Departamento de Farmacéuticos El Departamento de

Departamento de Farmacéuticos
El Departamento de Farmacéuticos tiene a su cargo Dra. Marta Ayala
del Departamento Farmacéuticos
el desarrollo de nuevos productos farmacéuticos Jefa
Licenciada en Bioquímica
Doctora en Ciencias Biológicas
para el tratamiento del cáncer y las enfermedades Investigadora Auxiliar
cardiovasculares
y
neurodegenerativas,
cicatrización, citoprotección y reguladores de
liberación de citocinas en las respuestas
inmunes/inflamatorias e identificación de blancos
terapéuticos contra el VIH. Se cuenta también con
tecnologías de desarrollo de anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos
recombinantes en E.coli y levadura, así como la identificación de interacción mediante la
tecnología de bibliotecas de péptidos y bibliotecas de anticuerpos en fagos.
Proyectos en curso:
• Oncología Molecular
• Vacuna contra Cáncer de Cerviz
• Péptidos antitumorales e inmunomoduladores derivados del CIGB-550
• Selección de nuevas moléculas a partir de bibliotecas combinatorias presentadas sobre
fagos
• Inmunoterapia del Cáncer (vacuna antiangiogénica, antitumorales y AcM anti CEA)
• Cicatrización y cito-protección
• CIGB845: Combinación terapéutica para Neuroprotección.
• Identificación de blancos celulares de inhibición del VIH
• Terapia génica con VEGF
Proyecto Oncología Molecular
Descripción:
Este proyecto centra su atención en la búsqueda de
fármacos con utilidad terapéutica en el cáncer y
desarrollar inhibidores peptídicos de acción intracelular
dirigidos contra la fosforilación mediada por la proteína
Kinasa 2 (caseína quinasa 2, CK2). La enzima CK2 es
una quinasa del tipo serina-treonina que es
frecuentemente desregulada en muchos tumores
humanos. Las investigaciones de nuestro proyecto se han encaminado tomando como
hipótesis que la abrogación de la fosforilación de la CK2 puede inducir efecto antitumoral en
diferentes localizaciones.
El producto líder del proyecto, CIGB-300, induce apoptosis en diferentes líneas celulares
tumorales (HPV+, pulmón, mama, y otros). La figura 1 ilustra los resultados obtenidos con el
CIGB-300 en cuanto a inhibición in vitro de la fosforilación de CK2, activación de caspasa, así
como el efecto antitumoral en modelo animal. Estos resultados se discuten con detalle en
artículo publicado en Cancer Research por Perea y colaboradores (2004).
Dr. Silvio Perea
Líder del Proyecto:
Fig. 1. Efecto del CIGB-300 en células tumorales.
En el caso del cáncer cérvico-uterino, el trabajo está dirigido a la obtención de un péptido
inhibidor del sitio de fosforilación de la oncoproteína E7 del Virus Papiloma Humano (VPH) el
cual se encuentra en el 99,7% de los tumores en esta localización. Para este propósito se han
ensayado bibliotecas de péptidos en fagos filamentosos con el objetivo de encontrar ligandos
de unión a E7 cuyas secuencias son sintetizados químicamente y los péptidos evaluados en
modelos celulares de tranformación por VPH (células CaSki) y en modelos animales con
tumores humanos en ratones atímicos. Debido a que la oncoproteína E7 se expresa
mayormente en el núcleo, se tiene previsto el empleo de un sistema de delivery a través de
péptidos de acción intracelular. Hasta el momento se han descrito diferentes péptidos que
logran entrar al interior de la célula y han sido usados para el transporte de macromoléculas y
péptidos hacia compartimentos como núcleo, citoplasma, retículo endotelial y mitocondria.
Actualmente se desarrolla el péptido CIGB-300 como ejemplo de inhibidor de la fosforilación
mediada por CK2. Este péptido venció las etapas de prueba de concepto farmacológico,
toxicológico y actualmente ha alcanzado el terreno clínico para su evaluación.
En el 2006 se realizó el primer Ensayo Clínico de Fase 1 con este péptido en pacientes con
lesiones cervicales de alto grado. Los resultados indicaron buena tolerancia y seguridad,
además de evidenciar algunos signos de eficacia.
Publicaciones
1. Perea SE, Reyes O, Baladron I, Perera Y, Farina H, Gil J, Rodriguez A, Bacardi D, Marcelo
JL, Cosme K, Cruz M, Valenzuela C, López-Saura PA, Puchades Y, Serrano JM, Mendoza
O, Castellanos L, Sanchez A, Betancourt L, Besada V, Silva R, López E, Falcón V,
Hernández I, Solares M, Santana A, Díaz A, Ramos T, López C, Ariosa J, González LJ,
Garay H, Gómez D, Gómez R, Alonso DF, Sigman H, Herrera L, Acevedo B. CIGB-300, a
novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer
properties both in vitro and in vivo. Mol Cell Biochem. 2008 Jun 25. [Epub ahead of
print]
2. Perera Y, Farina HG, Hernandez I, Mendoza O, Serrano JM, Reyes O, Gomez DE, Gomez
RE, Acevedo BE, Alonso DF, Perea SE. Systemic administration of a peptide that impairs
the protein kinase (CK2) phosphorylation reduces solid tumor growth in mice. Int J Cancer.
2008 Jan 1;122(1):57-62.
3. Perea SE, Reyes, Puchades Y, Mendoza O, Vispo NS, Torrens I, Santos A, Silva R,
Acevedo B, López E, Falcón V, Alonso DF. Antitumor effect of a novel proapoptotic peptide
that impairs the phosphorylation by the protein kinase 2 (casein kinase 2). Cancer Res.
2004 Oct 1;64(19):7127-9.
Proyecto: Vacuna contra VPH (CIGB-228)
Descripción
El cáncer cérvico-uterino continúa siendo un
serio problema de salud para la mujer a nivel
mundial con la aparición de alrededor de
500 000 nuevos casos cada año según reportes
de la Organización Mundial de la Salud. En
algunas regiones de Latino América por ejemplo,
el cáncer cérvico-uterino figura como el tumor de
mayor frecuencia en mujeres seguido por el cáncer mamario. En Cuba, a pesar de la
existencia de un programa nacional encaminado a la detección precoz del cáncer cérvicouterino mueren alrededor de 370 mujeres cada año a consecuencia de esta enfermedad. El
desarrollo del cáncer cérvico-uterino ha sido asociado a la infección por un tipo de
Papilomavirus humano (VPH) clasificado en la categoría de alto riesgo y entre los cuales
figuran el VPH-16 y VPH-18 como los de mayor frecuencia. Sobre la base de estos
antecedentes, la búsqueda de alternativas terapéuticas para el tratamiento del cáncer cérvicouterino que emerjan del conocimiento científico constituye una prioridad en los programas de
salud de muchos países del mundo.
El proyecto CIGB-228 se focaliza en la búsqueda de alternativas terapéuticas para el
tratamiento del cáncer cérvico-uterino desde la perspectiva de un enfoque vacunal. La vacuna
está compuesta por péptidos de VPH adyuvados con VSSP restringidos a seleccionados
alelos del complejo de histocompatibilidad principal de clase I, que inducen la activación de
linfocitos T citotóxicos y como resultado la destrucción de las células tumorales. Además esta
vacuna terapéutica puede conferir protección inmunológica contra la recurrencia de tumores
en pacientes con cáncer cérvico-uterino que hayan sido previamente tratados por cirugía. El
desarrollo de este candidato vacunal ha sido objeto de patente y los resultados obtenidos de
la prueba de concepto de la vacuna han sido publicados recientemente.
Las NIC de alto grado se pueden tratar con efectividad y facilidad por una excisión local o
destrucción; sin embargo existe cierto grado de morbilidad asociado con el procedimiento de
tratamiento y el control de la recidiva de la enfermedad. Además puede poner en riesgo la
capacidad reproductiva de mujeres jóvenes. Las pacientes en estos estadios de la
enfermedad por lo general aún son inmunocompetentes por lo que las vacunas antitumorales
terapéuticas suelen ser más efectivas y las pacientes pueden recibir un mayor beneficio con
esta terapia. La propuesta de un ensayo clínico de fase I de evaluación de la seguridad en
lesiones cervicales de alto grado y cáncer cervical en sus primeros estadios responde a las
consideraciones anteriormente mencionadas. El estudio de la seguridad y los beneficios de
este tratamiento pueden ser la base de otros ensayos en estadios superiores.
En la actualidad se está realizando un Ensayo Clínico de Fase I con el candidato vacunal
CIGB-228 en pacientes con carcinoma cérvico-uterino en estadio “in situ” y en neoplasia
Dra. Isis Torrens
Líder del Proyecto
intraepitelial cervical de grado 2 y 3 (NIC-II/III) con el objetivo de conocer la seguridad del
tratamiento y asegurar el paso a estudios clínicos más completos Fase II/III que permitan
demostrar la eficacia de la vacuna en pacientes diagnosticados con estas patologías.
200
80
Tumor volume (mm3)
% Tumor free
100
Peptide+VSSP
Peptide+IFA
VSSP
PBS
60
40
20
0
0
10
20
30
Days
40
50
0
Peptide + VSSP
Protección de los ratones
inmunizados del reto tumoral
2000
2000
Percent survival
TumorVolume
Volume
Tumor
(mm3)
(mm3)
100
1000
1000
500
500
00
80
60
00
10
10
40
40
Regresión de tumores establecidos
tratados con la vacuna
50
50
Peptide +VSSP
VSSP
PBS
40
Peptide +IFA
20
0
Days
20
20 Days30
30
Control
Protección de los ratones inmunizados de
un segundo reto tumoral
Peptide + VSSP
Peptide + VSSP
VSSP
VSSP
PBS
PBS
Peptide+IFA
Peptide+IFA
1500
1500
100
0
20
40
60
Days
80
100
Sobrevida de los ratones tratados
con la vacuna
Publicaciones
Torrens I, Mendoza O, Batte A, Reyes O, Fernandez LE, Mesa C, Guillen G. Immunotherapy
with CTL peptide and VSSP eradicated established human papillomavirus (HPV) type 16 E7expressing tumors. Vaccine. 2005 Dec 30;23(50):5768-74.
Péptidos antitumorales e inmunomoduladores derivados del CIGB-550
Descripción
A pesar de los progresos de la medicina moderna, el
cáncer permanece como la segunda causa de
muerte, superado solamente por las enfermedades
cardiovasculares. Según estima la Organización
Mundial de la Salud (OMS, 03/02/06), cada año se
registran 10 millones de casos de cáncer en todo el
mundo y se producen 6 millones de defunciones anuales como consecuencia de la
enfermedad. El cáncer de pulmón se considera uno de los tipos de cáncer que causa mayor
mortalidad en Estados Unidos y en Europa. La Sociedad Americana de Cáncer estimó que en
el 2005 se produjeron 172 000 nuevos casos
Efecto de péptido s análo go s del CIGB -550 so bre el pro medio
del vo lumen de masa tumo ral
de cáncer de pulmón, y aproximadamente 164
000 pacientes murieron por esta causa. Cada
600
año se producen entre 2 y 3 millones de casos
500
A nalo go 2
de cáncer cutáneo, de los cuales unos 130 000
A nalo go 8
se agravan en forma de melanoma maligno, la
400
CIGB -550
forma más severa de cáncer de piel. Las
P lacebo
300
Leucemias y Linfomas tienen un estimado de
200
muerte, para los EU, de un 4% y 3%
respectivamente. Por otra parte, mieloma
100
múltiple permanece incurable con un estimado
0
por año de 16 000 casos y representa el 2%
17 20 23 26 29 32 35 38 41
de las muertes por cáncer en los EU,
Días po st-ino culació n células TC-1
(American Cancer Society, 2006). Estudios en
Cuba confirman, que los tipos de cáncer mas
Survival Functions
frecuente en la mujer son los de mama, cuello
1.2
útero, pulmón y colon, mientras que en el
1.0
GRUPOS
hombre se suman a los dos últimos, los de
placebo
próstata y laringe. Cada año en Cuba fallecen
.8
unas 19 mil personas debido a tumores
CIGB-550
.6
malignos y se diagnostican un promedio de 29
mil nuevos casos, siendo la segunda causa de
.4
Analogo 8
muerte en el país. Nuestro proyecto de
Investigación-desarrollo está encaminado a la
.2
Analogo 2
obtención futura de nuevas drogas para tratar
0.0
el cáncer, basado en pequeños péptidos con
36
38
40
42
44
46
48
50
Cum Survival
Dra. Maribel Guerra Vallespí
Líder del Tema
Dias post-inoculacion celulas TC-1
Concentración de péptido que inhibe el 50% del crecimiento celular
300
Analogo 2
200
150
100
50
H
(fi
-8
br
2
ob
l
as
5R
to
(fi
s)
br
ob
la
st
os
M
R
C
X63
L9
29
Lineas celulares
K5
62
-1
-3
J7
74
TC
PC
A5
49
12
5
H
eL
a
H
ep
-2
0
H
CI50 (uM)
250
acción
antitumoral
e
inmunoestimulante
(Péptidos
análogos del CIGB-550).
Entre los efectos de los nuevos
miméticos del CIGB-550, destaca la
inducción de un patrón de citocinas
Th1 predominante. Así como un
efecto citotóxico selectivo en células tumorales humanas de diversos orígenes histológico. De
particular relevancia, es el resultado que demuestra que este péptido protege los animales en
experimento de doble reto (animales inicialmente protegidos del primer reto con la célula
tumoral reciben un segundo golpe), resaltando la efectividad de esta molécula en proporcionar
un mantenido efecto anti-tumoral, evidenciando el desarrollo de una respuesta inmune
adaptativa especifica.
En la actualidad, se ha seleccionado un péptido análogo con la proyección futura de
convertirse en un candidato antitumoral. Este péptido tiene una demostrada eficacia en
diversos modelos de tumor en ratones: modelo TC-1 (células epiteliales de pulmón),
melanoma B16, carcinoma de Lewis (modelo de metástasis en pulmón) y mieloma X-63. La
acción de esta molécula se basa en la combinación de un efecto citotóxico directo sobre la
célula cancerigena y el aporte de elementos inmunes que conlleven a revertir la tolerancia del
huésped al tumor.
Publicación
1. Rodríguez-Alonso I, Martínez H, Colás M, Garay HE, Reyes O, y Guerra Vallespí M.
Limulus-derived LALF32-51 peptide regulates cytokine expression and toll-likereceptor in
macrophages-derived THP-1 cells exposed to lipopolysaccharide. BA. 2006 abr-jun;23(2):
99-107.
Proyecto Cicatrización y cito-protección
Dr. Jorge Berlanga Acosta
Descripción
Líder del Proyecto
En este proyecto se investiga el mecanismo molecular
responsable de la acción citoprotectora demostrada por
el
péptido
CIGB500
en
situaciones
de
Isquemia/Reperfusión. Como se muestra en el siguiente
gráfico, se demostró que dicho mecanismo involucra la
preservación de los niveles de expresión del gen Hif 1α y el incremento en los niveles de
expresión como índice de la activación de la ruta PI3k/Akt. Las rutas de señales asociadas a
la activación de estos genes son capaces de promover la preservación de células que sufren
episodios de hipoxia. Se demostró además que el CIGB500 aumenta el radio de expresión de
los genes Bcl2/Bax, lo cual indica un efecto de inhibición de la apoptosis inducido por este
péptido.
Fig.1: Cambios en la expresión de genes
involucrados en la respuesta de citoprotección
inducida por el CIGB500. Los niveles de
expresión fueron normalizados empleando el gen
β-actin como control. Letras diferentes indican
diferencias estadísticas entre los grupos
experimentales para al menos p<0,05.
Los estudios con el péptido CIGB500 también están encaminados al área cardiovascular. Con
el modelo experimental de Miocardiopatía Dilatada inducida por la administración de
Doxorubicina (DX) en ratas se confirmó el efecto del CIGB500 como restaurador de la función
cardiaca, en tanto es capaz de revertir completamente la disfunción ventricular inducida por el
citostático, como se observa en el siguiente gráfico de la Fracción de Eyección. En
evaluaciones ex vivo e in vivo se demostró que el CIGB500 aumenta la función sistólica del
miocardio mediante el aumento de la contracción ventricular asociada a la entrada de iones
Ca2+ al citoplasma, a través de los canales de Ca tipo L. Esto se determinó mediante el
empleo del verapamilo, un inhibidor específico de estos canales, y diferentes concentraciones
de iones Ca2+ en la solución.
Fig. 2A: Efecto de restauración de la Función Ventricular inducido por el tratamiento con el CIGB500.
Fig. 2B: Efecto de aumento de la contractilidad del músculo cardíaco inducido por el CIGB500. Curva
Dosis-Respuesta.
Fig. 2C: El aumento de la contractilidad inducido por el CIGB500 solo se produce en presencia de un
gradiente de iones Ca2+ y en ausencia del inhibidor de los canales de Ca tipo L.
Publicaciones
1. León Fernández OS, Ajamieh HH, Berlanga J, Menéndez S, Viebahn-Hánsler R, Re L,
Carmona AM. Ozone oxidative preconditioning is mediated by A(1) adenosine receptors in
a rat model of liver ischemia/ reperfusion. Transpl Int. 2008 Jan;21(1):39-48.
2. Berlanga J, Cibrian D, Guevara L, Dominguez H, Alba JS, Seralena A, Guillen G, LopezMola E, Lopez-Saura P, Rodriguez A, Perez B, Garcia D, Vispo NS. Growth Hormone
Releasing Peptide 6 (GHRP6) prevents oxidant cytotoxicity and reduces myocardial
necrosis in a model of Acute Myocardial Infarction (AMI). Clin Sci (Lond). 2007
Apr;112(4):241-50.
3. Fernández-Montequín JI, Infante-Cristiá E, Valenzuela-Silva C, Franco-Pérez N, SavigneGutierrez W, Artaza-Sanz H, Morejón-Vega L, González-Benavides C, Eliseo-Musenden O,
García-Iglesias E, Berlanga-Acosta J, Silva-Rodríguez R, Betancourt BY, López-Saura PA;
Cuban Citoprot-P Study Group. Intralesional injections of Citoprot-P((R)) (recombinant
human epidermal growth factor) in advanced diabetic foot ulcers with risk of amputation. Int
Wound J. 2007 Dec;4(4):326-327.
4. Acosta JB, Savigne W, Valdez C, Franco N, Alba JS, Rio AD, Lopez-Saura P, Guillen G,
Lopez E, Herrera L, Fernandez-Montequin J. Epidermal growth factor intralesional
infiltrations can prevent amputation in patients with advanced diabetic foot wounds. Int
Wound J. 2006 Sep;3(3):232-9.
5. Borrego A, Zamora ZB, Gonzalez R, Romay C, Menendez S, Hernandez F, Berlanga J,
Montero T. Ozone/Oxygen mixture modifies the subcellular redistribution of bax protein in
renal tissue from rats treated with Cisplatin. Arch Med Res. 2006 Aug;37(6):717-22.
6. Cibrian D, Ajamieh H, Berlanga J, Leon OS, Alba JS, Kim MJ, Marchbank T, Boyle JJ,
Freyre F, Garcia Del Barco D, Lopez-Saura P, Guillen G, Ghosh S, Goodlad RA, Playford
RJ. Use of growth-hormone-releasing peptide-6 (GHRP-6) for the prevention of multiple
organ failure. Clin Sci (Lond). 2006 May;110(5):563-73.
CIGB845: Combinación terapéutica para Neuroprotección.
Descripción
Los objetivos de este proyecto están dirigidos a la
búsqueda de alternativas terapéuticas que faciliten o
promuevan eventos de regeneración de tejidos del
sistema nervioso después de un daño o lesión.
En estos momentos contamos con una combinación de dos péptidos neuroprotectores y
neuroregeneradores, a la cual denominamos CIGB845, cuya utilidad ha sido demostrada en
dos modelos experimentales de Encefalitis Autoinmune Experimental (EAE). Uno de estos
modelos es con ratas Lewis. En él la enfermedad se induce con homogenado de médula de
curiel y no se usan los adyuvantes clásicos. La EAE en ratas Lewis se caracteriza por tener un
curso leve y se asocia a una muy baja tasa de mortalidad, el no usar los componentes de los
adyuvantes clásicos nos permite tener una enfermedad recidivante. El otro de los modelos de
EAE es en ratones C57BL6, y la enfermedad se induce con el Péptido MOG35-55 junto con
altas concentraciones del Micobacterium tuberculosis y la toxina Pertussis. Aquí la
sintomatología es muy intensa y se produce un alto índice de mortalidad.
En ambos tipos de EAE el tratamiento con el CIGB845 produce una atenuación marcada de
los signos neurológicos así como de los infiltrados inflamatorios característicos de estos
modelos. En el caso de la EAE severa inducida con MOG35-55 el tratamiento con el CIGB845
incrementa notablemente la sobrevida. Los mecanismos moleculares que explican los efectos
del CIGB845 están relacionados a un incremento significativo de los niveles del gen de
sobrevida Factor de Crecimiento Similar a la Insulina tipo 1 (IGF1) y a la reducción de la
peroxidación lipídica.
Dra. Diana García del Barco
Líder del Proyecto
EAE Severa
EAE moderada
Curso clínico recidivante
Alta mortalidad
Recuperación espontánea y Curso
clínico monofásico.
Baja mortalidad
Publicaciones
1. del Barco DG, Berlanga J, Penton E, Hardiman O, Montero E. Boosting controlled
autoimmunity: a new therapeutic target for CNS disorders. Expert Rev Neurother. 2008
May;8(5):819-25.
2. Garcia del Barco D, Berlanga J, Penton E, Montero E, Hardiman O. Neuroprotective
autoimmunity: Reappraising current therapeutic approach and future perspectives. BA
2007, 24(2):
Projecto Fragmentos recombinantes de anticuerpo anti-CEA dirigidos al Cáncer Colorrectal y
su Inmunoterapia
Descripción
Dr. Jorge Gavilondo
Durante los últimos diez años hemos desarrollado una
Líder del Proyecto
plataforma tecnológica vinculada a la ingeniería genética
de anticuerpos y, en particular, al desarrollo de
fragmentos de anticuerpos a partir de hibridomas
murinos, así como su producción en in E. coli, Pichia
pastoris, y plantas transgénicas. En este caso se
clonaron los genes de las regiones variables ligera y
pesada del anticuerpo monoclonal ior/CB-CEA.1, con alta especificidad por el antígeno
carcinoembrionario (CEA), y se unieron en una proteína de fusión mediante espaciadores de
5 y 15-aa. Las construcciones génicas resultantes fueron usadas para transformar bacterias y
producir fragmentos monoméricos de simple cadena de anticuerpo Fv (scFv) (27 Kda) y
moléculas del tipo "diabody" del scFv. En el último caso, el apareamiento espontáneo de dos
de las moléculas scFV expresadas produce un fragmento divalente de anticuerpo de 60 kDa,
con una alta avidez y especificidad por el CEA humano.
Tanto el scFv monomérico como el diabody muestran actividad en
ELISA, FACS, inmunofluorescencia indirecta e inmunohistoquímica,
reconociendo células tumorales humanas y tejidos tumorales CEA+.
Los fragmentos de anticuerpo se purifican por una combinación de
IMAC y filtración por gel. El diabody se marca satisfactoriamente con
125
I y 131I y cuando se inyecta en ratones desnudos (Figura 1) con
tumores humanos CEA+ LS174T, muestra la localización específica
del tumor y presenta buenas características de retención (Figura 2).
Fig. 1
% ID /gr
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
tumor
hueso
músculo
estómago
Órganos
int.gr.
int.del
riñón
corazón
pulmón
bazo
hígado
sangre
24 horas
48 horas
72horas
3.0
3.5
El diabody se ha producido en condiciones de BPM y
recientemente recibió la aprobación para un ensayo clínico
Fase I donde la molécula radiomarcada con 131I será inyectada
en pacientes con cáncer colorrectal, a dos niveles de dosis
(masa) diferentes, para evaluar seguridad, retención tumoral,
farmacocinética y farmacodinámica. También se realizan
experimentos relacionados con la conjugación de los
fragmentos de anticuerpos a moléculas peptídicas con efecto
antitumoral.
Fig. 2
Publicación
Perez L, Ayala M, Pimentel G, Bell H, Canaán-Haden L, Bequet M, González LJ, Miranda M,
Ravelo R, Roque L, Acevedo B, Oliva JP, Gavilondo JV. A multivalent recombinant antibody
fragment specific for carcinoembryonic antigen. Biotechnol Appl Biochem. 2006 Jan;43(Pt
1):39-48.
Projecto Inmunoterapia activa específica orientada a angiogénesis
Descripción
Se encuentra en desarrollo una preparación vacunal
terapéutica para producir respuestas inmunes humoral y
celular contra factores pro-angiogénicos y sus
receptores. Hemos puesto especial énfasis en el sistema
Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular (VEGF)A/Receptor 2 de VEGF, debido a su importante papel en
el desarrollo de los vasos sanguíneos asociadas a tumor. Las preparaciones vacunales
probadas experimentalmente han estado basadas en ADN desnudo o en proteínas
recombinantes. En este último caso combinadas con varios adyuvantes.
Luego de numerosas pruebas, nos hemos concentrado en un candidato
vacunal compuesto por una proteína de fusión recombinante que contiene
dominios del VEGF humano, junto a potentes adyuvantes. Hemos
demostrado que este candidato vacunal previene el crecimiento tumoral,
aumenta la sobrevida de los animales portadores de tumores, así como
controla la metástasis en un sistema de modelo animal (ratones C57Bl/6 y
tumores transplantables; ver Figura 1 para el efecto en metástasis LLC y
Figura 2 para el tumor MB16-F10). Los
animales desarrollan anticuerpos anti VEGF
capaces de neutralizar la molécula e inducir
efectos anti-angiogénicos en tumores. Hay
también una cierta contribución de una Fig. 1
respuesta inmune mediada por células en el
efecto antitumoral total. Tenemos al menos cuatro formulaciones
con adyuvantes diferentes que producen efectos antitumorales
Dr. Jorge Gavilondo
Líder del Proyecto
Fig. 2
similares en el modelo animal. Los animales libres de tumor rechazan segundos y terceros
desafíos con tumor. Un segundo candidato vacunal, donde aparecen dominios del receptor 2
de VEGF se encuentra en desarrollo en la fase experimental.
Publicación
Bequet-Romero M, Ayala M, Acevedo BE, Rodriguez EG, Ocejo OL, Torrens I, Gavilondo JV.
Prophylactic naked DNA vaccination with the human vascular endothelial growth factor
induces an anti-tumor response in C57Bl/6 mice. Angiogenesis. 2007;10(1):23-34.
Projecto Anticuerpos recombinantes contra el Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular
(VEGF)
Descripción
Dr. Jorge Gavilondo
Entre los componentes de la plataforma tecnológica
Líder del Proyecto
relacionada con ingeniería genética de anticuerpos,
desarrollada en nuestro grupo durante los últimos años,
hemos producido bibliotecas de anticuerpos humanos
expuestos en fagos filamentosos. A partir de una
biblioteca de scFv humanos se obtuvo un sitio de unión
de anticuerpo específico para el Factor de Crecimiento
del Endotelio Vascular (VEGF). Este sitio de unión se produjo en bacteria como un scFv (lado
izquierdo de la Figura) y como una molécula tipo anticuerpo (scFv unida a un Fc de IgG
humana; lado derecho de la Figura) tanto en bacteria como en células de mamíferos. El
fragmento y las moléculas tipo anticuerpo mostraron reconocimiento específico de la molécula
de VEGF humano, así como una actividad, neutralizante y dependiente de dosis de la función
estimuladora del VEGF sobre Células Endoteliales del Cordón Umbilical Humano (HuVEC).
También se evidenció que estas moléculas afectan la angiogénesis inducida en modelos
animales. El sitio reconocido en la
molécula de VEGF humano por el sitio
de unión de anticuerpo es novedoso.
Se encuentran en curso estudios para la
aplicación de las moléculas obtenidas
en enfermedades basadas en un
exceso de angiogénesis, tales como el
cáncer y la degeneración macular
asociada a la edad.
Publicación
Rojas G, Lamdan H, Padron S, Munoz Y, Ayala M, Gavilondo JV. Efficient construction of a
highly useful phage-displayed human antibody repertoire. Biochem Biophys Res Commun.
2005 Nov 4;336(4):1207-13.
Proyecto: Identificación de blancos celulares de inhibición del VIH
Dra. Celia Fernández
Líder del Proyecto
Descripción
La reconstitución inmunológica del sistema inmune resulta
esencial en el desarrollo de estrategias terapéuticas para el
control clínico eficaz de pacientes de diferentes patologías.
El Extracto Dializable de Leucocitos (EDL) es un material
dializable de bajo peso molecular proveniente de la ruptura de leucocitos humanos periféricos,
compuesto por un amplio número de entidades moleculares, siendo el Factor de
Transferencia (FT) la entidad responsable de transferir hipersensibilidad retardada específica
de antígeno. El EDL ha sido muy usado en el tratamiento de infecciones virales, bacterianas,
parasitarias y micóticas, así como en inmunodeficiencias, neoplasias, alergias y desórdenes
autoinmunes. Desde hace algunos años se ha reportado el uso del EDL en individuos
infectados con el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). En ensayo clínico realizado en
nuestro país utilizando nuestra preparación de EDL se evidenció un retardo significativo en la
aparición de los síntomas de la enfermedad en individuos VIH seropositivos asintomáticos con
respecto a los individuos no tratados.
La rápida expansión del VIH en el mundo, hace imperiosa la búsqueda de fármacos efectivos
en el tratamiento y prevención del SIDA y las enfermedades relacionadas. Es evidente una
mejoría en la función del sistema inmune en la mayoría de los pacientes que reciben la
llamada terapia antirretroviral altamente activa (HAART), sin embargo, parece improbable la
normalización del sistema inmune y la total eliminación del virus, por lo que se requiere un
incremento de la respuesta inmune del individuo tanto específica como inespecífica.
El tratamiento HAART implica además posible toxicidad así como, la aparición de cepas
virales resistentes al tratamiento. Otra de las dificultades de la terapia se relaciona con los
altos costos del tratamiento y con la escasez de recursos que hay en muchos de los países
que presentan las mayores tasas de infección. Las desventajas asociadas con HAART han
dado lugar a la búsqueda de otros agentes terapéuticos para el tratamiento del VIH.
Investigaciones recientes exploran las vías de inhibir la replicación del VIH-1 utilizando como
blanco factores celulares de los cuales depende la replicación del virus incluidas moléculas
receptoras y co-receptoras, factores de transcripción y factores de ensamblaje. La
identificación de factores celulares que inhiban el ciclo replicativo viral es uno de los objetivos
más importantes en las investigaciones relacionadas con terapias anti VIH y se plantea que
una estrategia terapéutica que los aproveche tendría múltiples ventajas. Recientemente, una
nueva estrategia ha propuesto combinar una droga que inhiba directamente la producción de
virus con otra que inhiba indirectamente la producción viral a través de la reducción de la
proliferación celular.
Este proyecto ha encaminado sus investigaciones a dilucidar el efecto del EDL sobre la
replicación del virus y los mecanismos del hospedero que influyen en el proceso
inmunopatogénico del VIH. Utilizando un sistema de estudio in vitro en la línea celular humana
MT4 pudimos demostrar un efecto inhibitorio dosis dependiente de la replicación del VIH en
células tratadas con EDL antes y después del reto viral durante 24 horas o más (Figura 1).
A
B
100
% de inhibición (RT)
% de inhibición (p24)
100
80
60
40
20
0
80
60
40
20
0
0,15
0,3
0,6
1,25
2,5
0,15
EDL (U/m L)
0,3
0,6
1,25
2,5
EDL (U/m L)
Fig. 1: Efecto del EDL sobre la replicación in vitro del VIH
El EDL, además, reduce in vitro la producción de TNFα inducida por LPS y la actividad de los
factores de transcripción NFκB y Sp1, necesarios para la expresión del genoma viral (Figura
2). Otros factores celulares (MIP-1α, TNFβ) implicados en la replicación del VIH son también
modulados por el EDL o la fracción activa derivada del mismo.
Controles 0h
1 2 3 4
-
3h
-
1.2 2.5
3d
-
1.2 2.5
-
7d
Tiempo
1.2 2.5
EDL
Complejo Proteína -ADN →
Oligonucleótido libre →
Fig. 2: Efecto inhibidor del EDL sobre la actividad de enlace del factor de transcripción NFkB
En busca de factores endógenos que participen en el proceso inmunopatogénico no
conocidos hasta el momento el proyecto desarrolló un estudio de proteómica comparativa e
identificó un número importante de proteínas. En estos momentos la prioridad es conocer la
relación que guardan dichas proteínas con el proceso de infección. Para la demostración de
función de las mismas se utiliza la tecnología de RNA de interferencia.
Publicaciones
1. Rivero J, Miró A, Rosario M y P López-Saura (1995). Efecto del INF-alpha o del factor
de Transferencia en la supervivencia de individuos asintomáticos infectados por el VIH.
Biotecnología Aplicada 12 (3): 161-162.
2. Fernández-Ortega C, Dubed M, Ruibal O, Menéndez de San Pedro JC, Navea L, Ojeda
M, Araña MJ (1996). Inhibition of in vitro HIV infection by Dialyzable Leukocyte Extracts.
Biotherapy 9: 33-40.
3. Fernández-Ortega C, Dubed M, Ramos Y, Navea L, Álvarez G, Lobaina L, López L,
Casillas D, Rodríguez L (2004). Non-induced leukocyte extract reduces HIV replication
and TNF secretion. Biochemical and Biophysical Research Communications 325:
1075-1081.
4. Ojeda M, Fernández-Ortega C, Araña M (1996). Dializable leukocyte extract (DLE)
reduces lipopolisaccharide- induced tumor necrosis factor secretion in human
leukocytes. Biotherapy 9: 163-170.
5. Fernández-Ortega C, Araña M, Ojeda M, Dubed M, Ruibal I, Vilarrubia OL, Menéndez
de San Pedro JC, Navea L (1997). Identificación de nuevas funciones biológicas del
Extracto Dializable Leucocitario de impacto en la terapéutica de enfermedades
infecciosas e inflamatorias. Biotecnología Aplicada 14(3): 201-203.
6. Ojeda M, Fernández C, Araña M (2000). Dializable leukocyte extract suppresses the
activity of essential transcription factors for HIV-1 gene expression in unstimulated MT4
cells. Biochem Biophys Res Commun, 273: 1099-1103.
Obtención de la primera línea cubana de Ratones Transgénicos Modelo de Estudio de la
Enfermedad Genética Ataxia Espinocerebelosa tipo 2 (SCA2)
Descripción
Las Ataxias Espinocerebelosas dominantes (SCA) son un grupo
de
enfermedades
neurodegenerativas
que
afectan
fundamentalmente las neuronas de Purkinje del cerebelo. La
Ataxia Espinocerebelosa tipo 2 (SCA2) es una enfermedad
genética autosómica dominante, se caracteriza por ataxia de la
marcha, dificultades en el habla, anormal comportamiento de los reflejos y movimientos lentos
y limitados de los ojos, entre otros síntomas clínicos.
Molecularmente, la aparición de los síntomas de la enfermedad se produce cuando el alelo
patogénico presenta 32 o más repeticiones de CAG dentro de las secuencias del exón 1 del
gen SCA2, considerándosele a estas repeticiones como expansiones. El comienzo de los
síntomas de la enfermedad es inversamente proporcional a la longitud de la expansión. La
enfermedad es progresiva con una duración de 10 a 20 años.
Los índices de prevalencia de esta enfermedad hereditaria en las diferentes poblaciones
mundiales son de 5 enfermos por cada 100 000 habitantes. En la provincia de Holguín, Cuba,
la prevalencia de este desorden genético es de 44 por cada 100 000 habitantes, e inclusive,
en algunos municipios holguineros la prevalencia sobrepasa a los 500 por cada 100 000
habitantes. Buscarle una solución a esta deficiencia genética constituye por tanto una tarea de
máxima prioridad para la Salud Pública cubana.
El objetivo de este trabajo es la generación de un ratón transgénico como modelo animal de la
enfermedad SCA2 para utilizarlo en futuros estudios sobre la neuropatología, y las
Dr. Jorge Aguiar
Líder del Tema
posibilidades de diferentes candidatos terapéuticos para atenuar o eliminar los síntomas
clínicos de este devastador desorden genético. El ratón transgénico descrito anteriormente en
la literatura, utiliza un promotor específico que permite sólo la expresión del transgen en las
células de Purkinje, situación que no se presenta exactamente así en los pacientes de la
enfermedad SCA2. Los animales transgénicos fueron obtenidos mediante los métodos
descritos previamente (Castro FO, Aguilar A (1989). Microinjection, culture, and transfer of
one cell mouse embryos. I- Obtention of one cell embryos and its culture. Interferón y
Biotecnología 6: 65-70, Castro FO, Aguilar A (1989). Microinjection, culture and transfer of one
cell mouse embryos. II-Microinjection, culture and transfer of one cell mouse embryos (in
Spanish). Interferón y Biotecnología 6: 172-174, Castro FO, Aguilar A (1992). Effect of the
number of transferred embryos microinjected or non-manipulated on the pregnancy rate and
litter size in B6D2F1 mice. Theriogenology 36:105). La raza de ratones empleada fue el
híbrido B6D2F1 x OF1, obtenido en nuestro laboratorio. Los parentales B6D2F1 y OF1 fueron
obtenidos a partir de la colonia existente en el Centro Nacional de Producción de Animales de
Laboratorio de Cuba (CENPALAB).
Los resultados obtenidos demuestran la expresión ubicua del transgen que porta el ADNc
completo del gen SCA2 con una mutación de 75 CAG fusionado a las secuencias regulatorias
del propio promotor de este gen humano (figuras 1 y 2). La descoordinación motora de los
ratones transgénicos comparada con los ratones controles (figuras 3-4), demostró la
ocurrencia en nuestro modelo de estudio de la principal deficiencia fenotípica observada en
los pacientes de este desorden hereditario. La degeneración específica de las neuronas de
Purkinje del cerebelo del ratón y la expresión mayoritaria del transgen en el cerebro, hígado y
músculo esquelético comparada con la pobre expresión en riñones y pulmones, reproduce el
patrón de expresión de este gen en los humanos (figura 5).
Fig.1: Southern blot realizado para demostrar la integración del transgen humano
en los ratones y para determinar el número de copias. El ADN fue digerido con las
enzima de restricción Kpn I. Carril 1- Fragmento KpnI del plásmido 775 (0.01 ng)
de talla 4.5 Kb. Carril 2- Ratón control no transgénico. Carril 3-F1/10. Carril 4F1/14. Carril 5-F2/5. Carril 6-F2/6. Carril 7-F2/13.
Fig.2: Northern blot y Western blot para
determinar la expresión del transgen humano
en diferentes tejidos del ratón transgénico. (A)
Cerebelo: Carril 1- Homocigótico. Carril 2Heterocigótico. Carril 3- Ratón control no
transgénico. (B) Otros tejidos: Carriles 2, 4, 6,
7 y 8- Cerebro, hígado, músculo esquelético,
pulmón y riñón de ratones transgénicos
heterocigóticos. Carriles 1, 3 y 5- Cerebro,
hígado y músculo esquelético de ratón control
no transgénico. La talla esperada del transgen
humano (3.9 Kb) y la del gen de la β-Actina de
ratón (1.8 Kb) están indicadas. (C) Western
blot para determinar la expresión del transgen
a nivel de proteína en cerebelo. Carril 1- Anticuerpo monoclonal de 150 KD usado como patrón de peso
molecular. 2- Cerebelo de ratón control no transgénico. 3- Cerebelo de ratón transgénico. La talla esperada de la
Ataxina 2 humana (190 KD) y la de ratón (140 KD) están indicadas.
Fig.3: Evaluación de la conducta motora en el Rotarod. (A) 6 semanas de edad. (B) 12 semanas de edad
Fig.4: Análisis de la evaluación de la marcha. (A) Ratón control no transgénico (WT). (B) Ratón transgénico
(F066). El largo de los pasos (C) y el movimiento rectilíneo (D) fueron cuantificados. La significación estadística
(p<0.001, t-test) está indicada con asteriscos.
Fig.6: Inmunohistoquímica utilizando anticuerpos anti-Calbindina 28K sobre láminas de cerebelo de ratones
transgénicos y controles no transgénicos. (A) Ratón control no transgénico. (B y C) Ratones transgénicos. Las
flechas de cabeza grande señalan las neuronas de Purkinje, y las flechas más largas y finas señalan las
arborizaciones dendríticas de las células de Purkinje.
Publicaciones representativas
1. Aguiar J, Vázquez M, Fernández J, Mendoza Y, Auburger G. Cloning and sequence of the
5’ region from human spinocerebellar ataxia 2 gene. BA. 1999 jul-sep; 16(3):165-168.
2. Aguiar J, Santurlidis S, Nowok J, Alexander C, Rudnicki D, Gispert S, Schulz W, Auburger
G. Identification of the physiological promoter for spinocerebellar ataxia 2 gene reveals a
CpG island for promoter activity situated into the exon 1 of this gene and provides data
about the origin of the nonmethylated state of these types of islands. Biochem Biophys
Res Commun. 1999 Jan 19;254(2):315-8.
3. Aguiar J, Fernandez J, Aguilar A, Mendoza Y, Vazquez M, Suarez J, Berlanga J, Cruz S,
Guillen G, Herrera L, Velazquez L, Santos N, Merino N. Ubiquitous expression of human
SCA2 gene under the regulation of the SCA2 self promoter cause specific Purkinje cell
degeneration in transgenic mice. Neurosci Lett. 2006 Jan 16;392(3):202-6.
4. Aguiar J, Fernández J, Aguilar A, Mendoza Y, Vázquez M, Suárez J, Berlanga J, Cruz S,
Guillén G, Herrera L, Velázquez L, Santos N, Merino N. Characterization of a new
transgenic mouse model of the Spinocerebellar Ataxia type 2 disease. BA. 2006 ene-mar;
23(1):54-9.