Electroforesis: Fundamentos y aplicaciones. Allan Urbizo Laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología –LENAP – Instituto de Investigación de Enfermedades Genéticas y Metabólicas –INVEGEMEscuela de Biología Universidad de San Carlos de Guatemala Introducción • Método Analítico: visualización. Separación y • Acidos nucléicos (ADN, ARN), proteínas y otras biomoléculas. • Determinación: Peso molecular, punto isoeléctrico y No. de cadenas polipeptídicas de una proteína. • Migración: Carga neta, peso molecular y estructura tridimensional. Fundamento • V = qE /f • Densidad de carga de la molécula • Voltaje aplicado • Exceso: Sobrecalentamiento • Bajo: Pobre separación. • Porosidad del gel. Fundamento • Biomacromoléculas: Carga eléctrica con grupos aniónicos y catiónicos capaces de disociarse. • Carga neta: pH del medio. • Interacción con pequeñas moléculas de iones u otras macromoléculas. • pH influye sobre la velocidad de migración. • Punto isoeléctrico: No hay migración. Fundamento • Los soportes utilizados • Polímeros • Gel poroso • Restringe el movimiento de las moléculas • Disminuyen los flujos de convección del solvente. • Utilizados: Celulosa, almidón, poliacrilamida, agarosa, acetato de celulosa Equipo • Fuente de poder • Cubeta (vertical/horizontal) • 2 electrodos • Buffer (Solución tampón) • Soporte (Agarosa/Poliacrilamida) • Muestra/Loading dye • Marcador Molecular • Bromuro de Etidio Geles de Agarosa • Polisacárido • Extraído de algas marinas • 0.5 - 2% • Preparación sencilla y reproducible • No tóxico • Amplio rango de separación • Utilizado para ADN Preparación • Agarosa (%) • Buffer TBE • Calentar hasta disolver (microondas o estufa de laboratorio). • Enfriar hasta 50ºC • Bromuro de Etidio • Verter en el soporte • Polimerización 30 min Gel: Poliacrilamida • Separación electroforética • pH • Fuerza iónica • Gradiente de potencial • Tiempo de corrida • Concentración: acrilamida/bisacrilamida Gracias…. Preguntas?