Libro de resumenes 2013 - Instituto de Investigaciones Biológicas

PÓSTERS
ÁREAS TEMÁTICAS
I.
BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA ESTRUCTURAL
II.
BIOTECNOLOGÍA
III.
BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS
IV.
BIOFÍSICA
V.
NEUROCIENCIAS
VI.
PARASITOLOGÍA MOLECULAR
VII. INMUNOLOGÍA Y BASES BIOQUÍMICAS DE LA INFLAMACIÓN
VIII. GENÉTICA, GENÓMICA Y BIOINFORMÁTICA
IX.
BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR ANIMAL
XI.
RADICALES LIBRES
BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA ESTRUCTURAL (1-14)
1.
META-ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE GENÉNICA APLICADO AL
ESTUDIO DE LA PROGRESIÓN DE LOS TUMORES Y LA
ADMINISTRACIÓN DE GLUCOCORTICOIDES
Mario Huerta1, José Fernández-Márquez2, Jose Luis Cabello2, Alberto
Medrano2, Enric Querol1, Juan Cedano3
1
Institut de Biotecnologia i Biomedicina, Universitat Autònoma de Barcelona,
España; 2Escola Tècnica Superior de Ingenieria, Universitat Autònoma de
Barcelona; España; 3 Laboratorio de Inmunología “Dr. Alberto Nieto” Regional
Norte-Salto (UDELAR)
Las bases de datos Microarrays contienen información biológica muchas veces
despreciada por no contar con las herramientas de análisis apropiadas. Hemos
desarrollado herramientas que intentan sacar la máxima información de
relevancia biológica de estas microarrays estudiando las interdependencias
entre los fenotipos. Estas interdependencias se obtienen por la detección de
relaciones de expresión no lineales donde cada fluctuación en la relación
implica un cambio de fenotipo y cada tipología de relación implica una
interdependencia de fenotipo específica. Como consecuencia, los cambios de
fenotipo múltiples se identifican junto con los genes implicados. Finalmente,
cruzamos los resultados obtenidos con las bases de datos biomédicas para
contextualizar los genes objetivo de estudio y su función celular.
El efecto de la administración de los glucocorticoides en oncología sirve para
ilustrar la utilidad de estas herramientas para responder preguntas complejas.
Usando estas herramientas, hemos buscado la razón oculta para los efectos
opuestos en la progresión tumoral de ciertos agentes estresantes como la
dexametasona. Esta razón oculta ha resultado estar asociada con el tipo de
progresión del tumor dependiendo de su tejido originario.
Como conclusión, hemos encontrado un primer tipo de progresión tumoral, en
el que el tejido puede producir nuevas células mientras es sometido a estrés y
por lo tanto los agentes estresantes pueden acentuar su proliferación. En el
segundo tipo, el estrés celular y proliferación del tumor son antagonistas, por lo
tanto, los agentes estresantes paran la proliferación del tumor. Esta forma de
proliferar parece reflejarse en la estructura celular del tejido originario.
2.
TOXICIDAD DE ESPECIES OLIGOMÉRICAS DE LA PROTEINA SINUCLEÍNA
C. Chavarría1, Souza J.M.1
Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Departamento de
Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad de la República
La proteína alfa-sinucleína (-syn) es el principal componente fibrilar de los
cuerpos de Lewy y la agregación de esta proteína representa un evento crítico
en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson y otras sinucleinopatías. La
cinética de fibrilización de -syn consiste en un proceso dependiente de
nucleación, que involucra reorganizaciones estructurales que conducen a la
formación de fibras de -syn. La transformación de proteínas amiloidogénicas
desde el estado monomérico a la formación de agregados fibrilares progresa a
través de diferentes especies intermediarias. En el proceso de agregación de
-syn participan: el monómero desplegado, los oligómeros o protofibrillas y las
fibras tipo amiloíde. Evidencias recientes sugieren que los oligómeros, más que
los agregados fibrilares, son las especies responsables de la toxicidad de syn.
En este trabajo, fueron purificadas especies fibrilares y oligoméricas de -syn y
se analizaron sus características estructurales. La pureza de la preparación fue
evaluada por geles de poliacrilamida nativos. La morfología de las especies
intermediarias de -syn fue analizada utilizando microscopía de fuerza atómica.
Fue evaluada la toxicidad de dichas especies utilizando un modelo de células
de neuroblastoma humano SH-SY5Y. El cultivo celular fue incubado con fibras
y oligómeros de -syn durante dos días y luego fue determinada la viabilidad
celular utilizando citometría de flujo. Se demostró que la toxicidad de los
oligómeros de -syn duplica la de las fibrillas de -syn. Este trabajo contribuye
a la comprensión del mecanismo de toxicidad inducida por los oligómeros de syn, el cual aún permanece sin resolverse completamente. Apoya FCE-ANII6260.
3.
EFECTO DE LA HIPERPOLARIZACIÓN DEL POTENCIAL DE
MEMBRANA PLASMÁTICA SOBRE LA ANGIOGÉNESIS Y LA
PROGRESIÓN TUMORAL IN VIVO
L. Fajardo1, F. Evans1, P. Lagos2, S. Chifflet1
1
Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina; 2Departamento de
Fisiología, Facultad de Medicina
La angiogénesis es un proceso esencial en la transformación maligna, el
crecimiento tumoral y la producción de metástasis. La proliferación, la
migración y la invasión de la matriz extracelular de las células endoteliales
constituyen eventos necesarios para la angiogénesis. Estos procesos requieren
el debilitamiento de las uniones celulares. Resultados previos de nuestro
laboratorio indican que la hiperpolarización del potencial de membrana
plasmática (HPMP) provoca la estabilización de las uniones celulares,
inhibición de la velocidad de migración, proliferación e inducción de “sprouting”
en células de endotelio de aorta de bovino y de melanoma en cultivo.
Asimismo, se ha reportado que, en general, las células tumorales tienden a
estar más despolarizadas que su contrapartida diferenciada. Estos
antecedentes permiten especular que la HPMP podría inhibir la angiogénesis y
la progresión tumoral in vivo. En este trabajo evaluamos el efecto de la HPMP
sobre la angiogénesis de la membrana corioalantoidea (CAM) del embrión de
pollo y sobre la progresión de melanomas implantados en ratones. Para ello, se
provocó la HPMP por medio de la incorporación de valinomicina. Se calculó el
grado de angiogénesis en la CAM mediante análisis de imagen y se midieron
los tamaños de los tumores de los ratones luego de su extracción. Se encontró
que la HPMP provoca: a) la inhibición de la vascularización en la CAM, y b) la
reducción del tamaño de melanomas implantados en ratón. Estos resultados
sugieren que la inducción de una HPMP podría constituir una estrategia para la
inhibición de la progresión tumoral.
4.
IDENTIFICACIÓN DE NUEVOS INTERACTORES DE PknG DE
Mycobacterium tuberculosis
M. Gil1, A. Lima1, A. Denicola2, C. Batthyány1,3, R. Durán1
1
Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Institut Pasteur de
Montevideo/Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable;
2
Laboratorio de Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad de
la República, 3Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad
de la República.
Mycobacterium tuberculosis, el agente etiológico de la tuberculosis, constituye
un grave problema de salud pública a escala global. La aparición de cepas
resistentes y la baja eficiencia de las drogas actuales, en casos de infecciones
crónicas o subclínicas, hace imprescindible la identificación de nuevas
moléculas que permitan el desarrollo de terapias alternativas. El estudio de
factores de virulencia y su mecanismo de acción a nivel molecular es una de
las estrategias para el diseño racional de drogas. En los últimos años ha
cobrado gran relevancia el estudio de PknG, una quinasa de proteínas que
regula procesos críticos del metabolismo micobacteriano así como vías de
señalización en los macrófagos infectados. En base a lo anteriormente
expuesto se planteó la búsqueda de interactores proteicos de PknG tanto en el
macrófago como en la micobacteria. Se realizó un abordaje experimental del
tipo purificación por afinidad/espectrometría de masa que incluyó: la unión
covalente de PknG a una resina comercial, la incubación de la resina con un
extracto total de macrófagos J774A.1 o de M. smegmatis y la elución específica
de sustratos y/o interactores. Las proteínas eluídas se identificaron por
espectrometría de masa de tipo nano-LC-trampa iónica de alta sensibilidad
usando una aproximación de tipo shotgun. A partir del análisis bioinformático se
generó una lista de posibles interactores de PknG, se seleccionaron algunos
candidatos de interés y se comenzó recientemente con la validación in vitro.
5.
ESTUDIO ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA QUINASA MPK4 DE
LEISHMANIA: HACIA EL DISEÑO DE NUEVOS FÁRMACOS
J. A. Imelio1, S. Horjales1, A. Correa2, G. Spaeth3, A. Buschiazzo1
1
Unidad de Cristalografía de Proteínas, Institut Pasteur de Montevideo; 2Unidad
de Proteínas Recombinantes, Institut Pasteur de Montevideo; 3Unidad de
Parasitología Molecular y Señalización, Institut Pasteur Paris, Francia.
Las Ser/Thr protein quinasas (STPKs) son moléculas ubicuas involucradas en
la transducción de señales de procariotas y eucariotas. En los últimos años,
han sido empleadas como blanco terapéutico de importantes enfermedades
como cáncer, inflamación y diversas infecciones parasitarias. Nuestro trabajo
se ha centrado en MPK4, una proteína quinasa activada por mitógeno de
Leishmania, un protozoo parásito de la familia Trypanosomatidae y agente
etiológico de la leishmaniasis. Es una proteína esencial en L. mexicana por lo
que resulta un interesante blanco para el desarrollo de drogas antileishmánicas. Nuestro objetivo consiste en producir, purificar y cristalizar la
MPK4 recombinante de L. major para luego realizar estudios estructurales. Se
clonó MPK4 en el vector de expresión pQE80 de E. coli. Tras realizar ensayos
de expresión en distintas cepas y condiciones de inducción se logró expresar
MPK4 aunque mayoritariamente en forma insoluble. Con el fin de aumentar su
solubilidad, se clonó el gen de MPK4 en un vector que permite su expresión
como fusión a la proteína disulfuro isomerasa DsbC. MPK4 fusionada a DsbC
se expresó soluble con muy buen rendimiento. Se purificó DsbC-MPK4 por
cromatografía de afinidad y gel filtración. Se realizaron rastreos de condiciones
de cristalización con DsbC-MPK4. Hasta el momento los cristales identificados
no difractaron los rayos X. Estamos trabajando en mejorar los protocolos de
purificación y encontrar condiciones de clivado de la proteína de fusión, sin que
precipite MPK4 para lograr mejorar la homogeneidad y calidad de la proteína y
así poder realizar una nueva búsqueda de condiciones de cristalización.
6.
CARACTERIZACIÓN DEL EFECTO DE PknG DE Mycobacterium
tuberculosis SOBRE LA MADURACIÓN DE FAGOSOMAS MURINOS
A.Lima1, M. Gil1, M. Portela1,2, M. N. Álvarez3, C. Batthyány1,3, R. Durán1.
1
Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Institut Pasteur de Montevideo
e IIBCE, 2Facultad de Ciencias (UdelaR), 3Departamento de Bioquímica,
Facultad de Medicina (UdelaR).
Mycobacterium tuberculosis es capaz de sobrevivir en macrófagos del
hospedero mediante la inhibición del proceso de maduración de fagosomas. Se
ha postulado que la Ser/Thr-quinasa PknG de M. tuberculosis cumple un papel
importante en este proceso ya que micobacterias deficientes en PknG
muestran un fenotipo atenuado y son rápidamente degradadas en fagosomas
maduros. Sin embargo, aún no se conoce el mecanismo mediante el cual PknG
ejercería este efecto. En este trabajo nos planteamos estudiar, a nivel celular y
molecular, el efecto de PknG aislada en la maduración fagosomal. Para esto,
desarrollamos un modelo de fagocitosis utilizando macrófagos tratados con
partículas de látex cargadas con PknG activa, inactivada o proteínas control. El
efecto de la quinasa en la maduración del fagosoma se evaluó mediante
inmunocitoquímica, western blot y citometría de flujo usando marcadores de
fagosomas tempranos y tardíos, y sondas fluorescentes específicas de
lisosomas. Por primera vez, pudimos demostrar que PknG aislada tiene un
efecto inhibitorio en el proceso de maduración fagosomal. La caracterización a
nivel molecular de este proceso se está realizando mediante el estudio de
proteomas diferenciales de fagosomas aislados por ultracentrifugación en
gradientes de sacarosa en las distintas condiciones experimentales. Por tanto,
desarrollamos un modelo que nos permite estudiar el mecanismo molecular por
medio del cual PknG afecta el proceso maduración fagolisosomal y
actualmente estamos trabajando en la identificación de las proteínas del
hospedero involucradas en este proceso.
7.
DISMINUCIÓN DE LOS NIVELES DE CICLOOXIGENASAS 1 Y 2 EN
FIBROBLASTOS SENESCENTES POR EXPOSICIÓN A H2O2
I. Marmisolle1, A. Trostchansky1, C. Quijano1
1
Departamento de Bioquímica y Centro de Investigaciones Biomédicas
(CEINBIO) de la Facultad de Medicina, UDELAR
La senescencia celular se caracteriza por el cese de la proliferación,
transformaciones morfológicas, activación de la respuesta al daño al ADN,
aumento en la actividad de la enzima β-Galactosidasa a pH 6 (SA-βGal) y
secreción de factores proinflamatorios (SASP). Es un estado que se alcanza
después de sucesivas divisiones celulares (por acortamiento de los telómeros);
en presencia de estímulos mitogénicos potentes (ej. expresión de un oncogén);
o por exposición a agentes que dañan al ADN (ej. oxidantes, radiación).
Este trabajo apunta a establecer un modelo celular de senescencia
inducida por la exposición a peróxido de hidrógeno (H2O2), con el objetivo de
caracterizar las alteraciones en el metabolismo de los ácidos grasos, en
particular del ácido araquidónico (AA).
Expusimos fibroblastos humanos de pulmón (IMR-90) a H2O2 (200 µM, 2
horas, 2 incubaciones). El tratamiento con H2O2 produjo el cese en la
proliferación celular, aumento en el número de células positivas para SA-βGal,
hipofosforilación de la proteína del retinoblastoma y aumento en los niveles de
p21, un inhibidor de las quinasas dependientes de ciclinas. Resultados
preliminares mostraron además una disminución en los niveles de las enzimas
ciclooxigenasa 1 y 2 (COX1 y COX2). Estas enzimas pertenecen a la vía de
síntesis de prostaglandinas, mediadores lipídicos que regulan la proliferación
celular y la repuesta inflamatoria. Nuestros resultados señalan al metabolismo
del AA como otra vía moduladora, en conjunto con la SASP, del fenotipo de la
célula senescente y su relación con el entorno.
8.
CARACTERIZACIÓN
BIOQUÍMICA
Y
ESTRUCTURAL
REGULADOR DE RESPUESTA HEMR DE Leptospira biflexa
DEL
N.M. Morero1, H. Botti1, M. Picardeau2, N.R. Kazuhiro3, A. Buschiazzo1
1
Unidad de Cristalografía de Proteinas, Instituto Pasteur de Montevideo,
Uruguay; 2Biology of Spirochetes Unit, Institut Pasteur, Paris, France;
3
Department of Biosciences and Medical Nutrition, Karolinska Institutet,
Stockholm, Sweden.
En bacterias, los sistemas de dos componentes (SDC) juegan un papel clave
en señalización, y han sido involucrados en patogénesis bacteriana [1]. Las
espiroquetas son eubacterias antiguas, causantes de varias enfermedades
humanas tales como la leptospirosis, cuyo principal agente etiológico es
Leptospira interrogans. Conocemos muy poca información sobre sistemas de
señalización en espiroquetas y sobre secuencias consenso de promotores de
transcripción en estas bacterias. El regulador de respuesta HemR, junto con la
histidin-kinasa HemK de Leptospira conforman un SDC que ha sido involucrado
en la regulación del metabolismo del hemo [2]. Estudios previos con la cepa
saprófita L. biflexa Patoc demostraron que la doble knockout hemK-/hemR- es
auxótrofa para hemo [2]. En este trabajo caracterizamos la unión de HemR de
L. biflexa a diversas secuencias promotoras de genes cuya expresión se vio
desregulada en ausencia del sistema HemK/HemR en estudios previos de
qRT-PCR y/o RNAseq. Ensayos de retardo en geles de poliacrilamida
mostraron que HemR se une en forma específica a los promotores de hemA y
hemO (glutamil-tRNA-reductasa y hemo-oxigenasa, respectivamente).
Asimismo, mediante ensayos de Selex [3], se determinó una secuencia
consenso reconocida específicamente por HemR, la cual se encuentra
conservada en los promotores de hemA y hemO. Por otro lado, estamos
interesados en la caracterización estructural de HemK y HemR, a fin de obtener
información acerca del mecanismo molecular de transducción de señales
empleado por este sistema. En este trabajo, presentamos la estructura del
dominio recibidor de HemR de L. biflexa, obtenida a alta resolución (1.24 Å)
mediante cristalografía de rayos-X.
[1] Szurmant, H, et al. 2007 Curr Opin Struct Biol 17: 706; [2] Louvel, H, et al.
2008 BMC Microbiol 8: 25; [3] Jolma, A, et al. 2010 Genome Res. 20:861-73
9.
PERFIL METABÓLICO Y MUTAGÉNICO DE UN FLAVONOIDE
SINTÉTICO
CON
ACTIVIDAD
MODULADORA
DE
ENZIMAS
DETOXIFICANTES DE XENOBÓTICOS.
N. Presa1, M. Gabay1, M. Cabrera1, H. Cerecetto1, M. González1
1
Grupo de Química Medicinal, Facultad de Ciencias, UdelaR
Existen complejas vías de señalización, reguladas por proteínas altamente
inducibles, que protegen a las células del daño acumulativo resultante de la
exposición a radicales libres y a especies electrofílicas que son las principales
causas de neoplasma y enfermedades degenerativas crónicas. Estas proteínas
citoprotectoras comparten una regulación transcripcional común a través de la
vía Keap1-Nrf2, la cual puede ser activada por varios inductores exógenos.
Previamente ha sido descripto por nuestro grupo la modulación de enzimas
detoxificantes de xenobióticos por varios flavonoides sintéticos a través de la
vía Keap1-Nrf2 y se ha correlacionado con diversas actividades citoprotectoras.
En este trabajo se seleccionó el flavonoide prometedor CH38, para estudiar su
perfil metabólico in vitro. Se sometió a incubación con fracciones citosólicas y
microsomales de rata. Los estudios se realizaron acoplados a técnicas
cromatográficas CPF/HPLC variando tiempo, concentración proteica de las
fracciones e inhibidores enzimáticos, siendo posible aislar y caracterizar dos
metabolitos mayoritarios. Por otro lado se evaluó la mutagenicidad de CH38 y
de los dos metabolitos identificados M1 y M2. Para este fin se empleó el test de
Ames utilizando cepas de S. Thyphimurium TA98, TA100, TA1537 en ausencia
y presencia de activación metabólica y no se identificó para ninguna condición
actividad genotóxica mutagénica.
Agradecimientos: ANII
10.
CARACTERIZACIÓN PROTEÓMICA DE UNA LÍNEA DE CÁNCER DE
MAMA METASTÁSICO HER2- Y SU HOMÓLOGA NO MALIGNA
B. Rivera1, G. Spera1, A. Lima1, M. Portela1, M. Gil1,2, R. Duran1,2, C.
Batthyany1,3
1.
UByPA; Institut Pasteur de Montevideo, 2. Instituto de Investigaciones
Biológicas Clemente Estable, MEC, 3. Departamento de Bioquímica, Facultad
de Medicina, UDELAR.
La caracterización de un proteoma y el estudio diferencial de perfiles proteicos
referidos a condiciones metabólicas basales vs. patológicas puede permitir la
identificación de biomarcadores inherentes a dicha patología. La detección
temprana de alteraciones relacionadas a las mismas puede favorecer el
desarrollo de herramientas útiles en prevención, identificación de grupos de
riesgo, diagnóstico y evaluación pronóstica de los pacientes. El cáncer de
mama es el más frecuente y una de las principales causas de muerte por
cáncer en mujeres en el mundo. En Uruguay posee una alta incidencia y
mortalidad posicionándolo en el primer lugar en comparación con otros tipos de
cáncer. El objetivo de este trabajo es realizar la caracterización proteómica
diferencial de una línea celular de cáncer de mama metastático (MCF-7)
positiva para receptores de estrógeno y progesterona, y negativa para el
receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) y la de su
homóloga no maligna (MCF-10A). Los proteomas de las células control y
tumoral se estudiaron por una estrategia de electroforesis bidimensional
acoplada a espectrometría de masa. En las condiciones de cultivo celular
recomendadas (ATCC), los proteomas presentan diferencias marcadas sobre
una base en común. Sin embargo, cuando las células MCF-10A fueron
cultivadas en el medio de cultivo utilizado para la línea tumoral (sin adición de
factores de crecimiento específicos), las células se vuelven senescentes. Sin
embargo, no se pudieron identificar cambios marcados en su proteoma con
respecto a su situación basal.
11.
NUEVOS GALACTO-DERIVADOS COMO POTENCIALES LIGANDOS
DE GALECTINA 1: UNA APROXIMACIÓN EXPERIMENTAL Y TEÓRICA
E. Rodriguez1, A. Merlino2, C. Porciúncula1, L. Franco Fraguas1, G.
Irazoqui1, C.Giacomini1
1
Cátedra de Bioquímica, Depto. De Biociencias, Facultad de Química
(UDELAR); 2Laboratorio de Química Teórica y Computacional, Instituto de
Química Biológica, Facultad de Ciencias (UDELAR)
Los galactósidos han recibido una creciente atención debido a su participación
en múltiples procesos biológicos, en particular como ligandos de galectinas,
una familia de proteínas que poseen al menos un dominio de reconocimiento
para carbohidratos (DRC) con especificidad para -galactósidos. Dentro de
ellas, la galectina-1 participa en la biología del cáncer, promoviendo la adhesión
de las células tumorales, la metástasis y la generación de un ambiente
inmunosupresor que favorece el crecimiento del tumor. Por tal motivo ésta
proteína constituye un blanco molecular en la terapia del cáncer, lo que
convierte a sus inhibidores en potenciales agentes antitumorales.
En este trabajo se estudió la capacidad de unión a la galectina-1 de origen
bovino de dos galactósidos sintetizados enzimáticamente en nuestro
laboratorio
(2-O-β-D-galactopiranosil-etilenglicol
y
1-(2-aminoetil)--Dgalactopiranosido), a los efectos evaluar su potecial inhibitorio.
Este efecto inhibidor se evaluó a través de la afinidad relativa (AF), definida
como el cociente entre la mínima concentración inhibitoria de hemaglutinación
de la galactosa y la mínima concentración inhibitoria de hemaglutinación del
galactósido evaluado. Los dos galactósidos evaluados presentaron una AF de
16, evidenciando que la unión a la galactosa de una molécula de etilenglicol o
de etanolamina aumenta su afinidad por el CDR de la galectina. Los estudios
de docking molecular realizados demostraron que las interacciones del grupo
amino del 1-(2-aminoetil)--D-galactopiranosido con la Arg 73 y el Glu 71 y del
hidroxilo unido al C1 del 2-O-β-D-galactopyranosyl-ethylene glycol con la Arg 73
de la galectina podrían ser responsables del aumento de afinidad de los nuevos
galactósidos sintetizados.
12.
ESTUDIO DE LA ADHESIÓN Y AGREGACIÓN DE Pseudomonas
aeruginosa EN CÉLULAS EPITELIALES MEDIANTE APROXIMACIONES
PROTEÓMICAS
J. Rossello¹, A. Lima¹, M. Portela¹, A. Kierbel2, R. Durán¹-³
¹Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Institut Pasteur de Montevideo;
²Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Rodolfo Ugalde" (IIB-Intech), San
Martín, Buenos Aires; ³Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente
Estable, MEC
Pseudomonas aeruginosa (PA) es un patógeno oportunista que causa
infecciones agudas severas en individuos inmunocomprometidos. A su vez, las
infecciones crónicas con PA, son la principal causa de muerte en individuos
con fibrosis quística. La formación de biofilms es un factor clave en la
resistencia a antibióticos y la cronicidad de la infección. La transición desde una
forma de vida planctónica a una agregada y asociada a superficie, es un paso
temprano crucial en la formación de biofilms. Recientemente hemos visto que
PA forma estructuras multicelulares tipo biofilm cuando se contacta con la
superficie epitelial (Lepanto et al 2010) y que la formación de las mismas
depende de los niveles del segundo mensajero bacteriano 3´,5´-diguanilato
cíclico (c-di-GMP). En particular demostramos que una cepa de PA que sobreexpresa una fosfodiesterasa que degrada específicamente c-di-GMP, es
incapaz de formar éstas estructuras multicelulares. A partir de estos resultados
nos proponemos estudiar las bases moleculares de la adhesión y agregación
de PA sobre la superficie celular. Para ello utilizaremos un abordaje proteómico
comparativo de dos poblaciones bacterianas: WT y aquella con bajos niveles
de c-di-GMP.
Inicialmente nos centramos en proteínas de membrana de PA: Optimizamos un
protocolo para la purificación y separación de éstas proteínas en geles
bidimensionales y corroboramos que ésta fracción corresponde a proteínas de
membrana mediante espectrometría de masa de tipo MALDI-TOF. Las
diferencias en los perfiles de expresión proteica entre ambas cepas de PA
serán evaluadas mediante herramientas de proteómica cuantitativa, a destacar
entre ellas 2D-DIGE.
13.
CITOCROMO
C,
ESTUDIO
CONFORMACIONES ALTERNATIVAS
BIOQUÍMICO
DE
LAS
F. Tomasina1,3, V. Demicheli1,3, R. Jemmerson4, L. Thomson1,2., R. Radi1,3.
Center for Free Radical and Biomedical Research1; Facultad de Ciencias 2 y
Facultad de Medicina3, Universidad de la República; Department of
Microbiology, University of Minnesota Medical School, Minneapolis, MN, USA 4.
El citocromo c (cyt c) es una pequeña proteína mulitifuncional involucrada en
diversos procesos centrales, tanto para la vida como para la muerte. En la
mitocondria actúa como transportador de electrones en la cadena respiratoria,
y como mediador pro-apoptótico a nivel del citosol. Esta proteína tiene actividad
peroxidática bajo ciertas circunstancias. Entre las conformaciones varias que
puede adoptar el cyt c oxidado, la transición alcalina ha sido de gran interés.
Esta es un cambio conformacional inducido por el pH, en donde se disocia el
ligando axial de la metionina 80, y es remplazado por una lisina a valores de pH
alto. Es de interés poder especular si esta conformación está implicada en
procesos de importancia funcional in vivo. Estudios de nuestro grupo han
demostrado que modificaciones en el cyt c, como la nitración de las tirosinas,
dispara un profundo cambio estructural en la unión al hemo y en el
micorambiente, impactando en la función de la proteína. En este trabajo,
hemos unido al cyt c a la ovoalbúmina usando glutaraldehído, estabilizando la
conformación alcalina del cyt c y aumentando la actividad peroxidática. De
manera de poder detectar conformaciones alternativas en contextos
biológicamente relevantes se caracterizó el anticuerpo 1D3, que no es reactivo
al cyt c nativo, observando que se une tanto al cyt nitrado así como al cyt
tratado con glutaradehído.
14.
PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE AntA, PROTEASA
CISTEÍNICA EXTRAIDA DE FRUTOS DE Bromelia antiacantha Bertol.
D. Vallés,1, A.M.B Cantera1,2
1
Laboratorio de Enzimas Hidrolíticas, Instituto de Química Biológica, Facultad
de Ciencias (UDELAR); 2Cátedra de Bioquímica, Departamento de
Biociencias, Facultad de Química (UDELAR)
El extracto crudo obtenido de pulpa sin semillas de frutos maduros de Bomelia
antiacantha Bertol. (Banana do mato), planta perteneciente a la familia de las
Bromeliaceaes, contiene al menos 3 proteasas cisteínicas con alta actividad
proteolítica. La función de estas enzimas no ha sido determinada, se piensa
que pueden actuar como protección contra agentes patógenos.
Por cromatografía de intercambio catiónico (SP-Sepharose HP), se aisló la
proteasa de menor punto isoeléctrico que denominamos Antiacanthaína A
(AntA). La Antiacanthaína A presenta una actividad específica de 80 UE/mg
(utilizando azocaseína como sustrato). Muestra el máximo de actividad a pH
8,9, manteniendo una actividad superior al 75% en un amplio rango de pH (69). El efecto de la temperatura sobre la actividad de la AntA, muestra un
incremento constante de la actividad hasta los 65° (temperatura máxima
ensayada). La incubación con Urea 8M no afecta la actividad, permaneciendo
inalterada por tiempo prolongado (18hs). La incubación con Cloruro de
Guanidinio (GndHCl) 6M muestra una disminución de 41% de la actividad a los
30min de incubación, manteniéndose en este valor a lo largo del tiempo (18hs).
La especificidad de hidrólisis de la AntA sobre la cadena Beta de la insulina,
muestra 11 sitios de corte, 9 de los cuales coinciden con los de la Papaína.
Los estudios cinéticos de la AntA, se realizaron utilizando p-Glu- Phe-Leu-pnitroanilide (PFLNA), sustrato específico para proteasas cisteínicas (KM =
0,235mM, kcat = 2,88 x 10-3 s-1, kcat/Km = 12,3 x 10-3 s-1 mM-1).
BIOTECNOLOGÍA (15-23)
15.
RELACIÓN ENTRE TRANSGENES DE MAÍCES GENÉTICAMENTE
MODIFICADOS Y FRECUENCIA DE FENOTIPOS ANORMALES EN
VARIEDADES NATIVAS DE OAXACA, MÉXICO
F. Rivera1, M. Arleo2, C. Martínez Debat2
1
Universidade Federal de Santa Catarina, (UFSC); 2Sección Bioquímica,
Facultad de Ciencias (UDELAR).
México es centro de origen y diversidad del maíz. Su cultivo presenta una gran
riqueza genética y posee un enorme valor cultural y alimentario para el país y el
mundo. En el año 2001, Quist y Chapela, comprobaron la introducción de ADN
transgénico en variedades nativas de maíz mexicano, despertando una fuerte
preocupación por parte de la Sociedad y la Academia. Desde ese momento,
comenzaron a desarrollarse líneas de investigación con la finalidad de conocer
la extensión e intensidad del flujo de transgenes hacia variedades nativas. En
este contexto, un estudio realizado en México en el año 2011, evidenció la
existencia de una relación entre la presencia de transgenes y la aparición de
nuevos fenotipos anormales en cultivos de maíz, en cinco comunidades de la
región de los Valles Centrales de Oaxaca. Se encontró una diferencia
estadísticamente significativa entre la frecuencia de proteínas recombinantes
(cry1Ab y CP4ESPS) en los fenotipos anormales de maíz y los fenotipos
normales. En base a los resultados obtenidos y considerando las limitaciones
de la técnica de detección de proteínas transgénicas, pareció pertinente
ampliar este estudio utilizando técnicas moleculares de detección de
transgenes basados en ADN (detección del promotor 35S). El presente trabajo,
intenta validar y ampliar los resultados del estudio anterior, detectando con
mayor precisión la presencia de transgenes y la frecuencia de los mismos en
los fenotipos anormales encontrados.
16.
UTILIZACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES ASOCIADOS A
GENES DE RESISTENCIA EN EL MEJORAMIENTO GENÉTICO DE TOMATE
DE MESA.
A. Arruabarrena1, A. Rosso2, M. González-Arcos3
1
Laboratorio de Biotecnología, Estación experimental INIA Salto Grande (INIA);
Estudiante de Lic. en Bioquímica, Pasante en Laboratorio de Biotecnología, Estación
experimental INIA Salto Grande (INIA); 3Programa Nacional de Producción Hortícola,
Estación experimental INIA Salto Grande (INIA)
2
En el tomate (Solanum lycopersicum) varias resistencias a enfermedades son
determinadas por un gen de efecto dominante. Esta característica es utilizada
en el mejoramiento para la obtención de híbridos (F1) creando líneas
avanzadas con un adecuado complemento de genes de resistencia. A nivel
productivo, los cultivares utilizados deben presentar algunas resistencias
básicas a enfermedades de suelo y virus. Además de los objetivos de
producción y calidad en la selección, el proyecto de mejoramiento de tomate de
mesa de INIA incluye la resistencia para los siguientes patógenos existentes en
el país: Tospovirus (gen Sw-5), Tobamovirus (gen Tm22), Fusarium oxysporum
f. sp. lycopersici raza 1 y 2 (genes I e I-2), Verticillium albo-atrum o V. dahliae
raza 1 (gen Ve) y Meloidogyne spp. (gen Mi). También se busca incorporar
resistencia a Begomovirus (gen Ty-1), que tiene un riesgo potencial para los
cultivos de nuestro país. Estos genes cuentan con marcadores moleculares
ligados que permiten monitorear su presencia y estado (homocigota o
heterocigota). En el presente trabajo, se ajustaron y validaron estos
marcadores utilizando variedades de referencia. Luego se caracterizaron por
presencia y estado del gen, un total de 14 líneas avanzadas (F4), previamente
seleccionadas por características agronómicas y de calidad de fruta. El trabajo
permitió identificar aquellas combinaciones de líneas que complementen la
totalidad de resistencias buscadas. Las mismas serán usadas para formar la
primera generación de híbridos con múltiple resistencia a enfermedades que
serán validados en ambientes productivos.
17.
ESTUDIO DE LOS COMPONENTES ANTIGÉNICOS DE Mannheimia
haemolytica EN LA VACUNA PARA EL SINDROME RESPIRATORIO BOVINO
F. Cabrera1, L. Becco2, I. Corvo2, G. Grotiuz3 , E. Reolon3, P. Tucci2, M.
Marín1
1
Bioquímica, Facultad de Ciencias (UDELAR); 2División Biotecnología de
Laboratorios Celsius S.A.;3Laboratorios Santa Elena S.A. (SESA).
El síndrome respiratorio bovino (SRB) es causado por varios agentes
etiológicos entre los que se incluyen tanto bacterias como virus. Constituye una
de las principales patologías que afecta al ganado bovino, causando
importantes pérdidas económicas en la producción agropecuaria de nuestro
país. Es una enfermedad multifactorial, lo que dificulta el desarrollo de
estrategias de control efectivas, y requiere la búsqueda de eficientes sistemas
de prevención. Laboratorios Santa Elena produce vacunas contra el SRB
formuladas en base a cultivos inactivados de sus principales agentes
etiológicos, uno de los cuales es M. haemolytica. Esta bacteria pertenece a la
flora bacteriana usual del ganado. Sin embargo, frente a situaciones de estrés
tales como el destete, el hacinamiento y estrés del transporte, y la co-infección
por parte de otros agentes virales o bacterianos, se promueve su virulencia, y
su pasaje de la región nasofaríngea a los alvéolos pulmonares, provocando la
infección pulmonar y los síntomas típicos de la neumonía. Se ha propuesto la
identificación de los principales factores de virulencia de M. haemolytica, con la
intención de incrementar el efecto protector de las vacunas, así como disminuir
los síntomas clínicos y el daño pulmonar asociado. Entre estos factores tienen
particular importancia la leucotoxina y las proteínas de la membrana externa
reguladas por hierro. En este contexto, nos propusimos identificar los
principales componentes antigénicos del patógeno, presentes en la vacuna
comercializada por SESA, para lograr una caracterización a nivel molecular que
facilite la estandarización lote a lote de la producción.
18.
APLICACIÓN DEL ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS EN
CULTIVOS ALIMENTADOS DE Herbaspirillum seropedicae BAJO
CONDICIONES DE SÍNTESIS DE POLI-3-HIDROXIBUTIRATO
A.I. Catalán1, J.G. Cabrera-Gomez2, K. Malan1, S. Batista1
1
Unidad de Microbiología Molecular, IIBCE; 2Departamento de Microbiología,
Instituto de Ciencias Biomédicas (USP).
El Poli-3-hidroxibutirato (PHB) es un poliéster de la familia de los
Polihidroxialcanoatos (PHAs). Estos compuestos son termoplásticos y
biodegradables, constituyendo un material sustituto de los plásticos nobiodegradables. Los PHAs son sintetizados por diferentes microorganismos
como reserva de carbono y energía. La síntesis de PHAs y el crecimiento
celular compiten por la fuente de carbono.
Herbaspirillum seropedicae es una β-proteobacteria que acumula cantidades
significativas de PHB cuando crece en glucosa. Resultados preliminares
indican que el sustrato carbonado es transformado en polímero con una
eficiencia menor que la teórica calculada.
El análisis de flujos metabólicos (AFM) es una herramienta para el análisis del
funcionamiento metabólico de una célula. Este estudio permite establecer los
flujos reales presentes en una red metabólica dada, así como determinar flujos
alternativos para aumentar la producción del metabolito de interés.
El objetivo del trabajo fue realizar un AFM en cultivo en “fed batch” de H.
seropedicae en presencia de glucosa como única fuente de carbono. El AFM se
realizó mediante la determinación de Modos Elementales (ME). Se elaboró una
red metabólica constituida por las rutas: ED, Ciclo de Krebs, glioxilato,
gluconeogénesis y pentosas fosfato (vía de síntesis). Se determinó un período
donde el cultivo se encontraba en estado pseudo-estacionario para efectuar el
estudio de flujos. Se obtuvieron 22 ME, uno de los cuales se ajustó a los datos
experimentales para ciertos parámetros (biomasa y PHB). Otros ME poseen
una distribución de flujos que resultan en un mayor rendimiento de síntesis de
PHB, indicando posibles genes blancos a mutar.
Financiado por CYTED, PEDECIBA y ANII.
19. DESARROLLO Y CARACTERIZACIÓN DE INMUNOESTIMULANTES
DE LAS VÍAS RESPIRATORIAS BASADOS EN LISADOS BACTERIANOS
POLIVALENTES
F. Ferrara1, N. Suarez1, A. Martínez1, M. Moreno1, J. A. Chabalgoity1 y A.
Rial1
1
Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Instituto de Higiene, Facultad de
Medicina (UDELAR)
Las infecciones del tracto respiratorio (RTIs) son las infecciones humanas más
frecuentes, presentan una alta morbilidad y mortalidad, y representan un
problema mundial muy importante. La prevención y el tratamiento de las RTIs
continúan siendo un desafío. El objetivo principal en la búsqueda de
alternativas terapéuticas es proteger al huésped de la infección y no
necesariamente eliminar los agentes infecciosos como en el caso de las
terapias antimicrobianas. Desde hace muchos años se utilizan lisados
bacterianos polivalentes inmunomoduladores para la prevención y el
tratamiento de RTIs, principalmente en niños y pacientes inmunodeprimidos,
habiendo sido testeados clínicamente y comprobado su acción terapéutica. La
base de acción de los lisados bacterianos polivalentes es la estimulación no
específica y repetida del sistema inmune innato, intensificando las defensas
humorales y celulares contra una amplia variedad de microorganismos que
ingresan al organismo por la vía respiratoria, aumentando la eficiencia de
respuesta del sistema inmune y generando un efecto global no específico para
un determinado patógeno. Este trabajo tiene como objetivo el desarrollo de
procesos de producción de un lisado bacteriano polivalente, adecuado para uso
humano. Se han seleccionado cepas bacterianas que comúnmente infectan el
tracto respiratorio, estableciendo sus condiciones de cultivo, poniendo a punto
un adecuado proceso de lisis alcalina y purificación. Se caracterizó su perfil
proteico y actualmente se trabaja en la evaluación in vitro e in vivo de su
capacidad inmunoestimulante analizando la producción de citoquinas,
quimioquinas y péptidos antimicrobianos, de forma de contribuir a un mejor
entendimiento de su mecanismo de acción.
20. DETERMINACIÓN DEL
INSECTICIDA JABURETOX
ESTADO
ACTIVO
DE
LA
PROTEINA
M. Mailhos1, K. Kappaun2, L. Harispe1, C. Carlini2, P. Aguilar 1
1
Laboratorio de Biología Celular de Membranas, Institut Pasteur de
Montevideo; 2 Centro de Biotecnología, Universidad Federal de Rio Grande do
Sul.
En la actualidad, nuevas formas de proteger los cultivos contra depredadores y
patógenos son necesarias para evitar el uso de productos químicos agresivos
al medio ambiente.
La planta leguminosa Canavalia ensiformis posee diferentes isoformas de
enzima ureasa que presentan una potente actividad insecticida. La
entomotoxicidad de estas enzimas se basa en la presencia de un péptido
interno de 10-15 kDa, denominado Jaburetox, que producido de forma
recombinante presenta una efectiva actividad insecticida al ser introducido en la
dieta de varios insectos de interés médico o agrícola como Nezara viridula,
Dysdercus peruvianus, y Rhodnius prolixus. Resultados preliminares indican
que durante la purificación y/o almacenamiento, los monómeros de Jaburetox
interactúan entre sí generando oligomeros que correlacionan con baja o nula
actividad. En este trabajo se aborda el estudio de los distintos grados de
asociación alcanzados por Jaburetox y sus actividades asociadas. Mediante
Cromatografía de Exculsión Molecular y Dynamic Light Scattering hemos
determinado, por primera vez, cuál es el estado de agregación de Jaburetox en
las distintas etapas post-purificación y hayamos el estado oligomérico activo.
Dicha caracterización no sólo contribuye ampliamente al dilucidado de su
mecanismo de acción sino que es fundamental para determinar las condiciones
ideales de producción y almacenamiento de Jaburetox.
21.
BÚSQUEDA DE BIOCATALIZADORES MICROBIANOS A PARTIR DE
LA COMUNIDAD DE ENDOFÍTICOS DE MENTA POLEO (MENTHA
PULEGIUM).
Marconi, F*1,2; Rodriguez Bonnecarrere, P.1,2; Gonzalez Berruti, D.1;
Rodríguez Giordano, S.1,2
1
.Laboratorio de Biocatálisis y Biotransformaciones, DQO-DEPBIO, Facultad de
Química, UdelaR. 2. Cátedra Microbiología, Facultad de Química, UdelaR.
Desde el año 2007 nuestro grupo se ha abocado a la búsqueda de
nuevos biocatalizadores a partir del medio ambiente explotando la diversidad
microbiana endófita presente en plantas nativas y cultivadas. En el marco de
esta estrategia nos planteamos estudiar microorganismos endofíticos presentes
en plantas aromáticas ricas en aceites esenciales volátiles que contienen
compuestos terpénicos de valor industrial. Nuestra hipótesis de trabajo es que
microorganismos expuestos a este ambiente particular pueden haber
desarrollado sistemas enzimáticos capaces de metabolizar algunos
componentes del aceite esencial y que por ello pueden resultar en
biocatalizadores específicos de interés.
En ese sentido hemos estudiado la bio-reducción del sustrato terpénico
carvona, compuesto estructuralmente relacionado con los componentes del
aceite esencial de la menta, por hojas de Mentha pulegium y por los
microorganismos aislados de esta planta. De los resultados obtenidos se
observó que una cepa bacteriana endofítica resultó de interés por presentar
actividad enoatoreductasa frente a la carvona, rindiendo el compuesto
dihidrocarvona en un 51% de conversión.
Por otro lado se estudió el efecto del agregado de inhibidores
bacterianos y fúngicos cuando se empleó la menta como biocatalizador para
evaluar la incidencia de los microorganismos endofíticos en la bioconversión.
En este caso se observó bioconversión de carvona a dihidrocarvona en el
experimento sin inhibidores y en presencia de cloranfenicol. Es de destacar que
en el primer experimento fue donde se recupero la cepa bacteriana que rindió
la dihidrocarvona en alto porcentaje de conversión. Estos resultados podrían
indicar que la bacteria estaría participando en la biotransformación cuando se
emplea la menta como biocatalizador frente a la carvona.
22. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE COMPUESTOS
SINTÉTICOS INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DEL IFN-α
HUMANO
M. Bürgi1, C. Prieto1, V. Porro2, M. Etcheverrigaray1, R. Kratje1, M. Cabrera3,
P. Hernández2,3, H. Cerecetto3, M. González3, M. Oggero-Eberhardt1, M.
Bollati-Fogolín2
1
Laboratorio de Cultivos Celulares - UNL, Santa Fe. Argentina;
2
Unidad de Biología Celular - IPMONT. Montevideo. Uruguay
3
Grupo de Química Medicinal – Facultad de Ciencias – UdelaR. Montevideo.
Uruguay
Diversas patologías, en particular, el lupus eritematoso sistémico han
demostrado una producción excesiva de interferón-α (IFN-α), responsable de
los síntomas exhibidos por tales enfermedades. Por este motivo, resulta
importante identificar moléculas que puedan inhibir la actividad de la citoquina.
En nuestro laboratorio, se obtuvo la línea celular WISH-Mx2/eGFP reportera de
la actividad biológica de los IFNs de tipo I de origen humano (hIFNs-I, entre
ellos, el hIFN-α), con la cual se analizaron 88 compuestos sintéticos
pertenecientes a la Quimioteca del Grupo de Química Medicinal. La línea
reportera contiene la construcción Mx2/eGFP, donde la secuencia de la
proteína reportera eGFP se encuentra bajo el control del promotor Mx2,
inducible por IFNs-I. De esta forma, fue posible correlacionar directamente la
expresión de células verdes con la cantidad de IFN presente en la muestra.
Empleando esta línea, se comparó la expresión de eGFP en presencia y
ausencia de compuestos buscando aquellos que bloqueen tal expresión como
consecuencia de la inhibición de la actividad de los hFNs-I. Se lograron
identificar 10 compuestos que fueron caracterizados mediante el estudio de su
toxicidad, dosis efectiva, efecto sobre la actividad biológica antiviral y
antiproliferativa de los hIFNs-I y análisis de su efecto sobre el ciclo celular y
apoptosis.
Finalmente, el efecto combinado de 5 de ellos, sobre la actividad de los IFNs-I
fue evaluado mediante el ensayo de gen reportero, observándose un efecto
cooperativo para inhibir la actividad biológica de los hIFNs-I, acción que fue
corroborada mediante ensayos de actividad antiviral y antiproliferativa.
23. CARACTERIZACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL ANTIClostridium chauvoei EN BOVINOS
M. Rivera1, A. Rossi1, M. Breijo2, J.A. Chabalgoity1.
1
Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Facultad de Medicina, (UDELAR).
Unidad de Reactivos y Biomodelos de Experimentación, Facultad de Medicina,
(UDELAR).
2
El carbunclo sintomático es una enfermedad infecciosa no contagiosa causada
por Clostridium chauvoei, que afecta al ganado, provocándole la muerte a los
días y para la cual no existe un tratamiento eficaz. El principal mecanismo de
control es su prevención, mediante vacunación. Los programas de Sanidad
Animal incorporan al esquema de vacunación a las vacunas policlostridales,
que contienen a C. chauvoei en forma de bacterina. Para el funcionamiento
satisfactorio de dichos programas es imprescindible contar con vacunas puras,
inocuas, potentes y eficaces. En las vacunas clostridiales, la eficacia está dada
por el nivel de inmunidad protectiva inducida en la especie de destino. La
confirmación de protección contra C. chauvoei se evalúa en ensayos de
vacunación mediante el análisis de la respuesta inmune humoral y en ensayos
de desafío. A partir de un ensayo de vacunación y otro de desafío contra C.
chauvoei en bovinos realizado por una empresa local, optimizamos un ELISA
que permitió evaluar la respuesta inmune humoral específica inducida por la
vacunación a corto y largo plazo. Los resultados concuerdan con lo esperado
ya que se observa un alto título de anticuerpos 15 días después de la
vacunación. Sin embargo, al día 360 los títulos disminuyeron drásticamente,
recuperándose con la revacunación anual. Asimismo, se correlacionaron los
mayores títulos de anticuerpos con una menor sintomatología clínica frente al
desafío. Además, se analizaron los posibles antígenos de C. chauvoei por
Western Blot y se observó que los animales vacunados reconocen antígenos
que no son reconocidos por los animales no vacunados.
BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE LOS
MICROORGANISMOS (24-38)
24.
IDENTIFICACIÓN Y PREDICCION DE LAS PROPIEDADES
BIOQUÍMICAS DE LA ENZIMA LACCASA DE Pseudomona sp. AU10
V. Braña1, S. Castro-Sowinski1,2
1
Unidad de Microbiología Molecular, Instituto de Investigaciones Biológicas
Clemente Estable (IIBCE); 2Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias
(UDELAR)
La industria de celulosa y papel del Uruguay ha venido en constante
crecimiento debido a la producción de las empresas UPM y Montes del Plata.
La pulpa de papel se obtiene por procesos químicos de deslignificación y
blanqueo de las fibra que generan efluentes cuya toxicidad y persistencia en el
ambiente han conllevado potenciales riesgos de contaminación. Las laccasas
son polifenol-oxidasas capaces de oxidar un amplio rango de compuestos
orgánicos e inorgánicos. Debido a su amplio espectro de sustratos las laccasas
son consideradas de gran interés industrial y han demostrado tener un vasto
número de aplicaciones biotecnológicas. No obstante, su función más
estudiada es su capacidad deslignificante natural, por lo que se ha propuesto
su utilización en la industria papelera en procesos de biopulpeo y bioblanqueo,
como una alternativa sustentable y ambientalmente segura, comparada con los
procesos tradicionales.
Los objetivos de este trabajo fueron identificar el gen codificante para la enzima
laccasa de Pseudomona sp. AU10 (una bacteria sicrófila de origen Antártico),
analizar su contexto genómico, predecir in silico las propiedades bioquímicas
de la proteina y expresarla en forma recombinante en Escherichia coli, para su
purificación y análisis de su potencial aplicación en el bioblanqueo de pulpa de
papel. Se identificó el gen codificante para la enzima, y como en otras
Pseudomonas, aguas arriba del gen se detectó una PNP sintasa. El peso
molecular y pI teórico encontrados fueron 50637.8 Da y 6.63. Actualmente se
está realizando la expresión recombinante de la enzima en E.coli BL21.
25.
MONITOREO DEL CALCIO INTRACELULAR
APAREAMIENTO EN Saccharomyces cerevisiae
DURANTE
EL
N. Carbó1, P. Aguilar1
1
Laboratorio de Biología Celular de Membranas, IPMont.
La fusión célula-célula es el evento clave de la fertilización que da lugar al
cigoto diploide y es un aspecto casi universal de la biología eucariota. Aunque
los mecanismos moleculares asociados con la fusión de membranas
intracelulares o fusión mediada por virus están bien caracterizados, los
mecanismos moleculares de fusión célula-célula son menos conocidos. El
apareamiento en levaduras, donde células haploides sexualmente
diferenciadas se fusionan para formar un cigoto diploide, es un modelo
genético potente para el estudio de la fusión entre células. En los últimos años
se caracterizaron en S. cerevisiae varias proteínas implicadas en la fusión
celular, entre ellas Prm1 y Fig1, y se postuló la existencia de una relación
directa entre la disponibilidad de calcio extracelular y la eficiencia del
apareamiento en mutantes en estos genes. Por otra parte, se sabe que el
calcio intracelular se incrementa considerablemente en las etapas previas al
apareamiento. Sin embargo, se desconoce aún en que etapa precisa del
apareamiento se registra dicho aumento de la concentración intracelular del
calcio. Con este trabajo pretendemos desarrollar un sistema para monitorear in
vivo la concentración del calcio intracelular en tiempo real y de manera no
invasiva. Utilizando un indicador basado en la proteína verde fluorescente GFP
se propone estudiar el papel del calcio durante el apareamiento en el contexto
de distintos acervos genéticos.
26.
ANÁLISIS DE LAS MOLÉCULAS EXUDADAS DURANTE LA COINOCULACIÓN DELFTIA-RIZOBIO EN ALFALFA
Cagide1, S. Castro-Sowinski2, M.Morel1.
1
Unidad de Microbiología Molecular, IIBCE, AV. Italia 3318, Montevideo,
Uruguay; 2Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias, UdelaR, Iguá 4225,
Montevideo, Uruguay. mmorel@iibce.edu.uy
Delftia sp. JD2 promueve el crecimiento vegetal de alfalfa cuando se co-inocula
con Sinorhizobium meliloti U143 en condiciones gnotobióticas. Como otras
Delftia spp., JD2 produce ácido indol-acético (AIA), sideróforos y fija nitrógeno
en vida libre. Nuestros objetivos fueron i) analizar por GC-MS la composición
de los exudados durante la co-inoculación JD2-U143-alfalfa, y ii) evaluar el
efecto de JD2 y de los exudados sobre el crecimiento de alfalfa, en invernáculo.
Se obtuvieron los exudados en hidroponía, en presencia de U143 y JD2, a los 4
días de inoculación. Estos exudados (libre de células) se utilizaron para regar
las plantas en ensayo de invernáculo y para analizar su composición. Los
ensayos de invernáculo (realizados por triplicado), revelaron que la coinoculación promueve el crecimiento de alfalfa frente a la inoculación simple
con rizobio, reflejado en un aumento de biomasa aérea y radicular. Además, el
riego con exudados potenció el crecimiento vegetal en todos los casos, en
relación a plantas no sometidas a este tratamiento. Por GC-MS se detectaron
azúcares, ácidos orgánicos, amidas y compuestos orgánicos volátiles, entre
otros. No se detectó AIA en los exudados de plantas co- e inoculadas, pese al
alto valor de triptófano detectado (precursor de AIA). Entre los compuestos
detectados en plantas co-inoculadas, se destacan el D-limoneno, ácido
hidroxibutírico, ácido oleico, ácido propanodiol, nonanoico y amidas. Estos y
otros compuestos podrían estar involucrados en la promoción del crecimiento
vegetal evidenciado en los ensayos de invernáculo.
Los autores agradecen a PEDECIBA y ANII.
27.
PAPEL DE LOS EISOSOMAS
REPLICATIVO DE LAS LEVADURAS
EN
EL
ENVEJECIMIENTO
C. do Pazo 1 y P. Aguilar1
1
Laboratorio de Biología Celular de Membranas, Institut Pasteur de
Montevideo.
El proyecto se enmarca dentro del estudio de la función celular de los
eisosomas en la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae. Los eisosomas
son grandes ensambles proteicos citoplasmáticos que organizan dominios de la
membrana plasmática. Están compuestos principalmente por miles de copias
de dos proteínas parálogas, Pil1 y Lsp1, constituyendo el núcleo estructural de
los eisosomas. Estas proteínas cumplen diferentes roles a pesar de ser casi
idénticas y similares en abundancia.
Los eisosomas se forman de novo en la gema en crecimiento a partir de
subunidades proteicas recién sintetizadas. También, crecen en tamaño a
medida que la célula envejece y se ha relacionado la longevidad cronológica a
mutaciones de proteínas de estos.
El microorganismo S. cerevisiae se ha tomado como modelo para estudios de
envejecimiento y se ha encontrado una conservación en factores determinantes
de la longevidad con eucariotas multicelulares. Uno de los ensayos que se usa
para estudiar el envejecimiento celular en levaduras es el estudio del tipo
replicativo, el cual está pensado como modelo de estudio del envejecimiento en
células mitóticamente activas. Por otro lado, como modelo propuesto para
estudiar el envejecimiento en células post-mitóticas está el ensayo de
envejecimiento del tipo cronológico.
Este proyecto pretende investigar el posible papel de los eisosomas en el
envejecimiento en S.cerevisiae, determinando si mutantes de los genes que
codifican para el núcleo estructural de estos ensambles proteicos tienen
alterado el envejecimiento de tipo replicativo y/o cronológico.
28.
CARACTERIZACIÓN DE PLATAFORMAS GENÉTICAS QUE
SOSTIENEN AL GEN blaKPC-2 EN AISLAMIENTOS LOCALES DE
ENTEROBACTERIAS
N. Echeverría1, 2, G. Khalil1, A. Ingold1, M. Castro3, G. Borthagaray1, 3, A.
Galiana4, C. Márquez1, 5
1
Cátedra de Microbiología, Facultad de Química, UdelaR, Montevideo-Uruguay;
2
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares,
Facultad de Ciencias, UdelaR, Montevideo-Uruguay; 3Servicio de Bacteriología,
Hospital Central de las Fuerzas Armadas, Montevideo-Uruguay; 4Hospital
Maciel, Montevideo-Uruguay;
5
Cátedra de Microbiología, I.Q.B., Facultad de Ciencias y Facultad de Química,
UdelaR, Montevideo-Uruguay
La resistencia a carbapenemes en Enterobacterias está relacionada
mayoritariamente con la producción de carbapenemasas. La dispersión de
enzimas KPC ocurre por diseminación de clonas y/o del gen blaKPC localizado
en elementos genéticos móviles (EGM). La variante blaKPC-2 se identificó dentro
del transposón Tn4401, y asociada a plásmidos de diversos tamaños y
estructuras, pertenecientes a diferentes grupos de incompatibilidad que
usualmente portan determinantes de resistencia a aminoglicósidos y
cefalosporinas de 3eraG. El objetivo fue caracterizar las plataformas genéticas
que sustentan al gen blaKPC-2 en aislamientos de Enterobacterias provenientes
de los primeros brotes de bacterias productoras de KPC en Uruguay. Mediante
PCR y secuenciación se analizó la presencia de EGM, genes de resistencia a
antibióticos y el grupo de incompatibilidad plasmídica y se realizaron ensayos
de conjugación para determinar la capacidad de transferencia del gen blaKPC-2.
Se detectaron diferentes plataformas genéticas asociadas al gen blaKPC-2 entre
los dos brotes analizados, siendo en el primero el Tn4401 isoforma a (100pb
deletados), no transferible por conjugación (localizado en el cromosoma o un
plásmido pesado no tipable), y en el segundo Tn4401 isoforma b (sin deleción)
en un plásmido IncN transferible. Se hallaron además, otros EGM. Cabe
destacar la heterogeneidad genética observada en el segundo brote
detectándose aislamientos portadores de dos tipos de plásmidos (IncN e IncFII)
y la co-existencia de los genes blaKPC-2 y blaCTX-M-15. Dada la naturaleza
mosaico de las plataformas de EGM con el potencial para diseminar el gen
blaKPC-2, es de gran importancia la vigilancia epidemiológica para evitar nuevos
brotes.
29.
PATRONES EVOLUTIVOS DE POBLACIONES DE PARVOVIRUS
CANINO CIRCULANTES EN RIO DE JANEIRO
A.Fajardo1, T. de Castro2, M. Sóñora1, G. Moratorio1, R. Cubel2, J.
Cristina1.
1
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares,
Facultad de Ciencias (UDELAR); 2 Departamento de Microbiologia e
Parasitologia, Instituto Biomédico, Universidade Federal Fluminense, Niteroi,
Rio de Janeiro, Brazil.
El parvovirus canino (CPV-2) es un miembro de la familia Parvoviridae, género
Parvovirus. Este virus es causante de cuadros de gastroenteritis hemorrágica y
miocarditis en perros, siendo una de las principales causas de muerte de
cachorros. Su genoma consiste de una cadena simple de ADN de
aproximadamente 5000 nucleótidos que contiene dos grandes marcos abiertos
de lectura (ORFs). Su principal proteína de superficie se denomina VP2 y
representa aproximadamente el 90% de la cápside viral, que es el principal
determinante de la gama de huéspedes. Unas pocas diferencias aminoacídicas
en esta proteína distinguen a los 3 genotipos conocidos de este virus,
denominados CPV-2a, CPV-2b y CPV-2c, que circulan con diferentes
prevalencias alrededor del mundo.
Con el objetivo de investigar los patrones evolutivos de variantes de CPV-2
circulantes en Río de Janeiro, Brasil, se realizaron análisis bayesianos de
coalescencia mediante la aproximación de cadenas de Markov Monte Carlo
(MCMC). Se analizaron 98 secuencias de la región VP2 correspondientes a
variantes aisladas entre 1995 y 2011. Los resultados de estos estudios
revelaron que la emergencia del genotipo CPV-2b alrededor del año 2002,
contribuyó a un importante aumento poblacional de CPV en Río de Janeiro. Por
su parte, la emergencia del genotipo CPV-2c no alteró los patrones
epidemiológicos en Río de Janeiro, a diferencia de otras regiones geográficas
donde se estableció como el genotipo predominante. Como consecuencia, los
genotipos CPV-2a y CPV-2b se mantienen como los más frecuentes en esta
región, siendo únicamente reportados infecciones por el genotipo CPV-2c de
forma esporádica.
30. VARIABILIDAD GENÉTICA DE LOS RETROVIRUS ENDÓGENOS
HUMANOS Y SU POSIBLE ROL EN LA LEUCEMIA LINFOIDE CRÓNICA
(LLC)
S. Fischer 1, G. Moratorio1,3, N. Echeverria1, P. Oppezzo2, J. Cristina1, P.
Moreno1,2
1
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares,
Facultad de Ciencias, UdelaR, Montevideo, Uruguay; 2 Unidad de Proteínas
Recombinantes, Instituto Pasteur, Montevideo, Uruguay; 3 Departamento de
Virología, Instituto Pasteur, Paris, Francia.
El genoma humano contiene un importante número de retrovirus endógenos
humanos (HERVs), es decir, remanentes genéticos de infecciones retrovirales
ancestrales de la línea germinal producidas durante la evolución de los
primates. Alrededor del 8% del genoma humano está compuesto por este tipo
de secuencias retrovirales, y aunque la mayoría de ellos son disfuncionales
debido a la acumulación de múltiples mutaciones sin sentido, algunos (por
ejemplo los HERVs tipo K) permanecen activos y pueden producir proteínas
virales funcionales. Los HERVs han sido asociados tanto a procesos celulares
normales como a diferentes procesos patológicos (enfermedades neurológicas,
autoinmunes y cáncer). En relación a los procesos hemato-oncogénicos se ha
reportado la presencia de anticuerpos contra péptidos de HERV-K, así como
una sobre-expresión de sus genes y la presencia de partículas retrovirales en
células leucémicas primarias. En vistas del rol que parecen tener estos
retrovirus tanto en los procesos de carcinogénesis como en las diferentes
enfermedades autoinmunes actuando como auto-antígenos, el objetivo general
de este trabajo consiste en estudiar la variabilidad genética de los HERV-K y su
posible implicancia en la Leucemia Linfoide Crónica (LLC). Usando PCR a
Tiempo Real (RT-PCR), encontramos que la actividad transcripcional de dos
genes que codifican para oncoproteínas virales (np9 y rec) y el gen que codifica
para gag de HERV-K fue mayor en pacientes con LLC respecto a pacientes
sanos. El origen de estas variaciones transcripcionales y el hecho de que la
expresión de estas proteínas pueda afectar la vía AKT en LLC son objetivos de
nuestras futuras investigaciones.
31. PRODUCCIÓN DE POLI-HIDROXI
BACTERIANAS DE ORIGEN ANTÁRTICO
ALCANOATOS
POR
CEPAS
Y. Imbriago*, C. Callejas, A. Catalán,M. Minteguiaga,S. Batista
Unidad de Microbiología Molecular, Departamento de Bioquímica y Genómica
Microbiana, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (MEC)
En el presente trabajo se estudian los biopolímeros intracelulares producidos
en condiciones de exceso de fuente carbonada y restringidas en algún otro
nutriente esencial para el crecimiento microbiano (N, P, Mg, O 2, S). Su síntesis
se asocia a un mecanismo de reserva ante condiciones ambientales
desventajosas, situación normal para los microorganismos antárticos. Estos
polímeros, conocidos como Poli-hidroxialcanoatos (PHAs), están compuestos
por hidroxiácidos unidos por enlace éster y son sintetizados naturalmente por
una amplia variedad de microorganismos como reserva de carbono y energía.
Las propiedades plásticas y biodegradabilidad total de estos compuestos los ha
tornado en objeto de estudio por sus posibles aplicaciones biotecnológicas.
Objetivo: Evaluar la síntesis y composición de PHAs por aislamientos
bacterianos de origen antártico, en condiciones de cultivo in-vitro.
Materiales y Métodos: Se obtuvo una colección de aislamientos bacterianos de
muestras antárticas de agua (lagos, cañadas de deshielo),sedimento y matas
microbianas. Se evaluó la producción de PHAs mediante ensayo de
fluorescencia con Rojo Nilo. Se determinó el perfil de crecimiento en medio de
cultivo definido, para luego efectuar ensayos de acumulación. Se identificaron
los aislamientos seleccionados. Se determinó el PHA acumulado por GC-MS.
Resultados y Discusión: Se identificaron cuatro organismos productores de
PHAs, tres de ellos pseudomonas y el cuarto perteneciente al género Bacillus.
Se analizó la composición polimérica mediante GC-MS, obteniéndose el perfil
de producción de una de las pseudomonas, en el que se identificó la presencia
de3-hidroxi octanoato de metilo, 3-hidroxidecanoato de metilo, 3-hidroxi
dodecanoato de metilo.
Financiamiento: Instituto Antártico Uruguayo.
32. TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES EN BACTERIAS: ¿QUÉ ROL JUEGA
LA LOCALIZACIÓN SUBCELULAR?
M. Nieves1, F. Trajtenberg2, A. Buschiazzo2, P.S. Aguilar1
1
Laboratorio de Biología Celular de Membranas, Institut Pasteur de Montevideo
2
Unidad de Cristalografía de Proteínas, Institut Pasteur de Montevideo
Los sistemas de dos componentes (TCS) son mecanismos de transducción de
señales muy comunes en procariotas y juegan un rol clave en su adaptación,
sobrevivencia y patogenicidad. El TCS DesK-DesR de Bacillus subtilis es
responsable de preservar la fluidez de su membrana plasmática. El receptor
histidin-quinasa DesK es capaz de percibir descensos en la fluidez de la
membrana en la que está inserto y transmitir dicha información fosforilando el
factor de transcripción citosólico DesR. Este, induce la expresión de la
desaturasa Des, la cual introduce dobles enlaces en los ácidos grasos de
membrana restableciendo su fluidez. Si bien existe evidencia genética,
bioquímica y estructural que sostiene este modelo, el mismo carece de
información proveniente de la biología celular. Ensayos in vitro sugieren que
cuando la fluidez de membrana es óptima DesK interacciona con DesR y lo
retiene en la membrana plasmática. Así, nuestra hipótesis es que la
compartamentalización de este TCS juega un rol importante en la regulación de
su funcionamiento. En este trabajo nos proponemos estudiar la localización
subcelular de DesK, DesR y Des. Para esto se construyeron cepas que
expresan fusiones de una o dos de estas proteínas a GFP y/o mCherry y se
verificó su funcionalidad. Las primeras imágenes obtenidas por microscopía de
fluorescencia convencional, sugieren que DesK se localiza en regiones
discretas de la membrana. Será necesario continuar con las observaciones y
utilizar otras técnicas de microscopía complementarias para dilucidar el rol que
juega la localización subcelular de las proteínas implicadas en este TCS.
33.
DOMINIOS DE MEMBRANA PLASMÁTICA Y EISOSOMAS.
A.Olivera-Couto1, M. Digman2, V. Salzman1, M. Mailhos1, E. Gratton2, P.S.
Aguilar1.
1. Laboratorio de Biología Celular de Membranas, Institut Pasteur de
Montevideo.
2. Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California Irvine.
Si bien actualmente se acepta la existencia de dominios de membrana en
células eucariotas y procariotas, los mecanismos que explican su formación y
mantenimiento son prácticamente desconocidos. Mi proyecto de tesis aborda el
estudio de dominios de membrana plasmática, denominados eisosomas. En un
primer trabajo (1) hemos evidenciado que los componentes principales de los
eisosomas, las proteínas Pil1 y Lsp1, tienen la capacidad de autoensamblarse
y de modificar la curvatura de membranas (tanto in vivo como in vitro), estando
dichas capacidades asociadas a la generación de dominios de membrana.
Nuestros resultados sostienen la hipótesis de que la generación de curvatura
en membrana, lograda a través de la formación de ensambles de Pil1 y Lsp1,
es un mecanismo necesario para la formación de dominios (1). Con el fin de
aportar más evidencia que desafíe esta hipótesis, estamos trabajando en la
descripción cuantitativa del comportamiento dinámico de los eisosomas in vivo.
Para esto utilizamos técnicas de microscopía de fluorescencia y de
espectroscopía de correlación de fluorescencia que nos permiten determinar
los estados oligoméricos, las concentraciones y las velocidades de difusión de
Pil1 y Lsp1 en células vivas. También aplicamos FRET-FLIM con el objetivo de
determinar si existen interacciones directas entre los diferentes componentes
proteicos eisosomales.
1. Olivera-Couto A., et al. (2011) Molecular Biology of the Cell 22, 2360-2372.
34.
HERRAMIENTAS MOLECULARES PARA EL ESTUDIO DE LA
INTERACCIÓN BACTERIA HOSPEDERO
R. Platero1,4, C. Rios1,4, C. Taulé1,4, M. Yanes3,4, F. Battistoni1,4, P. Zunino2,4 y
E. Fabiano1,4
1
Departamento de Bioquímica y Genómica Microbianas, IIBCE;
Departamento de Microbiología, IIBCE; 3Laboratorio de Ecología Microbiana,
IIBCE. 4División Ciencias Microbiológicas, IIBCE.
2
La escasa disponibilidad de herramientas genéticas para el estudio de modelos
bacterianos alejados de los clásicos E. coli y B. subtilis, constituye una
importante limitante para el avance en el conocimiento de los factores que
afectan las interacciones entre bacterias y organismos hospederos. En este
trabajo nos propusimos investigar la utilidad de una colección de plásmidos
modulares llamados pSEVA(1), en algunos modelos empleados en la División
Ciencias Microbiológicas del IIBCE. Para esto se seleccionaron los siguientes
modelos; Proteus mirabilis (2) (patógeno oportunista en mamíferos),
Enterobacter sp. (3) (endófita, promotora del crecimiento de caña de azúcar),
Pseudomonas fluorescens (4) (rizóferica, controladora de hongos
fitopatógenos), Cupriavidus sp. (5) (simbionte de Parapitadenia rígida) y
Sinorhizobium meliloti (6) (simbionte de Medicago sativa). Se estudió el perfil
de resistencia a antibióticos, la capacidad de conjugarse y de replicar
plásmidos con distintos orígenes de replicación. Los resultados obtenidos nos
indican que la familia de plásmidos pSEVA es útil ya que cuenta con orígenes
de replicación y genes de resistencia a antibióticos funcionales en los distintos
modelos bacterianos. Actualmente estamos evaluando la utilidad de estos
plásmidos para la edición de genomas y estudios de expresión génica en varios
de estos modelos.
Financia ANII FCE y Fondo Dr. Prof. Roberto Caldeyro-Barcia
(1) Silva Rocha et al., NAR 2013 41:D666; (2) Zunino et al. FEMS Immun. Med.
Microbiol. 2001, 31:113; (3) Taulé et al., Plant Soil 2012, 356:35; (4) Yanes et
al., Agrociencia 2005 8:23; (4) Platero et al., Appl. Environ. Microbiol. 70: 4349;
(5) Taulé et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78:1692
35.
LEGUMINOSAS
OLEAGINOSAS
NATIVAS:
UNA
INEXPLORADA, CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE
SIMBIONTES DE MANIES NATIVOS.
RIQUEZA
RIZOBIOS
C.Ríos, E. Fabiano, R. Platero
Departamento de Bioquímica y Genómica Microbianas, Instituto de
Investigaciones Biológicas Clemente Estable – Ministerio de Educación y
Cultura.
Para la elaboración de biocombustibles, nuestro país emplea como materia
prima aceites obtenidos a partir de sorgo, canola, girasol, soja y maíz. Estos
cultivos reciben dosis de fertilizantes cercanas a 200 kilos de nitrógeno por
hectárea. Las leguminosas son capaces de obtener el nitrógeno necesario para
su desarrollo mediante la formación de asociaciones simbióticas efectivas con
bacterias fijadoras de nitrógeno. Al no necesitar fertilizante nitrogenado, las
leguminosas ofrecen una alternativa atractiva para los productores. Entre las
leguminosas oleaginosas, el maní (Arachis hypogaea) presenta importantes
ventajas para la producción de biocombustibles; el contenido de aceite de sus
granos llega al 50%, el mismo tiene una óptima relación entre ácidos grasos
oleicos y linoleico y el desarrollo de sus granos es subterráneo. Uruguay es uno
de los pocos países que tiene poblaciones naturales de maní encontrándose
dos especies Arachis villosa y Arachis burkartii. Mediante muestreos de raíces
de poblaciones naturales de A. villosa presentes en el Área protegida de
Esteros de Farrapos hemos construido una colección de rizobios simbiontes de
esta leguminosa. En este trabajo nos propusimos identificar y caracterizar esta
colección mediante análisis filogenéticos de las secuencias de los genes 16S
ARNr y nifH de sus integrantes. Los resultados obtenidos muestran que los
rizobios más frecuentes pertenecen al género Bradhyrhizobium, sin embargo
también se encontraron otras bacterias en los nódulos estudiados.
Paralelamente estamos estudiando la capacidad fijadora de nitrógeno de estos
aislamientos en su hospedero salvaje y en especies domesticadas de maní.
36. APAREAMIENTO DE LEVADURAS COMO MODELO DE FUSIÓN
CÉLULA-CÉLULA
V. Salzman1, V. Porro2, M. Bollati2, P.S. Aguilar1
1
Laboratorio de Biología Celular de Membranas Institut Pasteur de
Montevideo; 2Unidad de Biología Celular Institut Pasteur de Montevideo
La fusión de membranas es un proceso esencial para la vida de todo
organismo eucariota. El apareamiento de células haploides de Sacharomyces
cereviseae es un buen modelo para el estudio de la fusión célula-célula. Estas
células están sexualmente diferenciadas (como MATα o MATa) y aparean
espontáneamente formando zigotos diploides estables. Análisis genéticos han
permitido identificar un número significativo de proteínas que intervienen en el
proceso de fusión, sin embargo, los componentes claves aún no se conocen.
Actualmente las medidas de la eficiencia de la fusión celular se basan en la
cuantificación mediante microscopía de fluorescencia de pares fusionados,
donde uno de los componentes del par expresa en el citosol una proteína
fluorescente. Los pares que no pueden fusionar pueden lisarse o bien
permanecer no fusionados con sus membranas celulares muy cerca una de
otra. Si bien este método ha sido muy usado, consume mucho tiempo
limitando tanto el número de eventos de fusión como la cantidad de cepas que
pueden ser analizadas a la vez. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo
método basado en la ténica de citometría de flujo para cuantificar la fusión de
levaduras. Un defecto en la fusión puede medirse mediante ésta técnica
fácilmente ya que permite diferenciar pares fusionados, no fusionados y
lisados. Para este propósito células haploides MATa y MATalfa marcadas con
ConA conjugada a una proteína fluorescente son co-incubadas para permitir la
formación de zigotos. Cada cepa sintetiza un fragmento de una proteína
fluorescente que forma un fluoróforo exitable por complementación bimolecular. Así, en este ensayo se mide la acumulación de cuatro poblaciones
de células fluorescentes: triples positivas (pares fusionados), dobles positivas
(pares no fuionados), y simples positivas (haploides a o alfa). A su vez, una
modificación del ensayo permite cuantificar lisis. Con este nuevo método miles
de pares pueden ser analizados en segundos, proporcionando datos precisos y
reproducibles permitiendo por primera vez la cuantificación rápida de la fusión
celular en levaduras.
37. VINAZA COMO FERTILIZANTE DE CAÑA AZUCARERA: EFECTO
SOBRE LA COMUNIDAD BACTERIANA DEL SUELO.
D. Senatore1, P. Fernández1, V. Saravia2, M. Musso3, L. Loperena2, C.
Etchebehere1, A. Arias1, N. Bajsa1
1
Laboratorio de Ecología Microbiana, Instituto de Investigaciones Biológicas
Clemente Estable (IIBCE); 2Departamento de Bioingeniería del Instituto de
Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería (UDELAR); 3Departamento de
Geotécnica del Instituto de Estructuras y Transporte, Facultad de Ingeniería
(UDELAR)
La vinaza es un efluente que se obtiene de la producción de etanol como
biocombustible, caracterizado por un alto contenido de materia orgánica,
potasio y otros elementos. Es utilizada en diferentes países para riego por
poseer nutrientes para el crecimiento vegetal. Los microorganismos influyen en
el crecimiento de las plantas participando en ciclos biogeoquímicos,
aumentando la disponibilidad de nutrientes, regulando su crecimiento mediante
la producción de hormonas, causando enfermedades o antagonizando
patógenos. Al aplicar vinaza, la actividad microbiológica del suelo podría verse
afectada.
El objetivo general fue evaluar cambios en la microbiota del suelo tratado con
vinaza. Se tomaron muestras de dos sitios con suelos distintos, antes y
después de la aplicación de vinaza en tres concentraciones diferentes; se
utilizó como control una parcela sin vinaza. Se determinó la abundancia,
actividad y diversidad microbianas por técnicas bioquímicas y de biología
molecular. En el sitio 1 la vinaza promovió un aumento de las poblaciones
cultivables de bacterias heterótrofas, amonificantes y actinobacterias, mientras
que en el sitio 2 la vinaza aumentó la respiración microbiana. No se hallaron
diferencias significativas en la abundancia de bacterias totales, determinada
mediante PCR en tiempo real. Para visualizar el efecto sobre la diversidad
bacteriana se realizó DGGE a partir de productos de PCR del gen del ARNr
16S. Se observaron cambios en la estructura de la comunidad bacteriana entre
los diferentes tiempos de muestreo y tratamientos. Los efectos observados
fueron más pronunciados con la mayor dosis de vinaza, y perduraron hasta 5-8
meses después de la aplicación.
Financiación: Proyecto de Vinculación ANCAP – UdelaR; PEDECIBA; Beca de
apoyo para la finalización de posgrado en la UdelaR (CSIC)
38. ESTUDIO DEL POSIBLE ROL DE LA UBIQUITINACIÓN Y
FOSFORILACIÓN
EN
EL
TRÁFICO
INTRACELULAR
DEL
TRANSPORTADOR DE UREA (UREA) DE Aspergillus nidulans
M. Veyga1; M. Sanguinetti1; A. Ramón1
1
Sección de Bioquímica, Facultad de Ciencias (UDELAR)
En los microorganismos, el tráfico regulado de los transportadores de
nutrientes hacia y desde la membrana celular en respuesta a diferentes
estímulos, contribuye a la homeostasis celular y a la adaptación de la célula a
los cambios de su entorno. Se ha descrito un rol central de la ubiquitinación en
el control de estos procesos. También la fosforilación de residuos de Ser/Thr
parece jugar un rol importante en los mecanismos de control postraduccional
del tráfico de proteínas de transporte. Por otra parte, existen evidencias de que
para algunas de estas proteínas, el dominio C-terminal y las modificaciones
postraduccionales en el mismo, cumplen un importante rol en el tráfico y
localización final de las proteínas.
Nuestro grupo construyó un mutante de la proteína UreA, el transportador de
urea de Aspergillus nidulans, en el cual una deleción del dominio C-ter resultó
en la incapacidad de alcanzar la membrana plasmática. En este trabajo se
mutarán sitios identificados como posibles blancos de ubiquitinación o
fosforilación en este dominio, sobre una fusión de UreA a la GFP. Luego se
procederá a analizar la funcionalidad, capacidad de transporte y localización
subcelular de las proteínas mutadas, así como su nivel de degradación. De
esta manera esperamos poder contribuir a la comprensión de los mecanismos
de control postraduccional del tráfico intracelular de UreA en particular y de las
proteínas de membrana eucariotas en general.
BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR VEGETAL
(39-41)
39. ESTUDIO DE UN MUTANTE “KNOCKOUT” PARA UNA HISTONA DE
TIPO H1 Y SU EVALUACIÓN FRENTE A DIFERENTES TIPOS DE ESTRÉS
ABIÓTICO EN Physcomitrella patens.
G. Brañas1, C. Abreu2, S. Vidal3 y A. Ramón1.
1
Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular, Fac. de Ciencias (UDELAR).
2
Unidad de Proteínas Recombinantes, Instituto Pasteur de Montevideo.
3
Laboratorio de Biología Molecular Vegetal, Fac. de Ciencias (UDELAR)
Nuestro trabajo se centra en el estudio del rol de una histona de tipo H1,
BQ827028, del musgo Physcomitrella patens, en especial frente a diferentes
condiciones de estrés abiótico. Mediante recombinación homóloga se logró
generar tres mutantes “knockout”. Su caracterización implica la realización de
Southern blot para identificar posibles recombinaciones ilegítimas dentro del
genoma y la presencia de inserciones en tandem en los mutantes. Asimismo,
se realizó un estudio de citometría de flujo para determinar la ploidía de estos
mutantes. Estudios de un mutante con un silenciamiento parcial para este gen
demostró que no existe diferencia en la repetición nucleosomal pero sí en el
nivel de muerte celular y contenido de clorofila bajo condiciones de estrés
salino y osmótico. En el presente trabajo, se pretende evaluar en los mutantes
“knockout” generados, el efecto de la falta total de esta histona “linker” sobre la
distancia entre nucleosomas y el comportamiento de los mutantes a nivel de la
velocidad de crecimiento y frente a diferentes tipos de estrés abiótico: salino,
osmótico y térmico a nivel de recuperación post-estrés, contenido de clorofila y
muerte celular. Se han identificado otras histonas de tipo H1, Pp1s33 y
Pp1s72, cuya expresión será cuantificada en los mutantes como forma de
evaluar posibles efectos compensatorios ante la ausencia de BQ827028, en
condiciones normales de crecimiento y frente a estrés abiótico.
40.
ANÁLISIS DEL ROL FUNCINAL DE UNA NUCLEORREDOXINA DE
SOJA EN LA TOLERANCIA A SEQUÍA EN PLANTAS: AVANCES Y
PERSPECTIVAS.
A. L. Fleitas1, 2, J. P. Gallino1,O. Borsani2, S. Vidal1.
1
Laboratorio de Biología Molecular Vegetal, Facultad de Ciencias, Universidad
de la República; 2 Laboratorio de Bioquímica, Facultad de Agronomía,
Universidad de la República.
En nuestro país la soja es el principal cultivo de secano ocupando 1 millón de
hectáreas. La principal fuente de agua para éstos radica en precipitaciones
cuyas fluctuaciones originan períodos de déficit hídrico causantes de grandes
pérdidas económicas. La identificación de componentes genéticos involucrados
en las respuestas a estrés potenciará la mejora de los cultivos a nuestras
condiciones ambientales. En este sentido, se identificó un gen que codifica una
nucleorredoxina de soja (Glycine max; GmNRX) que se induce específicamente
en respuesta a sequía en genotipos resistentes a ella. Las NRXs son
tiorredoxinas de dominio múltiple acopladas a un dominio C1 (de unión a
diacilglicerol) C-terminal. El trabajo aborda la caracterización funcional de la
GmNRX mediante sobre-expresión en plantas y análisis bioquímicos de la
proteína recombinante. Actualmente, la secuencia de cDNA para la GmNRX fue
aislada a partir de mRNA de soja variedad N7001 y clonada mediante sistema
Gateway en vectores para expresión en E.coli (fusión a 6xHis) y en planta
(fusiones a HA y GFP). Se detectaron dos variantes de splicing que difieren en
un linker rico en cisteínas entre dos dominios Trx. Se realizaron pruebas de
inducción de la proteína recombinante siendo necesario optimizar las
condiciones para obtener proteína abundante. Se realizaron estudios de
expresión transitoria en tabaco de donde se infiere que la proteína tendría una
localización citosólica. Se ha avanzado en la agrotransformación de A.thaliana
con las construcciones antedichas así como en la obtención de plantas knockout para los genes ortólogos de A.thaliana. Se comentarán los avances
realizados hasta el momento, las perspectivas a futuro y las metodologías
mediante las cuales abordaremos los cuestionamientos.
Financiado por CYTED, PEDECIBA y ANII.
41. DESARROLLO RADICULAR CONTROLADO POR LUZ EN UN
MUTANTE DEFICIENTE EN ESTEROLES
F. Sena y O. Borsani
Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología vegetal, Facultad de
Agronomía, UdelaR.
El mutante dry2/sqe de Arabidopsis thaliana es hipersensible a sequía y su
fenotipo está asociado a una mutación a nivel de una escualeno epoxidasa
(SQE1) expresada en raíz, enzima clave dentro del metabolismo de esteroles.
Trabajos previos de nuestro grupo de investigación demuestran que los
esteroles son claves para el desencadenamiento de diversos tipos de
respuestas frente a sequía. La cantidad y calidad de luz influyen
significativamente sobre el metabolismo de esteroles, principalmente en los
intermediarios finales y en la distribución de formas conjugadas y libres. Hasta
el momento no se conocen en plantas los detalles sobre cuáles son los
mecanismos involucrados, en este trabajo se intenta responder estas
interrogantes a través de distintos abordajes. Resultados preliminares han
demostrado una alta dependencia del fenotipo dry2/sqe1 frente a la cantidad y
calidad de la luz incidente. Las raíces de este mutante presentan un incremento
de la actividad de la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGR),
enzima que sintetiza el mevalonato precursor de todos los esteroles en células
eucariotas. La actividad de esta enzima este aumentada posiblemente como
efecto compensatorio ante la reducción de ciertos esteroles de membrana
provocados por la mutación en SQE1. Nosotros planteamos la posibilidad que
la enzima HMGR este regulada a través de la luz en alguna de las formas ya
conocidas de regulación. Estos resultados permiten especular que los esteroles
o moléculas dependientes de su síntesis podrían estar controlando la respuesta
a diversos tipos de estrés ambientales.
NEUROCIENCIAS (42-55)
42.
EL RECEPTOR IMMUNE CD300F ES UNA NUEVA MOLECULA
INVOLUCRADA EN LAS INTERACCIONES NEURONA-GLIA Y PRESENTA
UN ROL NEUROPROTECTOR LUEGO DE LESIONES AGUDAS DE
CEREBRO.
1,2
D Alí-Ruiz, 3E Taranto, 3D Blanco, 2DTejera, 4,5A Ejarque-Ortíz, 6L Reyes,
E Comas-Casellas, 2M L Negro, 4,5A Martínez-Barriocanal, 2N Lago, 6P
Oliver, 4,5J Sayós and 1,2Hugo Peluffo.
4,5
1
Histology and Embryology, Faculty of Medicine, UDELAR, Uruguay;
Neurodegeneration Laboratory, Institut Pasteur de Montevideo, Uruguay;
3
Department of Physiopathology, Faculty of Medicine, Hospital de Clínicas;
4
Immunobiology Group, CIBBIM-Nanomedicine Program, Hospital Universitari
Vall d’Hebrón, Institut de Recerca (VHIR), Universitat Autònoma de Barcelona,
Barcelona, Spain; 5Networking Research Center on Bioengineering,
Biomaterials and Nanomedicine (CIBBER-BBN), Instituto de Salud Carlos III,
Barcelona, Spain; 6Uruguayan Center for Molecular Imaging (CUDIM).
2
Es bien sabido que los inmunoreceptores de la superficie celular juegan un rol
critico en la regulación del proceso inmune e inflamatorio, aunque poco se
conoce en el sistema nervioso central (SNC). CD300f es un inmunoreceptor
que participa en las reacciones inflamatorias en la Encefalomielitis autoinmune
experimental (EAE) y en diversos modelos de alergias. Hemos analizado la
función del CD300f en dos modelos de lesión cerebral: excitotóxico (NMDA) y
trauma (TBI). Utilizando el receptor soluble humano y de rata (CD300f-IgG), por
medio de microscopia confocal se analizó la presencia del ligando endógeno
para este receptor; se encontró principalmente en la sustancia blanca del SNC
y en la superficie de oligodendrocitos; astrocitos fibrosos y neuronas in vitro.
Cuando analizamos la expresión in vitro de rCD300f en células cerebrales por
medio de Q-PCR e inmunohistoquímica, observamos como se esperaba
expresión en la microglia, pero también en oligodendrocitos y neuronas.
Interesantemente, inyecciones intraparenquimatosas tardías (4 horas después
de la lesión) de un nanovector de terapia génica modular recombinante no viral
denominado NLSCt sobreexpresando hCD300f o rCD300f, indujo una
disminución en el volumen de lesión a los 3 días después de la inyección de
NMDA o TBI cuando se compara con la sobreexpresión de GFP control. Estos
datos sugieren que CD300f puede ser importante en las interacciones
inflamatorias neurona-glia y en sus interacciones tróficas. Además nuestros
resultados sugieren que la sobreexpresión tardía de CD300f por medio de una
terapia génica modular recombinante puede constituir una interesante
estrategia terapéutica para lesiones cerebrales agudas.
43.
LA ACTIVACIÓN DE Nrf2 INDUCIDA POR ACIDOS GRASOS
NITRADOS REVIERTE LA TOXICIDAD ASTROCITARIA EN UN MODELO
ANIMAL DE ELA
P. Diaz-Amarilla*, A. Trostchansky†, R. Barreto*, E. Trias*, P. Cassina‡, A.
Ferreira**, M. R. Vargas∞, B. A. Freeman∆, L. Barbeito*#1 y H. Rubbo†1
*
Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable y #Institut Pasteur,
Montevideo, Uruguay, †Departamento de Bioquímica, ‡Departamento de
Histología and Center for Free Radical and Biomedical Research, Facultad de
Medicina, Universidad de la República, Uruguay; **Departamento de
Inmunología, Facultad de Ciencias y Química, Uruguay; ∞Division of
Pharmaceutical Sciences, University of Wisconsin, WI; ∆Department of
Pharmacology, University of Pittsburgh, PA.
Los ácidos grasos nitrados (NO2-FA; nitro-fatty acids) son moléculas
electrofílicas que se forman en los tejidos debido a la sobreproducción de
especies reactivas de nitrógeno durante la inflamación y que pueden actuar
como mediadores de la señalización celular. Los NO2-FA inducen una variedad
de vías citoprotectoras y anti-inflamatorias a través de la modificación posttraducción de ciertas proteínas y la activación de factores de transcripción
como por ejemplo Nrf2. En ratas SOD1G93A, un modelo animal de Esclerosis
Lateral Amiotrófica (ELA), se demostró que la activación de Nrf2
específicamente en astrocitos previene la muerte de motoneuronas
característica de esta enfermedad neurodegenerativa fatal. Considerando que
los ácidos grasos nitrados son potentes inductores de Nrf2, en este trabajo
evaluamos el efecto protector de dos ácidos grasos nitrados, el ácido nitroaraquidónico (AANO2) y el ácido nitro-oleico (OANO2), en un modelo celular de
ELA. En primer lugar estudiamos la capacidad de AANO2 y OANO2 de inducir la
activación de Nrf2 en astrocitos en cultivo. Finalmente evaluamos la capacidad
de AANO2 y OANO2 de revertir la toxicidad de los astrcitos SOD1G93A sobre
motoneuronas en un sistema de co-cultivo. Los resultados obtenidos confirman
que los ácidos grasos estudiados son potentes inductores de Nrf2 y que la
inducción de esta vía podría constituir una estrategia terapéutica relevante para
el tratamiento de la ELA.
44. RESTRICCIÓN CALÓRICA EN RATONES TrJ: RESPUESTA
AUTOFAGICA-LISOSOMAL EN LA DEGRADACIÓN DE AGREGADOSPMP22 Y OTROS MECANISMO IMPLICADOS.
M. Bresque1,2, K Cal1, C Romeo1,2, G. Rosso4 , L. Canclini1, JM. Verdes3,
JR. Sotelo1 & A. Kun1,2
1 Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos, Instituto de Investigaciones
Biológicas Clemente Estable; 2 Departamento de Bioquímica, Facultad de
Ciencias; 3 Área Biofísica, Facultad de Veterinaria, Universidad de la
Republica, 4 Institut für Physiologie II Universitätsklinikum Münster, Alemania
Dentro del heterogéneo grupo de las neuropatías hereditarias periféricas
humanas, las alteraciones en el gen codificante de la Proteína de Mielina
Periférica-22 (PMP22) constituyen más del 50%. Charcot-Marie-Tooth 1E
(CMT1E), ubicada dentro de este grupo, causada por una sustitución L16P, se
caracteriza por ser una neuropatía desmielinizante donde la célula de Schwann
(SC) presenta un desequilibrio funcional que repercute en el axón y en la fibra
nerviosa en su conjunto.
En las CS de ratones Trembler-J, modelo animal de CMT1E, PMP22 presenta
dificultades en su plegamiento, provocando su agregación y acumulación
citosólica. Este estado metabólico lleva a la saturación de la vía proteosomal,
por lo cual la vía autofágica-lisosomal, toma un rol preponderante en la
patología. En ese contexto se ha observado que el estímulo de la autofagia,
favorece la eliminación de agregados de PMP22 en CS en cultivo.
Nuestro grupo, utilizando la estrategia de la Restricción Calórica (RC) como
herramienta para potenciar la autofagia, evaluó sus consecuencias en el
Sistema Nervioso Periférico (SNP) y sus ventajas terapéuticas para la
patología. Los hallazgos a nivel comportamental develaron cambios funcionales
a nivel de la fibra nerviosa. A nivel celular, se ha observado una drástica
disminución de los agregados proteicos alrededor de los núcleos en correlación
con un aumento de la expresión de marcadores lisosomales, lo cual indica el
éxito del tratamiento. Así mismo, los efectos de la RC sobre marcadores de
citoesqueleto, hacen posible hipotetizar algunos posibles mecanismos
involucrados en la modulación de los efectos de la RC en el SNP.
45.
ESTUDIO DE LA PROLIFERACIÓN
Austrolebias charrúa
EN
RETINA DE
PECES
I.Berrosteguieta, M. Torres, JC Rosillo, A. Fernández
Neuroanatomía Comparada (IIBCE)- Unidad Asociada a la Facultad de
Ciencias. (UDELAR)
En la retina de los peces, el sitio primario de neurogénesis postembrionaria se
encuentra en la zona marginal ciliar (ZMC). Las Austrolebias han resultado un
modelo propicio para el estudio de la proliferación y la neurogénesis en el
sistema nervioso central. Este estudio se propone evidenciar la proliferación en
la ZMC en la retina de Austrolebias. El método consiste en la utilización de dos
sustancia análogas a la timidina que presentan ventajas respecto al BrdU.
Estos compuestos halogenados: Cloro-deoxiuridina y Iodo-deoxiuridina,
pueden
marcar
diferentes
poblaciones
proliferantes
diferenciadas
temporalmente. Esto permite conocer origen y migración de las nuevas
células generadas. Los peces con 6 meses de vida, son inyectados
intraperitonealmente con IdU (día 0) y CldU (día 30). El día 31 se realiza la
fijación por perfusión intracardíaca de parafolmaldehído al 10%. Los ojos son
disecados y encastrados en una mezcla de gelatina-albúmina y cortados en
planos sagitales en un vibrátomo a 80 micras de espesor. Los cortes son
procesados mediante inmuncitoquímica para revelar la presencia de ambos
marcadores de proliferación. Se incuban durante 24 a 48 hs en ambos
anticuerpos primarios ratón anti IdU / rata anti CldU 1:500. Luego del revelado
con los anticuerpos secundarios las secciones son analizadas en un
microscopio Confocal. Las imágenes muestran abundante doble marcado en la
ZMC. Muy escasos fueron los núcleos individualmente marcados con un solo
compuesto halogenado, lo que indica que estas células reentraron en el ciclo
celular y por lo tanto son candidatas a ser las células madre de la retina.
46.
POSIBLE PARTICIPACIÓN DE SIRT1 Y DBC1 EN EL EFECTO
NEUROPROTECTOR MEDIADO POR RESVERATROL
A.Calliari1,2, MN. Bobba2, C. Escande3, E N. Chini3
1
Departmento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Veterinaria
(UDELAR); 2Departmento de Proteínas y Ácidos Nucleicos, IIBCE; 3Laboratory
of Signal Transduction, Department of Anesthesiology and Kodog Aging Center
Mayo Clinic College of Medicine.
Resveratrol es un polifenol capaz de ejercer una amplia gama de respuestas
fisiológicas y retrasar el inicio de enfermedades asociadas con el
envejecimiento. Por otro lado, el hecho de que efectos similares puedan ser
reproducidos mediante la activación de la proteína SIRT1, sugiere que esta
podría ser blanco de su regulación. Se ha reportado que la administración de
resveratrol ejerce un efecto neuroprotector en situaciones patológicas, como
isquemia cerebral y enfermedades neurodegenerativas; no obstante, su efecto
en el curso de la Degeneración Walleriana es aún un tema controversial.
Mediante la utilización de un modelo in vitro de Degeneración Walleriana
basado en cultivos de ganglio de raíz dorsal (DRG), nosotros pudimos observar
que el resveratrol produce un enlentecimiento en el curso de la degeneración
axonal, de un modo dependiente de NAD+. Además, observamos que dicho
efecto neuroprotector queda suprimido ante la presencia de suramina, un
inhibidor de SIRT1. Interesantemente, un fenotipo neuroprotector similar al
generado por la administración de resveratrol fue observado en cultivos de
DRG provenientes de animales knockout para DBC1, un inhibidor endógeno de
SIRT1, a la cual se encuentra asociado. Pudimos mostrar que el resveratrol es
capaz de disociar el complejo SIRT1/DBC1 e inducir la consecuente activación
de SIRT1. Ante estos resultados, proponemos que resveratrol ejerce un efecto
neuroprotector en la Degeneracion Walleriana al activar SIRT1 mediante la
disociación de su inhibidor DBC1.
47.
LA TRANSICIÓN FENOTÍPICA DE MICROGLÍA A CÉLULAS ABA
ESTÁ ASOCIADA AL DESARROLLO DE LA PATOLOGÍA EN UN MODELO
ANIMAL ELA
E. Trias1, S. Ibarburu1, P. Díaz-Amarilla1, E. Isasi1, S. Olivera-Bravo1, L.
Barbeito2
1
Neurobiología Celular y Molecular, Instituto de Investigaciones Biológicas
Clemente Estable, Montevideo 11600, Uruguay; 2Institut Pasteur de
Montevideo, Montevideo 11400, Uruguay
La reactividad asotrcitaria y microglial en la médula espinal de las ratas
SOD1G93A, un modelo de Esclerosis Lateral Amiotrófica, es caracterísitca de
dicha patología. Previamente hemos demostrado que la parálisis generada en
las ratas SOD1G93A está estrechamente asociado con la aparición de un
fenotipo astrocitario proliferativo rodeando a las motoneuronas. Éstas células
llamadas astrocitos aberrantes (AbA), son altamente tóxicas para las
motoneuronas. Sin embargo, el origen de las células AbA es desconocido. En
este trabajo analizamos los marcadores fenotípicos expresados por las células
AbA mediante inmunohistoquímica. Además, células microgliales aisladas de
animales sintomáticos fueron estudiadas por cell-sorting utilizando un marcador
de microglia, CD11b. Las células fueron re-plaqueadas y la transición fue
analizada. El número de AbA Ki67+ aumenta durante la fase sintomática de la
enfermedad. La mayor parte, expresa tanto marcadores astrocitarios, GFAP,
así como marcadores microgliales, Iba1 y CD163. Los cultivos de médula
espinal sintomática dieron lugar a un gran número de células microgliales que
expresan Iba1, CD11b y CD68. Las células CD11b+ re-plaqueadas luego del
cell-sorting sufren una transición fenotípica a células AbA luego de 2 semanas.
Durante este tiempo, la expresión de marcadores microgliales disminuye,
mientras que aumentan los niveles de marcadores astrocitarios, GFAP y
S100. Estos resultados muestran arrojan evidencia sobre una población de
células microgliales proliferantes en los animales SOD1G93A que sufren una
transición fenotípica hacia astrocitos aberrantes luego del comienzo de los
síntomas. Estas células podrían ser un nuevo blanco terapéutico para la
búsqueda de tratamientos que ayuden al enlentecimiento de la ELA.
48.
LA MATRIZ EXTRACELULAR DE LAS FIBRAS NERVIOSAS
PERIFÉRICAS ESTÁ ASOCIADA A DOMINIOS ESPECÍFICOS Y CAMBIA
DURANTE LA NEURODEGENERACIÓN.
Rosso G (3) , Villar S (1a), , Bresque M (1b,2), Romeo C (1b), Cal K (2),
Pizzarossa C (2) Canclini L (2); Sotelo JR (2), Negreira C (1c) & Kun A (1b,2).
(1a)
Facultad de Ciências, Microscopía Electrónica de Barrido; (1b) Facultad de
Ciências; DPAN- IIBCE Unidad Asociada a Sección Bioquímica; (1c) Facultad
de Ciencias, Laboratorio de Acustica y Utrasonido; (2) Departamento de
Proteínas y Ácidos Nucleicos, IIBCE; (3) Institut für Physiologie II
Universitätsklinikum Münster, Alemania
Información-General: La matriz extracelular (MEC) en las fibras nerviosas
periféricas en mamíferos juega un importante papel en: el desarrollo, la
proliferación de las células de Schwann, su adhesión, su extensión y el proceso
de mielinización. El anclaje de la fibra a su matríz, se asegura mediante
uniones en trans desde la glía, conectados en cis con el citoesqueleto de actina
subcortical. Su dinámica asegura la transducción de señales a través de la
modulación de la citoarquitectura, respondiendo el axón a la oferta de progreso
radial ofrecido por la glía.
Información-Específica: Nuestro grupo, ha señalado por primera vez, mediante
microscopía de fuerza atómica (MFA), la existencia de diferencias en la
constitución molecular y la organización de la matriz extracelular de las fibras
nerviosas periféricas, asociadas al genotipo murino Trembler-J, modelo animal
de la neuropatía humana CMT1E. Estas diferencias se asocian también a la
citoarquitectura de actina, lo que en conjunto le confiere distintas propiedades
mecánicas genotipo específicas.
Nuestro abordaje: La superficie de fibras nerviosas periféricas de genotipo
salvaje (+/+) y mutante (TrJ/+) han sido estudiadas por microscopía electrónica
de barrido. Las fibras metalizadas lucían diferencias en la MEC de similar
aspecto al observado empleando MFA. Sin embargo, el estudio de fibras (+/+)
no metalizadas mostró una MEC diferente asociada a dominios subcelulares
específicos (nodo, incisuras de Schmit-Lanterman, núcleo celular), sugiriendo
una estructura coordinada y jerarquizada de la lámina basal y de la MEC,
ausente en fibras (TrJ/+). Tales hallazgos no han sido señalados antes en la
literatura.
49. ROL DE LAS CILIAS PRIMARIAS EN LA DIFERENCIACIÓN IN VIVO
DE LAS CÉLULAS GANGLIONARES DE LA RETINA
P. Lepanto1, J.L. Badano1, F.R. Zolessi2
1
Laboratorio de Genética Molecular Humana, Institut Pasteur de
Montevideo;2Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de
Ciencias, UdelaR
Durante el desarrollo embrionario, las neuronas adquieren sus características
morfológicas y funcionales como resultado de la combinación de información
heredada y señales provenientes del entorno. Las cilias primarias son
organelos que participan en la recepción y procesamiento de diferentes señales
extracelulares, y mutaciones en proteínas involucradas en su funcionamiento
dan lugar a defectos en el desarrollo del sistema nervioso. Sin embargo, la
función de las cilias en la diferenciación neuronal no ha sido explorada en
profundidad. El objetivo de nuestro trabajo es estudiar la localización y función
de las cilias primarias durante la diferenciación de las células ganglionares de
la retina (RGCs), usando embriones de zebrafish como modelo. En embriones
que expresan la proteína de localización ciliar Arl13b fusionada a GFP, hemos
observado que las RGCs presentan una cilia primaria desde el inicio de su
diferenciación, localizándose en el extremo apical de los neuroblastos previo y
durante su retracción. Por otro lado, comenzamos a estudiar la función de este
organelo en el proceso de diferenciación por medio de la inyección de
morfolinos para IFT88 o elipsa, ambas proteínas necesarias para la formación
de las cilias. En los embriones morfantes las RGCs muestran una demora en la
retracción del proceso apical y el correcto posicionamiento del cuerpo celular
mientras que el crecimiento axonal no se ve significativamente afectado. Estas
observaciones indican que las cilias primarias podrían coordinar temporalmente
los diferentes eventos que ocurren durante la diferenciación, y nos llevan a
profundizar en los mecanismos moleculares involucrados en este proceso.
50. ESTUDIO DE LA NEUROPROTECCIÓN POR AGONISMO NICOTINICO
EN UN MODELO EXPERIMENTAL DE ENFERMEDAD DE PARKINSON
C.Mouhape, G. Costa, JA. Abin-Carriquiry, F. Dajas y G. Prunell
Dpto. Neuroquímica, IIBCE, Montevideo, Uruguay
La Enfermedad de Parkinson (EP) es una patología neurodegenerativa que
afecta un 2% de la población mundial mayor de 60 años. Se caracteriza por
alteraciones motoras debidas a un deterioro extrapiramidal asociado a la
pérdida selectiva de las neuronas dopaminérgicas de la Sustancia Nigra
compacta (SNc) y una disminución concomitante de dopamina (DA) a nivel de
sus terminales en el Cuerpo Estriado (CE). No existe hasta el momento una
terapia efectiva para esta enfermedad; los tratamientos disponibles son
sintomáticos y no detienen el proceso neurodegenerativo.
Estudios epidemiológicos indican que los fumadores de tabaco tienen menor
incidencia de EP. Se ha sugerido que este efecto podría ser mediado por la
acción de la nicotina sobre los receptores nicotínicos de acetilcolina (NAChR).
Para estudiar los efectos del agonismo nicotínico en un modelo de EP, se
indujo la muerte de las neuronas dopaminérgicas de la SNc de ratas
inyectando la toxina rotenona (1ug) unilateralmente en el haz medial del
cerebro anterior, mientras que se administró nicotina (0.4mg/K) a los animales
desde 5 días antes y hasta 30 días después de la lesión.
Los resultados muestran que los animales tratados con nicotina tienen más
células dopaminérgicas remanentes en la SNc analizadas por
inmunohistoquímica y mayores niveles de DA medidos por HPLC-EC en el CE
post-lesión en comparación a los animales no tratados.
Los resultados evidencian un efecto neuroprotector inducido por agonismo
nicotínico en un modelo de EP in vivo, apoyando la hipótesis de que los
NAChR podrían ser un blanco terapéutico para la EP.
IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS PROGENITORAS EN LA TRANSICIÓN
BULBO OLFATORIO-LÓBULOS TELENCEFÁLICOS
EN Austrolebias
charrua
51.
M. Torres, JC. Rosillo, S. Olivera, G. Casanova, A. Fernández
Neuroanatomia Comprada (IIBCE), Unidad Asociada a la Facultad de Ciencias
(UDELAR) Neurobiologia Celular y Molecular (IIBCE), Unidad de MicroscopÍa
Electrónica de Transmisión de Facultad de Ciencias (UDELAR)
En los peces adultos, la actividad neurogénica y regenerativa es muy marcada
en relación a otros grupos de vertebrados. Las células que generan nuevas
neuronas se localizan en los denominados “nichos neurogénicos”. Poco se
sabe de las características de las células madre que allí habitan. En el cerebro
de Austrolebias se ha demostrado la existencia de múltiples lugares con
actividad proliferativa y neurogénica. Una de ellas es la zona ventricular
telencefálica (ZVT) donde hay una marcada proliferación en las paredes
ventriculares. En este trabajo describiremos una región proliferativa particular,
ubicada en el parénquima de la transición entre los bulbos olfatorios y los
lóbulos telencefálicos. Ocho peces adultos se inyectaron intraperitonealmente
con dos marcadores de proliferación celular análogos de la timidina (IdU y
CldU), separados por una ventana temporal de 30 días. Se emplearon las
maniobras
metodológicas
para
revelar
estos
marcadores
por
inmunofluorescencia y para análisis mediante microscopía electrónica de
transmisión (MET). El revelado de la inmunofluorescencia permitió identificar
tres tipos celulares: IdU+, que migraron particularmente por la zona de
transición mencionada; CldU+, que se mantuvieron en el sitio de proliferación y
doble marcadas lo que indicó su reentrada al ciclo celular. Un grupo doble
marcado fue localizado aproximadamente a 30 micras de la luz ventricular. La
MET reveló que en la región de transición hay diferentes tipos de glïa radial. En
relación con estas hay un grupo de células medianas, redondeadas, de aspecto
homogéneo, con características de célula progenitora, que asociamos con
aquellas doble marcadas con IdU/CldU.
52.
ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DEL pmp22 EN
CEREBELO
DE Mus musculus Trembler-J, PORTADORES DE LA
MUTACIÓN PUNTUAL T1703C.
Pizzarossa C1, Canclini L1, Bresque M1,2, Romeo C1,2, Rosso G4, J. M.
Verdes3 , A.E. Kun1,2.
1
Departamento de Proteinas y Ácidos Nucleicos (IIBCE); 2Sección Bioquímica,
Unidad Asociada, Facultad de Ciencias (UDELAR); 3Área Biofísica de Facultad
de Veterinaria (UDELAR), 4 Institut für Physiologie II Universitätsklinikum
Münster, Alemania
Información general: El pmp22, está situado en Mus musculus en el
cromosoma 11, el cual tiene homologías con el 17 humano, en cuyo brazo
corto, se localiza dicho gen. Al menos uno de sus transcriptos, se traduce
luego en la proteína mielínica periférica (PMP22). La patología de esta
expresión ha sido
exhaustivamente estudiada en el Sistema Nervioso
Periférico (SNP), pero escasamente en el Sistema Nervioso Central (SNC).
Información específica: El gen pmp22 tiene actualmente dos funciones
principales conocidas: 1) generar una proteína integral de membrana y 2) como
gen expresado durante la detención del ciclo celular (“growth arrest specific
gene”, gas-3). En 1979, se detecta en los Laboratorios Jackson, (USA), una
cepa de Mus musculus “Tembladores” (Trembler-J, Tr-J), portadora de una
mutación espontánea puntual (T1703C), que afecta al primer dominio
transmembrana de la PMP22 y utilizada frecuentemente como modelo animal
en el estudio de la neuropatía periférica humana hereditaria CMT1E.
Nuestro abordaje: Las causas de la afectación central (temblor y ataxia de la
marcha) no han sido aún exploradas en Tr-J. Para ello, nos propusimos
estudiar la expresión de pmp22 en las neuronas de la corteza cerebelosa
(criosecciones parasagitales de encéfalos adultos de Mus musculus TremblerJ: (Tr-J/+) y wild type (+/+)) mediante hibridación in situ (utilizando sondas
complementarias del ARNm de pmp22) e Inmunohistoquímica (anticuerpo-antiPMP22). Como resultado se evidenció por primera vez, histológicamente, la
expresión de pmp22 a través de su transcripto y de la PMP22, en las neuronas
de la corteza cerebelosa, observándose menor expresión en mutantes.
53. BÚSQUEDA DE PROTEÍNAS RESPONSABLES DE LA REACTIVACIÓN
DE LA PLASTICIDAD EN LA CORTEZA VISUAL DE RATÓN ADULTO.
L. Ruiz, G. Vierci, N. Bornia, F.M. Rossi
Laboratorio de Neurociencias, Instituto de Biología,
Facultad de Ciencias, UdelaR
La escasa recuperación del sistema nervioso adulto luego de una lesión o de
una patología es en gran parte debida a la reducción fisiológica de su
capacidad plástica, la habilidad de modificar y adaptar su organización
anatomo-fisiológica en función de la experiencia. Afortunadamente, en los
últimos años se han identificado algunas estrategias que potencian la
plasticidad neuronal en el adulto y así facilitan la recuperación de determinadas
funciones. Estudios pioneros en la corteza visual primaria (CV1) de roedores
han demostrado que el tratamiento crónico con fluoxetina, ampliamente
conocido por su uso como anti-depresivo, potencia la plasticidad en el adulto y
determina la recuperación de la visión en animales ambliopes. Sin embargo, los
mecanismos subyacentes a la restauración de la plasticidad en el adulto son
aún desconocidos. El presente trabajo tiene como objetivo contribuir a la
caracterización de dichos mecanismos a nivel molecular. En particular,
desarrollamos ensayos de proteómica mediante electroforesis bidimensional
seguida por espectrometría de masa sobre muestras de CV1 de ratones C57B6
adultos tratados con fluoxetina (plasticidad restaurada) y controles (bajo nivel
de plasticidad). Resultados preliminares nos han permitido identificar de un
total de 300 spots, 41 con expresión diferencial entre las dos condiciones. De
estos, se han podido identificar 31 proteínas mediante espectrometría de masa.
Estas proteínas están implicadas en diversos procesos celulares (proteínas
mitocondriales, enzimas metabólicas, regulación de la estructura neuronal).
Esperamos poder confirmar próximamente el rol de algunas de estas proteínas
en la restauración de la plasticidad cortical inducida por la fluoxetina in vivo.
54.
INFLUENCIA DE LOS ASTROCITOS EN LA SOBREVIDA DE
NEURONAS EN UN MODELO DE ACIDEMIA GLUTÁRICA I
E. Isasi1, M.N. Sarlabós1, V. Cóppola1, E. Trías1, L. Barbeito2, S. OliveraBravo1
1
NBCM, Instituto Clemente Estable, Montevideo, Uruguay; 2 Institut Pasteur de
Montevideo, Uruguay
La Acidemia Glutárica I (GAI) es una enfermedad neurometabólica que afecta
selectivamente el sistema nervioso central (SNC) de niños que presentan una
desaparición casi total de la actividad catalítica de una enzima mitocondrial
involucrada en el catabolismo de aminoácidos claves como lisina y triptófano y
una acumulación en grandes cantidades de ácidos orgánicos cercanos al
glutamato como el ácido glutárico (GA). Se desconocen las causas de la
vulnerabilidad cerebral así como del papel de las células gliales en el comienzo
y progresión de GAI. Para conocer el efecto de los astrocitos en la patogénesis
de GAI, se sometieron astrocitos corticales a dosis de lisina presentes en la
dieta o a dosis fisiopatológicas de GA durante 24 h y luego se co-cultivaron
neuronas corticales o estriatales para evaluar viabilidad y morfología neuronal 3
a 5 días después. Las neuronas corticales y estriatales sembradas sobre
astrocitos controles mostraron patrones típicos de células saludables bien
desarrolladas. Cuando las neuronas se sembraron sobre astrocitos pretratados
con lisina 10 mM o GA 5 mM hubo una simplificación significativa del árbol
dendrítico, cambios de tamaño y disminución de la sobrevida entre un 18 y
30%. La viabilidad de los cultivos aislados de neuronas embrionarias no fue
afectada ni por lisina 10 mM ni GA mM, descartándose así un efecto directo de
dichas sustancias. Los astrocitos sometidos a GA aumentaron la expresión del
marcador de estrés de retículo BiP, sugiriendo que los astrocitos pueden ser
primariamente afectados en GAI lo que repercutiría posteriormente en la
sobrevida neuronal.
55. EFECTOS DEL ALCOHOLISMO MATERNO AGUDO SOBRE SU
PROGENIE
M. Perata1, E. Trías1, E. Isasi1, P. Días Amarilla1, L. Barbeito2, S. Olivera
Bravo1
1
Laboratorio de Neurobiologñia celular y molecular, IIBCE ; 2 Laboratorio de
Neurodegeneración, Institut Pateur de Montevideo.
El alcoholismo materno crónico es responsable de alteraciones en el
crecimiento y neurodesarrollo de los hijos. Como se desconoce si el
alcoholismo materno agudo produce los mismos efectos, realizamos diversos
protocolos de administración única de etanol a la madre durante distintas
etapas de la gestación para estudiar sus efectos sobre los hijos. Hemos
seleccionado un protocolo de administración intraperitoneal de una sola dosis
de 6g/kg de etanol 30% que produce efectos reproducibles sobre la progenie y
un modelo de alcoholismo materno crónico a demanda como control positivo.
Se estudió número, estado y peso corporal y cerebral de las crías al momento
de los nacimientos y posteriormente las poblaciones celulares principales del
hipocampo. La exposición aguda al etanol produjo una disminución del número
de crías viables de hasta el 40% y del peso corporal y cerebral de hasta el 20 y
25% respectivamente. El análisis histoquímico e inmunohistoquímico reveló
ausencia de muerte apoptótica significativa en el hipocampo y una disminución
del número de células proliferantes en la capa molecular del giro dentado del
hipocampo sugiriendo que esta es la estructura cerebral más afectada. No
hubo cambios significativos en la reactividad glial ni en las poblaciones
neuronales más importantes. Los datos obtenidos muestran que una única
dosis de alcohol que la madre reciba durante la gestación es suficiente para
alterar su progenie y dañar el hipocampo de los hijos, la estructura principal en
los procesos celulares que subyacen al aprendizaje y la memoria.
PARASITOLOGÍA MOLECULAR (56-60)
56.
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LA PGF2α SINTASA DE
Trypanosoma cruzi COMO BLANCO TERAPÉUTICO DE LA ENFERMEDAD
DE CHAGAS.
F. Díaz1, ML. Chiribao1, A. Trochine1, C. Robello1,2
1
Unidad de Biología Molecular, Institut Pasteur de Montevideo; 2 Departamento
de Bioquímica, Facultad de Medicina, UDELAR
La enfermedad de Chagas es una zoonosis endémica en Sudamérica causada
por el parásito protozoario Trypanosoma cruzi. Causa muy alta morbilidad y
mortalidad y solo se han desarrollado dos fármacos anti-chagásicos que
poseen eficiencia variable y efectos secundarios indeseables. El presente
trabajo describe el estudio de dos enzimas como posibles nuevos blancos
terapéuticos.
La enzima Old Yellow Enzyme (TcOYE), una NAD(P)H flavina oxidorreductasa
que contiene FMN como grupo prostético, cataliza la síntesis de prostaglandina
F2α (PGF2α) y media la reducción de algunos fármacos tripanocidas. La
síntesis de prostaglandinas por parte de los tripanosomas en el curso de la
infección, es un proceso que prácticamente no ha sido estudiado y que
posiblemente esté relacionado con los procesos de infección y patogénesis,
dado que han sido asociadas a procesos patológicos en otros protozoarios
relacionados. Esta enzima no se ha identificado en animales, por lo que cumple
con una de las características importantes para ser un posible nuevo blanco
terapéutico. La otra enzima pertenece a la familia de las aldocetoreductasas
(TcAKR). Presenta homología con las prostaglandinas sintasas humanas y de
Trypanosoma brucei, aunque su actividad como tal no ha sido demostrada en
T. cruzi. La síntesis de PGF2α catalizada por TcOYE es una característica
única de T. cruzi respecto a otros tripanosomátidos, en los cuales, la síntesis de
PGF2α es catalizada por aldocetoreductasas. Se generaron anticuerpos
policlonales específicos contra TcOYE y TcAKR y se estudió la localización
subcelular. Mediante sobreexpresión se estudiará el rol de dichas enzimas en
el contexto de la infección.
57. BIOSÍNTESIS DE TRIPANOTIÓN EN TRIPANOSOMAS: UNA POSIBLE
ALTERNATIVA PARA EL TRATAMIENTO DE TRIPANOSOMIASIS HUMANAS
L. Fiestas1, A. Medeiros1,2, M. A. Comini 1
1
Laboratorio de biología redox de tripanosomas, Institut Pasteur de
Montevideo; 2 Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina (UdelaR).
.
Las opciones terapéuticas para el tratamiento de tripanosomiasis humana y
leishmaniasis (enfermedad de Chagas, enfermedad del sueño, fiebre negra)
todavía son limitadas. El metabolismo redox de tripanosomátidos se basa en
una pequeña molécula ditiólica ausente en mamíferos, el tripanotión [T(SH) 2].
El trabajo de nuestro grupo tiene como objetivo principal caracterizar y explotar
el potencial farmacológico que la biosíntesis de T(SH)2 ofrece para el desarrollo
de quimioterapias más seguras y eficaces contra las tripanosomiasis.
Dependiendo de la especie, la biosíntesis de T(SH)2 podrá requerir de una sola
enzima, tripanotión sintetasa (TryS, por ejemplo, en Trypanosoma brucei) o dos
enzimas independientes monoglutationilespermidin sintetasa (GspS) y TryS (T.
cruzi, Leishmania infantum).
Secuencias codificantes para una GspS putativa fueron aisladas del ADN
genómico de T. cruzi de las cepas CL-Brener, DM28c, Esmeraldo y Tulahuen 2.
Se detectó expresión activa y compartimentalizada de TryS pero no de GspS,
en los tres estadíos de vida de las dos primeras cepas.
Estudios metabólicos de complementación con una línea de T. brucei
defectuosa en TryS (ARNi), suplementada con tioles fisiológicos de bajo peso
molecular [glutatión: GSH, y T(SH)2]. revelaron la dependencia exclusiva de los
parásitos en la síntesis de novo de T(SH)2. In vivo, utilizando la línea ARNi para
la TryS, se demostró la importancia fisiológica de T(SH)2 para la supervivencia
del parásito en un huésped mamífero (modelo de ratón).
58.
EXOMETABOLOMA
DE
RELEVAMIENTO
PRELIMINAR
EXCRETADOS
ECHINOCOCCUS
GRANULOSUS:
DE
LOS
ÁCIDOS
ORGÁNICOS
C. Ramos1, H. Bisio1, F. Ferreira1, G. Salinas1.
1
Departamento de Biociencias, Facultad de Química (UDELAR).
Los platelmintos parásitos presentan al menos tres vías divergentes de
obtención de energía a partir de la glucosa: fermentación láctica, dismutación
del malato y fosforilación oxidativa, que les permite a estos organismos, con
complejos ciclos de vida, adaptarse en sus diversos nichos de colonización. En
este trabajo nos planteamos analizar el exometaboloma de ácidos orgánicos
excretados (reflejo del complejo de reacciones intracelulares) por el platelminto
parásito Echinococcus granulosus durante su estadio larvario, con el objetivo
de entender cuál de estas vías canaliza en mayor medida la obtención de ATP.
Para esto, se analizaron muestras de las excreciones in vivo: líquidos hidático
(LH) provenientes de quistes fértiles (contienen protoescólex) y sanos (no
dañados por el sistema inmune), y no fértiles. El análisis se realizó por HPLC
utilizando las columnas Shodex RSPARK KC-811 y Phenomenex OA. Se
constató la presencia de lactato, succinato, fumarato, acetato, cis-aconitato y
trans-aconitato, además un metabolito que correspondería bien a malato o bien
a piruvato, y tres metabolitos que no pudieron ser asignados a ninguno de los
estándares utilizados. Asimismo, se descartó la presencia de propionato. Un
hallazgo interesante es que los LH provenientes de quistes fértiles tienen una
concentración mayor de fumarato y/o succinato que de lactato, en tanto lo
contario ocurre en los LH provenientes de quistes no fértiles. Nuestros
resultados preliminares indican que tanto la fermentación láctica como la
dismutación del malato están operativas en E. granulosus y que los productos
del exometabolismo son un marcador de fertilidad de los quistes.
59.
ESTUDIOS SOBRE LOS MECANISMOS HUMORALES ASOCIADOS
LA PROTECCIÓN DE UNA VACUNA RECOMBINANTE CONTRA LA
FASCIOLOSIS OVINA
C. Salazar1, G. Maggioli1, S. Rossi2, P. Alonso3, C. Carmona1
1
Unidad de Biología Parasitaria, Instituto de Higiene, Facultad de Ciencias
(UDELAR).
2
Polo Tecnológico de Pando. Facultad de Química (UDELAR)
3Servicio Seroterápico. Campo Experimental. Instituto de Higiene. Facultad de
Medicina.
La parasitosis causada por Fasciola hepatica representa un problema de
relevancia económica para el país debido a las pérdidas generadas por la
disminución en la producción pecuaria. Actualmente, la quimioterapia es el
tratamiento de elección, sin embargo, su control representa un alto costo para
el productor, no se evita la reinfección y más recientemente se ha constatado la
aparición de focos de resistencia a la única droga autorizada por la Unión
Europea para su tratamiento. Es este contexto, nuestro grupo viene
desarrollando una vacuna experimental contra el parásito centrada en el uso de
la leucina aminopeptidasa recombinante de F. hepatica (FhLAPr), una antígeno
que ha mostrado previamente su capacidad protectora en ovinos en
combinación con distintos adyuvantes. Se presentan los resultados de un
ensayo utilizando FhLAPr formulada con el Hidróxido de Aluminio (Sigma) y
Adyuvac 50 (Laboratorios Santa Elena) y sus respectivos controles distribuidos
en 4 grupos de 6 ovinos utilizando el esquema de primoinmunización, refuerzo
en la semana 4 y desafío experimental con la forma infectante del parásito en
la semana 6. Los resultados obtenidos fueron dispares respecto a los obtenidos
previamente constatándose un porcentaje de protección del 74% con Adyuvac
50 y 54% con el Hidróxido de Aluminio. Los niveles de anticuerpos anti-FhLAP
y su índice de avidez relativa (IAR) fueron determinados mediante ELISA,
obteniéndose un pico de anticuerpos anti-FhLAP en la semana del desafío
similar con ambos adyuvantes acompañado de un perfil de respuesta mixta
Th2/Th1 y un patrón de avidez diferencial en los grupos experimentales.
60.
ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA PROTEIN-QUINASA CK1 DE
LEISHMANIA: UN BLANCO PARA EL DESARROLLO DE NUEVOS
MEDICAMENTOS ANTI-PARASITARIOS
F. San Martín1 , S. Horjales1, N. Rachidi2, G. Spaeth2, A. Buschiazzo1
1
Unidad de Cristalografía de Proteínas (Institut Pasteur de Montevideo,
Uruguay); 2 Unité de Parasitologie Moléculaire et Signalisation (Institut
Pasteur, Francia)
Los parásitos del género Leishmania se enfrentan a ambientes hostiles,
exigiendo respuestas rápidas para su supervivencia. La fosforilación de
proteínas es un mecanismo central en la regulación de respuestas adaptativas
a señales ambientales. Las caseína-quinasas de tipo 1 (CK1) son una familia
de serina/treonina-quinasas, altamente conservadas y presentes de forma
ubicua en organismos eucariotas. La isoforma 2 de la CK1 de Leishmania
(LmaCK1.2) es una proteína-quinasa secretada constitutivamente en el estadio
promastigota, siendo capaz de fosforilar sustratos en la membrana del parásito
así como sustratos exógenos, entre ellos la cadena IFNAR 1 del receptor de
interferón de tipo 1 (IFN 1). LmaCK1.2 ha sido descripta como blanco potencial
para el desarrollo de inhibidores específicos, potencialmente útiles en
estrategias de descubrimiento racional de nuevas drogas que permitan
combatir la enfermedad.
Nuestro objetivo último es resolver la estructura cristalográfica de LmaCK1.2.
Para ello esta primer etapa se ha centrado en el desarrollo de métodos de
producción y purificación de la proteína recombinante. Estudios previos
mostraron que la fusión tiorredoxina-CK1 se expresaba soluble en E. coli con
bajo rendimiento. La expresión de esta fusión fue evaluada en diferentes
vectores, cepas de E. coli y condiciones de inducción. La cantidad de
LmaCK1.2 soluble ha sido sin embargo insuficiente. Decidimos entonces
ensayar la expresión en células eucariotas (S2 de Drosophila), para lo cual una
serie de construcciones han sido generadas, que permitan la expresión de la
proteína en forma intracelular o secretada. Discutiremos sobre los avances de
esta línea, en preparación para encarar estudios estructurales.
INMUNOLOGÍA Y BASES BIOQUÍMICAS DE LA
INFLAMACIÓN (61-62)
61.
ANÁLISIS DE LA INICIACIÓN DE LA ACTIVACIÓN DEL SISTEMA
COMPLEMENTO SOBRE LA CAPA LAMINAR DE ECHINOCOCCUS
GRANULOSUS
A.Barrios, P.I. Seoane, A. Díaz
Cátedra de Inmunología, Depto. de Biociencias de Facultad de Química e
Instituto de Química Biológica de Facultad de Ciencias, UdelaR, Uruguay
La capa laminar (CL) es la estructura acelular rica en carbohidratos que
delimita la larva del parásito cestode Echinococcus granulosus. La CL ofrece
una gran superficie de interacción al sistema complemento (SC) del hospedero,
una cascada enzimática especializada en opsonizar superficies no propias. El
SC se activa a partir de reconocimiento positivo o negativo. El reconocimiento
positivo puede ser por anticuerpos (vía clásica, VC) o ciertas lectinas (vía de
las lectinas, VL). El reconocimiento negativo es propio de la vía alterna (VA),
que se dispara sobre superficies que carecen de inhibidores, y que además
amplifica la activación iniciada por las otras dos vías. Sabemos que la CL activa
pobremente el SC y que recluta factor H, el inhibidor plasmático de la VA. Sin
embargo, más allá de que tiene anticuerpos unidos, y que ciertos datos han
sugerido activación por las vías de reconocimiento positivo, no se había
estudiado directamente la iniciación de la VC y/o VL sobre la CL. En este
trabajo comparamos el depósito del componente central C3b sobre CL in vitro
en suero humano conteniendo o no los componentes C2 (VC y VL) o factor B
(VA). Los resultados iniciales indican que la VC y/o VL contribuyen
decisivamente a iniciar la activación, y que en cambio la VA contribuye
mayoritariamente al depósito global de C3b, seguramente por amplificación de
las otras vías. Estamos estudiando la contribución relativa de VC vs VL, así
como la posible regulación a nivel de C4b, anterior al punto de convergencia
con la VA.
Financiación: CSIC I+D
62. EVALUACION DE BLANCOS MOLECULARES EN UN MODELO DE
ARTRITIS
F. Bentancor1, N. Cataldo1, M. Santos2, M. Naviliat3, L.
Thomson1
1
Laboratorio de Enzimología, Facultad de Ciencias (UDELAR) y Centro de
Investigaciones Biomédicas (CEINBIO); 2Unidad de Reactivos y Biomodelos
de Experimentación, Facultad de Medicina (UDELAR), 3Cátedra de
Reumatología, Facultad de Medicina (UDELAR)
La artritis reumatoidea (AR) es una enfermedad crónica, sistémica y
autoinmune caracterizada por inflamación articular, la cual liberada a su
evolución puede llevar a la destrucción y pérdida de función. En la
etiopatogenia de la AR se encuentra involucrada la generación desmedida de
especies reactivas derivadas tanto de la reducción parcial del oxígeno, como
formadas a partir de óxido nítrico; siendo los productos del óxido nítrico,
capaces de oxidar y nitrar moléculas biológicas. La formación de estas
especies reactivas, se refleja en un estado antioxidante bajo con una
disminución de los niveles de glutatión reducido, uno de los antioxidantes
intracelulares más importantes. Adicionalmente, la generación de
modificaciones oxidativas en blancos moleculares (en especial proteínas),
estaría en la base del daño articular. Si bien la nitración de proteínas en la
sinovial artrítica es un hecho conocido, no identificamos anticuerpos antinitrotirosina en el plasma de los ratones afectados. Adicionalmente, no se
encontraron diferencias significativas en el nivel de antioxidantes plasmáticos
totales medidos con la técnica de FRAP, ni en la concentración de glutatión
intraeritrocitario. Sin embargo, la peroxirredoxina II, la enzima antioxidante más
relevante en el glóbulo rojo, mostró un alto grado de sobreoxidación y
asociación a la membrana en los animales afectados, típico de glóbulos rojos
envejecidos y/o expuestos a condiciones de estrés.
Agradecimientos: F. Bentancor es Becaria de Iniciación de la ANII.
GENÉTICA, GENÓMICA Y BIOINFORMÁTICA (6368)
63. LA CO-INFECCIÓN COMO MECANISMO DE DIVERSIDAD GENÉTICA
EN PARVOVIRUS CANINO
L. Carrau1, Y. Panzera1, L. Calleros1, G. Tomás1, A. Marandino1, S. Grecco1,
L. Francia1, M. Hernández1, R. Pérez1
1
Sección Genética Evolutiva, Facultad de Ciencias (UDELAR)
El parvovirus canino (CPV) es un virus autónomo de DNA lineal (5.2 kb), hebra
simple y polaridad negativa. CPV es el agente infeccioso más importante en
cachorros, produciendo gastroenteritis hemorrágica con altos índices de
mortalidad. A pesar de tratarse de un virus ADN, presenta tasas elevadas de
sustitución y una importante variabilidad genética. La variante inicial del virus
(CPV-2) emergió en la década de 1970 y se extendió rápidamente causando
una pandemia. Dos años después, CPV-2 fue completamente reemplazada por
la variante CPV-2a. Posteriormente surgieron dos variantes genéticas y
antigénicas, 2b y 2c, que difieren en el aminoácido 426 de la proteína VP2 de la
cápside. En 2007 detectamos por primera vez en Uruguay y en Sudamérica, la
variante CPV-2c, y establecimos que tenía origen europeo. Durante tres años,
CPV-2c fue la única variante detectada en el país. En 2010 ocurrió una nueva
invasión por cepas 2a de origen asiático que comenzó a incrementar su
frecuencia. Durante 2010-2011, ambas variantes han coexistido, brindándonos
la oportunidad de analizar su interacción y dinámica. En este trabajo
analizamos la ocurrencia de eventos de co-infección por ambas variantes. Se
desarrolló y estandarizó una metodología utilizando primers varianteespecíficos basados en las diferencias nucleotídicas entre CPV-2a y CPV-2c.
La especificidad de los primers se confirmó por RFLP y secuenciación. El
análisis reveló la presencia de ambas variantes en varias muestras de campo.
Este estudio es el primero en poblaciones naturales, y sustenta que la coinfección es un mecanismo importante de generación de diversidad genética en
parvovirus.
64.
HACIA
LA
CARACTERIZACIÓN
DE
POBLACIONES
DE
CUASIESPECIES DEL VIRUS INFLUENZA A/H1N1 PANDEMICO
CIRCULANTES EN URUGUAY
V. Comas1, M. Sóñora1, M. Cappetta2, R. Uriarte2, S. Boschi2, P. Moreno1, 3,
G. Moratorio1, A. Fajardo1, J. Cristina1.
1
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares,
Facultad de Ciencias (UDELAR). Iguá 4225, 11400 Montevideo, Uruguay.
2
Laboratorio de Biología Molecular, Asociación Española Primera de Socorros
Mutuos. 3 Unidad de Proteínas
Recombinantes. Instituto Pasteur de Montevideo. Mataojo 2020, 11400
Montevideo, Uruguay.
En el 2009, un nuevo virus de la Influenza A (VIA) H1N1 entro a la población
humana y causó la primer pandémia del siglo XXI. Esta población viral
reemplazó al virus H1N1 que circulaba previamente y en conjunto con los VIA
H3N2 son actualmente los responsables de las epidemias. VIA posee un
genoma de ARN y su variabilidad genética radica en la alta tasa de error en la
replicación, debido a la baja fidelidad de su RdRp. El potencial evolutivo del VIA
ha sido estudiado a través de la secuencia consenso. Sin embargo, los virus
ARN no existen como un único genoma sino como un conjunto de secuencias
genómicas relacionadas: cuasiespecies. Esto permite a la población ser capaz
de emerger y adaptarse a nuevos ambientes representando blancos móviles
para la intervención terapéutica, como la resistencia a drogas antivirales. Se
estudiaron muestras desde el 2009 al 2013 y se realizaron análisis filogenéticos
que demostraron la existencia de dos sublinajes circulantes en Uruguay. Se
encontró una mutación S299A, siendo la responsable de la división de linajes.
Esta mutación ha sido reportada recientemente en Europa. Sin embargo, no se
ha observado la misma en secuencias regionales. Asimismo, su relación
filogenética con la cepa vacunal es muy distante. Los estudios de
cuasiespecies nos brindan información del tipo y frecuencia de mutaciones,
siendo muy importante para entender, el rol de esta variabilidad en la biología
del virus, qué cuasiespecies están involucradas en la patogenicidad, en la
evolución y en la adaptabilidad viral.
65. ESTUDIO DE POLIMORFISMOS EN EL GEN IL28B ASOCIADOS CON
LA RESPUESTA A LA TERAPIA ANTI HEPATITIS C EN PACIENTES
URUGUAYOS
N. Echeverría1, S. Fischer1, S. Boschi2, R. Uriarte2, J. Angulo3, M. LópezLastra3, G. Moratorio1, 4, J. Cristina1, P. Moreno1.
1
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares,
Facultad de Ciencias, UdelaR. Montevideo, Uruguay; 2 Laboratorio de Biología
Molecular, Asociación Española Primera de Socorros Mutuos, Montevideo,
Uruguay; 3 Laboratorio de Virología Molecular, Instituto Milenio de Inmunología
e Inmunoterapia, Centro de Investigaciones Médicas, Escuela de Medicina,
Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile; 4 Department of
Virology, Institut Pasteur, Paris, France..
El tratamiento estándar para la hepatitis C crónica es el interferón-α pegilado y
ribavirina. Su éxito depende tanto de factores virales como del hospedero. Sus
altos costos, sus efectos adversos y un clearance viral ineficaz son desafíos
actuales. Varios estudios demostraron que polimorfismos (SNP) del gen de la
IL28B se asocian con la respuesta a la terapia. El objetivo de este estudio fue
evaluar estos polimorfismos en pacientes uruguayos crónicamente infectados
por el virus de la hepatitis C (VHC), como una primera aproximación a una
terapia personalizada. Se determinó el genotipo viral y el genotipo del
hospedero respecto a tres SNP’s (rs8099917, rs12979860 y rs12980275) en 27
pacientes. La genotipificación viral y del
hospedero se realizó por
secuenciación directa, a excepción del SNP rs12979860 que se obtuvo por
discriminación alélica. A fin de comparar estos resultados con las frecuencias
alélicas en la población general, los SNP’s se evaluaron en 15 individuos
sanos. Nuestros resultados evidenciaron que la mayoría de cepas de VHC
corresponden al genotipo 1. Se encontraron mutaciones dentro de la región
5'NCR, aún no reportadas, que podrían impactar en la traducción viral. En
relación con los SNP’s, las frecuencias de los alelos desfavorables (0.23-0.27)
dentro de la población son similares a aquellas reportadas en poblaciones
europeas. Sin embargo, estas frecuencias aumentan dentro de la población
infectada (0.35-0.59). Nuestros resultados sugieren que esta última tiende a
portar los alelos desfavorables. Para establecer correlaciones estadísticamente
significativas entre los factores evaluados se propone aumentar el número de
pacientes estudiados.
66. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS INVOLUCRADAS EN LAS VÍAS DE
SILENCIAMIENTO GÉNICO MEDIADO POR ARN PEQUEÑOS EN
PLATELMINTOS
S. Fontenla1, L. M. Maldonado2, N. Dell'Oca1, M. Rosenvit2, P. Smircich1,3,
L. Kamenetzky2, J. F. Tort1
1
Departamento de Genética, Facultad de Medicina (UDELAR); 2Instituto de
Microbiología y Parasitología Medica (IMPaM), CONICET, Facultad de
Medicina - Universidad de Buenos Aires, Argentina; 3Laboratorio de
Interacciones Moleculares, Instituto de Biología, Facultad de Ciencias
(UDELAR)
Distintas vías de regulación de la expresión génica mediadas por ARN
pequeños, inicialmente descubiertas en organismos modelo, están
conservadas en metazoarios, revelando una maquinaria celular común. Los
miRNA generados en el núcleo bloquean específicamente la traducción de
algunos ARNm evidenciando un mecanismo endógeno de regulación. Otras
vías asociadas a la presencia de ARNs exógenos, presumiblemente
emergentes como respuesta a las infecciones virales, dan lugar a la
degradación específica de mensajeros (siRNA), mientras que otros ARN
pequeños nucleares (piRNA) participan en el silenciamiento de trasposones.
Los mediadores y vías subyacentes a estos procesos parecen estar
fuertemente interrelacionadas.
En el nematodo Caenorhabditis elegans las distintas vías mediadas por ARN
pequeños involucran a 61 proteínas, las que fueron utilizadas como carnada
para la búsqueda de ortólogos en los genomas y transcriptomas de
platelmintos (4 cestodos y 7 trematodos parásitos y 2 turbelarios de vida libre).
Encontramos ortólogos para 23 proteínas entre ellas los mediadores
principales: Argonauta, Drosha, Pasha y Dicer. Un nuevo grupo de proteínas
Argonauta propio de platelmintos fue identificado, al tiempo que detectamos la
ausencia en cestodos del gen ERI (Potenciador de RNAi), aunque parece estar
presente en trematodos. El hallazgo de un posible ortólogo de una polimerasa
dependiente de ARN (RdRP) en el turbelario Macrostomum lignano es notable,
pues esta vía secundaria de síntesis de ARNs pequeños ha sido encontrada
solamente en C.elegans y plantas. Finalmente, en el trematodo parásito
Fasciola hepatica confirmamos por RT-qPCR la presencia de cuatro proteínas
claves de la vía: Dicer, Argonauta, ERI y SID.
67.
PUESTA A PUNTO DE TÉCNICAS MOLECULARES PARA EL
DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE INFECCIONES POR FLAVIVIRUS EN
MUESTRAS CLÍNICAS
P. Nuñez1, A. Fajardo1, G. Moratorio1, 3, J. Cristina1, S. Boschi2, R. Uriarte2,
P. Moreno1.
1
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares,
Facultad de Ciencias, UdelaR. Montevideo, Uruguay; 2 Laboratorio de Biología
Molecular, Asociación Española Primera de Socorros Mutuos, Montevideo,
Uruguay; 3 Department of Virology, Institut Pasteur, Paris, France
El género Flavivirus, perteneciente a la familia Flaviviridae, comprende una
amplia gama de virus que son transmitidos principalmente por vectores
artrópodos. Este género incluye más de 70 virus ARN de simple cadena, que
comparten determinantes antigénicos comunes. Estos son responsables de
una considerable morbilidad y mortalidad, pudiendo causar desde cuadros
asintomáticos, hasta graves enfermedades febriles, encefálicas, hemorrágicas
y hepáticas en los vertebrados, incluidos los humanos. Este género está
constituido, entre otros, por los virus de la fiebre amarilla, el virus dengue, el
virus de la encefalitis japonesa y el virus de la encefalitis del Oeste del Nilo.
Debido a la amplia gama de enfermedades causada por estos virus, a los
síntomas clínicos muchas veces indiferenciables entre si y la naturaleza
emergente de los mismos en la región sudamericana, las pruebas de
laboratorio resultan cada vez de más importancia. Debido a esto, se ha
realizado un gran esfuerzo a fin de desarrollar diversas metodologías que
permitan una detección rápida y sensible de estos virus
Con este objetivo se han implementado en nuestro laboratorio técnicas
moleculares para el diagnóstico diferencial de virus pertenecientes al género
Flavivirus. Se desarrollaron metodologías de RT-PCR tanto a tiempo final como
a tiempo real contra regiones genómicas conservadas entre los Flavivirus
(región que codifica para la polimerasa viral, NS5), con el objetivo de contar
con técnicas cada vez más sensibles que nos permitan la búsqueda de estos
virus en muestras de Líquido cefalorraquídeo así como en suero de pacientes
con síntomas clínicos compatibles con estas infecciones.
68. VARIABILIDAD GENÉTICA DEL VIRUS INFLUENZA A H3N2
CIRCULANTE EN URUGUAY EN LA TEMPORADA INVERNAL 2011-2012
M. Sóñora1, V. Comas1, P. Moreno1, G. Moratorio1, 3, A. Fajardo 1, S.
Boschi2, R. Uriarte2, J. Cristina1
1
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares,
Facultad de Ciencias, UdelaR. Montevideo, Uruguay; 2Laboratorio de Biología
Molecular, Asociación Española Primera de Socorros Mutuos, Montevideo,
Uruguay; 3Department of Virology, Institut Pasteur, Paris, France
Los virus Influenza pertenecen a la familia Orthomyxoviridae. Estos virus son
envueltos y presentan un genoma segmentado de ARNss, polaridad negativa.
De los 3 tipos conocidos de Influenza: A, B y C, solo los tipos A y B ocasionan
frecuentemente enfermedades severas en humanos. Los Virus Influenza A
(VIA) están ampliamente distribuidos en la naturaleza e infectan una gran
variedad de especies animales. Este virus causa entre 300.000 y 500.000
muertes anuales. Durante el año 1968 se generó un nuevo virus humano de
origen aviar, subtipo H3N2 pandémico causante de la llamada “gripe de Hong
Kong”. El virus fue generado por reordenamiento génico entre un virus humano
H2N2 y uno de origen aviar H3N?. En el presente trabajo, se estudió el grado
de variabilidad genética y antigénica del VIA H3N2 circulante en Uruguay
durante la temporada invernal 2011-2012, comparando el mismo con la cepa
vacunal recomendada por la OMS para nuestro hemisferio. Los resultados del
presente estudio muestran que las cepas recolectadas se agrupan en un clado
notoriamente alejado del clado donde se encuentra la cepa vacunal. Por otro
lado, se muestra que todas las cepas uruguayas de VIA H3N2,
correspondientes a las temporadas invernales 2011-2012 presentan los
polimorfismos asociados a la resistencia a adamantanos. Estos estudios
confirman ampliamente la necesidad de monitorear la variabilidad genética de
las cepas que circulan en nuestro país y en la región Sudamericana, con el
objetivo de obtener vacunas más relacionadas con las cepas circulantes y por
lo tanto, más efectivas.
BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR ANIMAL
(69-78)
69.
CAMBIOS EN LA ACETILACIÓN DE TUBULINA DURANTE EL
PROCESO DE DEGENERACIÓN AXONAL WALLERIANA
V.Acosta1, A.Calliari1,2, C.Escande3
1
Area Biofísica, Facultad de Veterinaria (UDELAR); 2Departamento de
Proteínas y Ácidos nucleicos, IIBCE; 3Departamento de Anestesiología, Clinica
Mayo, Rochester.
Los microtúbulos son un elemento del citoesqueleto fundamental para
mantener la estructura y funciones vitales de las células. Se encuentran
constituídos mayormente por alfa y beta tubulina, la primera de las cuales
puede hallarse en su forma acetilada o des acetilada. Existe un equilibrio
dinámico entre la acetilación y des acetilación de microtubulos, siendo un
desbalance en dicha relación (hipo o hiper acetilación) causa de disfunción y
patología axonal. Por otra parte, se ha demostrado que la disrupción de los
microtubulos (mediante axotomía o administración de vincristina) causa
“degeneración walleriana” in vitro e in vivo. Nuestra hipótesis plantea que existe
una relación entre la des acetilación de microtúbulos y la degeneración axonal,
siendo la des acetilación de microtubulos un evento temprano y necesario del
proceso degenerativo. Para esto se estudió el efecto de drogas
neuroprotectoras (resveratrol) o inhibidoras de desacetilasas (tricostatina)
sobre la degenaración axonal inducida por axotomía, in vitro. Finalmente
intentamos correlacionar los niveles de acetilación de tubulina con la
neuropatía ṕeriferica generada en un modelo in vivo de diabetes tipo I.
(Financian: CSIC; CIDEC-Facultad de Veterinaria).
70.
RESPUESTA A ESTRES EN CARDIOMIOCITOS INFECTADOS POR
TRYPANOSOMA CRUZI
M. Boiani1,2, L. Piacenza 1,2, R. Radi 1,2
1
Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO); Facultad de Medicina
(UDELAR); 2Dpto de Bioquímica, Facultad de Medicina (UDELAR)
La cardiomiopatía chagásica es una de las principales causas de mortandad y
morbilidad en enfermos de Chagas. La etiología de la enfermedad no esta
completamente definida, y está asociada tanto con la presencia de parásitos
como con la respuesta inflamatoria desencadenada por los mismos. Las
características principales de esta enfermedad son hipertrófia, fibrosis e
inflación del tejido cardiaco. La principal consecuencia es la disfunción del
corazón dando lugar a arritmias, falla cardiaca y muerte súbita. Su tratamiento
actual se basa en fármacos utilizados en patologías relacionadas, aunque
resultan menos eficaces. En otras cardiomiopatías se ha establecido que la
respuesta celular a estrés juega un papel importante en la protección del
miocardio. Esta respuesta es regulada por el factor de transcripción HSF1, y su
activación se asocia al desarrollo de hipertofia adaptativa. El mecanismo de
cardioprotección de HSF1 es probablemente multifactorial debido a la
multiplicidad de tareas llevadas a cabo por las proteínas que regula. Un
inductor importante de esta respuesta es el estrés oxidativo y el daño asociado
al mismo. En modelos animales y celulares de infección por T. cruzi se ha
observado la generación de estrés oxidativo y el aumento de proteinas
modificadas por oxidación y nitración. Hasta el momento, sin embargo, no hay
ningún estudio del rol de la respuesta a estrés en la cardiomiopatía chagásica.
En el presente trabajo se estudió la activación de la respuesta a estrés en
cardiomiocitos infectados por T. cruzi y su correlación con la producción de
especies oxidantes y nitrantes.
71. DISTRIBUCIÓN DE LA METALOPROTEINASA-2 (MMP-2) EN CERVIX
DE OVEJAS DURANTE EL CICLO ESTRAL
D. Casuriaga, R. Gonzalez Camp, M. Rodríguez-Piñón
Área Bioquímica, Departamento de Biología Molecular y Celular, Facultad de
Veterinaria (UDELAR)
El objetivo de este trabajo fue determinar la distribución histológica de la
metaloproteinasa de la matriz extracelular-2 (MMP-2) en cérvix ovino durante el
ciclo estral. Cérvix de ovejas Corriedale adultas fueron obtenidos en los días 1
(n=6), 6 (n=6) o 13 (n=6) luego del estro (Día 0). La MMP-2 fue detectada
mediante inmunohistoquímica en las zonas craneal (Cr) y caudal (Ca) del
cérvix, utilizando un anticuerpo policlonal (hMMP-2, sc-8835, Santa Cruz,
Biotechnology, Inc.CA-USA). Se evaluaron cuatro compartimentos histológicos
del estroma (CHE): superficiales y profundos de los pliegues y de la pared. Se
contaron los núcleos positivos y negativos en un total de 1000 núcleos de cada
CHE, calculando el porcentaje de núcleos positivos (%MMP-2). Los resultados
(mean±sem) fueron analizados por ANOVA (MixedProc, SAS). La inmunoseñal
se observó mayoritariamente en fibroblastos activos, minoritariamente en
inactivos y esporádicamente en leucocitos. El %MMP-2 fue menor en Cr
(0.97±0.27) que en Ca (2.83±0.43), (P<0.0004). El %MMP-2 tendió a ser mayor
al día 1 respecto al día 13 en Cr (1.56±0.40 y 0.38±0.50, respectivamente),
mientras que fue menor a los días 1 y 6 que al día 13 en Ca (2.76±0.61,
1.43±1.05 y 4.30±0.43, respectivamente), (P<0.006). Estos resultados sugieren
que los fibroblastos activos podrían estar involucrados en la colagenolisis
cervical, con un potencial mayor en la zona caudal. El porcentaje de
fibroblastos positivos a MMP-2 podría estar regulado hormonalmente durante el
ciclo estral de forma diferencial dependiendo de la zona cervical.
Financiación: CIDEC-FVet y CSIC- Udelar. ANII.
72. DISTRIBUCIÓN TISULAR DE RECEPTORES DE ESTRÓGENOS ALFA
(REα) EN TEJIDO MAMARIO CANINO NORMAL.
C. Della Cella1, R. Sauto2, C. López2, C. Tasende2.
1
Departamento de Patología y Clínica de Pequeños animales, 2 Área
Bioquímica, Facultad de Veterinaria (UDELAR)
Se investigó la distribución tisular de REα por inmunohistoquímica en glándula
mamaria de perras en distintos estadíos del ciclo reproductivo. Los estadíos del
ciclo fueron clasificados por citología vaginal y niveles circulantes de
progesterona (P) en proestro (n=3), estro (n=2), diestro (n=4) y anestro (n=3).
La distribución de REα fue evaluada en tejido conjuntivo, alveolar y conductos
con microscopio óptico y expresada como intensidad de tinción a REα. Los
resultados obtenidos fueron analizados por ANOVA, incluyendo efecto de estadío
del ciclo, compartimento histológico e interacción entre ambos. Se consideró
significativo p<0,05. Los valores de P sérica (ng/mL,
± pooled s.e) fueron
mayores en diestro (52±11) que en proestro, estro y anestro (0,93±13, 2,81±15,
0,25±13; respectivamente). Se encontró efecto de estadío del ciclo,
compartimento histológico e interacción entre ambos en la intensidad de tinción
a REα. Se detectó tinción a REα en tejido conjuntivo, alveolar y conductos de
todas las muestras. En proestro y anestro la intensidad de tinción a REα fue
mayor en tejido alveolar que en tejido conjuntivo. La intensidad de tinción a
REα en tejido alveolar fue mayor en proestro y anestro que en estro y diestro,
tendiendo a ser mayor en proestro que en estro (p=0,088). En conductos fue
mayor en anestro que en proestro, estro y diestro. Estos resultados demuestran
que la distribución de REα en tejido mamario normal de la hembra canina varía
en el tejido epitelial y conjuntivo durante el ciclo reproductivo y depende de la
concentración de las hormonas esteroides ováricas.
73. INCREMENTO DEL CAMP EN RESPUESTA A LA DESPOLARIZACIÓN
DEL POTENCIAL DE MEMBRANA PLASMÁTICA EN ENDOTELIO DE
CÓRNEA DE BOVINO
F. Evans1, J.A. Hernández2, S. Chifflet3
Departamentos de 1Histología y Embriología y 3Bioquímica, Facultad de
Medicina (UDELAR), 2Sección Biofísica, Facultad de Ciencias (UDELAR)
Nuestro laboratorio encontró que la despolarización del potencial de membrana
plasmática (DPMP) de células de endotelio de córnea de bovino (BCEC) en
cultivo provoca la remodelación de la actina‐F cortical, lo que finalmente
conduce a la pérdida de los contactos célula‐célula. Asimismo hallamos que la
cadena liviana de la miosina no muscular II monofosforilada (pMLC) disminuye
en respuesta a la DPMP. Aquí investigamos si la vía del cAMP/PKA está
implicada en los cambios observados en la actina-F y la p-MLC frente a la
DPMP en BCEC. Las DPMP se indujeron mediante soluciones salinas
despolarizantes. Los niveles del cAMP y el estado de fosforilación de la MLC se
determinaron utilizando anticuerpos anti-cAMP y anti-pMLC respectivamente.
La PKA se inhibió con un péptido específico comercial, iPKA. Se realizaron
controles con forscolina.
En monocapas de BCEC en cultivo la DPMP determinó un incremento del
cAMP. Este aumento se observa a los 10 minutos, cuando aún no se
evidencian grandes cambios en la actina-F cortical, y se prolonga en el tiempo
aún cuando se produce una pérdida en los contactos celulares. En presencia
de iPKA, no se observó una disminución de la pMLC ni tampoco una
remodelación del citoesqueleto de actina-F en respuesta a la DPMP. Estos
resultados sugieren que la vía de la cAMP/PKA podría ser una de las vías
implicadas en los cambios del citoesqueleto de actina-F cortical en respuesta a
la DPMP. La intervención en esta vía podría ser una estrategia interesante para
modular las uniones celulares.
74.
MAPEO DEL DAÑO GENÉTICO INDUCIDO EN CÉLULAS
DIFERENCIADAS DE RETINA DE RATÓN CON ARQUITECTURA NUCLEAR
INVERTIDA
L. Lafon-Hughes1, M.V. Di Tomaso1, P. Liddle1, A. Toledo2, A.L. ReyesÁbalos1, G.A. Folle1
1Departamento de Genética, IIBCE, MEC; 2Departamento de Biología Celular
y Molecular, Facultad de Ciencias, UDELAR
El daño genético puede conducir a transformación, senescencia o muerte
celular. La fosforilación de la histona H2AX, visualizada mediante su
inmunomarcación con anticuerpos conjugados a un fluorocromo (foci H2AX),
representa una respuesta temprana al daño que persiste aún luego de su
reparación. Si bien estudios previos, realizados en células proliferativas,
reportaron un predominio de foci H2AX en la eucromatina, se discute si esta
distribución es debida a que la eucromatina posee mayor sensibilidad al daño,
a que los foci no se forman en la heterocromatina, o a que los mismos se
desplazan hacia la eucromatina. Analizamos la distribución del daño inducido
por bleomicina (foci H2AX y TUNEL) en un tejido (retina de ratón) compuesto
por células (bastones) diferenciadas (28 días post-nacimiento; G0) que
presentan una arquitectura nuclear invertida: heterocromatina constitutiva
central, heterocromatina facultativa en torno y eucromatina (H3K4me3+)
periférica. Observamos una localización preferencial tanto de los foci H2AX
como TUNEL en la eucromatina de los bastones de retina de ratón. La
ausencia de foci en la heterocromatina constitutiva sugiere la ausencia de
movimientos de foci H2AX de mediano o largo alcance. Por otra parte, tanto la
reducción de la señal de H3K4me3 observada en el sitio específico del focus
como la presencia de agrupamientos de focus individuales (clustering), podrían
estar relacionados a la ocurrencia de movimientos de foci no direccionados y
de corto alcance, con apertura local de la cromatina.
75. DISTRIBUCIÓN TEMPORAL Y ESPACIAL DE LA PROTEÍNA HIG-1 EN
SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE RATA
L. López1 , M. J. Zuluaga2, P. Lagos3, D. Agrati2, G. Bedó1.
1Sección Genética Evolutiva, Facultad de Ciencias; 2Sección Fisiología y
Nutrición, Facultad de Ciencias; 3Departamento de Fisiología, Facultad de
Medicina.
HIG-1 es una proteína localizada en las mitocondrias, cuya expresión se
relacionaría con un aumento de la supervivencia celular e inhibición de la
apoptosis en distintos tejidos. En particular en el Sistema Nervioso Central
(SNC) trabajos previos de nuestro laboratorio indican que la expresión de
ARNm de Hig-1 se incrementa desde el día 1 al 15 post-natal. Con el objetivo
de avanzar en la caracterización de la proteína HIG-1 se estudió su expresión y
su patrón de distribución en distintas regiones del SNC. Mediante ensayos de
western blot se analizaron las proteínas de tres regiones: médula, diencéfalo y
corteza cerebral de crías de 1, 5, 8 y 15 días y de ratas adultas, observando
que HIG-1 es abundante en todas las edades con una tendencia a aumentar
los niveles hasta el día 15. Por otra parte, a través de ensayos de
inmunoflurescencia sobre cortes de cerebro de crías de 8 días se observó una
amplia distribución de la proteína, con un patrón de expresión espacial
diferencial en ciertas áreas. Entre ellas, está presente en un área dimórfica del
hipotálamo (con mayor supervivencia neuronal en machos que en hembras
entre P5 y P8), en la que planeamos buscar diferencias de expresión entre
crías de ambos sexos. Como ya fue descrito en cortes de médula espinal, la
proteína se expresa en neuronas o en células gliales, dependiendo de la
región. El nivel de expresión de HIG-1 durante el período post-natal temprano y
su distribución espacial sugieren un papel funcional de esta proteína.
76. GANANDO INFORMACIÓN DE LA FUNCIÓN DE CCDC28B A TRAVÉS
DE LA IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS
INTERACTORAS.
Rossina Novas1, Magdalena Cárdenas-Rodríguez1, Jose L. Badano1
1
Laboratorio de Genética Molecular Humana, Institut Pasteur, Montevideo,
Uruguay.
El síndrome de Bardet Biedl (BBS) es una enfermedad oligogénica en la cual,
por lo menos en algunas familias, mutaciones en diferentes genes interactúan
para modular la penetrancia y expresividad de la patología. Mutaciones en
CCDC28B se correlacionan con una presentación más severa del síndrome.
Datos recientes de nuestro laboratorio indican que CCDC28B juega un rol
importante regulando el largo de las cilias tanto en células como en el pez
cebra (zebrafish). CCDC28B interactúa con SIN1, un miembro del complejo
mTOR2, y esta interacción es relevante para regular la actividad de SIN1 en el
contexto de mTOR2 así como fuera de él, controlando el largo de las cilias.
Para ganar más información respecto al rol biológico de CCDC28B, nos
enfocamos en la identificación y caracterización de nuevos interactores.
Utilizando un ensayo doble-hibrido hemos demostrado que CCDC28B
interactúa con dos proteínas asociadas al esqueleto de microtúbulos que
podrían ser importantes para su rol en el contexto de las cilias. Una de ellas es
la proteína de unión a los extremos positivos de los microtúbulos EB3, y la otra
es la cadena liviana de la kinesina KLC1. Hemos confirmado estas
interacciones en células de mamífero por co-inmunoprecipitación y estamos
actualmente estudiando como estas interacciones afectan la función de
CCDC28B tanto en células como en zebrafish. Esperamos que estos
resultados nos permitan continuar profundizando acerca de la función de
CCDC28B en la regulación de mTOR y en ciliogenesis, así como identificar
otras posibles funciones que pueda tener la proteína.
77.
CONTAMINANTE AMBIENTAL (TBT) AFECTA LA CAPACIDAD DE
UNIÓN A LOS ESTRÓGENOS Y A LA PROGESTERONA EN ÚTERO DE
RATAS OVARIECTOMIZADAS
M. Rodríguez Piñón1, J. Bernardes Graceli2, C. Tasende1
1
Bioquímica, Departamento de Biología Molecular y Celular, Facultad de
Veterinaria, Universidad de la República (UdelaR), Montevideo, Uruguay; 2
Departamento de Morfologia, Universidade Federal do Espírito Santo (UFES),
Vitoria, Espírito Santo, Brazil.
Los triorganoestaños como el Tributilestaño (TBT) son contaminantes
ambientales que actúan como disruptores hormonales, produciendo toxicidad
reproductiva en varias especies animales. El objetivo fue evaluar el efecto de la
administración de TBT sobre la capacidad del útero de unir a las hormonas
esteroideas ováricas. Ratas Wistar hembras adultas (12 semanas de edad,
aproximadamente 230 g de peso) fueron ovariectomizadas 21 días antes del
tratamiento con TBT (100 ng/kg/día por 15 días por sondaje orogástrico, n=6) o
vehículo (etanol 0.4%, n=6). Se midió la capacidad de unión a los receptores
de estrógenos (RE) y de progesterona (RP) mediante ensayos de unión con los
ligandos radiactivos correspondientes. Los valores de las constantes de
disociación aparente (Kd, nM) de RE y RP no fueron modificadas por el
tratamiento con TBT, siendo 0.93±0.23 y 1.32±0.40, respectivamente. El
tratamiento con TBT aumentó la concentración (fmol/mg de proteína) de RE
respecto a los controles (47.8±5.6 vs 30.6±2.5, respectivamente, p<0.05). La
concentración de RP (fmol/mg de proteína) tendió a ser mayor en las ratas
tratadas con TBT respecto a las controles (47.2±10.0 vs 24.5±2.7,
respectivamente, p=0.09). Se concluye que el potencial tóxico del TBT sobre el
útero podría estar mediado por cambios en la capacidad del útero para
responder a las hormonas esteroideas ováricas.
Financiación: Comisión de investigación y desarrollo Científico (CIDEC),
Facultad de Veterinaria, UdelaR; Comisión Sectorial de Investigación (CSIC),
UdelaR y Fundacao de Amparo a Pesquisa no Espirito Santo (FAPES).
E-mail: marodri@fvet.com.uy
78.
EXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES DE OXITOCINA EN EL ÚTERO DE
OVEJAS CICLANDO.
Sacchi I.1; Tasende C.1
1
Departamento de Biología Molecular y Celular, Facultad de Veterinaria.
Durante el ciclo estral los niveles circulantes de progesterona (P) y estrógenos (E)
son moduladores de la expresión del receptor de Oxitocina (ROx). Se estudió la
concentración de ROx en útero de 19 ovejas Corridale ciclando en estación
reproductiva a los días 1 (n=7), 6 (n=6) y 13 (n=6) de detectado el estro. Se
midieron los niveles de P y E por RIA. La constante de disociación aparente (Kd,
nM) y la concentración (fmol/mg de proteínas) de ROx se estudiaron por ensayos
de unión. Los resultados se analizaron por ANOVA. Se encontró efecto del día del
ciclo sobre la concentración de ROx, P y E. La concentración de ROx fue mayor
al día 1 que al 13 del ciclo estral (60,7 ± 5,8 vs 33,2 ± 5,8 fmol/mg de proteína
respectivamente; p=0,008), mientras que al día 6 tendió a ser menor que al 1
(44,6 ± 5,8 fmol/mg de proteína; p=0,0921) y no se diferenció del día 13 del ciclo.
Las concentraciones para P y E para los días 1, 6 y 13 del ciclo fueron: 0,7 ± 0,6;
7,1 ± 0,9; 10,3 ± 0,9 y 10,3 ± 0,9; 8,3 ± 0,9; 8,1 ±0,9 nmol/L respectivamente.
Alrededor del estro (día 1) la capacidad e unión es máxima debido al efecto
estimulador de los E, mientras que en la fase luteal es mínima debido al efecto
inhibitorio de la P. Similares resultados de capacidad de unión de ROx fueron
repostados en bovinos durante el ciclo estral.
79.
DISTRIBUCIÓN TISULAR DE RECEPTORES DE PROGESTERONA
(RP) EN TEJIDO MAMARIO CANINO NORMAL.
R. Sauto1, C. Della Cella2, C. López1, C. Tasende1.
1
Área Bioquímica, Facultad de Veterinaria (UDELAR), 2 Departamento de
Patología y Clínica de Pequeños animales, Facultad de Veterinaria (UDELAR)
Se estudió la distribución tisular de RP por inmunohistoquímica en glándula
mamaria de perras en distintos estadíos del ciclo reproductivo. Los estadios del
ciclo fueron clasificados por citología vaginal y niveles circulantes de
progesterona (P) en proestro (n=3), estro (n=2), diestro (n=4) y anestro (n=3).
La distribución de RP fue evaluada en tejido conjuntivo, alveolar y conductos con
microscopio óptico y expresada como intensidad de tinción a RP. Los resultados
fueron analizados por ANOVA, incluyendo efecto de estadío del ciclo y
compartimento histológico. Se consideró significativo p<0,05. Los valores de P
sérica (ng/mL,
± pooled s.e) fueron mayores en diestro (52±11) que en
proestro, estro y anestro (0,93±13; 2,81±15; 0,25±13, respectivamente). Se
encontró efecto de estadío del ciclo y de compartimento histológico en la
intensidad de tinción a RP. En proestro, la intensidad de tinción a RP fue mayor
en tejido alveolar que conjuntivo y conductos. En estro, fue mayor en tejido
conjuntivo y alveolar que en conductos. En diestro, tendió a ser mayor en tejido
alveolar que conjuntivo (p=0,07) y en anestro no se diferenciaron. En estro se
encontró la mayor intensidad de tinción en tejido conjuntivo y alveolar, ambos
disminuyeron en diestro y fueron similares en proestro y anestro. En los
conductos fue similar en los diferentes estadíos. Estos resultados demuestran
que la distribución de RP en tejido mamario normal de la perra varía en el tejido
epitelial y conjuntivo durante el ciclo reproductivo y depende de la
concentración de las hormonas esteroides ováricas.
80.
ANÁLISIS FUNCIONAL DE MUTACIONES SINÓNIMAS EN EL
SUPRESOR DE TUMORES TP53
M.J. Lista1,2, D. Segovia1, I. López1, C. Voisset2, M. Blondel2, M. Marin1
1
Sección Bioquímica-Biología Molecular, Facultad de Ciencias, UdelaR;
UMR1078, Faculté de Medicine et Sciences de la Santé, UBO, Francia.
2
La proteína supresora de tumores TP53 es un factor transcripcional que regula
vías centrales del ciclo celular, apoptosis y senescencia. En el cáncer, el
gen TP53 está mutado en casi 50% de los tumores. 90% de las mutaciones
son puntuales y afectan principalmente el dominio de unión al ADN. Las
mutaciones sinónimas, que no generan un cambio de aminoácido en la
proteína, son entre 20 y 100 veces más frecuentes de lo esperado si fueran
realmente neutras. El objetivo general de nuestro trabajo es comprender el
efecto de las mutaciones sinónimas en la funcionalidad de P53. En este
proyecto nos propusimos analizar el efecto de 12 mutaciones sinónimas en la
actividad transcripcional de este factor, empleando el sistema FASAY
en Saccharomyces cerevisiae. Dos cepas de levadura que contienen en su
genoma elementos de respuesta a P53 (p21y RGC) y controlan la expresión de
un gen reportero, fueron transformadas con el cDNA de los mutantes
sinónimos. Los resultados obtenidos indican que algunas mutaciones
sinónimas afectan la actividad transcripcional de P53 en p21 y RGC, en
comparación con la proteína salvaje. En algunos casos se detectan variaciones
del nivel de expresión de la proteína, lo que sugiere que diferentes mecanismos
pueden estar involucrados
RADICALES LIBRES (81-89)
81. ROL DEL HACINAMIENTO MOLECULAR EN EL DAÑO OXIDATIVO
PROTEICO CELULAR
A. Aicardo1,2, A. Cassina1,2, R. Radi1,2
1
Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina (UDELAR); 2Centro de
Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina (UDELAR)
La interacción entre proteínas y oxidantes ha sido ampliamente estudiada, sin
embargo, la mayoría de los datos publicados han sido obtenidos en
condiciones que difieren del ambiente intracelular. El entorno hacinado en el
que se encuentran las biomoléculas en los compartimientos celulares facilita
interacciones intermoleculares que pueden modificar propiedades bioquímicas
y biofísicas de proteínas, en comparación con las encontradas en soluciones
acuosas diluidas. En este trabajo proponemos que la alta densidad a cual las
proteínas se encuentran en bioambientes hacinados, posibilita reacciones de
oxidación radicalar entre diferentes proteínas desencadenando reacciones de
propagación en cadena comparables a procesos de lipoperoxidación de
membranas. Con el objetivo de obtener datos que apoyen esta hipótesis
evaluamos la participación de soluciones de alta concentración de albúmina
sérica bovina (BSA) en la formación de reacciones de oxidación en cadena.
Realizamos estudios de oximetría, quimioluminiscencia, y fluorescencia para
demostrar la formación de especies radicalares en el tiempo, luego de la
exposición de BSA a diferentes sistemas generadores de radicales proteicos
(peroxinitrito, metamioglobina/H2O2). Encontramos que radicales derivados de
aminoácidos llevan a la formación de radicales peroxilo que propagan el
proceso oxidativo. Nuestros resultados apoyan el concepto de que en
ambientes hacinados, como el citoplasma celular, el daño oxidativo puede ser
inducido y amplificado por reacciones en cadena de radicales proteicos oxigeno
dependientes, lo cual representa un proceso bioquímico previamente
menospreciado.
82. MECANISMO DE INHIBICIÓN
COMPUESTOS ANTI-TRIPANOSOMA
DE
TRIPARREDOXINA
CON
Carreño M.1, Ortiz C.2, Krauth-Siegel R L.3, Comini M A.2, Ferrer-Sueta G.1
1
Laboratorio de Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad de
la República, Montevideo, Uruguay; 2 Grupo Biología Redox de Tripanosomas,
Institut Pasteur de Montevideo, Montevideo, Uruguay; 3 Biochemie-Zentrum
der Universität Heidelberg, 69120 Heidelberg
Se han descrito compuestos sintéticos que actúan como inhibidores de
triparredoxina (TXN) (Fueller, et al JBC (2012) 287:8792), y muestran actividad
anti Trypanosoma brucei. Dicha enzima es una oxidorreductasa dependiente de
tioles que libera equivalentes de reducción directamente hacia un gran número
de blancos y es importante en el metabolismo redox de tripanosomátidos. De
los 80.000 compuestos evaluados, los más activos fueron diez cloroalcanos y
la principal reacción sería una sustitución nucleofílica resultando en la
alquilación de la cisteína catalítica. Este trabajo tiene como objetivo la
caracterización de la cinética de inactivación de TXN utilizando uno de los
compuestos
mencionados
anteriormente
(2-(clorometil)-5-(4fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4(3H)-ona, C1) cuyo índice de selectividad es el
más alto reportado. A su vez, se evaluará cinéticamente otros posibles blancos
que puedan resultar competencia. Sabiendo que T. brucei es un parásito
extracelular, dichos blancos incluyen la C34 de albúmina sérica (HSA) presente
en plasma, los tioles presentes en la célula hospedera (glutatión y tiorredoxina)
y aquellos presentes en T. brucei (tripanotiona y glutatión). Los estudios
cinéticos se realizarán mediante el uso de fluorescencia intrínseca y ensayos
de competencia con monobromobimano. Hasta el momento nuestros
resultados indican que la reacción de TXN con C1 posee una constante de
velocidad dos órdenes de magnitud mayor que con los otros blancos (3x102 M1 -1
s ).
83. MUERTE CELULAR PROGRAMADA DE AMASTIGOTAS DE
Trypanosoma cruzi POR ÓXIDO NÍTRICO Y PERÓXIDO DE HIDROGENO
DERIVADOS DEL CARDIOMIOCITO INFECTADO.
D. Estrada1, R. Radi1, L. Piacenza1.
1
Departamento de Bioquímica and Center for Free Radical and Biomedical
Research; Facultad de Medicina, Universidad de la República, Montevideo,
Uruguay
La infección por Trypanosoma cruzi induce la producción de mediadores
proinflamatorios (TNF-α/IL-1β; oxido nítrico, •NO) y una disfunción mitocondrial
con la generación de radical superóxido (O2•−) y peróxido de hidrogeno (H2O2)
en el cardiomiocito infectado. Hipotesis: mediadores con actividad-redox
derivados del cardiomiocito controlan la proliferación parasitaria de los
amastigotas mediante la inducción de la muerte celular programada (MCP).
Resultados: La exposición de epimastigotas de T. cruzi a H2O2 induce la MCP
parasitaria con disfunción mitocondrial, aumento de la generación de O 2•−,
fragmentación del ADN y exposición de fosfatidil-serina. Parásitos
sobreexpresantes de las enzimas antioxidantes peroxirredoxina (MPX) o Fesuperóxido dismutasa (Fe-SODA) mitocondrial inhiben el proceso de muerte
mediado por H2O2. En la linea celular H9c2 así como en cardiomiocitos
primarios de ratón, la disfunción mitocondrial desencadenada por la infección y
estimulada por la generación de citoquinas proinflamatorias se acompañada
por un aumento en la producción de H2O2. Amastigotas apoptóticos (CL-Brener
y Dm28) se identificaron en infecciones in vitro a cardiomiocitos estimulados o
no por citoquinas pro-inflamatorias. Los resultados obtenidos muestran que los
amastigotas intracelulares de la cepa atenuada CL-Brener presentan una
mayor tasa de apoptosis con respecto a los de la cepa virulenta Dm28c. Más
aún, la tasa de apoptosis fue mayor en cardiomiocitos estimulados con
citoquinas y •NO. Conclusiones: Tanto el •NO como el H2O2 derivados del
cardiomiocito llevan a la inducción de la MCP en amastigotas intracelulares de
T. cruzi. Las cepas de T. cruzi con un mayor contenido de enzimas
antioxidantes (más virulentas) serían más resitentes generadndo infecciones
más severas durante la fase crónica de la enfermedad de Chagas.
84. EFECTO DEL ÁCIDO NITROARAQUIDONICO (NO2AA) SOBRE LA
PROTEÍN DISULFURO ISOMERASA (PDI) EN MACRÓFAGOS ACTIVADOS
L. González-Perilli1, H. Rubbo1, F. Laurindo2 y A. Trostchansky1
1
Departamento de Bioquímica y Centro de Investigaciones Biomédicas,
Facultad de Medicina, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay; 2
Instituto de Corazón, Facultad de Medicina, Universidad de San Pablo, Brasil.
El Ácido Nitroaraquidonico (NO2AA) presenta acciones anti-inflamatorias como ser
la regulación de la actividad y secreción de enzimas inducibles o citoquinas proinflamatorias en macrófagos activados. Recientemente hemos demostrado que el
NO2AA inhibe la actividad la NADPH oxidasa fagocítica (NOX2), responsable de la
formación de superóxido en el fagosoma, mediante la prevención de la formación del
complejo activo en la membrana (Gonzalez-Perilli L. et al Free Radic. Biol. Med.
2013 May; 58:126-33). Trabajos recientes indican que durante la formación del
complejo activo de la NOX2 participa la proteín disulfuro isomerasa (PDI). Por lo
tanto, nuestra hipótesis actual propone que durante de la inhibición NOX2 por
NO2AA ocurre la modulación de la PDI por el nitroalqueno sin afectar los
componentes de la NOX2. El NO2AA inhibe la actividad reductasa de la PDI in vitro de
manera dosis y tiempo dependientes. En macrófagos activados, estudios de
microscopía confocal muestran que la presencia de NO2AA ejerce un cambio en la
distribución intracelular de PDI, promoviendo un posible cambio en la morfología
celular. En resumen, el NO2AA puede modular a PDI, sugiriendo que durante la
inhibición de NOX2 la PDI puede ser el blanco de acción del NO2AA.
85.
DETERMINANTES DE LA OXIDACIÓN Y NITRACIÓN EN LDL
HUMANA: RELEVANCIA EN ATEROGÉNESIS
M. Mastrogiovanni, A. Trostchansky, H. Rubbo
Departamento de Bioquímica y Centro de Investigaciones Biomédicas,
Facultad de Medicina, Universidad de la República
La oxidación y nitración lipídica y proteica en la lipoproteína de baja densidad
(LDL) han sido usados como marcadores pro-aterogénicos en la LDL. En los
últimos años se ha demostrado que un aumento en los niveles de ácidos
grasos nitrados (nitroalquenos) están relacionados con efectos señalizadores
antiinflamatorios y por ello la nitración lipídica de los componentes de la LDL
representa un área de investigación de creciente interés. En este trabajo se
plantea determinar las condiciones que favorecen la nitración lipídica con
respecto a la oxidación y nitración proteica. La LDL humana se expuso a
diferentes agentes nitrantes que incluyen al peroxinitrito, nitrito en pH ácido y
mieloperoxidasa/peróxido de hidrógeno/nitrito. En estas condiciones
experimentales, se analizaron y compararon los niveles de 3-nitrotirosina y
ácidos grasos nitrados (como marcadores de nitración proteica y lipídica,
respectivamente) con niveles de carbonilos, TBARS e hidroperóxidos lipídicos
(como marcadores de oxidación proteica y lipídica, respectivamente). Los
niveles de ácidos grasos libres (nitro-oleico, nitro-linoleico y nitro-araquidónico)
y esterificados (colesteril nitro-linoleato) se determinaron por análisis de TLC y
LC/MS utilizando estándares externos previamente caracterizados.
Especulamos que una LDL que presenta altos niveles de ácidos grasos
nitrados y menor cantidad de productos de oxidación lipídica sea menos
aterogénica que la LDL oxidada.
86.
LA REACCIÓN DEL RADICAL SUPERÓXIDO CON RADICALES
TIROSILO GENERA PRODUCTOS ELECTROFÍLICOS
MN Möller1,2, DM Hatch2, HY Kim2, N Porter2
1
Lab. Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad de la
República, Uruguay y 2Chemistry Department, Vanderbilt University, Nashville,
USA.
El radical superóxido producido enzimáticamente reacciona con radicales
tirosilo de diversos péptidos para formar 3-(1-hidroperoxi-4-oxociclohexa-2,5dien-1-il)-L-alanina (HPOCHDA), que puede ser reducido al alcohol 3-(1hidroxi-4-oxociclohexa-2,5-dien-1-il)-L-alanina (HOCHDA) con dimetil sulfuro.
No se observó ninguna adición de superóxido en la posición orto de la tirosina.
El oxígeno singulete conduce a la formación de la misma serie de productos
que el superóxido. El radical hidroxilo producido por reacción de Fenton
también lleva a la formación de los derivados de HOCHDA, pero en
rendimientos más bajos que la di-hidroxifenilalanina. A diferencia de los
productos aromáticos, estos derivados de tirosina pueden seguir reaccionando.
Los péptidos con una tirosina N-terminal sufren rápidamente una adición de
Michael intramolecular que conduce a derivados indólicos. Los péptidos con
tirosina en otra posicion permanecen sin ciclar. Cuando se añade glutatión
(GSH) a HPOCHDA o HOCHDA, se produce una reacción rápida que conduce
a la formación de aductos de GSH a través de una adición de Michael. La
formación de residuos electrofílicos también se evidenció en proteínas, usando
ribonucleasa A expuesta a oxígeno singulete y un alquino-tiol, un reactivo que
combina un tiol reactivo con una etiqueta de alquino mediante una cadena
polar. Después de la adicion de Michael, el alquino se acopló a una azidobiotina a través de una reacción click asistida por cobre (I), y luego se reveló
por Western blot utilizando estreptavidina fluorescente. Estamos trabajando en
este y otros métodos para determinar la importancia de esta modificación en
sistemas biológicos expuestos a estrés oxidativo.
87.
INFLUENCIA DE LOS RESIDUOS CONSERVADOS EN LA CATÁLISIS
POR TSA1
Nieves-Álvarez C.1, Portillo-Ledesma S.1, Netto L.E.S2, Ferrer-Sueta G1.
1Laboratorio de Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad de
la República, Montevideo, Uruguay; 2Departamento de Genética e Biologia
Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo
05508–090, Brasil.
La Tsa1 (Thiol Specific Antioxidant protein 1) es una peroxirredoxina de
Saccharomyces cerevisiae que reduce H2O2 con una constante de velocidad
de aprox. 107 M-1s-1. La Treonina 44 y la Arginina 127, presentes en el sitio
activo de esta proteína, estarían modulando la reactividad y especificidad de la
cisteína peroxidática. Con el fin de evaluar la importancia de estos dos
residuos, se estudiarán dos mutantes en los mismos: T44V y R127Q. Para la
T44V, el pKa de la cisteína peroxidática fue determinado por fluorscencia
intrínseca y por alquilación con monobromobimano (mBBr). La nucleofilia fue
ensayada por alquilación con mBBr y yodoacetamida. No encontramos
diferencias significativas entre la nucleofilia de Tsa1wt y Tsa1T44V.
También se evaluó la mitad reductiva del ciclo catalítico de la wt y T44V
mediante reacción con tiorredoxina y DTT.
La reacción con H2O2 será seguida mediante fluorescencia del Trp a 340nm
tanto para la proteína salvaje como para la T44V.
88. CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LA PROTEÍNA COMIGRATORIA
CON BACTERIOFERRITINA B DE Mycobacterium tuberculosis.
M. Reyes1, M. Hugo1, R. Radi1, M. Trujillo1
1Departamento de Bioquímica y Centro de Investigaciones Biomédicas
(CEINBIO), Facultad de Medicina, UDELAR, Uruguay.
Mycobacterium tuberculosis (Mt), el agente causante de la tuberculosis, es
capaz de sobrevivir en el interior de fagosomas de macrófagos activados,
donde esta expuesto a especies oxidantes citotóxicas. Por esto el sistema de
defensa antioxidante de este bacilo podría ser un blanco propicio para el
desarrollo de drogas terapéuticas. Mt expresa una hemo peroxidasa
catalasaperoxidasa y cinco peroxidasas dependiente de tioles de la familia de
las peroxirredoxinas. Dos de ellas (BcpB y Bcp) han sido clasificadas como
supuestas peroxirredoxinas del tipo proteína comigratoria con bacterioferritina
(Bcp) por estudios de homología de secuencia, pero su función como
peroxidasas no ha sido experimentalmente probada aún. En este trabajo,
nosotros determinamos que la MtBcpB recombinante cataliza la reducción de
diferentes peróxidos (peróxido de hidrógeno, peroxinitrito e hidroperóxidos de
ácidos grasos), utilizando Mt tiorredoxina B (MtTrxB) y Mt tiorredoxina C
(MtTrxC) como sustratos reductores. Estudios de cinética de estado
estacionario indicaron que la enzima utiliza un mecanismo catalítico de tipo
ping-pong. La constante de velocidad de reducción por MtTrxB y MtTrxC son 5
x 105 y 1.4 x 106 M-1s-1 a pH 7.4 y 25°C, respectivamente. MtBcpB reduce el
hidroperóxido de ácido araquidónico con una constate de velocidad en el rango
de 107 M-1s-1 siendo menos eficiente para reducir peroxinitrito (8 x 105 M-1s-1
a pH 7.4 a 25°C). Estos resultados establecen a la MtBcpB como un nuevo
sistema antioxidante de Mt, con alta especificidad para la reducción de
hidroperóxidos de ácidos grasos.
89.
EFECTO CITOPROTECTOR DE LAS PORFIRINAS DE MANGANESO
COMO ANTIOXIDANTES CATALÍTICOS SINTÉTICOS EN CÉLULAS
ENDOTELIALES.
Valez V. 1,3, Carballal S. 1,3, Batinic-Haberle I. 4, Ferrer-Sueta G. 2,3 and Radi R.
1,3
1
Facultad de Medicina, 2Facultad de Ciencias y 3Centro de Investigaciones
Biomédicas en Radicales Libres, Universidad de la República, Montevideo,
Uruguay; 4Department of Radiation Oncology, Duke University Medical Center,
USA.
El peroxinitrito (ONOO-) es un oxidante potente formado in vivo a partir de la
reacción controlada por difusión entre los radicales anión superóxido (O 2 -) y el
óxido nítrico ( NO). El daño oxidativo dependiente de peroxinitrito es capaz de
promover disfunción y/o muerte celular. En varias de estas condiciones, el
exceso de oxidantes formados por la mitocondria, incluyendo el peroxinitrito, ha
sido relacionado con la patogénesis de múltiples enfermedades. En este
sentido, la búsqueda de potenciales antioxidantes catalíticos sintéticos ha sido
un área de mayor interés en los últimos años.
Las metaloproteínas catalizan numerosas reacciones redox, en particular las
porfirinas de manganeso (MnPorfirinas) pueden alcanzar la mitocondria, y ha
sido recientemente reportado que pueden actuar como antioxidantes catalíticos
descomponiendo especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno (1). Además,
las MnPorfirinas han demostrado ser protectoras en diferentes modelos
animales de enfermedad.
En este trabajo, realizamos experimentos de citoprotección exponiendo células
endoteliales vasculares bovinas, en presencia de MnPorfirinas (5-50 µM), a una
condición de estrés nitro-oxidativo generado por el dador de peroxinitrito SIN-1.
Observamos protección del daño celular a través de la inhibición de la
formación de 3-nitrotirosina y de la muerte celular por apoptosis generada por
este oxidante.
Por lo tanto podemos decir que estas MnPorfirinas pueden servir atenuando el
daño mediado por peroxinitrito en las células endoteliales, representando un
mecanismo farmacológico detoxificador eficiente.
(1) Valez, V., et al (2013) Arch Biochem Biophys. 529(1): p. 45-54.
BIOFISICA (90-92)
90.
REPERCUSION DE LA EXPOSICION AGUDA A ANTIMONIO EN LA
FUNCION DE CORAZONES AISLADOS.
M.V. Campos2&, C. Costa1&, H.Torres1, G. Ferreira1,2
1Laboratorio
de Canales Iónicos. Departamento de Biofísica, Facultad de Medicina
(UDELAR); 2ProInBio. Cooperación Uruguay-Brasil. & Igual contribución al trabajo.
En la actividad industrial y también como resultado de procesos naturales, los
seres vivos están expuestos a exposición aguda o crónica de numerosos
elementos químicos que pueden afectar su Salud. Estos elementos tóxicos, son no
biodegradables, por lo que los riegos de contaminación de ecosistemas
generalmente aumentan en el tiempo. Los metaloides son algunos de estos
elementos químicos, intermedios entre los metales pobres y los halógenos en la
Tabla Periódica. El Antimonio (Sb, Z=51), se usa abundantemente en aplicaciones
industriales humanas en baterías, caucho, pinturas, cerámicas, semiconductores
electrónicos y fuentes de electricidad. Dadas sus características iónicas como
contaminante y posible blanco en proteínas de membrana, decidimos estudiar el
impacto a su exposición aguda en órganos cuya función depende de manera
crítica de las mismas, reportando inmediatamente fallas mínimas como es el caso
del corazón. Nuestros hallazgos en corazones aislados de cobayo con doble
registro simultáneo eléctrico y de tensión, muestran un marcado efecto inotrópico y
cronotrópico negativo de Sb, con un IC50 de aproximadamente 140 uM.
Interesantemente, en comparación con otros tóxicos metálicos no produce
contracciones alternantes, pero sí provoca un marcado enlentecimiento de las
contracciones cardíacas sin correlación eléctrica, sugiriendo impacto en la bomba
de Ca2+ del Retículo Sarcoplasmático (SERCA). La exposición a Sb, aumenta
también significativamente el daño ante stress isquémico y de reperfusión
cardíacos. Nuestros resultados muestran que la exposición aguda a Sb puede
provocar daños en órganos vitales en situaciones normales, agravándose los
mismos en patologías preexistentes como ser trastornos isquémicos.
Financiado CSIC p944-a G.F.
91.
CARDIOMIOPATIAS QUIMICAS: REPERCUSION FUNCIONAL
CLOROQUINA EN CORAZON AISLADO.
C.Costa , H. Hartmann, H.Torres, J.Dutra , L.Cespedes , G. Ferreira
DE
Laboratorio de Canales Iónicos. Departamento de Biofísica, Facultad de Medicina
UDELAR (Universidad de la República).
La cloroquina (CQ), es un fármaco del grupo de las 4-aminoquinolonas, utilizado
en el tratamiento y profilaxis de las enfermedades producidas por plasmodios
como malaria, aunque es utilizada ocasionalmente en el tratamiento de la artritis
reumatoide y el lupus eritematoso discoide crónico, ambas enfermedades
autoinmunes. Se han registrado muertes en pacientes que la utilizan como
antimalárico, pero también en pacientes tratados por artritis reumatoidea y lupus.
La intoxicación aguda por CQ puede resultar en cuadros clínicos de extrema
gravedad, con fallo multiorgánico sistémico. Entre los órganos de impacto de
toxicidad de la CQ se encuentra el corazón. Sin embargo, al momento actual, no
existen reportes de las características fisiopatológicas de las fallas cardíacas que
origina la exposición aguda a CQ. Este trabajo caracteriza los efectos de
exposición aguda a CQ a nivel cardíaco, procurando comprender las funciones y
moléculas de impacto que afectada en dicho órgano. Nuestros hallazgos indican
que CQ tiene un marcado efecto inotrópico negativo con un IC50 de 4 a 5 uM,
siendo este efectos reversible casi en su totalidad. Tanto la cinética de promoción,
como de lavado del efecto son sumamente rápidas, estando limitada
mayoritariamente por la perfusión. La actividad eléctrica se modifica en
concordancia con la respuesta contráctil, aunque no disminuye ni desaparece. CQ
también tiene efecto cronotrópico negativo y arritmogénico, aunque con un IC50
mayor. Dosis superiores a 100 uM originan ausencia de contracción con actividad
eléctrica. Los resultados sugieren que los canales de Ca L son blanco central de
CQ.
Financiado CSIC PAIE.
92. LA DIABETES AUMENTA LA RIGIDEZ DE CARDIOMIOCITOS AISLADOS
VIVOS. ESTUDIO POR MICROSCOPÍA DE FUERZA ATÓMICA
A. Zambrana1, I. Rauschert1, V. Bervejillo1, N. Oddone1, N. Benech2, J.C.
Benech1
1Laboratorio de Señalización Celular y Nanobiología, Instituto de Investigaciones
Biológicas Clemente Estable. 2Instituto de Física, Facultad de Ciencias, UDELAR.
La Diabetes Mellitus (DM) es una enfermedad crónica que altera, entre otros
órganos, el corazón. Uno de los mayores cambios promovidos por la diabetes en
dicho órgano, es una alteración de la homeostasis del Ca2+, que resulta del
cambio en la expresión de proteínas como la bomba de Ca2+ SERCA2a y el
intercambiador Na+/Ca2+. En el presente trabajo, determinamos la elasticidad
aparente en cardiomiocitos vivos aislados de corazones de ratones diabéticos o
controles, por el método de nano-hendiduras, utilizando Microscopía de Fuerza
Atómica. Ratones diabéticos del tipo I, fueron obtenidos por administración de
streptozotocina. Luego de 3 meses de diabetes constatada, imágenes histológicas
obtenidas del miocardio de ratones diabéticos, mostraron células desordenadas,
núcleos irregulares, fibras de miocardio fragmentadas y depósitos de colágeno
intersticial. Sin embargo, en ratones control no se observaron dichos cambios. En
homogenizados de Ventrículo Izquierdo (VI) de corazones diabéticos, se observó
una reducción en la expresión de SERCA2a respecto a ratones control de la
misma edad. Utilizando Microscopía de Fuerza Atómica, se midió el módulo
elástico aparente de cardiomiocitos aislados vivos de ratones diabéticos, siendo
éste 112% más alto que el de los cardiomiocitos de ratones control (diabéticos: 91
± 14 kPa, control: 43 ± 7kPa). Los resultados sugieren que las propiedades
materiales de los cardiomiocitos pueden ser afectadas por la diabetes,
aumentando su rigidez y contribuyendo a la rigidez diastólica del Ventrículo
Izquierdo, observada en algunos pacientes con DM. Futuros estudios son
necesarios para identificar las moléculas afectadas, responsables del aumento en
la rigidez.
OTROS (93-96)
93.
NUEVO ENSAYO INDIRECTO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE LA
ACTIVIDAD COLAGENOLÍTICA A PARTIR DE SUSTRATO SINTÉTICO
PARA COLAGENASA, EMPLEANDO TNBS PARA DETERMINAR AMINOS
LIBRES.
L. Macció1, D. Vallés1, AMB. Cantera1,2,*
1
Laboratorio de Enzimas Hidrolíticas, Instituto de Química Biológica, Facultad
de Ciencias (UDELAR); 2Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias,
Facultad de Química (UDELAR)
Las colagenasas son proteasas metalo-dependientes que hidrolizan fibras de
colágeno, pudiendo tener diversas aplicaciones en la industria cosmética.
Ultimamente se han implementado numerosas metodologías para la detección
y cuantificación de la actividad colagenolítica siendo estos métodos costosos y
tediosos. Los ensayos de actividad basados en la especificidad de la enzima
por el enlace X-Gly del colágeno y por la secuencia Pro-X-Gly-Pro en los
péptidos sintéticos, ha permitido la utilización de estos últimos para la
determinación de su actividad. En este trabajo se empleó el sustrato sintético
(Carbozbenzoxy-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala-OH), que es hidrolizado por
colagenasa en: Carbozbenzoxy-Gly-Pro-Gly y Gly-Pro-Ala. Tradicionalmente se
ha utilizado ninhidrina, capaz de reaccionar con el tripéptido liberado y así
determinar el grado de hidrólisis. Esta determinación es complicada e implica
tiempos prolongados. Nosotros proponemos la determinación del grado de
hidrolisis del sustrato sintético, utilizando ácido picrilsulfónico (TNBS) para la
cuantificación de aminos libres. La reacción enzimática se desarrolló en placa
de Elisa donde fueron mezclados 5µL de solución enzimática y 100µL de
solución de sustrato 5mM, pH 7.5 (buffer Tricina 50mM, 10mM en CaCl2 y
400mM en NaCl). La mezcla fue incubada 5 minutos a 25ºC y detenida la
reacción con 45µL de HCl 2M. Para el blanco, se agregó HCl 2M previo al
sustrato. Seguidamente se realizó el ensayo de TNBS (Minetti, 1995). Fue
evaluada la saturación de la enzima; la actividad enzimática a distintos tiempos
de reacción y los límites de sensibilidad. Se protocolizó un método sencillo,
sensible y económico para la determinación de actividad colagenolítica.
94.
GENERACIÓN ENZIMÁTICA DE QUITOOLIGOSACÁRIDOS A PARTIR
DE
QUITOSANO
UTILIZANDO
UNA
GLICOSILTRANSFERASA
(BRANCHZYME ®) SOLUBLE E INMOVILIZADA
A Montilla2, A. I. Ruiz-Matute2, N. Corzo2, C. Giacomini1,
G. Irazoqui1
1
Catedra de Bioquimica, Dpto. de Biociencias, Facultad de Quimica, UdelaR,
Montevideo, Uruguay; 2Dpto. Bioactividad y Analisis de Alimentos. Instituto de
Investigacion en Ciencias de la Alimentacion, CIAL (CSIC-UAM), Madrid,
España.
Los quitooligosacáridos poseen propiedades biológicas destacables tales como
actividad antibacterial y antitumoral al igual que la capacidad de promover un
aumento de las defensas en la salud animal. Los mismos pueden ser obtenidos
mediante la hidrólisis enzimática de la quitina. Dado el alto costo de las
quitosanasas, resulta importante el estudio de enzimas alternativas que aunque
no presenten actividad quitosanasa específica sean capaces de catalizar su
hidrólisis.
En
este trabajo se realizó la caracterización bioquímica de la
glicosiltransferasa (Branchzyme ®) y se estudió su actividad quitosanasa
utilizando quitosano como sustrato. Esta enzima demostró ser
homotetramérica con un peso molecular de 256 kDa, un punto isoeléctrico de
5.3 y un rango de temperatura óptima de entre 50 y 60°C. La misma fue
inmovilizada en forma covalente sobre glutaraldehído-agarosa obteniéndose
rendimientos de inmovilización de proteína y actividad de 67% y 17%
respectivamente.
La inmovilización mejoró la estabilidad de la enzima aumentando cinco veces
su vida media y permitiendo su reuso por al menos 20 ciclos consecutivos. El
perfil de hidrólisis de quitosano obtenido fue similar para la enzima soluble e
inmovilizada, obteniéndose quitooligosacáridos con grado de depolimerización
(DP) de entre 2 y 20 siendo mayor la concentración de aquellos con DP entre 3
y 8.
95.
CARACTERIZACIÓN ANATOMO-PATOLÓGICA DE TUMORES
MAMARIOS INDUCIDOS CON N-NITROSOMETILUREA EN RATAS.
N. Mazza1, P. Berasain2, J.P. Pacheco3, M.G. Kramer1.
1Departamendo de Desarrollo Biotecnológico, Facultad de Medicina,
Universidad de la República; 2Unidad de Biología Parasitaria, Departamento de
Biología Celular y Molecular, Instituto de Higiene, Facultad de Ciencias,
Universidad de la República; 3Cátedra de Patología, Facultad de Veterinaria,
Universidad de la República.
El cáncer de mama en Uruguay es la principal causa de muerte en la mujer por
cáncer y su diagnóstico se basa en parámetros macroscópicos e histológicos
del tumor, entre otros. Uno de los modelos experimentales para su estudio es la
rata con tumores mamarios inducidos con N-nitrosometilurea (NMU). En
estudios previos de nuestro grupo, utilizando este modelo, se analizó la cinética
de crecimiento de los tumores mamarios, encontrándose distintos
comportamientos según su zona de aparición: lento, medio y rápido. El objetivo
del presente trabajo fue determinar si esta población de tumores son
homogéneos o heterogéneos desde el punto de vista histológico,
caracterizándolos con los mismos criterios y metodologías de diagnóstico
usados para cáncer de mama en humanos. Se clasificaron tumores de distintas
zonas y se determinó la presencia de receptores de estrógenos y progesterona.
La mayoría de los tumores analizados fueron malignos y similares a algunos
tipos de carcinomas mamarios encontrados en humanos: adenocarcinoma
quístico papilar infiltrante, carcinoma ductal infiltrante o carcinoma lobulillar in
situ, y algunos pocos benignos de tipo adenoma quístico papilar. Por
inmunohistoquimica se comprobó que todos fueron hormono dependientes,
observando que la mayoría fueron de grado 3 (% células tumorales positivas ≥
20), y solo dos tumores fueron de grados menores: grado 2 (10≤ % células
tumorales positivas <20) y grado 1 (% células tumorales positivas <10). Los
datos recabados facilitarán el uso de este modelo para la evaluación de futuras
terapias antitumorales específicas de los carcinomas representados.
96. DE LA IDENTIFICACIÓN AL ANÁLISIS EXHAUSTIVO DE PROTEÍNAS:
LA TÉCNICA RECOMENDADA, ES REALMENTE RECOMENDABLE?
Madelón Portela1,2, Magdalena Gil1,3, Analía Lima1; Carlos Batthyany1,4,
Rosario Durán1,3
1. UByPA; Institut Pasteur de Montevideo; 2. Facultad de Ciencias, UDELAR; 3.
Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, MEC; 4.
Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, UDELAR.
La identificación de proteínas por espectrometría de masa (EM) de tipo MALDITOF/TOF involucra habitualmente la realización de un mapeo peptídico por EM
y posterior búsqueda en bases de datos. Para esto, la preparación de la
muestra (desalado y concentración) es un paso fundamental y bien
estandarizado en los laboratorios especializados. En el presente trabajo
evaluamos la metodología “gold standard” utilizando diferentes proteínas con
diferentes modificaciones post-traduccionales (PTM). Se comparó la
purificación, concentrado, recuperación e intensidad de la señal de los
péptidos: 1. utilizando microcolumnas de fase reversa (en tips) de las dos
marcas comerciales más utilizadas; 2. aplicación directa de la muestra en la
placa de MALDI-TOF/TOF y 3. utilizando resina de fase reversa en “batch”. Los
resultados fueron analizados en función de la composición de aminoácidos,
masa molecular, hidrofobicidad de los péptidos trípticos y el tipo de PTM
presente en los mismos. Los resultados obtenidos nos permitieron ajustar la
metodología recomendada y mejorar la eficiencia de las microcolumnas por
combinación de más de un soporte de fase estacionaria. Nuestros resultados
demuestran que la técnica ampliamente utilizada y recomendada no es siempre
recomendable. Presentamos una alternativa experimental para aumentar la
cobertura de secuencia y la identificación de PTMs de manera sistemática.
Estos resultados jerarquizan la importancia de la correcta preparación de la
muestra cuando el objetivo experimental va más allá de la simple identificación
de una proteína determinada.