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Micro Resonancia Magnética e Imágenes Moleculares
para la biotecnología y la farmacéutica.
Caso de la Isquemia Cerebral.
Agradezco al
Prof. Dr. Carlos O Della Védova y a la Prof. Dra. Cristina Caracoche
¡Gracias a todos Ustedes!
Dr. Carlos Cabal Mirabal
Investigador Titular. Académico de Mérito
Unidad de RM Cneuro
carlos.cabal@cneuro.edu.cu
carlos.cabal@infomed.sld.cu
Comparación entre los Métodos de Imágenes
¿?
[Rudin 2003]
Literatura científica sobre ensayos y RM
800
750
700
R2 = 0.9486
650
550
500
450
400
350
300
Biomundi julio 2009
250
200
150
100
50
2007
2008
2005
2006
2002
2003
2004
2000
2001
1997
1998
1999
Años
Años
1994
1995
1996
1992
1993
1989
1990
1991
0
1988
Cantidad de publicaciones
600
2009
2008
2007
2006
2005
2004
2003
2002
2001
2000
1999
1998
1997
1996
1995
1994
1993
1992
1991
1990
1989
1988
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Cantidad de publicaciones
Modelo de cáncer en anim al
Modelo de stroke en anim al
120
130
Definiciones de μRM e ImRM
• Las μRM son imágenes de estructuras biológicas vivas
con resoluciones espaciales
del orden de decenas de
micras, elevado contraste y tiempos de imágenes que
permiten estudiar los detalles anatómicos y los procesos
fisiológicos a nivel de células, tejidos y órganos, sin alterar
estos.
• Las ImRM in vivo y no invasivas han sido definidas como la
representación visual, la caracterización (estructural y
funcional) y la cuantificación de procesos biológicos a
niveles celulares y moleculares.
• Las ImRM y μRM detectan, cuantifican y visualizan
fenómenos dinámicos moleculares y celulares, en tejidos y
órganos, con resoluciones espaciales de hasta decenas de
micras y temporales de milisegundos.
μRM
lumen perimeter
(mm)
wall thickness
(mm)
0.48
3.6
3.0
mean lumen perimeter
mean wall thick
0.43
2.4
0.38
1.8
0.33
1.2
0.28
0.6
0.23
0.0
0.18
15-18 months
19-22 months
μRM
La isquemia.
Precede de una severa disminución de flujo:
60 mL/min/100g humano adulto
90-105 mL/min/100g roedor adulto
20-25 ml/min/100 g
EEG lento
(Preocuparse)
18-20 ml/min/100 g
Aparecen síntomas
neurológicos
16-18 ml/min/100mg
10ml/min/100mg
Rápida
muerte
celular
Desaparecen respuestas
Eléctricas “Umbral de
Fallo eléctrico”
Zona de penumbra
Núcleo o “Core”
Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones Biológicas
Instituto de Farmacia y Alimentos, UH
La Zona de penumbra es RESCATABLE y si logramos restablecer las
condiciones normales de funcionamiento el área de infarto puede
reducirse.
Ventana
terapéutica
Ventana
reperfusión
3-12h
+
Ventana
neuroprotección
• Buscar métodos más acordes con la ventana
• Ampliar la ventana para el diagnóstico y la terapéutica adecuadas.
T2
ADC
DWI
MTT
CBF
Curso de la Oclusión de la ACM en una rata
• Volumen y evolución temporal del infarto.
• Flujo sanguíneo local en el área infartada.
• Estudios sobre reperfusión.
• Farmacología del ictus.
• Influencia de la duración de la hipoxia en la talla y
localización del infarto.
• Respuestas inflamatorias después del infarto.
• Necrosis y apoptosis celular.
• Actividad fagocítica y microglial en la zona de teijdo
infartado.
• Homeostasia de la barrera hematoencefálica.
Métodos, condiciones fisio patológicas con μRM en modelos animales
(Dijkhuizen 2003)
Método de MRI
• Densidad protónica
Fisiopatología
Edema vasogénico
• T1W
• T2W
•
Contraste T1W
Daño de la barrera hematoencefálica
• MT
Degradación del tejido
Edema vasogénico
• DW
Edema Citotóxico
Lisis Tisular
• Perfusión
• BOLD
• MRA
Déficit de perfusión
Hemorragia
Perturbaciones
hemodinámicas
Perturbaciones del flujo
Muestra
N
Imán
M0
S
Magnetización M
N
tP
SCL
Excitación RF
B1
S
M Cambia de orientación
N
SCL
M XY (T2 ) =
M0
≈ 37% M 0
e
S
t =T 2
N
Relajación Magnética
T1, T2
Z´
SCL
Y´
X´
n =1
S
N
SCL
Z´
Señal de RM
Y´
Fem Inducida
X´
S
5
0
0
5
00
n=2
t
⎡ 1⎤
M Z (T1 ) = M 0 ⎢1 − ⎥ ≈ 63 % M 0
⎣ e⎦
Agua de los diferentes tejidos.
ρ
% H2O
T1ρ
100
Piel
Hígado
Pulmón
Corazón
DWI
T2
Contraste
ADC
T2*
χ
DTI
Hueso
20
Riñones
40
δ
Sustancia blanca
60
Sustancia gris
80
T1
Tipo de tejido
Agua enlazada
en superficie
τc = 10-10
1
∝ f (τ C )
T1, 2
Agua interna
τc = 10-5
Agua libre
τc = 10-12
Tiempo de correlación del agua (s)
Proteina
Órgano
Cerebro
Tejido
Tiempo de relajación
Spin-spin T2(ms)
A 1,5 T
A 0,2 T
Sustancia Gris
921
495
101
Sustancia Blanca
787
390
92
Líquido encéfalo raquídeo
3000
1200
1500
Edema
1090
627
113
Meningioma
979
549
103
Glioma
957
832
111
1109
864
141
493
229
43
1077
580
84
Astrocitoma
Hígado
Tiempo de relajación Spin-retículo
T1(ms)
Tejido normal
Hepatomas
Bazo
Tejido normal
782
400
62
Páncreas
Tejido normal
513
283
62
Riñones
Tejido normal
652
395
58
Pulmón
Tejido normal
830
Músculo
Tejido normal
868
Grasa
Tejido normal
79
372
47
IMÁGENES Sopesadas en T1
Imagen sopesada en T1 (TR corto, TE corto)
IMÁGENES Sopesadas en T2
Imagen potenciada en T2 (TR largo, TE largo)
Contraste SE
ρ
T1
(TE corto y
TR largo)
T2
(TE corto y
TR corto)
(TE largo y
TR largo)
RF
Eco
Eco
o
TE
TR
Contraste depende del
tejido, su estado
fisiológico, molecular.
Se hace mas o menos
evidente dependiendo
de los parámetros del
experimento
Imágenes T1 y T2 de rata
Axial plano de 49 mm y 1 mm de espesor
T1
Sagital 59 mm
T2
La difusión restringida
Difusión isotrópica
Difusión anisotrópica
Tamaño,
Forma
Orientación
Difusión en las células
6 Dt
Alta difusión
6 Dt
Baja difusión
Imágenes DWI, ADC en ratas
Utilización del tiempo
TI = 1minuto. 20 imágenes en
20 minutos implica varias
opciones de empleo de esos 20
minutos → óptima planificación
del experimento para
aprovechar el tiempo
Ejemplo 1. Dos valores de b, b= 0 (imagen base) y con b=1000 s/mm2 seleccionamos seis
orientaciones de los gradientes y para cada una de las orientaciones hacemos tres
acumulaciones con el fin de incrementar la relación señal/ruido tardaríamos 19 minutos en
realizar el estudio.
Ejemplo 2. Fijamos tres valores de la b; b=500; b= 1000 y 1500 s/mm2 y obtenemos 7
planos para esos valores. TI = 21 minutos.
Ejemplo 3. Un corte para 20 orientaciones con un valor fijo de b=1000s/mm2
Imágenes moleculares y celulares .
Mecanismos de contraste
I. Intrínsecos.
II. Extrínsecos.
1s2
2
2s2
2p6
8
3s2
3p6
3d10
4s2
4p6
4d10
4f14
32
5s2
5p6
5d10
5f14
32
6s2
6p6
6d10
6f14
32
18
1s2 2s22p6 3s23p6 4s2 3d10
M = χ ·Bo
Susceptibilidad Magnética
χ ⟨0 ⇔ Diamagnéti co
χ ⟩0 ⇔ Paramagnét ico
Metales de Transición:
Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu,
Tierras Raras:
Ce, Pr,
Pr Nd, Pm, Sm, Eu,
Eu Gd, Tb,
Tb
Dy, , Ho, Er,
El magnetismo molecular depende
de la intensidad del campo de
ligados y de su simetría alrededor del
ion central
Simetría e Intensidad del Campo de ligandos
Simetría tetraédrica
d z 2 ; d x2 − y2
Δ
d xy ; d xz ; d yz
Simetría octaédrica
d z 2 ; d x2 − y2
δ <Δ
Alto spin
d xy ; d xz ; d yz
δ >Δ
Bajo spin
Δ
S=0
δ < ΔBajo spin
S=2
Energía de apareamiento
δ > Δ Alto spin
Δ = EL ( intensidad del campo de Ligando)
I-<Br-<Cl-<F-<H2O<C2O42-<piridina~NH3< Etilendiamina<NO2-<CN-
Desoxi Hb
Paramagnético
Oxi Hb
Diamagnético
Resonancia Magnética funcional.
Imagen Base
Imagen con estímulo
A. Sensorial A. Motora A. Cognitiva
METABOLISMO AUMENTADO
VASODILATACION
Incremento
Flujo sanguíneo
Incremento
Consumo de O2
Imagen funcional
Zonas
activadas
Agentes contrastantes exógenos
ácido 1,4,7,10 tetraazaciclododecane 1,4,7,0 acido tri acético
S=7/2
ácido dietilenotriaminopentaacético
La dificultad fundamental: acumular suficiente cantidad en el área de
interés mantener el mínimo nivel de esta en otros órganos o tejidos.
Mecanismo de acción Gd(DTPA)
• No pasa a través de la BHE en cerebros sanos.
• Disminuye los T1 dentro del sistema vascular y
por ende aumenta la intensidad de la señal de
RM en imágenes sopesadas en T1.
• Crea gradientes de χ entre lo intra vascular y
extra vascular → T2* GRE y SE
Agentes contrastantes exógenos
Los biopolímeros reducen
la toxicidad, aumentan la
persistencia en sangre e
incrementan el contraste
ácido dietilenotriaminopentaacético
Gd (DTPA)
Polímeros biocompatibles:
poliaminas, polisacáridos,
PLL, albúminas, alteran
sus propiedades biofísicas
y farmacológicas.
J.-H. Kim et al. / Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 1031–1053
Actividad enzimática
Afinidad por el [Ca2+ ] ~ µm
Marcador
del Gen lac Z
Afinidad proteínas, pH, CO2, O2
Mn2+
• Mn2+
se introduce en células nerviosas
excitadas por mecanismos de transporte de Ca2+ .
Su comportamiento intracelular ha sido estudiado.
• Mn2+ metal pesado esencial como cofactor de
enzimas incluyendo la superoxidimutasa , Piruvato
carboxilasa , Glutamina sintetasa.
• La relación T1/ T2 es similar a la de los tejidos.
a) El estudio de la cito arquitectura cerebral
b) La identificación de los tractos neuronales
c) La determinación de las regiones de excitación neuronal.
Partículas super paramagnéticas = Nano partículas
magnéticas (npm).
4
3
Dominios magnéticos y partículas monodominio
2
1
d
c
1
2
3
4
Partícula monodominio, d < dc
Nanopartícula
Magnética (MNP)
Cubrimiento
polimérico
Superficie
Núcle
o
Energía de anisotropía
Ea = KV
Sistema de MNP con anisotrop
ía uniaxial, d < dcc ,
anisotropía
Hext
ext = 0
Tc
TB
Encapsulado de nano partículas magnéticas
a) SPIO superiores a 50 nm.
b) USPIO menores de 50 nm.
Sus propiedades magnéticas
cambian con las dimensiones.
J.-H. Kim et al. / Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 1031–1053
MPI = Imágenes de Partículas Magnéticas,
Physics in Medicine and Biology, Marzo 2009
Funciones d e las Nano partículas supermagnéticas (NPM)
cápsula de Biopolímero
Agente terapéutico
Mejorar permeabilidad
Núcleo nano partícula
Agente diana
ratas Wistar
• Aumento de contraste.
• Direcciona a la diana.
• Mejorar permeabilidad.
• Transportador y dosificador de agente terapéutico.
• Marcaje, direccionamiento y seguimiento celular .
(Wiart et al., 2007)
Marcaje con nano partículas súper paramagnéticas
Tumor en un ratón transgénico.
(Cherry 2004)
•Evaluación de daño de la Barrera Hematoencefálica.
• Determinación de la Densidad celular y los espacios
intracelulares.
•Micro vascularización en el tumor y sus alrededores.
•Fracción del volumen sanguino.
•Efectividad de la terapia( quirúrgica, radio quirúrgica,
ACM,...)
•Marcaje y rastreo de las células cancerígenas.
Npm multifuncionales. Otras estructuras
npm
multifuncionales
=
propiedades super paramagnéticas
+
colorantes fluorescentes ↔ detección a nivel celular con imágenes ópticas
de fluorescencia y de las IRM. IRM realiza la planificación quirúrgica y se
asiste el acto quirúrgico con la visualización por ambos métodos de las
fronteras del tumor en modelos animales para su extirpación precisa.
Ligandos
Bicapa Fosfolipidica
Los ACM primeros agentes dianas.
Dimensiones→ paso dificultoso por la BBB
Polyetilen glycol
Droga
Restricciones de los agentes contrastantes.
•
•
•
•
•
Caros.
Compleja su síntesis.
Bio disponibilidad.
Sitio de acción selectiva.
Efectividad del paso a través de la Barrera
Hematoencefálica y las membranas
celulares.
• Relativa invasividad.
Control genético del contraste de RM
Iones metálicos
endógenos
Proteína
Agente
contrastante
exógeno
Vesícula
Proteínas
superficiales
Gen
Molécula
diana
Proteína
Agente
contrastante
exógeno
Enzima
Tipos de Flujo.
Medición de velocidad
d
V=
TR
Velocidad del flujo
Conducto
1234
Fino 1
Medio 2
Semi grueso 3
Grueso 4
Capilar
Eritrocito
H2O
H2O
Gran vaso sanguíneo
Difusión isotrópica
Difusión anisotrópica
Tamañ
Tamaño,
Forma Orientació
Orientación
H2O
Coeficiente de Difusión
Aparente.
ADC.
Difusión media.
Métodos de Perfusión MR
Endógenos
PMR
2D y 3D
ASL Arterial Spin Labeling
AST Arterial Spin Tagging
↓
CBF
Pulso
PASL
Continuo CASL
_
Cerebro sano CBV=CBF
Isquemia cerebral CBV↑≠CBF↓
Exógenos
DSC Dinamic Suceptibility Contrast → CBV
ASL Arterial Spin Labeling
AST Arterial Spin Tagging
agente endógeno
DSC
Dinamic Suceptibility Contrast
agente exógeno
Tejido
Perfusión
Per =
F
W
Vena
arteria
Razón de Perfusión
f = ρP
Tiempo Medio de
Tránsito
qV
V
F=
= 0
Tmtt Tmtt
Fracción de volumen
de sangre
V
q≡
V0
capilares
Lugar de marcado
Lugar de Imagen
Marca
Imagen
Imagen
Marcada
No
Marcado
Imagen
Imagen
control
Modelo de Perfusión
1cm3 tiene 3 × 10 22 moléculas de
H 2 O D = 3,4 · 10-5 cm2 /s
L = 6 Dt = 6 × 2,210 −5 × 1 = 100 μ
d celula = 10 μ
Modelo
Capilares
Radio promedio: 3 µm
Largo promedio: 750 µm
Velocidad media a través del capilar : 300-500 µm/s.
Distancia recorrida en 100ms: 30-50 µm
Densidad de capilares: 400-500/mm3
Número de capilares en un vóxel de 1x1x7 mm3: 3000
Secuencia de experimentos para ASL
Momento 1
Δt =T I
Momento 2
Plano de imagen
marcada
Banda de
inversión con
pulso 1800
Banda de
inversión de
compensación
con pulso 1800
Momento 3
Las flechas azules indica la dirección del flujo
Imagen de
Control
Momento 4
Mapas de
Perfusión
intensidad
Tiempo Medio de Tránsito (MTT)
• La integral = Volumen
Sanguíneo Crebral
(CBV)
• Deconvolucionar esta
función da el Flujo
Sanguíneo Cerebral
(CBF)
0
Inyeccion de contraste
tiempo
10
Área =λ
20
30
40
Tiempo (s)
Área α CBV
10
20
30
Tiempo (s)
40
Proceso de medición
Proceso real
10
Señales de SE y GRE con agente contrastante
Spin Eco
Gradiente de Eco
Umbrales de flujo sanguíneo cerebral
Los umbrales de daño cerebral por isquemia son dinámicos.
100 %
80
↓ síntesis proteica
↑ expresión genética selectiva
50 ml
40
pérdida neuronal selectiva
60
30
↑ [lactato]
40
20
liberación de glutamato , ↓ pH
infarto
↓ ATP , ↓ PCr
0
↑ K++
20
10
0
Principales eventos de la cascada isquémica
1. Disminución Glucosa y ATP
2. Acidosis celular (desnat. Prot. Altera función de prot. dependiente
de PH y la re captación de neuro trasmisores, promueve radicales
libres.)
3. Liberación de Glutamato neurotransmisor excitatorio
Receptores.
NMDA:
KA:
AMPA:
Trans-ACPD:
L-AP4:
N-metil-D-Aspartato (entrada de Ca2+ y Na+)
Kainate
alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4isoxazol-4-propionato (entrada de Ca2+ y Na+)
1S,3R-trans-1-amino-ciclopentil-1,3-dicarboxilato
L-2-amino-4-acido fosfonobutanóico.
4. Influjo de Ca2+ (activación de enzimas proteasas, fosfolipasas,
lipasas y endonucleasasas).
5. Degradación de fosfolípidos de membrana.
6. Inflamación y edema.
7. Generación de radicales libres.
Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones Biológicas
Instituto de Farmacia y Alimentos, UH
MRS in vivo. Metabolitos
Decrecen durante la isquemia
δ ( ppm) =
B0 − Br ω0 − ω r
=
Br
ωr
Ejemplo de ensayo de trombolíticos para Ictus
μPli= Microplasmin
tPA =
Activador del
Plasminógeno
Tisular
Radiology:
Vol244: N 2—August 2007
Modelo Isquémico 1.5T (22 Oct 2009)
Coronal T2. Espesor 2 mm, Resolución 140 x 140 µm.
La lesión se muestra hiperintensa
Phantom B2
80
70
60
RSR (UR)
50
40
30
20
Flex S coronal
Extremity coronal
10
0
0
2
4
6
8
Planos
10
12
14
16
Instrumentos y aditamentos
Imanes, Transferencia de Magnetización.
⎛S⎞
Timag ∝ ⎜ ⎟
⎝R⎠
2
⎛ T1 ⎞
−7
−6
2
⎜
⎟(B0 ) (Δr )
⎝T2⎠
Agentes contrastantes,
secuencias de impulsos.
Bobinas, Electrónica, Criogénia,
Secuencias de impulsos.
( )
−6
Para una
⎛ S ⎞ Δr = ⟨1mm ⟩ ⇒ Timag= 5 min
⎜ ⎟
⎝ R ⎠ (Δr )−6 = ⟨1μm 3 ⟩ ⇒ Timag = 10años
3
Diámetros fibras nerviosas entre 1 - 10µm.
Células Betz tienen diámetros entre
Resoluciones
10 - 22 µm.
límites ≈10- 20μ
Posibilidades de las μRM e ImRM
• Herramienta efectiva
en el establecimiento de la
relación metabólica y genotípica con la expresión
fenotípica y para comprobar diseños de moléculas
activas, su relación estructura-función e interacción
con blancos terapéuticos.
• Aceleran y abaratan los ensayos preclínicos y clínicos.
En breve los estudios por imágenes serán ineludibles
para el diseño, desarrollo y validación de nuevas drogas.
• Las técnicas y métodos de IRM desarrollados en
animales son trasladables a humanos y viceversa.
• Menor consumo de animales, reactivos.
• Precisión y cuantificación mayores.
• Menor laboriosidad.
d RM
a
d
i
Un
Proyecto constructivo de la Unidad de Resonancia Magnética
Polo
3,0 T
9,4 T
Descargar