S32 XLII Congreso Anual de la Agrupación Mexicana de la Hematología, A.C. V Congreso Iberoamericano de Medicina Transfusional. Reunión del Grupo Colaborativo Ibero Americano de Medicina Transfusional. 11-15 de Mayo de 2001, Mérida, Yucatán, México. Hematopoyesis y Biología Molecular. 060. EFECTO DE LA VD3, INF-γγ y PMA EN LA FAGOCITOSIS EN LlNEAS CELULARES MONOCÍTICAS. Morales-Ramírez E, Corona-Ortega T, Rangel-Corona R, Weiss-Steider B, Soto-Cruz I. Lab. de Oncología, U. Invest. en Dif. Celular y Cáncer, FES Zaragoza, UNAM. Apdo 9-020, México, D.F., México. sotocruz@servidor.unam.mx Durante el proceso de diferenciación celular, las células hematopoyéticas sufren una serie de cambios moleculares, bioquímicos y morfológicos que les permite realizar diversas funciones específicas. En particular, los macrófagos son células altamente especializadas y entre sus funciones mas importantes destacan la defensa del organismo contra cuerpos extraños y la secreción de factores que regulan diversas funciones fisiológicas. Para analizar el efecto de agentes diferenciadores como el interferón gama (INF-γ), la vitamina D3 (VD3) y el forbol-miristato- acetato (PMA) en el proceso de diferenciación de monocito a macrófago, se cultivaron las líneas monocíticas THP-1 y U-937 en presencia de VD3, IFN-γ y PMA así como una combinación de VD3 con los otros factores. La VD3 induce un aumento en la fagocitosis, así como adherencia y cambios morfológicos muy evidentes en las células U937, por el contrario, el efecto no es tan notable en las células THP-1. Cuando se usó una combinación de VD3 con IFN-γ ó con PMA hubo una inhibición de la fagocitosis inducida por la VD3 tanto en células U-937 como en células THP- 1. La Revista Biomédica adherencia y los cambios morfológicos no fueron tan evidentes como con la VD3 sola. Es importante evaluar el efecto de diferentes agentes diferenciadores para determinar su participación en los procesos de diferenciación celular y poder establecer un modelo in vitro para analizar la función de diversas moléculas de superficie celular, tal como los receptores para inmunoglobulinas en células diferenciadas y sin diferenciar. 061. LA CINASA SYK SE UNE A LA CADENA β DEL RECEPTOR DE ALTA AFINIDAD PARA IgE, FcεεRI, EN MASTOCITOS DE LA LÍNEA RBL-2H3. Soto1 1 Cruz I , Lara-Padilla M, Ortega-Soto E. Unidad de Inv. en Dif. Celular y Cáncer, FES Zaragoza; Inst. de Investigaciones Biomédicas, UNAM. México, D.F., México. sotocruz@servidor.unam.mx El FcεRI pertenece a la familia de receptores multicadena de inmunoreconocimiento (MIRR), cuyos miembros carecen de actividad intrínseca de cinasa. El FcεRI es una proteína tetramérica compuesta de una cadena α que une IgE, una cadena β y un homodímero de cadenas γ. La agregación del FcεRI es mastocitos y basófilos da como resultado la activación de proteínas tirosina cinasas de la familia Src y Syk. En el dominio citoplasmático de varias subunidades de los MIRR se encuentran los motivos conservados de activación basados en tirosina (ITAM, por Este suplemento esta disponible en http://www.uady.mx/~biomedic/rbs01124.pdf S33 XLII Congreso Nacional de Hematología: Hematopoyesis y Biología Molecular. sus siglas en inglés Immunoreceptor Tyrosine bases Activation Motif) que son fundamentales para la activación mediada por los receptores. El ITAM contiene un residuo de tirosina en dos secuencias canónicas YXX(L/I). Estas tirosinas fosforiladas sirven de punto de anclaje para proteínas que contienen dominios SH2, en particular la tirosina cinasa Syk, enzimas como la fosfolipasa C gama y proteínas adaptadoras tal como Vav, Crk y Grb-2, las cuales conectan a los receptores con varias vías metabólicas. Para investigar que proteínas están asociadas a los dominios ITAM de la cadena β del FcεRI, se utilizaron péptidos sintéticos biotinilados, que representan estos dominios, acoplados a Neutravidina. Los péptidos se incubaron con lisados de células RBL-2H3 y las proteínas unidas a los péptidos se separaron mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante inmunoblot utilizando anticuerpos anti-fosfotirosina y anticuerpos específicos para diferentes cinasas. Los resultados obtenidos muestran que la tirosina cinasa Syk se encuentra unida al péptido bifosforilado que representa el motivo ITAM de; la cadena β, tanto en células estimuladas como no estimuladas, sin embargo solamente en células estimuladas se encuentra Syk fosforilada. La cinasa Syk se une en menor medida a los péptidos monofosforilados, siendo al parecer la tirosina de la primer secuencia canónica más importante para la unión de esta cinasa. Además, por ensayos de cinasa in vitro se ha podido determinar que la cinasa es activa. Se ha reportado que esta cinasa está unida a la cadena γ, sin embargo nuestros resultados sugieren que la cinasa Syk se une también a la cadena β del receptor de alta afinidad para IgE lo cual indicaría que está interacción pudiera ser importante para iniciar la activación de otra vía que desencadene eventos nucleares, ya que a la cadena γ se unen proteínas diferentes a las encontradas I para la cadena β. 062. TRANSPORTE SELECTIVO DE CITOCINAS EN MACRÓFAGOS. Rangel R, Mendoza J, Soto I, Weiss 1 B, Ibañez M , Corona T. Lab. de Oncología, Unidad de Investigación en Diferenciación Celular y Cáncer, FESZaragoza, UNAM. Apartado Postal 9-020, México, 1 09000, D.F. Lab. de Biomembranas, ENCB, IPN, México, D.F., México. tcvaldes@servidor.unam.mx En la actualidad se están utilizando liposomas como acarreadores de diversas sustancias. Se ha probado en diversos estudios que su uso modifica la farmacocinética de las sustancias englobadas por estas partículas. El objetivo del presente trabajo fue determinar la carga eléctrica de los liposomas a utilizar para transportar, IL-1β e IFNγ. Por lo anterior, se utilizaron liposomas de diferentes composiciones lipídicas y de diferente carga eléctrica y se evaluó la acción de las citocinas sobre macrófagos peritoneales in vivo. Los resultados mostraron que cada citocina requiere una combinación diferente de lípidos para ser transportada de forma eficiente y para que pueda ejercer sus funciones. Asímismo, los resultados aportan evidencias de que los lípidos utilizados interactúan tanto con las citocinas en forma específica como con las membranas de las células utilizadas. Lo anterior abre la posibilidad del estudio más específico de la relación lípido-proteína en los liposomas y liposomas-.membranas celulares. Lo anterior puede ser de utilidad en la diferenciación de poblaciones celulares hematopoyéticas con fines terapéuticos. 063. IL-2 ENCAPSULADA EN LIPOSOMAS DISMINUYE SUS EFECTOS TÓXICOS in vitro. 1 Corona T, Mendoza J, Weiss B, Ibañez M , Soto I, Rangel R. Lab. de Oncología, Unidad de Investigación en Diferenciación Celular y Cáncer, FES-Zaragoza, UNAM. 1 Apartado Postal 9-020, México, 09000, D.F. Lab. de Biomembranas, ENCB, IPN, México, D.F., México. rancor@servidor.unam.mx Nuestro grupo de trabajo ha demostrado que las células de las líneas celulares CALO e INBL poseen receptores para IL-2 y que altas concentraciones de la citocina inhiben su proliferación. Desafortunadamente se conocen los efectos altamente tóxicos de la IL-2 libre. Por lo anterior, en el presente trabajo se utilizaron liposomas para encapsular a la citocina y evaluar su efecto sobre la proliferación de las líneas celulares mencionadas. Se prepararon liposomas con diferentes concentraciones de la citocina y de lípido y se probaron con las líneas celulares mencionadas. Los resultados mostraron que la IL-2 retiene su efecto antiproliferativo sobre las líneas celulares después de encapsularla en liposomas catiónicos, que puede reducirse drásticamente la concentración y que la cantidad de lípido utilizada es determinante para obtener una respuesta similar a la de la citocina libre. Lo anterior abre la posibilidad de utilizar estos liposomas para acarrear de forma eficiente y segura la citocina para una posible aplicación terapéutica de forma tópica. 064. EFECTO DEL CasNa EN LA PROLIFERACIÓN y VlABILILIAD DE CÉLULAS LEUCÉMICAS Y CÉLULAS MONONUCLEADAS DE MÉDULA ÓSEA. G. Ramos-Mandujano*, H. Lagunes-Servín, E. LedesmaMatínez, A. Galván-Ouintanilla, B. Weiss-Steider, E. Santiago-Osorio. FES-Zaragoza, UNAM, México, D.F., México. Vol. 12/Supl. 1/Mayo, 2001 S34 INTRODUCCIÓN. El caseinato de sadio (CasNa) ha sido usado como un agente quimiotáctico de neutrófilos y macrófagos, sin embargo en nuestro laboratorio se ha observado también reduce la proliferación a favor de la diferenciación de la línea celular progenitora rnieloide 32D. Falta conocer el efecto del CasNa en líneas leucémicas y en células rnieloides normales. OBJETIVO. El objetivo de este trabajo es ver el papel del CasNa en la proliferación y viabilidad en células mieloides leucémicas y células mononucleadas de médula ósea de ratón. MÉTODOS Y RESULTADOS. La línea leucémica mielomonocítica WEHI 3BD+ y células mononucleadas de médula ósea de ratones CD-1 semipurificadas con Ficoll 1.077 g/mL, al ser estimuladas con 0.5 mg/mL de interleucina 3 (IL-3) en presencia de varias dosis de CasNa, se encontró una reducción de la proliferación de células WEHI en forma dosis-dependiente. Por otro lado, la proliferación de células mononucleadas de médula es aumentada en presencia de CasNa. El bloqueo de la proliferación no es consecuencia de muerte celular ya que se encontró una viabilidad (evaluada por azul tripano) de más del 90%. DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN. Varios productos y péptidos derivados de la caseína han sido reportados que reducen la proliferación en líneas celulares tumorales y afectan varias funciones de linfocitos y neutrófilos. Sin embargo el papel de estos compuestos en células hematopoyéticas es poco conocida. Aquí aportamos las primeras evidencias que indican que la caseína tiene un efecto anti-proliferativo en células leucémicas, contrario al efecto observado en células mononucleadas de médula ósea. Lo que nos alienta a seguir con los estudios para proponer en un futuro un uso terapéutico de estos productos en padecimientos como la leucemia. Proyecto apoyado por DGAPA PAPIIT IN215199. *Becario de CONACyT y DEGEP UNAM 065. MECANISMOS DE AUTORREGULACIÓN DEL COMPLEJO SCF/C- KIT EN CÉLULAS NO HEMATOPOYÉTICAS. Alvarado-Moreno JA, RangelCorona R, Cáceres-Cortés JR. Unidad de Investigación en Diferenciación Celular y Cáncer, FES-Zaragoza. UNAM, México, D.F., México. Alvarado96@aol.com Los mecanismos fundamentales por los cuales las células inician los eventos de proliferación, diferenciación y maduración celular, están regulados por la unión de factores de crecimiento a receptores que presentan o no, actividad de tirosina cinasa (RTK). Tal es el caso del receptor para el factor de células totipotenciales (SCF) c-Kit, que pertenece a la familia de receptores con actividad intrínseca de cinasas, y que al estar en contacto con su ligando SCF Revista Biomédica activa numerosas vías de señalamiento que estimulan la supervivencia, proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas, melanocitos y células primordiales. Recientemente demostramos la expresión del receptor cKit, en la membrana de dos líneas celulares de carcinoma cervical; asimismo, observamos que la presencia de bajas concentraciones de SCF exógeno induce una respuesta proliferativa y un exceso la reprime. Por lo que en el presente trabajo se planteó la hipótesis de la expresión y síntesis del SCF endógeno, sugiriendo un mecanismo autócrino en dichas células. Se determinó mediante ensayos de ELISA, la presencia de SCF en el sobrenadante de ambas líneas celulares de carcinoma cervical. Por otro lado, se evaluó el efecto de anticuerpos neutralizantes específicos del SCF y del receptor c-Kit en la proliferación celular mediante la técnica de MTT, y se observó que éstos reducen la tasa de proliferación hasta en un 50%. Nuestros resultados demuestran que en las células no hematopoyéticas, se lleva a cabo un mecanismo de autorregulación semejante al dado por el complejo SCF/c-Kit, en células del linaje mieloide, el cual favorece la supervivencia y la proliferación celular; lo que sugiere que in vivo, este mecanismo podría estar asociado al incremento de la masa tumoral y posiblemente al proceso metastásico. 066. TRANSCRIPCIÓN DEL GENE PARA EL M-CSF EN LA LÍNEA CELULAR MIELOIDE 32D TRATADAS CON CasNa. González-Ramírez J, Ramos1 Mandujano G , Manrigue-Gutiérrez B, Weiss B, Santiago Osorio E. F.E.S. Zaragoza U.N.A.M. México, D.F., México. INTRODUCCIÓN. Recientemente reportamos que el caseinato de sodio (CasNa) promueve la diferenciación de la célula progenitora mieloide 32D hacia el linaje monocitomacrófago, además el sobrenadante del cultivo tiene una fuerte actividad hematopoyética, similar a la observada con el factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF). OBJETIVO. El presente estudio tiene como objetivo evaluar la presencia de ARNm para el M-CSF en las células 32D tratadas con CasNa. MÉTODO. Se realizaron extracciones del ARN total de las células 32D en presencia o ausencia de 2 mg/mL de CasNa y de las células L-929 (como control positivo) por el método de Chornzynski, después de su cuantificación por espectrofotometría se realizó una retrotranscripción ligada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) utilizando los oligonucleotidos ya reportados. RESULTADOS. La electroforesis del producto de la RTPCR indica que las células 32D ya expresan RNAm para el M-CSF, sin embargo en presencia de CasNa la transcripción se ve aumentada. S35 XLII Congreso Nacional de Hematología: Hematopoyesis y Biología Molecular. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES. El incremento del RNAm para M-CSF inducido por el CasNa en las células 32D, permiten proponer que el mecanismo de acción del CasNa es activando la producción de M-CSF y muy posiblemente la de su receptor en las células 32D, por tal motivo será muy interesante evaluar si este mecanismo se conserva en células leucémicas. 1 Proyecto apoyado por DGAPA PAPIIT IN215199. Becario de CONACyT y DGEP UNAM 067. SOBRE EXPRESIÓN DE CD 95 EN PACIENTES PEDIÁTRICOS CON ANEMIA APLÁSICA GRAVE. González-Labra MG, Mendoza-García E, CastroMussot ME, Jiménez-Hernández E, Vázquez-Meraz E. Hospital Infantil de México, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas IPN, México, D.F., México. INTRODUCCIÓN. La etiología de la anemia aplásica adquirida grave (AAAG) es desconocida y su consecuencia es fatal. Desde el punto de vista inmunológico se ha demostrado que hay ciertas citocinas como el IFN- y el TNFa que inducen sobre expresión de CD95(Apo-1/as) en células CD34+ que induce apoptosis, lo cual sugiere que esta sea una de las causas de la hipoplasia medular. MATERIAL Y MÉTODOS. En el Hospital Infantil de México se realizó el cultivo de células linfoides de médula ósea de siete niños con AAAG y el sobrenadante se incubó con células totipotenciales Cd34 + obtenidas de muestras de médula ósea de donadores sanos con determinación previa de CD95. Además se analizó las subpoblaciones linfoides de la médula ósea de los pacientes con AAAG. RESULTADOS. Se encontraron bajos porcentajes de linfocitos B (CDI9) y linfocitos T cooperadores (CD4) comparados con valores de médula ósea sana. En las células CD 34+ normales se incrementó 3.7 veces más la sobre expresión de CD95. CONCLUSIONES. De acuerdo a los resultados se demuestra que las células linfoides de la médula ósea de pacientes con AAAG liberan citocinas capaces de incrementar la expresión de CD95 en células totipotenciales CD34 + normales lo que induce apoptosis. 068. EL EFECTO DEL TNFα α SOBRE CÉLULAS CD34+ lin - DE PACIENTES CON SÍNDROME MIELODISPLÁSICO. Flores-Figueroa E1, GutiérrezEspíndola G 2 , Mayani H 1 . Laboratorio de Hematopoyesis, U.I.M.E.O. Hospital de Oncología 1, Servicio de Hematología. Hospital de Especialidades2. Centro Médico Siglo XXI. I.M.S.S., México, D.F., México. Diversos estudios han mostrado que en la médula ósea de pacientes con Síndrome Mielodisplásico (SMD) existe una alta tasa de proliferación celular, y un incremento en el número de células progenitoras inmaduras (CD34+), sin embargo éste incremento en la proliferación se ve abatido por un incremento en la muerte celular por apoptosis. Al parecer, ciertas moléculas inhibidoras - principalmente el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), son las responsables de provocar la muerte de las células hematopoyéticas. Se ha observado, que los niveles de TNFα en el suero de los pacientes, correlacionan inversamente con los factores pronósticos y la respuesta al tratamiento. Sin embargo hasta el momento no se ha establecido con claridad el efecto del TNFα in vitro sobre células progenitoras normales y de pacientes. En el presente estudio, se obtuvieron células CD34+ lin- mediante columnas inmunomagnéticas de 9 pacientes con SMD y 3 de individuos normales. Las subpoblaciones fueron cultivas en cultivos líquidos suplementados con 10ng/ml de: el factor de células seminales (SCF), interleucina 6 (IL-6), trombopoyetina (Tpo) y el ligando de FLT - 3, citocinas que favorecen la proliferación de las células CD34+. Se siguió la cinética de células hematopoyéticas y de progenitores por 21 días en presencia y ausencia del inhibidor TNFα (10ng/ml), así como se valoraron los niveles de apoptosis de éstas células en día 7. En células CD34+ lin- normales se observó que el TNFα afectó considerablemente la cinética de células hematopoyéticas desde la segunda semana de cultivo, observándose un decremento celular muy amplio al día 21. El TNFα también afectó la cinética de las células de pacientes, sin embargo al parecer el número celular se mantuvo a lo largo del cultivo, no encontrándose ni un aumento ni una disminución en la cinética hasta el día 21. Al día 7 del cultivo, encontramos que los progenitores normales disminuyeron considerablemente, mientras que al parecer los progenitores de pacientes no se vieron afectados. Al día 7 se encontró un aumento en los niveles de apoptosis de la población de células hematopoyéticas de pacientes al ser cultivadas en presencia de citocinas y el inhibidor, este efecto no se encontró en células normales. Estos resultados sugieren que las células CD34+ de pacientes son menos susceptibles a morir por apoptosis, pero que al madurar (a un estadio de precursor), se vuelven más susceptibles al TNFα, lo que al parecer les produce apoptosis, y les impide madurar y salir a circulación. 069. PROLIFERACIÓN Y EXPANSIÓN DE CELULAS PROGENITORAS HEMATOPOYETICAS PROVENIENTES DE PACIENTES CON LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA. Montesinos-Montesinos JJ1 , Sánchez-Valle E 2 , Mayani H 1. Laboratorio de Hematopoyesis, U.I.M.E.O. Hospital de Oncología 1, Vol. 12/Supl. 1/Mayo, 2001 S36 Servicio de Hematología. Hospital de Especialidades2. Centro Médico Siglo XXI. I.M.S.S., México, D.F., México. La leucemia mieloide aguda (LMA) se caracteriza por la presencia en médula ósea y sangre periférica de células hematopoyéticas que presentan alteraciones en la proliferación y diferenciación. En la LMA se ha demostrado que existe una jerarquía de células progenitoras leucémicas similar a la observada en la hematopoyesis normal. Se ha establecido que dichas células definen subpoblaciones con características fenotípicas diferentes y algunas de ellas con la capacidad de mantener la hematopoyesis maligna a largo plazo. Así, aunque se han identificado distintas subpoblaciones de células leucémicas, aún se desconocen muchas de sus características biológicas. En el presente trabajo se determinaron las cinéticas de proliferación (definida por el número total de células producidas) y expansión (definida por la producción de células formadoras de colonias) de células progenitoras hematopoyéticas (CPH) CD34+1in-, provenientes de 12 pacientes con LMA y de 3 donadores sanos. Se utilizó un sistema inmunomagnético de separación para la obtención de la subpoblación celular y se realizaron cultivos líquidos en presencia de diferentes combinaciones de citocinas recombinantes. Se evaluaron cinco combinaciones: a) en ausencia de citocinas, b) SCF + IL-6 (cóctel básico), c) SCF + lL-6 + GM-CSF + G-CSF (cóctel mieloide), d) SCF + IL-6 + EPO + IL-3 (cóctel eritroide) y e) todas las citocinas (cóctel mixto). Los resultados indican que en ausencia de citocinas las células de los donadores normales alcanzaron un incremento de 1.71 veces su número inicial al día 10 de cultivo; en contraste las células de los pacientes disminuyeron en número hasta en un 98% al día 20. Asimismo en el cóctel básico se observó un incremento de 6.82 veces al día 10 en los donadores normales, mientras que en los pacientes no hubo proliferación. Tanto en los cultivos de los donadores sanos como en los de pacientes, no se observaron incrementos en el número de CPH en los dos cócteles estudiados. Por su parte en presencia de los cócteles mieloide, eritroide y mixto, se observó un aumento considerable en la proliferación de las células de los donadores normales, dado que los máximos incrementos observados fueron de 219,88 y 281 veces para cada cóctel respectivamente (día 20). Bajo estas mismas condiciones también se observó proliferación en las células de los pacientes, sin embargo el máximo incremento fue de tan solo 2.51 veces con el cóctel mixto (día 10). No se observó expansión de CPH en ninguna de las condiciones analizadas para los donadores normales, no obstante el número de progenitores se mantuvo constante en presencia del cóctel mixto. En los cultivos de los pacientes se observó una disminución en el número de CPH con respecto a los donadores sanos y en algunos casos no se detectaron Revista Biomédica progenitores. Nuestros resultados indican que existe una disminución en el potencial proliferativo y de expansión de la subpoblación CD34+lin- de pacientes con LMA en comparación con las células de donadores normales. 070. EFECTO DE DISTINTAS COMBINACIONES DE CITOCINAS EN LA PROLIFERACIÓN Y EXPANSlÓN DE CÉLULAS CD34+ LIN- DE SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL EN MEDIO LIBRE DE SUERO. Flores-Guzmán P, Mayani H. Laboratorio de Hematopoyesis, UIMEO, Hospital de Oncología, C.M.N. Siglo XXI. México, D.F., México. En la sangre de cordón umbilical (SCU) ha sido demostrada la presencia de células progenitoras hematopoyéticas (CPH) incluidas en la subpoblación CD34+lin-, la cual ha sido estudiada en los últimos años con la finalidad de conseguir su expansión in vitro enfocada para su uso en la clínica. El objetivo del presente trabajo fue analizar la respuesta de células CD34+lin- de SCU in vitro en presencia de determinadas combinaciones de citocinas para contribuir en el conocimiento de su biología. Para ello, células CD34+lin- fueron enriquecidas a partir de células mononucleares de sangre de cordón umbilical y cultivadas en medio libre de suero con las siguientes combinaciones de citocinas: a) ausencia de citocinas (control); b) una combinación que incluye citocinas que han sido implicadas en la expansión de CPH (cóctel seminal: SCF, IL-6, TPO, FL); y c) una combinación que presenta tanto citocinas involucradas en la expansión de CPH, como en su diferenciación (cóctel mixto: SCF, IL-6, TPO, FL, IL-3, EPO, G-CSF, GM-CSF). La proliferación y expansión de las células CD34+1in- fue monitoreada cada 5 días, la primera por conteo celular y la segunda por la capacidad de formar colonias sobre metilcelulosa. Se encontró que las células CD34+1in- sembradas en ausencia de citocinas son incapaces de mantenerse, declinando los cultivos desde los primeros 5 días, mientras que en presencia del cóctel seminal y mixto las células alcanzan un pico máximo de proliferación al día 15 de cultivo (26 veces y 1102 veces, respectivamente). Por otra parte, encontramos un incremento de 1.7 veces para el cóctel seminal y de 6.6 veces para el cóctel mixto en colonias totales. Este incremento fue principalmente en colonias mieloides, donde fue de 5 y 21 veces para el cóctel seminal y mixto, respectivamente, al día 10 de cultivo. Este trabajo aporta datos sobre la plasticidad de la respuesta de las CPH, donde se observa que su velocidad de respuesta a diferenciarse, proliferar y/o expandirse, frente a los diferentes estímulos que las rodean va a depender de la naturaleza de dichos estímulos; así, en presencia del cóctel mixto que las induce a proliferar a niveles muy superiores que con un cóctel S37 XLII Congreso Nacional de Hematología: Hematopoyesis y Biología Molecular. seminal, la velocidad de respuesta es mayor que en presencia de una combinación que las ayude a mantener su capacidad de CPH, con una tasa de proliferación y expansión mucho menor. 071. PRODUCCIÓN DE FACTOR DE NECROSIS TUMORAL-ALFA EN CULTIVOS A LARGO PLAZO DE MÉDULA ÓSEA DE PACIENTES CON ANEMIA APLASTICA. Martínez-Jaramillo G, Flores-Figueroa E, Sánchez-Valle E, Gómez-Morales E, Mayani H. UIM Enfermedades Oncológicas, Centro Médico Nacional "Siglo XXI", Instituto Mexicano del Seguro Social. México, D.F., México. La anemia aplástica (AA) se caracteriza por una inhibición de la hematopoyesis, lo que conduce a una producción deficiente de células sanguíneas (pancitopenia en circulación). A nivel de médula ósea se ha observado una disminución muy marcada en el número de progenitores hematopoyéticos, así como un incremento en los niveles de apoptosis (muerte celular programada). Existen algunas moléculas inhibidoras de la hematopoyesis que promueven la apoptosis, siendo el factor de necrosis tumoral (TNF), una de ellas. En el presente estudio, hemos analizado la producción de TNF en cultivos a largo plazo tipo "Dexter" de médula ósea, tanto de sujetos normales como de pacientes con AA, y hemos caracterizado el efecto del factor estimulador de granulocitos y monocitos (GM-CSF) sobre los niveles de TNF. En cultivos de sujetos normales, los niveles de TNF fueron extremadamente bajos (<7 pg/ml) después de 5 semanas de cultivo. En cultivos de pacientes con AA los niveles se incrementaron aproximadamente 7 veces (49 pg/ml), mientras que en cultivos de AA tratados con GM-CSF, los niveles de TNF fueron todavía mayores (135 pg/ml). Nuestros resultados demuestran que existe una relación inversa entre los niveles de TNF y la actividad hematopoyética en cultivos de médula ósea de pacientes con AA. En base a estos datos y al hecho de que TNF es un potente inductor de la apoptosis en progenitores hematopoyéticos, es razonable sugerir que este factor está implicado en la patofisiología de la AA. Por otra parte, estos resultados explican la inhibición de la hematopoyesis observada en este tipo de cultivos, cuando son tratados en forma continua con GM-CSF (Martínez-Jaramillo, et al. Am J Hematol 61:107-114; 1999). 072. APOPTOSIS, DIFERENCIACION CELULAR Y EXPRESION DE p53 EN ESTUDIOS IN VITRO EN CÉLULAS LEUCEMICAS MILOIDES Y EN CONTROLES NORMALES TRATADAS CON TRIOXIDO DE ARSENICO. Mejía-Domínguez AM, Salazar AM, Sordo M, Ostrosky P. Hospital Infantil de México "Federico Gómez" e Instituto de Investigaciones Biomédicas UNAM, México, D.F., México. INTRODUCCIÓN. Investigaciones recientes describen que el arsénico tiene efectos sobre la cinética celular y que en estas funciones existen muchos genes involucrados, señalando a la proteína p53 que interrrelaciona para la reparación del ADN si éste ha sido dañado, enviando a la célula a un arresto ó bién enviándola a apoptósis, en estudios previos hemos referido que el trióxido de arsénico a diferentes concentraciones modula el ciclo celular. OBJETIVO. Estudiar y analizar los efectos de tres diferentes concentraciones del trióxido de arsénico en el ciclo celular, tanto de células leucémicas mieloides y linfocitos normales. MATERIAL Y MÉTODO. Células mononucleares, obtenidas de sangre periférica tanto de pacientes con leucemias mieloides de novo, así cómo controles de individuos clínicamente sanos. Estudio de cinética celular y p53 tratados con trióxido de arsénico a 0.1,1.0 y 10.0 mM. RESULTADOS. En 15/20 cultivos evaluados de cada grupo se revisó la cinética celular observando diferencias en la cinética en caso de las células leucémicas a la dosis de 1.0 mM en cuanto a la diferenciación y cambios sugestivos de apoptósis a la concentración de 10.0 correlacionando con la expresión de p53, la banda se hace evidente a la 1.0 mM y desaparece a la dosis de 10.0 mM. CONCLUSIONES: 1.- La apoptósis (fragmentación nuclear y cuerpos apopóticos) observada en la cinética fue evidente en las células leucémicas tratadas a la dosis de 10.0 MM de tri+óxido de arsénico. 2.- La citodiferenciación se detecta a 1.0 mM de trióxido de arsénico, así mismo la observación de la diferenciación es incompleta. 3.- Sobre-expresión de p53 a la concentración de 1.0 mM de trióxido de arsénico en células leucémicas. 4.- La aplicación clínica del trióxido de arsénico en leucemias mieloides con dosis entre 1.0 mM. 073. DETERMINACIÓN DE APOPTOSIS, BCL-2 Y P53 EN PACIENTES CON LEUCEMIA AGUDA. León-Castañón MI, Reyes-Maldonado E, Moreno-Lafont M, Godines-Quezada R. Instituto Politécnico Nacional. Instituto Mexicano del Seguro Social S. XXI. México, D.F., México. La pérdida del gen supresor de tumores p53 participa en la desregulación del gen bcl-2 cuya función es la de contrarrestar la tendencia natural de la apoptosis, Vol. 12/Supl. 1/Mayo, 2001 S38 manteniendo el tumor en crecimiento. Con el fin de determinar la expresión de apoptosis, Bcl-2 y p53 en pacientes con leucemias agudas, por medio de citometría de flujo, se estudiaron 23 casos con leucemia aguda, clasificados de la siguiente manera; 8 pacientes con LAM de novo, 8 LAL de novo, 7 LAL en recaída y 36 individuos sanos como testigos, para lo cual se obtuvieron 5 mL de sangre periférica con EDTA; para cada determinación de Bcl-2, p53 y apoptosis se preparó una suspensión que contenía 1 x 106 células blancas, se adicionó el anticuerpo específico conjugado con FITC (anti-Bcl-2, anti-p53), y para determinar apoptosis se utilizó yoduro de propidio, para posteriormente ser analizados por citometría de flujo. Los individuos sanos presentaron un IFM para Bcl-2=13.25, p53= 6.57, apoptosis=0.39; en los pacientes de LAM de novo Bcl-2=34.12, p53=6.78, apoptosis=l.46; LAL de novo Bcl-2 = 30.99, p53= 6.70, apoptosis= 3.36; LAL en recaída Bcl-2= 41.24, p53=7.33, apoptosis=1.98. La IFM de Bcl-2 y apoptosis respecto a los donadores sanos fue diferente (p<0.05), para p53 no se obtuvo diferencia. Existe diferencia de expresión de Bcl-2 y apoptosis en los tres estadios de la enfermedad, por lo que indica que hay una mayor proliferación celular tanto en condiciones normales como en la enfermedad. 074. FRECUENCIA DEL REARREGLO Bcl-2 EN LINFOCITOS DE SANGRE PERIFERICA EN INDIVIDUOS SANOS (DONADORES DE SANGRE). Mejía-Domínguez AM, Salazar AM. Hospital Infantil de México "Federico Gómez" Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM, México, D.F., México. INTRODUCCIÓN. Estudios epidemiológicos han referido un aumento en la incidencia de Linfoma no Hodgkin y que lo asocian a personas que han estado en contacto con pesticidas, así cómo a fumadores y del sexo masculino, así cómo la demostración de la translocación (14;18) y el rearreglo MBR (Bcl-2) en estudio molecular en linfocitos de sangre periférica. Por lo que el objetivo del estudio fue estudiar la frecuencia de éste rearreglo por biología molecular (PCR) en linfocitos de sangre periférica en individuos sanos (Donadores de sangre), en fumadores y no fumadores. MATERIAL Y MÉTODO. El grupo se integro con 120 donadores de sangre: 60 fumadores y 60 no fumadores con estudio por (PCR) de Bcl-2 en linfocitos de sangre periférica. RESULTADOS. La frecuencia de MBR (Bcl-2) fue de 15.6% en fumadores y de 18.8% en no fumadores. Sin embargo la frecuencia de las células con el rrearreglo MBR (Bcl-2) fue de <2.30 a 17.03 X 10 (-7) para individuos no fumadores y de < 4.77 a > 92.42 X 10 (- 7) para los Revista Biomédica individuos fumadores, no se encontró diferencia significativa (p 0. 8625), se observó una correlación entre la edad y la presencia del rrearreglo (Bcl-2). CONCLUSIONES. Hasta el momento se podría considerar que a los individuos con la presencia del rrearreglo el beneficio de que continúen en vigilancia periódica y tratar de detectar si evolucionan a algún tipo de malignidad cómo se ha relacionado con el Linfoma no Hodgkin. 075. HETEROCIGOCIDAD DE LA REGIÓN HIPERVARIABLE DXS255, CON LOCUS EN EL CROMOSOMA X, EN MUJERES MEXICANAS SANAS. ANÁLISIS MEDIANTE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN DE LONGITUD POLIMÓRFICA β. Velázquez-González (RFLPs) CON LA SONDA M27β. A, Sandria Madrigal CL, Cerezo-González RM, GorianLemus C, Olmedo-Vasquez LO, Herrera-Marquez A. Laboratorio de Biología Molecular. Departamento de Hematología y Oncología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán. México, D.F., México. INTRODUCCIÓN. Lyon en su teoría de la inactivación del cromosoma X postuló, que todo mamífero femenino presenta un mosaico de células somáticas que resulta de la inactivación de uno de los cromosomas X y activación del otro; fenómeno que ocurre en etapas tempranas del desarrollo embrionario con el fin de compensar las dosis de expresión de los genes de ambos cromosomas. Este concepto se ha explotado para el estudio de la clonalidad de diversos tumores y enfermedades del humano. El análisis electroforético de las isoenzimas de la G-6-P-D fue uno de los primeros métodos para el estudio de la clonalidad de neoplasias hematológicas. Una limitación de éste, es la baja frecuencia de heterocigocidad de la enzima en la población femenina blanca. Recientemente la identificación de heterocigocidad, mediante el análisis de RFLP’s de genes con loci en el cromosoma X (v.gr.: hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRT), fosfoglicerato cinasa (PGK), y la región hipervariable [RH] DXS255) y el uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación del DNA, han permitido extender los estudios de clonalidad en diversas poblaciones femeninas. Empero, la capacidad informativa que ofrece el estudio de los tres primeros genes mencionados, indica un índice de heterocigocidad bajo con relación a la ofrecida por el análisis de la RH-DXS255. El estudio de esta región permite conocer la clase de clonalidad de las neoplasias en la mayor parte de las mujeres estudiadas. La capacidad informativa de heterocigocidad de DXS255 podría ser exclusiva de poblaciones caucásicas y por lo tanto poco definitorio de clonalidad en otras poblaciones. Por lo anterior se decidió estudiar la capacidad informativa de S39 XLII Congreso Nacional de Hematología: Hematopoyesis y Biología Molecular. heterocigocidad de la RH- DXS255 en mujeres mexicanas sanas. MATERIAL y MÉTODOS. Se estudiaron 300 mujeres mexicanas sanas. De 30 ml de sangre periférica con ACD se obtuvieron las células mononucleares por gradiente de Ficoll-Hipaque. De estas células se extrajo y purificó DNA de alto peso molecular; se digirió con la enzima de restricción Pst I; se sometió a electroforésis en geles de agarosa al 0.8% a voltajes y tiempos variados; se transfirió a filtros de nitrocelulosa nylon; se prehibridó por 24 h/42°C (Formamida 50%, Denhart’s 5X, SSPE 5X, SDS 0.1%, DNA esperma de salmón 200µg/ml) y se hibridó en la misma solución por 48 h/42°C con la sonda M27 β, marcada con 32P, que reconoce secuencias de la RH- DXS255. Los filtros fueron lavados en condiciones de alto rigor (SSC 0.1X + SDS 0.1%, 56°C) y expuestos a autorradiografía a -70ºC por tiempos variados. RESULTADOS. De las 300 mujeres estudiadas se obtuvo información en 218. De éstas, 123 mujeres (56.4%) resultaron heterocigotas y 95 (43.58%) homocigotas. En los primeros 90 casos se obtuvo una capacidad informativa de heterocigocidad del 35.55% (32 casos). Al modificar, en 91 casos, las condiciones electroforéticas se incremento la capacidad informativa al 71.0%. DISCUSIÓN. La capacidad informativa del estudio de la RH-DXS255 en mujeres mexicanas normales está por arriba del 50%. Al modificar las condiciones de la electrofóresis (más tiempo y mayor voltaje) se obtienen índices de información semejante a la población caucásica. El estudio del locus DXS255 parecería de mayor utilidad que el análisis de los genes HPRT y PGK Queda por definir en las mujeres heterocigotas el grado de Iyonización de la población mexicana y estudiar la clase de clonalidad de diferentes padecimientos hematológicos. Apoyado por CONACyT 5074-M 076. DETERMINACIÓN DEL GENOTIPO CCR5 EN PERSONAS CON Y SIN INFECCIÓN POR EL VIH-1 EN YUCATÁN, MEXICO. Valadez-González N, Góngora-Biachi RA, González-Martínez P, VeraGamboa L, Lara-Perera D, Castro-Sansores C. Centro de Investigaciones Regionales “Dr. Hideyo Noguchi” Universidad Autónoma de Yucatán. Mérida, Yucatán, México. OBJETIVO. El gen estructural CKR5 codifica para el receptor CCR5 que actúa como correceptor para la entrada del VIH-1 a las células. Se ha reportado que la deleción homocigota de 32pb (∆32) confiere resistencia contra la infección con el virus, mientras que la forma heterocigota no previene la infección pero se ha asociado con progresión lenta de la enfermedad. En Yucatán se desconoce la frecuencia de la deleción del gen CCR5. Por ello este estudio determinó el genotipo CCR5 en personas con y sin infección con el VIH-1, usuarias del Laboratorio de Hematología del CIR/UADY. MATERIAL Y MÉTODOS. Se analizaron 86 muestras de las cuales 50 corresponden a personas infectadas con el VIH y 36 personas seronegativas con exposición repetida al VIH. El grupo de personas infectadas se subdividió en: a) No progresores (NP) n=4, b) Progresores lentos PL) n=9, y c) Progresores normales (PN) n=37. Se extrajo DNA de CMP’s y se realizó PCR con los iniciadores CCR5 R y CCR5 F que amplifican un fragmento de 184 pb para el alelo normal y 152 pb para el alelo deletado. Los productos de PCR se visualizaron mediante PAGE con tinción de nitrato de plata. Para asignar genotipo se consideró homocigoto normal w/w si se observó 1 banda de 184 pb, genotipo ∆32/32 con una banda de 152 pb y heterocigoto w/∆32 por la presencia de 2 bandas 184 y 152 pb. RESULTADOS. Se observó una frecuencia de 2/4 (50%) heterocigotos w/∆32 en el subgrupo de NP y 3/9 (33.33%) en el de PL. En el grupo de seronegativos 1/36 (2.77%) fue heterocigoto. Todas las muestras restantes correspondieron al genotipo homocigoto normal w/w. Ninguna muestra fue del genotipo homocigoto ∆32/∆32. Al comparar los subgrupos de NP y PL con el de PN se encontró que la frecuencia de la deleción en ambos subgrupos es significativamente mayor que en el grupo de PN ( p= 0.0073 y p= 0.005). Al comparar el grupo de infectados con el de seronegativos no se encontraron diferencias significativas (p= 0.3937). CONCLUSIONES. La deleción ∆32 del gen CCR5 está presente en la población mestiza del estado de Yucatán, México. La frecuencia de la deleción es mayor en los subgrupos de NP y PL lo cual confirma los reportes de la literatura de que se asocia a retraso de la progresión y en este grupo podría estar participando en la no progresión de la enfermedad. La frecuencia muy baja en el grupo de seronegativos con exposición repetida al VIH, nos sugiere que otros factores diferentes de esta mutación están participando en la protección contra la infección en este grupo de personas. 077. IDENTIFICACIÓN DE ALTERACIONES NUMÉRICAS Y DE LA FUSIÓN BCR/ABL EN PACIENTES ADULTOS CON LEUCEMIA AGUDA LINFOBLÁSTICA. Sierra-Martínez M 1., Cruz R. J2., Pérez-Vera S.P 3 ., García G. M 4., Vergara M. D1 ., 1 Servicio de Genética Unidad de Investigación, 2Servicio de Hematología del Hospital Juárez de México SSA, 3 Servicio de Genética, Instituto Nacional de Pediatría, 4 DINO IMSS. México, D.F., México. Vol. 12/Supl. 1/Mayo, 2001 S40 INTRODUCCIÓN. El estudio citogenético en las leucemias agudas linfoblásticas (LAL ) es fundamental para el pronóstico y el asesoramiento terapéutico, ya que proporciona marcadores que se pueden evaluar durante la evolución de la enfermedad. Pero cuando por razones técnicas o del propio padecimiento no es posible obtener material de estudio de buena calidad, se ha desarrollado un método alternativo en estos casos que es la hibridación in situ con fluorescencia (FISH), ya que nos permite evaluar alteraciones numéricas y estructurales en miles de células en interfase (Secker-Walker, 1990; Walters et al., 1990; Harris, 1992, Moorman et al., 1996). OBJETIVO. Detectar alteraciones numéricas y la t(9;22) en pacientes adultos con LAL por medio FISH en núcleos en interfase. MATERIAL Y MÉTODO. Se estudiaron a 25 pacientes con diagnóstico de LAL, basado en los criterios propuestos por el grupo FAB de los subtipos L1 y L2, que acudieron al Servicio de Hematología del Hospital Juárez de México de 1996 al 2000. Sin resultado citogenético, el rango de edad fue de 18-52 años, el 60%masculino/40%Femeninos; se captaron al momento del diagnóstico y vírgenes de tratamiento. Se realizó la técnica de FISH, utilizando las sondas DNA α-satélite (centroméricas) de los cromosomas 8 y 18, y la secuencia única (21q22.13-q22.2) del cromosoma 21. Para la identificación de la t(9;22) se utilizó la secuencia única de los genes bcr y abl, analizándose simultáneamente los dos puntos de ruptura mayor M-bcr y menor m-bcr (Vysis, Downers, Grove lL,USA). RESULTADOS. La frecuencia de Alteraciones Numéricas observadas fue del 32% (8/25), la hiperdiploidía correspondió al % (6/25) y la hipodiploidía al 8% (2/25). La fusión génica BCR/ABL fue del 16%, el 75% se encontró con rompimiento M-bcr y solo el 15% fue m-bcr. El Ph+ se asoció con alteraciones numéricas en el 75% de los casos. CONCLUSIONES. Se puede detectar alteraciones numéricas y estructurales por medio de esta metodología hasta un 50%. La frecuencia de hiperdiploidía y de la fusión génica BCR/ABL son semejantes a los reportes de la literatura. 078. DETECCIÓN, EVOLUCIÓN Y COMPARACIÓN DE MONOCLONAS EN MÉDULA ÓSEA Y SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON DESÓRDENES LINFOPROLIFERATIVOS DE CÉLULAS B. Leal E, Jaloma AR, Aguilar C 1, López B 1, Esparza M1, Aguilar L 1, Galarza M1, Medina C, Barros-Núñez P. División de Genética- CIBO. Dep. de Hematología-CMNO1. IMSS. Guadalajara, Jalisco, México. OBJETIVOS. Detectar, comparar y hacer el seguimiento de monoclonas en médula ósea (MO) y sangre periférica Revista Biomédica (SP) de pacientes con desórdenes linfoproliferativos de células B. MATERIAL Y MÉTODOS. Amplificación de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas, como marcador de clonalidad, mediante PCR- nested en MO y SP. Electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con nitrato de plata. RESULTADOS. En todos los 114 pacientes, captados en un lapso de 18 meses, pudimos amplificar y visualizar la región CDR3. De los 77 pacientes en los que obtuvimos muestras pretratamiento de MO y SP, 70 (91%) mostraron resultados concordantes. Al final del tratamiento de inducción, 19 de 21 pacientes también mostraron concordancia entre MO y SP. En el 58% de los casos las monoclonas persistieron parcial o totalmente al final del tratamiento de inducción. CONCLUSIONES. La detección de monoclonas, mediante la amplificación de CDR3 en muestras de SP, puede lograrse con una sensibilidad de 92.8% y una especificidad de 85.7% en comparación con MO. El diagnóstico molecular en sangre periférica evitará las incomodidas y molestias de la biopsia de médula ósea, además de permitir un monitoreo más frecuente. 079. CARACTERIZACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR EuHe EN ENFERMEDAD DE HODGKIN. POSIBILIDADES DE TERAPIA GÉNICA. Gutiérrez RM 1, López ME 1, Martínez TA1, Montesinos MJ1, Pérez P 2, García-Carrancá A3, Zentella DA 4, Miranda PE 1. 1 Laboratorio de Investigación Servicio de Hematología, Hospital General de México, O.D. 2Departamento de Genética INP. 3IIBM-UNAM, 4IFC-UNAM, México, D.F., México. INTRODUCCIÓN. Como parte del proyecto CONACyT 0926PH "Participación del oncogen c-myc en linfomas" . se ha caracterizado la línea celular de la paciente E.H. fem. de 15 años con diagnóstico de Enfermedad de Hodgkin (EH). MATERIAL Y MÉTODOS. El 30/03/97 de la biopsia de ganglio cervical derecho se obtuvo el tejido, las células fueron disgregadas y sometidas a cultivo con técnica convencional. Obtenida la línea se observó la morfología celular, se realizaron: citoquímica, inmunofenotipo, citogenética, se midió el tiempo de duplicación de las células por citometría de flujo, eficiencia de clonación en agar suave, capacidad tumorigénica inyectando 1x106 cel. a ratones atimicos, se buscó la expresión del oncogén c-myc mediante RT-PCR y Western-Blot así como la secuenciación automática para ver el sitio de las mutaciones. Como control se valoró la línea celular Raji (linfoma de Burkitt). S41 XLII Congreso Nacional de Hematología: Hematopoyesis y Biología Molecular. RESULTADOS. Histopatológicamente resultó EH var. Celularidad mixta. La línea celular se denominó EuHe y persiste hasta la fecha, morfológicamente se encontraron células de Hodgkin de Reed-Sternberg y otras. Citoquímica PAS+, SN-, Esterasa-, Inmunofenotipo CD20+, CD19+, CD30 dudoso, CD10-, CD3-, CD8-, CD13-, CD33-, Ia-, Pendiente CD15. El tiempo de duplicaci6n de las células 16h, su eficiencia de clonación en agar suave 60%, la inyección de células a ratones NHI Swiss y NCr desarrolló tumores, el cariotipo fue complejo, hiperdiploide y abundantes trisomias. En la Rt-PCR hubo sobrexpresión de c-myc y en la secuenciación se encontraron mutaciones en el exon 2. DISCUSIÓN. Actualmente estamos tratando de transfectar c-myc normal a la línea EuHe para ver si hay cambios en la celularidad y volver a producir tumores en los ratones atimicos e inyectarlos con células que lleven c-myc normal transfectado para ver si hay regresión tumoral. A la fecha la paciente sobrevive, está en remisión completa. La patente de la línea EuHe está en trámite. Vol. 12/Supl. 1/Mayo, 2001