UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA FACULTAD DE AGRONOMÍA INCLUSIÓN DE ARCILLAS ESMECTITAS EN MASA DE NIXTAMAL PARA REDUCIR LA EXPOSICIÓN DE AFLATOXINAS Y FUMONISINAS TESIS QUE PRESENTA MVZ. JORGE MIGUEL VILLARREAL GUERRA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRÍA EN CIENCIA ANIMAL GENERAL ESCOBEDO, N.L. AGOSTO DEL 2014 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA FACULTAD DE AGRONOMÍA INCLUSIÓN DE ARCILLAS ESMECTITAS EN MASA DE NIXTAMAL PARA REDUCIR LA EXPOSICIÓN DE AFLATOXINAS Y FUMONISINAS T E S I S QUE PRESENTA MVZ. JORGE MIGUEL VILLARREAL GUERRA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBETENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIA ANIMAL GENERAL ESCOBEDO, N.L. AGOSTO DEL 2014 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA FACULTAD DE AGRONOMÍA INCLUSIÓN DE ARCILLAS ESMECTITAS EN MASA DE NIXTAMAL PARA REDUCIR LA EXPOSICIÓN DE AFLATOXINAS Y FUMONISINAS Aprobación de tesis por el comité particular de MVZ. Jorge Miguel Villarreal Guerra _____________________________________ Ph. D. Alicia Guadalupe Marroquín Cardona Asesor Principal ____________________________________ Dra. Patricia González Barranco Asesor Externo ___________________________________ Dr. Hugo Bernal Barragán Co-Asesor __________________________________ Dr. Francisco Javier Picón Rubio Co-Asesor GENERAL ESCOBEDO, N.L. AGOSTO DEL 2014 “Un gran placer en la vida, es lograr lo que la gente te dice que no puedes lograr” -Walter Bagehot. i DEDICATORIA Éste documento va dedicado a mis asesores, principalmente a la Ph. D. Alicia Marroquín, sin tu confianza depositada en mi desde un principio, nada de esto se habría realizado; así como a la Dra. Patricia González, al Dr. Francisco Picón y al Dr. Hugo Bernal; sin duda alguna todos ustedes han dejado una huella importante en mi vida profesional y académica. ii AGRADECIMIENTOS A mis padres gracias por hacer su trabajo: educarme y darme las herramientas para siempre prepararme más, ¡Gracias papás! A mis hermanos Eduardo, Alejandro, Erik y Devany por permitirme ser su ejemplo e inspiración, esto va por ustedes. A mis asesores, gracias por siempre motivarme e inspirarme a dar más, por compartir su invaluable aportación a ésta investigación. Al personal técnico y de servicio social del Laboratorio de Nutrición por su ayuda durante la fase experimental del proyecto. A mis amigos de posgrado por todos los ánimos que me dieron, por su ayuda, consejos, por el tiempo que compartimos dentro y fuera de las aulas, así como su inolvidable amistad. ¡Gracias totales! A mis amigos que no hace falta mencionarlos porque siempre han estado en este camino de mi lado, permitiéndome siempre buscar ser una mejor persona, con su apoyo, GRACIAS por ser parte de esto. Por último, al CONACyT que gracias a la beca de manutención otorgada para realizar mis estudios, puedo hoy concluir esta etapa de mi vida profesional. iii ABREVIATURAS µg Microgramo µl Microlitro ACS Reactivo analítico de American Chemical Society ADN Ácido desoxirribonucleico AF Aflatoxina CHC Carcinoma Hepatocelular ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FB Fumonisina g Gramo HBV Hepatitis B Virus HFB1 Fumonisina B1 hidrolizada HPLC High-Performance Liquid Chromatography kg Kilogramo mg Miligramo mL Mililitro NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato nm Nanómetro pH Potencial de hidrógeno ppb Partes por billón ppm Partes por millón iv ÍNDICE DE CONTENIDO Página ÍNDICE DE CONTENIDO……………………………………………………. V ÍNDICE DE TABLAS………………………………………………………… VII ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………….. VIII RESUMEN…………………………………………………………................ IX 1. INTRODUCCIÓN ……………………………………………………………. 1 1.1. OBJETIVO GENERAL..………………………………………………. 4 1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………….. 5 1.3. HIPÓTESIS……………………………………………………………… 6 1.4. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………... 7 2. REVISÓN DE LITERATURA……………………………………………….. 8 2.1. Micotoxinas………………………………………………………………. 8 2.2. Aflatoxinas……………………………………………………………….. 10 2.3. Mecanismo de acción y metabolismo de las aflatoxinas…………… 14 2.4. Fumonisinas…………………………………………………................. 19 2.5. Mecanismos de toxicidad de las fumonisinas………………….......... 20 2.6. Papel de las aflatoxinas y fumonisinas como carcinógenos………. 22 2.7. Estrategias para reducir la exposición a aflatoxinas y fumonisinas. 23 2.8. Uso de arcillas como enteroadsorbentes…………………………….. 24 3. MATERIALES Y MÉTODOS………..……………………………………… 29 3.1. Preparación de las muestras..……………………………………….… 30 3.2. Inmunoensayos para aflatoxinas y fumonisinas totales………...….. 31 3.2.1. Extracción de aflatoxinas y fumonisinas…………………………. 31 v 3.2.2. Procedimientos..…………………………………………........... 32 3.2.3. Medición de pH de las muestras de masa…..……..………… 34 3.3. Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)………………… 34 3.3.1. Extracción de micotoxinas para HPLC………………………….. 35 3.3.2. Separación cromatográfica….……………………………………. 36 3.4. Inclusión de la arcilla en la masa de nixtamal……………………….. 38 3.5. Análisis estadístico……………………………………………………… 39 4. RESULTADOS……………………………………………………………….. 40 4.1. Resumen de cuestionarios aplicados de consumo de maíz…..….. 40 4.2. Resultados de cuantificación de micotoxinas por ELISA…………… 43 4.3. Resultados de medición de pH……...………………………………… 45 4.4. Resultados de cuantificación de micotoxinas por HPLC…………… 45 4.5. Resultados de inclusión de arcilla…………………………………….. 46 5. DISCUSIÓN……………………………………………………………….….. 48 6. CONCLUSIONES………………………………………………………….… 54 7. LITERATURA CITADA……………………………………………………... 55 8. ANEXOS……………………………………………………………………… 63 8.1. Cuestionario aplicado sobre el consumo de maíz…………………... 63 8.2. Mapa de molinos muestreados……………………………………..… 64 8.3. Concentraciones de aflatoxinas y fumonisinas totales por ELISA… 65 vi ÍNDICE DE TABLAS TABLA Página 1. Respuestas más frecuentes del cuestionario…………………………. 42 2. Estadística descriptiva de aflatoxinas totales ……………………….. 43 3. Estadística descriptiva de fumonisinas totales..………………….... 44 4. Concentraciones de AFB1 y FB1 por HPLC………………………… 46 5. Eficacia de la arcilla para aflatoxinas……………………………….. 47 6. Eficacia de la arcilla para fumonisinas……………………………... 47 7. Cantidades posibles de AF y FB en una ración de masa……………. 51 vii ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA Página 1. Estructura química de AFB1…………………………………………………. 10 2. Estructura química de aflatoxinas……………………………………….….. 12 3. Aducto de AFB1-GUA……………………………………………….…….….. 16 4. Ruta metabólica de AFB1…………………………………………………..... 18 5. Estructura química de FB1…………………………………………….…….. 20 6. Estructura tridimiensional del aluminosilicato…………………………….. 25 viii RESUMEN Las aflatoxinas (AF) y fumonisinas (FB) son metabolitos tóxicos de algunos hongos Aspergillus y Fusarium, respectivamente, que frecuentemente contaminan el maíz y sus subproductos, representando un riesgo para la salud pública por sus efectos hepatotóxicos y carcinogénicos. El objetivo de este trabajo fue detectar la presencia de AF y FB en masa nixtamalizada de molinos del área metropolitana de Monterrey y evaluar la eficacia de la arcilla esmectita para reducir la concentración de estas micotoxinas cuando se adiciona en masa nixtamalizada. En total 62 muestras fueron analizadas mediante ELISA competitivo para detección de aflatoxinas totales y fumonisinas totales, y muestras representativas fueron analizadas con HPLC para la cuantificación de AFB1 y FB1. La metodología involucró el secado de las masas y posterior molido y tamizaje previo a extracción metanólica de las muestras. Los resultados de ELISA indicaron que los valores de aflatoxinas variaron de 0 a 22.66 μg/kg mientras que los valores de fumonisinas se encontraron en un rango de 0 a 16.68 mg/kg. Los resultados mostraron que en el 8% de las masas las AF se encontraban por encima del límite permisible (12 μg/kg) de acuerdo a la NOM-247-SSA1-2008, y que en el 13% las FB se encontraban superando los niveles permitidos a nivel internacional (4 mg/kg). Muestras representativas fueron analizadas a través de HPLC mostrando concentraciones desde 0-6.1 μg/kg para AFB1 y rangos desde 0.8-1.2 mg/kg para FB1. En los estudios de efectividad de la arcilla para reducir las AF en masa, se observó desde 75 a 91.3% de reducción en las muestras (n=5). Para FB sólo en algunas muestras (5 de 8) se obtuvo reducción de entre 5.3 a 82.4%. La reducción para AF resultó significativa (P< 0.05) mientras que para FB no lo fue (P>0.05). En conclusión, de acuerdo a los resultados del presente trabajo, AF y FB están ocasionalmente presentes en masas nixtamalizadas y la adición de esmectita tiene potencial para reducir AF y ix FB presentes en este alimento. 1.- INTRODUCCIÓN En el ámbito mundial, la contaminación de los alimentos es un problema de salud pública. Debido a los efectos que ésta ocasiona en la salud humana y animal, y a las pérdidas económicas asociadas para el sector agropecuario, en los países desarrollados se dedican innumerables esfuerzos a manera de investigaciones y legislaciones para combatirla (Nepusz et al., 2008). Las micotoxinas, metabolitos secundarios de algunos hongos filamentosos, son contaminantes comunes de alimentos como semillas y granos. En algunos países en vía de desarrollo, con sectores agrícolas poco desarrollados y con limitaciones en los sistemas de control y vigilancia, las dificultades causadas por las micotoxinas pueden llegar a afectar de manera importante. Por esto, la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO), ha divulgado desde hace algunos años, textos relacionados a la implementación de ciertas prácticas con el fin de disminuir la contaminación por micotoxinas. Entre ellos destacan el Sistema de Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (HACCP) en la prevención y el control de las micotoxinas, así como el Programa de la FAO para la Prevención y Control de las Micotoxinas (Cerf & Donnat, 2011; FAO, 2011). En México la documentación de información relacionada con los niveles de contaminación por micotoxinas en los alimentos es limitada debida a factores como: la falta de políticas sanitarias claras en relación a contaminantes naturales 1 de los alimentos, los pocos recursos disponibles para investigación, el reducido número de laboratorios tecnológicamente equipados para determinaciones especializadas y sus costos, la falta de estandarización de técnicas para análisis de laboratorio y de protocolos de muestreo, la sensibilidad de los métodos de cuantificación utilizados y el escaso número de profesionales con perfil de profundización en la materia (Arrúa-Alvarenga et al., 2012). Estudios pioneros en nuestro país sobre esta área se remontan a 1987 donde Torreblanca y colaboradores documentaron la presencia de micotoxinas como aflatoxinas y zearalanona usando cromatografía de capa fina en granos de maíz para masa nixtamalizada (Torreblanca et al., 1987). Estos estudios mostraron que granos destinados a consumo humano podían contener hasta 500 µg/kg de aflatoxinas, despertando un gran interés en la comunidad científica debido a los efectos carcinogénicos de este metabolito. Otros estudios contemporáneos al de Torreblanca, documentaron que la nixtamalización era capaz de reducir hasta en un 20% los niveles de aflatoxinas en las tortillas preparadas a partir de maíz contaminado (Carvajal et al., 1987). Estudios posteriores, como el realizado en la bodega “Las Yescas”, en el estado de Tamaulipas, en donde niveles de hasta 295 µg/kg fueron encontrados en muestras de maíz, resaltaron la importancia de las micotoxinas, de los posibles efectos económicos de la contaminación del maíz y de la falta de buenas prácticas de control en el almacenaje de este cereal (Carvajal & Arroyo, 1997). 2 Estudios más recientes revelan que niveles de contaminación de hasta 385 µg/kg de aflatoxinas pueden ocurrir en productos como tortillas de maíz colectadas en México (Castillo-Urueta et al., 2011). Todos estos estudios revelan que México ha tenido que lidiar con el problema de las micotoxinas por cerca de 20 años y que esta problemática es común y difícil de controlar. 3 1.1. OBJETIVO GENERAL Documentar y cuantificar la presencia de aflatoxina y fumonisina en masa obtenida de molinos del área metropolitana de Monterrey, y evaluar la eficacia de un aditivo mineral natural basado en arcilla esmectita para ligar y reducir la disponibilidad de ambas micotoxinas in vitro. 4 1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Ubicar un número representativo de expendios (molinos) en los cuales se ofrecía el servicio de molido de masa y venta de masa nixtamalizada. 2. Aplicar cuestionarios acerca de frecuencia del uso de ese servicio y del consumo de productos de maíz en general. 3. Determinar el contenido de aflatoxinas y fumonisinas totales mediante una prueba de anticuerpos (ELISA); así como AFB1 y FB1 por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). 4. Evaluar el efecto de adicionar a la masa un aditivo mineral basado en arcilla esmectita sobre la reducción de la disponibilidad de aflatoxinas y fumonisinas en la masa. 5 1.3. HIPÓTESIS Las aflatoxinas y fumonisinas están presentes en masa nixtamalizada de molinos y la adición de arcilla esmectita en esta masa reduce los niveles de ambas micotoxinas in vitro. Por consiguiente la exposición de ambas micotoxinas disminuirá en este alimento. 6 1.4. JUSTIFICACIÓN Cereales como el maíz, que son utilizados ampliamente en la alimentación humana y animal, sufren frecuentemente contaminación por algunos hongos que sintetizan micotoxinas, tales como aflatoxinas y fumonisinas. Estas micotoxinas pueden ocurrir en derivados de maíz tales como la masa nixtamalizada y pueden tener efectos importantes en la salud de sus consumidores. Es importante resaltar que aunque en México, la presencia de AFB1 ya ha sido documentada en algunos alimentos basados en maíz, la presencia de FB1 no ha sido adecuadamente investigada. De mayor importancia es encontrar estrategias que sean útiles para prevenir el riesgo de exposición a estas micotoxinas. Estas estrategias idealmente deben ser fáciles de implementar y de bajo costo, también deben ser culturalmente aceptables. En este sentido, la adición de arcilla esmectita en la masa constituye una tecnología con potencial para la reducción del riesgo a exposición de aflatoxinas y fumonisinas. 7 2.- REVISIÓN DE LITERATURA 2.1. Micotoxinas Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por algunos hongos, dentro de los cuales se encuentran como principales productores a especies de Aspergillus, Fusarium y Penicillium. Estos hongos frecuentemente colonizan y contaminan insumos que son utilizados en la alimentación humana y animal. Se cree que aproximadamente el 25 % de la producción de cereales a nivel mundial se encuentra contaminada con micotoxinas (CAST, 2003; Zain, 2011). Algunas micotoxinas son tóxicas para los humanos y animales aún en bajas concentraciones. Las micotoxicosis resultan principalmente por el consumo de alimentos contaminados, aunque también se han reportado casos de intoxicación a través de la piel, por tocar sustratos contaminados con cepas toxigénicas, o por inhalación de las esporas y fómites que contienen micotoxinas. Los síntomas de una micotoxicosis dependen de factores tales como el tipo de micotoxinas, la cantidad y la duración de la exposición, la edad, la salud y el sexo del individuo expuesto. La gravedad de la intoxicación por micotoxinas se puede aumentar mediante factores como deficiencias de vitaminas, bajo consumo de calorías, abuso del alcohol, enfermedades infecciosas, inmunosupresión, desnutrición y la interacción sinérgica con otras toxinas (Cano-Sancho et al., 2013; Bezerra da Rocha et al., 2014) 8 Los principales factores que influyen sobre la toxicidad de las micotoxinas en los humanos son: la cantidad, la biodisponibilidad, la toxicidad inherente, los sinergismos, la continuidad o intermitencia de ingestión, el peso del individuo, su estado de salud y su edad. Este último factor es muy relevante ya que los niños y los jóvenes son más susceptibles a la toxicidad de las micotoxinas debido a un mayor metabolismo basal y a que ellos pueden no tener suficientes mecanismos bioquímicos para la detoxificación (Kuiper-Goodman, 1995; Siloto et al., 2013). Existe una amplia variedad de micotoxinas que se pueden encontrar como contaminantes de granos de cereales, de las cuales, las más importantes son las aflatoxinas debido a su potencial carcinogénico. De las aflatoxinas más estudiadas, la aflatoxina B1 (AFB1) (Figura 1) es la más frecuente en alimentos y la más tóxica para los mamíferos. La AFB 1 es uno de los carcinógenos más potentes conocidos en la naturaleza y es clasificado como carcinógeno humano del grupo 1 por la Agencia Internacional de Investigación sobre Cáncer (IARC, 2012; Matsuda et al., 2013). Además, esta toxina es hepatotóxica, teratogénica y mutagénica, causando daños como la hepatitis tóxica, hemorragias, edema, inmunosupresión y el carcinoma hepatocelular (IARC, 2012; Reddy, 2009). 9 Figura 1.- Estructura química de la AFB1. 2.2. Aflatoxinas La palabra aflatoxina (AF) proviene de la primera letra “A” que define al género Aspergillus, seguida de las tres letras “fla” correspondiente a la especie flavus y el sustantivo “toxina” que significa veneno (Ellis et al., 1991). En particular Aspergillus flavus y A. parasiticus, los mayores productores de aflatoxinas, son contaminantes comunes en la agricultura. A. bombycis, A. ochraceoroseus, A. nomius y A. pseudotamari también son especies productoras de aflatoxinas, pero son encontrados con menor frecuencia (Giray, 2007; Klich-Maren, 2007). Los hongos Aspergillus se caracterizan por no producir conidióforos septados y pueden producir cierto tipo de conidias llamadas esclerotias que tiene función de espora, dándole resistencia en la adversidad de climas como desecación o congelamiento, o bajo condiciones de carencia de nutrientes (García-Cela, 2012; Marin et al., 2013). Las especies de Aspergillus son de distribución mundial, pudiendo crecer en una gran variedad de condiciones ambientales y sobre una 10 gran cantidad de alimentos. La presencia de este hongo no necesariamente implica presencia de aflatoxinas pues hay cepas no toxigénicas. Sin embargo, la ausencia visible del hongo en el alimento no necesariamente implica que el alimento no tenga aflatoxinas, debido a que la toxina puede persistir aún después de que el hongo ha desaparecido, e incluso después de la cocción del alimento (Wiemann & Keller, 2013). Las aflatoxinas fueron por primera vez aisladas y caracterizadas en Inglaterra después de la muerte de más de 100,000 pavos a causa de una patología denominada la enfermedad “X” que ocurrió en la década de los 60 y que fue asociada con el consumo de productos de cacahuete contaminados (Fountain et al., 2014; Wogan, 1966). Dentro de las AF más comunes se encuentran la AFB 1, AFB2, AFG1 y AFG2 (Figura 2); esta clasificación se basa en los colores de fluorescencia emitidos con luz ultravioleta y designados como “B” para azul y “G” para verde de acuerdo con su origen del Inglés “blue” y “green”, y a la movilidad cromatográfica relativa en capa fina (Degola et al., 2012). La AFB1 es la más importante ya que está clasificada como carcinógeno del grupo I por la International Agency for Research on Cancer (IARC). Las demás aflatoxinas (M1, M2, P1, Q1, aflatoxicol, etc.) ocurren como productos metabólicos de sistemas microbianos o animales pero no ejercen una toxicidad elevada. 11 Las toxinas tipo B se caracterizan por la fusión de un anillo ciclopentanona a un anillo lactona de la estructura cumarina (Figura 2), mientras las toxinas G contienen un anillo lactona fusionado en lugar del anillo ciclopentanona (IARC, 2012; Nicolas-Vazquez et al., 2010; Suarez-Bonnet et al., 2013). Figura 2.- Estructuras químicas de las aflatoxinas más comunes tomado de (Marin et al., 2013). Estas aflatoxinas pueden estar presentes en algunos cereales desde antes y después de la cosecha. La rapidez y el grado de contaminación dependen directamente de diferentes factores tales como la temperatura, la humedad, actividad del agua, micobiota concurrente, daño físico de los granos o semillas, así como las condiciones de almacenamiento de estos (EFSA, 2007). Algunos 12 estudios han reportado que los nutrientes y el tipo de sustrato son factores importantes para la producción de aflatoxinas, la cual es estimulada por un alto nivel de carbohidratos y un bajo nivel de proteínas, ya que los carbohidratos proveen los carbonos precursores para la síntesis de la toxina. Por esta razón, el maíz, es un buen sustrato para la producción de aflatoxinas debido a su alto contenido de carbohidratos y bajo contenido de nitrógeno (Viquez et al., 1994). La AFB1 es tóxica para una amplia gama de especies animales y aunque es principalmente un hepatocarcinógeno y hepatotoxina, puede causar otros efectos como inmunosupresión, anemia, reducción de la tasa de crecimiento, disminución de la producción de leche y huevo, reducción de la fertilidad, de la utilización del alimento y de la eficiencia alimenticia. Se ha demostrado que AFB1 induce el carcinoma hepatocelular en muchas especies de animales, incluidos los peces (trucha arco iris, salmón rojo y guppy), aves (pavos, patos, y gansos), primates no humanos (rhesus, macaco de Java, verde africano, y la ardilla monos) y los roedores (ratas, ratones y musarañas de árbol) (Rawal et al., 2010; Siloto et al., 2013). El efecto tóxico de las aflatoxinas en animales se divide en dos tipos: agudo y crónico. El primer tipo se manifiesta como una hepatitis aguda, con fiebre, depresión, inapetencia y diarrea. El segundo tipo se manifiesta como un hepatocarcinoma y los síntomas como vómito, dolor abdominal y hepatitis se van presentando paulatinamente hasta causar la muerte (Eaton et al., 2010; Wild & Gong, 2010). 13 La exposición a aflatoxinas se produce principalmente por ingestión de comidas contaminadas. La inhalación de estas toxinas también puede suceder ocasionalmente debido a exposición de tipo laboral. Dentro de los efectos de las aflatoxicosis agudas en los seres humanos se encuentran vómitos, dolor abdominal, edema pulmonar, coma, convulsiones, hígado graso, edema cerebral severo, así como afectaciones a riñón y al corazón (Goossens et al., 2012; Mary et al., 2012; Rawal et al., 2010). 2.3. Mecanismo de acción y metabolismo de las aflatoxinas El mecanismo de acción tóxica de las aflatoxinas, involucra la formación de ligandos entre uno de sus metabolitos (producido en el hígado luego de la ingestión de la toxina), con el ADN de los hepatocitos, causando alteraciones en su replicación (Wild & Turner, 2002). La ruta de activación es la conversión de AFB1 en el metabolito AFB1-8,9-epóxido por los citocromos P-450 (CYP-450). La formación del epóxido requiere la presencia de un doble enlace entre los carbonos C8-C9, por esta razón las aflatoxinas B2 y G2 son prácticamente atóxicas en comparación con las aflatoxinas B1 y G1 (Eaton et al., 2010). En mamíferos las funciones de los CYP-450 están bien descritas, pero la información es limitada en aves de corral, especialmente en el contexto del metabolismo de AFB1. Los CYP-450 son oxidasas de función mixta que catalizan la biotransformación de una amplia variedad de xenobióticos. Ellos son una superfamilia de hemoproteínas que ayudan en la oxidación de diversos sustratos 14 tales como esteroides, eicosanoides, productos farmacéuticos, plaguicidas, contaminantes y carcinógenos (Gross-Steinmeyer & Eaton, 2012; Rawal et al., 2010). Para que la acción tóxica de la aflatoxina ocurra es necesario que ésta tenga un cambio metabólico, el cual ocurre cuando la AFB 1 llega al hígado de los organismos que la ingieren. Dicho cambio ocurre en las células hepáticas, y es causado por los CYP-450 microsomales a través de una reacción en la que participan oxígeno y las enzimas dependientes del NADPH localizadas en el retículo endoplásmico. Así, una vez absorbida la AFB1 desde el tracto digestivo llega al tejido hepático donde pasa por dos fases de biotransformación: Fase I: por acción de enzimas específicas del tipo CYP-450 (principalmente la CYP1A2, 2A6 y 3A4) que producen derivados reducidos y oxidados, algunos de ellos con actividad carcinogénica. Uno de los productos del metabolismo en esta Fase I es el compuesto AFB1 exo-8,9-epóxido, el cual es altamente inestable y se une con alta afinidad a la guanina (GUA) reaccionando covalentemente con el ADN para formar aductos AFB1-GUA (Figura 3) responsables de los efectos carcinogénicos y mutagénicos de las aflatoxinas. La velocidad de generación de este metabolito activo es dependiente de la dosis, aumentando cuando la dosis de aflatoxina disminuye. El aducto, que ha sido identificado como el 8,9 -dihidro-8(N7-guanil)-9-hidroxiaflatoxina B1 (AFB1-N7-guanidina) no es removido del ADN debido a que su anillo imidazol se abre y forma una molécula más estable química y biológicamente, la AFB1-formamidopirimidina (AFB1-FAPY), que puede causar 15 errores en las transcripciones subsecuentes del ADN. Este compuesto puede estar presente por más de una ronda de replicación del ADN, y se sugiere que es muy importante durante la iniciación del tumor, ya que da lugar a una transversión G → T en la tercera base del codón 249 del gen p53. La persistencia del aducto AFB1-FAPY en tejido hepático y la formación de tumores se han demostrado en varios modelos experimentales (Eaton et al., 2010; Groopman et al., 2005; GrossSteinmeyer & Eaton, 2012; Guarisco et al., 2008; Guarisco et al., 2008; Smela et al., 2001; Wild & Gong 2010). Figura 3.- Formación del aducto aflatoxina B1 y la guanina del ADN. Tomado de (Wild & Turner, 2002). Fase II: El metabolismo de AFB1 incluye también a aquellas reacciones de conjugación enzimática que inactivan al 8,9-epóxido, el cual puede hidrolizarse espontáneamente a 8,9 dihidrodiol, o bien puede conjugarse con glutatión formando un aducto con este tripéptido (AFB1-SG). Este compuesto se forma por la acción catalítica de enzimas de la superfamilia glutatión S-transferasas (GTS). 16 El conjugado AFB1-SG es el metabolito biliar más abundante y es excretado en la orina (Figura 4). Algunas investigaciones han reportado que la inclusión de antioxidantes en la dieta, aumentan los niveles de GTS, y han mostrado una mayor eliminación de AFB1-SG en la orina de los animales tratados. De ahí que el tipo de dieta de una población podría ser determinante en su respuesta a la ingestión de alimentos contaminados con AFB1 (Groopman et al., 2005; Guarisco et al., 2008; Moudgil et al., 2013; Wild & Turner, 2002). 17 AFB1 1A2 1A2 1A2 3A4 3A5 3A4 3A5 AFM1 GST AF-ENDO 8,9-Epóxido AF-EXO 8,9-Epóxido AFQ1 AF-S-G ADN AF-Dihidrodiol AF-Dialdehído AF-Ácido Mercaptúrico ADN AF-Dialcohol 7 AF-N -Guanina AF-Albúmina AF-Glucorónido Sangre periférica Orina Figura 4.- Ruta metabólica de AFB1 que conduce a metabolitos y biomarcadores. 1A2:CYP1A2; 3A4:CYP3A4; 3A5:CYP3A5; GST:glutation S-transferasa; AFAR:Aflatoxin-aldehído reductasa; Aflatoxin-S-G:aflatoxin–glutation conjugado (Wild & Turner, 2002). 18 2.4. Fumonisinas Las fumonisinas son otras micotoxinas que frecuentemente contaminan el maíz y que han ganado importancia reciente. Estas toxinas son producidas por los hongos Fusarium verticilloides y Fusarium proliferatum. Se estima que el 59 % del maíz y sus productos a nivel mundial se contaminan con fumonisinas, entre las cuales se encuentran FA1, FA2, FB1, FB2, FB3 y FB4. Se considera que en los granos de maíz, FB2 y FB3 se producen simultáneamente con FB1 (Figura 5), siendo ésta la más tóxica, y por consiguiente clasificada dentro del grupo 2 B de la IARC (Domijan, 2012). La FB1 es la fumonisina más prevalente, ya que se ha reportado su presencia en alrededor de 70 a 80% del contenido de fumonisinas totales. La fumonisina FB1 contiene una cadena larga de hidrocarburos, similar a la esfinganina y esfingosina. La FB2 difiere de FB1 sólo por la ausencia del grupo hidroxilo en C10. La FB3 difiere de FB1 por la ausencia del grupo hidroxilo en C 5, y FB4 carece tanto de los grupos hidroxilo en C5 como C10 (Grenier et al., 2012; Zain, 2011). La FDA recomienda que las fumonisinas totales en la alimentación humana deben limitarse a 4 ppm (FDA, 2001). Figura 5.- Estructura química de FB1. 19 2.5. Mecanismos de toxicidad de las fumonisinas Los efectos tóxicos de las fumonisinas van desde la hepatotoxicidad y la toxicidad renal, hasta efectos específicos de la especie animal, tales como edema pulmonar en cerdos, leucoencefalomalacia en caballos y tumores en ratas. En los seres humanos, la exposición a fumonisinas se ha relacionado con el cáncer de esófago y defectos en el desarrollo del tubo neural. El efecto en el intestino ha sido menos investigado, pero las alteraciones de las vellosidades, reducen la expresión de mediadores inmunes y se ha detectado un aumento en la colonización intestinal por bacterias patógenas oportunistas en lechones (Gelderblom & Marasas, 2012; Gelderblom et al., 2008; Marasas, 2004; Voss, 2007). La FB1 afecta los principales procesos celulares, tales como el crecimiento y la diferenciación celular, la apoptosis y el estrés oxidativo. Algunos autores han demostrado que FB1 tiende a ser carcinogénica tanto en el hígado como en el riñón, debido a la interrupción de la biosíntesis de los esfingolípidos (Mary et al., 2012) ya que FB1 es altamente polar, por lo que atraviesa la membrana plasmática probablemente a través de transportadores de aminoácidos, y es capaz de interactuar con estructuras subcelulares alterando la función celular. Esta toxina es resistente a las condiciones de temperatura y preparación de alimentos que normalmente se utilizan en el sector agroalimentario y por lo tanto representa un riesgo significativo para la salud humana y animal (Scott, 2012). Se estima que el promedio de rango de consumo diario para humanos de FB1 varía entre 12 y 140 ppm; sin embargo, en regiones geográficas donde el maíz es el principal alimento (por ejemplo, Sudáfrica), su consumo puede llegar hasta 2500 ppm (Lombard et 20 al., 2014). Si bien el mecanismo citotóxico de FB1 se atribuye a la interrupción del metabolismo de los esfingolípidos, sus mecanismos subyacentes específicos para la promoción de cáncer aún son desconocidos (Karuna & Rao, 2013). La toxicidad de FB1 Hidrolizada (HFB1) no está bien documentada, reportes in vitro e in vivo, indican que la HFB1 tiene una capacidad limitada para inhibir la acción de la ceramida sintetasa (Voss et al., 2009). En los mamíferos, la concentración de esfingosina es, por lo general, de 3 a 5 veces más elevada que la de esfinganina. La esfinganina N-aciltransferasa y la esfingosina N-aciltransferasa o ceramida sintetasa son enzimas fundamentales en el metabolismo de la biosíntesis de los esfingolípidos (Voss, 2007; Voss et al., 2009). Las fumonisinas pueden alterar la concentración y la proporción entre la esfinganina y la esfingosina de forma que se disminuye la biosíntesis de la esfingosina y se acumula esfinganina. Estas micotoxinas pueden, en células eucarióticas, bloquear la biosíntesis de los esfingolípidos complejos, que son la base de formación de mensajeros secundarios que controlan los diferentes procesos entre células tales como la activación y desactivación de proteínas específicas y la expresión genética (Frisvad, 2007; Gelderblom et al., 2008). La acumulación de esfinganina y esfingosina es una causa principal de la toxicidad de la fumonisina B1, ya que ambas pueden ser citotóxicas, y tienen efectos inhibidores del crecimiento, además de que estas bases esfingoides inducen la apoptosis. El aumento de la apoptosis parece jugar un papel importante en los efectos tóxicos, incluyendo la inducción de tumores. Sin embargo, se debe mencionar que la reducción de la concentración de la ceramida y el aumento de la 21 concentración de esfingosina-1-fosfato pueden también dar lugar a una inhibición de la apoptosis y promueve la mitosis y la regeneración celular (Bondy et al., 2012; Gelderblom & Marasas, 2012; Lazzaro et al., 2012). 2.6. Papel de las aflatoxinas y fumonisinas como carcinógenos El carcinoma hepatocelular (CHC), es la sexta causa principal de muertes por cáncer en el mundo (Persson et al., 2012). De los 550,000-600,000 nuevos casos reportados cada año a nivel mundial, se estima que entre 25,000 y 155,000 se pueden atribuir a exposición a aflatoxinas. La mayoría de los casos ocurren en África, sudeste asiático y China, cuyas poblaciones además tienen alta prevalencia de Hepatitis B Viral (HBV) y existen pocos controles en la contaminación de alimentos por aflatoxinas y fumonisinas (Domijan, 2012; Liu, 2010; Pizzolitto et al., 2012). Ambas micotoxinas, AFB1 y FB1 se han relacionado al desarrollo de CHC actuando como promotor de cáncer y carcinógeno completo, respectivamente (Sozmen et al., 2013). Por otra parte, para FB1, se ha propuesto que la inhibición de la producción de ceramida sintetasa podría conducir a una reducción de la apoptosis y supervivencia de células con ADN dañado, a un incremento en la estimulación de la división celular y al aumento de la regeneración celular que por consiguiente fomentan la carcinogénesis. Sin embargo se sabe muy poco, sobre los efectos de FB1 en los seres humanos y las investigaciones se han llevado a cabo mayormente en roedores. Algunos estudios ecológicos han reportado correlaciones entre FB1 en los tipos de alimentos y el carcinoma de células 22 escamosas locales del esófago y cáncer de hígado, pero los estudios ecológicos proporcionan sólo una débil evaluación de cualquier carcinógeno. Un único estudio epidemiológico utilizando un biomarcador de la exposición individual no encontró ninguna asociación con el riesgo de cáncer de estómago o esofágico (Domijan, 2012; Persson et al., 2012). 2.7. Estrategias para reducir la exposición a aflatoxinas y fumonisinas Se han desarrollado varias estrategias para reducir la exposición a las aflatoxinas, algunas de ellas basadas en el uso de agentes químicos como el ozono (McKenzie et al., 1998) y otras que promueven la conjugación de las toxinas para ser eliminadas por orina (Wang et al., 1999). Algunas estrategias han sido implementadas como tecnologías propias de la preparación de alimentos de maíz, por ejemplo la nixtamalización. La eficacia de este proceso ancestral para reducción de aflatoxinas ha sido muy controversial, ya que algunos autores han documentado que la alcalinización con hidróxido de calcio solo afecta estructuralmente a la molécula, abriendo sus anillos de lactona reduciendo su fluorescencia, sin embargo una vez que la toxina alcanza ambientes ácidos tales como los encontrados en el jugo gástrico durante la digestión de alimentos, ésta recobra su estructura original y toxicidad (Elias-Orozco et al., 2002; Guzman-dePena et al., 1995; Nicolas-Vazquez et al., 2010). Para el caso de las fumonisinas, el tratamiento alcalino del maíz contaminado, escinde mediante hidrólisis el ácido tricarbalílico de las cadenas laterales de FB 1 que conducen a la formación de la HFB1. Esta conversión de FB1 a HFB1 también se puede obtener por la degradación microbiana, a través del uso de carboxilesterasas de fumonisinas, 23 enzimas específicas del catabolismo de FB1 (Heinl et al., 2010; Murphy et al., 1996). 2.8. Uso de arcillas como enteroadsorbentes Constantemente se están buscando nuevas estrategias para reducir la presencia de micotoxinas en los alimentos. Un enfoque prometedor y práctico parece ser la adición, a alimentos contaminados, de materiales adsorbentes no nutritivos, tales como aluminosilicatos naturales del tipo esmectita (p. ej. montmorillonita, bentonita) (Daković et al., 2008). Desde la época de los 70’s se ha impulsado el uso de arcillas naturales, tales como la montmorillonita (Figura 6), ya que se encuentran ampliamente distribuidas en todo el mundo. Mediante investigaciones con arcillas realizadas en países como EE.UU., Japón, México, India, China y Argentina, se ha observado que estas arcillas son promisorias para secuestrar aflatoxinas y propiciar con ello la reducción de su toxicidad (Deng et al., 2010; Phillips et al., 2006). 24 Figura. 6.- Estructura tridimiensional del alumniosilicato (Marroquín Cardona et al., 2009). Las bentonitas son arcillas minerales resultantes de la descomposición de cenizas volcánicas, compuestas principalmente de esmectitas. Reciben este nombre por sus propiedades de expansión y deshidratación. Existen seis tipos de esmectitas pero las más abundantes en la naturaleza y las más efectivas como adsorbentes de aflatoxinas son las montmorillonitas. Estas arcillas tienen la capacidad de reducir efectivamente la biodisponibilidad de AFB1 y FB1 que se encuentra en los alimentos contaminados (Daković et al., 2010; Marroquín Cardona et al., 2009; Vekiru et al., 2007). Muchas bentonitas se han probado en numerosos ensayos de alimentación animal en especies como pollos, pavos, patos, cerdos, corderos, visones, truchas, tilapias, vacas lecheras y cabras (Deng et al., 2010). Estudios clínicos en los que la arcilla comercial NovaSil (BASF, Alemania) fue añadida a la dieta humana, a 25 niveles altos y bajos, tuvieron resultados prometedores en la reducción de biomarcadores de exposición. En estos estudios, las concentraciones del aducto aflatoxina B1-albúmina en muestras de sangre y de la aflatoxina M1, un metabolito de la aflatoxina B1 presente en la orina, fueron reducidos de manera dependiente de la dosis de arcilla (Afriyie Gyawu et al., 2008 a; Afriyie Gyawu et al., 2008 b; Phillips et al., 2008; Wang et al., 2008). Algunos autores han discutido la mineralogía y las propiedades químicas de las bentonitas, relacionadas con la adsorción de aflatoxinas. Para esto se establecieron protocolos para modificar las esmectitas o zeolitas con cationes inorgánicos, amonio cuaternario orgánico, y fosfatidilcolina, para aumentar la capacidad de adsorción a través de los minerales y con ello reducir los niveles de las aflatoxinas. Así mismo se ha investigado la interferencia de otros ingredientes alimentarios en la harina de maíz respecto a la adsorción de aflatoxinas, con el fin de seleccionar o modificar esmectitas que desintoxican efectivamente aflatoxinas y mejorar la selectividad de las mismas para su uso en piensos. El mecanismo molecular de la interacción de la aflatoxina y la esmectita también ha sido investigado (Deng et al., 2010; Dixon et al., 2008; Jaynes et al., 2007), sin embargo no existe hasta ahora un mecanismo aceptado que pueda considerarse como único. Algunas investigaciones sugieren que las superficies basales externas, los bordes y el espacio entre las capas son los posibles sitios de adsorción de aflatoxinas, mientras que otras basados en la simulación computacional y 26 observaciones realizadas en experimentos, concluyen que la adsorción se produce sólo en las superficies de borde externo y que el espacio entre capas es inaccesible para las toxinas. Otros estudios sugieren que la integridad de los espacios interlaminares (capas) son indispensable para la adsorción ya que al colapsar la arcilla (p. ej. NovaSil) con calor de hasta 800 grados Celsius, se reduce la adsorción de aflatoxinas de manera significativa. Los autores designaron este mecanismo quimisorción selectiva (Deng & Dixon 2002; Desheng, 2005; Phillips et al., 2002; Phillips et al., 1995). Algunos autores han sugerido mecanismos de acción que involucran interacciones del tipo ion-dipolo y puentes de hidrógeno entre los grupos carbonilo de la toxina y los cationes intercalados en el espacio intralaminar (Deng & Szczerba, 2011), mientras que otros han propuesto modelos de unión, tales como un modelo de donante - receptor de electrones (Phillips et al., 2006; Phillips et al., 2002); así como la quelación de los dos grupos carbonilo con borde incoordinado de aluminio (Smith et al., 1994). Para fumonisina, se han reportado posibles mecanismos de acción de las arcillas tales como la adsorción de la toxina en la capa superficial de la arcilla. Un posible mecanismo de acción que se ha sugerido tiene que ver con la protonación del grupo amino en el C2 de la molécula que ocurre en las condiciones ácidas del estómago. Esta protonación carga positivamente a la fumonisina haciendo que se ligue a la superficie interlaminar negativa de la arcilla (Robinson et al., 2012). 27 A través de estos posibles mecanismos descritos para ambas toxinas, la arcilla es capaz de adsorber las micotoxinas durante su paso por el tracto gastrointestinal de animales y seres humanos, reduciendo así la biodisponibilidad de las mismas hacia la sangre y otros órganos (Marroquín-Cardona et al., 2011). 28 3.- MATERIALES Y MÉTODOS Para la primera fase se localizaron expendios de masa nixtamalizada (molinos) representativos del área metropolitana de Monterrey, en total se encontraron diez para cada uno de los siguientes municipios: Monterrey, Apodaca, San Nicolás de los Garza, Guadalupe, Santa Catarina y General Escobedo; para el municipio de San Pedro Garza García, sólo se encontraron dos expendios de masa nixtamalizada, resultando así un total de sesenta y dos molinos muestreados. Así mismo se aplicó un cuestionario (ver Anexo No. 8.1.) para documentar el proceso de nixtamalización que se utilizaba en los molinos o de qué manera la población prepara la masa que ahí se procesa, así mismo se consideró conocer la frecuencia de consumo de los diferentes productos de maíz que existen. Los resultados de este cuestionario fueron sometidos a un análisis estadístico no paramétrico usando la prueba de alfa de Cronbach, el cual demuestra la confiabilidad de estos instrumentos bajo este análisis (Cabello & Chirinos, 2012). 29 La fórmula de este análisis consiste en lo siguiente: [ ∑ ∑ ] α= alfa de Cronbach K= Número de ítems Vi= Varianza de los ítems Vt= Varianza total 3.1. Preparación de las muestras Una vez ubicados los molinos, se procedió a colectar muestras de masa nixtamalizada. Cada muestra consistió en 500 g de masa, la cual fue sometida a un proceso de secado en una estufa de aire forzado, a temperatura de 65° C durante 48 horas. Una vez deshidratada, la masa fue pulverizada en un molino marca THOMAS-WILEY® (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) modelo 4 con tamiz interno de 1 mm y tamizada usando un tamiz de la marca FISHERBRAND® (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) modelo No. 20 con 850 µm de apertura. El resto de la masa fue congelado a -20 °C para futuros análisis. 30 3.2. Inmunoensayos para aflatoxinas y fumonisinas totales Para la extracción de las aflatoxinas se realizaron los procedimientos descritos en el manual del estuche comercial de AgraQuant® de los laboratorios Romer (Singapore Pte. Ltd.) para detección de aflatoxinas totales. Las muestras para extracción consistieron en 20 g de masa previamente deshidratada y tamizada. La solución de extracción (70:30 metanol:agua) se preparó tomando 70 mL de metanol grado ACS (Jalmek, México) y 30 mL de agua bidestilada, para tener un total de 100 mL para cada muestra. Las mezclas de muestra más solución de extracción fueron licuadas durante tres minutos a alta velocidad en una licuadora convencional, para posteriormente filtrar la mezcla a través de papel filtro Whatman (GE, Healtcare; UK) No. 1. El filtrado que se obtuvo fue utilizado para los analisis de micotoxinas correspondientes. 3.2.1. Extracción de aflatoxinas y fumonisinas El estuche comercial AgraQuant® es un ELISA directamente competitivo en el cual las aflatoxinas extraídas de las muestras y las micotoxinas controles competirán con las aflatoxinas conjugadas a enzimas por los sitios de unión disponibles de los anticuerpos que se encuentran recubriendo los pocillos de dilución. El estuche consta de una solución de conjugado, cinco viales que contienen soluciones concentradas de aflatoxinas (controles), una solución de sustrato que contiene la enzima para la reacción colorimétrica, que desarrolla un color azul, y la solucion bloqueadora o de alto encargada de detener la reacción colorimétrica de la unión del sustrato con el conjugado. El resultado colorimétrico 31 es inversamente proporcional a la concentración de aflatoxinas en la muestra o en los controles. 3.2.2. Procedimientos Se utilizaron placas de 48 ó 96 pocillos de dilución. Para la curva de calibración, en los pozos respectivos se depositaron por separado 100 μL de cada una de las soluciones control, que incluían concentraciones de 0, 4, 10, 20 y 40 µg/mL (ppb) de aflatoxinas totales. Después se agregaron 100 µL de la solución previamente extraída de cada muestra, para posteriormente adicionar 200 µL de la solución de conjugado a cada uno de estos pocillos. Después de esto, la solución en cada pocillo se mezcló en tres ocasiones usando una micropipeta, y se tomaron 100 µL que fueron colocados en pocillos recubiertos con anticuerpos y se dejó reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, éstos se voltearon para desechar el sobrenadante y se enjuagaron cinco veces con 300 μL de agua destilada. Al terminar, a cada pozo se le colocaron 100 µL de la solución sustrato y se dejó actuar durante cinco minutos. Posteriormente se aplicaron 100 μL de la solución bloqueadora o de alto y cinco minutos después se colocó la placa con pocillos en un espectrofotómetro lector de placas de ELISA Chromate® Microplate Reader (Awareness Technology Inc. Palm City, FL, USA) para su lectura a 450 nm de longitud de onda. Las densidades ópticas obtenidas fueron usadas para cuantificar la concentración de aflatoxinas totales en base a la curva de calibración. 32 Para la cuantificación de fumonisinas totales se utilizó un estuche comercial de la misma marca AgraQuant®, cuyo procedimiento consistió en colocar en cada pocillo la cantidad de 100 µL de los patrones de control con concentraciones de 0, 0.25, 1, 2.5 y 5 ppm de fumonisinas totales, así como de las soluciones extraídas de las muestras. Después de esto, se agregaron 200 µL del conjugado en cada pocillo con la solución de titulación o la muestra y se mezclaron con una pipeta tres veces para obtener 100 µL de esta solución, la cual fue colocada en los pocillos recubiertos con anticuerpos para fumonisinas. Se dejó incubar durante diez minutos a temperatura ambiente; y se voltearon para permitir desechar el sobrenadante. Posterior a esto, se enjuagaron con 300 µL de agua destilada. Después se colocaron 100 µL de la solución sustrato y se dejó actuar durante cinco minutos. Posteriormente se añadieron 100 μL de la solución bloqueadora o de alto; para finalmente, cinco minutos después se colocó la placa con pocillos dentro del espectrofotómetro lector de ELISA y se realizó la lectura a una longitud de onda de 450 nm con el fin de cuantificar las fumonisinas totales en base a su densidad óptica. 33 3.2.3. Medición de pH de las muestras de masa La medición del pH de las muestras se realizó con el objetivo de verificar las condiciones de alcalinidad residual de las muestras ya que la alcalinidad afecta la detección de aflatoxinas. El equipo usado para medición de pH fue un potenciómetro de la marca ThermoScientific® Orion Star A Series (Waltham, MA, USA) con sus estándares respectivos. Para la medición del pH de las muestras se prepararon suspensiones con 2 g de masa deshidratada y 10 mL de metanol. Esto se realizó simulando las proporciones de masa y metanol usados para las extracciones de micotoxinas. Las suspensiones fueron agitadas en un agitador Vibrax® Vxr Basic (IKA, Wilmington, USA) por 30 segundos y el pH fue medido inmediatamente después. 3.3. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Los análisis de HPLC fueron realizados en el Texas Veterinary Diagnostic Lab (TVMDL) ubicado en College Station, Texas. Las muestras de masa deshidratada (cerca de 60-80 g) fueron enviadas a través de FedEx. Solo se enviaron las muestras que resultaron con niveles que excedían los límites permisibles de aflatoxinas y fumonisinas. A continuación, se describen brevemente los materiales y la metodología empleada para las extracciones de micotoxinas y su análisis con HPLC. 34 3.3.1. Extracción de micotoxinas para HPLC La AFB1 fue extraída siguiendo las recomendaciones del manual de extracción de VICAM. Brevemente, 50 g de muestra de masa pulverizada, 5 g de cloruro de sodio y 100 mL de solución de metanol:agua [80:20] fueron colocados en una licuadora. La mezcla fue licuada por 1 minuto a alta velocidad. La mezcla fue después pasada a través de papel filtro. Un volumen de 10 mL del filtrado fue después diluido y mezclado con 40 mL de agua desionizada ultra pura. Esta dilución fue filtrada a través de filtros de microfibra. El filtrado (10mL) fue después pasado a través de una columna de inmunoafinidad Aflatest™ (VICAM, Watertown, MA, USA) con una velocidad de 1-2 gotas por segundo. Posteriormente, un volumen de 10 mL de agua desionizada ultra pura fue pasado a través de la columna para enjuagarla. Este procedimiento se repitió una vez. Por último, la AFB1 fue eluida de la columna con 1 mL de metanol y colectada. Posteriormente, 1 mL de agua fue adicionado a la AFB 1 eluida. Esta solución fue usada para inyección en el HPLC (ver condiciones de HPLC en 3.3.2). La extracción de FB1 se realizó de manera idéntica a la de AFB1 para el proceso de licuado. En el proceso de dilución se adicionaron 40 mL de PBS en vez de agua. Posteriormente, 10 mL de filtrado fueron pasados a través de columnas de inmunoafinidad Fumonitest™ (VICAM, Watertown, MA, USA). Un volumen de 10 mL de PBS fue transferido a la columna para enjuagarla con una velocidad de 1-2 gotas por segundo de flujo. Después, 1.5 mL de metanol fueron usados para eluir la FB1 que fue colectada en una cubeta de vidrio. Esta solución fue usada para el HPLC (ver condiciones de HPLC en 3.3.1). 35 3.3.2. Separación cromatográfica Metanol, acetonitrilo, hidróxido de sodio, borato de sodio, cianuro de sodio, fosfato de potasio dibásico, nafatleno-2,3-dicarboxaldehído (NDA) fueron adquiridos grado HPLC. Los estándares de aflatoxina y fumonisina fueron adquiridos de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Agua ultrapura estéril (18 MΩ) fue obtenida a través de un sistema de filtración. La AFB1 fue cuantificada usando HPLC de fase reversa. El sistema de detección consistió en un equipo con detector de fluorescencia (Waters 2475), un reactor fotoquímico para aumentar la detección (PHRED-12) (Aura Industries, Inc, New York, NY), una bomba binaria (Waters 1525) y un automuestreador (Waters 717). Una columna de fase reversa Spherisorb® (Waters, Milford Massachusetts) C18 con 5µm de tamaño de partícula (4.6 x 150 mm, Waters) se usó para separar la AFB1 de la solución. Las longitudes de onda usadas para emisión y excitación fueron 360 y 420 nm, respectivamente. La cuantificación fue determinada usando las medidas de área debajo de la curva usando el software Breeze™ HPLC (Waters, Milford Massachusetts) comparando con los estándares apropiados. Los estándares y las muestras (100 µL) fueron colocados en el automuestreador para su análisis. La fase móvil consistió acetonitrilo/metanol/agua en proporción de 57:41:2 con una velocidad de flujo de 1.0 mL/min. El tiempo de corrida fue de 19 min con un volumen de inyección de 10 µL. Bajo estas condiciones la AFB1 muestra un tiempo de retención de 16 min. 36 Para la detección de FB1 se empleó NDA como agente derivatizador ya que esta molécula no emite fluorescencia. El método de derivatización empleado se basa en investigaciones previas de Bennet y Richard (1994), de acuerdo a las cuales NDA forma un complejo estable con la FB 1 que no se degrada rápidamente y permite el re-análisis de muestras. Para la detección de FB1, el sobrenadante obtenido de las extracciones (1mL) se colocó en tubos de 40 mL color ámbar. Un volumen de 1 mL de amortiguador de borato de sodio [0.05M] fue adicionado al vial, seguido de 0.5 ml de cianuro de potasio (0.13 mg/mL) y 0.5 mL de NDA (0.25 mg/mL). Los viales fueron cerrados, agitados en un vórtex y colocados en un baño de agua caliente a 60°C por 20 min. Después, los frascos fueron colocados en un refrigerador a 4°C durante 4 minutos. Seguido de esto, 7 mL de solución de acetonitrilo:fosfato 60:40 se añadieron a cada frasco para posteriormente ser agitados. De esta solución, 1.5 mL fueron pasados a través de filtros de jeringa de 0.25 µm y el filtrado fue colectado en un frasco de 2 mL para inyección en el HPLC. Estándares apropiados fueron usados y derivatizados de la misma manera que las muestras. La FB1 también fue detectada con HPLC fase-reversa usando una columna µBondapack™ C18 (Waters, Milford Massachusetts) con 10 µm de tamaño de partícula (3.9x150mm, Waters). Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron establecidas a 420 y 500 nm, respectivamente. La fase móvil consistió en una solución de acetonitrilo, agua: ácido acético en proporción 57:42:1 con una velocidad de flujo de 1.0 mL/min. El tiempo de corrida fue de 8 min con un 37 volumen de inyección de 10 µl. Los tiempos de retención exhibidos para fumonisina variaron entre 4.7 y 5.8 min bajo estas condiciones. 3.4. Inclusión de la arcilla en la masa de nixtamal Para verificar si la adición de arcilla podría tener un efecto en la reducción de aflatoxinas y fumonisinas, se realizó un estudio preliminar en el que arcilla NovaSil Plus® (Selko, The Netherlands) fue adicionada al 2% (0.4 g) en cada muestra de 20 g de masa nixtamalizada (en polvo), y se mezclaron mediante agitación en un frasco de plástico. Para este estudio se usaron las muestras de masa nixtamalizada que resultaron con niveles superiores a los límites permisibles bajo la NOM-188-SSA1-2002 (12 µg/kg). Posterior a la adición y mezclado de la arcilla con la masa, se realizó la extracción metanólica y se utilizó el estuche comercial de ELISA de AgraQuant® para aflatoxinas y fumonisinas, con el mismo procedimiento anteriormente mencionado (ver sección 3.2.2. Procedimientos) en la cuantificación de niveles de ambas micotoxinas para su análisis por ELISA. 38 3.5. Análisis estadístico Los resultados de los estudios de las pruebas de ELISA para determinar las concentraciones preliminares de ambas micotoxinas fueron analizados con el software PAST 3.X (Øyvind Hammer, Natural History Museum, University of Oslo), mediante pruebas de Kruskal-Wallis y Mann-Whitney para comparar los resultados de aflatoxinas y fumonisinas totales en los diferentes municipios. Los datos obtenidos del estudio preliminar de efectividad de la arcilla fueron evaluados mediante la prueba de T, utilizando el software mencionado anteriormente. 39 4.- RESULTADOS 4.1. Resultados de los cuestionarios aplicados de consumo de maíz El cuestionario de consumo de productos de maíz fue revisado por tres nutriólogos y fue sometido a la prueba de alfa de Cronbach para su validación como instrumento en el aspecto de consistencia de las preguntas. Se realizó también una prueba piloto en la que 10 cuestionarios fueron respondidos antes de la aplicación final para revisar la redacción y claridad de las preguntas. No se tuvieron que hacer ajustes al instrumento después de la prueba piloto. En la prueba de consistencia del cuestionario, la cual está relacionada con la fiabilidad del instrumento, se registró un valor de alfa de 0.85. Si el valor de alfa (α) es igual o superior a 0.8, el diseño del instrumento en cuanto a consistencia es aceptable, La ecuación de la prueba de alfa de Cronbach y su resolución para este estudio fue la siguiente: ∑ ∑ [ ] [ ] [ ( ] )( ) 40 Dónde: α= valor de Alfa de Cronbach K= número de encuestas aplicadas ∑Vi =varianza del número de encuestas ∑Vt= varianza total Los resultados de las encuestas de consumo de productos de maíz evidenciaron que los productos de mayor consumo por la población fueron la tortilla y la tostada. En cuanto al conocimiento acerca del proceso de nixtamalización, los datos muestran que poca gente conoce el método ancestral y el procedimiento específico varía de molino a molino. Las preguntas con sus respuestas más frecuentes se presentan en la Tabla 1. 41 Tabla 1. Respuestas más frecuentes del cuestionario de consumo de productos de maíz. ¿Con qué frecuencia consume en el desayuno cereal de maíz? Respuesta más frecuente 1 vez por semana ¿Con qué frecuencia consume elotes (vaso o entero)? 1 vez al mes ¿Con qué frecuencia consume frituras de maíz? 1 vez al mes ¿Qué tan frecuentemente consume tortillas? 2-3 veces al día ¿Cuántas tortillas consume en cada comida? 2-5 tortillas ¿Qué tan frecuentemente consumes productos de maíz preparado en molino? 1 vez al mes ¿Preparas tu propio maíz y lo traes al molino o lo compras? Lo compra preparado en molino ¿Conoce la historia del proceso de nixtamalización? No ¿Consumes maicena u otro atole que lleve maíz? Si ¿Con qué frecuencia por semana? 1 vez por semana ¿Consume usted algún otro producto elaborado con maíz? ¿Cuál? (otras opciones: gorditas, palomitas, sopes, tamales) Si, tostadas ¿Con qué frecuencia? 1 vez por semana Pregunta Cuestionario revisado y avalado por profesionistas en nutrición. Prueba de alfa de Cronbach fue usada para validar el instrumento (alfa=0.85). 42 4.2. Resultados de cuantificación de micotoxinas por ELISA Los resultados de las pruebas de ELISA realizadas para la detección de micotoxinas demostraron la presencia de aflatoxinas y fumonisinas en la mayoría de las muestras. Del total de 62 muestras, 52 muestras resultaron con cantidades detectables de aflatoxinas y 50 muestras con niveles detectables de fumonisinas. Del total, solo 5 muestras excedieron los límites para aflatoxinas establecidos en la NOM-188-SSA1-2002 (12 µg/kg) y para fumonisina 8 muestras excedieron los límites establecidos por la FAO (4 mg/kg). El municipio con la mayor cantidad de muestras positivas para el caso de aflatoxinas fue Guadalupe, para fumonisinas fue General Escobedo. En la Tabla 2 se presentan los resultados (medianas y otros valores estadísticos descriptivos) de concentraciones de aflatoxinas distribuidos por municipio. Tabla 2. Estadística descriptiva de aflatoxinas totales por municipio. Rangos Ciudad Apodaca Gral. Escobedo Guadalupe Monterrey San Nicolás San Pedro Santa Catarina Medianas 2.3a 0.0b 2.8a 2.4a 2.7a 9.9ab 3.9a Inferior Superior 0.0 0.0 2.2 0.0 0.0 0.5 1.1 16.9 6.3 22.6 9.8 16.1 19.2 6.6 n 10 10 10 10 10 02 10 Medianas con distintos superíndices denotan diferencias significativas (P<0.05) usando pruebas de KruskalWallis y Mann-Whitney. 43 Para el caso de fumonisinas totales, en la Tabla 3 se exponen los valores estadísticos, indicando las diferencias detectadas con los modelos estadísticos utilizados. Los valores de cada muestra analizada para ambas micotoxinas (aflatoxinas y fumonisinas totales) se presentan en el Anexo 8.3. Tabla 3. Estadística descriptiva de fumonisinas totales por municipio. Rangos Ciudad Apodaca Gral. Escobedo Guadalupe Monterrey San Nicolás San Pedro Santa Catarina Mediana 2.5a 1.3b 0.3b 0.7bc 0.3bc 0.0c 0.1c Inferior 0.0 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Superior 10.1 16.7 1.5 4.2 3.0 0.0 3.3 n 10 10 10 10 10 02 10 Medianas con distintos superíndices denotan diferencias significativas (P<0.05) usando pruebas de KruskalWallis y Mann-Whitney. Los valores de cada muestra analizada para ambas micotoxinas (aflatoxinas y fumonisinas totales) se presentan en el Anexo 8.3. 44 4.3. Resultados de la medición de pH La medición del pH de las muestras fue relevante ya que la alcalinidad residual del proceso de nixtamalización puede afectar los resultados de cuantificación por ELISA. En este sentido los niveles de pH determinados oscilaron en un rango de 5.34 a 7.55; con esto se demostró que las muestras se encontraban ligeramente ácidas o neutras al momento de realizar las extracciones para la determinación por ELISA. Estas condiciones de pH no afectan la cuantificación de aflatoxinas ni fumonisinas por el método de ELISA. 4.4. Resultados de cuantificación de micotoxinas por HPLC Las muestras que excedieron los niveles permisibles de aflatoxinas y fumonisinas mediante ELISA fueron también analizadas con HPLC para verificar la presencia de AFB1 y FB1, los congéneres de aflatoxinas y fumonisinas más importantes y tóxicos. En este sentido, los resultados de la cuantificación por HPLC se presentan en la Tabla 4. Ninguna de las muestras que por ELISA mostraban niveles elevados de aflatoxinas y fumonisinas registró niveles que excedieran los límites permisibles de la NOM-188-SSA1-2002 al ser analizadas por HPLC. EL valor más alto de AFB1 (6.1 ppb) fue registrado para una muestra del municipio de Guadalupe. Mientras que para fumonisina, las muestras con niveles más altos de esta micotoxina (1.2 ppm) resultaron provenientes del municipio de Apodaca y Monterrey. 45 Tabla 4. Concentraciones de aflatoxina B1 y fumonisina B1 de muestras que excedieron los niveles permisibles mediante ELISA. Toxina Aflatoxina (µg/kg) Fumonisina (mg/kg) Muestra No. 16 22 23 39 50 08 16 19 54 56 57 59 61 Concentración de micotoxinas totales (ELISA) 16.9 16.1 18.5 22.6 19.1 10.1 4.3 4.2 4.7 13.5 16.6 9.7 8.5 Concentración de AFB1/FB1 (HPLC) No detectado 1.9 5.5 6.1 1.7 1.2 0.8 1.2 1.0 0.9 0.9 0.7 1.0 El método utilizado fue por cromatografía líquida de alta resolución HPLC con detector de fluorescencia. 4.5. Resultados de la inclusión de la arcilla en la masa de nixtamal Se realizó un estudio preliminar para determinar si la inclusión de arcilla esmectita en las masas pulverizadas era efectiva en la reducción de aflatoxinas y fumonisinas. Para esto, se seleccionaron las masas que habían resultado con niveles que excedían los límites permisibles de ambas micotoxinas de acuerdo a la NOM-188-SSA1-2002 y la FDA. Las micotoxinas fueron cuantificadas mediante ELISA. Los resultados mostraron que la inclusión de arcilla al 2% fue capaz de reducir hasta en un 91% los niveles de aflatoxinas y de hasta 82% de fumonisinas (Tablas 5 y 6). 46 Tabla 5. Eficacia de la arcilla esmectita en la reducción de aflatoxinas en masa. No. de muestra 16 22 23 39 50 Masa (AF totales μg/kg) 16.9 16.1 18.4 22.6 19.1 Masa + arcilla (AF totales μg/kg) 1.4* 2.9* 1.8* 5.6* 3.8* Porcentaje de reducción (%) 91 82 90 75 80 *Resultados significativamente diferentes al primer análisis de acuerdo a la prueba de T (P<0.05). Sin embargo, en el caso de las fumonisinas, en tres de las muestras adicionadas con arcilla se registró un incremento en el nivel de fumonisinas, con respecto al nivel de estas toxinas en las muestras sin adición de arcilla esmectita (Tabla 6). Tabla 6. Eficacia de la arcilla esmectita en la reducción de fumonisinas en masa. No. de muestra 8 16 19 54 56 57 59 61 Masa (FB totales mg/kg) 10.1 4.3 4.2 4.7 13.5 16.6 9.7 8.5 Masa + arcilla (FB totales mg/kg) 1.7 8.1* 1.3 6.0* 3 15.7 23.4* 6.9 Porcentaje de reducción (%) 83 NA 69 NA 78 5 NA 19 NA: No aplica (La concentración de fumonisinas fue superior comparado al primer análisis). * Valores superiores comparados con el primer análisis. Resultados no fueron significativamente diferentes al primer análisis de acuerdo a prueba de T (P>0.05). 47 5.- DISCUSIÓN La contaminación de alimentos basados en maíz ha sido reportada previamente en México por algunos autores como Valdivia-Flores y colaboradores (1999), quienes ya han evidenciado la presencia de aflatoxinas en maíz para consumo humano en nuestro país. Torreblanca y colaboradores (1987) realizaron estudios pioneros en molinos del área de la Ciudad de México colectando muestras de maíz y tortillas de estos establecimientos. En sus resultados se reportó la presencia de aflatoxinas en un 72% de los molinos muestreados, con 64% de las muestras rebasando los límites permitidos por las legislaciones mexicanas en aquella época (> 20 µg/kg). En el presente estudio, el 82% de un total de 62 molinos muestreados demostraron niveles detectables de aflatoxinas, aunque sólo el 8% de las muestras superaron el límite permitido actual (12 µg/kg) por las legislaciones mexicanas. En nuestro estudio, el rango de niveles aflatoxinas totales obtenidos mediante pruebas de ELISA fue de 0 a 22.6 µg/kg. Otros estudios, como el realizado en Tamaulipas en el año de 1989 en el que se analizaron muestras de maíz recién cosechado, han documentado niveles de contaminación de entre 68 y 102 µg/kg de aflatoxinas. Así mismo, investigaciones en maíz blanco y amarillo recién cosechado en siete municipios del norte del estado de Tamaulipas, encontraron niveles de contaminación que variaban de 34 µg/kg a 125 mg/kg (Guzmán de Peña, 1989). Ninguno de nuestros resultados fue similar a los de estos estudios realizados en maíz recién cosechado. Sin embargo, nuestros datos 48 sí son similares a los niveles bajos de AFB1 que han sido reportados históricamente por Guzmán de Peña (1977). Este autor analizó muestras de alimentos basados en maíz de diversos estados de la República y reportó concentraciones de AFB1 que variaron entre 0.32 y 465.31 μg/kg (Guzmán de Peña, 1997). En este sentido, los niveles menores a los límites permisibles para AFB1 y aflatoxinas totales (< 20 µg/kg) pueden no representar un problema significativo de salud pública. Sin embargo, aún los niveles bajos pueden potencialmente representar un riesgo para poblaciones vulnerables como lo son los infantes, mujeres embarazadas y personas con deficiencias para el metabolismo de las aflatoxinas. Así mismo, aunque las cantidades de estas toxinas parecen ser bajas en estos alimentos, el alto consumo de ellos y otros alimentos que contienen aflatoxinas puede incrementar las dosis a las que la población se expone. Para el caso de fumonisinas, existen reportes del año 1999 por RobledoMarenco y colaboradores (2012) en el estado de Nayarit en donde se realizaron estudios con maíz forrajero para consumo humano y animal que era producido en 20 municipios. En ese estudio se encontraron niveles detectables de FB1 en el 100% de las muestras con concentraciones promedio de 2.54 ± 2.2 mg/kg, estos niveles son mucho más altos que los encontrados en nuestro estudio donde los niveles de FB1 variaron entre 700 y 1200 µg/kg de masa. También se ha reportado la presencia de fumonisinas en algunas especies de maíz híbrido en México por Reyes-Velazquez y colaboradores (2011) en donde se analizaron en total 28 muestras de siete híbridos de maíz fresco, y se reportaron concentraciones de FB1 49 de entre 13.8 - 4,860 μg/g, lo cual puede representar riesgos considerables a la salud pública ya que exceden los límites de 4 ppm ó 4 µg/g. En otros países en desarrollo se ha investigado la co-ocurrencia de ambas micotoxinas, AF y FB, en alimentos. Por ejemplo Kimanya y colaboradores en 2014 en Tanzania, analizaron muestras de harina de maíz mediante HPLC, y mostraron que las AF totales variaron entre 0.11 - 386 ppb (media de 0.91 ppb), mientras que la AFB1 estuvo en un rango de concentración de 0.53 - 364 ppb (media de 1.27 ppb). Para FB totales se obtuvieron rangos de 0.06 - 2.28 ppm y un promedio de 0.36 ppm mientras que para FB1 se reportó un rango entre 0.05 1.67 ppm y un promedio de 0.32 ppm. Estos resultados son parcialmente similares a los revelados en nuestro estudio donde se obtuvieron rangos de 0.3 ppb a 22 ppb para AF totales y de 1.7 - 6.1 ppb para AFB1, mientras que para FB totales se registraron rangos de 0.1 - 17 ppm y de 0.7 - 1.2 ppm para FB1. En resumen, los niveles bajos de ambas micotoxinas en ambos estudios fueron muy similares. Sin embargo, los niveles altos de las micotoxinas fueron diferentes en ambos estudios. Una pregunta difícil de contestar es que tan relevante es la exposición a estos niveles de micotoxinas y si esto es de importancia en salud pública. En este sentido, con los datos obtenidos en el presente estudio y considerando que el consumo de masa nixtamalizada se usa principalmente para la elaboración de tamales, se pudiera realizar un cálculo de los niveles a los que se expondría un individuo si consumiera una ración de masa de 500 g, lo equivalente a una ración de 4 o 5 tamales. De esta manera, usando el nivel máximo de consumo por 50 kilogramo de peso (PMTDI) para un adulto promedio de 70 kg establecido por la WHO (1 ng de AF/kg de peso corporal), se pueden cotejar con los niveles a los que un individuo se expone en México en algunas situaciones, tal como se presentan en la Tabla 7. De esta manera, usando el PMTDI para AF, el máximo nivel tolerable para un adulto de 70 kg sería 70 ng por día. Suponiendo que esta persona consume 500 g de la masa más contaminada (22.6 µg/kg), esta persona estaría consumiendo (22.6 x 0.5)/70 = 0.16 µg de AF por kg de peso corporal, es decir 161 ng por kg de peso corporal, cuando lo tolerable para ella es de 70 ng. Tabla 7.-Cantidades de AF y FB posibles en una ración de 500 g de masa. Método ELISA HPLC Min Máx Cantidad posible en una comida Min Máx AF totales (µg/kg) 0.3 22.6 0.15 µg 11.3 µg FB totales (mg/kg) 0.1 16.7 0.05 mg 8.35 mg AFB1 (µg/kg) 1.7 6.1 0.85 3.05 µg FB1 (mg/kg) 0.7 1.2 0.35 0.6 mg Toxina Rango detectado Los rangos mínimos presentados son las cantidades mínimas detectadas que son diferentes a cero. 51 Para FB, el máximo nivel provisional establecido de exposición diaria es de 2 µg/kg de peso corporal. Entonces para una persona de 70 kg el nivel máximo tolerable diario seria de 140 µg totales. En nuestro estudio, en el escenario del consumo de la masa más contaminada (16.7 mg/kg) con esta toxina esta persona estaría consumiendo 8.35 mg diarios, lo equivalente a 119 µg por kilogramo de peso por día, claramente sin exceder el límite máximo provisional. En nuestro estudio, el rango de peso de los encuestados fue de 44-105 kg; dependiendo de su nivel de consumo de alimento, algunas de ellas pueden estar ingiriendo mayor cantidad de micotoxinas por kg de peso corporal de lo que indica la WHO como PMTDI. De acuerdo a la WHO, la exposición a ambas micotoxinas, AF y FB, debe tratar de eliminarse o mantenerse al mínimo. Estrategias capaces de reducir ambos niveles de micotoxinas en los alimentos son altamente deseables. En este sentido y de acuerdo con varios autores (Dixon et al., 2008; Mitchell et al., 2013; Phillips et al.,2008) la inclusión de arcillas basadas en esmectitas es una alternativa para reducir los niveles de algunas micotoxinas. De manera particular es interesante comparar los resultados del presente trabajo con los de Jaynes y colaboradores (2007), quienes emplearon NovaSil® (2-2.5%) en soluciones de harina de maíz altamente contaminada y agua; la arcilla fue capaz de reducir considerablemente estos niveles de contaminación. En el presente trabajo, cinco muestras que excedían los niveles máximos permitidos en México para AF (12 ppb) y ocho muestras que excedían los niveles de FB (4 ppm) permitidos por la FAO, fueron adicionados con arcilla NovaSil al 2% y la eficacia de esta adición fue 52 evaluada mediante ELISA. Para el caso de AF se observó una reducción de AF en todas las muestras contaminadas (n=5), teniendo un rango de reducción desde un 75 a un 91.3%. En el caso de FB se observó un rango de reducción que varió entre el 5.3 al 82.4% en solo cinco de las muestras contaminadas con FB. En las 3 muestras restantes contaminadas con FB se observó un aumento en la cantidad de FB detectada. Este aumento fue de 27.5 hasta 140.9% comparado con los niveles detectados en la masa sin arcilla. Jaynes y colaboradores (2007) muestran resultados similares a los nuestros con respecto a la eficacia de la arcilla en cuanto a la reducción de AF en harina de maíz, y sugieren que posiblemente el metanol que se usa para la extracción de las micotoxinas interactúe con la arcilla y esta no pueda adsorber la AF en un 100%. En cuanto a nuestras observaciones con FB, estudios in vitro realizados por Brown y colaboradores (2012) han demostrado que la arcilla NovaSil es capaz de adsorber FB aunque en un grado menor que para AF. Esto también ha sido demostrado en estudios in vivo reportados por Robinson y colaboradores (2012) en donde los participantes de Ghana consumieron cápsulas de arcilla NovaSil por un período de tres meses y los niveles de FB en orina fueron reducidos de manera significativa debido al tratamiento con la arcilla. Sin embargo, más estudios son requeridos para conocer a detalle el mecanismo específico de la arcilla sobre la FB y poder explicar las posibles causas de los resultados observados en nuestro estudio. 53 6.- CONCLUSIONES 1. Aflatoxinas y fumonisinas están presentes a niveles detectables en muestras de masa nixtamalizada de molinos del área metropolitana de Monterrey. 2. Usando métodos de ELISA, 5 de las 62 muestras analizadas excedieron los límites permitidos para AF en México, y 8 de las 62 muestras analizadas excedieron los límites de FB permitidos por la FAO internacionalmente. Usando HPLC, ninguna de las muestras excedió los límites permisibles recomendados en México o establecidos por la FAO para AFB 1 y FB1, respectivamente. Sin embargo, considerando los PMTDIs establecidos por la WHO, algunas muestras pueden aun presentar un riesgo para poblaciones vulnerables. 3. En los estudios de eficacia in vitro, la arcilla esmectita fue capaz de reducir significativamente (P<0.05) los niveles de AF en la masa nixtamalizada. Para FB, los resultados muestran un patrón que sugieren que la arcilla puede ser efectiva para reducir FB en masa nixtamalizada. Sin embargo los resultados no fueron significativos en el caso de esta micotoxina (P> 0.05) y más estudios son requeridos para explicar este fenómeno. 54 7.- LITERATURA CITADA Afriyie Gyawu, E., Ankrah, N., Hueber, H., Ofosuhene, M., Kumi, J., Johnson, N., Phillips, T. (2008 a). NovaSil clay intervention in Ghanaians at high risk for aflatoxicosis: I Study desing and clinical outcomes. Food Additional Contamination, 76-87. Afriyie Gyawu, E., Wang, Z., Ankrah, N.-A., Xu, L., Johnson, N., Tang, L., Phillips, T. (2008 b). NovaSil clay dpes nos affect the concentrations of vitamins A and E and nutrien minerals in serum samples from Ghanaians at high risk for aflatoxicosis. 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Describa el procedimiento de nixtamalización que utiliza? _________________________________________________ Estatura: _______________ 5. Edad: ___________________ 16. ¿Consumes maicena u otro atole que lleve maíz? a) Sí b) No 6. ¿Con qué frecuencia consume en el desayuno de cereal de maíz? a) 1 plato Día Semana Mes Año b) 2 platos Día Semana Mes Año c) 3 platos Día Semana Mes Año d) Más de 3 platos Día Semana Mes Año 7. ¿Con que frecuencia consume elotes (vaso o enteros)? a) 1 vaso/elote Día Semana Mes b) 2 vasos/elotes Día Semana Mes c) 3 vasos/elotes Día Semana Mes d) Más de 3 vasos/ Día Semana Mes Año elotes 8. ¿Con que frecuencia consume frituras de maíz (sabritas, por mencionar una)? a) 1 bolsa Día Semana Mes Año b) 2 bolsas Día Semana Mes c) 3 bolsas Día Semana Mes Año d) Más de 3 bolsas Día Semana Mes Año Año Año Año Año 9. ¿Qué tan frecuentemente consume tortillas? a) 1 vez Día Semana b) 2-3 veces Día Semana c) 4-5 veces Día Semana d) Más de 6 veces Día Semana Mes Mes Mes Mes Año 10. ¿Cuántas tortillas consumes en cada comida? a) 1 b) 2-5 c) 5-10 d) Más de 10 17. ¿Con que frecuencia por semana? a) 1 vez b) 2-3 veces c) 4-5 veces d) Más de 6 veces 18. Consume usted algún otro producto elaborado con maíz? a) Si b) No Describa cual: _________________________ 19. Con que frecuencia a) 1 vez Día Semana Mes Año b) 2-3 veces Día Semana Mes Año c) 4-5 veces Día Semana Mes Año d) Más de 6 veces Día Semana Mes Año Como parte de esto se entregará un folleto o poster que describa el proceso de nixtamalización y su historia. Certificó que he entendido el presente cuestionario y se explicó cada una de las preguntas, que no he realizado este cuestionario previamente y que las respuestas brindadas son reales. Nombre: ____________________________Firma: __________________ Fecha:____________ Año Año Año 63 8.2. Mapa de los molinos del área metropolitana. 64 8.3. Concentraciones de aflatoxinas y fumonisinas totales por ELISA. Municipio Apodaca Muestra 5 7 8* 13 15 16** 17 18 44 54* AF totales (µg/kg) 4.2 2.4 1.7 2.1 1.3 16.9 1.4 9.1 7.9 0.0 FB totales (mg/kg) 3.0 1.0 10.1 2.7 0.3 4.3 2.0 2.3 0.0 4.7 Gral. Escobedo 9 10 11 55 56* 57* 58 59 60 0.0 0.0 1.2 2.8 0.0 6.2 0.0 0.3 0.0 0.1 0.0 0.0 0.1 13.5 16.6 0.2 9.7 2.3 61 0.0 8.5 14 23* 24 25 39* 40 41 42 43 62 19* 20 26 27 28 29 30 31 32 53 2.2 18.4 2.4 3.0 22.6 2.7 2.1 2.7 3.7 2.8 1.8 2.3 1.8 1.0 2.5 3.0 3.3 9.7 3.8 0.0 1.5 0.3 0.5 0.3 0.3 0.0 0.0 0.4 0.0 0.2 4.2 0.3 0.2 0.0 0.2 2.7 1.4 2.1 0.0 1.2 Guadalupe Monterrey 65 8.4.Cont. Concentraciones de aflatoxinas y fumonisinas totales por ELISA. Municipio San Nicolás de los Garza Santa Catarina San Pedro Garza García Número de muestra 1 2 3 4 6 12 21 22* 38 52 Aflatoxinas totales (µg/kg) 3 1.2 2.2 4.6 6.4 1.4 2.0 16.1 8.3 0 Fumonisinas totales (mg/kg) 0.1 0.1 0.1 2 2.9 0.2 2.9 2 0 0.3 33 34 35 36 37 45 46 47 48 49 50* 51 1.1 1.4 1.4 2.6 3.8 4.4 3.9 6.6 4.6 6.6 19.1 0.5 0.1 3.3 0 0 0.3 0 0 0.2 0 1.4 0 0 Resultados superiores a 12 µg/kg para el caso de AF y 4 mg/kg para el caso de FB; **Muestra que contiene niveles superiores en ambas micotoxinas a los límites permitidos. (El método utilizado fue un ELISA indirecto, con un lector de micro Elisa a una longitud de onda de 450 nm y un filtro de 2 630 nm. Curva de calibración con un coeficiente de correlación de R =0.9998. 66