Manual de Procedimientos - Clasificación fenotípica de las
Anuncio
Manual de Procedimientos Clasificación fenotípica de las micobacterias Dra. Amelia Bernardelli Referente en Paratuberculosis Referente en Tuberculosis Bovina OIE - Organización Mundial de Sanidad Animal Referente en Tuberculosis Animal del Mercosur Dirección de Laboratorio y Control Técnico Ciudad Autónoma de Buenos Aires Año 2007 SENASA Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Av. Paseo Colón 367 C1063ACD Ciudad Autónoma de Buenos Aires - República Argentina. Tel. (054) (011) 4121-5000 website: http://www.senasa.gov.ar Edición: Coordinación de Prensa y Comunicaciones Institucionales Area de Diseño Gráfico. Fotografías de interior: José Huerga. Marzo de 2007. 2 Dirección de Laboratorio y Control Técnico Autoridades del SENASA Dr. Jorge Néstor Amaya Presidente Ing. Carlos Casamiquela Vicepresidente Autoridades de la Dirección de Laboratorio y Control Técnico Lic. Verónica Torres Leedham Directora de Laboratorio y Control Técnico Dr. Ramón Sanguinetti Coordinador de Bacteriología, Parasitología, Patología y Zooterápicos Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 3 Mi agradecimiento: al Dr. Bernardo Alonso y al Sr. Julio Tinao, por su inestimable colaboración. A mis hijos: Hernán Pablo y Javier Gonzalo, por su infinita solidaridad. 4 Dirección de Laboratorio y Control Técnico Indice Introducción ......................................................................................................................... 7 Identificación fenotípica ........................................................................................................ 9 Protocolo de identificación bioquímica ............................................................................... 10 1. Temperatura de crecimiento ........................................................................................... 10 2. Producción de pigmento ................................................................................................ 10 3. Reacciones bioquímicas ................................................................................................ 12 a. Producción de niacina .................................................................................................... 12 b. Reducción de nitratos .................................................................................................... 14 c. Actividad de catalasa ..................................................................................................... 15 c1. Catalasa semicuantitativa ............................................................................................. 16 c2. Catalasa cualitativa a 68ºC ........................................................................................... 17 c3. Método a temperatura ambiente o de la gota. ............................................................. 17 d. Hidrólisis de Tween 80 ................................................................................................... 18 e. Método de Arilsulfatasa .................................................................................................. 19 f. Toma de hierro. ............................................................................................................... 20 g. Reducción del telurito. ................................................................................................... 21 h. Método de la ureasa. ..................................................................................................... 22 i. Presencia de la fosfatasa ácida. ...................................................................................... 22 j. Prueba de la pirazinamidasa. .......................................................................................... 23 k. Prueba de la Β-galactosidasa. ....................................................................................... 24 l. Inositol, Manitol o Citrato. ................................................................................................ 25 4. Crecimiento en presencia de drogas .............................................................................. 26 - Hidracida del ácido 2-Tiofeno carboxílico (TCH) - Cloruro de sodio - Acido p-nitrobenzoico - Acido pícrico - Hidroxilamina (HA) - Isoniacida (INH) 5. Plaqueo para el control de pureza en agar Dubos o Middlebrook 7H10 ........................ 29 6. Referencias .................................................................................................................... 30 7. Anexo. Formulaciones .................................................................................................... 33 8. Diagramas de flujo ......................................................................................................... 47 A. Clasificación inicial de Micobacterias No Tuberculosas (NTM) de acuerdo con el tiempo de crecimiento / producción de pigmento. B. No cromógenas - Lento crecimiento. Catalasa e Hidrólisis de Tween positiva. C. Crecimiento lento. Catalasa y Nitrato reducción negativa. D. Crecimiento lento. Fotocromógena. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 5 E. Crecimiento lento. Escotocromógena. F. Crecimiento rápido. No cromógena. 9 . Ta b l a s . N° 1. Identificación de Micobacterias No Tuberculosas (NTM). N° 2. Identificación de Micobacterias No Tuberculosas (NTM). Rápido crecimiento. N° 3. Especies de lento crecimiento. N° 4. Especies de rápido crecimiento. 10. Fotos. 6 Dirección de Laboratorio y Control Técnico I n t ro d u c c i ó n La tuberculosis es una enfermedad de importancia global. Una tercera parte de la población mundial ha sido infectada por el Mycobacterium tuberculosis y ocho millones de nuevos casos se producen en cada año. Un incremento importante en el número se ha detectado por la presencia del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La tuberculosis mata 2 millones de personas por año, por lo cual los análisis diagnósticos son relevantes para aminorar su transmisión. Por otro lado, Mycobacterium bovis, que produce la enfermedad en el bovino, puede también infectar a una amplia variedad de especies y ello nos hace reconocerla como una zoonosis clásica, al considerarla como una infección que es transmisible naturalmente entre los animales y el ser humano. El examen mediante la coloración de Ziehl-Neelsen es rápido y económico, pero siguen siendo los cultivos bacteriológicos los que proveen el resultado definitivo. Dependiendo de los medios de cultivo y las técnicas de decontaminación utilizadas es posible incrementar entre 30% a 50 % los hallazgos de la clínica. Los aislamientos proveen el material necesario para realizar las tipificaciones y las técnicas de sensibilidad a las drogas, por ello se deberán estandarizar las metodologías, con el fin de lograr la armoni zación de los resultados. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 7 8 Dirección de Laboratorio y Control Técnico Clasificación fenotípica de las micobacterias Identificación fenotípica La denominación de tuberculosis comprende a la producida por el complejo Mycobacterium tuberculosis integrado por: M. bovis, M. africanum, M. microti, M. caprae, M. canetti y M. pinnipedii. Otro número de micobacterias denominadas No Tuberculosas (NTM) han sido clasificadas por Runyon en cuatro grupos de acuerdo con su velocidad de crecimiento y producción de pigmento en la oscuridad o por exposición a la luz. Grupo I: Lento crecimiento –Fotocromógenas Crecimiento abundante de los cultivos que producen pigmentos: cristales amarillos de caroteno, por exposición a la luz, pero que no lo generan en la oscuridad. El desarrollo de las colonias se produce entre 2 a 6 semanas. Ej.: M. kansasii, M. xenopi, M. marinum, M. simiae. Grupo II: Lento crecimiento-Escotocromógenas Los organismos desarrollan un pigmento amarillo brillante, en la luz y en la oscuridad. Algunas cepas de M. scrofulaceum intensifican su coloración por exposición a la luz. El desarrollo de las colonias se produce entre 2 a 6 semanas. Ej.: M. xenopi, M. gordonae, M. flavescens, M. scrofulaceum, M. szulgai. Grupo III: Lento crecimiento - No fotocromógenas Incluye un número de especies que producen una pequeña cantidad de pigmento amarillo pálido. Expuestas a la luz brillante no intensifican su coloración. La mayoría presentan coloración crema. El crecimiento es sumamente lento. Ej.: Complejo M. avium-intracellulare, M. terrae, M. triviale, M. celatum, M. shimodei, M. gastri, M. malmoense, M. nonchromogenicum. Grupo IV: Rápido crecimiento Mientras que un grupo de las especies producen pigmento amarillo, otras no lo poseen: M. fortuitum y M. chelonae. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 9 El desarrollo de las colonias se produce entre 2 a 7 días. Ej.: M. abscessus, M. mucogenicum, M. phlei, M. smegmatis, M. vaccae, M. peregrinum, M. parafortuitum, M. chelonae, M. fortuitum. P ro t o c o l o d e i d e n t i f i c a c i ó n b i o q u í m i c a 1 . Te m p e r a t u r a d e c r e c i m i e n t o Desarrollo a 25 °C, 37 °C y 45 °C. Diferentes especies con distinto significado clínico muestran variación en el tiempo de crecimiento y la habilidad de desarrollarse a variadas temperaturas. Medios y Reactivos Para la determinación de la temperatura de crecimiento se utiliza un medio de cultivo no selectivo el que se distribuye en tubos en pico de flauta o mejor en cajas de Petri donde es posible observar detenidamente el desarrollo de las colonias y la posible contaminación. Se usan los medios de Löwestein-Jensen, Stonebrink, Middlebrook 7H10 ó 7H11. 2. Producción de pigmento Medios y Reactivos Se procede con medios de cultivo no inhibitorios. No se usan medios de cultivo selectivo o bien conteniendo antimicrobianos ya que pueden interferir en la formación del pigmento. Löwestein-Jensen es el más frecuentemente utilizado. Procedimiento para el desarrollo de 1) y 2) Preparación del inóculo Cultivar en un medio líquido (7-10 días) o bien en una suspensión de colonias de un medio sólido en una solución salina o en un medio líquido, con turbidez que no debe sobrepasar el patrón turbidométrico de Mac Farland 0.5 para obtener un crecimiento moderado, de modo tal que la producción de pigmento pueda ser observada. 10 Dirección de Laboratorio y Control Técnico Inocular tres tubos con medio de Löwestein-Jensen y uno con Stonebrink. Tubo N° 1: dejar sin cubrir a 37 °C. Tubo N° 2: cubierto con papel negro u hoja de aluminio, colocar a 37 °C. Tubo N° 3: cubierto con papel negro u hoja de aluminio, colocar a 25 °C. Interpretación Cuando se controla el crecimiento en el Tubo N° 1, observar también el desarrollo en los Tubos N° 2 y N° 3, los cuales están creciendo en la oscuridad y anotar los resultados: - Si las colonias en los Tubos N° 2 y N° 3 están pigmentadas: escotocromógenas. - Si las colonias en el tubo N° 1 no están pigmentadas, descubrir la mitad de los tubos N° 2 y N° 3 de manera tal que una parte del cultivo esté expuesta a la luz y la otra mitad esté cubierta. Los tubos deben ser ubicados debajo de una lámpara de 60 W o de luz blanca a una distancia de 20 a 25 cm, por un período de 3 a 5 horas. Cubrir los tubos totalmente otra vez y observar la producción de pigmentos a las 24, 48 y 72 horas y comparar las colonias expuestas a la luz con las que permanecieron en la oscuridad. - Crecimiento de colonias no pigmentadas en los Tubos N° 1, 2 y 3: no cromógenas. - Crecimiento de las colonias pigmentadas en los tubos N° 1 y N° 2: escotocromógenas. - Crecimiento de las colonias en la parte del tubo N° 2 expuesta a la luz: fotocromógenas. - Crecimiento de colonias pigmentadas en la parte del tubo N° 3 expuesta a la luz: fotocromógena a 25 °C (M. szulgai es escotocromógena a 37 °C y fotocromógena a 25 °C). Controles M. gordonae: escotocromógena. M. kansasii: fotocromógena. M. fortuitum: no cromógena. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 11 3. Reacciones bioquímicas a. Producción de niacina La niacina (ácido nicotínico) juega un papel vital en las reacciones de oxidación-reducción que ocurren durante los procesos metabólicos de todas las micobacterias. A pesar de que todas estas bacterias producen niacina, estudios comparativos han demostrado de que en ocasiones está bloqueado el camino metabólico. debido a la acción de una enzima que transforma la niacina libre en niacina -ribonucleótido. M. tuberculosis acumula grandes cantidades de ácido nicotínico y su determinacción es utilizada como diagnóstico definitivo. Son escasas las cepas de M. tuberculosis, niacina negativa, mientras que algunas otras especies de micobacterias pueden ser niacina positiva. Medios y Reactivos 1 - Solución acuosa de bromuro de cianógeno al 10 % y bencidina o anilina al 4 %. 2 - Alternativa: Tiras de papel reactivas comercial (BBLTM TaxoTM). Löwestein-Jensen es el medio de cultivo recomendado. Es muy importante la aireación para la formación de niacina. Aflojar las tapas durante el período de incubación. Procedimiento 1-- Agregar 1 mL de agua destilada a un cultivo de 3 a 4 semanas en el medio de LöwesteinJensen, se necesita un desarrollo mínimo de 50 colonias. Cortar la superficie del medio con una espátula para extraer la niacina. Colocar los tubos en forma horizontal para que la superficie del mismo esté en contacto con el agua. Incubar por 15 a 30 minutos. Colocar el tubo en posición vertical durante 5 minutos para permitir que el fluido se ubique en el fondo del tubo. Extraer 0.5 mL del mismo y colocar en un tubo limpio con tapa y agregar 0.5 mL de solución de bencidina o anilina y 0.5 mL de bromuro de cianógeno. Cerrar los tubos y observar en la solución la formación de color (resultado positivo) dentro de los 5 minutos que aparece como un anillo en la interfase de los dos reactivos, al agitar el tubo la coloración pasa a toda la columna del líquido. Agregar a cada tubo 2 a 3 mL de Hidróxido de sodio al 4 % y descartar. Si se utiliza la tira de papel con el reactivo impregnado, se deben colocar el extracto acuoso del cultivo y la tira en el tubo a rosca cerrado herméticamente. 12 Dirección de Laboratorio y Control Técnico La reacción consiste en la evolución del bromuro de cianógeno de la parte superior de la tira con la niacina ubicada en el fondo del tubo. Interpretación Color amarillo, con la tira comercial. Color púrpura, con la solución de bromuro de cianógeno –bencidina. Color amarillo, con la solución de bromuro de cianógeno-anilina. M. tuberculosis, M. simiae, ocasionalmente, algunas cepas de M. marinum y M. chelonae así como un número de cepas de M. bovis, han perdido esta enzima y la niacina, soluble en agua es acumulada en el medio de cultivo. Un resultado negativo se observa cuando existe insuficiente cantidad de cultivo, para aumentar la masa bacteriana, realizar una reincubación adicional de 2 a 4 semanas y controlar la aparición de por lo menos 50 colonias. Asimismo se puede producir resultado negativo cuando el crecimiento bacteriano cubre por completo la superficie del medio de cultivo, por ello es necesario romper la masa de colonias para lograr liberar la niacina. Controles Mycobacterium tuberculosis: positivo. Mycobacterium intracellulare: negativo. 2--Las tiras de papel reactivas permiten idéntica determinación de la niacina, se evitan la preparación y almacenamiento de reactivos tóxicos, pero su costo es mayor. Procedimiento Realizar los pasos similares indicados para la técnica anterior con los reactivos líquidos, hasta colocar 0.5 mL del extracto fluido en el tubo limpio, insertar la tira con la identificación en la parte inferior y cerrar inmediatamente el tubo. Dejar a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. Ocasionalmente agitar. Observar el color del líquido en el fondo del tubo (amarillo: positivo) contra una base blanca, descartar si la tira tiene este color como propio, ello puede ocurrir por oxidación química especialmente en la parte superior de la tira. Neutralizar las tiras con hidróxido de sodio al 10%. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 13 b. Reducción de nitratos La presencia de la enzima nitratoreductasa es importante para la clasificación de las micobacterias: M. tuberculosis, M. kansasii, M. szulgai, M. fortuitum las que reducen nitratos a nitritos. Otras especies producen también nitratoreductasa tales como: M. flavescens, M. terrae, M. triviale y M. chelonae. Las micobacterias que contienen esta enzima pueden utilizar el oxígeno de los nitratos y de otros productos de reducción. La reacción química es: NO3 + 2 ë NO2 + H2O La presencia de nitrito es detectada por la adición de sulfanilamida y N-naftiletilendiamina a pH ácido. Si el nitrito está presente se forma un compuesto rojo de diazonio. La técnica se efectúa en cultivos de menos de un mes. Medios y Reactivos Buffer substrato de nitrato de sodio, ácido clorhídrico al 10 %, solución de sulfanilamida al 0.2 %, solución de N-naftiletilendiamina al 0.1%. Procedimiento La reacción se realiza en tubos de 16 mm x 125 mm con tapa rosca, a los que se agregan 4 ó 5 gotas de agua destilada, luego se introduce con un anza aproximadamente 10 mg de masa bacilar, tratando de homogeinizar la mezcla. El substrato lo constituyen 2 mL de la solución de nitrato de sodio en buffer de fosfato. Se incuba la suspensión 2 horas a 37 °C. Al cabo de ese tiempo, acidificar con una gota de ácido clorhídrico dilución 10 %. Agregar 2 gotas de solución de sulfanilamida y 2 gotas de solución de N-naftiletilendiamina. Interpretación El desarrollo de color se produce entre 30 a 60 segundos. Si no se produce color se confirma el resultado como negativo por el agregado de pequeña cantidad de polvo de zinc. Si el color rojo desarrolla después del agregado de zinc, significa que el nitrato está todavía presente y es catalizado por el zinc con formación del color, por lo cual la reacción es verdaderamente negativa. Si el color no se produce después del agregado de zinc, repetir la técnica para confirmar la reacción. 14 Dirección de Laboratorio y Control Técnico Por estas razones el método no es altamente reproducible entre laboratorios y es conveniente utilizar una escala de color estándar. El problema entre las divergencias del método se ha producido con M. szulgai, sobre el cual algunos informes lo han reportado nitratoreductasa negativo. Rosado pálido: +/Rosado claro: 1+ Rosado intenso: 2+ Rojo:3+ Rojo intenso: 4+ Rojo púrpura: 5+ Solamente son considerados positivos: 3+ y 5+. Controles M. tuberculosis H37: fuertemente positivo. M. kansasii: débilmente positivo. M. intracellulare: negativo. c. Actividad de catalasa La mayoría de las micobacterias producen la enzima catalasa, algunas más que otras, la determinación se puede realizar por tres técnicas: 1- La catalasa semicuantitativa, indica el nivel de producción de la enzima. 2- Pérdida de la actividad a 68 °C y pH. 3- Método a temperatura ambiente o de la gota: realizado en ocasiones para una determinación cualitativa rápida de catalasa. Los organismos productores de esta enzima tienen la habilidad de descomponer el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno libre. +2 +22 La reacción en las micobacterias difiere de la utilizada en otros tipos de bacterias, por el empleo de peróxido de hidrógeno al 30 % y una solución concentrada de detergente: Tween 80 Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 15 al 10 %, el cual ayuda a dispersar la masa bacteriana hidrofóbica, hasta bacilos separados individualmente, maximizando la determinación de la enzima. c1. Catalasa Semicuantitativa Medios y Reactivos - Agua oxigenada 110 volúmenes (solución de peróxido de hidrógeno al 30 %). Debe conservarse en heladera. - Solución acuosa de Tween 80 al 10 %. En el momento de usar calentar ligeramente para obtener una mejor disolución, mantener en heladera. Procedimiento Distribuir 5 mL de medio de Löwestein-Jensen en tubos estériles de 18 mm x 150 mm con tapa rosca. Coagular el medio con los tubos en posición vertical, lo cual puede efectuarse colocando los tubos en un baño de agua termorregulado a 85 °C, durante 40 minutos. Inocular la superficie del medio con 0.1 mL de la suspensión bacilar en agua destilada incubar 2 semanas a 37 °C. Observar al cabo de ese tiempo que exista un buen desarrollo bacteriano. Mezclar partes iguales de peróxido de hidrógeno y solución de Tween 80. Mantener a temperatura ambiente. Agregar 1.0 mL de la mezcla de soluciones Tween-peróxido de hidrógeno al tubo de cultivo. Dejar el tubo en posición vertical durante 5 minutos. Interpretación Medir en milímetros la altura de la columna de burbujas sobre la superficie del medio. Menor de 31 mm: negativa ó muy débil. Entre 31 y 45 mm: resultado no concluyente. Más de 45 mm: catalasa francamente positiva. Controles M. terrae: positivo. M. bovis: negativo. 16 Dirección de Laboratorio y Control Técnico c2. Catalasa Cualitativa: a 68 °C Reactivos Las soluciones de peróxido de hidrógeno y Tween descritas para la prueba semicuantitativa. Solución reguladora de fosfatos M/15, pH 7 Procedimiento Distribuir la solución reguladora, 0.5 mL, en tubos de 12 mm x 100 mm. Agregar en cada uno de ellos el contenido de un anza cargada de colonias tomada de un cultivo joven en medio a base de huevo. Colocarlos en baño de agua termorregulado a 68 °C durante 20 min. Retirar y dejar enfriar a temperatura ambiente. Agregar a los tubos una mezcla de la solución de Tween y peróxido de hidrógeno. Interpretación Observar la formación de burbujas en la superficie. Esperar 20 minutos antes de informar el resultado negativo: no se han producido burbujas. Controles M. terrae: positivo. M. tuberculosis: negativo. c3. Método a temperatura ambiente o de la gota Procedimiento Agregar 1 ó 2 gotas de una solución recientemente preparada de Tween 80-peróxido de hidrógeno a las colonias ubicadas en un tubo con medio de cultivo. Observar en 4 a 5 minutos la aparición de burbujas. En las bacterias fuertemente positivas aparecerá rápidamente, en las débilmente, más lentamente y en las negativas se observará la ausencia de burbujas. Interpretación En cada uno de las técnicas la presencia de catalasa es indicada por las burbujas. El método de la gota es rápido y simple pero provee solamente una idea aproximada de la cantidad de enzima presente. La determinación de catalasa estable a la temperatura es una muy buena ayuda característica de la identificación de micobacterias no pigmentadas. La catalasa lábil a la temperatura es característica de: M. tuberculosis, M. bovis, M. gastri, y Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 17 ocasionalmente cepas del complejo M. avium-intracellulare. El método de catalasa semicuantitativa es utilizado para distinguir cepas que son fuertemente catalasa positiva y otras que la poseen en pequeña cantidad y particularmente para la identificación de M. tuberculosis - INH-resistente que es negativo. Controles - M. kansasii: fuertemente positivo, catalasa semicuantitativa y estable al calor. - M. tuberculosis: H37Rv, ligeramente positivo, catalasa semicuantitativa y lábil al calor. - M. tuberculosis: INH-resistente es negativo al método de la gota y a la catalasa semicuantitativa. d. Hidrólisis de Tween 80 La hidrólisis enzimática del Tween 80 es una importante característica de la diferenciación de micobacterias. Con raras excepciones las especies que hidrolizan el Tween 80 en 10 días no son clínicamente significativas, por ej. el bacilo del agua de canilla M. gastri, M. terrae y M. triviale, mientras que las especies que tienen importancia clínica, M. scrofulaceum y el complejo M. avium-intracellulare, son negativas. El Tween 80 es la marca registrada del detergente: monoloeato de polioxietileno sorbitan. Medios y Reactivos Sustrato: Solución reguladora de buffer fosfato M/15, pH7, Tween 80 y rojo neutro. Procedimiento Suspender en el sustrato colonias de un cultivo joven en medio sólido (aproximadamente, el contenido de un anza de 3 mm de diámetro). Incubar a 37 ºC, sin contacto con la luz. Examinar a los 5 y a los 10 días. Incubar un tubo control sin inóculo. Interpretación Observar los tubos, comparativamente con el control de color ámbar. Se considera positivo un cambio de color a rosa salmón. Tomar nota de la fecha en que observa ese cambio de color y seguir incubando hasta completar los 10 días para confirmar; el color puede intensificarse a rosado más intenso y hasta rojo pajizo. 18 Dirección de Laboratorio y Control Técnico Los tubos no deben ser agitados antes de la lectura. Algunas células pueden tomar el colorante, lo que provoca un color rosado en el sedimento del tubo, mientras que el sobrenadante continua ámbar; en estos casos el informe es negativo. Controles - M. kansasii: rápido, positivo. - M. gordonae: lento, positivo. - M. scrofulaceum: negativo. e. Método de Arilsulfatasa Miembros del complejo M. fortuitum-chelonae son los únicos que producen suficiente cantidad de enzima para resultar positivos dentro de los 3 días. Pequeñas cantidades son también producidas por M. xenopi, M. szulgai M. marinum, M. kansasii, M. gordonae y miembros del complejo M. avium - intracellulare entre otros. La reacción positiva en menos de 3 días ayuda a identificar a las especies de lento crecimiento y dentro de ellas los resultados son proporcionales a la masa bacteriana. Esta técnica es sumamente utilizada para la identificación del complejo M. avium – intracellulare. La arilsulfatasa es una enzima que produce fenolftaleína libre del disulfato de fenolftaleína sal tripotásica. Medios y Reactivos - Sustrato: Solución 0.08 M de fenolftaleína disulfato tripotásico. - Preparar 200 mL de medio líquido de Dubos. Agregarle 2.5 mL de sustrato a la prueba de 3 días y 7.5 mL para la de 2 semanas. Distribuir estérilmente 2 mL, en tubos de 16 x 125 mm con tapa rosca. - Solución de carbonato de sodio 2N. El método también se puede realizar usando una solución 0.001 M de fenolftaleína, sal sódica en el caldo Middlebrook 7H9. Una cantidad de solución de disulfato de fenolftaleína sal tripotásica 0.003 M ha sido propuesta para detectar pequeñas cantidades de la enzima con períodos de incubación superiores a 14 días. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 19 Procedimiento Para cada cepa, colocar 0,1 mL de una suspensión bacilar concentrada de bacterias tomadas de colonias de un cultivo joven. Incubar a 37 ºC. A los 3 días, agregar en el tubo correspondiente 6 gotas de la solución de Na2CO3. A las 2 semanas proceder en forma idéntica en el tubo restante. Colocar un tubo control con sustrato y sin inóculo. Interpretación La aparición de una coloración roja o rosada en la parte superior del medio señala resultado positivo indicando la liberación de fenolftaleína libre. - Cuando el sustrato contiene fenolftaleína libre, el tubo control no inoculado puede desarrollar color rojo al agregarle la solución de carbonato de sodio. Para resolver el problema hay que recristalizar el sustrato en etanol absoluto, donde la fenolftaleína es soluble, en tanto que el disulfato de fenolftaleína tripotásico es insoluble. Controles - M. fortuitum:: positivo. - M. avium: negativo. f. Toma de hierro Medios y Reactivos Solución acuosa de citrato de hierro amoniacal al 4 %, esterilizada en autoclave. Procedimiento Inocular 2 tubos de medio Löwenstein-Jensen, cada uno con 0,1 mL de una suspensión bacilar de aproximadamente 1 mg/mL de la cepa. Colocar los tubos inclinados, difundiendo la siembra en toda la superficie del medio. Luego en posición vertical y añadir en el fondo de uno de ellos 1 mL de la solución de citrato de hierro amoniacal. En el otro tubo, agregar 1 mL de agua destilada estéril. Incubar en posición vertical a 37 ºC. 20 Dirección de Laboratorio y Control Técnico Interpretación De ser la reacción positiva aparece en el tubo con citrato, entre la primera y la tercera semana de incubación, un color marrón que se va extendiendo a las colonias por encima del nivel del líquido. Se compara con el tubo control. Controles M. fortuitum: positivo. M. chelonae: negativo. g. Reducción del telurito Medios y Reactivos Middlebrook 7H9 distribuir 5 mL en tubos de 18 x 150 mm. Solución de Telurito de potasio al 2 %, esterilizada en autoclave. Procedimiento Colocar 2.5 ml del medio de cultivo en los tubos con tapa a rosca. Inocular 2 tubos con una gota de suspensión bacteriana. Incubar a 35-37 ºC por 7 días (agitar para mejorar el crecimiento). Luego de 7 días agregue 2 gotas de solución de telurito a los 2 tubos y agitar. Reincubar a 35-37 ºC (no agitar los tubos durante esta re-incubación) y observar luego de 3 días. Si a los 3 días la prueba da negativa, descartar este tubo y observar el segundo tubo re-incubando por 9 días. Interpretación Formación de un precipitado negro metálico: Positivo. Tubo control sin inóculo: Negativo. No hay formación de un precipitado negro: Negativo. Algunas especies producen un precipitado marrón claro o gris, esto debe considerarse como negativo. No agitar los tubos. Observar la coloración de la masa bacilar depositada en el fondo. Controles Complejo M. avium-intracellulare: positivo. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 21 Complejo M. terrae: negativo. h. Método de la ureasa Determina la capacidad del organismo para desdoblar la urea formando dos moléculas de amoníaco por acción de la enzima ureasa, que está clasificada como una amidasa, es decir que cataliza la hidrólisis de las amidas, es capaz de romper la unión entre el carbono y el nitrógeno. + 1 XUHDVD & 2+2+ &2+21+ 1+&2 + 1 Medios y Reactivos Medio de cultivo, ver Anexo. Procedimiento Con el anza, agregar al tubo colonias de un cultivo joven en medio de huevo. No arrastrar medio de cultivo. Incubar 3 días a 37 °C. Interpretación La aparición de color rosa se interpreta como resultado positivo. Controles M. kansasii, M. scrofulaceum:: positivo. M. avium: negativo. i. Presencia de la fosfatasa ácida Medios y Reactivos Ver Anexo. Procedimiento Variante1: Colocar dos anzas del cultivo joven de la micobacteria a ser identificada en un tubo 22 Dirección de Laboratorio y Control Técnico que contenga 1.5 mL de agua destilada estéril. Agregar 0.5 mL de solución sustrato difosfato de fenolftaleína. Llevar a 37 ºC durante 2 horas. Adicionar 0,1 mL del reactivo revelador Carbonato de sodio 10%. Variante 2: Utilización como sustrato sal magnésica de monofosfato de timolftaleína. Colocar dos anzas del cultivo joven en un tubo que contenga el sustrato. Mezclar bien llevar a 37 °C durante 6 hs. Adicionar 0.1 mL del reactivo revelador Carbonato de sodio 10 %. Interpretación Variante 1. La aparición de color rojo indica que la prueba es positiva. Incoloro o rosado pálido indica que la prueba es negativa. Variante 2. La aparición de un color azul indica que la prueba es positiva. La aparición de color verde, celeste verdoso ó precipitado azul indica que es negativa. Controles M. terrae o M. fortuitum: positivo. M. tuberculosis: negativo. j. Prueba de la pirazinamidasa Las cepas de M. tuberculosis que son sensibles a la pirazinamida poseen la enzima pirazinamidasa que metaboliza la pirazinamida en ácido pirazinoico. Las cepas pirazinamida - resistente han perdido la actividad pirazinamidasa. Medios y Reactivos Agar medio de cultivo, ver Anexo. Solución de sulfato ferroso al 1 %. Procedimiento Cultivar 5 a 10 mg de la masa bacteriana proveniente de un desarrollo joven en medio Löwestein-Jensen, en el medio de agar preparado para el método, incubar a 37 ºC durante 4 días. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 23 Agregar a cada tubo 1 mL de la solución de sulfato ferroso amoniacal al 1 % y colocar los tubos en el refrigerador. Luego de 4 horas se examina la presencia de una banda rosada de difusión de la sal ferrosa. Interpretación Banda rosa en la interfase, indica la hidrólisis de la pirazinamida con formación de ácido pirazinoico. Controles M. tuberculosis H37Rv: positivo. M. bovis, BCG: negativo. k. Prueba de la ß-galactosidasa Se demuestra la presencia o ausencia de la enzima ß-galactosidasa, por utilización del compuesto orgánico: o-nitrofenil-ß-D-galactopiranósido (ONPG). Bacteria + ONPG (incoloro) hidrólisis β-galactosidasa o - nitrofenol (amarillo) NO2 OH CH2OH OH hidrólisis O NO2 β-galactosidasa OH OH (ONPG) o - nitrofenol (ONP) Medios y Reactivos Medio de Dubos modificado. Procedimiento Se inoculan 0,5 mL de una suspensión bacilar de aproximadamente 1 mg/mL, en cada tubo 24 Dirección de Laboratorio y Control Técnico con medio de cultivo. La suspensión bacilar debe prepararse a partir de un cultivo joven. Se incuba a 37 ºC, durante 4 a 6 semanas. Interpretación La aparición de color amarillo indica positivo, debido a la hidrólisis enzimática del sustrato, con liberación de nitrofenol. Controles M. chelonae:: positivo. M. bovis: negativo. l. Inositol, Manitol ó Citrato Utilización del carbono para el desarrollo. Medios y Reactivos Ver Anexo. Procedimiento Utilizar cultivos de 7 días en caldo ADC-Middlebrook 7H9 ó suspensión de un cultivo en LJensen, preparar diluciones en base 10 en solución salina estéril hasta no observar turbidez. De la última dilución inocular 0.1 mL en cada tubo con los medios suplementados. Colocar un tubo de control, sin inocular, por cada medio. Incubar a 37 °C, observar a los 14 días. Interpretación Desarrollo en los medios con inositol, manitol ó citrato: positivo. No se observa crecimiento: negativo. Controles M. smegmatis:: desarrolla en los tres medios. M. fortuitum: no desarrolla en los tres medios. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 25 4. Crecimiento en presencia de drogas Los agentes químicos recomendados para pruebas de tipificación son: Hidracida del ácido 2-Tiofeno carboxílico, Cicloserina, Acido p-aminosalicílico, Isoniacida, Estreptomicina, Etambutol y Rifampicina. Medios y Reactivos Estas drogas son agregadas en solución concentrada al medio de Löwenstein-Jensen antes de su coagulación y en cantidades establecidas para dar las siguientes concentraciones finales: Hidracida del ácido 2-Tiofeno carboxílico: 2 mg/L-1 Cicloserina: 30 mg/L-1 Acido p-aminosalicílico: 0,5 mg/L-1 Isoniacida: 0,2 mg/L-1 Estreptomicina: 4 mg/L-1 Etambutol: 2 mg/L-1 Rifampicina: 40 mg/L-1 El medio de cultivo debe agitarse, luego de la adición de las drogas, para obtener una buena dispersión de las mismas. Procedimiento Se prepara una suspensión bacilar, de aproximadamente 1 mg/ mL-1, a partir de un cultivo en medio sólido; de esta suspensión madre se realizan diluciones (10-3 y 10-5). Se inoculan 0,1 mL de cada dilución en 2 tubos de medio sin droga y en otros 2 con droga. Se incuba durante 4 semanas. Interpretación La lectura se realiza contando el número de colonias en cada tubo. Se considera que una cepa es resistente cuando el desarrollo en el tubo con droga es de 10 % de lo que se observa en el tubo control. - Hidracida del ácido 2-Tiofeno carboxílico (TCH): 2 mcg/mL. 26 Dirección de Laboratorio y Control Técnico Materiales y Reactivos Ver Anexo. Procedimiento Inocular con una gota de la suspensión bacteriana. Incubar a 35-37 ºC durante 2-3 semanas. Interpretación Crecimiento en ambos medios (con y sin TCH): Micobacteria resistente al TCH. Crecimiento solamente en medios sin TCH: Micobacteria sensible al TCH. Controles M. triviale: resistente, crecimiento en ambos tubos. M. bovis: sensible, solamente crecimiento en el tubo control. - Cloruro de sodio (NaCl): 5 % Reactivos Ver Anexo. Procedimiento Inocular una suspensión bacilar, de concentración aproximada igual a 1 mg/mL-1, en agua destilada, a 2 tubos de Löwenstein-Jensen, uno con NaCl y otro sin agregado. Incubar a 37 ºC y examinar una vez por semana, durante 28 días. Interpretación En el tubo control normalmente se obtendrá desarrollo de colonias incontables. Si, en esas condiciones, en el tubo con NaCl se observa desarrollo de más de 50 colonias, se considera que la cepa es resistente o tolerante al NaCl. Si el desarrollo es menor de 50 colonias se considerará que es sensible. Controles M. triviale: resistente, crecimiento en ambos tubos. M. avium: sensible, crecimiento solamente en el tubo control. - Acido p-nitrobenzoico: 0.5 mg/mL. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 27 Medios y Reactivos Ver Anexo. Procedimiento Inocular una gota de suspensión bacteriana. Incubar 35-37 ºC durante 2 ó 3 semanas. Interpretación Crecimiento en presencia de PNB: Micobacteria No Tuberculosa (MNT). Controles M. fortuitum: resistente. M. bovis: sensible. - Acido pícrico: 0.2 % Ver Anexo. Procedimiento Preparar una suspensión de la micobacteria a ser identificada a una concentración de 1 mg/ mL y sembrar 0,2 mL en un tubo de agar Sauton como control de desarrollo de la micobacteria y 0,2 mL en un tubo de agar Sauton con ácido pícrico al 0,2%. Incubar a 37 ºC. Leer observando la aparición de crecimiento a los 6 días, si es negativo se lee nuevamente a los mismos tiempos que para detección de tiempo de crecimiento. Interpretación En el tubo de agar Sauton debe aparecer crecimiento y en el de agar Sauton con ácido pícrico aparecerá crecimiento si se trata de micobacterias de rápido crecimiento, mientras que no habrá desarrollo si es una micobacteria de crecimiento lento. En caso de que no aparezca crecimiento en el tubo control de agar Sauton, repetir la prueba. Controles M. fortuitum: resistente. M. tuberculosis: sensible. 28 Dirección de Laboratorio y Control Técnico - Hidroxilamina (HA) 500 mg/mL. Ver Anexo. Procedimiento Inocular una gota de la suspensión bacteriana. Incubar a 37 ºC durante 2 a 3 semanas. Controles M. fortuitum:: resistente. M. flavescens: sensible. - Isoniacida (INH) 10 mg/mL. Ver Anexo. Preparación Inocular una gota de la suspensión bacteriana. Incubar a 37 ºC durante 2 a 3 semanas. Controles M. fortuitum: resistente. M. bovis: sensible. 5. Plaqueo para el control de pureza en agar Dubos o Middlebrook 7H10 Colocar el medio de cultivo en placas de Petri, dejar solidificar y realizar la inoculación por el agregado de 0.1 mL, distribuir homogéneamente la suspensión, sellar la placa mediante cinta adhesiva para evitar la evaporación excesiva. Realizar observación semanal del desarrollo para comprobar la aparición de las colonias de micobacterias y/o contaminantes. Hacer coloración de Gram y de Ziehl-Neelsen del cultivo. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 29 6. Referencias - American Thoracic Society. Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria. Am. J. Respir. Crit. Care Med, 1997, 156:1-25. -Aranaz A., D. Cousins, A. Mateos, and L. Domínguez. Elevation of Mycobacterium tuberculosis subsp. caprae Aranaz et al. 1999. to especies rank as Mycobacterium caprae com. nov., sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 2003, 53:1785-1789. -Brander, E.; E. Jantzen; R. Huttunen; A. Julkunen, and M. L. Katila. Characterization of a distinct group of slowly growing mycobacteria by biochemical tests and lipids analyses - J. Clin. Microbiol., 1992, 30:1972-1975. -Brosh, R., S. V. Gordon, M. Marmiesse, P. Brodin, C. Buchrieser, K. Eiglmeier, T. Garnier, C. Gutiérrez, G. Hewinson, K. Kremer, L. M. Parsons, A. S. Pym, S. Samper, D. van Soolingen, and S. T. Cole. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:3684-9. -Brown-Elliot, B., A.; R., J., Wallace. Clinical and Taxonomic Status of Pathogenic Nonpigmented or Late-Pigmenting Rapidly Growing Mycobacteria. -Clin. Microbiol. Reviews, October 2002, p. 716-746, Vol. 15. -Burkhard S.; P. Kirschner, et al. Mycobacterium interjectum, a New Species Isolated from a Patient with Chronic Lymphadenitis - J. of Clin. Microbiol., Dec. 1993, Vol. 31, N° 12, p. 3083-3089. -Burnens, A. P. and U. Vurma-Rapp. Simplified diagnostic susceptibility testing of mycobacteria against thiacetazone hydroxylamine, p-nitrobenzoic acid and picric acid-Res. Microbiol. 1989, 140: 235-241. -Collins, C. H., J. M. Grange, M. D. Yates. Mycobacteria in water, 1984 J. Appl. Bacteriol. 57:193-211. -Cousins, D. V., R. Bastida, A. Cataldi, V. Quse, S. Redrobe, S. Dow, P. Duignan, A. Murray, C. Dupont, N. Ahmed, D. M. Collins, W. R. Butler, D. Dawson, D. Rodríguez, J. Loureiro, M. I. Romano, A. Alito, M. Zumárraga and A. Bernardelli. Tuberculosis in seals caused by a novel member of the Mycobacterium tuberculosis complex: Mycobacterium pennipedii sp. nov., Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 2003, 53:1305-1314. -David, H.; V. Lévy-Frebault, and M. F. Thorel. Méthodes de laboratoire pour mycobactériologie clinique. Institut Pasteur, París, 1989. -Donlan, R. M. Biofilms: a microbial life on surfaces. Emerg. Infect. Dis., 2002, 8:881-90. -Hoffner, S. E.; B. Henriquez et al. Mycobacterium malmoense: an easily missed pathogen – J. Clin. Microbiol., 1991, 29:2673-2674. -Falkinham, J. O., 3rd. Nontuberculous mycobacteria in the environmental - Clin. Chest. Med., 2002, 23:529-51. -Hakim, A., N. Hisam, and P. D. Reuman. Enviromental mycobacterial peritonitis complicating peritoneal dyalisis: three cases and review, 1993 Clin. Infect. Dis., 1993, 16:426-31. 30 Dirección de Laboratorio y Control Técnico -Inderlied, C. B.; C. A., Kemper, and L. E. M. Bermúdez. The Mycobacterium avium complex Clin. Microbiol. 1993, Rev. 6:266-310. -Kantor, I. N.; A., Bernardelli. Identificación preliminar de micobacterias aisladas en muestras de origen humano o animal - Rev. Med. Vet. (Bs. As.) Vol. 68 N° 2, 1987. -Kasda, J.; E. Stackebrandt, J.; Smida, D. E.; Minnikin, M. Daffe, J. H. Parlett, and C. Pitulle. Mycobacterium cookii sp. nov. -Int. J. Syst. Bacteriology, 1990, 40:217-223. -Kirschner, P.; A. Testke, K. H. Schröder, et al. Mycobacterium confluentis sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1992, 42:257-262. -Kubica, G. P. and R. C. Good. The genus Mycobacterium (except M. leprae)-The Prokaryotes: a handbook on habitats, isolation and identification of bacteria. Springer-Verlag, Berlín –1981, p. 1962-1984. -Kuzunoki, S.; and T. Ezaki. Proposal of Mycobacterium peregrinum sp. nov. nom. rev., and elevation of Mycobacterium chelonae subsp. abscessus (Kubica et al.) to species status:Mycobacterium abcessus comb. nov. -Int. J. Syst. Bacteriol. -1992, 42:240-245. -Leão, S. C.; Martin, A.; Mejía, G. I.; Palomino, J. C.; Robledo, J.; da Silva Telles M. A. and Portaels, F. Practical handbook for the phenotypic and genotypic identification on mycobacteriaINCO-DEV-CA-2004. -León, C. Presencia de las micobacterias no tuberculosas en Colombia, Med. UIS, 1998, 12:181-87. -Meier, A.; Kirschner, P.; Schöder, K-H.; Wolters, J.; Kroppenstedt, R. M. and Böttger, E. C. Mycobacterium intermedium sp. nov. –Int. J. of Syst. Bacteriology, Apr. 1993, 204-209. -Morales, A. Infección cutánea por Mycobacterium marinum: informe de un paciente con linfangitis nodular. Arch. Argentinos de Pediatría, 2000, 98:398-399. -Narvaiz de Kantor I., S. J. Kim, T. Frieden, A. Laszlo, F. Luelmo, P. I. Norval, H Rieder, P. Valenzuela and K. Meyer. Laboratory Services in Tuberculosis Control –Culture Part III-WHO/TB/98. 258, World Health Organization 1998. -Oriani, D. S., and M. A. Sagardoy. Nontuberculous mycobacteria in soils of La Pampa province (Argentina) Rev. Argent. Microbiol., 2002, 34:132-7. -Palomino, J. C., A. Martin, and F. Portaels. New methods for the diagnosis and drug resistance detection of mycobacteria, Recent. Res. Devel. Microbiology, 2002, 2:297-318. -Rastogi, N., E. Legrand, and C. Sola. The mycobacteria: an introduction to nomenclature and pathogenesis, Rev. Sci. Tech, 2001, 20:21-54. -Portaels, F. Epidemiology of mycobacterial diseases, Clin. Dermatol., 1995, 13:207-22. -Roberts, G. D.; E. W. Koneman, and Y. K. Kim. Mycobacterium – Manual of clinical microbiology, 5th ed. American Society for Microbiology, Washington, D. C. –1991, p. 304-339. -Sommers, H. M.; and R. C. Good. Mycobacterium –Manual of clinical microbiology, 4th ed. American Society for Microbiology Washington, D. C. , 1985, p. 216-248. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 31 -Stahl, D. A. and J. W. Urbance. The division between fast- and slow-growing species corresponds to natural relation-ships among the mycobacteria – J. Bacteriol., 1990, 172: 116-124. -Thorel, M. F.; M., I., Krichevsky and V. Vincent Lévy-Frébault. Numerical taxonomy of mycobactin-dependent mycobacteria, emended description of Mycobacterium avium, and description of Mycobacterium subsp. avium subsp. nov., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis subsp. nov., and Mycobacterium avium subsp. silvaticum subsp. nov. -Int. J. Syst. Bacteriol. 1990, 40:254-260. -Tortoli, E.; C., Piersimone; D., Bacosi; et al. Isolation of the Newly Described Species Mycobacterium celatum from the AIDS Patients J. of Clin. Microbiol., Jan. 1995, Vol 33, N° 1, p. 137-140. -Vincent Lévy-Frébault, V. and Françoise Portaels. Proposed Minimal Standards for the Genus Mycobacterium and for Description of New Slowly Growing Mycobacterium Species-Int. J. of Syst. Bacteriol., Apr. 1992 Vol. 42, N°2, p. 315-323. -Wallace, R. J. Jr.; V. A. Silcox et al. Clinical Significance Biochemical Features and Susceptibility Patterns of Sporadic Isolates of the Mycobacterium chelonae –Like Organism-J. of Clin. Microbiol., Dec. 1993, Vol 31, N° 12 P. 3231-3239. -Wallace, R. J. Jr., B. A. Brown et al. Clinical disease, drug susceptibility, and biochemical patterns of the unnamed third biovariant complex of Mycobacterium fortuitum. - J. Infect. Dis. 1991, 163: 598-603. -Wayne, L. G. and G. P. Kubica. The mycobacteria -Bergey’s manual of systematic bacteriology, vol. 2. The Williams & Wilkins Co., Baltimore, 1986, p. 1435-1457. -Wayne, L. and H. A. Sramek. Agents of newly reconized or infrequently encountered mycobacterial diseases-Clin. Microbiol. 1992, Rev. 5:1-25. -Wayne, L. G.; D. J. Brenner; et al. Report of the Ad Hoc Committee on Reconciliation of Approaches of Bacterial Systematics Int. J. Syst. Bacteriol., 1987, 37:463-464. -Wayne, L. G.; R. C. Good et al. First report of the cooperative, open-ended study of slowly growing mycobacteria by the International Working Group of Mycobacterial Taxonomy. 1981, Int. J. Syst. Bacteriol. 31:1-20. -Wayne, L. G.; D. J. Good et al. Second report of the cooperative, open-ended study of slowly growing mycobacteria by the International Working Group on Mycobacterial Taxonomy -Int. J. Syst. Bacteriol. 1983, 33:265-274. -Wayne, L. G.; D. J., Good et al. Third report of the cooperative, open-ended study of slowly growing mycobacteria by the International Working Group on Mycobacterial Taxonomy -Int. J. Syst. Bacteriol., 1989, 39:267-278. -Wayne, L. G.; D. J. Good et al. Fourth report of the cooperative, open-ended study of slowly growing mycobacteria by the International Working Group on Mycobacterial Taxonomy- Int. J. Syst. Bacteriol., 1991, 41:463-472. -Zhibang, Y., Z. BiXia, L. Qishan, C. Lihao, L. Xiangquan and L. Huaping. Large-scale outbreak of infection with Mycobacterium chelonae subsp. abscessus after penicillin injection, J. Clin. Microbiol., 2002, 40:2626-8. 32 Dirección de Laboratorio y Control Técnico 7. Anexo Formulaciones Se describen los insumos y metodología de elaboración correspondientes a las reacciones ó condiciones de desarrollo prescritas. a. Producción de niacina Solución de anilina 4% La anilina es oncogénica y penetra a través de la piel, trabajar con guantes y cuidadosamente. La anilina cambia de color por exposición al aire y a la luz, preparar solución fresca cuando sea necesario. Anilina, fresca, clara, incolora.......................4 mL Etanol 95 %...................................................96 mL Mezclar la anilina con el etanol en una botella color ámbar y conservar a oscuras y en la heladera, descartar la solución si cambia a color amarillo. Solución de bromuro de cianógeno 10 % El bromuro de cianógeno es tóxico y severo irritante de las mucosas cuando es inhalado,trabajar en ambiente ventilado cuando se prepara la solución y en cabina de seguridad biológica cuando se procede con los cultivos. En solución ácida el bromuro de cianógeno se hidroliza a ácido cianhídrico el que es extremadamente tóxico Cuando se descartan todos los tubos de la reacción, agregar previamente una solución desinfectante alcalina, adicionando hidróxido de sodio. Bromuro de cianógeno, cristales......................5 g Agua destilada.................................................50 mL Colocar los cristales de bromuro de cianógeno con el agua destilada en un vaso de vidrio,tapar y dejar bajo campana a temperatura ambiente hasta disolución de los mismos, aproximadamente 24 hs. No calentar la solución con mechero Bunsen. Colocar dentro de un frasco de colocar ámbar y mantener en el refrigerador. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 33 Calentar a temperatura ambiente para disolver cualquier precipitado formado por el enfriamiento. Preparar pequeñas cantidades porque el bromuro de cianógeno es volátil y pierde potencia a través del tiempo. Soluciones débiles pueden llegar a dar resultado falso-negativo. En algunas regiones se prepara la solución acuosa de cianuro de potasio al 4 % y bromo en la siguiente forma: Trabajar en una cabina de bioseguridad. El agua de bromo es altamente corrosiva y volátil y deberá mantenerse alejada de otros reactivos químicos. El cianuro de potasio es sumamente venenoso. Abrir una ampolla de bromo (50 mL) en un frasco de vidrio oscuro de 1000 mL de capacidad con tapón de vidrio,conteniendo 150 mL de agua destilada fría. Preparar la solución acuosa de cianuro de potasio al 4 %, disolviendo 4 g de la droga en 100 mL de agua destilada. El cianuro de potasio debe ser puro y no estar hidratado. Retirar con una pipeta 1 mL de la capa de bromo por debajo de la superficie del agua de bromo y transferir en el fondo de un frasco erlenmeyer de vidrio de 250 mL, agregar rápidamente, gota a gota y con mezcla por rotación, la solución de cianuro de potasio, hasta total decoloración de la solución. b. Reducción de Nitrato - Método clásico con reactivos líquidos -Sustrato de nitrato de sodio en buffer Preparar una solución de nitrato de sodio 0.01M en buffer fosfato 0.022 M, pH7, en la siguiente forma: KH2 PO4......................................3.02 g Agua destilada......................... 1000 mL Disolver el fosfato de potasio en agua destilada para obtener una solución 0.022 M ..............Solución 1. Na2 HPO4...........................................3.16 g Agua destilada................................1000 mL Disolver el fosfato de sodio en agua destilada para obtener una solución 0.022 M ...............Solución 2. 34 Dirección de Laboratorio y Control Técnico Agregar 611 mL de la solución 2 a 389 mL de la solución 1 y mezclar bien, controlar el pH7.............Solución 3. Preparar el sustrato de nitrato de sodio en buffer en la siguiente forma: NaNO3 ...............................................0.85 g Solución 3.........................................1000 mL Disolver el nitrato de sodio en el buffer y distribuir en alícuotas de 100 mL Esterilizar por autoclavado a 121 °C durante 15 minutos. Cuando sea necesario, alicuotar la solución del substrato en forma aséptica en tubos con tapa esterilizados en cantidad de 2 mL. - Solución de ácido clorhídrico Acido clorhídrico concentrado......................................10 mL Agua destilada...............................................................10 mL Agregar lentamente el ácido clorhídrico al agua destilada, nunca a la inversa para obtener una solución 1:1. Mantener en un frasco color ámbar, en la oscuridad, en la heladera. - Solución de sulfanilamida al 0.2 % Sulfanilamida.......................0.2 g Agua destilada.....................100 mL Disolver la sulfanilamida en agua destilada y mantener en un frasco color ámbar,en la oscuridad, en la heladera. - Solución de N-naftiletilendiamina 0.1 %..........................0.1 g Agua destilada................................................................100 mL Disolver la N-naftiletilendiamina en agua destilada y conservar en frasco color ámbar en la oscuridad, en la heladera. - Método con cristales como reactivo El reactivo en seco, con cristales es fácil de preparar, tiene un tiempo una duración de 6 meses y la ventaja de utilizar un solo compuesto para la determinación de nitrato en lugar de los tres reactivos líquidos utilizados en el método químico convencional. Sustrato de nitrato de sodio en buffer Prepararlo como fue indicado previamente. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 35 Reactivo en cristales Acido sulfanílico.............................................................1 parte. Dihidrocloruro de N-(1naftil)-etilendiamina....................1 parte. Acido tartárico L (+)....................................................10 partes. Colocar los componentes en un frasco color caramelo y mezclar vigorosamente, mediante agitación manual durante 30 minutos. El ácido tartárico es de composición difícil de mezclar, por ello es necesario colocarlo en un mortero y disgregarlo fuertemente, para que su incorporación a las otras dos drogas sea más integrada. La mezcla seca tiene una apariencia cristalina heterogénea. Conservar en frasco color ámbar a temperatura ambiente. - Técnica de nitrato en tiras de papel Es un material comercial con el cual se puede determinar la reducción del nitrato. Se obtienen resultados consistentes especialmente con fuertes reductores de nitrato, tal como el M. tuberculosis. Los resultados son reproducibles, la técnica implica mucho menor trabajo que el método químico, pero es más oneroso. Estándar de reducción del nitrato Para asegurar los resultados de la interpretación de la reducción del nitrato es recomendable preparar una serie estándar donde la intensidad de color varía de +/- a 5+. Se mantiene en forma indefinida y es posible utilizar cada vez que se realiza la técnica. Reactivos - Solución concentrada a- Fosfato disódico 0.067 M Na2 HPO4 anhidro.....................................9.47 g H2O dest..............................................1000 mL b- Fosfato monopotásico 0.067 M KH2 PO4..................................................9.07 g H2O dest............................................. 1000 mL 36 Dirección de Laboratorio y Control Técnico c- Fosfato trisódico 0.067 M Na3 PO4 .2H2O......................................25.47 g H2O dest..............................................1000 mL d- Fenolftaleína 1 % (1 g en 100mL de alcohol etílico) e- Azul de bromotimol 1% (1 g en 100 mL de alcohol etílico) f- Azul de bromotimol 0.01%: preparar mezclando 1.0 mL de la solución e) en 100 mL de agua destilada). - Buffer solución de trabajo Mezclar 35 mL de la solución concentrada a), 1.5 mL de la solución concentrada b) y 100 mL de la solución concentrada c). Procedimiento -Colocar ocho tubos limpios en una gradilla, numerarlos de 1 a 8, usar el mismo tamaño de tubos que los utilizados en la técnica de nitrato reducción. -Colocar 2 mL del buffer solución de trabajo en los tubos 2 a 8. -En 10 mL del buffer solución de trabajo, agregar 0.1 mL de solución d) y 0.2 mL de solución f)........... solución g). - Colocar 2 mL de la solución g) en el tubo número 1. Corresponde a 5+ del estándar de color. - Al tubo 2, agregar 2 mL de la solución g), mezclar bien y transferir 2 mL al tubo siguiente número 3, proseguir con la serie de diluciones por el agregado de 2 mL, en todos los tubos descartando 2 mL del último tubo. Estándar de color Tubo 1: 5+ Tubo 2: 4+ Tubo 3: 3+ Tubo 5: 2+ Tubo 6: 1+ Tubo 8: +/Autoclavar los tubos, sellar y mantener a 5 °C. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 37 c. Prueba de catalasa cuantitativa y cualitativa -Solución buffer de fosfatos 0.067 M, pH 7 Mezclar 61.1 mL de una solución de fosfato disódico M/15 (9.47 g. Na2PO4H en 1000 mL de H2O), con 38.9 mL de una solución de fosfato monopotásico M/15 (9.07 g de KPO4H2 en 1000 mL de H2O). - Peróxido de hidrógeno al 30 % (mantener en heladera) No utilizar peróxido de hidrógeno al 3 %, de venta en farmacias. Manipular el reactivo con guantes y protección ocular. - Tween 80 al 10 % Disolver 10 mL de Tween 80 en 90 mL de agua destilada, mezclar y autoclavar 10 minutos a 121 °C. Mantener en refrigeración. - Reactivo para catalasa Mezclar inmediatamente antes de su uso, partes iguales de Tween 80 al 10 % y peróxido de hidrógeno al 30 %. Calcular la utilización de 0.5 mL de la solución por cada cepa a analizar. d. Hidrólisis de Tween 80 - Tween 80. - Rojo neutro. - Solución reguladora de fosfato M/15, pH 7: Mezclar 61.1 mL de fosfato disódico M/15 (9.47 g en 1000 mL de agua) con 38.9 mL de una solución de fosfato monopotásico M/15 (9.07 g en 1000 mL de agua). Disolver 0.5 mL de Tween 80 y 2.0 mg de rojo neutro en 100 mL de solución reguladora. Controlar el pH, que no debe ser menos de 7.0 y el color amarillo ámbar. Distribuir en tubos de 16 x 125 mm con tapa rosca (4 mL en cada uno). Autoclavar 15 minutos a 121 °C. Conservar en refrigeración y sin contacto con la luz, no más de dos semanas. e. Prueba de Arilsulfatasa - Sustrato Fenolftaleína disulfato tripotásico.....................2.6 g Agua destilada...................................................50 mL 38 Dirección de Laboratorio y Control Técnico Solución 0.08 M Esterilizar por filtración. Mantener en refrigeración. CO3 Na2 anhidro...............................................10.6 g Agua destilada..................................................100 mL Solución de Carbonato de sodio 2N Medio de cultivo Preparar 200 mL de medio líquido de Dubos. Agregar al medio 2,5 mL de la solución del sustrato para la prueba de 3 días, y 7,5 mL para la prueba de 2 semanas. Distribuir asépticamente en tubos de 16 mm x 125 mm con tapa rosca, a razón de 2,0 mL por tubo. Reactivo Solución de carbonato de sodio 2,0 N (disolver 10,6 g de Na2CO3 anhidro en 100 mL de agua destilada). f. Toma de Hierro Citrato de hierro amoniacal................................4 g Agua destilada................................................100 mL Esterilizar 15 minutos a 121 °C g. Reducción del Telurito Solución de telurito de potasio 0.2 % (telurito de potasio 0.1 g en 500 ml de agua destilada). Colocar 2 ml en pequeños tubos o en viales y autoclavar (10 minutos x 121 ºC). Conservar a 4 ºC. Procedimiento Preparar medio Middlebrook 7H9 y suplementar con 0.5 mL de Tween 80 por cada 1000 mL de medio, distribuir en volúmenes de 180 mL y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121 °C, a cada 180 mL del medio estéril mantenido a 50-55 °C suplementar con 20 mL de OADC (ácido oleico, albúmina, dextrosa y catalasa) adquirido en el comercio o bien prepararlo en las siguientes proporciones: - Dextrosa 0.8 mL al 50 %, que se prepara disolviendo 50 gramos de la droga en 99 mL de agua destilada. Se agrega 1 mL de solución de ácido cítrico al 10 %. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 39 Se autoclava 10 minutos a 121 °C. - Catalasa 1000 mg/mL, agregar 0.4 mL - Complejo albúmina-ácido oleico, preparado en la siguiente forma: Disolver 0.12 mL de ácido oleico en 20 mL de Hidróxido de sodio N/20. Preparar una solución de albúmina bovina al 5 %, mezclando 95 mL de cloruro de sodio al 0.85 % y 5 g de la fracción V albúmina bovina. Agregar 5 mL de la solución de ácido oleico a 95 mL de solución de albúmina al 5 %, ajustar el pH a 6.8. Filtrar por placa o membrana esterilizante. Repartir en tubos esterilizados e incubarlos a 37 °C, durante una noche. Colocar en baño de maría a 56 °C durante 30 minutos y conservar a 4 °C. Distribuir el medio resultante en tubos con tapa a rosca, de 16 x 160 mm, colocar en posición inclinada y dejar solidificar. h. Método de la ureasa Medio de cultivo Peptona.............................................................1 g Dextrosa............................................................1 g ClNa..................................................................5 g PO4H2K..............................................................2 g Urea................................................................20 g Rojo de fenol....................................................0.012 g Agua destilada c.s.p......................................100 mL Procedimiento Realizar la mezcla de los componentes y esterilizar por filtración. Diluir 1:10 con agua destilada estéril y distribuir en tubos esterilizados de 13 x 100 mm con tapa a rosca. Mantener en oscuridad y en refrigeración. i. Presencia de la Fosfatasa ácida Reactivos Variante 1 40 Dirección de Laboratorio y Control Técnico Sustrato: Fenolftaleína difosfato 0.5 M. Solución 1: Acido acético 0.2 M Acido acético 11.41 mL/1000 mL de agua destilada. Mantener a 4 °C por el plazo de 1 año. Solución 2: Acetato de sodio 0.2 M Acetato de sodio: 16.41 g/1000 mL de agua destilada. Autoclavar, mantener a 4 °C por el plazo de 1 año. Procedimiento Mezclar 14.5 mL de la solución 1 y 85.5 mL de la solución 2, calentar durante 30 minutos. Enfriar a temperatura ambiente y agregar 100 mg de difosfato de fenolftaleína por cada 100 mL de la solución. Mantener a 4 °C por un plazo no mayor de 6 semanas. Carbonato de sodio al 10 % Autoclavar, mantener a 4 °C por un tiempo no mayor de 1 año. Variante 2 Buffer de acetato de sodio Soluciones concentradas 1. Acido acético glacial....................................................................30 mL Agua desionizada.............................................................................470 mL 2. Acetato de sodio Acetato de sodio.3H2O.....................................................................68 g Agua desionizada...........................................................................500 mL Buffer acetato pH 5.0 Solución concentrada 1.....................................................................195 mL Solución concentrada 2.....................................................................300 mL Agua desionizada..............................................................................505 mL El pH final debe ser 5.0. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 41 Sustrato Fosfatasa ácida Sal magnésica de monofosfato de timolftaleína................................ 25 mg Hidróxido de sodio 1 N..........................................................................2 mL Disolver la sal completamente en el hidróxido de sodio, agregar el buffer acetato pH 5.0, hasta un volumen final de 50 mL. Esterilizar por filtración mediante placa ó membrana de 0.45 υm. Envasar en tubos con tapa rosca esterilizados volúmenes de 2 mL. Revelador de la reacción Hidróxido de sodio 5 N Esterilizar en autoclave a 15 libras de presión durante 20 minutos. j. Prueba de la pirazinamidasa Medio de cultivo Caldo base deshidratado de Dubos comercial.......................................6.5 g Agua destilada.................................................................................1000 mL Pirazinamida......................................................................................100 mg Piruvato de sodio.....................................................................................2 g Agar.......................................................................................................15 g Procedimiento Calentar la mezcla hasta fundir el agar, distribuir 5 mL en tubos con tapa rosca de 16 x 125 mm, esterilizar 15 libras, durante 15 minutos, dejar solidificar los tubos en posición vertical. Sulfato ferroso amoniacal.......................................................................1 g Agua destilada.................................................................................100 mL k. Prueba de la β-galactosidasa Medio de cultivo Preparar medio de Dubos modificado según la fórmula siguiente: Fosfato monopotásico anhidro............................ 1 g 42 Dirección de Laboratorio y Control Técnico Fosfato disódico.12 H2O................................. 0.25 g Sulfato de magnesio.7 H2O............................... 0.6 g Citrato de sodio............................................... 1.5 g Asparragina......................................................2.0 g Tween 80 solución acuosa 10 %......................5.0 mL Procedimiento Se disuelven los componentes, cada uno por separado, en un volumen de 100 mL de agua. Mezclar y completar a 1000 mL, pH 7.2 Se distribuye en frascos, 100 mL en cada uno. Autoclavar 20 minutos a 121 °C. Se prepara una solución al 20 % de fracción V de albúmina bovina en solución fisiológica. Esta solución debe calentarse a 56 °C durante 30 minutos y esterilizarse por filtración. Se disuelven en 100 mL del medio basal anteriormente descrito, 100 mg del sustrato 2-nitrofenil β-D-galactopiranósido, agregándose luego 4 mL de la solución de albúmina. Se esteriliza por filtración nuevamente y se distribuye en tubos con tapa a rosca, 5 mL en cada tubo. l. Citrato, Manitol e Inositol Medios de cultivo (NH4)2SO4......................................................................2.4 g KH2PO4 ………………………………………………………..0.5 g MgSO4.7 H2O……………………………………………..…. 0.5 g Agar 2 %………………………………………………….……20 g Agua destilada……………………………………………..950 mL Citrato de sodio................................................................5.6 g Manitol.............................................................................5.0 g Inositol.............................................................................5.0 g Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 43 Procedimiento Medio basal Disolver en agua destilada todos los reactivos excepto, citrato de sodio, manitol e inositol. Ajustar a pH 7, con NaOH 10% ó ClH 10 %, autoclavar durante 20 minutos a 121 °C. Medio con Citrato Enfriar a 56 °C en baño de agua, disolver 5.6 g de citrato de sodio en 50 mL de agua destilada esterilizar mediante filtración por membrana, agregar asépticamente al medio basal, distribuir 8 mL por tubo, solidificar en pico de flauta. Medio con Manitol Ajustar el medio basal a pH 7 antes de autoclavar, dejar enfriar a 56 °C en baño de agua, disolver 5.0 g de manitol en 50 mL de agua destilada, esterilizar mediante filtración por membrana, agregar asépticamente al medio basal, distribuir 8 mL por tubo, dejar solidificar en pico de flauta. Medio con Inositol Ajustar el medio basal a pH 7 antes de autoclavar, dejar enfriar a 56 °C en baño de agua disolver 5.0 g de inositol en 50 mL de agua destilada estéril, esterilizar mediante filtración por membrana, agregar asépticamente al medio basal, distribuir 8 mL por tubo, dejar solidificar en pico de flauta. 4. Crecimiento en presencia de drogas - Hidracida del ácido 2-Tiofeno carboxílico (TCH) 2 mcg/mL Preparar TCH 2 mcg/mL: 20 mg de TCH en 20 mL de agua destilada estéril. Transferir 0.1 mL de esta solución a un tubo con 9 mL con agua destilada. Agregar 1 mL a 100 mL de medio de L.-Jensen. Distribuir en tubos y coagular en pico de flauta a 80 °C durante 45 minutos. O bien: dividir 4 cuadrantes en una caja de Petri, colocar en 2 medios de cultivo con TCH y en los otros dos sin TCH. - Cloruro de sodio 5 % Preparar un lote con la concentración final de cloruro de sodio al 5 %, asegurar que la mezcla sea homogénea. 44 Dirección de Laboratorio y Control Técnico - Acido p-nitrobenzoico 0.5 mg/mL Preparar una solución madre de 25 mg/mL: disolver 2,5 g de PNB en 15 mL de NaOH 1 N, completar el volumen con agua destilada estéril, agregar 1 ó 2 gotas de fenolftaleína al 0.1 % (solución en etanol) y agregar 3 mL aproximadamente y gota a gota de solución de HCl 1 N hasta que el color desaparezca. Si aparece un precipitado es debido al exceso de ácido, agregar entonces otro volumen de NaOH. Completar con agua destilada estéril hasta 100 mL. Preparar alícuotas de 5 mL, la solución es estable a –20 °C durante 3 meses. Agregar 4 mL de PNB 25 mg/mL a 200 mL de medio de L-Jensen antes de la coagulación. - Acido pícrico 0.2 % Preparar un lote de medio de Sauton con ácido pícrico al 2 % disuelto en agua. - Hidroxilamina (HA) 500 mg/mL Pesar 0.5 mg de Hidroxilamina y diluir en 10 mL de agua destilada estéril. Agregar 1 mL de la solución a 100 mL de medio base de L-Jensen. Distribuir 2 mL en tubos de 12 x 120 mm, coagular en pico de flauta, durante 50 minutos a 85 °C. - Isoniacida (INH) 10 mg/mL Pesar 100 mg de isoniacida y diluir en 10 mL de agua destilada estéril. Colocar 1 mL de esta solución en 9 mL de agua destilada estéril. Agregar 1mL de esta solución a 100 mL de medio base de L-Jensen. Distribuir 2 mL en tubos de 12 x 120 mm. Coagular durante 50 minutos a 85 °C. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 45 8. Diagramas de Flujo A. Clasificación inicial de Micobacterias No Tuberculosas (NTM) de acuerdo con el tiempo de crecimiento / producción de pigmento. B. No cromógenas - Lento crecimiento. Catalasa e Hidrólisis de Tween positiva. C. No cromógena - Lento crecimiento. Catalasa y Nitrato reducción negativa. D. Fotocromógena - Lento crecimiento. E. Escotocromógena - Lento crecimiento. F. No cromógena - Rápido crecimiento. 9 . Ta b l a s . N° 1. Identificación de Micobacterias No Tuberculosas (NTM). N° 2. Identificación de Micobacterias No Tuberculosas (NTM) Rápido Crecimiento. N° 3. Especies de Lento Crecimiento. N° 4. Especies de Rápido Crecimiento. 10. Fotos. 46 Dirección de Laboratorio y Control Técnico 8. Diagramas de flujo A. Clasificación inicial de Micobacterias No Tuberculosas (NTM) de acuerdo con el tiempo de crecimiento / producción de pigmento. Ref.: Practical handbook for phenotypic and genotypic identification of mycobacteria INCO-DEV-CA-2004. B. No cromógenas - Lento crecimiento. Catalasa e Hidrólisis de Tween positiva. Ref.: Practical handbook for phenotypic and genotypic identification of mycobacteria INCO-DEV-CA-2004. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 47 C. Crecimiento lento. Catalasa y Nitrato Reducción negativa Ref.: Practical handbook for phenotypic and genotypic identification of mycobacteria INCO-DEV-CA-2004. D. Crecimiento lento. Fotocromógena (*): M. szulgai es fotocromógena a 25 °C. Ref.: Practical handbook for phenotypic and genotypic identification of mycobacteria INCO-DEV-CA-2004. 48 Dirección de Laboratorio y Control Técnico E. Crecimiento lento. Escotocromógena (*): M. flavescens se identifica como de crecimiento rápido. Ref.: Practical handbook for phenotypic and genotypic identification of mycobacteria INCO-DEV-CA-2004. F. Crecimiento rápido. No cromógena M. smegmatis M. mucogenicum M. abscessus M. chitae M. chelonae Ref.: Practical handbook for phenotypic and genotypic identification of mycobacteria INCO-DEV-CA-2004. M. peregrinum M. fortuitum Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 49 50 Dirección de Laboratorio y Control Técnico + + + + + + + + M. flavescens M. gordonae M. scrofulaceum M. szulgai**** Requiere hemina para su crecimiento. Amarillo pálido. S/I F a 25 ºC. + + + + + + + M.xenopi*** M. kansasii M. marinum M. simiae * ** *** **** + + + + + + + + + +/+ + + + + + - 25°C 37°C M. avium M. gastri M. intracellulare M. malmoense M. nonchromogenicum M. shimoidei M. terrae M. triviale M. celatum** ESPECIES +/- + - +/-/+ - 45°C +: -: +/-: -/+: INH Cat.Sc. Nitrato Urea sa PZA - + - - 3d +/+ + + - + + + + + + Fos. - - + + SI ß-gal + + +/- + + - + + + + + + - Tween -/+ +/- + + + + - 3d -/+ + +/- + + + + + + - 9d Telurito HA: Hidroxilamina INH: Isoniacida Cat Sc Catalasa Semicuantitativa PZA: Pirazinamidasa Fos: Fosfatasa B-gal: Beta-galactosidasa Telurito 3d, 9d: Reducción del telurito en 3 días, 9 días. + +/- + + + - +/+ +/+ 14d Arilsulfatasa Símbolos R: Rápido M: Moderado L: Lento N: No cromógena Ec: Escotocromógena F: Fotocromógena S/I: Sin Información LENTO C RECIMIENTO NO CROMOGENAS + + + +/+/+ +/+ + + +/+/+ + + +/+ + + + +/+/SI + + + +/SI SI + LENTO CRECIMIENTO FOTOCROMOGENAS + +/+/+ + + SI +/-/+ + + + +/+ + + LENTO CRECIMIENTO ESCOTOCROMOGENAS SI + + + + SI + +/+ + + -/+ + + SI + + + + + HA > 85% de las cepas positivo < 15% de las cepas negativo 50% a 85% de las cepas positivo 15% a 49% de las cepas positivo + - - + - NaCI N° 1: Identificación de Micobacterias No Tuberculosas (NTM) 9 . Ta b l a s Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 51 Símbolos + : > 85% de las cepas positivas. - : <15% de las cepas negativas. +/- : 50 a 85% de las cepas positivas. -/+ : 15% a 49% de las cepas negativas. + Ec/F M. parafortuitum + + + + + + - - + + SI - - - - 45°C +/- + + + - + - -/+ + L: Ec: Ec/F: SI: + + + + SI + -/+ + + NaCI Pícrico Hidroxilamina Fosfatasa Beta-galactosidasa Arilsulfatasa 3 días No cromógena +/- + + 37°C HA: Fos: B-gal: Aril 3d: N: N M. smegmatis + + N M. mucogenicum + + SI N M. abscessus Ec + N M. chelonae Ec/F + N M. peregrinum M. vaccae + N M.fortuitum M. phlei 25°C Pigm. ESPECIES +/- + + + +/- - - + + Nitrato +/- -/+ - - + + + + + Aril.3d - - - - + + + + HA Lento Escotocromógena Escotocromógena / Fotocromógena Sin Información - - + - + + + + Fos. - - - - - - + - - ßgal. + + + + SI - - + + SI + + + + -/+ -/+ + + Hierro Tween + - + - - - - Inositol N° 2: Identificación de Micobacterias No Tuberculosas (NTM). Rápido crecimiento + + + + - - + - Manitol + + + + - + - - Citrato 52 Dirección de Laboratorio y Control Técnico - - - +/- + + + + + - - + + N N N N N N N N N N N N N N N M. tuberculosis M. bovis M. africanum M. microti M. avium M. gastri M. genavense M. haemophilum** M. intracellulare M. malmoense M. nonchrogenicum M. paratuberculosis M. shimodei M. terrae M. triviale - + + + + + +/- + + + + N/F F F F F F Ec Ec Ec Ec Ec Ec Ec/F M. celatum M. xenopi M. asiaticum M. intermedium M. kansasii M. marinum M. simiae M. cooki M. flavescens M. farcinogenes M. gordonae M. interjectum M. scrofulaceum M. szulgai + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +/- + SI + + + + + + + + + + + + + + + - - - + TCH - - - - - + - - - - SI - - - - + - - - - - - - - - - - - - - NaCI Lento. No cromogénica. Escotocromógena. Fotocromógena. Sin información. - - - - - +/- - - - - - - + - - - - -/+ - - - +/- - - - - - - - - 45°C L: N: Ec: F: SI: 37°C Símbolos + : > 85% de las cepas positivas. - : < 15% de las cepas negativas. +/-: 50 a 85% de las cepas positivas. -/+: 15% a 49% de las cepas negativas. R: Rápido. M: Moderado. + - +/- N N* M. ulcerans +/- - 25°C Pigm. ESPECIES DE LENTO CRECIMIENTO + + SI + SI + + + + +/- SI + +/- SI SI + + + SI + + + - SI +/- + - - - - PNB SI + SI SI SI SI SI + SI - SI + + SI + SI + - SI + + + + SI +/- + - - - - HA - - SI - - - - +/- +/- - SI +/- +/- SI + + + - SI + + +/- + SI - + - - - - INH - - - - - - -/+ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + +/- - + Niacina + + + + + + +/- + + + +/- + + + + +/- +/- + -/+ + - + - +/- - - - - Catalasa 68°C + + -/+ + + + + + -/+ + SI + - - - + + - - + - - - + - - - - - - Catalasa SC Convenciones Pigm: Pigmentación 25 ºC: Crecimiento a 25 ºC. 37 ºC: Crecimiento a 37 ºC. 45 ºC: Crecimiento a 45 ºC. TCH: Hidracida del ácido 2-tiofeno carboxílico 5mg/mL. NaCl: Crecimiento en NaCl al 5%. PNB: Crecimiento en ácido p-nitrobenzoico 0.5 mg/mL. Pícric.: Crecimiento en ácido pícrico 0.2%. INH: Crecimiento en presencia de isoniacida 10 m/mL. Catalasa a 68 ºC. - - SI - - + - - - - SI - - SI - - - - SI - - - - - - - - - - - Pícrico N° 3: Especies de lento crecimiento + + + - +/- + - + + + + - - - +/- - - - - - +/- - - +/- +/- - + + + + Ureasa Catalasa Sc: Nitrato: PZA: HA: b-gal: Hierro: Tween: Telurito 3d: Telurito 9d: + -/+ - - + + + - - + + - - - - + +/- - - - - - - - - - +/- +/- - + Ni tr ato +/- - SI - SI + + - + + SI - + + - +/- - - - + - +/- - - +/- - - - - - A r il. 3d. +/- - SI - SI - SI + + - + + SI - + + - +/- - - - + - +/- - - - - - - A r il. 14d. + - - +/- - - + - + + + + - + +/- + + + - + - - - - + - - +/- - - Fosfatasa Catalasa semicuantitativa. Reducción de nitratos a nitritos. Pirazinamidasa. Hidroxilamina. Beta-galactosidasa. Toma de Hierro. Hidrólisis de Tween. Reducción de telurito en 3 días. Reducción del telurito en 9 días. + + + +/- SI + - + + - - - +/- + - +/- +/- + + +/- +/- + + + - + + +/- - + PZA +/- - - + + + - - + + + + - - - + + + +/- + + - - +/- + - +/- +/- +/- +/- +/- - - - SI -/+ - + - - SI - - - - - - - SI - + + - SI - + - - - - Telurito 3d. +/- + - - SI -/+ - + - - SI - + - - + - - SI - + + - SI - + - - + + Telurito 9d. Utilización de inositol. Utilización de manitol. Utilización de citrato. Arilsulfatasa a los 3 días. Arilsulfatasa a los 14 días. Fosfatasa ácida. Tween Inositol: Manitol: Citrato: Aril 3d: Aril 14d: Fosfatasa: - - SI - SI - SI - - - SI - - SI - - + - - + - - - SI - - - - - - ßgal . Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 53 + + + Ec/F Ec/F Ec Ec M. vaccae M. parafortuitum M. thermoresistibile M. duvalli + + + + + + + + +/- + + + Símbolos +: >85% de las cepas positivas. -: <15% de las cepas negativas. +/-: 50 a 85% de las cepas positivas. -/+: 15% a 49% de las cepas negativas. R: Rápido. M: Moderado. L: Lento. N: No cromogénica. Ec: Escotocromógena. F: Fotocromógena. SI: Sin información. + + + N Ec M. phlei SI + + + + + - + - - + + SI - - - - - SI + +/- + + + - + - + -/+ + NaCI + + + + + + + + + + + PNB SI + + + + + SI + -/+ + + + Pícrico SI SI SI SI SI SI SI SI SI + + - - - - + - + + + + + INH Fosfatasa SI + + + - SI -/+ +/- + + + Catalasa 68°C + + +/- + + + +/- - - + + + Nitrato SI SI + + + + + + + + + Ureasa SI SI SI SI SI SI + + + + + PZA - - +/- -/+ - - + + + - + + Ar i l 3d - - - - - - + + - + + HA - - - - - - - + - - - ßgal Fosfatasa ácida. Catalasa a 68 ºC. Catalasa Sc: Catalasa semicuantitativa. Nitrato: Reducción de nitratos a nitritos. PZA: Pirazinamidasa. HA: Hidroxilamina. b-gal: Beta-galactosidasa. Hierro: Toma de Hierro. Tween: Hidrólisis de Tween. SI + + + - + + + + + + Catalasa SC Convenciones Pigm: Pigmentación 25 ºC: Crecimiento a 25 ºC. 37 ºC: Crecimiento a 37 ºC. 45 ºC: Crecimiento a 45 ºC. TCH: Hidracida del ácido 2-tiofeno carboxílico 5mg/mL. NaCl: Crecimiento en NaCl al 5%. PNB: Crecimiento en ácido p-nitrobenzoico 0.5 mg/mL. Pícric.: Crecimiento en ácido pícrico 0.2%. INH: Crecimiento en presencia de isoniacida 10 m/mL. + + + + + + + + + + + 25°C 37°C 45°C TCH M. smegmatis N N M. chelonae N N M. chitae M. mucogenicum N M. abscessus N M. peregrinum Pigm. M. fortuitum ESPECIES DE RAPIDO CRECIMIENTO N° 4: Especies de rápido crecimiento SI SI SI SI SI SI + + + + + Telurito 3d SI - SI + - + - - SI - - Inositol + - + + + + - - - + - Manitol Reducción de telurito en 3 días. Reducción de telurito en 9 días. Utilización de inositol. Utilización de manitol. Utilización de citrato. Arilsulfatasa a los 3 días. Arilsulfatasa a los 14 días. Fosfatasa ácida. SI + SI + + + + -/+ -/+ + + + Tw een Telurito 3d: Telurito 9d: Inositol: Manitol: Citrato: Aril 3d: Aril 14d: Fosfatasa: SI - + + + + SI - - - + + Hi erro - - + + + + - + - - - Citrato 10. Fotos 1. Mycobacterium bovis AN5. 2. Niacina. Cepa H37 Rv: reacción positiva. 54 Dirección de Laboratorio y Control Técnico 3. Reducción de nitrato. Mycobacterium phlei: reacción positiva. 4. Reducción de nitrato. Mycobacterium fortuitum: reacción positiva. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 55 5. Catalasa semicuantitativa. Lado derecho: reacción positiva. 6. Catalasa a temperatura ambiente y a 68 °C. Tubos 1 y 2: negativo. Tubos 3 y 4: positivo. 56 Dirección de Laboratorio y Control Técnico 7. Arisulfatasa - 3 días. Cepa 10: reacción positiva. 8. Toma de hierro. Lado izquierdo: reacción positiva. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 57 9. Reducción del telurito. Tubo central: reacción positiva. 10. Reducción del telurito. Lado izquierdo: reacción positiva. 58 Dirección de Laboratorio y Control Técnico 11. Ureasa. Tubo color rojo: reacción positiva. 12. Fosfatasa ácida. Cepa 166: reacción positiva. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 59 13. Pirazinamidasa. Cepa 534. Reacción positiva: anillo rosado. 14. Reacción de la beta-galactosidasa. Lado izq.: tubo control negativo. Lado der.: reacción positiva. 60 Dirección de Laboratorio y Control Técnico 15. Mycobacterium phlei: desarrollo en presencia de ClNa. 16. Crecimiento en presencia de drogas PNB, HA, ClNa, INH, TCH, cepa 2615. 17. Crecimiento en presencia de drogas, cepa 2610. Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 61 18. Crecimiento en presencia de drogas, cepa Mycobacterium bovis AN5. 19. Crecimiento en presencia de drogas, cepa 2617. 62 Dirección de Laboratorio y Control Técnico Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias 63 Dirección de Laboratorio y Control Técnico Coordinación General de Laboratorio Animal
