universidad austral de chile facultad de ciencias veterinarias

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
INSTITUTO DE MEDICINA PREVENTIVA VETERINARIA
EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE TRES TÉCNICAS DE ELISA Y UN PCR
PARA DIAGNOSTICAR LA INFECCIÓN POR VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA
Memoria de Título presentada como parte
de los requisitos para optar al TÍTULO DE
MÉDICO VETERINARIO.
CARLOS LUIS RAMÓN MUÑOZ TRONCOSO
VALDIVIA – CHILE
2010
PROFESOR PATROCINANTE
Dr. Gustavo Monti
Nombre
PROFESOR COLABORADOR
Firma
Dr. Gerardo Acosta Jamett
Nombre
PROFESORES CALIFICADORES
Firma
Dra. Isabel Aguirre Gil
Nombre
Firma
Dr. Fernando Wittwer Menge
Nombre
FECHA DE APROBACIÓN:
07 de Abril de 2010
Firma
ÍNDICE
Capítulo
Página
1.
RESUMEN
1
2.
SUMMARY
2
3.
INTRODUCCIÓN
3
4.
MATERIAL Y MÉTODOS
11
5.
RESULTADOS
15
6.
DISCUSIÓN
24
7.
BIBLIOGRAFÍA
30
8.
ANEXOS
34
1
1. RESUMEN
El objetivo de este estudio fue evaluar 4 pruebas para el diagnóstico de la Leucosis
viral bovina: Enzime-Linked InmunoSorbent Assay (ELISA) indirecto IDEXX-Bommeli
(IDBOM), ELISA de competencia INGENASA (INGE), ELISA para leche IDEXXPourquier (IDPOUQ) y Reacción de polimerasa en cadena (PCR).
Para ello, se muestrearon sobre 300 vacas de 72 predios, provenientes de la décima
región de los Lagos. De cada una de ellas se obtuvieron muestras de leche, sangre y suero, las
cuales fueron refrigeradas, transportadas y posteriormente almacenadas a -20° C hasta su
procesamiento y análisis.
La evaluación de las pruebas se realizó, utilizando 3 tipos de referencias:
Inmunodifusión en gel de agar (ID), Reacción de polimerasa en cadena (PCR) y una
combinación de los resultados de estas dos pruebas. Utilizando cada combinación se estimó;
sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo, razón de verosimilitud
positiva y negativa, Valor de J de Youden e índice kappa. Adicionalmente a esto se evaluó el
punto de corte y el área bajo la curva para las tres pruebas de ELISA y se determinó si estas
diferencias eran significativas entre las distintas pruebas evaluadas.
Los resultados indican que existe una gran concordancia entre las pruebas de ELISA e
ID, siendo ELISA INGE la que obtiene el índice kappa más elevado (0,8) y PCR el más bajo
(0,45). Además se determinó que no existen diferencias significativas entre los tres ELISA
estudiados. La evaluación de los puntos de corte, demuestran que los ELISA serían pruebas
con una gran utilidad diagnóstica (rango 0,84 a 0,94) y que los puntos de cortes recomendados
por los fabricantes se encuentran muy cerca a los óptimos estimados para la región.
Basándonos en la prueba de McNemar, se determinó que existen diferencias significativas
entre las proporciones de todas las pruebas evaluadas (P< 0,05), a excepción de PCR con los 3
ELISA que contempla este estudio.
En base a las estimaciones evaluadas, se concluye, que sin importar el tipo de ELISA
que se trate, todas ellas guardan una gran similitud, por lo cual podrían ser aplicadas como
métodos alternativos a inmunodifusión dentro de programas de control y erradicación del virus
de la Leucosis bovina. El uso de métodos directos, se recomendaría para confirmar o descartar
individuos falsos positivos.
Palabras claves: Leucosis, diagnóstico, Inmunodifusión, PCR, ELISA
2
2. SUMMARY
PERFORMANCE EVALUATION OF THREE ELISA AND A PCR TECHNIQUE FOR
DIAGNOSING BOVINE LEUKOSIS VIRUS
The aim of this study was to evaluate 4 diagnostic tests for detecting bovine leukosis
virus infection: indirect IDEXX-Bommeli ELISA (IDBOM), competition INGENASA ELISA
(INGE), milk IDEXX-Pourquier ELISA (IDPOUQ) and a Polimerase chain reaction (PCR).
Over three hundred samples from cows of 72 herds were obtained, and located in the
tenth region of Los Lagos. Blood, serum and milk samples from each cow were taken,
transported in cold and stored at -20° C until processed and analyzed in the lab.
For the evaluation of diagnostic performance, 3 different references: Agar gel
immunodifussion (AGID), Polimerase chain reaction (PCR) and a combination of both tests
was used. In each evaluation: sensitivity, specificity, positive and negative predictive value,
likelihood ratios, Youden's and kappa index were estimated. The optimal cut off point and the
area under the curve for the 3 ELISAs were estimated. Finally we evaluated if there was a
significant difference between the tests.
The results showed a good agreement between ELISA tests and AGID, the higher
kappa index (0,8) was estimated for ELISA INGE and for PCR was the lowest (0,45). There is
no significant difference between the 3 ELISAs. The area under the curve, for all ELISA's test
suggested a high diagnostic performance (range 0,84 to 0,94) and the cut off points suggested
by the manufactures, were very similar with those estimated in this study. McNemar's test
indicates a significant difference between the tests under evaluation, except for PCR with all 3
ELISA tests in this study.
From the results, we concluded, that no matter which ELISA test we prefer, all are very
similar and well-performed; therefore we recommend them as alternative methods for
immunodiffusion in control and eradication programs of the bovine leukosis virus. The direct
methods are recommended for confirmation of false positive results from serological tests.
Key words: Leukosis, diagnosis, immunodifusion, PCR, ELISA
3
3. INTRODUCCION
3.1
ANTECEDENTES GENERALES
La leucosis enzoótica bovina es una neoplasia mortal, sistémica y maligna del sistema
reticuloendotelial de los bovinos, que se caracteriza por la aparición de acúmulos de linfocitos
neoplásicos en casi cualquier órgano, con una variedad correspondiente de signos clínicos
(Blood y Radostits 1992). Se presenta comúnmente en animales de entre 3 a 8 años de edad
(Lucas 1999), además de tener un gran impacto económico sobre el sector ganadero en
muchos países alrededor del mundo (Monti 2005).
En Chile, los primeros casos publicados aparecen en 1962, no significando con ello que
la enfermedad no haya existido con anterioridad a esta fecha, ya que diversos profesionales la
habrían diagnosticado en distintas zonas del país. En esta primera referencia escrita de la
enfermedad en Chile, se describen cuatro casos tumorales, tres en la zona de Talca y uno en
Los Ángeles. Con posterioridad, otros estudios, utilizando técnicas hematológicas a nivel de
predios, realizados en las provincias de Santiago (1965, 1971), Bío-Bío (1974), comuna de
Valdivia (1967) y comuna de Coihueco (Ñuble 1978), determinaron que más del 2% del
ganado lechero de estas zonas era positivo a la enfermedad (Wilhelm 1979). Un estudio
efectuado en 1984, en un total de 600 predios de la X Región, se detectó un 35% de rebaños
con animales reaccionantes a la prueba de Inmunodifusión en Agar, siendo el nivel de
infección en estos predios de un 13,3%. Por otra parte, sobre un total de 19.072 hembras
mayores de 30 meses de edad examinadas, se pesquisó un 4,9% de bovinos positivos a la
prueba. Un 65% de los predios fue negativo y un 23,3% tenía menos de un 10% de infección
(Chile 1992).
La infección es de lenta difusión y se presenta asociada a los sistemas de producción
lechera intensiva. Esto debido principalmente, a que las prácticas de manejos del ganado
lechero, su alta densidad animal y la permanencia prolongada de los animales en el rebaño dan
las mayores posibilidades de difusión del virus (Chile 1992).
La leucosis viral bovina no es patógena o infecciosa en condiciones naturales. Las
pérdidas económicas se relacionan a los tumores inducidos por el VLB (Schwartz y Lévy
1994) la producción promedio de leche de los animales con linfocitosis persistente es 3 a 10
% menor que el rebaño y puede llevar a temprano faenamiento (Schwartz y Lévy 1994 y Da y
col 1993) además de existir pérdidas asociadas a los expurgos en canales debido al
descubrimiento de tumores (Schwartz y Lévy 1994).
4
En los Estados Unidos se estimó que las pérdidas ocasionadas por VLB debido a
disminución en la producción y la cantidad de grasa de la leche, asociada a cuadros de
linfocitosis persistente, llego a 86 millones de dólares durante 1992 (Da y col 1993).
3.2 ETIOLOGIA Y CARACTERIZACION DEL AGENTE
El virus de la leucosis bovina (VLB) es un virus RNA perteneciente a la familia
Retroviridae. En 1969 fue identificado y clasificado en Estados Unidos por Miller y
colaboradores mediante cultivos in vitro. El genoma del retrovirus está compuesto de una
cadena simple RNA, el cual es convertido a DNA por medio de la enzima transcriptasa
reversa. Esto permite a muchos retrovirus integrarse al DNA de la células del huésped, lugar
en el cual persiste de por vida, produciendo transformaciones en las células. Este virus está
presente en una parte de la población de linfocitos B circulantes, en los cuales se integra la
información genética de este virus (Lucas 1999).
Este virus produce proliferación crónica de células B en bovinos y es un importante
modelo para el virus de la leucemia tipo 1 de células T en humanos, debido a que ambos
comparten muchas características moleculares y biológicas. Sin embargo la leucosis bovina no
es una zoonosis (Radostits y col 2000).
Sus genes constituyentes son gag, pol y env quienes codifican para las proteínas de la
cápside, para la transcriptasa reversa y para las glicoproteínas de envoltura respectivamente. El
gen gag es traducido en la proteína precursora Pr70 Gag que luego es procesada en tres
proteínas: la proteína de la matriz p15, la proteína de cápside p24 y la proteína de la
nucleocápside p12. El gen env posee la información para la proteína precursora Pr72 env, que
es cortada en el aparato de Golgi para dar origen a la glicoproteína gp51 de la superficie de la
envoltura y a la glicoproteína transmembranal gp30 (De Giuseppe y col 2004).
3.2 TRANSMISIÓN
3.2.1 Horizontal
La transmisión horizontal a través de vectores es la forma usual por el cual el virus se
disemina bajo condiciones naturales. Al parecer también el estrecho contacto e intercambio de
materiales biológicos contaminados pueden ser vías para que ocurra la transmisión. El virus
está mayormente presente en linfocitos B y puede ser hallado en sangre, leche y en masas
tumorales. Los bovinos pueden ser infectados por la exposición a linfocitos infectados y no
por virus fuera de células. Por lo tanto, cualquier medio por el cual se pueda transmitir
linfocitos infectados con VLB desde una vaca a otra, es un potencial medio de transmisión. La
transmisión natural ocurre comúnmente en animales mayores de 1,5 años, usualmente durante
los meses de verano debido al contacto entre animales y la infección facilitada por insectos o
murciélagos de linfocitos contaminados hacia la sangre del huésped (Radostits y col 2000).
5
La transmisión iatrogénica es una de las principales razones por las cual la prevalencia
de la infección es tan alta en algunos rebaños (Lucas 1999). Esto podría atribuirse al uso de
instrumental quirúrgicos con sangre contaminada con el virus, tales como guantes, pinzas de
tatuaje auricular y agujas hipodérmicas utilizadas en animales infectados y reutilizadas sin
desinfección en animales susceptibles (Radostits y col 2000).
3.2.2 Transmisión vertical
La transmisión congénita se presenta entre un 4 a 8% en terneros nacidos de vacas
seropositivas a VLB infectadas naturalmente con el virus. Estos valores son el resultado de la
exposición transplacentaria al virus durante la gestación. Terneros nacidos de vacas
seropositivas adquieren anticuerpos calostrales mediante la ingestión de calostro. Los niveles
de anticuerpos comienzan a declinar durante los primeros 6 a 7 meses de edad. (Radostits y
col 2000).
3.3 PATOGENIA
El virus establece una infección persistente en una subpoblación de linfocitos B
mediante la inclusión de DNA viral en el DNA celular del huésped. Las 4 situaciones posibles
después de la exposición de bovinos al VLB incluye:
•
•
•
•
Falla en la infección del animal, debido a resistencia genética
Establecimiento de infecciones permanentes y desarrollo de niveles detectables de
anticuerpos (Estos animales son portadores latentes de la infección)
Establecimiento de infecciones permanentes; el animal se convierte en seropositivo y
también desarrolla una linfocitosis persistente, un proceso linfoproliferativo benigno.
No corresponde a una etapa subclínica de linfosarcoma.
Infectado, animales seropositivos pueden o no atravesar etapas de linfocitosis
persistente y los cuales desarrollan tumores neoplásicos malignos – linfosarcoma
El animal se infecta o desarrolla alguna de las formas de la enfermedad dependiendo de
la constitución genética. La expresión puede también estar influenciada por el estatus
inmunológico del animal y el tamaño de la dosis viral infectante. Alrededor del 80 % de los
animales que presentaron estados avanzadas de la enfermedad muestran una marcada
depresión de inmunoglobulinas M (Radostits y col 2000).
La forma de presentación más común es la Leucosis Enzoótica Bovina; este cuadro se
caracteriza por la aparición de múltiples cuadros de linfosarcoma multicéntrico, con tumores
que se desarrollan rápidamente en muchos lugares, acompañados de una gran variación de
signos clínicos y síndromes. El período usual de incubación es de 4 a 5 años, y comúnmente se
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presenta 4 a 5 años después de la introducción del caso original o de alguna transfusión de
sangre de animales ajenos al rebaño. Esta forma de presentación rara vez la desarrollan
animales menores de 2 años, siendo más común en lotes de entre 4 a 8 años de edad. La
linfocitosis persistente sin signos clínicos ocurre tempranamente pero es infrecuente antes de
los 2 años de edad. En la mayoría de los casos, los bovinos se mantienen subclínicos a los
largo de su vida productiva sin ninguna reducción aparente en sus rendimientos. Los signos
clínicos y la duración de la enfermedad varían según el número y la importancia de los lugares
donde se desarrollan las masas tumorales (Radostits y col 2000).
3.4 CONTROL
Han sido pocos los intentos para desarrollar vacunas para prevenir VLB en bovinos.
Hasta la fecha, el único inmunógeno al parecer efectivo es la glicoproteína de superficie del
virus. Desafortunadamente este es el antígeno que se utiliza en las pruebas serológicas para
identificar bovinos infectados. Por lo tanto es poco probable que tal vacuna sea aceptada por
los países, que utilizan pruebas serológicas para el control y erradicación de VLB (Dinter y
Morein 1990).
Las medidas de control usualmente requieren el sacrificio del rebaño completo o del
individuo infectado y muchas veces sus crías. Debido a que tales prácticas son costosas, los
esfuerzos para reducir la diseminación de VLB se han enfocado en segregar animales
infectados de no infectados. Esta es una medida de control relativamente efectiva pero no es
usada extensamente, debido probablemente a la labor extra que requiere la mantención de dos
rebaños separados, especialmente cuando son vacas de lechería las segregadas. Para el caso de
ingresar animales al rebaño, es mucho mas practico obtener animales libres de VLB y
mantenerlos separados del rebaño infectado (Dinter y Morein 1990).
Con respecto al rol del Médico Veterinario en el control del VLB, la necesidad de
buenas prácticas de higiene tendientes a evitar la transferencia de sangre (u otros materiales
que puedan contener linfocitos) por ejemplo durante la vacunación o cuando se realizan
procedimientos quirúrgicos, deben ser implementadas para reducir el riesgo de la
diseminación del virus. A su vez el profesional debe educar a sus clientes respecto a estas
prácticas en el manejo diario del rebaño (Dinter y Morein 1990).
3.5 DIAGNÓSTICO
Un virus puede ser aislado fuera del huésped, usualmente desarrollado en medios de
cultivos celulares, en huevos embrionados o en animales antes de que puedan ser identificados
por varios métodos inmunológicos como causa de infección. El aislamiento e identificación en
cultivos celulares es el método ideal para la virología (Klintevall 1995).
7
Pero debido al tiempo y costo que ello significa, es que se han desarrollado distintas
técnicas diagnósticas a lo largo del tiempo tales como:
3.5.1 Diagnóstico hematológico
Rebaños con alta incidencia de linfosarcomas en adultos, pueden presentar muchos
animales clínicamente normales que presentan linfocitosis persistente. El desarrollo de
linfosarcoma es a menudo precedido por un período en el cual el animal cursa una linfocitosis
persistente, sin presentar signo alguno de enfermedad. Los métodos hematológicos de
diagnóstico fueron por muchos años la principal herramienta de diagnóstico por muchos años,
y muchas claves relacionando edad y recuento de linfocitos fueron desarrolladas (Bendixen,
Gottingen, entre otras), presentándose niveles máximos por los cuales un animal se declaraba
como con linfocitosis persistente (Lucas 1999).
El porcentaje de linfocitos B en bovinos normalmente fluctúa entre 18 a 28 %. En el
caso de los animales infectados con VLB y que presentan linfocitosis persistente pueden
aumentar tanto como un 70%. En animales clínicamente normales infectados con VLB sin
linfocitosis persistente, los linfocitos B se encuentran aumentados en un 40 a 50% (Lucas
1999)
3.5.2 Diagnóstico serológico
Las pruebas serológicas juegan un rol primordial en cuanto se refiere a la decisión
médica. Se utilizan para determinar la frecuencia de la enfermedad en un rebaño, identificar la
causa de la enfermedad y algunas veces elegir los animales que deben ser descartados (Smith
1991).
Las infecciones con VLB en bovinos son de por vida y producen como respuesta un
aumento persistente de anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser inicialmente detectados entre
3 a 16 semanas después de la infección (OIE 2004).
Los anticuerpos más fácilmente detectados, son aquellos dirigidos a los antígenos gp51
y p24 del virus. Muchas pruebas serológicas usadas rutinariamente, detectan anticuerpos para
la glicoproteína gp51, debido a su temprana aparición (OIE 2004).
3.5.2.1 Inmunodifusión en Gel de Agar (ID): Por al menos 30 años, el método tradicional
para la detección de anticuerpos anti VLB fue el método de Inmunodifusión en Gel Agar (ID),
el cual es reconocido como prueba oficial en muchos países (Choi y col 2002). Esta prueba
remplazo al diagnóstico hematológico rápidamente después de su desarrollo a mediados de los
años 70 (Simard y col 2000b) y se convirtió en el primer método serológico rutinario,
mediante la detección de anticuerpos contra las proteínas p15 y p24 del virus (Klintevall
1995).
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Como principio, cuando un anticuerpo es puesto en contacto con el antígeno
correspondiente, se forman complejos antígeno-anticuerpo que se insolubilizan en su mayor
parte, dando lugar a una reacción de precipitación (FAO 1988).
Empleando soportes adecuados, en especial aquellos que contienen como base Agar y
electrolitos, es posible que los antígenos y anticuerpos migren con diferentes velocidades, de
modo que al encontrarse entre ellos, interaccionen y precipiten. Los precipitados que se
originan, se visualizan como bandas, que permanecerán estables mientras un mayor flujo de
moléculas de alguno de los reactivos empleados no provoque su redisolución (FAO 1988).
Se utiliza normalmente el método de Oucherlony o de doble difusión. Consistente en
enfrentar las soluciones de antígeno y anticuerpo, en pequeñas perforaciones efectuadas en el
Agar. Al difundir y ponerse en contacto, producirán una banda de precipitación solo cuando se
encuentren en concentraciones optimas. Si la concentración es la adecuada, la banda de
precipitación estará situada aproximadamente en la distancia media que separa los reservorios.
Este sistema permite identificar las bandas de precipitación mediante la comparación de la
reacción simultanea de antígenos y anticuerpos conocidos (FAO 1988).
Se pueden observar tres tipos de reacciones:
•
Reacción de identidad: los dos sistemas difunden en una única banda de precipitación
•
Reacción de no identidad: cada sistema reacciona independientemente, originando
bandas de precipitación que se cruzan.
•
Reacción de identidad parcial: cuando uno de los antígenos tiene menos de un
componente y es capaz de dar una reacción cruzada con un anticuerpo elaborado contra un
antígeno elaborado contra un antígeno más simple. En cuyo caso las bandas de precipitación
de ambos sistemas se unen y funden parcialmente en una banda, apareciendo una prolongación
o espolón. Esto indica que en este antígeno hay componentes antígenos no compartidos (FAO
1988).
Esta prueba es simple y fácil de realizar, y ha demostrado ser altamente útil y eficiente
como esquema básico de erradicación (OIE 2004). Pueden ser utilizados para detectar
anticuerpos, usando los antígenos virales como p15, p24 y gp51 (Lucas 1999). La prueba que
utiliza el antígeno glicoproteico gp51 de la VLB, ha sido designada como más sensible en
relación a las pruebas que utilizan el antígeno p24 (Johnson y Kaneene 1991).
La ID fue crucial para los epidemiólogos debido a que demostró que la prevalencia de
anticuerpos a VLB era mayor a la sugerida por el diagnóstico clínico y hematológico (Johnson
y Kaneene 1991).
3.5.2.2 Enzime-Linked InmunoSorbent Assay (ELISA): Se basa en que el antígeno o
anticuerpo se inmoviliza en una superficie solida de soporte, la cual permite la fijación del
reactivo marcado que reaccionó y la elusión de aquel que no lo ha hecho. La degradación
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enzimática de un sustrato cromógeno produce un factor de amplificación que facilita la
detección sensible y precisa la presencia de la enzima fijada a la fase solida (FAO 1988).
La prueba se lee mediante un cambio de color en el sustrato y puede ser medido
cuantitativamente por diluciones seriadas de antígenos para obtener un punto definido o por
lecturas fotométricas del nivel de cambio de color, reflejo de la cantidad de anticuerpos
conjugados con enzimas en los pocillos (Fenner y col 1987).
Existen 2 tipos de pruebas de ELISA: para medición de antígenos (ELISA competitivo,
Sandwich y Sandwich indirecto o antiglobulina) y para medición de anticuerpos (ELISA
competitivo, indirecto y Anti-Ig M) (FAO 1988).
Las pruebas de ELISA han sido adaptadas para la detección de anticuerpos a VLB.
Esta prueba se puede utilizar tanto en leche así como muestras de suero u otros fluidos
(Lucas 1999) y ha demostrado ser particularmente útil para muestras con bajos títulos de
anticuerpos, como son muestras de leche o suero (De Giuseppe y col 2004).
La técnica de ELISA entrega resultados cuantitativos y tiene la ventaja de ser sensible,
altamente reproducible y consume menos tiempo que las pruebas convencionales de ID
(Nguyen y Maes 1993 y Johnson y col 1991).
3.5.2.3 Reacción de polimerasa en cadena (PCR): El método de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) para detectar provirus de VLB, ha sido descrito por varios investigadores
(OIE 2004) y consiste en la repetición de la síntesis de una parte seleccionada de una
molécula de ADN. El número de fragmentos sintetizados a partir de las muestras de ADN
aumentan linealmente con cada ciclo de multiplicación (Ballagi-Pordány 1995).
El PCR utiliza pequeños partidores de oligonucleótidos y la enzima termoestable DNA
polimerasa, como es Taq polimerasa, para amplificar un segmento blanco de DNA típicamente
de 100 a 1000 pares de bases de largo. El PCR en si, incluye 25 a 40 ciclos, consistiendo cada
uno en desnaturalización, preparación de partidores y etapa de extensión la que permite la
aplicación de varias temperaturas. Una de las etapas más importantes es la elección de los
partidores, estos deben cumplir dos requisitos: sensibilidad; capacidad de amplificar el DNA
blanco con alta eficiencia y especificidad; que reaccione solo el blanco deseado, es decir que
no tenga reacción cruzada con secuencias heterólogas similares (Ballagi-Pordány 1995).
La progresión a través de las etapas de los ciclos es controlado por un instrumento
llamado Termociclador, el cual controla la temperatura de la reacción. Después de la
amplificación, el producto PCR o Amplicon, es detectado por la electroforesis en gel o alguna
de las técnicas de hibridación, como es el blot. El análisis de sensibilidad del PCR puede ser
tan bajo como 1 a 10 copias de las secuencias blanco de DNA. Debido a la simplicidad y
variada aplicabilidad, el PCR se ha usado ampliamente en diagnóstico viral (Storch 2001).
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Los partidores han sido desarrollados para ajustarse a las regiones gag, pol y env del
genoma, observándose un éxito variable. PCR doble (anidado) seguido por electroforesis por
gel y staining es el método más rápido y sensible (OIE 2004).
Actualmente existe una amplia gama de métodos para diagnosticar el VLB. La
relevancia de la elección está dada principalmente por las distintas características y ventajas
que presentan cada uno, en comparación con el método oficial utilizado en Chile.
Para documentar la contribución al tema, se pretende analizar 3 métodos diagnósticos
disponibles mediante la utilización de distintos indicadores estadísticos. Así se determinará la
similitud que tienen entre sí y con ello presentar argumentos que permitan definir la
homologabilidad de estas pruebas. Finalmente se ampliara la gama de herramientas
disponibles para la detección de la enfermedad, aportando de esta forma al control de la
misma.
OBJETIVOS
El objetivo general de este estudio fue evaluar el desempeño de tres pruebas de ELISA
y PCR para la detección de la infección por el virus de la Leucosis Viral Bovina. Los objetivos
específicos fueron:
• Determinar sensibilidad y especificidad para cada método evaluado
• Determinar: valor predictivo positivo y negativo; razón de verosimilitud positiva y
negativa; Valor de J de Youden e índice de kappa.
• Comparar el punto de corte de las pruebas de ELISA sugerido por los fabricantes con
el óptimo obtenido por el método de la Curva Receptor Operador
• Determinar si existen diferencias significativas entre las pruebas evaluadas
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4. MATERIAL Y METODOS
4.1
MATERIALES
Para este estudio se muestrearon hembras bovinas, de distintas categorías, de 72
predios de la X Región de los Lagos, de los cuales se obtuvieron muestras de sangre entera,
suero y leche.
• Sangre y suero
En animales mayores de 1 año de edad, se realizó una punción en la arteria coccígea
mediante sistema Vacutainer. Las muestras de sangre entera, se almacenaron en tubos con
EDTA, y las de suero en envases sin aditivos. Tanto las muestras de sangre como las de suero
fueron conservadas en una nevera con hielo, hasta su arribo al laboratorio donde se congelaron
a -20°C hasta su procesamiento y análisis.
• Leche
Se obtuvo una muestra de leche de un cuarto de la ubre al azar, de cada hembra bovina
en lactancia, la cual se almacenó en tubos de ensayo tapados sin aditivos y se mantuvieron en
una nevera con hielo para su conservación, hasta su arribo al laboratorio donde se congelaron
a -20°C hasta su análisis.
4.1.2 Cálculo de tamaño muestral y selección de las muestras
El tamaño muestral mínimo necesario para validar las pruebas diagnósticas
individuales, con una sensibilidad o especificidad esperada del 90%, un nivel de confianza del
95% y un error del 5%, es de al menos 138 animales (Greiner y Gardner 2000). Para aumentar
la precisión de las estimaciones se incrementó el número de muestras previamente calculado.
Las muestras se obtuvieron a partir de otro estudio donde se obtuvo leche, suero y sangre de
72 predios de la X región escogidos aleatoriamente y de un predio con certificación oficial de
libre de Leucosis Bovina.
4.1.3 Métodos diagnósticos evaluados: Se utilizaron las siguientes pruebas diagnósticas:
Inmunodifusión en Gel de Agar (prueba oficial) (ID), ELISA para suero (IDEXX-Bommeli)
(IDBOM), ELISA para suero (INGENASA) (INGE) y leche IDEXX-Pourquier (IDPOUQ) y
Reacción de polimerasa en cadena (PCR).
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En este subtitulo se mencionaran solo algunos aspectos relevantes para las pruebas
utilizadas, ya que la información detallada de cada una, se puede obtener de manera fácil, con
tan solo la información antes proporcionada.
4.1.3.1 Inmunodifusión en Gel de Agar (ID): El método utilizado corresponde al
recomendado por la OIE (2004). Todas las muestras de suero se analizaron empleando el
equipo comercial producido por la firma Bommeli, utilizando el procedimiento estándar. El
equipo detecta suero positivo de referencia E4 diluido 1/10 en suero negativo (Council
Directive 64, EEC, July 1989, Annex G0).
4.1.3.2 Reacción de polimerasa en cadena (PCR): Se aplicara un PCR anidado siguiendo la
técnica detallada por Beier y col (2001). Los partidores sintetizados para un segmento del gen
env son los siguientes:
•
Primers externos:
env5032 5’ - TCT GTG CCA AGT CTC CCA GAT A - 3’
env5099 5’ - CCC ACA AGG GCG GCG CCG GTT T - 3’
•
Primers internos:
env5521r 5’ - GCG AGG CCG GGT CCA GAG CTG G - 3’,
env5608r 5’ - AAC AAC AAC CTC TGG GAA GGG T - 3’
Para cada muestra de sangre entera se extraerá el ADN utilizando kits comerciales para
tal fin (Quiagen). Las dos amplificaciones se realizaron en un volumen total de 50 µl, en 30
ciclos cada una (2 min a 72 ˚C, 1 min a 72 °C). Los productos finales fueron corridos en un gel
de agarosa al 2 % y teñidos con Bromuro de Etidio. Utilizando UV las muestras positivas
fueron caracterizadas por la aparición de una banda correspondiente a 444 pares de bases. En
cada corrida se incorporará un control de un animal conocido como infectado y un control
negativo.
4.1.3.3 ELISA IDEXX-BOMMELI (IDBOM): Se utilizo el protocolo diseñado para el Kit
HerdCheck para detección de VLB elaborado por el laboratorio IDEXX.
4.1.3.4 ELISA INGEZIM (INGE): Se utilizo el protocolo diseñado por INGENASA para su
prueba diagnóstica INGEZIM BLV COMPAC 2.0
4.1.3.5 ELISA IDEXX-POURQUIER (IDPOUQ): Se utilizo el protocolo diseñado por
INSTITUT POURQUIER para su prueba diagnóstica ELISA BOVINE LEUKOSIS MILK
SCREENING.
13
4.2 MÉTODOS
Los resultados de las 5 pruebas incluidas en el estudio, fueron ordenados y procesados
en planillas Excel. Este estudio contemplo 3 referencias; Inmunodifusión, PCR y la
combinación de los resultados de estas dos pruebas.
Para la elaboración de la referencia utilizando a Inmunodifusión y PCR, se consideró
como infectado a cualquier animal que haya sido diagnosticado como positivo en cualquiera
de las dos pruebas señaladas. Para el caso de ser considerado no infectado, el animal en
cuestión debe ser negativo en ambas pruebas sin excepción.
Los datos se reordenaron en tablas 2 x 2 siguiendo este esquema:
Positivo
Negativo
Enfermo
VP
FN
No enfermo
FP
VN
Donde enfermo y no enfermo se considera a todo individuo positivo o negativo a la
prueba de referencia, según corresponda y positivo o negativo a todo individuo positivo o
negativo a la prueba evaluada, según corresponda. Teniendo claro este punto, se procedió a
rellenar cada uno de los cuadrantes de la tabla en verdaderos positivos (VP), verdaderos
negativo (VN), falsos negativos (FN) y verdaderos negativos (VN). Se utilizo como
referencia, lo descrito por Martin y col (1988).
Este procedimiento se realizo un total de 11 veces (ver anexos); 4 cuando se utilizo a
Inmunodifusión como referencia, 4 para PCR y 3 veces para la combinación de
Inmunodifusión y PCR. Cada serie de referencias incluían la comparación con los 3 ELISA y
con PCR, a excepción de la última referencia, que al ser formulada en conjunto con PCR, solo
se considero los 3 ELISA incluidos en el estudio.
4.2.1 Análisis estadístico
Utilizando las tablas obtenidas, los resultados fueron ingresados en el programa
computacional WIN EPISCOPE versión 2.0 con el cual se obtuvieron los siguientes
indicadores: sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo y
los estadísticos J de Youden y kappa.
Para la evaluación de kappa se utilizo la escala propuesta por Landis y Koch. Ellos
hacen la siguiente clasificación: 1 – 0 pobre; 0 - 0,2 reducida; 0,2 - 0,4 aceptable; 0,4 - 0,6
moderada; 0,6 - 0,8 notable y 0,8 – 1 casi perfecta (Szklo y Nieto 2006).
14
En el caso de la prueba de la razón de la verosimilitud positiva y negativa, se aplicaron
las siguientes formulas, según lo descrito por Gil (2002):
RVP = SE
1-ES
RVN = 1 - SE
ES
Donde RVP es la razón de verosimilitud positiva y RVN; la negativa, SE es
sensibilidad y ES; la especificidad.
Para interpretar la RVP se utilizo la siguiente escala: > 10 excelente; 5 – 10 buena; 2 –
5 regular y 1 – 2 deficiente. La RVN se interpreta en forma inversa a RVP, por tanto, a menor
valor, mayor es la importancia de la prueba (Gil 2002).
4.2.1.1 Curva Receptor Operador: Corresponde a una serie de cocientes de probabilidad
correspondiente a cada valor de corte. Como los cocientes de probabilidad son independientes
de la prevalencia de la enfermedad, la curva RO, otorga un acercamiento estándar para la
evaluación de las capacidades de las pruebas diagnósticas (Smith 1991) en especial para el
caso de las pruebas de ELISA.
Gracias a este método es posible, evaluar la correspondencia del punto de corte
sugerido por el fabricante, con el punto óptimo calculado por este método, donde se logran los
más altos valores de sensibilidad y especificidad. Adicionalmente se puede obtener el área
bajo la curva, es cuál es la medida de la capacidad diagnostica de la prueba evaluada
Los datos de densidad óptica de las pruebas de ELISA y los resultados de las pruebas
de referencias, fueron ingresados al programa computacional R versión 2.3.1 el cual nos
entrego las curvas, punto de corte, sensibilidad y especificidad para ese punto y las áreas bajo
la curva de las pruebas evaluadas (ver anexos).
4.2.1.2 Prueba de McNemar: Las tablas obtenidas fueron sometidas a esta prueba, con la
finalidad de determinar si existían diferencias estadísticamente significativas.
En esencia, tanto la hipótesis nula como la alternativa, son aplicables para todas las
pruebas evaluadas, por lo tanto se resumieron de la siguiente manera:
H0 R = E α < 0,05
H1 R ≠ E
Donde R equivale a la prueba de referencia y E a la prueba a evaluar. Los resultados se
estimaron con un nivel de confianza de 95 % y 1 grado de libertad y fueron procesados
mediante el programa computacional Statistix 8 versión 8,0.
15
5. RESULTADOS
Los resultados del estudio se exponen en forma de cuadros. El cuadro 1 pretende ser un
cuadro introductorio, que aportará los aspectos más básicos a obtener del análisis de los datos.
Cuadro 1. Número y porcentaje de positivos y negativos, obtenidos de 301 muestras bovinas
sometidas a las técnicas para el diagnóstico del Virus de la Leucosis Bovina; Inmunodifusión
(ID), Reacción de cadena de la polimerasa (PCR), ELISA IDEXX-Bommeli (IDBOM),
ELISA INGENASA (INGE) y ELISA IDEXX-Pourquier (IDPOUQ).
Positivo
Negativo
Total
ID
80
26,5 %
221
73,4 %
301
PCR
104
34,5 %
197
65,4 %
301
IDBOM
99
32,8 %
202
67,1%
301
INGE
108
35,8 %
193
64,1 %
301
IDPOUQ
119
39,5 %
182
60,4 %
301
5.1 EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DIAGNÓSTICO UTILIZANDO LA PRUEBA
DE INMUNODIFUSION EN GEL DE AGAR COMO REFERENCIA
Las pruebas de ELISA se comportan de manera similar cuando se les evalúa en
términos de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo, no siendo así el
caso de PCR, que presenta indicadores con resultados más bajos a los obtenidos por los 3
ELISA evaluados. En particular, los principales hallazgos son un 100% de sensibilidad por
parte de ELISA INGE. Por otra parte la prueba más específica es ELISA IDBOM con un
89,2% (Cuadro 2).
Respecto a los valores predictivos, estos se encuentran en directa relación con la
sensibilidad y especificidad calculada para cada prueba, por lo tanto, los ELISA evaluados
tendrían una mayor capacidad de predecir tanto un individuo enfermo como no enfermo en
relación a PCR, siempre teniendo en cuenta el uso de Inmunodifusión como prueba de
referencia. ELISA INGE obtuvo simultáneamente el valor predictivo positivo y negativo más
alto de todas las pruebas evaluadas (Cuadro 2).
16
Cuadro 2. Valores (porcentaje, límite inferior y límite superior) de sensibilidad, especificidad,
valor predictivo positivo y negativo de las técnicas para el diagnóstico del Virus de la
Leucosis Bovina; Reacción de polimerasa en cadena (PCR), ELISA IDEXX-Bommeli
(IDBOM), ELISA INGENASA (INGE) y ELISA IDEXX-Pourquier (IDPOUQ) en relación a
Inmunodifusión como prueba de referencia (Nivel de confianza 95%).
Parámetro
Sensibilidad
Especificidad
Valor predictivo
positivo
Valor predictivo
negativo
PCR
69,4 %
59,6 ; 79,2
79,6 %
74,6 ; 84,5
53,6 %
44,3 ; 62,9
88,4 %
84,2 ; 92,6
Pruebas
IDBOM
INGE
89,2 %
100 %
82,6 ; 95,9
100
89 %
88,38 %
85,2 ; 92,7 84,33 ; 92,42
72,1 %
75,22 %
63,4 ; 80,7 67,26 ; 83,18
96,3 %
100 %
93,9 ; 98,6
100
IDPOUQ
90,4 %
84,1 ; 96,7
80,7 %
75,9 ; 85,6
60,8 %
52,2 ; 69,3
96,2 %
93,7 ; 98,8
Los indicadores de Razón de verosimilitud, evalúan simplemente la ventaja que otorga
la aplicación o la reserva de un método diagnostico, es así, que nos encontramos con que la
aplicación de las 3 técnicas de ELISA, otorgan un aporte considerable en el diagnostico de la
enfermedad, en especial el uso de INGE e IDBOM.
PCR, constituiría una herramienta válida para el diagnostico de la enfermedad, pero
que debiera ser usada con menor prioridad que el resto de pruebas, esto se relaciona
directamente con los indicadores de sensibilidad y especificidad que obtuvo esta prueba.
Cuadro 3. Valores de la Razón de verosimilitud positiva (RVP) y verosimilitud negativa
(RVN) de las técnicas para el diagnóstico del Virus de la Leucosis Bovina; Reacción de
polimerasa en cadena (PCR), ELISA IDEXX-Bommeli (IDBOM), ELISA INGENASA
(INGE) y ELISA IDEXX-Pourquier (IDPOUQ) en relación a Inmunodifusión como prueba de
referencia.
RVP
RVN
PCR
3,2
0,39
IDBOM
8
0,12
INGE
8,3
0,00
IDPOUQ
4,5
0,13
17
Los resultados expuestos en el cuadro 4, confirman lo resultados anteriores. Las
pruebas de ELISA obtienen los valores más altos de J de Youden, lo que indica que tienen una
alta concordancia con Inmunodifusión (prueba de referencia), ya que obtienen los valores más
altos de sensibilidad y especificidad, en relación a PCR, que presento una discreta
concordancia con la prueba de referencia.
Cuadro 4. Valor, límite inferior y límite superior de J de Youden de las técnicas para el
diagnóstico del Virus de la Leucosis Bovina; Reacción de polimerasa en cadena (PCR),
ELISA IDEXX-Bommeli (IDBOM), ELISA INGENASA (INGE) y ELISA IDEXX-Pourquier
(IDPOUQ) en relación a Inmunodifusión como prueba de referencia (Nivel de confianza
95%).
Valor
PCR
IDBOM
INGE
IDPOUQ
0,49
0,78
0,88
0,71
Límite
inferior
0,38
0,70
0,84
0,63
Límite
superior
0,60
0,85
0,92
0,79
El estadístico de kappa, también evalúa concordancia, la mayor diferencia con J de
Youden radica en que este último, no elimina el factor azar. Por lo tanto, en el cuadro 5
podemos apreciar nuevamente, que existe una gran concordancia entre los 3 ELISA evaluados,
a diferencia de PCR que obtuvo el valor más bajo en ambas evaluaciones.
Cuadro 5. Valor de concordancia observada; concordancia esperada e índice kappa de las
técnicas para el diagnóstico del Virus de la Leucosis Bovina; Reacción de polimerasa en
cadena (PCR), ELISA IDEXX-Bommeli (IDBOM), ELISA INGENASA (INGE) y ELISA
IDEXX-Pourquier (IDPOUQ), considerando a Inmunodifusión como prueba de referencia.
Observada
Esperada
Índice kappa
Concordancia
PCR IDBOM
0,77
0,89
0,58
0,60
0,45
0,72
INGE
0,91
0,57
0,80
IDPOUQ
0,83
0,57
0,61
18
5.2 EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DIAGNÓSTICO UTILIZANDO LA PRUEBA
DE PCR COMO REFERENCIA
Al cambiar la prueba de referencia, los resultados cambiaron importantemente. En el
cuadro 6, podemos apreciar que todos los indicadores evaluados disminuyeron, pero a pesar de
esto mantienen cierta aproximación, ya que no sobrepasan una diferencia de 13% cosa distinta
que pasaba al utilizar a Inmunodifusión como referencia, donde las diferencias alcanzaron
hasta un 30%. Este hallazgo no hace más que reafirmar, que existen diferencias entre PCR y el
resto de pruebas evaluadas.
Cuadro 6. Valores (porcentaje, límite inferior y límite superior) de sensibilidad, especificidad,
valor predictivo positivo y negativo de las técnicas para el diagnóstico del Virus de la
Leucosis Bovina; Inmunodifusión (ID), ELISA IDEXX-Bommeli (IDBOM), ELISA
INGENASA (INGE) y ELISA IDEXX-Pourquier (IDPOUQ) en relación a Reacción de
polimerasa en cadena como prueba de referencia (Nivel de confianza 95%).
Parámetro
Sensibilidad
Especificidad
Valor predictivo
positivo
Valor predictivo
negativo
ID
53,6 %
44,3 ; 62,9
88,4 %
84,2 ; 92,6
69,4 %
59,6 ; 79,2
79,6 %
74,6 ; 84,5
Pruebas
IDBOM
INGE
61,9 %
66,9 %
52,9 ; 70,8
58 ; 75,9
84,2 %
80 %
79,5 ; 88,9
74,5 ; 85,4
66 %
63,3 %
57 ; 75
54,4 ; 72,3
81,7 %
82,4 %
76,8 ; 86,7
77,1 ; 87,7
IDPOUQ
59,3 %
50,6 ; 68
76,5 %
71,3 ; 81,8
55,3 %
46,8 ; 63,7
79,4 %
74,3 ; 84,5
Producto de que no existe un consenso entre PCR y las pruebas evaluadas, los valores
de la Razón de verosimilitud se mantienen bajo. La prueba de referencia, no logra buenos
niveles de concordancia con sus resultados, por lo tanto, la pruebas parecen tener un bajo
aporte al diagnostico de la enfermedad, tanto para confirmar como descartar la presencia de la
misma (cuadro 7).
19
Cuadro 7. Valores de la Razón de la verosimilitud positiva (RVP) y verosimilitud negativa
(RVN) de las técnicas para el diagnóstico del Virus de la Leucosis Bovina; Inmunodifusión
(ID), ELISA IDEXX-Bommeli (IDBOM), ELISA INGENASA (INGE) y ELISA IDEXXPourquier (IDPOUQ) en relación a Reacción de polimerasa en cadena como prueba de
referencia.
RVP
RVN
ID
4,4
0,53
IDBOM
3,8
0,46
INGE
3,3
0,43
IDPOUQ
2,8
0,54
El valor de J de Youden, no aporta mayor novedad, el nivel de concordancia de las
pruebas con PCR, es moderado y solo nos indica, en forma particular que ELISA IDPOUQ
presenta el valor más bajo (Cuadro 8).
Cuadro 8. Valor, límite inferiores y límite superior de J de Youden de las técnicas para el
diagnóstico del Virus de la Leucosis Bovina; Inmunodifusión (ID), ELISA IDEXX-Bommeli
(IDBOM), ELISA INGENASA (INGE) y ELISA IDEXX-Pourquier (IDPOUQ) en relación
Reacción de polimerasa en cadena como prueba de referencia (Nivel de confianza 95%).
Valor
ID
IDBOM
INGE
IDPOUQ
0,42
0,46
0,46
0,35
Límite
inferior
0,31
0,36
0,36
0,25
Límite
superior
0,52
0,56
0,57
0,46
Si aplicamos la escala de Landis y Koch, podemos decir que existe un grado de
acuerdo moderado entre las pruebas evaluadas y PCR, lo cual reafirma los resultados antes
expuestos; no existe una buena concordancia con la prueba de referencia (Cuadro 9).
20
Cuadro 9. Valor de concordancia observada; concordancia esperada e índice kappa de las
técnicas para el diagnóstico del Virus de la Leucosis Bovina; Inmunodifusión (ID), ELISA
IDEXX-Bommeli (IDBOM), ELISA INGENASA (INGE) y ELISA IDEXX-Pourquier
(IDPOUQ), considerando a Reacción de polimerasa en cadena como prueba de referencia.
Observada
Esperada
Índice kappa
Concordancia
ID
IDBOM
0,77
0,77
0,58
0,37
0,45
0,47
INGE
0,76
0,54
0,46
IDPOUQ
0,71
0,55
0,35
5.3
EVALUACIÓN
DEL
DESEMPEÑO
DIAGNÓSTICO
UTILIZANDO
COMBINACIÓN DE RESULTADOS DE DOS PRUEBAS (INMUNODIFUSION EN
GEL DE AGAR Y PCR) COMO PRUEBA DE REFERENCIA.
Los resultados al usar una referencia elaborada en base a dos pruebas (Inmunodifusión
y PCR), mejoran en relación a usar solamente a PCR como referencia. Adicionalmente a ello,
se destaca que los niveles de sensibilidad son inferiores a los valores de especificidad
obtenidos cuando se utilizo a Inmunodifusión como referencia, lo que indicaría, que los
ELISA tendrían una mayor capacidad de identificar a los individuos no enfermos (cuadro 10).
Cuadro 10. Valores (porcentaje, límite inferior y superior) de sensibilidad, especificidad,
valor predictivo positivo y negativo de las técnicas para el diagnóstico del Virus de la
Leucosis Bovina; ELISA IDEXX-Bommeli (IDBOM), ELISA INGENASA (INGE) y ELISA
IDEXX-Pourquier (IDPOUQ) en relación a la prueba de referencia elaborada en base a dos
pruebas diagnósticas (Inmunodifusión y Reacción de polimerasa en cadena) (Nivel de
confianza 95%).
Parámetro
Sensibilidad
Especificidad
Valor predictivo
positivo
Valor predictivo
negativo
IDBOM
65,4 %
57,5 ; 73,3
92,4 %
88,7 ; 96,1
85,8 %
79,2 ; 92,4
79,3 %
74 ; 84,5
Pruebas
INGE
73,4 %
65,9 ; 81
91,1 %
86,9 ; 95,2
85,8 %
79,4 ; 92,2
82,4 %
77,1 ; 87,7
IDPOUQ
63 %
55,3 ; 70,8
82,8 %
77,4 ; 88,1
74 %
66,3 ; 81,6
74,2 %
68,4 ; 80,1
21
Del cuadro 11 se desprende, que tanto ELISA IDBOM e INGE, tienes un mayor aporte
para diagnosticar la enfermedad, a diferencia de IDPOUQ. Este resultado mantiene la
tendencia mostrada a lo largo del estudio, que indica, que ELISA IDPOUQ es una prueba
similar al resto de ELISA, pero que tiene un desempeño inferior al resto de ellas.
Cuadro 11. Valor de la Razón de la verosimilitud positiva (RVP) y verosimilitud negativa
(RVN) de las técnicas para el diagnóstico del Virus de la Leucosis Bovina; ELISA IDEXXBommeli (IDBOM), ELISA INGENASA (INGE) y ELISA IDEXX-Pourquier (IDPOUQ) en
relación a la prueba de referencia elaborada en base a dos pruebas diagnósticas
(Inmunodifusión y Reacción de polimerasa en cadena )
RVP
RVN
IDBOM
8,1
0,38
INGE
8,1
0,30
IDPOUQ
3,5
0,45
Los valores de J de Youden obtenidos, ubican a los ELISA, en una estado intermedio,
comparado cuando se utilizo como referencia a Inmunodifusión y PCR, en otras palabras, en
nivel de concordancia, no fue mayor que al usar a Inmunodifusión como referencia, ni fue
menor; cuando se uso a PCR como referencia. Se mantiene la tendencia, ELISA IDPOUQ
presenta los niveles más bajos de concordancia entre los ELISA evaluados (Cuadro 12).
Cuadro 12. Valor, límite inferior y límite superior de J de Youden de las técnicas para el
diagnóstico del Virus de la Leucosis Bovina; ELISA IDEXX-Bommeli (IDBOM),ELISA
INGENASA (INGE) y ELISA IDEXX-Pourquier (IDPOUQ) en relación a la prueba de
referencia elaborada en base a dos pruebas diagnósticas (Inmunodifusión y Reacción de
polimerasa en cadena ) (Nivel de confianza 95%).
Valor
IDBOM
INGE
IDPOUQ
0,57
0,64
0,45
Límite
inferior
0,49
0,55
0,36
Límite
inferior
0,66
0,73
0,55
Los valores de los índices de kappa se mantienen similares a los de J de Youden, por lo
tanto reafirman una moderada concordancia con la referencia elaborada. Nuevamente ELISA
IDPOUQ presenta el valor más bajo (Cuadro 13).
22
Cuadro 13. Valor de Concordancia observada, concordancia esperada e índice kappa de las
técnicas para el diagnóstico del Virus de la Leucosis Bovina; ELISA IDEXX-Bommeli
(IDBOM), ELISA INGENASA (INGE) y ELISA IDEXX-Pourquier (IDPOUQ), en relación a
la prueba de referencia elaborada en base a dos pruebas diagnósticas (Inmunodifusión y
Reacción de polimerasa en cadena ).
Observada
Esperada
Índice kappa
Concordancia
IDBOM INGE
0,81
0,84
0,53
0,52
0,60
0,66
IDPOUQ
0,74
0,52
0,47
5.4 EVALUACION DE LAS PRUEBAS DE ELISA MEDIANTE AREA BAJO LA
CURVA Y PUNTO DE CORTE
En el cuadro 14 se exponen los resultados obtenidos de la evaluación de las distintas
pruebas de ELISA (IDBOM, INGE e IDPOUQ), utilizando 3 pruebas de referencia (ID, PCR
y CPR). A partir de los puntos de corte obtenido por la curva de ROC, se puede decir, que las
pruebas presentan una mayor sensibilidad en el punto de corte, cuando se utiliza como prueba
de referencia a Inmunodifusión y en menor medida cuando se realiza con PCR y la
combinación de dos pruebas (ID + PCR). Cuando se comparan con inmunodifusión, las
pruebas con la más alta área bajo la curva fueron ELISA IDBOM e INGE (0,93 y 0,94
respectivamente). En relación a la comparación con PCR y CPR, todos los ELISA presentaron
valores bajos de área bajo la curva. Los valores de área bajo la curva, se relacionan
adecuadamente con los distintos indicadores de concordancia, ya que al haber mayor acuerdo
con la prueba de referencia, más alto fue el valor del área bajo la curva.
23
Cuadro 14. Valor de punto de corte (PC), sensibilidad (Se), especificidad (Es) y área bajo la
curva (ABC) de las técnicas para el diagnóstico del Virus de la Leucosis Bovina; ELISA
IDEXX-Bommeli (IDBOM), ELISA INGENASA (INGE) y ELISA IDEXX-Pourquier
(IDPOUQ) cuando se utiliza como referencia a Inmunodifusión (ID), Reacción de polimerasa
en cadena (PCR) y la combinación de resultados de las dos prueba antes mencionadas (CPR).
IDBOM
INGE
IDPOUQ
PC
Se
Es
ABC
PC
Se
Es
ABC
PC
Se
Es
ABC
ID
1,47
0,91
0,87
0,93
0,11
0,82
0,01
0,94
99,68
0,91
0,82
0,84
PCR
0,23
0,68
0,75
0,68
2,22
0,25
0,63
0,72
97,77
0,64
0,76
0,69
CPR
0,36
0,52
0,64
0,50
2,22
0,36
0,68
0,53
34,76
0,52
0,59
0,53
5.5 EVALUACION DE LAS PRUEBAS DIAGNOSTICAS MEDIANTE LA PRUEBA
DE MCNEMAR.
En el cuadro 15 se presentan los resultados obtenidos para la prueba de McNemar, para
evaluación de diferencias entre técnicas relacionadas. El principal hallazgo es que PCR no
presentaría diferencias con ELISA IDBOM, INGE e IDPOUQ
Cuadro 15. Valor P de la prueba de McNemar, de las técnicas para el diagnóstico del Virus de
la Leucosis Bovina; Inmunodifusión (ID), Reacción de polimerasa en cadena (PCR), ELISA
IDEXX-Bommeli (IDBOM), ELISA INGENASA (INGE) y ELISA IDEXX-Pourquier
(IDPOUQ) (α < 0,05 y 1 grado de libertad).
ID
PCR
IDBOM
INGE
PCR
0,0044
IDBOM
0,0012
0,4310
INGE
0,0000
0,4913
0,0082
IDPOUQ
0,0000
0,3887
0,0015
0,0343
24
6. DISCUSION
El objetivo de este estudio es evaluar el desempeño de 3 tipos de ELISA (indirecto,
competencia y en leche) y PCR, principalmente frente al método de diagnóstico utilizado
oficialmente en Chile. Adicionalmente, las pruebas de ELISA se compararon con PCR, por ser
indicado como uno de los métodos de detección directa y como último punto, ver las
variaciones que se presentan al formular un método de referencia, constituido por dos métodos
diagnósticos (ID y PCR).
Los resultados obtenidos indican que, los ELISA evaluados mediante kappa, presentan
una notable concordancia con inmunodifusión (cuadro 5), sensibilidades que oscilan entre un
89 y 100% y especificidades que oscilan entre 81 y 90% (Cuadro 2) y una eficiencia según J
de Youden de 0,79 aproximadamente (cuadro 4). Estos resultados son comparables con los
obtenidos por Felmer y col (2006); Monti (2005); Recabal (2005); Choi y col (2002);
Gutiérrez y col 2001; Trono y col (2001); Simard y col (2000) y Molloy y col (1990), los
cuales indican altos valores de sensibilidad y especificidad para los ELISA evaluados, la
diferencia con ellos, radica en la magnitud de los valores. Nuestros resultados son mucho más
mesurados, y en promedio obtienen valores de sensibilidad de 93% y una especificidad de
85% aproximadamente, mientras que ellos obtuvieron valores más cercanos al 100%. Esta
variación se explica mayormente debido al número de positivos obtenidos por inmunodifusión
en este estudio; al ser utilizado como referencia y al obtener un numero más bajo (cuadro 1)
que el obtenido por el resto de pruebas, los valores de sensibilidad y especificidad se ven
disminuidos, pero la tendencia indica que existe una correlación importante entre estas
pruebas.
La variación en las capacidades diagnósticas de inmunodifusión y la determinada por
los autores antes citados, podría deberse a la utilización de distintos procedimientos para
realizar la prueba, ya que todos utilizaron métodos descritos y recomendados a partir de
distintos kits. Por otra parte, cierto sesgo también es atribuible a la subjetividad con que se
interpreta esta prueba, ya que depende en forma importante de la experiencia de quien la
evalúa (OIE 2004; Nguyen y Maes 1993).
Otra posible explicación para estos resultados, consiste en la mayor sensibilidad
descrita para las pruebas de ELISA. Simard y col (2000) indican que la dilución a partir de la
cual ELISA indirecto es capaz de entregar resultados positivos, es de 1 es a 5000 frente a 1 es
a 100 que presentaría inmunodifusión. Por lo cual podría ser que las muestras, no presentaran
títulos de anticuerpos lo suficientemente elevados para dar un número mayor de muestras
positivas a ID, pero si adecuadas, para los distintos ELISA. Esta variación en las
concentraciones podría deberse también, a que utilizamos muestras compuestas por animales
de distintos predios de la decima región, por lo cual, existe la posibilidad que se encuentren en
distintos momentos de infección, (post infección, linfocitosis persistentes o
25
inmunosuprimidos), a diferencia de los estudios antes mencionados que utilizan generalmente
animales de un mismo rebaño y generalmente con alta seroprevalencia. Por último, la OIE
(2004) indica que entre 2 a 6 semanas antes del parto y entre 1 a 2 semanas post parto, existe
movilización de anticuerpos séricos, hacia la glándula mamaria, por lo cual muchos resultados
negativos otorgados por inmunodifusión, no son concluyentes y debiera repetirse, esta
situación se condice también con lo antes expuesto, y agregaría otra fuente de discordancia
entre pruebas.
Dentro de las pruebas evaluadas destaca el ELISA INGE, que obtiene los valores más
altos en todos los indicadores estimados en este estudio. Este ELISA, es una prueba serológica
del tipo de competencia, por lo cual es de esperar que presente un mejor desempeño en
relación a las otras pruebas evaluadas, como lo confirman Monti 2005; Gutiérrez y col 2001 y
Hoff-jorgensen 1989.
PCR es la prueba con más bajos índices de todas las pruebas evaluadas
(inmunodifusión como referencia). Con una sensibilidad de 69,4%; especificidad de 79,6%
(cuadro 2), eficiencia medida en J de Youden de 0,49 (cuadro 4) y un kappa de 0,45 (cuadro
5). La sensibilidad concuerda con los resultados obtenidos por Nagy y col (2003), pero
difieren con los obtenidos por Felmer y col (2006) y Recabal (2005). Ambos autores describen
a esta prueba con una alta sensibilidad (96%). Esta diferencia se explica por el número de
positivos determinados por las pruebas. Al haber una cantidad de positivos similares entre las
dos pruebas, se posibilita la obtención de niveles de sensibilidad más altos. Los resultados
obtenidos por ambos autores podrían considerarse como adecuados a su estudio en cuestión,
pero no serian del todo fiables, ya que para realizar la validación de pruebas diagnósticas, con
niveles esperados de sensibilidad y especificidad de 90 %, nivel de confianza de 95 % y un
error de 5 %, se requiere de al menos 138 animales (Greiner y Gardner 2000), cuando ellos
consideraron solo 126. Por lo tanto, no alcanzaría el tamaño mínimo muestreal para dar mayor
seguridad a sus resultados. Con Felmer y colaboradores (2006) se concuerda con el valor de
kappa (0.45), este valor seria mas aplicable, ya que analiza la concordancia entre los
resultados obtenidos entre las pruebas evaluadas. Si bien el PCR tiene una alta sensibilidad
analítica, la OIE (2004) indica que PCR puede entregar resultados falsos positivos, debido a
contaminación durante los procesos y falsos negativos por la presencia de sustancias
inhibidoras, o a partir de muestras de sangre asociadas a bajos niveles de linfocitos periféricos
infectados.
Cuando utilizamos a PCR como método de referencia, los resultados se modifican
considerablemente. En la cuadro 6 se puede apreciar una importante caída en la sensibilidad de
todas las pruebas evaluadas (inmunodifusión, ELISA IDBOM, INGE e IDPOUQ). Al ser
evaluadas en comparación con inmunodifusión, la sensibilidad ronda el 93 %
aproximadamente y cuando se comparan con PCR, el valor cae a un 62 % aproximadamente
(para todos los ELISA). Inmunodifusión también presenta un valor de sensibilidad bajo (53,6
% cuadro 6). Por otra parte, la especificidad para todas las pruebas se mantiene semejante (82
% aproximadamente) y no difiere demasiado, de los resultados obtenidos cuando
inmunodifusión era considerada como referencia (84% aproximadamente). Los resultados de
este estudio se contraponen a lo publicado por Felmer y col (2006); Monti (2005); Recabal
26
(2005) y Gregory y col (2004). Describen una sensibilidad de 97% para ELISA indirecto, a
excepción de Monti (2005) que encontró un valor de 89,3%. Felmer y col (2006) y Recabal
(2005) describen también un 97% de sensibilidad para ELISA en leche, valores muy alejados
a los calculados en este estudio.
Tanto los valores de sensibilidad como de especificidad, se ven afectados por el
numero de positivos y negativos diagnosticados y a la concordancia que existe entre ellos. Es
así por ejemplo, que al haber una cantidad mayor de positivos en la prueba de referencia, se
posibilita que haya una mayor sensibilidad con la prueba evaluada y una mayor probabilidad
de que coincidan los resultados. El nivel de eficiencia de esta prueba mediante J de Youden
tiene un promedio aproximado de 0,42 y según kappa las pruebas se definirían como de
moderada concordancia (cuadro 9). Existe un grado de acuerdo parcial con Felmer y col
(2006) y Recabal (2005), ya que ambos autores obtuvieron un índice kappa de 0,45 para
inmunodifusión, pero un valor de 0,85 para los ELISA indirecto y en leche. El mayor grado de
concordancia entre ELISA y PCR, se podría atribuir, a que se trata de un rebaño con una
prevalencia alta, lo que implica un aumento en la probabilidad de diagnosticar individuos
positivos. Algunas razones que pueden explicar una menor cantidad de muestras
diagnosticadas como positivas pueden ser: los partidores elegidos; de su elección depende
altamente la sensibilidad, ya que los resultados de la elección de uno u otro, pueden verse
afectados por las variaciones de las cadenas del virus (Marsolai y col 1994). Otra causa se
atribuye, a que los linfocitos circulantes de animales seropositivos, hematológicamente
normales y asintomáticos contiene de 1 a 3 copias provirales, mientras que el porcentaje de
células infectadas por el virus es menor al 10 % (Mirsky y col 1996). Estos niveles pueden ser
indetectables para PCR, pero ser lo suficientemente adecuados para inducir una respuesta
inmune. En base a este último punto, Monti (2005) describe, que existe una tendencia a que
las pruebas serológicas entreguen una gran cantidad de positivos y que varias de esas muestras
den negativo para PCR.
Como comparación adicional en este estudio, se desarrolló una prueba de referencia
combinada, basada en inmunodifusión y PCR. Esta referencia se elaboró en base a los
siguientes requerimientos: individuo positivo, se considera aquel que se encuentre positivo en
al menos una de las pruebas consideradas (ID y PCR) y negativo es aquel individuo que se
encuentre negativo para ambas pruebas.
Los resultados obtenidos (cuadro 10), son similares a los arrojados por la comparación
de las pruebas, con PCR como referencia. La sensibilidad de los ELISA fue en promedio
aproximadamente de un 67,43 %; mientras que cuando se utilizó a PCR como referencia fue
de un 62,75 aproximadamente. En relación a la especificidad, esta obtuvo valores elevados
(88,79% aproximadamente), similares a los obtenidos, cuando se utilizó como referencia a
inmunodifusión (86,05% aproximadamente). El valor J de Youden es de 0,55
aproximadamente (cuadro 12) y el valor de kappa indica una moderada concordancia entre
ELISA y la prueba de referencia elaborada (cuadro 13).
Los resultados obtenidos se explican principalmente, por el criterio de formulación de
la prueba de referencia. Los valores moderados de sensibilidad están supeditados a los
27
requisitos para la determinación de una muestra como positiva en relación a la prueba de
referencia. Ya que para la formulación de la misma se consideró como positivo a cualquier
individuo que fuera positivo, al menos a una de las dos pruebas incluidas en la referencia (ID y
PCR), es así como el numero de muestras positivas en la referencia es mayor en relación a los
ELISA evaluados, esto, porque en su formulación no solo se incluyen las muestras que son
concordantes para inmunodifusión y PCR, sino que además se amplía este valor, por la
inclusión de los valores positivos individuales para ambas pruebas. Es así, que al aumentar las
muestras positivas como referencia, la sensibilidad disminuye producto de un aumento de
falsos negativos al momento del tamizaje.
Para el caso de la especificidad, ocurre un caso distinto, el criterio de clasificación de
las muestras como negativas, requería que para ello, ambas pruebas tuvieran resultados
negativos (ID y PCR). Como resultado de esto, el número de muestras negativas disminuye,
ya que solo considera aquellas en las cuales ambas pruebas concuerdan. Al disminuir este
valor, se posibilita que exista una mayor concordancia con las pruebas de ELISA evaluadas, lo
que a su vez aumenta el valor de la especificidad.
Es importante destacar, que según los resultados obtenidos en este estudio,
inmunodifusión y PCR, son pruebas que no tienen una gran concordancia (evaluada según
kappa), por lo tanto era de esperarse que los indicadores obtenidos apuntaran a que las pruebas
de ELISA no tuvieran un gran desempeño.
Si bien este resultado es más que nada, una confirmación de los datos obtenidos, es
relevante destacar, que estos índices son mejores, que los obtenidos por PCR, lo que indica
que existe una mayor influencia de inmunodifusión en esta prueba de referencia elaborada,
principalmente al momento de determinar las muestras consideradas como positivas.
Cuando evaluamos las pruebas de ELISA según la curva de ROC, y usando a
inmunodifusión como referencia, podemos decir que en términos generales, todas las pruebas
presentaron valores altos de área bajo la curva, por lo cual se considerarían como pruebas de
gran utilidad para el diagnóstico de la enfermedad (rango 0,84 a 0,93 cuadro 14). Además se
presentan variaciones entre los puntos de corte sugeridos por los fabricantes y los que podrían
optimizar tanto la sensibilidad como la especificidad de las pruebas. Los nuevos puntos de
corte para ELISA IDBOM e IDPOUQ, significan un incremento en la sensibilidad de 1,72 y
de 0,53 % respectivamente, lo que en términos generales quiere decir que los puntos sugeridos
y estimados son bastante similares para estas pruebas. No así para ELISA INGE, la variación
de esta prueba corresponde a un 18%, con una sensibilidad estimada de 100% y una
determinada por el punto de corte calculado de 82%. Esto indica que el punto de corte
propuesto por el fabricante, no sería el óptimo bajo las condiciones de este estudio, ya que este
valor estaría dando una cantidad menor de falsos negativos, lo que aumenta la sensibilidad de
la prueba arbitrariamente. Estos resultados se contraponen a lo publicado en otros estudios,
varios autores indican que los ELISA de competencia presentan una mayor sensibilidad que
aquellos del tipo indirecto, por lo tanto, los resultados obtenidos inicialmente concordarían con
lo publicado, pero no serian consistentes con los obtenidos en la evaluación de área bajo la
curva y punto de corte (Monti 2005; Gutiérrez y col 2001; Hoff-jorgensen 1989).
28
Al usar PCR como referencia, ocurre una situación similar a cuando se utiliza a
inmunodifusión como tal. Los ELISA IDBOM e IDPOUQ, presentan valores similares entre
sí, las estimaciones indican que ambas pruebas deben modificar sus puntos de corte para así
aumentar su sensibilidad y especificidad, ya que no estaría usando todo su potencial. Aunque
basados en el área bajo la curva, las pruebas no presentaría una gran capacidad diagnóstica
(rango 0,68 a 0,72 cuadro 13). Nuevamente ELISA INGE, presento ser la excepción, según la
estimación, esta prueba estaría sobrevalorada y el nuevo punto de corte que optimizaría la
prueba, le daría un muy discreto 25% de sensibilidad y un 63% de especificidad, por lo cual
sus capacidades diagnósticas serian muy bajas, aun así, esta prueba presenta el área bajo la
curva mayor de las 3 pruebas evaluadas.
La evaluación de las pruebas de ELISA, usando la combinación de los resultados de
dos pruebas de referencia, mantiene la tendencia anterior. El área bajo la curva indica que
todas las pruebas tienen un valor bajísimo para ser utilizadas como pruebas diagnósticas
(rango 0,50 a 0,53 cuadro 14) y al punto de corte estimado la sensibilidad presenta un rango de
36 a 52% y la especificidad; 59 a 68 % (cuadro 14).
Del análisis de las curvas de ROC, podemos finalmente decir, que los resultados
obtenidos, indican que, al tener una mayor similitud los ELISA con inmunodifusión, sus
resultados las muestran como pruebas de gran utilidad diagnóstica, cosa que no sucede con
PCR ni con la combinación de resultados de dos pruebas, que serian pruebas que se alejan
tanto de inmunodifusión como con los ELISA evaluados.
Una vez concluido este estudio, podemos decir, que todas las distintas pruebas de
ELISA evaluadas obtienen resultados similares, y guardan una buena concordancia con
inmunodifusión. ELISA de tipo competitivo, presenta niveles de sensibilidad y especificidad,
mayores que el resto de pruebas evaluadas.
Al ser PCR un método diagnóstico directo, su sensibilidad y especificidad, la ubican
como un método de baja concordancia con el resto de pruebas evaluadas.
Los puntos de cortes proporcionados por los fabricantes de las distintas pruebas de
ELISA evaluadas, se encuentran en un rango bastante similar, al óptimo recomendable para el
país, esto siempre y cuando se les decida utilizar como pruebas alternativas a inmunodifusión,
ya que al ser evaluadas con PCR, los puntos de corte obtenidos dañan considerablemente las
cualidades diagnósticas de los ELISA evaluados.
Con respecto a la combinación de dos pruebas como referencia, podemos indicar, que
su utilización estaría muy limitada, principalmente por el tiempo y costo que implica realizar
PCR en forma conjunta con Inmunodifusión, en una masa de animales.
Como último punto, sería recomendable analizar las políticas de los programas de
control y erradicación de la Leucosis viral bovina, ya que estudios previos y este, reafirman
que las pruebas de ELISA constituye un métodos con buenos niveles de sensibilidad y
29
especificidad comparables a inmunodifusión, pero que además presenta un par de ventajas
sobre la misma, como son su capacidad de aplicarse a una gran cantidad de animales, su costo
relativo frente a las masas ganaderas que se evalúan, además de ser una prueba sencilla, rápida
y que entrega resultados cuantitativos.
30
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34
8. ANEXOS
ANEXO 1. Clasificación sanitaria de PCR en relación a inmunodifusión como referencia.
ID
PCR
51
199
250
+
59
26
85
+
-
110
225
335
ANEXO 2. Clasificación sanitaria de ELISA IDEXX-Bommeli (IDBOM) en relación a
inmunodifusión (ID) como referencia.
ID
IDBOM
+
-
+
75
9
84
29
235
264
104
244
348
ANEXO 3. Clasificación sanitaria de ELISA INGEZIM (INGE) en relación a inmunodifusión
(ID) como referencia.
ID
INGE
+
-
+
85
0
85
28
213
241
113
213
326
35
ANEXO 4. Clasificación sanitaria de ELISA IDEXX-Pourquier (IDPOUQ) en relación a
inmunodifusión (ID) como referencia.
ID
IDPOUQ
+
-
+
76
8
84
49
206
255
125
214
339
ANEXO 5. Clasificación sanitaria de inmunodifusión (ID) en relación a PCR como referencia.
PCR
ID
+
59
51
110
+
-
26
199
225
85
250
335
ANEXO 6. Clasificación sanitaria de ELISA IDEXX-Bommeli (IDBOM) en relación a PCR
como referencia.
PCR
IDBOM
+
-
+
70
43
113
36
193
229
106
236
342
ANEXO 7. Clasificación sanitaria de ELISA INGEZIM (INGE) en relación a PCR como
referencia.
PCR
INGE
+
-
+
71
35
106
41
164
205
112
199
311
36
ANEXO 8. Clasificación sanitaria de ELISA IDEXX-Pourquier (IDPOUQ) en relación a PCR
como referencia.
PCR
IDPOUQ
+
-
+
73
50
123
59
193
252
132
243
375
ANEXO 9. Clasificación sanitaria de ELISA IDEXX-Bommeli (IDBOM) en relación a la
combinación de resultados de dos pruebas (CPR).
CPR
IDBOM
+
-
+
91
48
139
15
184
199
106
232
338
ANEXO 10. Clasificación sanitaria de ELISA INGEZIM (INGE) en relación a la
combinación de resultados de dos pruebas (CPR).
CPR
INGE
+
97
35
132
+
-
16
164
180
113
199
312
ANEXO 11. Clasificación sanitaria de ELISA IDEXX-Pourquier (IDPOUQ) en relación a la
combinación de resultados de dos pruebas (CPR).
CPR
IDPOUQ
+
-
+
94
55
149
33
159
192
127
214
341
37
ANEXO 12. Curva operador receptor de ELISA IDEXX-Bommeli, INGEZIM e IDEXXPourquier, utilizando a inmunodifusión como referencia.
Sensitivity: Sensibilidad; Specificity: Especificidad; Cut off: Punto de corte; AUC: Área bajo
la curva
38
ANEXO 13. Curva operador receptor de ELISA IDEXX-Bommeli, INGEZIM e IDEXXPourquier, utilizando a PCR como referencia.
Sensitivity: Sensibilidad; Specificity: Especificidad; Cut off: Punto de corte; AUC: Área bajo
la curva
39
ANEXO 14. Curva operador receptor de ELISA IDEXX-Bommeli, INGEZIM e IDEXXPourquier, utilizando a la combinación de resultados de dos pruebas de referencia (ID + PCR).
Sensitivity: Sensibilidad; Specificity: Especificidad; Cut off: Punto de corte; AUC: Área bajo
la curva