Subido por Fabricio Castillo Avilez

Electroforesis en geles de poliacrilamida

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Electroforesis en geles de poliacrilamida
Integrantes:
Kevin Aguirre
Cristina Cajas
Cinthya Jiménez
Tatiana Lara
Jairo Quimbita
OBJETIVOS:
• Manipular adecuadamente los reactivos, materiales y equipos de
laboratorio para la preparación de soluciones, que permitan realizar un
corrimiento electroforético en geles de poliacrilamida.
• Determinar el funcionamiento de los reactivos empleados durante el
proceso de electroforesis.
• Preparar geles de poliacrilamida que intervienen en el proceso de
electroforesis discontinua, y describir su utilidad dentro del mismo.
• Realizar una corrida electroforética y determinar la existencia de proteínas
separadas en el gel.
Poliacrilamida
La poliacrilamida es
un polímero
entrecruzado que
forma geles
porosos.
En la electroforesis,
forma la matriz del
gel y provoca el
retardo
dependiente del
tamaño que marca
la separación.
La acrilamida forma
polímeros lineales
y la bisacrilamida
introduce uniones
cruzadas
Es un soporte
empleado para
evitar
perturbaciones
mecánicas
Forma geles que
permiten buena
visualización de las
bandas durante
tiempo
prolongado.
Es químicamente
inerte, de
propiedades
uniformes, capaz
de ser preparado
de forma rápida y
reproducible.
Tiene la ventaja de
que variando la
concentración de
polímeros, se
puede modificar de
manera controlada
el tamaño del poro.
Electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE)
Proteínas y pequeñas moléculas
de RNA
PAGE: Proteínas
nativas o
desnaturalizadas
SDS-PAGE: Para
separar proteínas
desnaturalizadas
Técnica popular
para separar
proteínas
Resolución,
facilidad de uso y
flexibilidad
Estos geles han reemplazado a los de
almidón por:
• Efecto como tamiz molecular
• Proporcionan el control del tamaño
de sus poros
• Presentan adsorción despreciable
del material proteico
Uso adecuado de poliacrilamida
Trabajar bajo vitrina extractora.
No inhalar la sustancia.
Evítese la generación de vapores/aerosoles.
Protección preventiva de la piel.
En el caso de no poder sustituir la forma sólida
del producto en el proceso de pesada y
dilución, usar mascara para polvo de tipo 3.
GEL DE POLIACRILAMIDA VS GEL DE AGAROSA
Agarosa+poliacrilamida: se consigue una porosidad
intermedia.
SEMEJANZAS
Reutilizable
Gran poder de
resolución
El espécimen se
puede añadir a
cualquier zona del
medio de soporte
Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-agar). Se
disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad.
Diferencias
mezclas complejas de proteínas.
En agarosa se puede hacer
concentraciones de 1/2 a 2
por ciento de agarosa en
una solución tampón.
Gel de agarosa puede
separar fragmentos de ADN
de 200 a 50.000 pares de
bases.
Poliacrilamida pueden hacer en las
concentraciones de 3,5 a 20 por ciento.
La gama de gel de acrilamida es mucho
más pequeño, menos de 500 pares de
bases.
La acrilamida es mejor para la separación
de proteínas, ya que la resolución es mejor
para el gel de agarosa. También se puede
utilizar para separar el ADN que difiere
únicamente por un solo par de bases.
Una ventaja importante
de los geles de
poliacrilamida es que
son químicamente
inertes, transparentes y
estables en un amplio
rango de pHs,
temperatura y fuerza
iónica.
Condiciones necesarias para una corrida electroforética
en geles de poliacrilamida
• +Voltaje: Excesivo calor
• -Voltaje: Pobre separación
• Corridas cortas: Impiden
que las muestras avancen
el espacio necesario para
su separación.
Voltaje
Cantidad de
catalizador
Tiempo de
corrida
Pureza de los
reactivos
• +catalizador:
Polimerización rápida
 deformar las bandas.
• -catalizador: Superficie del
gel desigual
 romperse con facilidad.
• Empleo de reactivos de
alta calidad “grado
molecular” y agua des
ionizada para hacer geles
de alta resolución.
Formación del gel de poliacrilamida
Polimerización de
acrilamida por
acción de un
agente
entrecruzador, bisacrilamida.
Formación de
radicales libres en
el medio
Catalizadores:
- ión persulfato
(S2O8-)
 persulfato
amónico.
- TEMED
Desgasificación
 Gel
reproducible
Se detiene cuando
desaparecen los
radicales libres del
medio
Velocidad: concentraciones de ión
persulfato y TEMED.
Porosidad: poliacrilamida y bis-acrilamida.
%Acril/Bis-acrilamida: rango de separación
del gel.
Menor porcentaje
=
mejor separación de
proteínas grandes.
Clasificación PAGE
(Electroforesis den geles de poliacrilamida)
Función del estado
de las proteínas
Electroforesis desnaturalizante
Las proteínas se someten a migración
 proporcional carga y tamaño
molecular.
SDS
Electroforesis nativa
Migración sin desnaturalización
 en función de la carga, tamaño y
forma.
Tris-Glicina (pH=8,3-9,5)
Tris-borato (pH=7,0-8,5)
Tris-acetato (pH=7,2-8,5)
Metodología
Resolving Stacking
Gel
Gel
H2O
30%
acril:bisacr
1.5 M Tris
pH 8.8
10% SDS
10% APS
TEMED
10 ml
3.3
5 ml
3.4
4
830 ul
2.5
630 ul
0.1
0.1
4 ul
Para 2
geles
50 ul
50 ul
5 ul
Para 2 geles
Preparación del BIS-Acril AL 30%
𝑉1 : 𝑥
𝐶1 : 40% de bis−acril
𝐶2 : 30% de bis−acril
𝑉2 : 10𝑚𝐿
Para SDS al 10% se tiene:
10𝑔 → 100 𝑚𝐿
𝑥 → 1 𝑚𝐿
𝑥=
10𝑔×1𝑚𝐿
100𝑚𝐿
= 0,1𝑔 en 1mL
• CIVI=C2V2
• 40VI=30x10
• VI=7.5ml
• Agua= 2.5 ml
Para APS al 10% se tiene:
10𝑔 → 100 𝑚𝐿
𝑥 → 1 𝑚𝐿
10𝑔×1𝑚𝐿
𝑥 = 100𝑚𝐿 = 0,1𝑔 en 1mL
Reactivos para electroforesis
Tris-HCl
- Buffer
- Alcalinidad
SDS
- Desnaturalizante
- Detergente
APS
- Catalizador
- Radical
TEMED
- Catalizador
- Tasa de
polimerización
MONTAJE DEL GEL
Buffer de carga:
• Sacarosa: Peso a la muestra
para que precipite al fondo
de los pozos.
Para la muestra
• El azul de bromofenol:
Comprobar el progreso de
la electroforesis. Marca el
"frente de avance".
• SDS para desnaturalizar y cubrir
a las proteínas de una carga
uniformemente negativa
• Mercaptoetanol para reducir
los puentes disulfuro
SDS
CORRIDA ELECTROFORÉTICA
Buffer de Electroforesis
• Tris: mantiene el pH
• Glicina: conductor
electricidad
• SDS: mantiene las proteínas
cargadas negativamente
Cubrir el tanque con la tapa y
conectar los cables de los electrodos
en la fuente de poder
Tiempo: 1 hora y
media aprox.
1. Glicina carga - en el Tampón de
electroforesis a pH 8,8.
2. Campo eléctrico Gly, en Stacking Gel,
se aleja del electrodo negativo.
3. La Gly pierde carga a pH 6,8 y
ralentiza su movimiento. Los iones de
cloruro avanzan por delante de la
Gly.
4. Aumento de la resistencia, obliga a
las proteínas a alejarse, de forma
apilada
CORRIDA ELECTROFORÉTICA
“Frente de avance“: de azul de
bromofenol alcanza la parte
inferior del gel, se desconecta
la fuente.
Se retiran los electrodos
Se sacan los geles de
acrilamida, separando los
cristales con una espátula.
COLORACIÓN Y VISUALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS USANDO AZUL
BRILLANTE DE COOMASIE
Solución Colorante
Se deja el gel en
agitación suave.
Azul de Coomassie
Penetre y se fije a las
proteínas.
• Colorante: 24horas
• Decolorante: 7 días
Decolorante
Atracción
electrostática
ácido sulfónico:
tautómero menos estable
del ácido sulfuroso
Proteínas
RESULTADOS
ESPERADOS
OBTENIDOS
DISCUSIÓN
DESTINCIÓN
• La solución de destinción fue mal
elaborada.
• La solución de destinción tenía
mucho tiempo de elaboración.
DISCUSIÓN
BANDAS
.
• El voltaje que se aplica en los geles de
agarosa depende de la resolución
requerida y del tamaño de los
fragmentos a separar.
• Si se cambia el voltaje, los fragmentos
cambian su movilidad electroforética,
sin que ésta guarde relación con su
tamaño.
DISCUSIÓN
BANDAS
.
• Pocillos de poliacrilamida mal polimerizado.
Mala homogeneización del APS y el TEMED en
la solución de poliacrilamida.
• La muestra no cayó de forma eficiente y se
difundió con el baffer de electroforesis en el
momento en que fue depositado en el
pocillo.
CONCLUSIONES
• La correcta manipulación de reactivos, materiales y equipos dentro del laboratorio
permitieron realizar un corrimiento electroforético en geles de poliacrilamida.
• Se determinó el papel que cumple cada uno de los reactivos empleados durante el
proceso de electroforesis.
• Los pasos a seguir para la preparación de geles de poliacrilamida que intervienen en el
proceso de electroforesis discontinua fueron descritos minuciosamente, así como su
utilidad dentro del mismo.
• La manipulación del gel bajo condiciones cambiantes no permitió que se pueda
determinar la existencia de proteínas separadas en el gel tras el proceso de electroforesis
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