REB 22(3): 158-160 158 RESPUESTAS AL PROBLEMA BIOQUÍMICO Los estudios de inhibición por producto son uno de los enfoques más comúnmente utilizados en la determinación del mecanismo cinético de una enzima, debido a que a partir de estos se puede deducir el orden de unión de los substratos y de liberación de los productos en ambos sentidos de la reacción. Para estos experimentos las velocidades iniciales se determinan de manera usual pero se utilizan diferentes concentraciones fijas de inhibidor (incluyendo cero) en la mezcla de reacción y concentraciones saturantes o no saturantes del substrato fijo variable. Cabe enfatizar que la concentración del substrato fijo debe cuidarse, pues puede modificar el patrón de inhibición por producto. En el caso de la enzima málica presentamos los resultados de los experimentos a concentraciones no saturantes del substrato fijo (1). El tipo de inhibición por producto se puede determinar fácilmente al analizar el efecto del inhibidor sobre la pendiente y el intercepto sobre el eje vertical (ordenada al origen) de gráficas de dobles recíprocos. Un producto (P) actuará como un inhibidor competitivo con respecto a un substrato variable (S) solamente si P y S son mutuamente excluyentes, lo cual implica que P y S compiten por la misma forma de la enzima o si P se une antes que S en una secuencia ordenada para dar lugar a una forma de la enzima que no une S (2). En este caso solamente la pendiente del gráfico de dobles recíprocos se ve afectada, pero no la ordenada al origen al variar la concentración del producto (Tabla IIA). Si en el gráfico de dobles recíprocos los interceptos sobre el eje vertical son los que se modifican y no la pendiente al aumentar la concentración de producto, se obtendrá una serie de líneas paralelas que corresponden al patrón gráfico de un inhibidor de tipo incompetitivo (Tabla IIB). P será un inhibidor incompetitivo con respecto a S solamente si S debe unirse antes que P en la secuencia de reacción (2). En este caso P y S no son mutuamente excluyentes porque se unen a diferentes formas de la enzima y no están interconectados por pasos reversibles porque existen entre ellos pasos que experimentalmente no se llevan a cabo (ver explicación más adelante). P actuará como un inhibidor mixto o no competitivo con respecto a S si P y S son mutuamente excluyentes y P puede unirse antes que S (2). En este caso tanto las pendientes como los interceptos se incrementan al aumentar la concentración de producto y las líneas convergen en un punto a la izquierda del eje vertical, ya sea por arriba, en o debajo del eje horizontal, incluso pueden no cruzarse en el mismo punto (Tabla IIC). Es conveniente aclarar que se puede clasificar a un compuesto indistintamente como inhibidor no competitivo o como inhibidor mixto. Algunos autores consideran un inhibidor no competitivo a aquél en el que las líneas de dobles recíprocos se cruzan sobre el eje de las equis y al resto de los patrones de cruce (por encima o por debajo) los definen como mixtos (2). Sin embargo, Cleland (3) considera que no existe una justificación teórica sólida que permita distinguir entre ambos tipos de inhibidores, por lo cual define como inhibidor no competitivo a cualquier compuesto que modifique tanto interceptos (1/Vmáx) como pendientes (Km/ Vmáx) en el gráfico de dobles recíprocos al aumentar su concentración. Una vez revisados estos antecedentes, podemos definir el mecanismo cinético de la enzima málica analizando los patrones de inhibición por producto que se muestran en la Tabla I. En el caso de la enzima málica el producto NADH es un inhibidor competitivo con respecto al sustrato variable NAD+, lo cual indica que estas dos moléculas se unen a la misma forma de la enzima. Con esta evidencia podemos proponer que ambas moléculas sólo se pueden unir a la enzima libre (E), es decir, en la reacción forward de la enzima málica el NAD+ es el primer sustrato que se une y el NADH es el último de los tres productos en liberarse. Con esta información se puede concluir que el malato se une en segundo lugar. Para apoyar esta propuesta en la secuencia de unión de los substratos se analiza el tipo de inhibición del NADH con respecto al malato. Si el malato es el segundo substrato en unirse, eso implicaría que el NADH y el malato se unen a diferentes formas de la enzima (E y ENAD+ respectivamente), y en consecuencia, el NADH inhibiría la reacción de manera no-competitiva con respecto al malato. Además el malato y el NADH pueden estar conectados reversiblemente debido a que REB 22(3): 158-160 159 TABLA II PATRONES GRÁFICOS DE DOBLES RECÍPROCOS Y DEFINICIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS Vmáxap (Vmáx/Km)ap PATRÓN GRÁFICO ↑ TIPO DE INHIBICIÓN A. Competitivo Vmáx [P] (Vmáx/Km) (1+ I/Kic) ↑ [P] B. Incompetitivo Vmáx Vmáx/Km Vmáx Vmáx/Km (1+ I/Kiu) (1+ I/Kic) [P] ↑ C. No competitivo o mixto ↑ ↑ (1+ I/Kiu) [P] Vmáxap (Velocidad máxima aparente) y (Vmáx/Km)ap (Constante de especificidad) para cada tipo de inhibición. P = concentración de inhibidor; Kic = constante de inhibición competitiva; Kiu = constante de inhibición incompetitiva. existe una secuencia ordenada estricta desde la liberación del NADH hasta la unión del malato al complejo enzima-NAD +. La interconexión entre un substrato y un producto por pasos reversibles conduce a una competencia, indirecta, por la enzima. Por lo tanto esperaríamos que el NADH fuera un inhibidor no competitivo (o mixto) con respecto al malato como se muestra en la Tabla I. Con los datos analizados podemos proponer un esquema cinético parcial de la reacción de la enzima málica (Esquema I). Varela Gómez M 160 NAD+ ↓ malato ↓ ENAD-malato ↔ ENADH-piruvato-HCO–3 ENAD+ E ? ↑ ? ↑ NADH ↑ ENADH E Esquema I. Diagrama de Cleland obtenido a partir de los patrones de inhibición por producto del NADH con respecto a los dos sustratos. Para determinar el orden de liberación de los otros dos productos (HCO3– y piruvato) es necesario analizar sus patrones de inhibición con respecto a ambos substratos. De acuerdo con los datos que se presentan en la tabla I, el HCO3– es un inhibidor no competitivo con respecto a ambos substratos. Este patrón de inhibición indica que este producto se une a una forma diferente de la enzima a la que se unen los substratos, pero las cuales están interconectados por pasos reversibles. Por otro lado, el piruvato es un inhibidor de tipo incompetitivo con respecto a ambos sustratos. Esto sugiere que el piruvato se une a una forma de la NAD+ ↓ E malato ↓ ENAD+ enzima diferente a la que se unen los sustratos, pero a diferencia de lo que se determinó para el HCO3, no existen pasos reversibles que interconecten directamente a las formas de la enzima que unen los sustratos y al piruvato. La explicación de que no existan pasos reversibles entre la liberación del piruvato y la unión del NAD+ y el malato es que entre estos eventos se produce la liberación de otro producto. Finalmente, con este análisis podemos proponer que el HCO3– es el primer producto que se libera y el piruvato el segundo. Por lo tanto el esquema de Cleland final para la enzima málica es el siguiente: HCO–3 ↑ piruvato ↑ ENAD-malato ↔ ENADH-piruvato-HCO–3 ENADH-piruvato NADH ↑ ENADH E REFERENCIAS 1. Hsu RY, Lardy HA, Cleland WW (1967) JBC 242, 5315. 2. Segel, H I. (1975). Enzyme Kinetics. John Wiley and Sons, New York, USA pp 342-344 3. Cleland, W W (1970) Steady State Kinetics. En: The Enzymes volumen 2. Editor: Boyer PD. Academic Press., New York pp 1-65 Comercializadora e Importadora de Productos Químicos, S.A. de C.V. Proveedores de Insumos Nacionales e Importados para la Industria Farmacéutica, Química, Cosmética, Alimenticia, Hospitalaria e Investigación * Biología Molecular * Microbiología * Bioquímica * Inmuno química * Fibrosis * Farmacología * Virología * Etc.... * Inmunología * Validación * Equipos para Laboratorio Somos tu mejor opción, cotizaciones en menos de 24 horas, Excelente tiempo de entrega, contáctanos. Calle 3 Privada Alicia Mz. 8 Lote 3 Col. Cuchilla Pantitlán, México, D. F. Tel.: 5115-4708 Tel./Fax: 5758-9726 E-Mail: cipquim@hotmail.com