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Micro Resonancia Magnética e Imágenes Moleculares para la biotecnología y la farmacéutica. Caso de la Isquemia Cerebral. Agradezco al Prof. Dr. Carlos O Della Védova y a la Prof. Dra. Cristina Caracoche ¡Gracias a todos Ustedes! Dr. Carlos Cabal Mirabal Investigador Titular. Académico de Mérito Unidad de RM Cneuro carlos.cabal@cneuro.edu.cu carlos.cabal@infomed.sld.cu Comparación entre los Métodos de Imágenes ¿? [Rudin 2003] Literatura científica sobre ensayos y RM 800 750 700 R2 = 0.9486 650 550 500 450 400 350 300 Biomundi julio 2009 250 200 150 100 50 2007 2008 2005 2006 2002 2003 2004 2000 2001 1997 1998 1999 Años Años 1994 1995 1996 1992 1993 1989 1990 1991 0 1988 Cantidad de publicaciones 600 2009 2008 2007 2006 2005 2004 2003 2002 2001 2000 1999 1998 1997 1996 1995 1994 1993 1992 1991 1990 1989 1988 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Cantidad de publicaciones Modelo de cáncer en anim al Modelo de stroke en anim al 120 130 Definiciones de μRM e ImRM • Las μRM son imágenes de estructuras biológicas vivas con resoluciones espaciales del orden de decenas de micras, elevado contraste y tiempos de imágenes que permiten estudiar los detalles anatómicos y los procesos fisiológicos a nivel de células, tejidos y órganos, sin alterar estos. • Las ImRM in vivo y no invasivas han sido definidas como la representación visual, la caracterización (estructural y funcional) y la cuantificación de procesos biológicos a niveles celulares y moleculares. • Las ImRM y μRM detectan, cuantifican y visualizan fenómenos dinámicos moleculares y celulares, en tejidos y órganos, con resoluciones espaciales de hasta decenas de micras y temporales de milisegundos. μRM lumen perimeter (mm) wall thickness (mm) 0.48 3.6 3.0 mean lumen perimeter mean wall thick 0.43 2.4 0.38 1.8 0.33 1.2 0.28 0.6 0.23 0.0 0.18 15-18 months 19-22 months μRM La isquemia. Precede de una severa disminución de flujo: 60 mL/min/100g humano adulto 90-105 mL/min/100g roedor adulto 20-25 ml/min/100 g EEG lento (Preocuparse) 18-20 ml/min/100 g Aparecen síntomas neurológicos 16-18 ml/min/100mg 10ml/min/100mg Rápida muerte celular Desaparecen respuestas Eléctricas “Umbral de Fallo eléctrico” Zona de penumbra Núcleo o “Core” Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones Biológicas Instituto de Farmacia y Alimentos, UH La Zona de penumbra es RESCATABLE y si logramos restablecer las condiciones normales de funcionamiento el área de infarto puede reducirse. Ventana terapéutica Ventana reperfusión 3-12h + Ventana neuroprotección • Buscar métodos más acordes con la ventana • Ampliar la ventana para el diagnóstico y la terapéutica adecuadas. T2 ADC DWI MTT CBF Curso de la Oclusión de la ACM en una rata • Volumen y evolución temporal del infarto. • Flujo sanguíneo local en el área infartada. • Estudios sobre reperfusión. • Farmacología del ictus. • Influencia de la duración de la hipoxia en la talla y localización del infarto. • Respuestas inflamatorias después del infarto. • Necrosis y apoptosis celular. • Actividad fagocítica y microglial en la zona de teijdo infartado. • Homeostasia de la barrera hematoencefálica. Métodos, condiciones fisio patológicas con μRM en modelos animales (Dijkhuizen 2003) Método de MRI • Densidad protónica Fisiopatología Edema vasogénico • T1W • T2W • Contraste T1W Daño de la barrera hematoencefálica • MT Degradación del tejido Edema vasogénico • DW Edema Citotóxico Lisis Tisular • Perfusión • BOLD • MRA Déficit de perfusión Hemorragia Perturbaciones hemodinámicas Perturbaciones del flujo Muestra N Imán M0 S Magnetización M N tP SCL Excitación RF B1 S M Cambia de orientación N SCL M XY (T2 ) = M0 ≈ 37% M 0 e S t =T 2 N Relajación Magnética T1, T2 Z´ SCL Y´ X´ n =1 S N SCL Z´ Señal de RM Y´ Fem Inducida X´ S 5 0 0 5 00 n=2 t ⎡ 1⎤ M Z (T1 ) = M 0 ⎢1 − ⎥ ≈ 63 % M 0 ⎣ e⎦ Agua de los diferentes tejidos. ρ % H2O T1ρ 100 Piel Hígado Pulmón Corazón DWI T2 Contraste ADC T2* χ DTI Hueso 20 Riñones 40 δ Sustancia blanca 60 Sustancia gris 80 T1 Tipo de tejido Agua enlazada en superficie τc = 10-10 1 ∝ f (τ C ) T1, 2 Agua interna τc = 10-5 Agua libre τc = 10-12 Tiempo de correlación del agua (s) Proteina Órgano Cerebro Tejido Tiempo de relajación Spin-spin T2(ms) A 1,5 T A 0,2 T Sustancia Gris 921 495 101 Sustancia Blanca 787 390 92 Líquido encéfalo raquídeo 3000 1200 1500 Edema 1090 627 113 Meningioma 979 549 103 Glioma 957 832 111 1109 864 141 493 229 43 1077 580 84 Astrocitoma Hígado Tiempo de relajación Spin-retículo T1(ms) Tejido normal Hepatomas Bazo Tejido normal 782 400 62 Páncreas Tejido normal 513 283 62 Riñones Tejido normal 652 395 58 Pulmón Tejido normal 830 Músculo Tejido normal 868 Grasa Tejido normal 79 372 47 IMÁGENES Sopesadas en T1 Imagen sopesada en T1 (TR corto, TE corto) IMÁGENES Sopesadas en T2 Imagen potenciada en T2 (TR largo, TE largo) Contraste SE ρ T1 (TE corto y TR largo) T2 (TE corto y TR corto) (TE largo y TR largo) RF Eco Eco o TE TR Contraste depende del tejido, su estado fisiológico, molecular. Se hace mas o menos evidente dependiendo de los parámetros del experimento Imágenes T1 y T2 de rata Axial plano de 49 mm y 1 mm de espesor T1 Sagital 59 mm T2 La difusión restringida Difusión isotrópica Difusión anisotrópica Tamaño, Forma Orientación Difusión en las células 6 Dt Alta difusión 6 Dt Baja difusión Imágenes DWI, ADC en ratas Utilización del tiempo TI = 1minuto. 20 imágenes en 20 minutos implica varias opciones de empleo de esos 20 minutos → óptima planificación del experimento para aprovechar el tiempo Ejemplo 1. Dos valores de b, b= 0 (imagen base) y con b=1000 s/mm2 seleccionamos seis orientaciones de los gradientes y para cada una de las orientaciones hacemos tres acumulaciones con el fin de incrementar la relación señal/ruido tardaríamos 19 minutos en realizar el estudio. Ejemplo 2. Fijamos tres valores de la b; b=500; b= 1000 y 1500 s/mm2 y obtenemos 7 planos para esos valores. TI = 21 minutos. Ejemplo 3. Un corte para 20 orientaciones con un valor fijo de b=1000s/mm2 Imágenes moleculares y celulares . Mecanismos de contraste I. Intrínsecos. II. Extrínsecos. 1s2 2 2s2 2p6 8 3s2 3p6 3d10 4s2 4p6 4d10 4f14 32 5s2 5p6 5d10 5f14 32 6s2 6p6 6d10 6f14 32 18 1s2 2s22p6 3s23p6 4s2 3d10 M = χ ·Bo Susceptibilidad Magnética χ ⟨0 ⇔ Diamagnéti co χ ⟩0 ⇔ Paramagnét ico Metales de Transición: Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Tierras Raras: Ce, Pr, Pr Nd, Pm, Sm, Eu, Eu Gd, Tb, Tb Dy, , Ho, Er, El magnetismo molecular depende de la intensidad del campo de ligados y de su simetría alrededor del ion central Simetría e Intensidad del Campo de ligandos Simetría tetraédrica d z 2 ; d x2 − y2 Δ d xy ; d xz ; d yz Simetría octaédrica d z 2 ; d x2 − y2 δ <Δ Alto spin d xy ; d xz ; d yz δ >Δ Bajo spin Δ S=0 δ < ΔBajo spin S=2 Energía de apareamiento δ > Δ Alto spin Δ = EL ( intensidad del campo de Ligando) I-<Br-<Cl-<F-<H2O<C2O42-<piridina~NH3< Etilendiamina<NO2-<CN- Desoxi Hb Paramagnético Oxi Hb Diamagnético Resonancia Magnética funcional. Imagen Base Imagen con estímulo A. Sensorial A. Motora A. Cognitiva METABOLISMO AUMENTADO VASODILATACION Incremento Flujo sanguíneo Incremento Consumo de O2 Imagen funcional Zonas activadas Agentes contrastantes exógenos ácido 1,4,7,10 tetraazaciclododecane 1,4,7,0 acido tri acético S=7/2 ácido dietilenotriaminopentaacético La dificultad fundamental: acumular suficiente cantidad en el área de interés mantener el mínimo nivel de esta en otros órganos o tejidos. Mecanismo de acción Gd(DTPA) • No pasa a través de la BHE en cerebros sanos. • Disminuye los T1 dentro del sistema vascular y por ende aumenta la intensidad de la señal de RM en imágenes sopesadas en T1. • Crea gradientes de χ entre lo intra vascular y extra vascular → T2* GRE y SE Agentes contrastantes exógenos Los biopolímeros reducen la toxicidad, aumentan la persistencia en sangre e incrementan el contraste ácido dietilenotriaminopentaacético Gd (DTPA) Polímeros biocompatibles: poliaminas, polisacáridos, PLL, albúminas, alteran sus propiedades biofísicas y farmacológicas. J.-H. Kim et al. / Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 1031–1053 Actividad enzimática Afinidad por el [Ca2+ ] ~ µm Marcador del Gen lac Z Afinidad proteínas, pH, CO2, O2 Mn2+ • Mn2+ se introduce en células nerviosas excitadas por mecanismos de transporte de Ca2+ . Su comportamiento intracelular ha sido estudiado. • Mn2+ metal pesado esencial como cofactor de enzimas incluyendo la superoxidimutasa , Piruvato carboxilasa , Glutamina sintetasa. • La relación T1/ T2 es similar a la de los tejidos. a) El estudio de la cito arquitectura cerebral b) La identificación de los tractos neuronales c) La determinación de las regiones de excitación neuronal. Partículas super paramagnéticas = Nano partículas magnéticas (npm). 4 3 Dominios magnéticos y partículas monodominio 2 1 d c 1 2 3 4 Partícula monodominio, d < dc Nanopartícula Magnética (MNP) Cubrimiento polimérico Superficie Núcle o Energía de anisotropía Ea = KV Sistema de MNP con anisotrop ía uniaxial, d < dcc , anisotropía Hext ext = 0 Tc TB Encapsulado de nano partículas magnéticas a) SPIO superiores a 50 nm. b) USPIO menores de 50 nm. Sus propiedades magnéticas cambian con las dimensiones. J.-H. Kim et al. / Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 1031–1053 MPI = Imágenes de Partículas Magnéticas, Physics in Medicine and Biology, Marzo 2009 Funciones d e las Nano partículas supermagnéticas (NPM) cápsula de Biopolímero Agente terapéutico Mejorar permeabilidad Núcleo nano partícula Agente diana ratas Wistar • Aumento de contraste. • Direcciona a la diana. • Mejorar permeabilidad. • Transportador y dosificador de agente terapéutico. • Marcaje, direccionamiento y seguimiento celular . (Wiart et al., 2007) Marcaje con nano partículas súper paramagnéticas Tumor en un ratón transgénico. (Cherry 2004) •Evaluación de daño de la Barrera Hematoencefálica. • Determinación de la Densidad celular y los espacios intracelulares. •Micro vascularización en el tumor y sus alrededores. •Fracción del volumen sanguino. •Efectividad de la terapia( quirúrgica, radio quirúrgica, ACM,...) •Marcaje y rastreo de las células cancerígenas. Npm multifuncionales. Otras estructuras npm multifuncionales = propiedades super paramagnéticas + colorantes fluorescentes ↔ detección a nivel celular con imágenes ópticas de fluorescencia y de las IRM. IRM realiza la planificación quirúrgica y se asiste el acto quirúrgico con la visualización por ambos métodos de las fronteras del tumor en modelos animales para su extirpación precisa. Ligandos Bicapa Fosfolipidica Los ACM primeros agentes dianas. Dimensiones→ paso dificultoso por la BBB Polyetilen glycol Droga Restricciones de los agentes contrastantes. • • • • • Caros. Compleja su síntesis. Bio disponibilidad. Sitio de acción selectiva. Efectividad del paso a través de la Barrera Hematoencefálica y las membranas celulares. • Relativa invasividad. Control genético del contraste de RM Iones metálicos endógenos Proteína Agente contrastante exógeno Vesícula Proteínas superficiales Gen Molécula diana Proteína Agente contrastante exógeno Enzima Tipos de Flujo. Medición de velocidad d V= TR Velocidad del flujo Conducto 1234 Fino 1 Medio 2 Semi grueso 3 Grueso 4 Capilar Eritrocito H2O H2O Gran vaso sanguíneo Difusión isotrópica Difusión anisotrópica Tamañ Tamaño, Forma Orientació Orientación H2O Coeficiente de Difusión Aparente. ADC. Difusión media. Métodos de Perfusión MR Endógenos PMR 2D y 3D ASL Arterial Spin Labeling AST Arterial Spin Tagging ↓ CBF Pulso PASL Continuo CASL _ Cerebro sano CBV=CBF Isquemia cerebral CBV↑≠CBF↓ Exógenos DSC Dinamic Suceptibility Contrast → CBV ASL Arterial Spin Labeling AST Arterial Spin Tagging agente endógeno DSC Dinamic Suceptibility Contrast agente exógeno Tejido Perfusión Per = F W Vena arteria Razón de Perfusión f = ρP Tiempo Medio de Tránsito qV V F= = 0 Tmtt Tmtt Fracción de volumen de sangre V q≡ V0 capilares Lugar de marcado Lugar de Imagen Marca Imagen Imagen Marcada No Marcado Imagen Imagen control Modelo de Perfusión 1cm3 tiene 3 × 10 22 moléculas de H 2 O D = 3,4 · 10-5 cm2 /s L = 6 Dt = 6 × 2,210 −5 × 1 = 100 μ d celula = 10 μ Modelo Capilares Radio promedio: 3 µm Largo promedio: 750 µm Velocidad media a través del capilar : 300-500 µm/s. Distancia recorrida en 100ms: 30-50 µm Densidad de capilares: 400-500/mm3 Número de capilares en un vóxel de 1x1x7 mm3: 3000 Secuencia de experimentos para ASL Momento 1 Δt =T I Momento 2 Plano de imagen marcada Banda de inversión con pulso 1800 Banda de inversión de compensación con pulso 1800 Momento 3 Las flechas azules indica la dirección del flujo Imagen de Control Momento 4 Mapas de Perfusión intensidad Tiempo Medio de Tránsito (MTT) • La integral = Volumen Sanguíneo Crebral (CBV) • Deconvolucionar esta función da el Flujo Sanguíneo Cerebral (CBF) 0 Inyeccion de contraste tiempo 10 Área =λ 20 30 40 Tiempo (s) Área α CBV 10 20 30 Tiempo (s) 40 Proceso de medición Proceso real 10 Señales de SE y GRE con agente contrastante Spin Eco Gradiente de Eco Umbrales de flujo sanguíneo cerebral Los umbrales de daño cerebral por isquemia son dinámicos. 100 % 80 ↓ síntesis proteica ↑ expresión genética selectiva 50 ml 40 pérdida neuronal selectiva 60 30 ↑ [lactato] 40 20 liberación de glutamato , ↓ pH infarto ↓ ATP , ↓ PCr 0 ↑ K++ 20 10 0 Principales eventos de la cascada isquémica 1. Disminución Glucosa y ATP 2. Acidosis celular (desnat. Prot. Altera función de prot. dependiente de PH y la re captación de neuro trasmisores, promueve radicales libres.) 3. Liberación de Glutamato neurotransmisor excitatorio Receptores. NMDA: KA: AMPA: Trans-ACPD: L-AP4: N-metil-D-Aspartato (entrada de Ca2+ y Na+) Kainate alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4isoxazol-4-propionato (entrada de Ca2+ y Na+) 1S,3R-trans-1-amino-ciclopentil-1,3-dicarboxilato L-2-amino-4-acido fosfonobutanóico. 4. Influjo de Ca2+ (activación de enzimas proteasas, fosfolipasas, lipasas y endonucleasasas). 5. Degradación de fosfolípidos de membrana. 6. Inflamación y edema. 7. Generación de radicales libres. Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones Biológicas Instituto de Farmacia y Alimentos, UH MRS in vivo. Metabolitos Decrecen durante la isquemia δ ( ppm) = B0 − Br ω0 − ω r = Br ωr Ejemplo de ensayo de trombolíticos para Ictus μPli= Microplasmin tPA = Activador del Plasminógeno Tisular Radiology: Vol244: N 2—August 2007 Modelo Isquémico 1.5T (22 Oct 2009) Coronal T2. Espesor 2 mm, Resolución 140 x 140 µm. La lesión se muestra hiperintensa Phantom B2 80 70 60 RSR (UR) 50 40 30 20 Flex S coronal Extremity coronal 10 0 0 2 4 6 8 Planos 10 12 14 16 Instrumentos y aditamentos Imanes, Transferencia de Magnetización. ⎛S⎞ Timag ∝ ⎜ ⎟ ⎝R⎠ 2 ⎛ T1 ⎞ −7 −6 2 ⎜ ⎟(B0 ) (Δr ) ⎝T2⎠ Agentes contrastantes, secuencias de impulsos. Bobinas, Electrónica, Criogénia, Secuencias de impulsos. ( ) −6 Para una ⎛ S ⎞ Δr = ⟨1mm ⟩ ⇒ Timag= 5 min ⎜ ⎟ ⎝ R ⎠ (Δr )−6 = ⟨1μm 3 ⟩ ⇒ Timag = 10años 3 Diámetros fibras nerviosas entre 1 - 10µm. Células Betz tienen diámetros entre Resoluciones 10 - 22 µm. límites ≈10- 20μ Posibilidades de las μRM e ImRM • Herramienta efectiva en el establecimiento de la relación metabólica y genotípica con la expresión fenotípica y para comprobar diseños de moléculas activas, su relación estructura-función e interacción con blancos terapéuticos. • Aceleran y abaratan los ensayos preclínicos y clínicos. En breve los estudios por imágenes serán ineludibles para el diseño, desarrollo y validación de nuevas drogas. • Las técnicas y métodos de IRM desarrollados en animales son trasladables a humanos y viceversa. • Menor consumo de animales, reactivos. • Precisión y cuantificación mayores. • Menor laboriosidad. d RM a d i Un Proyecto constructivo de la Unidad de Resonancia Magnética Polo 3,0 T 9,4 T
