Instituto Nacional de Salud PROCESO - REDES EN SALUD PÚBLICA Elaborado: Jenny Lucero Zambrano Fecha: Septiembre 2010 PREPARACION DE LOS SUEROS CONTROL PARA LA PRUEBA DE IDONEIDAD DE SEROLOGÍA DE SIFILIS INT-R01.001.5030-030 Revisado: Kelly Alejandra Orozco Vargas Profesional Grupo Microbiología Fecha: Octubre 2010 Página 1 de 6 Versión:01 Fecha de la próxima versión: 2014/08 Aprobado: María Elena Realpe Coordinadora Grupo Microbiología Fecha: Octubre 2010 1. OBJETIVO El presente instructivo describe el procedimiento para preparación y empaque de los sueros control para la prueba de idoneidad en serología de sífilis (PISS). 2. ALCANCE Este instructivo fue diseñado, para el personal de salud responsable del proceso de elaboración de la PISS. 3. RESPONSABILIDAD Es responsabilidad del profesional encargado de la PISS aplicar el instructivo para la elaboración y empaque de los sueros control para la PISS y del coordinador del área verificar su cumplimiento. 4. DEFINICIONES Prueba de idoneidad: es un programa, realizado por una institución externa, que permite evaluar en forma imparcial el desempeño, en una de las áreas del laboratorio. Evaluación externa directo del desempeño (EEDD): “Sistema de comparación retrospectivo y objetivo de los resultados de diferentes laboratorios por medios de encuestas organizadas por un ente externo independiente”. OMS/OPS 2002. Laboratorios participantes: Laboratorios de Salud Pública, los laboratorios clínicos de los hospitales de III nivel de la RNL y laboratorios clínicos de hospitales de II nivel de la red pública que han participado en la prueba en los 3 últimos años y que tienen área de microbiología y buena cobertura de atención de pacientes. 5. CONDICIONES GENERALES • o • o o o o Tratamiento del plasma Recolectar suficientes bolsas de plasma reactiva y no reactiva para sífilis y negativa para VIH y hepatitis de los bancos de sangre. Realizar las pruebas de VDRL y RPR a los plasmas reactivos según la metodología descrita en el manual de procedimientos “Diagnóstico serológico de la sífilis” del Grupo de Microbiología (REGR01.001.5030-119), y (REG-R01.001.5030-141). Seleccionar los plasmas con reactividad similar (por ejemplo 4 y 8 dls). Dejar preferiblemente los plasmas de reactividad alta y descartar los de reactividad baja Mezclar los plasmas seleccionados en un matraz estéril, utilizando un agitador magnético durante 4 horas. Dispensar 50 ml de las mezclas de plasmas en tubos de centrifuga estériles. Incubar durante 30 minutos al baño de María a 37ºC Instituto Nacional de Salud PROCESO - REDES EN SALUD PÚBLICA Elaborado: Jenny Lucero Zambrano Fecha: Septiembre 2010 o o o o o o o o o o PREPARACION DE LOS SUEROS CONTROL PARA LA PRUEBA DE IDONEIDAD DE SEROLOGÍA DE SIFILIS INT-R01.001.5030-030 Revisado: Kelly Alejandra Orozco Vargas Profesional Grupo Microbiología Fecha: Octubre 2010 Página 2 de 6 Versión:01 Fecha de la próxima versión: 2014/08 Aprobado: María Elena Realpe Coordinadora Grupo Microbiología Fecha: Octubre 2010 Adicionar a cada tubo con plasma 500µl de solución de trombina con Cloruro de Calcio e incubar durante 10 minutos al baño de María a 37ºC. Dejar a temperatura ambiente durante una hora (esto ayuda a la coagulación del plasma) Congelar los plasmas a –20ºC durante 24 a 48 horas. Descongelarlos a temperatura ambiente y luego pasarlos por un tamiz para retirar el coagulo. Colocarlos en un matraz y adicionar 10g de kaolin por cada 100 ml de la muestra. Mezclar en un agitador magnético durante 4 horas. Dejar durante la noche en cuarto frío (2 a 8 ºC) en agitación a baja revolución (27r.p.m.) Dispensar 50 ml de la mezcla en tubos Falcon, pesarlos para llevar a centrifugar a 4.000 r.p.m. por 45minutos. Decantar Guardar el sobrenadante en botella de vidrio con tapa estéril, claramente marcado y refrigerado. Definición del título de reactividad o Realizar las pruebas cualitativas y cuantitativas de VDRL y RPR según la metodología descrita en el manual de procedimientos “Diagnostico serológico de la sífilis” NML del Grupo de Microbiología. • Registrar los resultados en hoja de registro (REG-R01.001.5030-119), y (REG-R01.001.5030-141). o Si los títulos son muy altos y se desea preparar una reactividad menor se mezcla con solución salina estéril hasta alcanzar la reactividad deseada. Esterilización o o o o o o o o Proceso de prefiltrado Limpiar con alcohol las piezas del porta filtro y armarlo con el pre-filtro AP 25EM y la membrana de 0.45 µm. Apretar bien las abrazaderas y los tornillos del aparato con la llave suministrada para tal fin. Introducir la mangera larga que sale de la parte superior del porta filtro en el canal de la bomba de vacío, asegurarla y el extremo libre queda en la botella del suero que se va a filtrar. La manguera corta que sale de la parte inferior del porta filtro va a la botella estéril vacía que recibirá el plasma filtrado. Prender la bomba de vacío y graduar la velocidad en 1 para evitar que la excesiva presión rompa las membranas, evitar la entrada de aire a la manguera cuando la bomba este funcionando. Dejar la válvula ubicada en la parte superior del portafiltros abierta (posición vertical) hasta que empiece a gotear, esto indica que el suero está pasando adecuadamente, inmediatamente se debe cerrar (bajar). Cuando se ha terminado el proceso tapar la botella del suero filtrado y guardar en refrigeración. apagar la bomba de vacío, liberar la manguera, desarmar el portafiltros e introducir las partes en un recipiente amplio con desinfectante dejar actuar por 20 minutos, enjuagar con abundante agua y secar con gasa y alcohol, las mangueras se secan con aire. Proceso de filtrado Instituto Nacional de Salud PROCESO - REDES EN SALUD PÚBLICA Elaborado: Jenny Lucero Zambrano Fecha: Septiembre 2010 o o o o o o PREPARACION DE LOS SUEROS CONTROL PARA LA PRUEBA DE IDONEIDAD DE SEROLOGÍA DE SIFILIS INT-R01.001.5030-030 Revisado: Kelly Alejandra Orozco Vargas Profesional Grupo Microbiología Fecha: Octubre 2010 Página 3 de 6 Versión:01 Fecha de la próxima versión: 2014/08 Aprobado: María Elena Realpe Coordinadora Grupo Microbiología Fecha: Octubre 2010 Limpiar con alcohol las piezas del portafiltros y armarlo con el pre-filtro AP 25EM, la membrana de 0.45 µm y membrana de 0.22 µm. Llevar el equipo a esterilizar, de aquí en adelante todo el trabajo se realiza en cabina y con elementos estériles. Repetir los pasos 2 a 7 del proceso de prefiltrado. Adicionar por cada 100 ml del suero filtrado, 1 ml de una solución antibiótica penicilinaestreptomicina. Tapar bien, sellar con papel parafilm y almacenar los sueros en refrigeración Nota: el mismo procedimiento se realiza con los plasmas no reactivos, para la elaboración de los sueros controles negativos. EMPAQUE o o o o o Preparación de los viales con los sueros controles Cada panel de sueros controles de la PISS consta de 5 viales que contienen 1 ml de suero control cada uno. Dos pareados y uno individual, de reactividad conocida. Marcar los viales con el código correspondiente representado por el número del suero (1 al 5), el número de la prueba y el año. Envasar, en condiciones estériles, 1 ml. de cada suero control en el vial respectivo, utilizando una jeringa dispensadora para cada lote de suero control. Almacenar 1 vial de cada lote de suero en las cajas de envío. Cada caja de envío debe contener 1 vial de cada suero control. Control de calidad del lote en el Grupo de Microbiología o o o • o o • o o Seleccionar un vial de cada lote del suero control Sembrar en agar sangre e incubar por 48 horas Realizar las pruebas de VDRL, RPR y TP-HA Registrar los resultados en la hoja de registro (REG-R01.001.5030-119),y (REG-R01.001.5030-141). Comparar el resultado con los de las pruebas realizadas antes del almacenamiento, es posible que se haya bajado en un titulo la reactividad de las pruebas no treponémicas. Si los resultados son concordantes, los sueros control están listos para el envío, si el cultivo es positivo se debe repetir el proceso de filtrado hasta que el cultivo sea negativo, pero si la reactividad no es concordante se debe descartar el lote. Registrar los resultados en la hoja (REG-R01.001.5030-119), y (REG-R01.001.5030-141). Almacenar refrigerado de 2 a 8 ºC un vial de cada lote de sueros control para pruebas posteriores de verificación y otro a temperatura ambiente para vericar la estabilidad física del suero y de la reactividad por dos semanas. Registrar el resultado en el formato de control de estabilidad sueros REG-R01.001.5030-113 Instituto Nacional de Salud PROCESO - REDES EN SALUD PÚBLICA Elaborado: Jenny Lucero Zambrano Fecha: Septiembre 2010 PREPARACION DE LOS SUEROS CONTROL PARA LA PRUEBA DE IDONEIDAD DE SEROLOGÍA DE SIFILIS INT-R01.001.5030-030 Revisado: Kelly Alejandra Orozco Vargas Profesional Grupo Microbiología Fecha: Octubre 2010 Página 4 de 6 Versión:01 Fecha de la próxima versión: 2014/08 Aprobado: María Elena Realpe Coordinadora Grupo Microbiología Fecha: Octubre 2010 6. MATERIALES Y REACTIVOS Materiales y reactivos • Viales estériles de 2 ml • Tubos de centrifuga de 50 ml • Cajas de empaque • Pipetas de 1ml y 5 ml estériles • Plasmas reactivos y no reactivos • Solución salina al 0,85% • Estuches diagnósticos VDRL y RPR • Trombina (Sigma T3068) • Solución de cloruro de calcio 1M • Solución de antibióticos de 5000 UI de penicilina y 5 mg estreptomicina por ml Kaolin (Sigma K7375) • Solución de trombina en cloruro de calcio 1M a una concentración de 100 unidades/ml (guardar a – 20ºC en viales de 5ml) 7. EQUIPOS Equipos • • • • • • • • • • • Microscopio Agitador de Mazzinii Congelador a –20ºC Baño María Matraces Agitador magnético Centrifuga refrigerada de 4.000 r.p.m. Filtro con presión de aire y con membranas de 0,45 µm y 0,22 µm Cámara de flujo laminar Dispensador automático Micropipetas 8. CONTENIDO PROCEDIMIENTO Definición del título de reactividad Instituto Nacional de Salud PROCESO - REDES EN SALUD PÚBLICA Elaborado: Jenny Lucero Zambrano Fecha: Septiembre 2010 • • • • • • PREPARACION DE LOS SUEROS CONTROL PARA LA PRUEBA DE IDONEIDAD DE SEROLOGÍA DE SIFILIS INT-R01.001.5030-030 Revisado: Kelly Alejandra Orozco Vargas Profesional Grupo Microbiología Fecha: Octubre 2010 Página 5 de 6 Versión:01 Fecha de la próxima versión: 2014/08 Aprobado: María Elena Realpe Coordinadora Grupo Microbiología Fecha: Octubre 2010 Realizar las pruebas cualitativas y cuantitativas de VDRL y RPR según la metodología descrita en el manual de procedimientos “Diagnóstico serológico de la sífilis” del Grupo de Microbiología. Registrar los resultados en el formato correspondiente (REG-R01.001.5030-119), y (REGR01.001.5030-141). Sí los títulos son muy altos y se desea preparar una reactividad menor se mezcla con solución salina estéril hasta alcanzar la reactividad deseada Filtrar los plasmas tratados por membrana 45 µm y luego por membrana de 22µm. Adicionar a 100 ml del suero, 1ml de una solución de penicilina estreptomicina en cámara de flujo laminar. Almacenar los sueros refrigerados a 4ºC. Nota: el mismo procedimiento se realiza con los plasmas no reactivos, para la elaboración de los sueros control negativos Preparación de los viales con los sueros control Cada panel de sueros control de la PISS consta de 5 viales que contienen 1 ml de suero control cada uno. Dos pareados y uno individual, de reactividad conocida • • • Marcar los viales con el código correspondiente representado por el número del suero (1 al 5), el número de la prueba y el año Envasar, en condiciones estériles, 1 ml de cada suero control en el vial respectivo, utilizando un dispensador automático para cada lote de suero control. Almacenar 1 vial de cada lote de suero en las cajas de envío. Cada caja de envío debe contener 1 vial de cada suero control. Control de calidad del lote en el Grupo de Microbiología • • • • • • Seleccionar un vial de cada lote del suero control Realizar las pruebas de VDRL y RPR Registrar los resultados en los anexos 1 y 2 Comparar el resultado con los de las pruebas realizadas antes del almacenamiento Sí los resultados son concordantes, los sueros control están listos para el envío Almacenarlos refrigerados a 4ºC, un vial de cada lote de sueros control para pruebas posteriores de verificación 9. DOCUMENTOS DE REFERENCIA Instituto Nacional de Salud PROCESO - REDES EN SALUD PÚBLICA INT-R01.001.5030-030 Elaborado: Jenny Lucero Zambrano Fecha: Septiembre 2010 • • • PREPARACION DE LOS SUEROS CONTROL PARA LA PRUEBA DE IDONEIDAD DE SEROLOGÍA DE SIFILIS Revisado: Kelly Alejandra Orozco Vargas Profesional Grupo Microbiología Fecha: Octubre 2010 Página 6 de 6 Versión:01 Fecha de la próxima versión: 2014/08 Aprobado: María Elena Realpe Coordinadora Grupo Microbiología Fecha: Octubre 2010 Desfibrination of blood plasma for use in the VDRL test for syphilis. Castro Arnold, Kikkert Sussan, Fears Martha, Pope Victoria. Division of AIDS, STD and TB Laboratory Research, Centers for Disease Control and Prevetnion, Atlanta GA. Manual of test for syphilis, 9th edition. Larsen SA, Pope V, Johnson RE and Kennedy JR. American Public Health Association, Washington, D.C. 1998 Manual de procedimientos “Diagnóstico serológico de la sífilis” del Grupo de Microbiología 10. CONTROL DE REGISTROS CONTROL DE REGISTROS IDENTIFICACION ARCHIVO CENTRAL ARCHIVO DE GESTION ORDENACIO N DOCUMENT AL RESPONSAB LE formato de resultado de sifilis vdrlmha-tp Se ordena cronológicamen te por programa El profesional responsable del programa Archivo Satélite del grupo de Microbiol ogía 3 años REGR01.001.5 030-119 formato de resultado de sifilis rpr-mhatp Se ordena cronológicamen te por programa El profesional responsable del programa Archivo Satélite del grupo de Microbiol ogía 3 años REGR01.001.5 030-113 EED- Control de producción sueros PISS Se ordena cronológicamen te por programa El profesional responsable del programa Archivo Satélite del 3 años COD NOMBRE REGR01.001.5 030-141 LUGAR TIEMPO DE RETENCI ON METODO UTILIZAD O Se mantiene en el archivo de gestión de Microbiolo gía hasta que pase al archivo central Se mantiene en el archivo de gestión de Microbiolo gía hasta que pase al archivo central Se mantiene en el ARCHIV O HISTÓR ICO RESPON SABLE TIEMP O METODO UTILIZAD O Secretaria del Grupo de Microbiolo gía 5 años Eliminación Secretaria del Grupo de Microbiolo gía 5 años Eliminación Secretaria del Grupo de 5 años Eliminación Instituto Nacional de Salud PROCESO - REDES EN SALUD PÚBLICA Elaborado: Jenny Lucero Zambrano Fecha: Septiembre 2010 PREPARACION DE LOS SUEROS CONTROL PARA LA PRUEBA DE IDONEIDAD DE SEROLOGÍA DE SIFILIS INT-R01.001.5030-030 Revisado: Kelly Alejandra Orozco Vargas Profesional Grupo Microbiología Fecha: Octubre 2010 grupo de Microbiol ogía Página 7 de 6 Versión:01 Fecha de la próxima versión: 2014/08 Aprobado: María Elena Realpe Coordinadora Grupo Microbiología Fecha: Octubre 2010 archivo de gestión de Microbiolo gía hasta que pase al archivo central Microbiolo gía 11. REGISTRO DE REVISIONES Y APROBACIONES VERSIO N 00 01 FECHA APROBACION AA MM D D 201 10 29 0 201 08 19 1 12. ANEXOS N.A DESCRIPCIÓN Creacio de Documento Modificacion de Documento