumenta
el periodo vida útil de los productos
cárnicos.
IV. CONCLUSIONES
Las condiciones aceleradas del
ensayo demostraron que el extracto
crudo de metabolitos de LAC 231 (T3),
incrementó dos días el periodo de vida
útil respecto al T1 y T2, en cuanto a
carga microbiana, análisis químicos y
organolépticos. Es probable que si el
ensayo se trabajara a condiciones
estrictamente controlada de refrigeración
estable se podría pensar que el uso de
BAL con capacidad antagónica podría
retrasar los cambios alterativos durante
la refrigeración del producto, lo que
permitiría incrementar la vida útil de la
carne fresca poco tiempo.
Bajo las condiciones de este estudio, se
determinó que el empaque en atmósfera
modificada, no prolongó el periodo de
vida útil de la carne de res y debe
combinarse
con
una
adecuada
refrigeración, buena manipulación para
controlar
la
microbiota
original
deteriorante presente en el producto.
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Comestibles y Derivados Cárnicos
Destinados para el Consumo Humano y
los requisitos sanitarios y deinocuidad
que se deben cumplir en su producción
primaria, beneficio, desposte, desprese,
procesamiento,
almacenamiento,
transporte, comercialización, expendio,
importación o exportación. 14 pp
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AGRADECIMIENTOS
Agradecemos al Laboratorio de
Ecología Microbiana y de AlimentosLEMA, de la Universidad de los Andes,
Bogotá-Colombia,
por el apoyo y
financiación para la realización de
esta investigación. A la planta de
alimentos que nos proporciono las
muestras y demás colaboradores.
Vol 20, No 22 (2011), Revista Alimentos Hoy - 27