Argyrosomus regius - Universidad de Granada

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UNIVERSIDAD DE GRANADA
FACULTAD DE CIENCIAS
Departamento de Zoología
INVESTIGACIONES APLICABLES AL
DESARROLLO DE LA PRODUCCIÓN
INTENSIVA DE CORVINA
(ARGYROSOMUS REGIUS)
SERGIO GARCÍA MESA
TESIS DOCTORAL
GRANADA, 2012
Editor: Editorial de la Universidad de Granada
Autor: Sergio García Mesa
D.L.: GR 754-2013
ISBN: 978-84-9028-422-3
INVESTIGACIONES APLICABLES AL DESARROLLO DE
LA PRODUCCIÓN INTENSIVA DE CORVINA
(Argyrosomus regius)
Memoria para optar al grado de Doctor por el Licenciado en Biología
D. Sergio García Mesa
Prof. D. Manuel García Gallego
Prof. D. Mª Dolores Suárez
Medina
ASPIRANTE
Sergio García Mesa
Los trabajos de investigación que se rocegen en la presente memoria de
Tesis Doctoral han sido realizados en la Unidad de Fisiología Animal del
Departamento de Zoología de la Universidad de Granada y el
Departamento de Biología Aplicada de la Universidad de Almería, a partir
de animales suministrados por una empresa privada, Ceutamar, S.L. y el
centro IFAPA “El Toruño”, Puerto de Santa María, Cádiz.
Parte de los resultados de esta Tesis Doctoral se han presentado en
diferentes congresos nacinales e internacionales:
- 7th Euro Fed Lipid Congress. Lipids, Fats and Oils. Graz, Austria, 1821 octubre 2009.
- XII Congreso Nacional de Acuicultura. Madrid, 24-26 noviembre
2009.
- 9th International on the Biology of Fish. Barcelona, 5-9 julio 2010.
- XIII Foros dos Recursos Mariño e da Acuicultura das Ría Galegas.
Pontevedra, 7-8 octube 2010.
- XIII Congreso Nacional de Acuicultura. Barcelona, 21-24 nociembre
2011.
Indice
0.OBJETIVO………………………………………………………...……1
I. INTRODUCCIÓN.
I.1. BIOLOGÍA Y CULTIVO DE LA CORVINA. ......................................... 5
I.1.1. ASPECTOS GENERALES. ..................................................................................... 5
I.1.2. PRODUCCIÓN.................................................................................................. 9
I.1.3. ESTUDIOS Y CRÍA EN CAUTIVIDAD. .................................................................... 10
I.1.4. COMERCIALIZACIÓN Y CONSUMO ..................................................................... 15
I.2. ESTRATEGIAS ALIMENTARIAS. .................................................... 15
I.2.1. DETERMINACIÓN DEL TAMAÑO DE RACIÓN ÓPTIMO. ........................................... 16
I.2.2. DETERMINACIÓN DE LA FRECUENCIA ALIMENTARIA ÓPTIMA. ................................. 18
I.3. ASPECTOS DE FISIOLOGÍA DIGESTIVA. ...................................... 21
I.3.1. EL TRACTO DIGESTIVO .................................................................................... 21
I.3.2. ENZIMAS DIGESTIVAS ..................................................................................... 22
I.4. METABOLISMO INTERMEDIARIO EN PECES ............................... 27
I.4.1. METABOLISMO HEPÁTICO ............................................................................... 27
I.4.2. METABOLISMO MUSCULAR ............................................................................. 36
I.5. ESTRÉS OXIDATIVO. ..................................................................... 37
I.5.1. ASPECTOS GENERALES DEL ESTRÉS OXIDATIVO. ................................................... 37
I.5.2. RADICALES LIBRES .......................................................................................... 38
I.5.3. ORIGEN DE LOS RADICALES LIBRES. ................................................................... 40
I.5.4. MECANISMOS DE DEFENSAS ANTIOXIDANTES...................................................... 40
I.5.5. DAÑOS OXIDATIVOS CAUSADOS A BIOMOLÉCULAS. .............................................. 44
I.5.5. IMPLICACIONES DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN EL CULTIVO DE PECES. ........................... 46
I.6. CALIDAD DE MÚSCULO ................................................................. 46
I.6.1. CONCEPTO DE CALIDAD EN PECES. .................................................................... 46
I.6.2. CALIDAD NUTRICIONAL. .................................................................................. 47
I.6.3. TEXTURA. ..................................................................................................... 48
I.6.4. PROTEOLISIS MUSCULAR. ................................................................................ 50
II.1. SEGUIMIENTO TÉCNICO DE LA FASE INICIAL DE UN
CULTIVO EXPERIMENTAL DE CRÍA INTENSIVA DE CORVINA
(ARGYROSOMUS REGIUS, Asso 1801) EN JAULAS
FLOTANTES.
II.1.1 INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS.................................................... 53
I
II.1.2. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................. 54
II.1.2.1. ANIMALES E INSTALACIONES. ....................................................................... 55
II.1.2.2. ALIMENTACIÓN ......................................................................................... 57
II.1.2.3. MUESTREOS. ............................................................................................ 58
II.1.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................... 65
II.1.3.1. CRECIMIENTO ........................................................................................... 65
II.1.3.2. OTROS ÍNDICES BIOMÉTRICOS ...................................................................... 74
II.1.3.3. PARÁMETROS HEMÁTICOS. ......................................................................... 85
I.1.3.4. COMPOSICIÓN CORPORAL ............................................................................ 90
II.1.5. RESUMEN ................................................................................... 95
II.2. EVOLUCIÓN DEL CONTENIDO DE GRASA Y ÁCIDOS
GRASOS EN EL MÚSCULO DE CORVINA (ARGYROSOMUS
REGIUS, Asso 1801) DURANTE LA FASE INICIAL DE CRÍA EN
PISCIFACTORÍA ALIMENTADA CON DIETAS COMERCIALES.
II.2.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS................................................... 97
II.2.2. MATERIALES Y MÉTODOS. ....................................................... 99
II.2.2.1. ANIMALES, CONDICIONES EXPERIMENTALES Y MUESTREOS. .............................. 99
II.2.2.2. ANÁLISIS DE LOS PECES ............................................................................. 100
II.2.2.3. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO ...................................................................... 102
II.2.3. RESULTADOS. .......................................................................... 102
II.2.3.1. CRECIMIENTO E ÍNDICES MORFOMÉTRICOS. ................................................. 102
II.2.4. DISCUSIÓN ............................................................................... 107
II.2.5. RESUMEN ................................................................................. 114
III. CARACTERIZACIÓN PRELIMINAR DE LA ACTIVIDAD
DIGESTIVA DE LA CORVINA (ARGYROSOMUS REGIUS, Asso
1801
III.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS................................................... 115
III.2. MATERIALES Y MÉTODOS. ....................................................... 117
III.2.1. ANIMALES, CONDICIONES EXPERIMENTALES Y MUESTREOS. .............................. 117
III.2.2. PROCESADO DE LAS MUESTRAS Y ANÁLISIS DE LAS ACTIVIDADES DIGESTIVAS......... 118
III.3. RESULTADOS. ............................................................................ 119
III.3.1. INFLUENCIA DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD PROTEASA ....................................... 119
III.3.2. DISTRIBUCIÓN ANATÓMICA DE LAS ACTIVIDADES DIGESTIVAS EN LA CORVINA. ...... 119
II
III.3.3. ACTIVIDAD PROTEASA ALCALINA EN DIFERENTES ESPECIES................................. 121
III.4. DISCUSIÓN. ................................................................................ 122
III.5. RESUMEN ................................................................................... 129
IV. EFECTO DEL TAMAÑO DE LA RACIÓN DIARIA SOBRE EL
CRECIMIENTO, LA UTILIZACIÓN DE LA DIETA, EL
METABOLISMO Y EL ESTRÉS OXIDATIVO EN LA CORVINA
(ARGYROSOMUS REGIUS, Asso 1801)
IV.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS. ................................................. 131
VI.2. MATERIALES Y MÉTODOS. ....................................................... 133
IV.2.1. ANIMALES, CONDICIONES EXPERIMENTALES Y MUESTREOS ............................... 133
IV.2.2. PROCESADO DE LAS MUESTRAS. ................................................................... 135
IV.2.3. PARÁMETROS BIOMÉTRICOS Y COMPOSICIÓN QUÍMICA .................................... 135
IV.2.4. ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ........................................................ 136
IV.2.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................ 136
IV.3. RESULTADOS ............................................................................ 136
IV.3.1. CRECIMIENTO ........................................................................................... 136
IV.3.2. ÍNDICES BIOMÉTRICOS ................................................................................ 138
IV.3.3. COMPOSICIÓN .......................................................................................... 139
IV.3.4. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS DEL METABOLISMO INTERMEDIARIO........................ 139
IV.3.5. ESTRÉS OXIDATIVO .................................................................................... 144
IV.4. DISCUSIÓN ................................................................................. 145
IV.5. RESUMEN. .................................................................................. 158
V. EFECTO DEL AYUNO Y POSTERIOR REALIMENTACIÓN
SOBRE EL CRECIMIENTO, METABOLISMO Y ESTRÉS
OXIDATIVO EN LA CORVINA (ARGYROSOMUS REGIUS, Asso
1801)
V.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS ................................................... 159
V.2. MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................. 162
V.2.1. ANIMALES, CONDICIONES EXPERIMENTALES Y MUESTREOS ................................ 162
V.2.2.PROCESADO DE LAS MUESTRAS...................................................................... 163
V.2.3. PARÁMETROS BIOMÉTRICOS Y COMPOSICIÓN QUÍMICA. .................................... 163
V.2.4. ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ......................................................... 163
V.2.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................. 164
V.3. RESULTADOS ............................................................................. 164
V.3.1. CRECIMIENTO ............................................................................................ 164
V.3.2. ÍNDICES BIOMÉTRICOS ................................................................................. 165
III
V.3.3. COMPOSICIÓN ........................................................................................... 166
V.3.4. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS DEL METABOLISMO INTERMEDIARIO......................... 167
V.3.5. ESTRÉS OXIDATIVO ..................................................................................... 172
V.4. DISCUSIÓN .................................................................................. 174
V.4.1. EFECTOS DEL AYUNO ................................................................................... 174
V.4.2. EFECTOS DE LA REALIMENTACIÓN .................................................................. 191
V.5. RESUMEN .................................................................................... 202
VI. ESTUDIO DE DIFERENTES FRECUENCIAS DE
ALIMENTACIÓN SEMANAL EN LA CORVINA (ARGYROSOMUS
REGIUS, Asso 1801). IMPLICACIONES PRODUCTIVAS,
FISIOLÓGICAS Y SOBRE LA CALIDAD.
VI.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS. ................................................. 203
VI.2. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................ 205
VI.2.1. ANIMALES, CONDICIONES EXPERIMENTALES Y MUESTREOS ............................... 205
VI.2.2.PROCESADO DE LA SANGRE Y LOS TEJIDOS ...................................................... 207
VI.2.3. PARÁMETROS BIOMÉTRICOS Y COMPOSICIÓN QUÍMICA .................................... 207
VI.2.4. ANÁLISIS DE METABOLITOS PLASMÁTICOS Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA................... 207
VI.2.5. ESTUDIO DE LA CALIDAD DEL MÚSCULO ......................................................... 207
VI.2.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................ 208
VI.3. RESULTADOS ............................................................................ 208
VI.3.1. CRECIMIENTO E ÍNDICES MORFOMÉTRICOS .................................................... 208
VI.3.2. COMPOSICIÓN CORPORAL ........................................................................... 209
VI.3.3. METABOLITOS PLASMÁTICOS ...................................................................... 212
VI.3.4. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS EN HÍGADO Y MÚSCULO ........................................ 213
VI.3.4. FIRMEZA, PH Y CAPACIDAD DE RETENCIÓN DE AGUA (CRA) .............................. 216
VI.3.5. CONTENIDO EN PROTEÍNAS ......................................................................... 217
VI.3.6. ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE LAS PROTEÍNAS SARCOPLASMÁTICAS (PSP)......... 218
VI.3.7. ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE LAS PROTEÍNAS MIOFIBRILARES (PMF) .............. 221
VI.4. DISCUSIÓN ................................................................................. 223
VI.5. RESUMEN ................................................................................... 234
VII. CONCLUSIONES………………………………...………………235
VIII. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………..……...237
IV
0. Objetivo
La cada vez mayor demanda de productos de origen marino ha dado lugar a un
casi agotamiento de los caladeros y recursos acuícolas por la actividad pesquera, lo que
ha aumentado el interés por el desarrollo de la acuicultura marina en estos últimos 30
años. En la última década la producción mundial de pesca de captura se ha mantenido
relativamente estable en torno a los 80 millones de Tm. La acuicultura es un sector que
sigue creciendo a un mayor ritmo superior al crecimiento de la población, situando su
producción alrededor de 60 millones de Tm, por lo que se espera que supere a la pesca
de captura como fuente de pescado comestible. A nivel nacional, la producción acuícola
se situó en 252000 Tm en 2010. En la costa mediterránea, las primeras experiencias
piscícolas se realizaron con la dorada y la lubina, cultivos cuyo éxito ha derivado en una
cierta saturación de los mercados con la consiguiente caída de precios, que se podría
paliar acudiendo a la diversificación, es decir, la ampliación de la lista de especies objeto
de producción intensiva.
La corvina (Argyrosomus regius Asso, 1801) es un esciénido eurihalino que se
presenta como firme candidato a esta diversificación, pues posee unas características
fisiológicas, como alta fecundidad, cierta facilidad de cría en cautividad, llegándose a
cerrar el ciclo reproductivo, además de un alto porcentaje de músculo con baja
adiposidad, aún cuando se alimenta con piensos ricos en grasa, y una buena calidad
nutricional y organoléptica general. Unido a lo anterior, el gran tamaño que puede
alcanzar la corvina, así como la posibilidad de obtener transformados, ha dado lugar a
que esta especie irrumpa con fuerza en la piscicultura mediterránea, pasando a ser la
cuarta especie en importancia, tras lubina, dorada y rodaballo.
La producción europea de corvina fue de 2178 Tm en 2009, aumentando un 77%
el año 2010, siendo España el principal productor. Las posibilidades de expansión de
este cultivo deben acompañarse de campañas de promoción, pues el principal freno del
mismo es el relativo de esta especie por el consumidor.
Para asegurar y ampliar este papel de la corvina como nueva especie en la
piscicultura, es conveniente ampliar el conocimiento sobre su fisiología en general y sus
necesidades nutricionales en particular, ya que el diseño de una práctica alimentaria
saludable y rentable resulta fundamental; no debemos olvidar que su destinatario es el
consumidor humano y que el mayor capítulo de gasto de un cultivo intensivo es el
correspondiente a la alimentación de los animales.
1
Sergio García Mesa
La presente Memoria de Tesis Doctoral recoge datos relacionados con estas
cuestiones: biología y fisiología básicas, evolución en cultivo, aspectos de la digestión y
alimentación, con la esperanza de que puedan resultar útiles en el futuro del cultivo de
esta especie.
En primer lugar se exponen los resultados de un seguimiento del desarrollo de un
cultivo piloto de corvina en condiciones reales de piscifactoría (apartado 2.1.), para lo
que se contó con la colaboración de una empresa privada interesada en el tema.
Animales de ese cultivo fueron utilizados para una primera aproximación a la calidad del
producto, en concreto en lo que concierne al perfil de ácidos grasos de la parte
comestible de la misma y su evolución durante el cultivo basado en piensos comerciales
(apartado 2.2.).
A continuación se exponen los resultados de una serie de experimentos
relacionados con el ámbito de especialización de grupos de investigación “Nutrición y
Alimentación de Peces” (Departamento de Zoología) de la Universidad de Granada
(UGR) y del Departamento de Producción Animal de la Universidad de Almería (UAL) en
colaboración, algunos de ellos con el centro del IFAPA “El Toruño” (Junta de Andalucía).
Conocer el equipamiento enzimático digestivo de la corvina podría ayudar a
esclarecer el potencial que posee la especie para actuar sobre lípidos, proteínas y
carbohidratos del pienso, y cómo una adecuada proporción de éstos en la dieta podría
permitir un mejor aprovechamiento. Además, como primera aproximación resulta
interesante la comparación con otras especies de interés en la acuicultura. Ambos
aspectos se abordan en el apartado 3.
En relación con el diseño de una estrategia alimentaria óptima se ensayaron
diferentes tamaños de ración a fin de determinar cuál es el más apropiado tanto para su
aprovechamiento por los peces como para reducir el impacto ambiental derivado de la
emisión de residuos orgánicos. Además de enfocar el tamaño de ración desde el punto
de vista de crecimiento y aprovechamiento de la dieta, así como de la de la influencia en
la composición corporal de los animales, se ha profundizado en el efecto sobre enzimas
clave del metabolismo intermediario e indicadores de estrés oxidativo esperando,
además, con estos datos pioneros ampliar el volumen de conocimientos sobre la
fisiología de la especie. En este último sentido, se amplió el ensayo a lotes de corvinas
que fueron privadas de alimento durante 60 días y luego realimentadas durante otros 60
lo que nos permitió valorar el impacto de una maniobra tan drástica sobre algunos
aspectos de la fisiología del animal así como su reversión o no durante la realimentación
posterior así como una aproximación al interesante tema del crecimiento
compensatorio. Los apartados 4 (tamaño de ración) y 5 (ayuno/realimentación)
describen estos ensayos.
2
Objetivo
Finalmente, se abordó otro aspecto de la estrategia alimentaria de gran
aplicabilidad en las explotaciones acuícolas, como es la frecuencia alimentaria más
conveniente a lo largo de una semana de cultivo. No olvidemos que la alimentación con
piensos secos, propia de la piscicultura intensiva, supone una sobrecarga de las
capacidades digestivas y metabólicas del animal que debería tener una adecuada
gestión temporal que permita una utilización óptima de dicho pienso sin olvidar, otro
aspecto muy importante desde el punto de vista comercial como es la posible reducción
de gastos, sobre todo de personal, derivada de posibles reducciones en la frecuencia
alimentaria. En este experimento también se abordó, de forma sencilla, otro tema muy
interesante como es el de la hora más apropiada para la distribución del alimento.
Aprovechamos este diseño para estudiar los posibles efectos sobre algunos parámetros
relativos a la calidad de la fracción comestible (músculo) así como su evolución a lo largo
de un periodo post-mortem de varios días. Este experimento se desarrolla en el
apartado VI.
El conjunto de datos que se exponen en esta Memoria surgen de la colaboración
entre la universidad (UGR, UAL), un centro público de investigación (IFAPA) y la empresa
privada (Ceutamar, S.L.), que creemos muy interesante y fructífera pues los posibles
problemas derivados de diferencias en diseño de los ensayos, modos de trabajo o
intereses/especializaciones concretas, son superados con creces por la riqueza que
supone la pluralidad de puntos de vista, de la que surge un “mestizaje” muy interesante
en lo que concierne a la aplicabilidad de los resultados.
3
I. Introducción.
I.1. BIOLOGÍA Y CULTIVO DE LA CORVINA.
I.1.1. Aspectos generales.
I.1.1.1. ENCUADRE TAXONÓMICO
La corvina, Argyrosomus regius (Asso, 1801) pertenece al phylum Chordata. Dentro del
cual se encuentra el subphylum Gnathostomata, que por definición son animales cordados que
poseen mandíbulas articuladas además de poseer un cráneo que protege al cerebro.
Dentro del subphylum Gnathostomata se encuentra la clase Actinopterygii, que se
caracteriza por poseer un esqueleto óseo con aletas con radios.
La corvina está englobada en la subclase Teleostei ya que posee una cola homocerca,
escamas de tipo ctenoideo o ciclodeo y preservación de la vejiga natatoria, en este grupo se
incluyen los peces más evolucionados. Quedando incluida en el orden Perciformes, peces que
poseen los primeros radios de la aleta anal espinosos y robustos, las aletas pectorales de
inserción alta y las abdominales con un radio espinoso y un máximo de seis blandos.
Entre las distintas familias, la corvina se incluye en la familia Scianidae que incluye 70
géneros y más de 270 especies, entre los cuales se encuentra el género Argyrosomus.
Figura I.1.1.1. Aspecto externo de la corvina (www.peixosdepalamos.es)
5
Sergio García Mesa
Phylum Chordata
Subphylum Gnathostomata
Superclase Tetrapoda
Superclase Peces
Clase Chondrichthyes
Subclase Elasmobranchii
Subclase Holocephali
Clase Actinopterygii
Subclase Chondrostei
Subclase Teleostei
Superorden Elopomorfa
Orden Anguilliformes
Suborden Anguilloidei
Suborden Congroidei
Superorden Neoognathi
Orden Cyprinodontiforme
Suborden Aplocheiloidei
Suborden Cyprinodontoidei
Suborden Mugiliformes
Orden Perciformes
Suborden Blennioidei
Suborden Caproidei
Suborden Percoidei
Familia Scianidae
Género Argyrosomus
I.1.1.2. DESCRIPCIÓN GENERAL.
La corvina es un esciénido que presenta el cuerpo alargado y esbelto, casi fusiforme,
ligeramente comprimido, de color gris oscuro plomo, flancos gris plateado levemente pardo con
reflejos en forma de espejuelos de bronce, vientre blanco y aletas pardo-rojizas (Riedl, 1986). La
cabeza es relativamente grande, con boca terminal, ancha y ligeramente oblicua; las dos
mandíbulas son de longitud similar aunque la inferior está levemente adelantada. Presenta unos
dientes pequeños dispuestos en varias bandas formando cardas en ambas mandíbulas, los más
grandes ocupan la banda externa en la mandíbula superior, mientras que en la mandíbula
inferior los dientes mayores se encuentran entre los pequeños o formando una banda interna.
Carece de dientes en el paladar. La cavidad bucal es de color amarillo dorado pasando a marrón
tras la muerte. Los ojos son de tamaño mediano. No tiene barbillas en el mentón, pero posee
varias aberturas o poros que son salidas de tubos mucosos.
6
Introducción
El cuerpo está totalmente cubierto por escamas ctenoideas relativamente grandes,
excepto en algunas partes de la cabeza en que son cicloideas y pequeñas. Las del cuerpo
parecen disponerse en bandas oblicuas en los flancos (de 50 a 55 sobre la línea lateral). El
opérculo tiene dos espinas y el preopérculo está finamente dentado. La línea lateral es evidente,
completa y se prolonga hasta el extremo de los radios centrales de la aleta caudal. La aleta
dorsal es única pero está dividida en dos partes por una marcada hendidura, la parte anterior
está formada por 10-11 radios espinosos (el primero poco desarrollado) mientras que la
posterior, el doble de larga que la anterior, sólo presenta un radio espinoso y el resto blandos
(27-29). El pedúnculo caudal es ancho y potente con la cola truncada o en forma de arco.
Como en el resto de los esciénidos, los otolitos están extraordinariamente desarrollados,
así como la vejiga natatoria, que ocupa gran parte del abdomen. Estos peces son capaces de
emitir sonidos gracias a las contracciones de unos músculos sonicadores que se insertan en las
paredes de la vejiga, de ahí que se conozcan como peces roncadores. La emisión de sonidos se
circunscribe a la época de reproducción (Lagardère y Mariani, 2006).
El tracto digestivo de la corvina es relativamente corto, típico de especies carnívoras. A
un esófago corto y de gran diámetro, con paredes musculosas, sigue un estómago en forma de
saco, que permite la ingestión de presas grandes, provisto de glándulas y capas musculosas
desarrolladas. Tanto el esófago como el intestino se insertan en la porción anterior del
estómago. En la porción anterior del intestino existen 7-9 ciegos pilóricos. El intestino es corto y
de paredes de grosor variable: más finas en la zona intermedia que en las zonas anterior y anal
(Oliva et al., 2005; Gil et al., 2009).
Una vez adultos, se manifiesta una diferencia intersexual en la tasa de crecimiento,
como en otras especies gonocóricas (Imsland et al., 1997; Gorskov et al., 2003), que se hace
patente cuando los machos inician la maduración.
Debido a que se trata de una presa fácil de capturar y de localizar en la época de
reproducción (por la emisión de sonidos) y que madura tardíamente, las poblaciones salvajes
han sufrido un retroceso muy importante. A lo que hay que añadir la alteración de su medio de
cría, cerca de las desembocaduras de grandes ríos como el Ebro, el Guadalquivir, el Ródano y la
Gironda, ha provocado la disminución de la presencia de esta especie, considerándose
prácticamente extinguida en zonas donde era habitual, como las Islas Baleares y la
desembocadura del Delta del Ebro.
I.1.1.3. DISTRIBUCIÓN
La corvina es una especie euriterma y eurihalina (temperatura: 2 a 38°C, salinidad: 5 a 39
‰), lo que le permite entrar en las desembocaduras de los ríos y estuarios, donde realiza la
puesta. Normalmente habita en aguas someras y estuarios, desde la costa litoral hasta
profundidades de 200 m en fondos rocosos o praderas de Posidonia
7
Sergio García Mesa
La corvina se distribuye a lo largo del mar Mediterráneo pero también en el Atlántico
desde el sur de Suecia y Noruega, hasta la bahía de Dakar, en Senegal, incluidas Madeira y
Canarias, donde parece estar el límite sur de su distribución (Froese y Pauly, 2007) y donde se
suelen localizar los individuos de mayor talla. De toda la familia, Argyrosomus regius, es la
especie que mayor tamaño puede alcanzar llegando a medir un metro y pesar 50 kg; por lo
general, los ejemplares capturados se hallan en torno a los 50 cm. El pez más grande encontrado
medía 203 cm y pesaba 103 kg, según fishbase.org.
Figura I.1.1.2. Distribución geográfica de la corvina (A. regius)
En el litoral andaluz, es frecuente en las aguas de Cádiz, especialmente en la
desembocadura de los ríos Guadiana y Guadalquivir (Sobrino et al., 2005), donde el medio es
más salobre. En estas zonas se capturan individuos adultos en todas las épocas del año, aunque
con mayor frecuencia en los meses de marzo a junio (Calderón et al., 1997).
I.1.1.4. ALIMENTACIÓN
Las presas principales de los juveniles de corvina en su medio natural son los míscidos,
destacando Mesopodopsis salberii y Neomysis intiger. Tras los míscidos, los copépodos son los
que tienen mayor importancia en la alimentación de la corvina. Los míscidos reemplazan
progresivamente a los copépodos en las dietas de las postlarvas y juveniles conforme van
creciendo (Cabral y Ohmert, 2001; Baldó y Drake, 2002).
La alimentación natural de los adultos está formada por mugílidos, clupeidos y algunos
crustáceos nadadores, lo que justifica un aparato digestivo típico de especies carnívoras, esófago
de amplio diámetro y musculoso, estómago musculoso de luz pequeña e intestino relativamente
corto.
8
Introducción
I.1.1.5. CICLO DE REPRODUCCIÓN.
A. regius se reproduce cuando los machos alcanzan unos 64 cm de talla y 4 kg de peso y
las hembras unos 86 cm y 7.5 kg (García-Pacheco y Bruzón, 2009). Durante la época de
reproducción, los adultos abandonan la costa a mediados de Abril y penetran en los estuarios a
finales de mayo para desovar. Durante la estación de freza, los machos emiten unos ronquidos
gracias a unos músculos sónicos que, al contraerse, producen vibraciones de la vejiga natatoria,
causando un sonido cíclico que alterna ronquidos largos y cortos. Los ronquidos tienen función
de llamada, para que se dé la agregación en el tiempo y en el espacio, facilitando el éxito en el
momento del desove (Lagardère y Mariani, 2006). Desde mediados de junio hasta finales de julio
abandonan los estuarios para alimentarse en la costa. Las corvinas permanecen en aguas
superficiales hasta el inicio del otoño y durante el invierno vuelven a aguas profundas,
pudiéndose encontrar hasta los 80 m y, rara vez, hasta los 200 m.
Los juveniles abandonan las áreas de nursery (estuarios) al final del verano y emigran a
las aguas costeras, entre 20 y 40 m de profundidad, para pasar el invierno. A mediados de mayo
vuelven a las zonas estuarias, donde se alimentan.
La temperatura del agua es el factor más importante de entre los que determinan la
migración de la corvina para alimentarse y para reproducirse. La llegada de los adultos y la salida
de los juveniles a y desde los estuarios suceden en mayo y octubre, cuando la temperatura del
agua está cerca de 13 - 14 °C. La mejor temperatura para el crecimiento está entre 17 - 21 °C,
con un rango de tolerancia entre 14 - 23 °C, fuera del cual disminuye el crecimiento (Quèmener,
2002).
Una hembra puede poner hasta 800000 huevos, la puesta ocurre a 17 – 22 °C. La
medida de los huevos fertilizados es de unos 990 µm de diámetro. Después de 30 horas tras la
eclosión, la gota lipídica se reabsorbe; a las 96 horas el saco vitelino está casi totalmente
consumido y se abren la boca y el ano.
I.1.2. Producción.
La corvina es la especie de pescado que ha irrumpido con más fuerza, en cuanto a
producción, en la acuicultura en diversos países europeos, colocándose en el cuarto puesto en
importancia en la piscicultura marina.
La producción de corvina en Europa pasó de 2178 Tm en 2009 a 3855 Tm en 2010, lo
que supuso un aumento del 77% en sólo un año. De la producción de 2010, 3280 Tm
correspondieron a España, primer país productor, por encima de Italia, Francia y Grecia, y que
duplicó su producción con respecto a 2009.
9
Sergio García Mesa
Figura I.1.2.1. Evolución de la producción de corvina en Europa y Mediterráneo (APROMAR, 2011)
La captura de corvina por parte de la flota pesquera es prácticamente inexistente.
I.1.3. Estudios y cría en cautividad.
La historia de la corvina en la acuicultura es bastante corta y reciente. Las primeras
pruebas con grupos salvajes se realizaron en el sur de Francia. Desde comienzos de 1996, la
producción neta ha sido muy limitada, con una sola instalación de reproducción en Francia. De
hecho, el protocolo de crianza de estas especies es relativamente desconocido y todavía no se
ha hecho público. La primera producción comercial se hizo en Francia en 1997. Desde entonces
la producción se ha extendido lentamente en Italia y, especialmente, España.
Las primeras experiencias con corvina en España las desarrollaron Calderón et al.,
(1997), estableciendo el primer experimento de engorde de un lote de 10 juveniles de corvina
salvajes (180 g) en tanques de 10 m3 durante 30 meses hasta alcanzar 4 kg, con una
supervivencia del 60%.
La empresa Niordeas S.L. ha desarrollado desde 2001 el cultivo de la corvina,
consiguiendo cerrar el ciclo reproductivo. Tras finalizar esta experiencia pionera en 2006, la
empresa amplió el número de jaulas destinadas a este cultivo, obteniendo casi 1000 Tm en 2007
(Mateos Velasco, 2007).
10
Introducción
I.1.3.1. REPRODUCCIÓN EN CAUTIVIDAD.
La corvina, al igual que otras especies de peces, presenta disfunciones reproductoras
cuando están en cautividad, lo cual hace que la reproducción sea improbable, siendo el
tratamiento con hormonas gonadotrofinas el único medio de asegurar la puesta. En España,
gracias a la financiación de la Junta Nacional de Cultivos Marinos (JACUMAR) se desarrolló el
Plan Nacional de Cría de Corvina (PLANACOR) que nació con el propósito de conseguir la
reproducción en cautividad de la corvina en España y en el que participaron distintos centros de
investigación, como IFAPA (Andalucía), LIMIA (Baleares), IRTA (Cataluña) e ICCM (Canarias).
Para ello, fue necesaria la captura de reproductores salvajes de corvina, concretamente
en las costas del Algarve portugués y bajo Guadalquivir, y su posterior transporte hacia los
centros de investigación antes mencionados. Este transporte de los reproductores por carretera
y/o avión no supuso un riesgo para su supervivencia en las condiciones adecuadas (Correia et al.,
2008).
Los reproductores, una vez adaptados a las condiciones de cautividad y en un grado
óptimo de madurez sexual, actividad del esperma y tamaño de los oocitos (0.5 mm), fueron
tratados hormonalmente (Duncan et al., 2007a, 2007b, 2008). Los tratamientos con hormonas
liberadoras de gonadotropina o gonadoliberinas actúan a nivel de hipófisis, estimulando la
liberación de otras hormonas que modulan muchos aspectos del control gonadal, crecimiento y
maduración del ovocito, ovulación y desove. El tratamiento hormonal con hormonas liberadoras,
fue tanto con inyecciones intraperitoneales (150 μg/kg), como con implantes (40 μg/kg para
hembras y 20 μg/kg para machos), produciéndose la freza a las 60 - 70 horas tras la
administración de la hormona. Los resultados fueron un completo éxito en la obtención de
huevos fecundados.
Los dos modos de administración de hormonas liberadoras de gonadotropinas
(inyección e implante), dieron lugar a diferencias significativas en el diámetro de los huevos
fecundados (Estévez et al., 2009), teniendo un diámetro de 0.99 ± 0.02 mm los huevos
obtenidos por implante, mientras que los huevos obtenidos por inyección midieron 0.93 ± 0.01
mm de diámetro. En ambos casos, la composición bioquímica fue: 17.95 % de lípidos, 31.9 % de
proteínas y 5 % de carbohidratos, todos en sustancia seca.
La cría larvaria presenta altas tasas de supervivencia, 15-40% a los 30 y del 15% a los 60
días post-eclosión (Cárdenas, 2010). Las larvas de corvina presentan crecimientos superiores a
los descritos en larvas de dorada y, a partir de los 20 días tras la eclosión son capaces de
alimentarse con una dieta mixta de alimento vivo y pienso artificial.
11
Sergio García Mesa
Figura I.1.3.1. Fases de desarrollo y protocolo de alimentación de corvina (PLANACOR, 2009)
)
La co-alimetación temprana de las larvas de corvina reduce la dependencia del alimento
vivo, haciendo que el destete sea más fácil; siendo posible eliminar completamente el alimento
vivo desde el día 20 post-eclosión con una supervivencia bastante alta, 17% según FernándezPalacios et al. (2009) o del 40-45% según Hernández-Cruz et al. (2007). Se ha conseguido
desarrollar el protocolo de alimentación de corvina eliminando los nauplios y metanauplios de
Artemia sp., cambiando el día 15 después de la eclosión los rotíferos por pienso seco
(Fernández-Palacios et al., 2009; Durán et al., 2009).
I.1.3.2. PREENGORDE Y ENGORDE.
Como consecuencia del éxito del Plan Nacional de Cría de Corvina (PLANACOR) en la
reproducción en cautividad de esta especie, se han realizado experimentos de pre-engorde y
engorde, en tanques, jaulas y esteros, comparándose cómo crecen en los distintos recintos, en
función de parámetros ambientales como la calidad del agua, la temperatura y la salinidad, con
el fin de determinar las condiciones óptimas de cultivo de esta especie.
Según Lavié et al. (2008), las cargas de alevines de corvina probadas no afectaban al
crecimiento tanto como lo hace la temperatura de cultivo, siendo la de 24-25°C la que mejoró su
crecimiento e ingesta. Sin embargo Quémener et al, (2002) proponen que el desarrollo óptimo
de juveniles de corvina se efectúa dentro del rango 17-21°C, viéndose afectado su crecimiento
negativamente a partir de 23°C. Por lo que la corvina, en sus etapas iniciales de preengorde,
podría crecer mejor a mayor temperatura, aunque con una mayor demanda de alimento.
Al tratarse de una especie eurihalina, es posible su crianza incluso en aguas de baja
salinidad. Se ha estudiado el efecto de la salinidad tanto en el preengorde (Tinoco et al., 2009a,
b, c) como en el engorde (Muñoz et al., 2008). Durante el preengorde se vio que las mejores
12
Introducción
tasas de crecimiento (TCE o SGR) y tasa de conversión del alimento (TCA o FCR) se alcanzaban en
salinidades bajas (12-13 g/L). Estudios realizados durante el engorde a distintas salinidades han
resultado en un mejor crecimiento en aguas de salinidades más bajas (<37‰)
La crianza de corvina se puede llevar a cabo en distintos tipos de instalaciones acuícolas,
como son tanques en tierra firme, esteros, jaulas flotantes. Independientemente del modo de
engorde, extensivo, intensivo o semiintensivo, el crecimiento de la corvina es prometedor, ya
que según Pastor et al. (2007) se cuadriplica el peso de la dorada durante la fase larvaria y en tan
sólo 18 meses se alcanza 1 kg.
Poli et al. (2002) y Ortega y Gándara (2007) hicieron experimentos de cultivo en tanques,
obteniéndose resultados similares entre ellos, con unas tasas de crecimiento altas. Pastor et al.
(2002) obtuvieron una tasa de crecimiento mayor que las anteriores, pero en este caso el
engorde se hizo en jaulas, aunque este experimento se realizó con individuos nacidos en
cautividad a partir de ejemplares silvestres.
También Jiménez et al. (2005) obtuvieron mejores resultados en la conversión del
alimento de las corvinas cultivadas en jaulas frente a las cultivadas en tanques.
Los primeros ensayos sobre alimentación de corvinas se realizaron con presas vivas, así
Quero y Vayne (1985) obtuvieron buenos crecimientos con juveniles de corvina alimentados con
pequeños crustáceos y adultos de peces pelágicos; posteriormente, Cabral y Ohmert (2001) lo
hicieron con sardinas. También El-Shebly et al. (2007) cultivaron alevines de corvina en
estanques de agua salobre y las alimentaron con presas vivas de alto contenido proteico
obteniendo una ganancia de peso diaria de 2.55 g/pez; por los mismos autores con otras
especies cultivadas de forma similar como la dorada (0.73 g/pez, El-Shebly y Siliem, 2003) y la
lubina (1.13 g/pez, El-Shebly, 2005).
Los estudios realizados sobre alimentación con piensos comerciales son aún escasos y,
aunque los resultados obtenidos son diversos, todos muestran unas necesidades altas de
proteína (por encima del 45%) y relativamente bajas de lípidos (sobre el 17%). Se ha podido
comprobar que, cuando se cultiva en condiciones óptimas, presenta un rápido crecimiento,
alcanzando la talla comercial (600-800 gramos) en un año (Cárdenas, 2010), y a los 18 meses
puede llegar a alcanzar 1 kg de peso vivo, bastante superior a los 400 g que alcanza la dorada en
este periodo (Cárdenas y Meseguer, 2008). Calderón et al., (1997) alimentaron corvinas con
piensos comerciales que provocaron un crecimiento de 178 a 410 g en 5 meses, lo que supuso
una tasa de crecimiento específico (SGR) de 0.57 %/día. Otros estudios han mostrado que la
corvina mediterránea puede alcanzar, desde pocos gramos, los 0.7-1.0 kg después de 12 meses
de crianza y 2.0-2-5 kg después de 24 meses con un alto índice de conversión del alimento (entre
0.9 y 1.2 dependiendo del pienso) (Monfort, 2010).
13
Sergio García Mesa
A fin de determinar los niveles óptimos de alimentación en esta especie, Velazco et al.,
(2009) ensayaron 5 raciones diarias diferentes (0, 0.5, 1.75, 3.25 y 4.75 % de la biomasa al día),
no encontrando diferencias significativas en el crecimiento de las corvinas alimentadas con tres
raciones más altas. Teniendo en cuenta los índices de conversión y los de eficacia proteica, la
ración diaria de 1.75 % fue la que mostró los mejores resultados globales.
El contenido lipídico corporal de la corvina es muy bajo cuando se compara con otras
especies cultivadas, esto significa que tiene una limitada capacidad de almacenar lípidos en el
músculo, lo que justifica el hecho de que se use como nombre común para esta especie el de
“maigre” en francés o el de “meagre” en inglés. Estudios realizados por Poli et al. (2003) la han
mostrado como un pez particularmente esbelto que, incluso cuando se cultiva de forma
intensiva, presenta un alto porcentaje de músculo y un alto contenido en ácidos grasos de buena
calidad. Además, en una comparación con otras especies cultivadas en el Mediterráneo,
realizada por Grigorakis et al. (2011), la corvina mostró el menor contenido lipídico muscular,
rico en lípidos polares y en ácidos grasos, con bajos índices aterogénicos y trombogénicos, lo que
confirmaba la alta calidad de los lípidos de esta especie.
Para evaluar el efecto del contenido lipídico del pienso, Piccolo et al. (2008) ensayaron
dos piensos comerciales con un contenido de proteína del 47% y diferente contenido en lípidos
(21 y 14%), sobre el crecimiento de corvinas con un peso inicial de 12 g. Tras 15 meses de cultivo
en jaulas, los peces alcanzaron un peso medio de 869.1 y 811.8 g, respectivamente. Las corvinas
alimentadas con la dieta con menor relación Proteínas/Lípidos (P/L) mostraron mayores
porcentajes de grasa mesentérica y mayor rendimiento de filete. El contenido lipídico de los
filetes, aunque bajo en relación con la mayoría de los peces cultivados, también fue superior en
estas corvinas y presentó un mayor contenido de ácidos grasos saturados y menor de
poliinsaturados. Las corvinas alimentadas con la dieta de mayor relación P/L mostraron muy
buenos índices de calidad de la grasa.
Estudios Posteriores realizados por Chatzifotis et al. (2010) han confirmado las bajas
necesidades de lípidos en la dieta de la corvina. Tras alimentar a juveniles de corvina con tres
dietas isoproteicas (43%) y diferente contenido en lípidos (13, 17 y 21%), observaron, en primer
lugar, una ingesta diaria similar para las tres dietas, pero fueron las corvinas alimentadas con el
contenido lipídico intermedio las que exhibieron una mayor tasa de crecimiento específico, un
mejor índice de conversión y un mayor coeficiente de eficacia proteica. La dieta con mayor
contenido lipídico dio lugar a mayores valores de lípidos corporales y del músculo, no
afectándose el resto de los componentes.
En un estudio reciente (Martínez-Llorens et al., 2011) se ha evaluado el crecimiento y la
eficiencia alimentaria de juveniles de corvina (94 g peso inicial) alimentados con cuatro dietas
comerciales de diferentes contenidos porcentuales en proteínas/lípidos (44/25, 43/21, 46/20,
47/20). El crecimiento y los índices de conversión más satisfactorios se obtuvieron con las dietas
de mayores niveles proteicos, lo que parece confirmar unas elevadas necesidades proteicas para
esta especie, al menos en su fase juvenil.
14
Introducción
I.1.4. Comercialización y consumo
Como se ha indicado antes, la corvina ha pasado a ser la cuarta especie piscícola en
importancia tras la lubina, la dorada y el rodaballo. Sin embargo, el principal freno al completo
desarrollo y expansión del cultivo de corvina parece ser su comercialización, ya que se trata de
un producto relativamente desconocido para el consumidor, salvo para aquellos que lo han
consumido de forma tradicional gracias a la pesca extractiva.
Con el propósito de conocer la opinión de los consumidores se desarrollaron pruebas
sensoriales para valorar los atributos de la carne de esta especie (García-García et al., 2008). El
resultado fue una amplia satisfacción ante el producto, definiéndose la gran mayoría de los
catadores como consumidores potenciales de corvina siempre que tuviera un precio razonable.
Debido a la creciente demanda de productos transformados en la sociedad actual, la
corvina se presenta como un perfecto candidato, debido a la facilidad de su fileteado y a la gran
proporción que ocupa éste (Cárdenas, 2010).
I.2. ESTRATEGIAS ALIMENTARIAS.
La alimentación de los peces no sólo es uno de los principales factores que determinan
el éxito o el fracaso de una piscifactoría sino que es el de mayor peso en el capítulo de los costes
de producción de estas empresas, tanto por el propio coste del pienso en sí, como por el
derivado de su administración. No olvidemos que uno de los principales objetivos de la
acuicultura es generar un producto de alta calidad con el mínimo coste (Sveier y Lied, 1998).
Pues bien, el peso económico de estos capítulos puede reducirse con un adecuado
programa de alimentación que incluya, entre otros factores, una apropiada frecuencia
alimentaria, que puede reducir la sobrealimentación y mejorar la eficiencia del cultivo (Riche et
al., 2004; Ustaogul y Alagil, 2009). La frecuencia alimentaria puede afectar a la ingesta de
alimento (Grayton y Beamish, 1997) e influenciar el crecimiento (Giberson y Litvak, 2003).
La temperatura del agua, la tasa de alimentación y el tamaño de los peces son los tres
principales factores que afectan al crecimiento y estado energético de los peces (Brett y Groves,
1979; Gardeur et al., 2007). En cautividad los peces tienen restringido su movimiento y su
alimentación depende exclusivamente de la aportada por el piscicultor; por lo tanto, el
crecimiento va a estar ligado al tipo de alimento recibido, al tamaño de la ración, a la frecuencia
de alimentación, a la densidad poblacional, etc. (Thia-Eng y Seng-Keh, 1978)
Definir un protocolo de alimentación adecuado es una tarea multidisciplinar ya que
exige conocimientos de nutrición, fisiología, conducta de los animales y técnicas de
15
Sergio García Mesa
alimentación. Siempre es necesario plantear una estrategia alimentaria previa al inicio del
cultivo de peces que debe establecer las pautas acerca de la cantidad de alimento que se
distribuirá, la frecuencia con que se hará y la forma más adecuada de administración. Establecer
una adecuada estrategia de alimentación es importante, no solo en términos de crecimiento,
sino también por razones económicas y medioambientales: minimizar el alimento desechado
disminuye la pérdida económica y nutricional y la polución del agua (Langar y Guillaume, 1994;
Sumagaysay, 1998; Ng et al., 2000; Mihelakakis et al., 2002).
Muchas especies no regulan la ingesta de alimento sobre una base diaria, sino que
utilizan períodos mucho más amplios para su regulación. Ello supone que en determinados días
su apetito es reducido e ingieren raciones por debajo de lo esperado, mientras que otros días
son capaces de ingerir cantidades superiores a las esperadas (Madrid et al., 2001). Esto podría
definir una nueva variable a tener en cuenta en las estrategias alimentarias, cómo sería dejar de
distribuir alimento un día, redistribuyendo la tasa alimentaria semanal en el resto de días, con el
fin de que no se reduzca el crecimiento y empeore el índice de conversión del alimento.
Aunque la estimación de las necesidades alimentarias básicas puede ser, en principio,
una tarea no muy complicada, la alimentación es una variable que no solamente está sometida a
ritmos diarios, lunares y estacionales, sino que además actúa como un factor sincronizador de
los ritmos biológicos. El hecho que el pez sea un sistema funcional diferente a lo largo del día, las
estaciones o el año justifica que la hora de alimentación influya poderosamente en la ingesta y el
rendimiento del alimento ingerido. Muchas especies de peces muestran en su medio natural
variaciones en la actividad alimenticia concentrándola en el momento del día en que el balance
entre disponibilidad de alimento y riesgo de depredación es el mejor.
I.2.1. Determinación del tamaño de ración óptimo.
Ajustar la cantidad de alimento suministrado a las necesidades del animal es crítico y
puede tener consecuencias biológicas; si es insuficiente los animales no crecen todo lo que
podrían, mientras que si es excesiva, contribuye a la eutrofización del medio y a generar otros
problemas ambientales. Así pues, la alimentación afecta a la producción y a los resultados
económicos del cultivo (Alanärä et al., 2001).
Las necesidades nutricionales y energéticas varían con el tamaño y/o edad de los peces
(Paul et al., 1994; Haroon y Pitman, 1997). Los animales, al aumentar el peso, necesitan un
mayor aporte absoluto de energía aunque, en relación al peso corporal, puede ser menor.
También es bien sabido que, con el aumento del peso de los peces, la tasa de conversión de
alimento disminuye, al destinarse parte de la energía del mismo a otros objetivos diferentes a
los de incrementar su biomasa como sería, por ejemplo, el desarrollo de gónadas.
En la mayoría de peces carnívoros y omnívoros, la relación entre tasa de crecimiento y
tamaño de ración tiene el perfil de una curva desacelerada (Brett y Groves, 1979). A medida que
16
Introducción
aumenta la ración, el crecimiento y la eficiencia de conversión también lo hacen inicialmente. En
el caso del crecimiento esto es así hasta que, a partir de un cierto tamaño de ración no se
produce una mejora adicional de la tasa de crecimiento, se ha alcanzado lo que se conoce como
ración y crecimiento máximos. Sin embargo, en el caso de la eficiencia de conversión de
alimento en biomasa, el máximo se suele alcanzar para raciones de aproximadamente 2/3 de la
ración máxima y después disminuye (Brett y Shelbourn, 1975; Chua y Teng, 1982, Sun et al.,
2006). La ración que promueve el mejor índice de conversión se conoce como ración óptima; el
intervalo entre las tasas de alimentación, óptima y máxima, definirá el margen de maniobra del
piscicultor. En este margen de racionamiento, es posible maximizar el crecimiento o minimizar el
coste alimentario, en función de imperativos económicos o de otro tipo. Es fácil deducir de lo
expuesto que la obtención de un crecimiento máximo implica un sobrecoste alimentario.
Según Jiwyam (2010), un cultivo de tilapia del Nilo con alimentación restringida a cierto
nivel es más rentable que el basado en una alimentación a saciedad. En el período de
alimentación restringida, la eficiencia de conversión del alimento descendió con el aumento de
la ración, de forma similar a un estudio previo también en tilapia (Xie et al., 1997). Esto ratifica
la importancia de definir una adecuada tasa de alimentación con el fin de abaratar los costes de
producción.
Fontaine et al. (1997) determinaron, en un experimento con Perca fluviatilis, que
distinto tamaños de ración no generaban diferencias en cuanto a la tasa de conversión de
alimento, pero sí observaron que la tasa de crecimiento fue mucho menor para los peces
alimentados con la ración más baja, indicando que los animales alimentados con la misma
estaban sólo ligeramente por encima del mantenimiento (Mélard et al., 1995). Por otro lado, un
aumento del tamaño de ración diaria al 3% del peso corporal mejoró ligeramente la tasa de
crecimiento, pero redujo significativamente su índice de utilización.
En un experimento llevado a cabo por Puvanendran et al. (2003) con Limanda ferruginea
alimentada con diferentes tamaños de ración, se puso de manifiesto que los animales
alimentados con una ración diaria del 3% de su peso corporal, presentaron un mayor peso final
que los que se alimentaron al 1, 1.5 o 2%. Sin embargo, los alimentados al 3% mostraron una
tasa de conversión del alimento significativamente peor que los alimentados con raciones más
pequeñas, lo que indica un mayor desperdicio del alimento en aquellos. Una vez más, la máxima
eficiencia de conversión del alimento se produjo con raciones submáximas.
Durante el preengorde de alevines de corvina (6-20 gramos) se estableció que la tasa de
alimentación óptima a 24-25°C era de 2.5 a 5% peso corporal/día (Bajandas et al., 2009a, b, c).
Mientras que para corvinas en engorde (40-100 gramos) esa tasa óptima era de sólo 0.5 y 1%
peso corporal/día (Velazco et al., 2009).
17
Sergio García Mesa
I.2.2. Determinación de la frecuencia alimentaria óptima.
La gestión de la alimentación en términos de la optimización de la tasa y frecuencia
alimentaria se ha convertido en una exigencia en el cultivo de peces de agua dulce y salada, y en
una de las áreas cruciales de investigación en piscicultura. Controlando la frecuencia alimentaria
óptima, los acuicultores pueden reducir el coste del alimento y maximizar el crecimiento y
también ser capaces de reducir efectos negativos como la variación del tamaño de los individuos
y sobre la calidad del agua. Ya hemos indicado que el crecimiento puede verse afectado
significativamente por la frecuencia alimentaria, la cual afecta notablemente a la ingesta y
asimilación del alimento. (Marimuthu et al., 2010).
El alimento debe ser suministrado con una frecuencia tal que permita su adecuada
ingesta para obtener la mejor tasa de crecimiento (Ruohonen et al., 1998; Lee et al., 2000;
Dwyer et al., 2002; Wang et al., 2007).
Es evidente que la determinación de la frecuencia óptima de alimentación puede ser
abordada desde dos diferentes puntos de vista. El primero es el económico, que determina los
beneficios de una producción acuícola y el otro es desde el punto de vista de la fisiología del
propio pez.
I.2.2.1. IMPORTANCIA DE LA FRECUENCIA ALIMENTARIA EN EL CRECIMIENTO.
Definir una frecuencia alimentaria semanal óptima persigue que las tasas de crecimiento
sean buenas, obteniendo unas altas tasas de eficiencia alimentaria y retención proteica,
parámetros que nos indican el buen desarrollo del cultivo y aprovechamiento del alimento. La
eficiencia alimentaria valora la proporción de alimento que sería empleada con fines
metabólicos y energéticos, tanto para el crecimiento como para el mantenimiento mientras que
retención proteica nos informa del aprovechamiento de la proteína suministrada con el alimento
con fines de crecimiento. Además, existe otro tipo de índices morfológicos que nos indican
rápidamente el estado nutricional, así como la condición fisiológica de los peces, como son el
índice de condición, el índice hepatosomático o el índice viscerosomático (Desai y Singh, 2009).
Ganancia de peso, eficiencia alimentaria e índice de condición son herramientas útiles que nos
podrían ayudar a definir la frecuencia alimentaria más idónea de la corvina sin necesidad de
emplear técnicas más específicas y complejas.
Según Thia-Eng y Seng-Keh (1978) la mejor frecuencia alimentaria para Ephinephelus
tauvina, a juzgar por los datos de crecimiento y eficiencia alimentaria, era de una comida cada 2
días, frente a frecuencias más bajas (una comida cada 5, 4 ó 3 días) o más altas (una comida al
día). Resultados similares obtuvieron Lambert y Dutil (2001) con bacalao, que al ser alimentado
cada 2 días crecía más que cuando el alimento se administraba cada 3 ó 5 días. Wang et al.
(2007) encontraron que Nibea miichthioides necesita alimentarse al menos una vez al día, ya que
la ganancia de peso fue mejor en este caso que cuando se les alimentó una vez cada dos días, si
bien el aumento de la frecuencia a dos veces por día no significó cambio significativo alguno.
18
Introducción
Generalmente, a la hora de decidir el régimen de alimentación adecuado se consideran el
crecimiento y la utilización del alimento, pero también los costes derivados de las labores de
alimentación ya que la alimentación de los peces es laboriosa pues cuando son criados en jaulas
se alimentan generalmente de forma manual; por lo tanto, se recomienda tener en cuenta no
sólo crecimiento y conversión sino también coste laboral.
El efecto de la frecuencia alimentaria semanal también fue medido por El-Sayed et al.
(2005) en tilapia del Nilo. Esto autores no obtuvieron diferencias significativas en el peso final ni
en el SGR para grupos de peces alimentados 6 o 7 días a la semana, mientras que grupos que se
alimentaron 4 o 5 días presentaron valores significativamente más bajos. Cuando la tilapia se
alimenta a saciedad 6 días a la semana parece incrementar su capacidad de ingerir alimento
para compensar el día de ayuno y, consecuentemente, el crecimiento fue similar con respecto a
grupos alimentados 7 días a la semana. Aunque la ingesta de alimento no presentó diferencias
significativas entre tratamientos, la frecuencia 6 días a la semana presentó los mejores índices
de conversión de alimento.
I.2.2.2. IMPORTANCIA DE LA FRECUENCIA ALIMENTARIA EN LA COMPOSICIÓN
CORPORAL.
La frecuencia de alimentación también tiene efecto sobre la composición corporal de los
animales. Una alimentación poco frecuente en ratas provoca una lipogénesis adaptativa,
aumenta la síntesis de lípidos a causa de una mayor actividad de las enzimas del tejido adiposo.
La posibilidad de adaptarse a alimentaciones poco frecuentes, de forma similar a lo que se ha
observado en ratas, podría producirse en peces y tener importancia en la piscicultura,
especialmente en términos de eficiencia y calidad. También se ha observado en truchas
alimentadas con frecuencias altas una mayor presencia de depósitos lipídicos (Grayton y
Beamish, 1977). Otra respuesta a una alimentación poco frecuente es un descenso en la tasa
metabólica e hiperlipogénesis, estas situaciones tienden a desarrollar la hiperfagia de los peces
y, por tanto, la explosión de alimento ingerido conduce a que se metabolice y sea almacenado
en forma de lípidos de reserva.
Se ha descrito en varias especies que el contenido lipídico corporal aumenta con la
frecuencia alimentaria (Grayton y Beamish, 1977; Kayano et al., 1993; Yao et al., 1994; Lee et
al., 1996). Resultados obtenidos por Lee et al. (2000) indican que la frecuencia alimentaria tiene
un notable efecto en la composición corporal en Sebastes schlegeli, sobre todo de la fracción
lipídica y proteica en diferentes compartimentos corporales como hígado, músculo y paquete
visceral. Una menor frecuencia alimentaria provocó un aumento significativo del contenido de
agua en músculo e hígado, sin embargo el paquete visceral no se vio afectado; al aumentar la
frecuencia alimentaria aumentó el contenido lipídico de músculo, hígado y paquete visceral.
La composición corporal del pez gato africano también se vio afectada por la frecuencia
alimentaria (Marimuthu et al., 2010): administrar una ración al día o cada 2 días condujo a un
descenso del contenido lipídico, frente a frecuencias de 2 raciones diarias o cada 2 días. Por lo
19
Sergio García Mesa
tanto parece constatable que una menor frecuencia alimentaria conlleva un menor contenido
lipídico; sin embargo otros autores como Van Ham et al. (2003) y Wang et al. (2009), parecen
proponer que el aumento de frecuencia alimentaria conlleva a una disminución de la retención
lipídica y proteica.
I.2.2.3. IMPORTANCIA DE LA FRECUENCIA ALIMENTARIA EN EL RANGO DE
TAMAÑOS.
Cuando los peces se están criando en condiciones de cultivo intensivo, a menudo se
produce, con el tiempo, un aumento del rango o dispersión de tamaños dentro del grupo, mayor
del que se esperaría en la naturaleza. Este aumento extra de la variación del tamaño se ha
explicado por el establecimiento de una jerarquía con dominancia social de algunos individuos
más fuertes en las condiciones de cría intensiva (Thomassen y Fjaera, 1996). Una estrategia
alimentaria apropiada resultaría en una reducción en el rango de tamaños (Fontaine et al.,
1997). Kadri et al. (1996) sugieren que, para prevenir la monopolización del alimento por
algunos individuos, el mismo debería administrarse de manera impredecible en el tiempo y en
el espacio. Con esto también se evitaría el canibalismo normalmente asociado con tamaños
heterogéneos de la población, disponibilidad limitada de alimento, refugios escasos, etc.
(Marimuthu et al., 2010).
Las diferencias en el tamaño corporal, por medio de su impacto sobre la capacidad
individual de competir socialmente, podrían generar un menor crecimiento global. A luz de estas
palabras, el régimen alimentario debe ofrecer la oportunidad para que todos los peces coman
cuando se administra la comida y así reducir el efecto de la jerarquización. Goddard (1996)
propuso que si los peces reciben su ración diaria en pocas comidas, los más grandes o agresivos
podrían alimentarse a expensas de los más pequeños. Es posible que los más grandes se
alimenten a tasas máximas, mientras que otros del mismo grupo tendrían restringido el
alimento.
Grayton y Beamish (1977) encontraron un patrón de crecimiento similar para peces que
recibieron una dieta restringida del 2%, siendo la variabilidad entre individuos menor que
cuando se alimentaron a saciedad.
Como hemos visto, la frecuencia alimentaria, entendida como número de comidas al día,
se ha postulado como un eficaz modulador de la dispersión de tamaños en peces, de modo que
se asegura que todos los peces reciben alimento a lo largo del día, los peces más agresivos se
alimentarán con las primeras comidas del día, pero una vez saciados van a permitir alimentarse
al resto. No hemos encontrado en la literatura trabajos que exploren el efecto de la frecuencia
alimentaria semanal sobre la distribución de tamaños o jerarquías en producciones acuícolas.
El metabolismo del pez se ve influenciado por multitud de factores, como la temperatura
del agua, el tamaño/edad del individuo, la cantidad y calidad del alimento, etc. (Grayton y
Beamish, 1977); por lo tanto, la frecuencia con que algunos animales se alimentan puede afectar
20
Introducción
substancialmente a su metabolismo (Fabry, 1967; Kekwick y Pawan, 1971). A pesar de que no
hay estudios preliminares del efecto de la frecuencia alimentaria semanal sobre el metabolismo
en la bibliografía, cabe esperar modificaciones en las principales rutas metabólicas.
I.3. ASPECTOS DE FISIOLOGÍA DIGESTIVA.
I.3.1. El tracto digestivo
El tracto digestivo de los peces presenta una gran diversidad. En general el aparato
digestivo es una estructura tubular en la cual se pueden establecer cuatro zonas: cavidad oral
(bucal) que se encuentra asociada a la cavidad faríngea o branquial; digestivo anterior
compuesto por el esófago, estómago y píloro; digestivo medio, la porción de mayor longitud,
que incluye los ciegos pilóricos; y el digestivo posterior, cuya parte final es el ano.
El estómago puede presentar formas muy diversas, desde un tubo simple hasta un saco
bien diferenciado. En algunas especies está ausente. El tracto intestinal de los peces puede
variar desde muy corto y estrecho a largo y dispuesto en espiral o bucle. La longitud
generalmente se correlaciona con los hábitos de alimentación: peces herbívoros que consumen
alimentos difíciles de digerir poseen a menudo un intestino más largo que los peces carnívoros
(Stevens, 1988). Es difícil diferenciar a simple vista las distintas partes del intestino, ya que
carece de diferencias anatómicas externas en su trayectoria, si bien las diferencias histológicas y
funcionales son patentes.
Una particularidad importante es la presencia de apéndices o ciegos pilóricos,
divertículos terminales en la parte proximal del intestino, que aumentan la superficie de
absorción incrementando la eficacia digestiva, ya que normalmente se trata de un tracto
intestinal relativamente corto (Buddington y Diamond, 1987). Los ciegos pueden variar en
tamaño y forma, desde pequeñas evaginaciones de la pared intestinal a estructuras tubulares,
ramificadas similares a mechones. El número y las formas de los ciegos varían
considerablemente entre las especies; van desde unos pocos (2-4) a varias decenas (Stevens,
1988; Jobling, 1995). Las secciones histológicas muestran que el apéndice pilórico se alinea con
los enterocitos, que son similares a los de la pared intestinal. Su función es retrasar el paso de
los alimentos (Stevens, 1988) mediante el aumento de superficie intestinal sin aumentar la
longitud o el grosor del intestino (Buddington y Diamond, 1987). En varias especies de peces se
ha encontrado una actividad enzimática muy alta en los ciegos pilóricos (Harpaz y Uni, 1999;
Krogdahl et al, 1999; Harpaz et al., 2005a, b), también juega un papel importante en la absorción
de los nutrientes digeridos (Bell et al., 1987; Horn, 1998). Más de la mitad de la proteína
dietética se digiere y se absorbe en estos divertículos (Krogdahl et al., 1999).
21
Sergio García Mesa
I.3.2. Enzimas digestivas
La hidrólisis de las proteínas, lípidos y carbohidratos del alimento son procesos
enzimáticos y, por lo tanto, específicos que necesitan un cierto número de enzimas digestivas
intraluminales extracelulares que son secretadas en las distintas partes del tubo digestivo.
Las enzimas digestivas de peces presentan características que las diferencian de sus
homólogas en mamíferos. Uno de los factores más importantes que determinan estas
diferencias es el carácter poiquilotermo de estos animales, que hace que la temperatura sea el
principal factor ambiental que afecta al proceso de adaptación de estos organismos. Las especies
que habitan en medios a bajas temperaturas han sufrido una serie de adaptaciones evolutivas
con el fin de mantener la actividad fisiológica de sus enzimas a estas temperaturas (Kristjansson
y Nielsen, 1992).
El equipamiento de enzimas digestivas no es el mismo en todas las especies de peces.
Además, la actividad de las enzimas digestivas puede variar con la edad del pez, su estado
fisiológico y la estación del año. Cada enzima digestiva presenta un rango de pH y temperatura
óptimos para su actividad fuera del cual se produce una rápida y marcada disminución de la
misma. Dentro del rango óptimo, la secreción y la actividad enzimática aumentan al hacerlo de
la temperatura. En la mayoría de las especies el pH óptimo de las enzimas gástricas se sitúa en
torno a 2.0 (Glass et al., 1989). Por otra parte, las enzimas gástricas de animales que habitan
medios fríos poseen puntos isoeléctricos relativamente mayores que los de sus homólogas en
mamíferos (Arunchalan y Haard, 1985). Por lo que respecta a las enzimas intestinales, presentan
el óptimo de actividad a un pH más alcalino, entre 7.0 y 10.0 (Kristjansson y Nielsen, 1992).
Las etapas finales de la degradación y la asimilación de los nutrientes se producen
gracias a las enzimas y los transportadores que están unidos a la superficie del borde en cepillo
(microvellosidades) de las células intestinales. Procesos enzimáticos y celulares transfieren
pasiva y activamente nutrientes de todo tipo desde el lumen, a través del borde en cepillo, al
interior de los enterocitos.
I.3.2.1. PROTEASAS Y PEPTIDASAS
De todas las enzimas digestivas, las proteasas son quizá las más importantes ya que
catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos que forman la estructura primaria de las
proteínas, componente principal de la dieta en animales carnívoros. Además de estar implicadas
en los procesos de digestión, las proteasas tienen otras funciones como la activación de
proenzimas y prehormonas. La digestión proteica ocurre en el lumen del tracto digestivo de una
manera secuencial, donde las proteínas se degradan a polipéptidos por proteasas y los
polipéptidos a aminoácidos libres.
Las proteasas, al ser hidrolasas específicas de enlaces peptídicos, se agrupan bajo el
código EC 3.4. Dentro de ellas, existen dos subgrupos: las exopeptidasas, que hidrolizan enlaces
22
Introducción
peptídicos entre aminoácidos terminales (extremo amino o carboxilo de la proteína), se agrupan
bajo EC 3.4.11-19 mientras que las endopeptidasas, que hidrolizan enlaces peptídicos internos,
pertenecen a la categoría EC 3.4.21-24. Asímismo, se clasifican de acuerdo con su mecanismo de
acción, donde se reconocen 4 grupos principales: 1. Serina-proteasas (EC 3.4.21) que poseen un
grupo serina en el centro activo, así como histidina y aspártico. 2. Cisteína-proteasas (EC 3.4.22)
que se caracterizan por la presencia del grupo cisteína (-SH) en su centro catalítico. 3. Proteasas
ácidas o aspárticas (EC 3.4.23) que se definen por la presencia de ácido aspártico en el centro
activo y poseen máxima actividad a pH ácido. 4. Metaloproteasas (EC 3.4.24) que poseen un
residuo de ácido glutámico en el centro activo y requieren de un catión divalente (Zn, Ca o Mg)
para catalizar la hidrólisis del enlace peptídico.
Dentro del grupo de las endoproteasas se encuentra la pepsina (EC 3.4.23.1), gastricsina
(EC 3.4.23.3) y la quimosina o renina (EC 3.4.23.4) que son proteasas ácidas presentes en el jugo
gástrico de muchos organismos. En el intestino de muchas especies se ha detectado otro tipo de
enzimas que funcionan a pH alcalino como la tripsina (EC 3.4.21.4) que es una endoproteasa
pancreática que hidroliza los enlaces peptídicos entre lisina y arginina. La quimotripsina (EC
3.4.21.1) también es una serina proteasa cuya especificidad de sustrato implica l-isómeros de
tirosina, fenilalanina y triptófano; también actúa sobre amidas y ésteres. Las catepsinas son
enzimas relacionadas con los procesos de digestión intracelular. En el caso de las exoproteasas
se pueden mencionar las aminopeptidasas (EC 3.4.11) las cuales catalizan la hidrólisis de los
restos aminoacídicos, concretamente desde el extremo amino de un péptido y las
carboxipeptidasas que liberan residuos aminoacídicos del extremo carboxi terminal de los
péptidos y proteínas. Se conocen dos familias de carboxipeptidasas: las serina carboxipeptidasas
(EC 3.4.16), que contienen un residuo de serina en su centro activo y las metalo
carboxipeptidasas (EC 3.4.17) que requieren de iones Zn para ser activas.
La proteína ingerida es digerida en primer lugar en el estómago por la pepsina,
posteriormente se produce una digestión adicional en el intestino por la acción de peptidasas
pancreáticas como la tripsina, quimotripsina y la elastasa (todas endopeptidasas). También
actúan carboxipeptidasas y una gran variedad de peptidasas del borde en cepillo de los
enterocitos como endopeptidasas (EC 3.4.11.?), aminopeptidasa A (EC 3.4.11.7) y N (EC 3.4.11.2)
y dipeptidil aminopeptidasa N (EC 3.4.14.5). En peces agastros, la digestión proteica se lleva a
cabo en el intestino proximal y ocurre a pH neutro-básico, el aumento de la longitud intestinal
suple la deficiencia de estómago.
El páncreas es el principal órgano secretor de proteasas. En algunos peces, como los
salmónidos, que carecen de una glándula pancreática bien definida, la síntesis de proteasas
pancreáticas se localiza en tejidos localizados en las proximidades de los ciegos pilóricos como
hígado, mesenterio intestinal, vesícula biliar e incluso la bilis, que muestran una clara actividad
proteolítica (Einarsson y Davies, 1996). Otras fuentes importantes de actividad proteolítica son
el intestino y los ciegos pilóricos. Los acinos exocrinos están uniformemente distribuidos a lo
largo de los ciegos pilóricos y alrededor de la grasa (Pringle et al., 1992; Einarsson y Davies,
1996) y las proenzimas que sintetizan se transfieren al tejido pilórico a través de un sistema
23
Sergio García Mesa
multiductal (Einarsson y Davies, 1997). Como en mamíferos, la secreción enzimática digestiva se
activa por la hormona CCK que, a su vez, se libera por la presencia de productos de la digestión,
grasas y proteínas (Liddle, 2000).
Las proteasas digestivas son secretadas por el páncreas en formas inactivas (zimógenos),
que se activan en el interior del intestino mediante la acción de la enteroquinasa, una enzima
secretada por la pared intestinal, y tripsina, evitando así que ataquen a tejidos propios antes de
su liberación. Esta activación de proteasas pancreáticas por enzimas intestinales es la causa de
que la actividad proteolítica de la mezcla de las enzimas pancreáticas con las intestinales sea
mayor que la de cada una por separado.
Las especies carnívoras suelen tener una alta actividad de pepsina y una menor de las
proteasas pancreáticas, tripsina y quimotripsina (Sabapathy y Teo, 1993; Jobling, 1995). Los
estudios han demostrado que algunos peces herbívoros presentan actividades de tripsina
similares o incluso superiores a las especies carnívoras. Se podría decir que los peces carnívoros
se basan principalmente en la pepsina para la digestión de proteínas, ya que puede digerir
oligoproteínas e incluso las macromoléculas de proteínas (Sabapathy y Teo, 1993). Por otro lado,
los peces herbívoros podrían compensar la reducida presencia de proteína en su dieta natural
por el aumento de su actividad enzimática (Sabapathy y Teo, 1993, Hidalgo et al., 1999),
posiblemente para maximizar la eficiencia de las proteínas digestivas (Chan et al., 2004).
De todas las proteasas pancreáticas, la tripsina es de particular importancia porque
activa a las otras proteasas durante los procesos de digestión; el desarrollo de la actividad
tripsina en etapas tempranas de la vida de los peces es utilizado comúnmente como indicador
de desarrollo del sistema digestivo y actividad alimentaria exógena en larvas (Zambombino
Infante y Cahu, 1994; Ueberschär, 1993). La actividad tripsina está influenciada por un amplio
rango de factores como la talla de pez, el tiempo después de la alimentación, variaciones
estacionales, estado nutricional, temperatura del agua y presencia de inhibidores de la tripsina
en el alimento (Sunde, 2006).
Las isozimas son proteínas enzimáticas que llevan a cabo la misma función enzimática
pero son estructuralmente diferentes (difieren en la secuencia de aminoácidos); suelen mostrar
diferentes parámetros cinéticos o propiedades de regulación diferentes. La existencia de las
isozimas permite el ajuste del metabolismo para satisfacer las necesidades particulares de un
determinado tejido o etapa del desarrollo. Son consecuencia de un mecanismo de adaptación
que permite a individuos expuestos a cambios frecuentes en su medio ambiente la necesaria
flexibilidad metabólica para afrontarlos. Las proteasas digestivas de los peces permiten esta
flexibilidad metabólica dado la variedad de proteasas observadas en un amplio rango de
especies. En estos animales se han descrito múltiples formas de tripsina y de quimotripsina
(Sunde, 2006). La ventaja de varios tipos de tripsina puede ser proveer de un arsenal de enzimas
con propiedades catalíticas diferentes (Outzen et al., 1996) o diferente especificidad por el
sustrato. En organismos poiquilotermos como los peces, y particularmente los que viven en
ambientes marinos fríos, la tripsina muestra una considerable mayor eficiencia catalítica que las
24
Introducción
de mamíferos (Ahsan y Watabe, 2001); posiblemente debido a una respuesta evolutiva dirigida
aumentar su afinidad por el sustrato a bajas temperaturas.
Varios autores han propuesto que la digestión de las proteínas, en particular la mediada
por tripsina, es un potencial factor limitante de la tasa de crecimiento y utilización de la dieta
por los peces (Torrissen y Shearer, 1992; Blier et al., 1997; Lemieux et al., 1999; RungruangsakTorrissen et al., 1999; Rungruangsak-Torrissen y Male, 2000; Rungruangsak-Torrissen et al.,
2006). Esta hipótesis se basa, en parte, en la estrecha relación observada entre la presencia de
determinadas isozimas de la tripsina y el aumento de la tasa de crecimiento y la utilización de la
dieta en el salmón (Torrissen, 1987). Se ha comprobado que la presencia de isozimas específicas
de la tripsina puede aumentar la utilización del alimento a bajas temperaturas (Torrissen y
Shearer, 1992; Rungruangsak-Torrissen et al., 1998) o aumentar la utilización de las proteínas de
alimentos de baja digestibilidad (Bassompierre et al., 1998).
I.3.2.2. LIPASAS
Las lipasas son enzimas que pertenecen a la familia serín-proteínas y llevan a cabo la
hidrólisis extracelular de los lípidos (Higgs y Dong, 2000) en estómago, intestino y ciegos
pilóricos (Sargent et al., 1989; Smith, 1989). En la mayoría de las especies, la hidrólisis lipídica
comienza en los ciegos pilóricos e intestino anterior; sin embargo, en algunas de ellas se ha
detectado una lipólisis en el estómago catalizada por una lipasa gástrica (Gisbert et al., 1999).
La lipasa pancreática (EC 3.1.1.3), en presencia de un factor llamado colipasa, hidroliza
los triglicéridos para formar diacilglicerol, monoacilglicerol y ácidos grasos libres (Murray et al.,
2003). La lipasa presente en los fluidos intestinales de los peces no es específica e hidroliza
ácidos grasos con igual facilidad para las tres posiciones del glicerol de los triglicéridos (Cowey y
Sargent, 1979). Los ácidos grasos y monogliceroles se agregan con las sales biliares en pequeñas
micelas. Cuando se unen al borde en cepillo su contenido se libera en el enterocito. Sin
embargo, los ácidos grasos de cadena corta pueden ser absorbidos sin sales biliares (Horn,
1998).
Algunas esterasas (EC 3.1.1.1), que preferentemente actúan sobre ésteres simples de
ácidos grasos con bajo peso molecular, poseen la capacidad, al igual que las lipasas, de hidrolizar
triglicéridos; sin embargo, se distinguen de estas últimas porque hidrolizan sustratos solubles.
Las actividades esterasa y lipasa dependen de la presencia de sustancias activadoras
tales como las sales biliares o de la temperatura. La actividad lipasa en peces parece ser mayor
que en mamíferos. Su acción depende de la presencia de las sales biliares, las cuales son
detergentes que emulsionan los lípidos y facilitan la acción de las enzimas lipolíticas.
25
Sergio García Mesa
I.3.2.3. CARBOHIDRASAS
Las carbohidrasas llevan a cabo la lisis extracelular de los hidratos de carbono complejos
en el estómago, intestino y ciegos pilóricos (Sabaphaty y Teo, 1993), estas enzimas están tanto
en el lumen del intestino y ciegos como asociadas a la membrana, en el glucocalix. Los productos
de esta hidrólisis son polisacáridos y azúcares simples que pueden ser más fácilmente
asimilados.
La principal carbohidrasa es la α-1-4 glucosidasa o α-amilasa (EC 3.2.1.1.), está presente
en el jugo pancreático de gran cantidad de animales ya que hidroliza indistintamente enlaces a
lo largo de la cadena del polímero hidrocarbonado α 1-4 de la amilosa o fragmentos lineales de
la amilopectina o del glucógeno. Por su parte, la β-amilasa hidroliza los carbohidratos por el
extremo no reductor y se restringe exclusivamente al reino vegetal. Finalmente, las fosfatasas
ácida y alcalina (EC 3.1.3.2. y 3.1.3.1.) que catalizan la separación de P inorgánico a partir de
fosfato orgánico, se encuentran en los epitelios intestinales y en diferentes capas tisulares del
estómago. Su papel fisiológico en los vertebrados superiores está relacionado con los procesos
de mineralización de los huesos, así como en procesos de transporte a través de membrana. De
hecho, ambas fosfatasas se asocian con el transporte activo de glucosa, proteína y lípidos, e
incluso de agua e iones en el caso de la fosfatasa alcalina.
El pH óptimo de estas enzimas está próximo a la neutralidad (Thoma et al., 1971), sin
embargo, resultados reportados por Fernández et al. (2001) indican la existencia de posibles
isozimas con máximos de actividad a diferentes pHs.
Los peces son generalmente considerados poco aptos para digerir polisacáridos, aunque
en todas las especies estudiadas se ha puesto en evidencia una importante actividad amilasa
que, en todos los casos, tiene origen pancreático (Sabapathy y Teo, 1993). Se ha comprobado
que la relación de actividades amilasa/proteasa de diferentes especies es un buen indicador del
régimen alimentario de un pez. Así, los peces carnívoros están caracterizados por valores
menores de esta relación que los peces herbívoros u omnívoros (Albertini-Berhaut, 1980), y
presentan una peor digestibilidad para los hidratos de carbono. Las especies herbívoras
presentan mayor actividad amilasa (Hidalgo et al., 1999). La mayoría de autores sugieren que en
el pez carnívoro sólo se secreta una limitada cantidad de amilasa y, por tanto, su actividad está
restringida a digerir sólo pequeñas concentraciones de almidón (Furné, 2008). Por el contrario,
en algunos peces herbívoros la actividad de lipasas y proteasas es mínima, mientras que en
peces carnívoros es alta (Martínez Palacios y Ríos Durán, 2003).
26
Introducción
I.4. METABOLISMO INTERMEDIARIO EN PECES
La regulación del metabolismo en peces es compleja, y responde, como en mamíferos, a
estímulos de origen hormonal y enzimático que se presentan acorde con las condiciones
ambientales, nutricionales y reproductivas (Seiliez et al., 2011). Además, el carácter
poiquilotermo de los peces implica que la cinética de sus reacciones físicoquímicas internas sea
dependiente de las características térmicas del medio que rodea al animal (Cowey y Luquet,
1983).
El metabolismo intermediario comprende todas las reacciones que ocurren a nivel
celular y del organismo, involucradas con el almacén y generación de energía metabólica con el
fin de utilizar esa energía para la biosíntesis. Las rutas centrales del metabolismo intermediario
son pocas y están altamente conservadas: a grandes rasgos, la maquinaria metabólica de peces
es muy parecida a la de mamíferos. Sin embargo, las necesidades energéticas de los peces
dependen de cada especie y, dado en el medio en el que viven, van a presentar unas ciertas
ventajas y desventajas frente a mamíferos. La principal ventaja es la posibilidad de excretar los
desechos nitrogenados en forma de amonio a través de las branquias. Estas particularidades
hacen que el metabolismo intermediario difiera del de mamíferos en cuanto a su regulación,
sensibilidad a factores bióticos y abióticos y el papel exacto que juegan los órganos y tejidos
(Dabrowski y Guderley, 2002).
Generalmente, en los sistemas multienzimáticos sólo unas cuantas enzimas, llamadas
enzimas reguladoras, son las que marcan el flujo de la vía. Los mecanismos de regulación de
estas enzimas atienden básicamente a dos tipos de control: uno grosero, que se produce de
forma lenta y con variación de la cantidad de enzima, y uno fino, regulación alostérica, que es
mucho más rápido, variando la actividad por cambios de la Km del enzima. La actividad de estas
enzimas se ve modificada por varios factores, además del sustrato, tales como pH, efecto iónico,
concentración de nucleótidos y metabolitos que ejercen un control feed-back al igual que en
vertebrados superiores (Hall y Cottam, 1978).
I.4.1. Metabolismo hepático
I.4.1.1. METABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO.
La importancia de la glucosa en el metabolismo de los peces ha sido estudiada por
numerosos investigadores (Shiau, 1997; Moon, 2001; Legate et al., 2001; Hemre et al., 2002;
Krogdahl et al., 2005; Seiliez et al., 2011). No obstante, los carbohidratos de la dieta no son el
principal recurso de energía y carbono para la mayoría de los peces. Existen estudios que
demuestran que la utilización metabólica de la glucosa absorbida puede ser escasa,
encontrándose altos niveles de glucemia postprandial en la mayor parte de los teleósteos, con
ligeras diferencias entre las especies (Bergot, 1979). Esta glucemia prolongada parece estar
relacionada con la tasa de fosforilación de la glucosa debida a la reducida capacidad de las
27
Sergio García Mesa
enzimas encargados de realizar este proceso, o bien a la diferente receptividad tisular a la
glucosa (Nagayama y Oshima, 1974). Las actividades glucolíticas en peces son más elevadas en el
músculo cardíaco y esquelético y más reducidas en el hígado (Knox et al., 1980).
A pesar de este mal uso de la glucosa, la inclusión de carbohidratos en la dieta permite
un ahorro de proteína al disminuir su uso energético o gluconeogénico, confirmado por la
prolongada hiperglucemia postprandial producida por los altos niveles de aminoácidos en la
dieta observada en varias especies de peces. Esta elevada ingesta en aminoácidos provoca una
persistente síntesis de glucosa hepática por inducción de las enzimas gluconeogénicos (Kirchner
et al., 2003).
I.4.1.1.A. GLUCOLISIS
Es la vía principal del catabolismo de la glucosa en los tejidos de los peces, implica la
oxidación gradual de la misma hasta su transformación en piruvato y ATP y se halla
estrechamente coordinada con otras rutas metabólicas de generación y utilización de energía
como la síntesis y degradación de glucógeno, la gluconeogénesis, la ruta de las pentosas fosfato,
el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y la fosforilación oxidativa.
La regulación de esta vía es compleja y responde a una serie de estímulos hormonales y
enzimáticos, además de estímulos ambientales como puede ser la temperatura. Podemos
enfocar la atención sobre determinadas enzimas que son las que van a marcar verdaderamente
el flujo de degradación de la glucosa. Estas enzimas reguladoras de la glucolisis son la
Fosfofructoquinasa (PFK, E.C. 27.1.1.11) y la Piruvato quinasa (PK, E.C. 27.1.1.40), aunque
también podemos considerar como tal a la Hexoquinasa (HK, E.C. 27.1.1.10) que cataliza la
incorporación de glucosa a esta vía, un paso regulado por el producto de dicha reacción, la
glucosa 6P.
Diferentes autores sugieren un mecanismo de regulación atípico después de una ingesta
de hidratos de carbono, como una baja capacidad para la fosforilación de la glucosa por la HK, lo
que se ha confirmado por la pobre utilización de glucosa exógena en músculo de trucha (Kam y
Milligan, 2006; Kirchner et al., 2003). También se ha comprobado que dietas ricas en
carbohidratos no afectan a la actividad o niveles de ARNm de las enzimas claves de la
gluconeogénesis hepática de la trucha (Kirchner et al., 2005, Panserat et al., 2000, 2001) en
contraste con lo que ocurre en mamíferos (Díaz et al., 2007).
Comparada con el resto de las enzimas glucolíticas, la HK hepática muestra poca
actividad en trucha arcoíris (Driedzic y Hochachka, 1978), de hecho, es 25 veces menor que la
actividad presentada por PFK y 45 veces menor que la de PK (Fideu et al., 1983; Cowey et al.,
1977). Su actividad aumenta con una dieta rica en hidratos de carbono y disminuye con una rica
en proteínas o durante el ayuno (Fideu et al., 1983; Furné et al., 2011; Pérez-Jiménez et al.,
2011). Se ha observado que aquella inducción por hidratos de carbono, tanto a nivel enzimático
28
Introducción
como molecular (Panserat et al., 2000) y parece ser que se debe al aumento postprandial de la
glucosa (Panserat et al., 2001).
La PFK, que cataliza la reacción de segunda fosforilación de la glucosa, se considera
como la primera enzima clave en la regulación de esta ruta tanto en mamíferos como en peces y
otros animales (Knox et al., 1980) habiendo sido detectada en casi todos los tejidos. Presenta
una actividad menor comparada con el resto de las enzimas de la glucolisis, lo que puede
confirmar su papel regulador del flujo glucolítico. Se ha observado una mayor actividad de esta
enzima en peces omnívoros, como la carpa, que en carnívoros (Shimeno, 1982).
La PK cataliza la reacción de conversión del fosfoenolpiruvato (PEP) en piruvato. Esta
enzima puede jugar dos papeles importantes, como reguladora del flujo glucolítico y como
reguladora de la gluconogénesis de forma indirecta ya que durante periodos de alto flujo
gluconeogénico se piensa que podría disminuir su actividad para evitar ciclos innecesarios de
carbono a través de PEP, piruvato y oxalacetato (Korsgaard y Mommsem, 1993). La distribución
de esta enzima ha sido estudiada en bacalao, platija y trucha por Knox et al.
(1980),
presentando valores relativamente más altos en músculo esquelético que en hígado, riñón y
branquias (Knox et al., 1980).
Se ha comprobado que la composición de la dieta, sobre todo por lo que se refiere al
contenido de hidratos de carbono, afecta al flujo glucolítico. Así, el incremento de los
carbohidratos de la dieta va a producir aumentos de la actividad PK en respuesta a la alta
disponibilidad de glucosa. La mayoría de los autores han confirmado este aumento del flujo
glucolítico, y por lo tanto de la PK hepática, en distintas especies de peces como la trucha
arcoíris (Sánchez-Muros, 1990), anguila europea (Suárez et al., 1995), carpa (Shikata et al.,
1994) y dorada (Meton et al., 1999). Las dietas con alto contenido proteico parecen ejercer un
efecto parecido sobre esta actividad (Lupiañez et al., 1989), debido a que los aminoácidos
estarían a altos niveles y parte de ellos serían oxidados incorporándose a la glucolisis y
posteriormente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT), para producir energía. Las dietas altas
en grasa proporcionan datos dispares. Así, en hígado de trucha se han registrado niveles
aumentados de actividad PK (Hilton y Atkinson, 1982; Sánchez-Muros, 1990). Esta situación
nutritiva elevaría la cantidad de ácidos grasos disponibles que se podrían oxidar en el CAT. En
anguila, sin embargo, no se han observado diferencias significativas atribuibles a los niveles de
grasa de la dieta, incluso se observó una inhibición de esta actividad (Suárez et al., 1995).
Hay autores que consideran a la PK como la enzima clave del control del flujo glucolítico
en condiciones de privación de alimento (Sheridan y Mommsen, 1991; Borrebaek y
Christophersen, 2000), mientras que otros, como Collins y Anderson (1997), se inclinan por la
PFK como la reguladora del flujo en estas circunstancias. Así, en situación de ayuno, la actividad
PK descendió en dorada (Meton et al., 1999), perca dorada (Collins y Anderson (1997) y dentón
(Pérez-Jiménez et al., 2011). Sin embargo, Sánchez-Muros (1990) en la trucha no observó que la
PK se afectara por ello, ni tampoco la PFK, aduciendo que esto sería una consecuencia más de la
pobre utilización de la glucosa por parte de estos animales. Por su parte, Furné et al. (2011)
29
Sergio García Mesa
observaron tendencias opuestas de la actividad de esta enzima después de cinco días de ayuno
en esturión y trucha; así, se produjo un aumento de la actividad glucolítica (HK y PK) en esturión
mientras que en trucha disminuyó, indicando una menor capacidad de utilización de los
carbohidratos por esta especie.
La vuelta a la alimentación tras el ayuno tiene también un efecto claro en la actividad
glucolítica, en concreto en la de PK, resultando en la mayoría de los casos en un incremento
general de la misma (Collins y Anderson, 1997; Meton et al., 1999; Borrebaek y Christophesen,
2000; Pérez-Jiménez et al., 2011).
La Lactato deshidrogenasa (LDH, EC 1.1.1.27) es responsable de la conversión de
piruvato a lactato. El piruvato es convertido en acetil-coA y después en citrato en la mitocondria
por la Citrato sintasa que es la primera enzima del ciclo de los ATC (Elcock y McCammon, 1996).
I.4.1.1.B. VÍA DE LAS PENTOSAS FOSFATO.
Otra vía en la que se produje la degradación de la glucosa, aparte de la glucolisis, es la
vía de las pentosas fosfato. Esta es una ruta principalmente anabólica ya que produce
compuestos muy importantes para los procesos de biosíntesis, como poder reductor (NADPH)
para la síntesis lipídica y ribosa 5P para la síntesis de ácidos nucleicos.
Las enzimas reguladoras de esta vía son la Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (G6PDH,
E.E.1.1.1.49) y la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6PGDH, E.C.1.1.1.44) que catalizan dos pasos
claves en la misma, la deshidrogenación de la glucosa y la hidrólisis del fosfogluconato producido
hasta ribulosa 5-P. En las dos reacciones se genera NADPH. El hígado es el órgano donde se
registra la mayor actividad G6PDH (Nagayama et al., 1972; Shimeno, 1982), por lo que los
estudios en peces se han centrado fundamentalmente en este tejido (Barroso et al., 1994).
En general, la actividad G6PDH del hígado de los peces aumenta con la disponibilidad de
alimento (Storebakken et al., 1991) y el crecimiento (Walzem et al., 1991). Por el contrario,
condiciones como el ayuno reducen claramente esta actividad en el hígado de trucha arcoíris
(Barroso et al., 1999), dorada (Meton, 1999) y dentón (Pérez-Jiménez et al., 2011). La
realimentación produce el efecto contrario, un aumento de actividad G6PDH en dorada
(Bonamusa et al., 1989; Meton et al., 1999), trucha arcoíris (Barroso et al., 1999) y perca
(Borrebaek y Christofersen, 2000), siendo este incremento dependiente del nivel de
carbohidratos de la dieta (Meton et al., 1999; Borrebaek y Christofersen, 2000). Furné et al.
(2011), no observaron cambios en esta actividad durante 60 días de ayuno en trucha y esturión.
Sin embargo, con la realimentación aumentó la misma en trucha pero no en esturión.
Las dietas ricas en hidratos de carbono activan el flujo de la vía de las pentosas fosfato,
aumentando la energía disponible y produciendo así NADPH y esqueletos carbonados necesarios
para los procesos de biosíntesis, aunque este hecho no esté muy bien documentado en peces
dada su baja capacidad para metabolizar hidratos de carbono (Barroso et al., 2001). Las dietas
30
Introducción
con contenido elevado en proteína aumentan la concentración intracelular de la enzima G6PDH
(Barroso et al., 1994), mientras dietas con alto contenido en grasa provoca su disminución
debido a la inhibición de la síntesis de lípidos en el hígado (Suárez et al., 1995; Shimeno et al.,
1996).
I.4.1.1.C. METABOLISMO DEL GLUCÓGENO
El glucógeno es el principal hidrato de carbono de reserva en peces, se trata de un
polímero de almacenamiento de glucosa en los animales y una fuente de ésta en momentos de
necesidades metabólicas. La síntesis de glucógeno está catalizada por la enzima glucógeno
sintetasa (GS, EC 2.4.1.11 .) que se activa cunado los niveles celulares de energía son altos.
La enzima encargada de la glucogenolisis es la glucógeno fosforilasa (GP, EC 2.4.1.1),
cuya función en peces es controvertida. A diferencia de mamíferos, donde las condiciones de
ayuno estimulan la glucogenolisis para mantener constante la glucemia; en peces, tales como
bacalao, carpa y rutilo, si las reserva de lípidos hepáticos son altas, son la primeras en utilizarse
durante el ayuno (Black y Love, 1986; Méndez y Wieser, 1993).
Los estudios de Machado et al. (1988) en bagre sapo (Rhamdia hilarii), Segner y
Braunbeck (1988) en cacho (Leuciscus idus) y Shimeno et al. (1990) en juveniles de carpa
establecen una disminución en los niveles de glucógeno y lípidos hepáticos en peces con 30 días
de ayuno respecto a los valores registrados al inicio de la experimentación. Estudios posteriores
han confirmado que las reservas de glucógeno hepático son el principal sustrato movilizado
durante el ayuno en lubina (Pérez-Jiménez et al., 2007), bagre (Rhamdia quelen, Barcellos et al.,
2010) y trucha y esturión (Furné et al., 2011).
Si bien estos resultados indicarían que existe una tendencia marcada en el descenso de
tales constituyentes hepáticos, la proporción en que lo hacen varía según las especies, debido a
una capacidad diferencial para priorizar la utilización de las distintas sustancias de reserva en
condiciones de ayuno (Vigliano et al., 2002).
I.4.1.1.D. GLUCONEOGÉNESIS
Es la vía por la que se sintetiza glucosa a partir de diversos precursores, como piruvato,
aminoácidos o glicerol. Se realiza fundamentalmente en hígado y riñón, que trabajarían
coordinadamente manteniendo la homeostasis de la glucemia. La capacidad gluconeogénica de
ambos órganos es similar, aunque el aporte parece mayor en hígado debido a su mayor tamaño.
Esta ruta biosintética es paralela a la glucolisis y varios pasos coinciden ya que son
reversibles y catalizados por la misma enzima. Sin embargo, hay tres pasos que son irreversibles,
responsables del control de esta ruta: conversión de piruvato a fosfoenolpiruvato (PEP),
catalizada por la Piruvato carboxilasa (PC, EC 6.4.1.1), previo paso de oxalacetato (OAA) a PEP
catalizada por la Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK, EC 4.1.1.49); defosforilación de la
31
Sergio García Mesa
fructosa bifosfato por la Fructosa bisfosfatasa (FBPasa, EC 3.1.3.11) y desfosforilación de glucosa
6 fosfato mediante la Glucosa 6 fosfatasa (G6Pasa, EC 3.1.3.9).
La gluconeogénesis se ve afectada por las condiciones nutricionales; el ayuno y la
realimentación ejercen un efecto claro sobre esta ruta y, en concreto, sobre la FBPasa. En
general su actividad se eleva por condiciones de privación de alimento, descendiendo a los
valores de partida con la realimentación (García-Salguero y Lupiáñez, 1988; Bonamusa et al.,
1989, Meton, 1999). No obstante, en algunos casos, como en la perca, no se han detectado
cambios en la actividad de esta enzima con el ayuno y la realimentación (Borrebaek y
Christophersen, 2000); tampoco se han observado estos cambios en lubina (Pérez-Jiménez et al.,
2007), dentón (Pérez-Jiménez et al., 2011) trucha y esturión (Furné et al., 2011).
Dietas con alto contenido en proteínas provocan una elevación de la actividad de esta
enzima (Sánchez-Muros, 1990; Metón et al., 1999; Pérez-Jiménez et al., 2009), mientras que
dietas con alto contenido en hidratos de carbono ejercen un efecto contrario (Suárez et al.,
1995, 2002 en anguila; Metón et al., 1999 en dorada), lo que supone un papel importante de los
hidratos de carbono en el ahorro de proteína dietaria. No obstante, esto no se ha observado en
algunas especies como dentón (Pérez-Jiménez et al., 2009). Las dietas altas en grasa producen
un aumento de ácidos grasos plasmáticos cuya oxidación genera un aumento en el flujo
gluconeogénicos hepático (Mommsen y Suárez, 1984), aunque este aumento no ha sido
observado en trucha (Sánchez-Muros, 1990) ni en anguila (Suárez et al., 1995).
Los precursores gluconeogénicos más frecuentes son el piruvato y el lactato
(procedentes del metabolismo de carbohidratos), el glicerol (del metabolismo de ácidos grasos)
y los aminoácidos gluconeogénicos: alanina, serina y glicina. La gluconeogénesis a partir de
aminoácidos procedentes de la degradación de proteínas de la dieta incrementa las actividades
de enzimas gluconeogénicas y disminuye las ligadas a la glucolisis.
La enzima lactato deshidrogenasa (LDH) en hígado actúa normalmente en la
transformación de lactato (procedente del músculo) a piruvato, que entra en la ruta
gluconeogénica. En dentón se ha observado aumento de esta actividad enzimática durante el
ayuno (Pérez-Jiménez et al., 2011), mientras que no se han observado modificaciones en trucha
ni esturión también en ayunas (Furné et al., 2011).
I.4.1.2. METBOLISMO PROTEICO.
Las proteínas corporales sufren procesos continuos de síntesis y degradación, aunque
este proceso parezca, en principio, un derroche, es fundamental, a largo plazo, para la
renovación y reparación de las estructuras proteicas lo que proporciona longevidad a los
organismos. Los aminoácidos libres pueden proceder de la absorción intestinal de proteínas, de
interconversiones y síntesis de novo o de la degradación de proteínas corporales. Así mismo,
pueden ser utilizados en procesos como la síntesis de proteínas corporales o de compuestos
nitrogenados, fuente de carbono en el metabolismo intermediario o ser catabolizado con fines
32
Introducción
energéticos. La tasa de síntesis proteica va a variar en función del tejido considerado. En peces,
la mayor tasa de síntesis es alcanzada por el hígado, seguida de branquias, tubo digestivo,
músculo rojo y músculo blanco.
Las proteínas corporales no pueden ser almacenadas en grandes cantidades y deben ser
renovadas continuamente por procesos de síntesis y degradación. El perfil del pool de
aminoácidos libres cambia y su concentración depende del tejido (Carter et al., 1994), frecuencia
y tiempo transcurrido tras la alimentación (Tantikitti y March, 1995) y salinidad (Auerswald et
al., 1997)
En los peces, a diferencia de vertebrados terrestres, la fuente preferencial de energía en
condiciones aerobias es la oxidación de aminoácidos. Durante el catabolismo, el esqueleto
carbonado de los aminoácidos puede ser empleado para la síntesis de otros compuestos
nitrogenados, aunque mayoritariamente es oxidado en el ciclo de Krebs. La capacidad oxidativa
más elevada de aminoácidos se da en aquellos tejidos más ricos en mitocondrias, tales como el
hígado, branquias y músculo rojo.
La primera etapa de la degradación de los aminoácidos es una transaminación que
ocurre en el citoplasma celular: el aminoácido se transforma por desaminación en un αcetoácido acoplado a la síntesis concomitante del glutamato a partir de α-cetoglutarato. Las
transaminasas más importantes son la Aspartato aminotransferasa, o glutamanto oxal-acetato
transaminasa (GOT, EC 2.6.1.1) y la Alanina aminotransferasa (GPT o AAT, EC 2.6.1.2). El
glutamato obtenido va a regenerar el α-cetoglutarato liberando ión amonio por acción de la
enzima Glutamato deshidrogenasa (GDH, EC 1.4.1.2.) de origen mitocondrial. Estas enzimas se
acoplan en lo que se conoce como reacción de transdeaminación, que juega un papel central en
el metabolismo de aminoácidos procurando la ruta principal para la excreción del nitrógeno de
estos, por lo que se suelen utilizar como indicadores de la utilización proteica.
El glutamato es transaminado por numerosos aminoácidos, siendo el hígado el lugar
esencial en que se utilizan con fines energéticos. Una vez eliminado el nitrógeno, el esqueleto
carbonado puede entrar en la gluconeogénesis vía OAA o bien ser oxidado en el CAT. Los
aminoácidos entran en el ciclo a diferentes niveles. El grupo amonio puede participar en las
reacciones de transaminación, pero en gran parte es liberado por reacciones de desaminación
antes de ser eliminado, siendo por una desaminación directa o transfiriendo el grupo amino a un
aceptor común que será desaminado. Esta segunda vía parece ser la dominante, ya que las
desaminaciones directas requieren enzimas muy específicas.
La regulación nutricional del metabolismo hepático de aminoácidos ha sido estudiada
por un amplio número de investigadores (Walton 1985; Cowey y Walton 1989; Dabrowski y
Guderley, 2002).
33
Sergio García Mesa
Los niveles de proteína dietaria parecen ejercer poco efecto sobre el catabolismo de
aminoácidos, mientras que hay una relativamente buena respuesta de las enzimas a la ingesta
de aminoácidos. La falta de control por parte de la proteína dietaria contrasta con lo observado
en mamíferos y es la principal causa de la adaptación de los teleósteos a dietas con alto
contenido en proteína (Kaushik y Seiliez, 2010).
Se ha detectado actividad GOT y GPT en varios tejidos de peces, siendo el hígado donde
se encuentran en mayor concentración (Cowey y Walton, 1989). El contenido proteico de la
dieta y el ayuno son las condiciones nutricionales que más afectan a estas enzimas. Se ha
observado un aumento de su actividad con dietas altas en proteínas en truchas (Sánchez-Muros
et al., 1998), dorada (Metón et al., 1999), lubina (Pérez- Jiménez et al., 2007) y dentón (PérezJiménez et al., 2009).
En situaciones de ayuno se han obtenido resultados dispares; en peces tan diferentes
como la trucha y el múgil, se ha comprobado que la situación de ayuno prolongado tras una
alimentación rica en proteínas, produce una degradación de las proteínas corporales (Alexis y
Papaparaskeva-Papoustsoglou, 1986; Lupiáñez et al., 1989; Pérez-Jiménez et al., 2007). En otros
trabajos se ha descrito un incremento o ausencia de cambios de estas actividades durante el
ayuno (Moon y Jonhston, 1981; Kim et al., 1992; Fynn-Atkins et al., 1995; Pérez-Jiménez et al.,
2007). En dorada, por el contrario, la GPT disminuyó su actividad en situaciones de ayuno,
aunque sí se observó un incremento de la GOT, sugiriendo que, en esta especie, esta última
enzima posee un papel más importante que la anterior en la movilización proteica y el uso de
aminoácidos (Metón et al., 1999). Estos resultados también se observaron en dentón (PérezJiménez et al., 2011) lo que se interpretó como un efecto protector de las proteínas musculares
durante el ayuno prolongado.
I.4.1.3. METABOLISMO LIPÍDICO
Los lípidos juegan un papel fundamental en el suministro de energía para los peces. Así,
la adición de lípidos a la dieta contribuye a una mejor utilización de la proteína reflejada en unas
mejoras en el crecimiento de los animales y en los índices de utilización proteica (De la Higuera
et al., 1977). También se produce una disminución de la tasa de excreción de amoniaco y del
consumo de oxígeno (Cho et al., 1982).
La síntesis de ácidos grasos en peces tiene lugar esencialmente en el hígado por medio
del complejo ácido graso sintasa (AGS) y está regulada por diversos factores como el estado
nutricional (Lin et al., 1977a; Álvarez et al., 2000), el contenido en energía de la dieta (Kolditz et
al., 2008), la constitución genética (Skiba-Cassy et al., 2009), procesos de migración (Sheridan et
al., 1985) y hormonas (Higgs et al., 2009). Otra enzima importante en la síntesis de lípidos es la
G6PDH, que proporciona el NADPH necesario para la síntesis de lípidos por la AGS (Richard et al.,
2006).
34
Introducción
En este sentido, Lin et al., (1977a, b) comprobaron que dietas con alto contenido
glucídico incrementaban la actividad de las enzimas implicados en la síntesis de ácidos grasos y
de la vía de las pentosas fosfato (AGS ; Citrato sintasa (CS, EC 4.1.3.7); Enzima málico (EM, EC
1.1.1.40), G6PDH, 6PGDH) en hígado de salmón (Oncorhynchus kisutch), mientras que el ayuno y
las dietas de alto contenido en ácidos grasos provocaban un descenso de la actividad de estas
enzimas lipogénicas. Estos resultados coinciden con los anteriores en especies como seriola
(Shimeno et al., 1981), trucha (Jürss et al., 1985), lubina (Pérez-Jiménez et al., 2007) y dentón
(Pérez-Jiménez et al., 2011). La EM disminuyó significativamente en trucha después de 5 días de
ayuno mientras que en esturión aumentó durante los primeros días para luego disminuir (Furné
et al., 2011). La realimentación provocó un aumento de la actividades de esta enzima en las dos
especies y también en dentón (Pérez-Jiménez et al., 2011). También Skiba-Cassy et al., (2009)
observaron un aumento en la expresión de las enzimas AGS y G6PDH después de la
realimentación en trucha y también que era mayor en truchas seleccionadas para ser gruesas
que las seleccionadas para ser delgadas (Skiba-Cassy et al., 2009). También se ha observado un
aumento del ARN mensajero de estas dos enzimas cuando los peces se alimentan con dietas
suplementadas con carbohidratos (Panserat et al., 2009).
La degradación de los lípidos, y especialmente de los ácidos grasos, es una fuente
importante de energía metabólica en peces, especialmente marinos. La energía se obtiene en
forma de ATP en la mitocondria por el proceso de β-oxidación originando moléculas de acetilCoA que entra a formar parte de del ciclo de Krebs para la obtención de energía. La enzima clave
en este proceso es la β-hidroxiacil-CoA-deshidrogenasa (HOAD, EC 1.1.1.35).
Además de como precursor en la síntesis de colesterol y otros esteroides, el acetil-CoA
se utiliza para la formación de cuerpos cetónicos en el hígado (acetoacetato, β-hidroxibutirato y
acetona). La enzima implicada en la síntesis de estos compuestos es la Acetoacetil-CoA tiolasa
(EC 2.3.1.9). Los cuerpos cetónicos sirven como importantes combustibles metabólicos en
tejidos periféricos bajo situaciones excepcionales como por ejemplo el ayuno (Soengas et al.,
1996a, 1998).
Es bien conocido que el uso de lípidos hepáticos como fuente de energía durante el
ayuno depende de la especie, los tejidos de reserva lipídica y la estrategia seguida para movilizar
otras reservas como los carbohidratos. El incremento sérico de los ácidos grasos libres junto con
un descenso de los triglicéridos indicaría un aumento de la lipólisis en los tejidos (Machado et
al., 1988; Shimeno et al., 1990). La actividad HOAD mostró una relativamente alta actividad,
acompañando a una reducción del contenido de lípidos hepáticos, durante el ayuno en algunas
especies como el esturión (Furné et al., 2011) y el dentón (Pérez-Jiménez et al., 2011),
reflejando el importante papel que tienen los almacenes lipídicos en el suministro de energía
durante el ayuno prolongado para estas especies, como ha sido observado previamente en otras
especies como la lubina (Gutiérrez et al., 1991), la dorada (Grigorakis y Alexis, 2005) y la trucha
(Furné et al., 2011).
35
Sergio García Mesa
Como resultado de la degradación de lípidos también se produce un aumento de los
niveles de glicerol, sustrato que puede usarse para la vía gluconeogénica, glucolítica o de síntesis
de ácidos grasos en función de la situación nutricional de los peces. En este sentido, el glicerol
derivado de la hidrólisis de los triglicéridos parece ser activamente usado como sustrato
gluconeogénico. La enzima Glicerol kinasa (GyK, EC 2.7.1.30) es importante en la interfase del
metabolismo de carbohidratos y lípidos; cataliza la interconversión de glicerol a glicerol 3fosfato, necesario para la síntesis de triglicéridos (Dipple et al., 2001). La vía alternativa sería el
uso del glicerol con fines energéticos.
Bajo condiciones de ayuno los ácidos grasos oxidados en el hepatocito no pueden
ingresar al ciclo de Krebs para su completa oxidación ya que uno de sus metabolitos
intermediarios - el oxalacetato - es utilizado fundamentalmente en el proceso de
gluconeogénesis, lo que produce un descenso en la tasa de oxidación de todos los
intermediarios del ciclo y también del Acetil-CoA. En ese caso, la producción y exportación de
cuerpos cetónicos libera coenzima A, lo que permite continuar la oxidación de ácidos grasos.
Esto coincide con los datos aportados por Harmon y Sheridan, (1992) y Soengas et al. (1996b)
quienes observaron un aumento en la actividad cetogénica del hígado que frecuentemente se
asocia a los procesos gluconeogénicos hepáticos en la mayoría de los vertebrados (Morata et al.,
1982).
I.4.2. Metabolismo muscular
Aunque en el músculo se siguen las mismas vía metabólicas que a nivel hepático, la
regulación es diferente. El metabolismo de los carbohidratos en el músculo tiene como objetivo
la producción de ATP para llevar a cabo la contracción muscular, la síntesis proteica o el
transporte iónico y no tanto para la generación de intermediarios biosintéticos como ocurre a
nivel hepático.
En músculo blanco, ante una situación de ejercicio repentino las fibras glucolíticas
pueden trabajar hasta varios minutos con una aporte mínimo desde las reservas corporales ya
que obtienen el ATP, necesario para la contracción muscular, de la fosfocreatina. Cuando los
niveles de fosfocreatina disminuyen, comienza la glucolisis anaerobia para producir ATP (Dobson
et al., 1987). Esta vía metabólica conlleva la disminución de las reservas de glucógeno muscular
lo que conduce a la formación de lactato.
La capacidad aeróbica y anaeróbica del tejido puede ser caracterizada determinando la
actividad de las enzimas limitantes implicadas en las diferentes rutas metabólicas. La enzima
Citrato sintasa es una enzima clave en el CAT y se considera indicadora de la capacidad aeróbica
(Rajotte y Couture, 2002; Lemos et al., 2003). Alternativamente, la β-hidroxiacil coenzima A
deshidrogenasa puede ser indicativa de la capacidad lipolítica de los tejidos (Londraville y Duvall,
2002; Rajotte y Couture, 2002). Estas enzimas están implicadas en el metabolismo aeróbico, en
36
Introducción
cambio algunas actividades anaeróbicas pueden jugar un papel importante en la actividad
natatoria de rutina (Moyes et al., 1992; Rajotte y Couture, 2002).
Los almacenes lipídicos juegan un papel clave en el crecimiento y la supervivencia de los
peces (Pratt y Fox, 2002; Biro et al., 2004). Mientras que los carbohidratos y las proteínas se
pueden utilizar durante la actividad mantenida, los lípidos son la fuente principal de combustible
durante la natación aeróbica y, por lo tanto, son principalmente oxidados por el músculo rojo.
Esta observación se ve apoyada por una gran capacidad oxidativa mitocondrial en el músculo
rojo de las especies más activas (Moyes et al., 1992; Moyes y West, 1995). Los triglicéridos se
almacenan principalmente en el tejido hepático, muscular y visceral, y se transportan en la
circulación como ácidos grasos libres.
Los salmónidos metabolizan preferentemente los lípidos durante los recorridos
migratorios de forma que el catabolismo de proteínas sólo comienza después de que los
almacenes de lípidos se han agotado (Moyes y West, 1995; Mommsen et al., 1999; Guderley,
2004). Esto se ha observado en otras especies de peces cuando se someten a condiciones de
ayuno como la dorada (Grigorakis y Alexis, 2005) o el dentón (Pérez-Jiménez et al., 2011).
A diferencia de los animales terrestres, que simplemente pierden peso cuando ayunan,
los peces, además de perder peso, aumentan la hidratación de los tejidos, lo que puede ayudar a
mantener su forma a un bajo coste energético (Guderley, 2004). En músculo blanco, las enzimas
glucolíticas y mitocondriales disminuyen durante el ayuno, mientras que las proteasas
lisosomales se mantienen. Los aminoácidos de las proteínas musculares sirven como sustratos
para la gluconeogénesis hepática. En esta situación, la hidrólisis de las proteínas musculares
causa una acumulación de solutos y retención de agua que contribuye a la hidratación (Lambert
y Dutil, 1997), con el consecuente mantenimiento del peso del filete.
Hay una especificidad en la respuesta a condiciones nutricionales entre los distintos
tipos de fibras musculares, las fibras blancas son más susceptibles que las rojas (Guderley, 2004).
En ambos tipos de fibras el ayuno afecta a las actividades de enzimas mitocondriales del bacalao
(Martínez et al., 2003), mientras que las proteasas lisosomales y actividades de enzimas
antioxidantes cambian poco (Guderley et al., 2003).
I.5. ESTRÉS OXIDATIVO.
I.5.1. Aspectos generales del estrés oxidativo.
La dependencia del oxígeno de la vida aerobia, trae consigo la formación de especies
reactivas del oxígeno que pueden interactuar con biomoléculas esenciales como lípidos,
proteínas, carbohidratos y ácidos nucleicos, conduciendo a alteraciones en su estructura y
37
Sergio García Mesa
función. Para tratar de neutralizar estos efectos tóxicos colaterales, los sistemas biológicos
poseen mecanismos de defensa antioxidante, enzimáticos y no enzimáticos, que son capaces de
controlar la presencia y los efectos de estos productos. Cuando los agentes oxidantes superan a
los mecanismos antioxidantes celulares se genera un situación de estrés oxidativo (Sies, 1986).
Esta situación puede estar influenciada por múltiples factores, como el contacto con
xenobióticos y agentes contaminantes, factores nutricionales y ambientales.
Por otra parte, las situaciones de estrés clásico producen alteraciones en los mecanismos
de respuesta antioxidante (Davies, 2000; George et al., 2000), promoviendo la activación de vías
catabólicas con fines energéticos, lo que produciría un aumento de la tasa metabólica y de la
producción de radicales libres, desembocando en último término en un equilibrio de los
sistemas antioxidantes (Ross et al., 2001).
I.5.2. Radicales libres
Los radicales libres se definen como especies químicas, moléculas o átomos, capaces de
existir de forma independiente, que contienen uno o más electrones desapareados en su último
orbital electrónico (Halliwell et al., 1992; Cheeseman et al., 1993). Su carga puede ser negativa,
positiva o neutra. La existencia de electrones desapareados le proporciona una gran reactividad
puesto que tienden a ganar o ceder electrones para alcanzar configuraciones más estables, lo
que determina que tengan una vida media muy corta. La presencia de radicales libres genera
una cadena de reacciones de transferencia de electrones con moléculas vecinas que, a su vez, se
convierten en radicales libres. Por otra parte, existen otras moléculas denominadas especies
reactivas que, si bien no presentan electrones desapareados, se caracterizan por poseer un
electrón en un orbital de mayor contenido energético que el correspondiente a su estado
fundamental, lo que puede llegar a favorecer la aparición de radicales libres.
En general, las especies reactivas más importantes son las derivadas del oxígeno,
conocidas como especies de oxígeno reactivo (ROS: reactive oxigen species). Junto a éstas,
también podemos encontrar las derivadas de compuestos nitrogenados, denominados especies
de nitrógeno reactivo (RNS) (Halliwell y Gutteridge, 2000).
Las fuentes de radicales libres y especies reactivas son numerosas y variadas, pudiendo
diferenciarse en endógenas y exógenas. Entre las primeras, se encuentran la cadena de
transporte mitocondrial, la activación catalítica de diversas enzimas del metabolismo
intermediario celular, etc.; entre las exógenas destacan los xenobióticos, radiaciones ionizantes,
fármacos, ozono e hiperoxia.
38
Introducción
Entre las ROS, las mejor caracterizadas son:
Radical superóxido (O2 -)
Se trata de un radical libre cargado formado como consecuencia de una reducción
monovalente o monoeléctrica del oxígeno molecular.
O2 + e-
O2
-
Peróxido de hidrógeno (H2O2)
Se origina por una reacción de dismutación del anión superóxido por la actuación del
enzima superóxido dismutasa (SOD) o directamente a través de la reducción bivalente del
oxígeno.
2 O2 - + 2 H
O2 + 2 H2O
Su actividad química es limitada, aunque no es un radical libre en sentido estricto,
puesto que no presenta electrones desapareados, su importancia se debe a su capacidad para
atravesar las membranas biológicas e intervenir en reacciones de síntesis de otros radicales
debido a la debilidad de su enlace entre los átomos de oxígeno.
Radical hidroxilo (·OH-)
Es un radical muy reactivo, presenta un electrón despareado lo que le confiere la
capacidad de captar electrones de otras moléculas. Es el principal responsable directo de la
oxidación de biomoléculas.
Oxígeno singlete (1O2)
No se trata exactamente de un radical libre, pero su capacidad para captar dos
electrones antiparalelos le confiere un carácter oxidante y de gran reactividad.
Ácido hipocloroso / ión hipoclorito (OHCl / OCl-)
No se pueden considerar radicales libres en sí, pero tienen una alta capacidad de
interacción con otros radicales libres así como para oxidar otras moléculas.
39
Sergio García Mesa
I.5.3. Origen de los radicales libres.
La aparición de especies de oxígeno reactivo se asocia a diferentes reacciones (Beckman
y Ames, 1998; Halliwell y Gutteridge, 2000):
- Reacciones electromagnéticas o fotoquímicas que pueden dar lugar a ·OH- y 1O2.
- Reacciones endógenas de dismutación (H2O2)
- Reacciones enzimáticas como las catalizadas por la xantina oxidasa y la urato oxidasa
que intervienen en las vías de degradación de purinas o la acil-CoA oxidasa (asociada a la βoxidación peroxisomal).
- Reacciones asociadas a la actividad de células fagocíticas que generan O2- por la acción
de la NADPH oxidasa con intervención del NADPH.
- En el proceso de unión del O2 a la hemoglobina se forma el intermediario
oxihemoglobina que en ocasiones puede liberar O2 -, quedando la hemoglobina como
metahemoglobina, estado no funcional reversible.
- La cadena de transporte electrónico mitocondrial es la principal fuente de radicales
libres generados de forma accidental bajo condiciones fisiológicas normales. La cadena de
transporte electrónico nuclear es más nociva debido a su proximidad al material genético.
- El citocromo P450 es un sistema localizado en el retículo endoplasmático que tiene
como objetivo la detoxificación de compuestos xenobióticos, como medicamentos o etanol,
mediante reacciones de oxidación utilizando O2 con la subsiguiente generación de radicales
libres.
I.5.4. Mecanismos de defensas antioxidantes.
Se entiende por antioxidante aquella sustancia que inhibe o retarda significativamente la
oxidación de un sustrato (Halliwell y Guteridge, 2000). Los mecanismos de los sistemas
antioxidantes actúan suprimiendo la generación de radicales libres, neutralizándolos y
reparando los daños producidos (Peña de la A et al., 1997). Se trata de moléculas de origen
endógeno o exógeno.
I.5.4.1. ENZIMAS ANTIOXIDANTES
I.5.4.1.A. Superóxido dismutasa (SOD; EC 1.15.1.1)
Se trata un grupo de metaloproteínas que catalizan la dismutación del radical superóxido
(O2 ) que inicia la cascada de producción de radicales del oxígeno, produciéndose peróxido de
hidrógeno y oxígeno.
-
Se han identificado tres tipos de SODs, según el metal que forme su centro activo: Cu,
Mn o Fe. Para la identificación de las distintas clases de SOD se utilizan inhibidores específicos, la
40
Introducción
CuZn-SOD es inhibida por cianuro, H2O2 y dietiltiocarbamato, mientras que la Mn-SOD y Fe-SOD
se inhiben por cloroformo y metanol, además de H2O2 para Fe-SOD.
Es importante destacar que una elevada actividad SOD, que no se encuentra
acompañada de un incremento en las actividades glutation reductasa y catalasa, conlleva un
aumento en la producción de H2O2, con los consecuentes posibles efectos tóxicos (PérezJiménez, 2008).
I.5.4.1.B. CATALASA (CAT; EC 1.11.1.6)
Es una enzima ferriporfirínica constituida por cuatro subunidades, cada una de ellas con
un grupo hemo en su centro activo. Posee una doble función: cataliza la descomposición de
peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno y, por otra parte, produce la oxidación de compuestos
reducidos tales como metanol, etanol, ácido fórmico y fenoles.
Esta enzima se encuentra prácticamente en todos los tejidos animales, presentando
concentraciones y actividades más altas en hígado y eritrocitos. Esta enzima está localizada
esencialmente en los peroxisomas. La actividad catalasa se inhibe principalmente por cianuro,
azida y aminotriazol.
I.5.4.1.C. GLUTATION PEROXIDASA (GPX; EC 1.11.1.9)
Juega un papel importante en la eliminación H2O2 en situaciones fisiológicas, además es
capaz de reaccionar con hidroperóxidos. Se diferencian dos tipos de GPX, las seleniodependientes y las selenio-independientes.
La GPX selenio-dependiente, a diferencia de la catalasa, requiere la presencia de
glutation reducido (GSH) para descomponer el H2O2. Se ha determinado su presencia en la
mayoría de los tejidos, teniendo más importancia en el hígado y corazón; se localiza
fundamentalmente en el citosol, aunque también se ha encontrado, en menor cantidad, en
mitocondrias y retículo endoplasmático. La GPX selenio-independiente presenta una menor
afinidad por el H2O2, de hecho se ha sugerido como una isoenzima de la glutation transferasa
(GST) (Carmagnol et al., 1983); se halla en el citosol, mitocondrias y cualquier fracción celular
que contenga membrana.
Puesto que tanto la CAT como la GPX actúan sobre el H2O2, el que su actividad varíe va a
estar determinado por la localización dentro de la célula: la catalasa se sitúa mayoritariamente
en los peroxisomas, mientras que la glutation peroxidasa se ubica fundamentalmente en el
citosol (Halliwell y Gutteridge, 2000). Cohen y Hochstein, (1963) demostraron que en
condiciones fisiológicas la GPX tiene un papel más importante que la catalasa, mientras que a
altas concentraciones de H2O2 la actividad catalasa aumenta considerablemente.
41
Sergio García Mesa
I.5.4.1.D. GLUTATION REDUCTASA (GR; E. 1.6.4.2)
Es una flavoproteína que presenta como grupo prostético el FAD y que cataliza la
reducción del glutation oxidado (GSSG) usando NADPH como donador de H, el cual proviene de
la vía de las pentosas fosfato. La GR es responsable de mantener la concentración intracelular de
glutation reducido (GSH) (Staal et al., 1969; Beutler, 1969). Tiene una distribución similar a la
glutation peroxidasa, es decir, se localiza principalmente en el citosol y, en menor cantidad, en
mitocondrias y retículo endoplasmático.
Figura I.5.4.1. Principales mecanismos de detoxificación en la célula.
I.5.4.1.E. GLUTATION TRANSFERASA (GST; EC 2.5.1.18)
La GST es una enzima que juega un importante papel en la detoxificación y excreción de
xenobióticos mediante la formación de conjugados con el glutation promoviendo su posterior
eliminación del organismo. La forma citosólica se encarga de la eliminación de xenobióticos y la
localizada en el retículo endoplasmático de la eliminación de tóxicos endógenos.
El proceso de biotransformación de los compuestos xenobióticos, consta de dos fases: la
primera es un conjunto de reacciones de oxidación que preparan a los tóxicos para que puedan
transformarse por efecto de la segunda que comprende una serie de reacciones de conjugación
con metabolitos endógenos.
42
Introducción
I.5.4.1.F. DT-DIAFORASA (NAD(P)H-QUINONA OXIDOREDUCTASA)
(NQO1; EC 1.6.99.2)
También conocida como NAD(P)H:quinona oxido reductasa, es una flavoproteína
citosólica, con FSD como grupo prostético. Parece tener múltiples funciones fisiológicas, pues
presenta especificidad para un amplio número de sustratos debido a la gran plasticidad del sitio
activo (Faig et al., 2001), y así aparece implicada como sistema de detoxificación. La DTdiaforasa juega un papel en el metabolismo endógeno de las quinonas, éstas tienen largas colas
hidrofóbicas y en su estado reducido (hidroquinonas) protegen a las membranas celulares frente
al daño por peroxidación lipídica, contrarrestando así los efectos prooxidantes del ciclo redox. La
DT diaforasa se caracteriza por su capacidad para utilizar NADH y NADPH como donador de
electrones (Daniel, 1993). Esto rompe el ciclo redox prooxidante previniendo la formación de
radicales superóxido dependiente de la quinonas y que a su vez puede llevar a la formación de
peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo.
I.5.4.2. SUSTANCIAS ANTIOXIDANTES
Son moléculas que ejercen un papel protector frente a la oxidación, siendo consumidas
durante esta acción, por lo que deben ser reemplazadas, fundamentalmente a través del aporte
dietario (Felton, 1995; Halliwell y Gutteridge, 2000). Estas moléculas antioxidantes pueden
clasificarse como hidrosolubles ó liposolubles.
I.5.4.2.A. ANTIOXIDANTES HIDROSOLUBLES
Glutation: es un tripétido formado por glutamina, cisteína y glicina. El grupo sulfhidrilo
(–SH) de la cisteína es el que le confiere la capacidad antioxidante, siendo capaz de pasar de
forma reducida (GSH) a forma oxidada (GSSG), transfiriendo el poder reductor a los radicales
libres con el fin de detener la cascada de oxidación. Además es sustrato de enzimas
antioxidantes como la glutation peroxidasa y dehidroascorbato reductasa, para la conversión de
dehidroascorbato a ascorbato (Halliwell y Gutteridge, 2000).
Ácido úrico: es un producto de la oxidación de hipoxantina y xantina por acción de la
xantina oxidasa y xantina deshidrogenasa (XOD y XDH). Capta especies de oxígeno reactivo del
tipo ·OH-, 1O2, RO2· (peroxilo) y OHCl/OCl-, originando productos menos tóxicos.
Proteínas captadoras de iones metálicos: entre estas proteínas encontramos las
captadoras de hierro, ferritina o transferrina; captadoras de iones cobre como la ceruloplasmina,
albúmina e histidina. La metalotioneínas, catecolaminas y glucagón están asociadas al
mantenimiento de la homeostasis del cobre y zinc, la detoxificación de metales no esenciales
como cadmio y mercurio, y la captación de ·OH- y 1O2.
Vitamina C o ácido ascórbico (AA): es capaz de pasar de su forma reducida a su forma
oxidada por dos procesos oxidativos monovalentes consecutivos. Actúa como reductor de
43
Sergio García Mesa
moléculas como ·OH- , HO2·, O2·-. La enzima dehidroascorbato reductasa recupera el AA con la
ayuda del glutation.
I.5.4.2.B. ANTIOXIDANTES LIPOSOLUBLES
Ubiquinonas y β-carotenos: la ubiquinona o coenzima Q, además de formar parte de la
cadena de transporte electrónico, en su forma reducida actúa como un potente antioxidante en
las membranas (Cadenas, 1995). Los β-carotenos son derivados del ácido retinoico o vitamina A,
los cuales reaccionan con los radicales peroxilo y alcoxilo, interrumpiendo los procesos de
peroxidación lipídica y quelan al 1O2 (Halliwell y Gutteridge, 2000).
Vitamina E o tocoferol: su estructura química es la de un compuesto constituido por un
grupo hidroxicromona al que se le une una cadena de fitilo. Se conocen al menos ocho
isoformas, que pueden dividirse en dos grupos diferenciados en el grado de saturación de su
cadena fitilo. El α-tocoferol es el biológicamente más activo. Destaca su capacidad para la
eliminación del 1O2, entre otros. Su papel evitando la propagación de la peroxidación lipídica es
altamente conocida.
Existe un efecto sinérgico entre el tocoferol y el ácido ascórbico, puesto que este último
interviene en la regeneración del tocoferol oxidado (Halliwell y Gutteridge, 2000).
I.5.5. Daños oxidativos causados a biomoléculas.
I.5.5.1. HIDRATOS DE CARBONO
Los hidratos de carbono son altamente susceptibles a los radicales libres, produciéndose
radicales de azúcares por la reacción con el ·OH-.
Los monosacáridos, en condiciones normales, son capaces de reducir el O2,
autooxidándose y formando cetoaldehídos e intermediarios oxidantes como O2 -, autooxidación
catalizada por metales de transición. La glucosa es capaz de unirse a los grupos amino terminal,
iniciando su glicación y generando productos que son extremadamente reactivos y alteran la
estructura espacial proteica y su funcionalidad. Tanto la autoxidación como la producción de
estos productos están íntimamente relacionados a través de la interacción con metales de
transición.
I.5.5.2. PROTEÍNAS
Los radicales libres son capaces de actuar sobre residuos aminoacídicos de proteínas
originando entrecruzamientos catalíticos, cambios conformacionales y pérdida de función. Este
daño proteico es rápidamente reparado por la actuación de proteasas, las cuales evitan la
acumulación de proteínas dañadas, manteniendo el balance entre daño y reparación.
44
Introducción
I.5.5.3. ÁCIDOS NUCLEICOS
·OH- y H2O2 son los principales radicales libres implicados en el daño sobre el ADN. La
incidencia de estos agentes va a provocar alteraciones en el material genético, como son
aumento de mutaciones, entrecruzamientos, roturas de cromátidas o pérdidas de fragmentos
cromosómicos. Se ha observado en varias especies, que situaciones de estrés oxidativo da lugar
a un acortamiento de la longitud relativa de los telómeros, pudiendo considerarse como un
bioindicador del estrés a largo plazo (von Zglinicki, 2002; Monaghan, 2010). Las alteraciones más
frecuentes en el material genético son la fragmentación de la cromátidas y las modificaciones
oxidativas en las bases nitrogenadas púricas y pirimidínicas.
I.5.5.4. LÍPIDOS
La peroxidación lipídica es una de las consecuencias del estrés oxidativo, entendiéndose
como la oxidación de ácidos grasos en un proceso autocatalítico e incontrolable que da lugar a la
formación de hidroperóxidos de estos ácidos grasos y una serie de productos secundarios,
incluyendo aldehídos (particularmente malondialdehído) cetonas y alcoholes. Todos los ácidos
grasos del organismo son susceptibles a la peroxidación lipídica, pero se van a alterar con más
facilidad los insaturados, entre los que encuentran los que son más apreciados en nuestra dieta,
n3 y n6 HUFA.
La oxidación de los HUFA y PUFA en las biomembranas puede resultar en alteraciones
funcionales y patológicas. Los peces, cuyo contenido en n3 HUFA es particularmente alto, son
altamente susceptibles al daño oxidativo, por lo tanto resulta fundamental una alta protección
antioxidante para el bienestar fisiológico de los animales.
El organismo posee dos mecanismos de defensa frente al fenómeno de la peroxidación
lipídica: captación de los radicales libres y un sistema enzimático que permite la destrucción de
ciertos compuestos intermediarios. Los secuestradores de los radicales libres son antioxidantes
como la vitamina A y, sobre todo, los tocoferoles. El ácido ascórbico suele estar unido a este
grupo; de hecho es un secuestrador hidrosoluble del O2, mientras que el tocoferol es un donador
de protones particularmente activo en medio liposoluble. En el segundo mecanismo de defensa,
la primera enzima implicada es la superóxido dismutasa (SOD), que dismuta el anión superóxido
en H2O2. Este compuesto, altamente tóxico para la célula, debe ser reducido por la catalasa que
los transforma en agua y oxígeno (Corraze, 2004).
Los efectos negativos de la peroxidación de los lípidos son múltiples. En los peces puede
provocar una disminución de la actividad de enzimas como amilasa, lipasa o tripsina. A nivel
metabólico también pueden aparecer alteraciones como esteatosis hepática o inhibición de
ciertas enzimas del ciclo de Krebs. Sin embargo, los síntomas que se encuentran con mayor
frecuencia son una carencia de vitamina E que puede haberse empleado completamente en las
reacciones de destrucción de radicales libres. Entonces en los peces se produce una distrofia
muscular y lisis de los hematíes. Para el consumidor, a parte de la distrofia muscular, que hace
45
Sergio García Mesa
que la textura de la carne sea inaceptable, es probable una disminución en la coloración de la
carne y alteración de su sabor. A todo esto se añade una disminución de la calidad dietética
debida a la destrucción parcial de los ácidos grasos más valorados para la salud humana y la de
vitamina E (Corraze, 2004).
I.5.5. Implicaciones del estrés oxidativo en el cultivo de peces.
Estamos asistiendo a un incremento notable del interés por el estudio de los
mecanismos implicados en la defensa frente al estrés oxidativo en peces tanto por el interés de
los datos que pueden aportar para el estudio de la evolución filogenética de estos
importantísimos mecanismos de protección como por su aplicación en la detección de diversas
fuentes de contaminación ambiental (Rabie et al., 1972; Smith, 1976; Radi et al., 1985a, b;
Roberts et al., 1987; Di Giulio et al., 1989; Nakano et al., 1992; Filho et al., 1993; Filho y Boveris,
1993; Ross et al., 2001; Basha y Rani, 2003; Berntssen et al., 2003; Avci et al., 2005; MartínezÁlvarez et al., 2005).
Los tejidos de peces contienen gran cantidad de lípidos insaturados (PUFAs), esenciales
para la funcionalidad de las membranas celulares. Una gran cantidad de PUFAs implica un
elevado riesgo de estrés oxidativo, ya que los lípidos son las principales dianas de ROS (Abele y
Puntarulo, 2004; Martínez-Álvarez et al., 2005).
Entre las circunstancias que pueden alterar el equilibrio ataque/defensa frente al estrés
oxidativo las relacionadas con la alimentación (composición de la dieta) y/o su restricción
(alimentación/ayuno) están recibiendo una amplia atención (Guderley et al, 2003; Pascual et
al., 2003; Morales et al., 2004; Furné et al., 2009a; Bayir et al., 2010).
I.6. CALIDAD DE MÚSCULO
I.6.1. Concepto de calidad en peces.
Es difícil definir la “calidad” en peces puesto que existe una amplia variedad de
preferencias regionales, actitudes de los consumidores y métodos de consumo, características
de la propia especie y otros factores (García-García et al., 2008). Estudios recientes han
demostrado que atributos como el sabor, el olor, la apariencia, etc. continúan siendo claves en
la decisión del consumidor a la hora de adquirir el pescado. De todos los factores que definen la
calidad del pescado, uno de los más valorados son las propiedades nutritivas, ya que la actitud
del consumidor se dirige hacia el consumo de pescado sano y seguro (Pieniak et al., 2009).
Normalmente el consumidor espera que las características sensoriales y nutritivas de los peces
cultivados sean similares a los de vida libre y sin embargo, aquellos suelen ser menos valorados
46
Introducción
(Kaiser y Stead, 2002, Rogdakis et al., 2011). Es, por lo tanto, tarea del acuicultor proporcionar
un producto lo más parecido posible al obtenido de la pesca tradicional y, en este sentido,
existen múltiples estudios que proporcionan información sobre la forma en que la composición
de la dieta, por ejemplo, puede influir en los atributos sensoriales de los peces cultivados (Hardy
y Lee, 2010).
Aspectos como la pérdida de sabor y el aumento en el contenido graso son algunos de
los factores que pueden perjudicar la aceptación de los peces cultivados. Una serie de estudios
han comparado aspectos sensoriales y nutricionales entre las principales especies cultivadas y
sus coespecíficos de origen silvestre (Periago et al., 2005; Grigorakis, 2007; Sveinsdóttir et al.,
2009). Estas investigaciones han puesto de manifiesto que los peces cultivados suelen ser más
blandos y suaves en cuanto a textura, tener mayores depósitos de grasa perivisceral y menos
sabor que los de vida libre (Grigorakis et al., 2003; Grigorakis, 2007). También se ha estudiado la
influencia de las condiciones de cultivo (salinidad, temperatura, densidad, tipo de alimentación,
procedimiento de sacrificio) y se han relacionado con los criterios de calidad (Calabretti et al.,
2003; Eroldogan et al., 2004; Bagni et al., 2007; Le Vay et al., 2007).
Otro de los atributos de calidad más apreciado por los consumidores es la “frescura”,
determinada por varios parámetros como aroma, sabor, textura y apariencia, valorados a través
de métodos sensoriales o instrumentales. Esta frescura comienza a disminuir tan pronto como el
pez es sacrificado debido a procesos biológicos, químicos y físicos, haciendo del pescado uno de
los alimentos más perecederos, con un tiempo medio de vida en fresco y congelado mucho más
corto que el de otros alimentos. Es necesaria, por tanto, una buena coordinación de todos los
profesionales implicados en la obtención y comercialización del producto con objeto de llevar al
mercado el pescado con la suficiente rapidez y en unas condiciones de almacenamiento que
garanticen su calidad.
I.6.2. Calidad nutricional.
El pescado y los productos derivados ocupan un lugar destacado a la hora de conseguir
dietas equilibradas y saludables. En general, los pescados aportan una buena cantidad de
proteínas de alto valor biológico, vitaminas tanto hidrosolubles como liposolubles, elementos
minerales y un contenido calórico relativamente bajo. Además, constituyen una excelente
fuente de ácidos grasos poliinsaturados de la serie n3, cuyo consumo se ha asociado con efectos
beneficiosos para la salud.
La composición química del pescado varía entre especies y, dentro de una misma
especie, depende de aspectos fisiológicos (edad, peso corporal, época reproductora-desove,
intensidad de la natación) y ambientales (estación, temperatura, ciclos alimentarios). La
composición del alimento, el ambiente, el tamaño y varios rasgos genéticos, afectan la
composición y la calidad del pescado de acuicultura.
47
Sergio García Mesa
Como se ha indicado antes, los lípidos del pescado se caracterizan por presentar una
elevada proporción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga, especialmente de la serie
n3. Los ácidos eicosapentaenoico (EPA, 20:5n3) y docosahexaenoico (DHA, C22:6n3) son
característicos de la grasa del pescado. Estos ácidos abundantes en el plancton marino y en
algunas algas y se incorporan a los tejidos de los peces al ser ingeridos por ellos. Se ha
demostrado una estrecha relación entre la composición en ácidos grasos de la dieta y la del
cuerpo de los peces, tanto de agua dulce como en especies marinas (Yildiz et al., 2007). También
se ha observado que la composición de ácidos grasos varía con la temperatura y la época del año
(Shirai et al., 2002). Sin embargo, estas diferencias son más intensas en los peces de vida libre
que en los cultivados y son debidas a la variabilidad estacional de la dieta (Yildiz et al., 2007).
Los ácidos grasos EPA y DHA tienen un papel nutritivo importante en la dieta, en este
sentido, diversos estudios han demostrado que entran a formar parte de determinadas rutas
metabólicas que dan lugar a prostaglandinas y leucotrienos que desempeñan diferentes
funciones en el desarrollo de algunos estados patológicos (Simopoulos, 1996). Estudios recientes
han demostrado una tendencia inversa, estadísticamente significativa, entre el riesgo de
enfermedad coronaria y la ingesta de EPA y DHA en adultos sanos (Salem et al., 2001, Uauy et
al., 2003; Gebauer et al., 2006; Barceló-Coblijn et al., 2009).
I.6.3. Textura.
La textura del pescado es una característica sensorial que influye decisivamente en la
aceptabilidad del producto. Son variados los factores que determinan la textura que, a su vez,
dependen del estado nutricional del pez, entre los que cabe mencionar la tasa e intensidad del
acortamiento post-mortem del músculo, la magnitud de la disminución del pH y la proteolisis por
la rotura de las miofibrillas. Las propiedades de retención de agua en el músculo son también de
una gran importancia para el valor comercial y la aceptación del consumidor ya que juegan un
papel esencial en la firmeza de la carne y son buenos índices de jugosidad (Olsson et al., 2003).
La cantidad de agua inmovilizada dentro del tejido muscular depende de la organización de las
proteínas miofibrilares.
El ablandamiento de la carne es uno de los principales síntomas de la pérdida de
frescura de los peces cultivados. Este ablandamiento (muy rápido en determinadas ocasiones lo
que provoca pérdidas económicas importantes en las piscifactorías) no tiene unas causas
conocidas del todo; diferentes investigaciones apuntan hacia varios factores estructurales del
músculo del pez, sin embargo aún no se ha establecido cuál es el motivo responsable último de
esta alteración de la textura. La manipulación del producto en el momento del pre-rigor mortis,
cuando los procesos de deterioro aún no han comenzado, permite una ventaja con respecto a
los productos obtenidos de la pesca, en los que este tipo de intervención no es posible.
No debemos perder de vista que los cambios post-mortem varían claramente
dependiendo de la especie considerada, debido a la diferente constitución estructural y
48
Introducción
metabólica, que determinan que el proceso de envejecimiento del pez sea muy distinto en
cuanto a duración y causas que lo provocan. Por este motivo, los fenómenos post-mortem
observados en una especie generalmente no son extrapolables a otras.
La firmeza del músculo de los peces disminuye rápidamente durante el almacenamiento
en frío después del sacrificio (Mochizuki y Sato, 1996). Debido al ablandamiento se produce un
deterioro de la calidad, por lo que es muy importante el conocimiento de los procesos por los
que se produce este ablandamiento y el desarrollo de métodos para prevenirlo. Se han realizado
gran cantidad de estudios que demuestran que los cambios texturales ocurridos en el músculo
del pez durante el almacenamiento post-mortem son resultado de la degradación de los
componentes miofibrilares (Ofstad et al., 1996; Delbarre-Ladrat et al., 2006). Sin embargo, otros
muchos estudios apuntan a la desintegración de la matriz extracelular y la fracción de colágeno
como responsables de estos cambios (Ando et al., 1995; Montero y Borderías, 1990, Espe et al.,
2004), siendo el colágeno el mayor componente del tejido conectivo, considerado un importante
determinante de las propiedades texturales de los peces (Hatae et al., 1986; Hallett y Bremner,
1988; Toyohara et al., 2000; Bugeon et al., 2004). La importancia relativa de la degradación de
los distintos componentes no está aún clara, y depende de la especie y otros factores que
influyen sobre los procesos proteolíticos.
Como se ha indicado antes, la textura de los peces está influenciada por varios factores,
por ejemplo especie, edad, época del año, fotoperiodo (Espe et al., 2004, Hagen et al., 2007), el
estrés sufrido antes del sacrificio (Bagni et al., 2007; Lefevre et al., 2008; Roth et al., 2009), el
contenido de grasa muscular y su distribución en el músculo (Regost et al., 2001; Poli et al.,
2009; Hardy y Lee, 2010; Sándor et al., 2011), los métodos de procesamiento de los filetes y las
condiciones de almacenamiento post-mortem (Sigholt et al., 1997, Skjervold et al., 2001, Roth
et al., 2009, Veiseth-Kent et al., 2010).
La composición y distribución de los lípidos corporales de los peces son los factores más
variables estando influenciados por la especie y el ambiente. En general, el pez se vuelve más
graso en la parte delantera del cuerpo, habiéndose encontrado así mismo altos niveles de lípidos
en los tejidos periviscerales. Thakur et al. (2002) establecieron que los lípidos y el colágeno son
los dos constituyentes del músculo de la seriola que tienen una mayor influencia en la textura de
su carne si bien se trata de influencias opuestas. Thakur et al. (2003) publicaron una correlación
negativa entre el contenido en lípidos del músculo y la resistencia a la rotura de la carne de
seriolas de piscicultura. El exceso de deposición de lípidos a lo largo del tejido conectivo pudo
haber causado una rotura estructural del músculo y reducido la fuerza mecánica que aporta este
tejido. El uso en acuicultura de dietas altamente energéticas ha llevado a la producción de peces
excesivamente grasos, lo que repercute negativamente sobre las características texturales de los
animales provocando una menor firmeza (Thakur et al., 2002, 2003). Este exceso en la
acumulación de grasa hace que, en general, los peces cultivados sean menos apreciados que los
salvajes (Grigorakis, 2007).
49
Sergio García Mesa
I.6.4. Proteolisis muscular.
La electroforesis (sistema SDS-PAGE desnaturalizante, según Laemmli, 1970) es un
método ampliamente utilizado en investigación de calidad de productos alimenticios. Así, es una
técnica bien establecida para la determinación de especies de peces y de la autenticidad de los
alimentos de origen marino. Recientemente se está investigando sobre las posibilidades del uso
de esta técnica en el control de la frescura de los peces, para detectar la posible falsificación de
productos derivados de proteína animal y vegetal y arrojar luz sobre las condiciones de
procesado de los productos.
Un método de determinación del grado de proteolisis muscular es el estudio de las
alteraciones en el perfil electroforético de sus proteínas y de los productos de dicha proteolisis.
Con el conocimiento existente de los mecanismos bioquímicos implicados en el ablandamiento
del músculo, se podría intentar seleccionar posibles marcadores de calidad como pudieran ser
los fragmentos proteicos obtenidos como consecuencia de la hidrólisis de proteínas musculares
durante el almacenamiento y conservación del músculo, que podrían ser de gran valor para el
control de calidad en la industria de la producción piscícola.
En la separación de las proteínas del músculo de los peces por su solubilidad en
soluciones de diferente fuerza iónica se obtienen dos componentes:
 Proteínas sarcoplásmicas: solubles en soluciones de baja fuerza iónica, normalmente se
trata de enzimas intracelulares implicadas en el metabolismo de la energía. Chéret et al. (2006)
las describieron para el músculo de lubina. Las principales bandas obtenidas para estas proteínas
son: péptido de 97 kDa ha sido identificado en mamíferos con la enzima glucógeno fosforilasa; el
de 58 kDa con la piruvato kinasa, el de 46 kDa con la enolasa, el de 43 kDa con la creatina kinasa,
el de 39 kDa con la aldolasa, el de 38 kDa con la lactato deshidrogenada, el de 36 kDa con la
gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa y el de 16 kDa con la mioglobina. Otras bandas no
identificadas poseen una masa molecular relativa de 34, 27, 25 y 21.5 kDa. Por último se
observaron también dos bandas de bajo peso molecular, 13 y 12 kDa.
 Proteínas miofibrilares: solubles en soluciones de alta fuerza iónica, constituyen el
armazón estructural del músculo. Varios autores describen para el músculo de peces una serie
de bandas: cadena pesada de la miosina (unos 200 kDa), 180 kDa (proteína M); 148 kDa
(proteína C); 110 kDa (-actinina); 55 kDa (desmina); 45 kDa (actina); 40 kDa (-tropomiosina);
38 kDa (troponina T); 35 kDa (-tropomiosina); y una serie de bandas desde 35 a 17,6 kDa que
corresponden a la cadena ligera de miosina.
El proceso de envejecimiento de la carne de mamíferos se ha asociado a la degradación
de una de estas proteínas, la desmina (55 kDa) y proteínas miofibrilares como la troponina T (37
kDa) y la aparición de fragmentos de proteína de 30 y 110 kDa. Estos dos fragmentos se han
propuesto como indicadores del grado del proteolisis en la carne. El uso de estos marcadores
50
Introducción
podría contribuir de forma rápida y fácil al conocimiento de la frescura del pescado y, sobre
todo, sería útil para establecer comparaciones entre las distintas especies. Algunos autores han
observado la degradación de moléculas de elevado peso molecular como la distrofina, así como
la rotura de la titina y la nebulina.
Los procesos degradativos en los peces son tantos y tan complejos que aún no se ha
encontrado un indicador único para evaluar la calidad del pescado. Es necesario seguir
investigando en esta línea debido a que el uso de estos marcadores en la industria podría
suponer un avance en las técnicas de conservación y manipulación del pescado y satisfacer a la
cada vez mayor demanda por los consumidores de un producto de calidad.
51
II.1. Seguimiento técnico de la fase
inicial de un cultivo experimental de
cría intensiva de corvina
(Argyrosomus regius Asso, 1801) en
jaulas flotantes.
II.1.1 INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS
El cultivo intensivo de especies de peces marinos goza ya de una cierta tradición
en nuestro país en sus diversas modalidades (tanto en instalaciones en tierra como en
mar abierto) aunque se ha concentrado en unas muy pocas especies. Pese a que las
pautas básicas de esos cultivos han sido establecidas y validadas por la experiencia
repetida, cuando se aborda la consideración de una especie “nueva”, como es la corvina
en este caso, se plantean algunos interrogantes y reservas que desaconsejan una pura y
directa extrapolación de las prácticas que han funcionado con éxito en esas otras
especies.
Es por ello por lo que los primeros intentos se suelen hacer a una escala más
reducida y con seguimiento más exhaustivo con el fin de poder implementar, si fuera
necesario, las medidas correctoras oportunas antes de validar una práctica concreta en
aspectos tales como densidad/carga, tipo de jaulas, pautas y tipo de alimentación,
monitorización de parámetros ambientales y sus posibles efectos, prácticas sanitarias de
prevención, etc.
En esta línea, Ceutamar S.L. se planteó incluir entre su actividad industrial la cría
intensiva de corvinas a partir de alevines importados y se dirigió a nuestro grupo para
solicitarle apoyo técnico de evaluación y control en este intento preliminar. En todo
momento, la empresa y su departamento técnico, en base a su experiencia previa en la
cría de otras especies, especialmente lubina, establecieron las directrices generales del
cultivo y fueron realizando un seguimiento de los parámetros de más interés desde el
punto de vista de la producción (supervivencia, crecimiento, alimentación, etc.).
Nosotros tuvimos oportunidad de participar y profundizar en los controles
correspondientes con un doble objetivo; por una parte, generar información
complementaria sobre la marcha de esta experiencia piloto y, por otra, obtener datos
sobre la biología de la especie que, además de ampliar el bagaje de conocimientos sobre
53
Sergio García Mesa
la misma, pudieran ser utilizados en el diseño ulterior de unas prácticas de cultivo
específicas para corvina.
En el capítulo de Introducción general a esta Memoria y, más en concreto, en los
apartados I.1.3. y I.1.4. se exponen con cierto detalle los resultados más destacables de
anteriores intentos de cría intensiva de corvina (reproducción controlada, alimentación,
crecimiento, etc.), a los que nos remitimos para completar este apartado de
Introducción al objetivo II.1.
II.1.2. MATERIAL Y MÉTODOS
Para cubrir los objetivos propuestos se procedió a un seguimiento exhaustivo de
la evolución de la primera fase de un cultivo industrial de corvinas durante un periodo
de algo más de un año. Este seguimiento se realizó sobre dos remesas (R1 y R2) de peces
juveniles llegados a la piscifactoría en dos fechas distintas. A su llegada a la granja, cada
remesa se subdividió en dos grupos (A y B), totalizando cuatro grupos (R1-A, R1-B, R2-A
y R2-B). Los cuatro lotes se alimentaron inicialmente con un pienso común (Alphamar®),
pero posteriormente se introdujo un segundo pienso comercial (Regius®) que se
suministró a los lotes B de cada remesa.
El seguimiento se basó en controles sucesivos de diversos parámetros de interés
que incluían:
-
-
evolución de peso y biometría general, tanto sobre muestras amplias con un
número elevado de peces y determinaciones a pie de instalaciones, como con
muestras más reducidas analizadas en laboratorio,
datos sobre composición corporal,
datos sobre biometría de diversas fracciones corporales,
datos sobre ciertos parámetros sanguíneos.
Adicionalmente, animales de los lotes R1-A y R1-B fueron utilizados para el
análisis de la evolución temporal del contenido en ácidos grasos del músculo de estos
peces, datos en los que se basa el ensayo descrito en el apartado II.2.
54
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus
reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
II.1.2.1. Animales e instalaciones.
Este seguimiento se basó en juveniles de corvina procedentes de la instalación
Les Poissons de Soleil, que la empresa Ferme Marine de Dohuet, tiene en la localidad de
Balaruc-les-Bains, próxima a Montpellier (Francia).
Todos los peces habían sido vacunados previamente y habían dado negativo para
nordavirus.
Al ingresar en las instalaciones de Ceutamar, los animales contaban entre 80 y
100 días de edad. La primera remesa (R1) estaba compuesta por unas 120 000 unidades
que se distribuyeron entre dos jaulas tipo S (ver más adelante). Una segunda remesa
(R2) estaba compuesta por 100 000 animales que se distribuyeron en dos jaulas tipo S, a
razón de 60 000 unidades el lote R2-A y 40 000 el lote R2-B.
Las instalaciones de Ceutamar S.L. estaban situadas en aguas de la Bahía de
Algeciras, dentro del Distrito Marítimo de Algeciras, entre la desembocadura del río
Palmones y el muelle de Juan Carlos I. La superficie de ocupación era la de una lámina de
agua de unos 48 000 m2 frente a la playa de “El Rinconcillo”. El parque de jaulas se
encontraba dentro de un polígono cuyo punto central se correspondía con las
coordenadas 36⁰ 0.9600 N y 0.5⁰ 25.900 O, zona en la que la profundidad es, como
media, superior a 20 metros.
Las jaulas de mantenimiento eran de polietileno de alta densidad, tanto los tubos
de flotación como sus apoyos. Como se señalado antes, los animales se recibieron en
jaulas de tipo S: 16 m de diámetro, 5 m de profundidad y 8 mm de luz de malla. A lo
largo del cultivo y durante la fase de engorde, los animales se trasladaron sucesivamente
a jaulas de tipo M: 25 m de diámetro, 5 m de profundidad y 10 mm de luz de malla y
jaulas de tipo L: 25 m de diámetro, 10 m de profundidad y 15 mm de luz de malla.
Gracias a estos trasvases, la densidad/carga se mantuvo siempre por debajo de 7 kg/m 3.
Figura II.1.2.1. Imagen de
las instalaciones en la
bahía de Algeciras.
55
Sergio García Mesa
Los datos, obtenidos en años anteriores, de niveles de oxígeno del agua,
indicaban un mínimo en el período estival de 7.2 ppm. El aumento posprandial del
consumo por parte de los peces deprimía esos niveles de oxígeno disuelto a mínimos
entre 5.5 y 6.5 ppm; niveles que se considera están siempre por encima de las
necesidades de la especie, lo que hizo innecesario su control diario en esta ocasión.
La temperatura del agua en la zona de cultivo se midió diariamente a dos
profundidades (2 y 8 m) con objeto de obtener una información más completa de la
existente en la columna de agua donde vivían los peces. Esas determinaciones se
hicieron a las 8 a.m., siendo únicas pues la instalación no disponía de infraestructura
para un registro más continuado. Las diferencias entre las temperaturas a ambas
profundidades nunca llegaron a 1 °C, siendo algo mayores, 0.3-0.9 °C, en los meses más
cálidos (abril-octubre) y prácticamente nulas (menores de 0.1 °C) en el resto del año. Por
esa razón, a partir de ahora se considerará únicamente el valor promedio de ambas
medidas diarias.
La figura II.1.2.2. muestra la evolución de dicha temperatura a lo largo periodo
experimental considerado durante el cual se registró un máximo de 22.5 y un mínimo de
14.6 °C. La temperatura promedio a lo largo de un año completo, junio 2007-junio 2008
fue de 17.9 ± 0.1 °C. En la tabla II.1.2.1. se muestra la temperatura media registrada en
los diferentes intervalos de muestreo.
La salinidad se mantuvo constante a lo largo de todo el período experimental, en
torno a 37 ‰.
Figura II.1.2.2. Evolución de la temperatura a lo largo del periodo controlado. Cada punto
representa el día de muestreo amplio
56
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus
reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
Tabla II.1.2.1.Temperatura media (°C) de los intervalos inter-muestreos (M) de
los diferentes lotes.
Intervalo
M1-M2
Fechas
22jun07/24jul07
22jun07/27jul07
16ago07/09oct07
10ago07/02oct07
R1-A
18.1 ± 0.2
24jul07/22ago07
27jul07/29ago08
09oct07/26nov07
02oct07/13nov07
18.4 ± 0.2
22ago08/18oct07
29ago08/25oct07
26nov0721feb08
13nov07/27feb08
20.5 ± 0.2
18oct07/05dic07
25oct07/05dic07
21feb08/22abr08
27feb08/30abr08
18.5 ± 0.2
05dic07/05mar08
05dic07/11mar08
22abr08/27may08
30abr08/03jun08
16.1 ± 0.1
05mar08/23abr08
11mar08/07may08
27may08/12sep08
03jun08/01jul08
15.4 ± 0.1
23abr08/26may08
07may08/10jun08
16.1 ± 0.1
M8-M9
26may08/04jul08
17.5 ± 0.2
M9-M10
04jul08/26ago08
19.2 ± 0.1
M2-M3
M3-M4
M4-M5
M5-M6
M6-M7
M7-M8
Remesas-Lotes
R1-B
R2-A
R2-B
18.0 ± 0.2
20.4 ± 0.2
20.3 ± 0.2
18.8 ± 0.2
19.0 ± 0.1
19.3 ± 0.1
20.6 ± 0.1
16.1 ± 0.1
16.3 ± 0.1
18.6 ± 0.1
15.7 ± 0.1
15.7 ± 0.1
16.1 ± 0.1
16.1 ± 0.1
15.9 ± 0.1
15.7 ± 0.1
18.8 ± 0.2
17.7 ± 0.2
15.9 ± 0.1
II.1.2. 2. Alimentación
Durante todo el cultivo se realizó una distribución manual de alimento,
repartiendo la ración diaria entre 3 y 4 tomas, con un intervalo de 3 horas entre ellas. El
tamaño de la ración diaria a ofrecer se calculaba a partir de los datos suministrados por
el fabricante de piensos y de la carga previsible de cada jaula, una vez determinada la
temperatura diaria.
57
Sergio García Mesa
Dentro del proyecto a desarrollar, se consideró oportuno diferenciar el tipo de
dieta a partir de un punto establecido por el director técnico de la explotación, a fin de
observar posibles diferencias entre los resultados de una dieta comercial estándar para
lubina (Alphamar®) y una experimental, en diseño, específica para corvina (Regius®). Los
lotes A de cada remesa se mantuvieron alimentados con el primer pienso citado durante
todo el periodo controlado, mientras que en los B se introdujo, tras un breve periodo de
transición con alimentación mixta, el pienso Regius® entre el 7º y el 8º mes de estancia
en piscifactoría.
Los piensos utilizados fueron suministrados por la casa Dibaq-Diproteg S.A.,
quien indica que las materias primas utilizadas eran, en proporciones variables según
tipo de pienso y lote, las siguientes:
harina y aceite de pescado,
hemoderivados,
aceite vegetal de soja,
harina de soja tostada,
concentrado de proteína de soja,
haba de soja,
harina de trigo,
harina de avena,
harina de trigo,
gluten de trigo,
harina de guisantes y
minerales.
Los análisis llevados a cabo en el laboratorio con muestras representativas se
indican en las tablas II.1.2.2., II.1.2.3. y II.1.2.4.
II.1.2.3. Muestreos.
Como se ha indicado antes, los datos que se exponen en esta parte de la
Memoria, proceden del seguimiento técnico de un proyecto llevado a cabo en las
instalaciones de CeutaMar S.L. Ello significó no sólo el uso de las instalaciones de la
empresa para el mantenimiento de los animales, sino que durante el periodo
considerado, el cultivo se desarrolló según las pautas técnicas de la misma en cuanto a
jaulas utilizadas, alimentación suministrada (tipo, ración, horario y frecuencia de
dispensación, etc.) y mantenimiento general de los animales.
58
59
7.44
7.37
Alphamar®
Regius®
20.59
23.81
Grasa
42.88
40.03
Proteína
7.90
5.49
Ceniza
21.26
23.24
MELN*
22.23
25.72
Grasa
** Calculada sobre la base de 39.7, 24.3 y 17.2 kJ/g de grasa, proteína y MELN, respectivamente.
* Materia extractiva libre de nitrógeno (calculada por diferencia)
Humedad
Pienso
en sustancia fresco (%)
46.29
43.25
Proteína
8.53
5.93
Ceniza
22.95
25.11
MELN*
En sustancia seca (%)
Tabla II.1.2.2. Composición y contenido energético de los piensos utilizados
21.46
22.32
Energía**
bruta
(MJ/kg)
19.98
17.94
Relación**
proteína/ene
rgía (g/MJ)
Alphamar®
2.5
17.4
4.7
3.2
22.2
2.3
2.5
2.4
26.2
3.4
0.7
0.5
0.2
3.8
1.0
6.8
24.6
32.6
15.9
26.7
0.60
Regius®
3.0
17.7
4.7
3.8
21.0
2.5
2.6
2.3
25.1
3.1
0.8
0.7
0.0
4.3
1.0
7.5
25.4
32.2
16.7
25.8
0.65
Tabla II.1.2.3. Composición en ácidos grasos de los
lípidos de los piensos utilizados (% sobre lípidos
totales)
14:0
16:0
18:0
16:1n7
18:1n9
18:1n7
20:1n9
22:1n11
18:2n6
18:3n3
18:4n3
20:4n6
20:4n3
20:5n3
22:5n3
22:6n3
Total saturados
Total monoinsaturados
Total poliinsaturados n3
Total poliinsaturados n6
Relación n3/n6
Alphamar
®
7.39
6.12
10.68
17.77
6.41
3.99
3.80
11.12
5.94
1.92
5.77
0.57
5.32
4.29
4.16
4.78
1.30
1.76
6.61
7.47
9.42
21.08
6.58
3.29
4.44
8.61
6.58
2.81
4.77
0.60
4.85
4.55
4.18
4.15
1.25
1.69
1
(g / 100 g de proteína)
Harina de
Regius®
pescado1
6.5
6.1
9.0
13.6
6.5
2.0
4.3
7.8
8.1
3.1
4.0
4.2
4.5
4.4
3.2
4.8
2.9
2.6
1.6
2.6
4.3
4.8
2.0
2.6
4.6
Necesidades
de lubina2
Tabla II.1.2.4. Perfil aminoacídico de las proteínas de los piensos
utilizados. Valoración mediante Índices de aminoácidos esenciales
(IAAEE)
Aminoácido
ALA
ARG*
ASP
GLU
GLY
HIS*
ILE*
LEU*
LYS*
MET*
PHE*
PRO
SER
THR*
TYR
VAL*
IAEE HP3
IAAEE Lubina4
*Aminoácidos considerados esenciales en los peces. Según recopilación de Schuchardt,
2
3
2005. Según recopilación de Wilson, 2002. Valor promedio de las relaciones proteína
4
pienso/harina de pescado de los aminoácidos esenciales (excepto triptófano).
Valor
promedio de las relaciones proteína pienso/necesidades de lubina de los aminoácidos
esenciales (excepto triptófano)
60
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
En concreto, las fechas de los distintos muestreos vinieron impuestas por la
coincidencia con alguna operación de mantenimiento: cambio de redes, cambio de
jaulas…, único momento en que fue dado tomar la muestra correspondiente. A su vez,
en algunos momentos, estas maniobras tuvieron también un importante
condicionamiento climático, ajeno a los planes de la empresa. Es por ello, por lo que
los intervalos entre muestreos son de amplitud diferente para las distintas remesas y,
a veces, para los dos lotes de cada remesa.
Por otra parte, algunas de las determinaciones se realizaron in situ, por parte
del personal técnico de la empresa asesorado por nosotros (biometría de muestras
amplias) y otras en nuestro laboratorio (biometría exhaustiva de muestras reducidas,
análisis de piensos,…). Finalmente, algunas determinaciones se iniciaron “a pie de
jaulas”, en concreto en el barco de apoyo y se continuaron y terminaron en el
laboratorio de la UGR (extracción de vísceras y análisis de sangre.
La figura II.1.2.3. muestra, esquemáticamente, la secuencia temporal y el tipo
de muestreos realizados.
Como se ha indicado antes, se realizaron muestreos periódicos por el personal
de la piscifactoría para obtener datos de la evolución del cultivo; se trata de lo que
denominamos “muestreos amplios”. A estos animales se les midió in situ la longitud
total, la longitud cefálica y el peso y se almacenaron en un congelador industrial a
-20 °C hasta posterior procesado en el laboratorio donde, con muestras de tamaño
más reducido, se procedió a una biometría más exhaustiva.
Cada lote fue muestreado dos veces (en torno a los meses 5-6 y 10 de estancia
en la piscifactoría), para análisis de sangre. La extracción se realizó se realizó en
animales previamente sedados por inmersión en agua con hielo. La sangre se extrajo
de la vena caudal con jeringas heparinizadas. Estas muestras se usaron para la
determinación de constantes eritrocitarias y análisis bioquímico de plasma.
61
Figura II.1.2.3. Esquema cronológico de los diferentes muestreos realizados.
lote
jun07 jul07 ago07 sep07 oct07 nov07 dic07 ene08 feb08 mar08 abr08 may08 jun08
22
24
22
18
5
5
23
26
R1-A
0
32
61
118
166
257
306
339
R1-B
22
27
29
25
5
11
7
10
0
35
68
125
166
263
320
354
ago07 sep07
R2-A
R2-B
62
ene08
26
378
431
jul08
ago08
sep08
oct07
nov07
9
26
21
22
27
1
12
0
54
102
189
250
285
326
393
10
2
13
27
30
3
1
0
53
95
201
264
298
326
Análisis de músculo
Análisis hematológico
feb08 mar08 abr08 may08 jun08
ago08
4
16
Biometrías de muestras amplias
Biometría exhaustiva en muestras reducidas
Análisis de cuerpo entero
dic07
jul08
2, 9, 16 …: días del mes en curso
0, 52, 94 …: días del experimento
sep08
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
II.1.2.4. Métodos analíticos
Aquí se recoge una relación de los parámetros e índices determinados. La
forma precisa en que se hicieron esas determinaciones se expone con detalle en el
apartado IX: Metodología.
1)
Análisis biométrico de muestras amplias.
El personal técnico de la piscifactoría midió una serie de parámetros:
Longitud total y cefálica.
Peso
El tamaño del muestreo se determinaba en función de la variabilidad del peso,
hasta que la dispersión era muy baja y se consideraba que el muestreo era eficaz. Para
determinar la eficacia se utilizó el índice de Maguran, que se basa en la media de los
pesos acumulados.
Con los datos disponibles se calcularon:
-
Índice de condición
Índice cefálico
Tasa específica de crecimiento
Coeficiente de crecimiento térmico
2)
Análisis biométrico exhaustivo en muestras reducidas.
En el laboratorio, se extrajeron al azar 15 individuos de cada muestreo amplio
para llevar a cabo una biometría más exhaustiva.
-
Longitud total, estándar y ágil
Longitud cefálica
Altura máxima
Peso total
Tras la oportuna disección: peso de aletas, branquias, paquete
visceral o vísceras, tracto digestivo, hígado, riñón, corazón y
gónadas (en los individuos en que fue posible) y cabeza. También
se separó cuidadosamente el filete de un lado y se pesó.
A partir de las anteriores determinaciones se obtuvieron una serie de
parámetros morfométricos:






Índice de condición
Índice de agilidad
Índice cefálico
Perfil relativo
Índice cráneo-somático
Índice digestivo-somático
63
Sergio García Mesa
 Índice víscero-somático
 Índice hepato-somático
 Rendimiento del filete
3)
Análisis de composición de los piensos y de los peces (cuerpo
entero, músculo).
Se analizó el contenido en agua, cenizas, proteína, grasa, ácidos grasos y
aminoácidos de los piensos. Se calcularon el contenido en material extractivo de
nitrógeno (MELN), energía total y relación proteína energía de los mismos. En
homogeneizados de cuerpo entero y alícuotas de músculo se determinó el contenido
de agua, cenizas, proteína y grasa. La metodología analítica concreta se expone en el
apartado IX.
4)
Análisis de sangre.
Se determinaron recuento (número) de glóbulos rojos, contenido en
hemoglobina e índice hematocrito. A partir de ellos se calcularon: Volumen
Corpuscular, Hemoglobina Corpuscular Media y Concentración de Hemoglobina
Corpuscular Media
Por otra parte, en alícuotas del plasma obtenido como se ha descrito más arriba
se determinó el contenido de glucosa, colesterol, triglicéridos y proteínas.
5)
Tratamiento estadístico.
Se utilizó el análisis de la varianza de una vía (ANOVA) usando el paquete
estadístico SPSS 15.0 para Windows. Las diferencias significativas en la evolución
temporal para un mismo grupo, en los distintos puntos de muestreo (P < 0.05) y entre
tratamientos se determinaron por el test de Duncan (Duncan, 1955).
64
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
II.1.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
II.1.3.1. Crecimiento
Una vez superadas las fases larvaria y de preengorde, en las que la
supervivencia del mayor número posible de peces es la preocupación fundamental de
los piscicultores, el interés de éstos se centra, por una parte, en la prevención de las
patologías asociadas a un cultivo intensivo y, sobre todo, en la consecución de unos
índices de crecimiento y conversión del alimento que hagan viable el negocio a la vez
que se ofrece al consumidor un producto sanitaria, organoléptica y nutricionalmente
deseable.
Por ello, el seguimiento de la evolución del peso de los individuos durante el
ciclo de producción es uno de los controles más habituales en piscifactoría, con el fin
de obtener datos que, en el caso de una especie relativamente novedosa en los
cultivos de engorde cual es la corvina, son aún de más importancia.
En el cultivo experimental al que se refiere la presente Memoria, el personal
técnico de la empresa realizó muestreos a intervalos predefinidos, normalmente
asociados a alguna práctica como cambio de redes para limpieza o cambio de peces de
una jaula a otra. Se pretendía que la frecuencia de estos muestreos fuese más alta al
principio para irla reduciendo posteriormente.
En las tablas II.1.3.1. y II.1.3.2. y en la figura II.1.3.1. se muestra un resumen de
dichos datos. Como se observa, las corvinas ingresaron en la piscifactoría con pesos
iniciales en torno a los 4 g (Remesa 1) y entre 6 y 9 g (Remesa 2). El peso de los
animales fue creciendo de forma sostenida hasta alcanzar (últimos muestreos
disponibles) los 130-170 g en la remesa 1 y los 170-210 g en los lotes de la remesa 2,
cuando, en ambos casos, se cumplía un año o poco más de estancia en la planta.
65
Sergio García Mesa
Tabla II.1.3.1. Evolución de algunos datos biométricos de las corvinas de la Remesa-1.
Peso
Longitud
Longitud
Días de
Índice de
Índice
cultivo
total
total
cefálica
condición
cefálico
(fecha)
(g)
(cm)
(mm)
R1-A
0
4.10 (196)
7.46 (196)
12.24 (60)
0.98
0.16
R1-B
22/06/07
± 0.08
± 0.05
± 0.16
± 0.01
± 0.002
32
12.04 (121)
10.15 (60)
17.04 (60)
1.14
0.17
24/07/07
± 0.32
± 0.90
± 0.23
± 0.10
± 0.01
61
18.85 (79)
11.60 (79)
21.03 (62)
1.18
0.18
22/08/07
± 0.61
± 0.12
± 0.31
± 0.01
± 0.002
118
62.25 (72)
17.86 (72)
31.64 (62)
1.07
0.18
18/10/07
± 2.15
± 0.21
± 0.38
± 0.01
± 0.001
166
84.56 (91)
19.63 (91)
34.59 (60)
1.09
0.18
05/12/07
± 25.83
± 1.83
± 0.45
± 0.08
± 0.01
257
89.79 (78)
20.27 (78)
38.11 (64)
1.03
0.19
05/03/08
± 33.78
± 2.20
± 13.28
± 0.07
± 0.06
306
107.50 (51)
21.42 (51)
39.15 (20)
1.04
0,18
23/04/08
± 6.11
± 0.37
± 1.15
± 0.05
± 0.01
339
128.20 (59)
22.73 (59)
40.33 (59)
1.05
0.18
26/05/08
± 7.08
± 0.40
± 0.65
± 0.01
± 0.001
378
140.46 (73)
23.12 (73)
41.20 (20)
1.08
0.18
04/07/08
± 6.99
±0.34
± 0.71
± 0.01
± 0.002
431
171.89 (62)
26.84 (62)
44.28 (62)
0.99
0.17
26/08/08
± 112.23
± 1.61
± 0.90
± 0.03
± 0.003
0
4.09 (128)
7.40 (128)
11.83 (60)
0.98
0.16
22/06/07
± 0.11
± 0.07
± 0.15
± 0.01
± 0.001
35
12.75 (121)
9.71 (121)
17.23 (44)
1.25
0.18
27/07/07
± 0.28
± 0.07
± 0.33
± 0.01
± 0.002
68
23.29 (102)
12.62 (102)
22.22 (60)
1.13
0.17
26/08/07
± 0.79
± 0.15
± 0.39
± 0.01
± 0.002
125
63.85 (114)
17.93 (114)
31.37 (62)
1.07
0.18
21/10/07
± 1.90
± 0.18
± 0.46
± 0.01
± 0.002
166
81.30 (77)
19.27 (77)
33.86 (60)
1.11
0.18
05/12/07
± 2.50
± 0.19
± 0.39
± 0.01
± 0.001
263
104.21 (99)
21.31 (99)
38.45 (61)
1.05
0.18
11/03/08
± 3.19
± 0.20
± 0.41
± 0.01
± 0.001
320
114.32 (46)
21.74 (46)
38.08 (46)
1.05
0.18
07/05/08
± 7.91
± 0.43
± 0.72
± 0.01
± 0.001
354
132.86 (80)
22.83 (80)
40.76 (60)
1.09
0.18
10/06/08
± 4.19
± 0.23
± 0.46
± 0.01
± 0.001
Los valores son promedio (N) ± EEM. Los valores de N para Índice de condición son los de Longitud total y los de
Índice cefálico los correspondientes a Longitud cefálica.
66
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
Tabla II.1.3.2. Evolución de algunos datos biométricos de las corvinas de la Remesa-2.
Peso
Longitud
Longitud
Días de
Índice de
Índice
cultivo
total
total
cefálica
condición
cefálico
(fecha)
(g)
(cm)
(mm)
R2-A
0
6.35 (80)
8.38 (80)
20.70 (23)
1.06
0.24
16/08/07
± 1.56
± 0.80
± 5.00
± 0.14
± 0.29
54
27.71 (72)
13.13 (72)
24.26 (62)
1.20
0.18
09/10/07
± 0.96
± 0.17
± 0.33
± 0.02
± 0.002
102
65.66 (74)
17.36 (74)
32.23 (60)
1.24
0.18
26/11/07
± 2.07
± 0.20
± 0.34
± 0.02
± 0.002
189
103.91 (71)
20.93 (71)
21/02/08
± 3.76
± 0.21
1.10
n.d.
± 0.02
n.d.
250
122.70 (53)
22.00 (53)
40.84 (24)
1.11
0.18
22/04/08
± 5.56
± 0.36
± 0.65
± 0.01
± 0.002
285
152.63 (57)
23.20 (57)
41.80 (57)
1.19
0.18
27/05/08
± 6.78
± 0.37
± 0.66
± 0.02
± 0.002
393
211.55 (41)
27.30 (41)
47.06 (41)
1.00
0.17
12/09/08
± 10.73
± 0.48
± 0.73
± 0.01
± 0.001
R2-B
0
9.24 (80)
9.61 (80)
15.66 (57)
1.04
0.16
10/08/07
± 0.17
± 0.06
± 0.17
± 0.87
± 0.01
53
26.20 (90)
13.14 (90)
24.07 (62)
1.11
0.18
02/10/07
± 0.94
± 0.15
± 0.36
± 0.01
± 0.002
95
50.08 (91)
16.24 (91)
29.15 (60)
1.15
0.18
13/11/07
± 1.45
± 0.16
± 0.33
± 0.02
± 0.001
201
107.64 (93)
21.09 (73)
38.04 (60)
1.12
0.18
27/02/08
± 3.32
± 0.22
± 0.39
± 0.01
± 0.001
264
140.85 (73)
22.68 (71)
40.89 (53)
1.18
0.18
30/04/08
± 4.28
± 0.23
± 0.47
± 0.01
± 0.002
298
155.47 (71)
23.44 (75)
41.20 (37)
1.16
0.18
03/06/08
± 6.34
± 0.29
± 0.86
± 0.01
± 0.002
326
171.01 (75)
24,82 (64)
43.79 (20)
1.09
0.17
01/07/08
± 6.22
± 0.28
± 0.83
± 0.01
± 0.002
Los valores son promedio (N) ± EEM. Los valores de N para Índice de condición son los de Longitud total y los de
Índice cefálico, los correspondientes a Longitud cefálica.
250
Peso (g)
200
R1-A
150
R1-B
R2-A
100
R2-B
50
0
0
100
200
300
400
500
Días de cultivo
Figura II.1.3.1. Evolución del peso de las corvinas de cada remesa.
67
Sergio García Mesa
Coeficiente de Variación (CV)
Es común en las piscifactorías que, al crecer los peces, también lo haga la
dispersión de tamaños dentro del grupo lo que, en algunas ocasiones, obliga a
proceder a una selección y separación de individuos con el objeto de que la marcha
general de la unidad no se resienta. El aumento del coeficiente de variación también se
ha detectado en este caso (figura II.1.3.2.) desde unos valores inferiores a 30 al
comienzo hasta otros superiores a 40 en los muestreos finales o por encima de 50 en
el último del lote R-1A durante el cual se detectaron en la misma jaula animales que
apenas llegaban a 50 g junto a otros que superaban los 500 g. Durante el periodo de
tiempo controlado en este cultivo experimental, no se ha efectuado, en ningún
momento, un proceso de selección por tamaños. No obstante, es previsible que en
muestreos posteriores esa elevada dispersión no se manifieste y los datos de los
mismos sean más representativos del peso medio real del lote. No sabemos hasta qué
punto esa ausencia de selección y, por tanto, de cierta homogeneidad en el peso de los
individuos dentro de cada recinto ha podido afectar negativamente al peso medio del
conjunto.
60
50
40
R1-A
30
R1-B
20
R2-A
10
R2-B
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Muestreos
Figura II.1.3.2. Evolución del Coeficiente de Variación (%) del peso en los diferentes muestreos.
Además de en términos absolutos, es común expresar el crecimiento en
términos relativos, usándose para ello varios índices de los que la tasa de crecimiento
instantáneo, estándar o específico (SGR) es el más utilizado. Dichos índices se exponen
en la tabla II.1.3.3. en la que se presentan, tanto los obtenidos en cada intervalo entre
muestreos como los acumulados (es decir, entre el día de inicio del cultivo y el de la
fecha del muestreo en cuestión). Se observa en todos los casos que la tasa de
crecimiento en % por día es más alta en los individuos más jóvenes, circunstancia que
era de esperar pues es lo común en cualquier explotación animal incluyendo las
piscícolas (Austreng et al., 1987), y luego va cayendo; así se pasa de valores de SGR
entre 2 y 3 a valores inferiores a la unidad.
68
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
Tabla II.1.3.3. Crecimiento de los distintos lotes: Valores de Tasa de Crecimiento Específico (SGR) y
Coeficiente de Creciemiento Térmico (CCT) (para intervalos y acumulado*)
Período
SGR
SGR*
CCT
CCT*
3.27
3.27
0.0026
0.0026
R1-A
M1-M2
1.55
2.46
0.0014
0.0021
M2-M3
2.10
2.29
0.0022
0.0021
M3-M4
0.64
1.81
0.0011
0.0018
M4-M5
0.07
1.20
0.0002
0.0014
M5-M6
0.37
1.06
0.0010
0.0013
M6-M7
0.53
1.01
0.0014
0.0014
M7-M8
0.23
0.93
0.0005
0.0013
M8-M9
0.37
0.61
0.0007
0.0010
M9-M10
3.16
3.16
0.0025
0.0025
R1-B
M1-M2
1.82
2.52
0.0018
0.0022
M2-M3
1.77
2.18
0.0019
0.0020
M3-M4
0.59
1.79
0.0010
0.0018
M4-M5
0.26
1.23
0.0006
0.0015
M5-M6
0.16
1.04
0.0004
0.0013
M6-M7
0.44
0.98
0.0013
0.0013
M7-M8
2.68
2.68
0.0021
0.0021
R2-A
M1-M2
1.80
2.27
0.0024
0.0022
M2-M3
0.82
1.76
0.0013
0.0019
M3-M4
0.18
1.18
0.0008
0.0017
M4-M5
0.62
1.11
0.0017
0.0017
M5-M6
0.30
0.89
0.0006
0.0014
M6-M7
1.93
1.93
0.0016
0.0016
R2-B
M1-M2
1.54
1.76
0.0018
0.0017
M2-M3
0.72
1.21
0.0016
0.0017
M3-M4
0.43
1.03
0.0012
0.0016
M4-M5
0.29
0.94
0.0009
0.0015
M5-M6
0.34
0.89
0.0008
0.0014
M6-M7
Es preciso recordar que los intervalos entre muestreos varían para cada lote y
que las fechas de entrada de los animales en las instalaciones y las de los sucesivos
muestreos también son diferentes (ver figura II.1.2.3. o, por poner un ejemplo, el
intervalo entre M3 y M4 puede ser de duración diferente y transcurrir en distinta
época del año para cada lote/remesa), así pues, aunque útiles para seguir la evolución
de cada lote, no permiten hacer comparaciones inter-remesas más que en cifras
globales. Si acudimos a éstas, la conclusión es que el valor del SGR general, último
valor acumulado, es muy similar y próximo a la unidad en todos los casos, salvo en el
lote R1-A para el que la afirmación anterior es válida hasta el penúltimo muestreo ya
que, en el último intervalo estudiado (M9-M10) el crecimiento se ralentizó
notablemente. Estas cifras, aceptables para otras explotaciones de peces marinos,
defraudan claramente las expectativas de alto crecimiento para esta especie (Calderón
et al., 1997; Pastor et al., 2007, Ortega y Gándara, 2007, Cárdenas, 2010; Monfort,
2010).
69
Sergio García Mesa
Esta circunstancia podría atribuirse, al menos en parte, a una relativamente
“pobre calidad” de estas remesas pues los pocos datos disponibles sobre una tercera,
llegada en fechas posteriores a la planta, mostraron un comportamiento claramente
más favorable. Efectivamente, esta tercera remesa, incorporada el 24 de julio de 2008
con 7.3 g de peso medio inicial, superaba los 110 g en un muestreo efectuado del 22
de octubre de ese año, es decir unos 3 meses después, mientras que las dos remesas
iniciales seguidas por nosotros, en un periodo de tiempo parecido no llegaban a los 60
g, promediando los valores de los 4 lotes. El SGR acumulado para esta R-3 fue de 2.4,
siendo de 3.9 para el primer mes, valores que, en el mejor de los casos de las remesas
R-1 y R-2 eran de 2.3 y 3.3 y de 1.9 y 1.8, respectivamente, en el peor de ellos.
El crecimiento de los peces está determinado, fundamentalmente, por la
cantidad de alimento ingerido y por la temperatura del agua. Los peces son incapaces
de regular su temperatura corporal, por lo que su metabolismo únicamente funciona
de forma óptima dentro de un rango de temperaturas ambientales adecuadas, dentro
del cual la ingestión de alimento y el crecimiento son máximos, pero disminuyen
cuando la temperatura está por encima o por debajo del rango óptimo. En cuanto a la
cantidad de alimento, el crecimiento suele ser máximo con una alimentación “a
saciedad”. En las piscifactorías marinas, debido a la dificultad de determinar la
“saciedad” de los peces, la “alimentación restringida” es la opción más razonable. La
predicción del crecimiento de los peces resulta imprescindible para establecer las
necesidades nutritivas y las tasas de alimentación de una forma científica y rigurosa,
pero, además, la determinación de la curva de crecimiento de una especie, en unas
condiciones dadas, es fundamental para establecer unas pautas de producción en
piscicultura intensiva (Querellou, 1984).
Cho (1992) propuso, para ser usado con fines predictivos, un Coeficiente de
Crecimiento Térmico (CCT ó TGC, de las iniciales en inglés) que relaciona el
incremento de peso en un intervalo de tiempo dado con la temperatura ambiental de
ese periodo y así, en vez de hablar en crecimiento por día, se habla de crecimiento por
“grados·día”. La determinación, con ciertas condiciones de seguridad, de este
coeficiente para una especie dada permitiría al piscicultor realizar una previsión de
crecimiento razonable si conoce la evolución térmica del agua en sus instalaciones.
En este ensayo hemos empezado a determinar el mencionado coeficiente que
se expone, de nuevo tanto para intervalos dados, como en acumulado en la citada
tabla II.1.3.3. Aunque en la mayoría de los casos, los valores de CCT calculados son más
altos en los periodos iniciales, los acumulados muestran una cierta homogeneidad
entre remesas y lotes, situándose en torno a 1.35 · 10-3, algo superiores a los
reportados para lubina en el informe de Alamar et al. (2001), donde no llegan a 1.0 ·
10-3. De nuevo, estos valores resultaron algo mejores para la que hemos dado en
70
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
llamar remesa 3 a que antes nos hemos referido (un acumulado al tercer mes de 3.0 ·
10-3), aunque para ésta, los únicos datos disponibles fueron los del periodo inicial,
donde, como en las dos anteriores, los valores son, previsiblemente, los más altos.
Varios factores pueden ser invocados como responsables de estos poco
favorables datos sobre crecimiento. Aquellos varían desde las características (genéticas
y otras) de los juveniles introducidos en la granja desde la hatchery de origen hasta la
práctica alimentaria en la piscifactoría, pasando por varios factores ambientales. No
disponemos de datos concretos sobre los del primer tipo aunque no parecen haber
sido determinantes dado que juveniles de la misma hatchery han sido criados con
mejores resultados en otras factorías (comunicación personal).
Las principales variables ambientales condicionantes de la tasa de crecimiento
de los peces de piscifactoría tales como temperatura, oxígeno disuelto y salinidad
fueron monitorizadas antes o durante el ensayo encontrándose, en todos los casos,
dentro del rango considerado adecuado para esta especie, aunque los mínimos de
temperatura detectados en invierno (14 -16 °C) podrían estar en el origen de los peores
datos de crecimiento registrados en los periodos intermuestrales correspondientes (ver
tablas II.1.2.1. y II.1.3.3.). Cárdenas et al. (2009) sugieren que 24-25 °C es la
temperatura óptima para el crecimiento de la corvina, mientras que Collet et al. (2008)
recomendaban la temperatura de 24-26 °C para la cría de Argyrososmus japonicus, en
ambos casos por encima del rango 15-23 °C, detectado durante el experimento en el
área de la piscifactoría. Por otra parte, debe notarse que la piscifactoría se encuentra
en una zona, el Estrecho de Gibraltar, sujeta a fuertes vientos con cierta frecuencia lo
que implica el cese en la distribución de la comida durante 3-4 días en cada caso. Una
frecuencia más alta de la normal de estos episodios podría ayudar a explicar la
reducida productividad encontrada. La extrema sensibilidad del crecimiento de estos
peces a la temperatura ambiente se puso de manifiesto en un estudio en laboratorio
de Estévez et al. (2011) en el que las mismas dietas que habían producido SGRs de 1.3
a 1.9 durante las primeras semanas del experimento, en las que la temperatura media
del agua fue de 20.2 °C, pasaban a generar SGRs negativos (de hasta -0.40) durante las
últimas semanas del citado experimento en las que la temperatura del agua cayó a una
media de 15.6 °C.
En lo que concierne a las prácticas del cultivo, la alimentación es considerada
habitualmente como el principal factor determinante de las tasas de crecimiento.
En este cultivo piloto se han ensayado dos piensos comerciales, Alphamar® y
Regius®. El primero se suministró como único durante todo el periodo controlado a los
lotes A de cada remesa, en tanto que el segundo se introdujo, sustituyendo a
71
Sergio García Mesa
Alphamar®, en los lotes B de cada remesa entre el 7º y 8º mes de estancia en
piscifactoría.
La tabla II.1.2.2. muestra la composición en macronutrientes de ambos piensos,
resultando Regius® con un nivel proteico algo mayor, un nivel lipídico algo menor y
una mayor relación P/E que Alphamar®. La tabla II.1.2.3. se refiere a uno de los
principales determinantes de la calidad del componente lipídico de un pienso para
peces como es su perfil en ácidos grasos, incluyendo los HUFAn3; como se puede
observar en dicha tabla no existen diferencias importantes en los datos
correspondientes de ambos piensos lo que nos hace pensar que el componente
lipídico de los mismos, aunque diferente cuantitativamente hablando, no lo era en
cuanto al tipo (mezcla) de grasas incorporadas. Si contrastamos ese perfil con el de un
aceite de pescado comercial, fuente lipídica comúnmente considerada óptima para
estos animales (figura II.1.3.3.), podemos apreciar que los piensos ofrecen un
contenido sustancialmente menor de HUFAn3 y notablemente mayor de oleico
(18:1n9) y linolénico (18:2n6), lo que conlleva una claramente más reducida relación
n3/n6 en la grasa de los piensos que en el aceite de pescado comercial.
14:00
30
n3/n6 (x20)
25
16:00
20
15
22:6n-3
18:00
10
5
Aceite de
pescado
Alphamar®
0
22:5n-3
16:1n-7
20:5n-3
Regius®
18:1n-9
20:4n-6
18:2n-6
Figura II.1.3.3. Perfil de los principales ácidos grasos de las dietas comerciales, frente al aceite de
pescado
La tabla II.1.2.4. muestra los datos concernientes al perfil de aminoácidos,
incluidos la mayoría de los esenciales, de la proteína que incorporaban ambos piensos.
Se puede observar que la mezcla de fuentes proteicas usada en los piensos
comerciales utilizados rebaja la aportación de algunos aminoácidos esenciales (lisina o
metionina por ejemplo) con respecto a una harina de pescado convencional, el
“deterioro” que ello podría suponer en su calidad quizá no sea muy importante pues el
72
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
valor promedio de los demás supera incluso al de la mencionada fuente, considerada
unánimemente como de muy alta calidad. Pero, aún más importante, todos los
aminoácidos esenciales analizados están por encima de las necesitadas establecidas
para la lubina de las que, presumiblemente, las de corvina no deben ser muy distintas.
Todo ello supone una cierta garantía de calidad del componente proteico de los
piensos, al menos en la que a su aporte de aminoácidos esenciales concierne.
Dietas con niveles proteicos similares a los usados en este ensayo pero con
cantidades variables de lípidos (de 13 a 21%) fueron ensayadas por Chatzifotis et al.
(2010) quienes obtuvieron SGRs entre 0.40 y 0.46 con corvinas de 230 g de peso inicial,
valores dentro del rango de los obtenidos en este experimento. No obstante, los
autores citados informaban de una ingesta diaria de alimento entre 0.75 y 0.80% del
peso corporal (peces alimentados hasta saciedad aparente). En nuestro caso, la
cantidad de pienso suministrado cada día, obedeciendo indicaciones del departamento
técnico de la empresa, varió del 2% al 0.9% el peso corporal a medida que avanzaba el
experimento, aunque no puede descartarse que la ingesta real por los peces fuera
inferior a la ración ofrecida ya que en esta especie y en las jaulas de cultivo es
complicado evaluar de forma visual directa el apetito de los peces. Chatzifotis et al.
(2010) encontraron también que la dieta con un 17% de lípidos producía mejores
índices de crecimiento, conversión y utilización de la proteína que aquellas otras que,
manteniendo el nivel proteico (43%), contenían una proporción más alta (21%) o más
baja (13%) de grasa. En nuestro seguimiento, los peces alimentados con el pienso
Regius® en la que el contenido de grasa era del 22.2% aumentando el de proteínas
hasta el 46.3%, en sustancia seca, con el consiguiente aumento de la relación
proteína/energía y una reducción del aporte total de energía crecieron algo menos que
los mantenidos con el primer pienso (Alphamar®) (tabla II.1.3.3.), aunque la reducida
magnitud de estas diferencias y la elevada dispersión de los pesos individuales dentro
de cada grupo, hizo que esas diferencias no resultaran significativas desde un punto de
vista estadístico. Por tanto, el “efecto negativo” derivado del aumento de la cantidad
de lípidos de la dieta, aunque éste significara un mayor aporte de energía, que
detectaron Chatzifotis et al. (2010) no resultó evidente en nuestro ensayo. En un
estudio reciente (Martínez-Llorens et al., 2011) se ha evaluado el crecimiento y la
eficiencia alimentaria en juveniles de corvina (94 g peso inicial) alimentados con cuatro
dietas comerciales de diferentes contenidos porcentuales en proteínas/lípidos. El
crecimiento y los índices de conversión más satisfactorios se obtuvieron con las dietas
de mayores niveles proteicos, lo que parece confirmar unas elevadas necesidades
proteicas para esta especie, al menos en su fase juvenil.
Piccolo et al. (2008) realizaron un experimento con corvinas de mayor tamaño a
las que alimentaron con dos dietas diferentes en su relación proteína/grasa pero los
resultados publicados se centraban en los efectos sobre la composición corporal y
73
Sergio García Mesa
otros rasgos biométricos que no incluían los posiblemente ejercidos sobre el
crecimiento. Creemos que se requieren más estudios para determinar con precisión
los niveles óptimos de proteína, grasa y energía en la dieta para corvina en cada etapa
del ciclo de producción.
II.1.3.2. Otros índices biométricos
En colaboración con el departamento técnico de la empresa realizamos
mediciones de longitud total y cefálica de los peces que permitieron, unidos a los datos
de peso, la determinación de los correspondientes índices de condición y cefálico
(tablas II.1.3.1. y II.1.3.2.), se trataba de determinar si la morfología del pez cambiaba a
lo largo del periodo de cultivo.
En todos los casos, las corvinas se incorporaron a las jaulas con un índice de
condición próximo a la unidad; este índice aumentó ligeramente (el pez creció
proporcionalmente algo más en peso que en longitud, esto es, tendía a
“redondearse”), a medida que transcurrió el tiempo, pero esa tendencia que se
expresó al máximo coincidiendo con los valores iniciales más altos de SGR, no se
mantuvo y, de nuevo en todos los casos, una vez alcanzado un máximo en el segundotercer muestreo, el mencionado índice tendía a volver a los valores iniciales cercanos a
la unidad.
El aumento inicial en el índice de condición coincidió en el tiempo, como
veremos más adelante, con el de los índices hepato y digestosmático (IHS e IDS,
respectivamente). La transición de una práctica alimentaria propia de una hatchery, en
la que muy probablemente se usaron alimentos tipo “alta proteína-baja grasa”, a las
dietas comerciales de engorde, más pobres en proteína y más ricas en grasa, pueden
estar en la base de estos cambios: engrosamiento del cuerpo y aparente acúmulo de
grasa en el hígado y en torno al tubo digestivo. La posterior ralentización de la tasa de
crecimiento fue acompañada de un retorno de estos índices hacia los valores iniciales,
excepto en lo que respecta al IHS que, al final del período controlado, continuaba
siendo más elevado que en los juveniles a su llegada a la piscifactoría.
Poli et al. (2003) encontraron, en corvinas de 900 a 1500 g, valores de índice de
condición (K) similares a los de este ensayo, sin que detectaran variaciones
significativas en el mismo a lo largo de un período experimental de 6 meses. Ese
estudio también reportó un elevado “dressing percentage” (peso corporal menos
vísceras en relación a peso corporal total) que alcanzaba el 95%, una situación similar a
la hallada en este trabajo, como veremos más adelante. En un experimento posterior
74
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
con esta misma especie, pero con animales de 800 g, Piccolo et al. (2008) encontraron
valores similares a los nuestros de Índice de Condición (K) e IHS, pero el primero de
ellos subió a 1.2 cuando los peces se alimentaban con una dieta de elevados
contenidos graso y energético, lo que fue acompañado de un incremento de grasa
mesentérica pero no del IHS. Finalmente, Chatzifotis et al. (2010) en un estudio con
peces de un tamaño parecido al de los de este trabajo, se encontraron de nuevo con
valores de índice de condición muy próximos a la unidad que, en este caso, se
revelaron independientes del nivel lipídico de la dieta (de 13 a 21%, experimento de
110 días). En ese estudio, el IHS era inferior al 1% mientras que el viscerosomático se
encontraba dentro del rango 2.5-3.5%, de nuevo sin diferencias atribuibles a la
composición de la dieta. Martínez-Llorens et al. (2011) y Estévez et al. (2011) también
encuentran valores de K muy próximos a la unidad en la mayoría de las situaciones
experimentales utilizados en sus laboratorios con esta especie. Existe pues un acuerdo
general de que el K de la corvina es muy próximo a 1.0 a edades muy diferentes, una
cifra inferior a la encontrada en otros peces acuicultivados como la lubina o la dorada
(Poli et al., 2003) y típica de peces “delgados”, un rasgo morfológico normalmente bien
considerado por los consumidores de pescado.
El índice cefálico también se mantuvo muy estable (la cabeza representa en
torno al 18% de la longitud corporal total) a lo largo de todo el periodo de cultivo y
para todos los lotes. El único valor que se escapó de esta tendencia general fue el
inicial del lote R2-A con un índice cefálico de casi el 24%.
La conclusión general deducible del análisis de estos índices es que, a grandes
rasgos, la morfología externa de la corvina no se alteró de forma importante durante
su primer año de estancia en piscifactoría.
Un número más reducido de los animales procedentes de los muestreos
anteriormente comentados, fue trasladado al laboratorio para ser sometidos a un
análisis biométrico exhaustivo, tanto externo como interno.
Las tablas II.1.3.4. a II.1.3.7. resumen los resultados de tales mediciones que
pretenden realizar un perfil morfométrico exhaustivo de las corvinas en cultivo, así
como detectar posibles alometrías que pudieran resultar indicativas de alguna
inadecuación en las prácticas de cultivo.
75
Sergio García Mesa
Tabla II.1.3.4. Biometría exhaustiva de laboratorio de las corvinas de R1-A
Días de
cultivo
(fecha)
0
32
61
118
166
257
306
339
378
(22/06/07)
(24/07/07)
(22/08/07)
(18/10/07)
(05/12/07)
(05/03/08)
(23/04/08)
(26/05/08)
(04/07/08)
LONGITUD (cm)
Total
7.56•
± 0,16
9.91
± 0.28
11.94+•
± 0.23
18.82+•
± 0.39
18.69
± 0.71
20.60•
± 0.57
22.47
± 0.92
24.18
± 0.77
22.83
± 0.57
Estándar
6.42•
± 0.14
8.48
± 0.26
10.13+•
± 0.27
16.33+•
± 0.35
16.85
± 0.39
17.71•
± 0.50
20.16
± 0.92
20.76
± 0.69
20.33
± 0.54
Cefálica
1.87•
± 0.07
2.50
± 0.07
2.92+•
± 0.07
4.74+•
± 0.10
4.87
± 0.10
5.24•
± 0.14
5.90
± 0.18
6.00
± 0.18
5.88
± 0.12
Altura
1.83•
± 0.03
2.50
± 0.08
2.89+•
± 0.09
4.52+
± 0.10
4.65
± 0.12
4.87•
± 0.14
5.24
± 0.22
5.51
± 0.15
5.52
± 0.14
Ágil
3.83•
± 0.11
5.21
± 0.15
6.35
± 0.17
9.68+
± 0.24
9.49
± 0.72
10.37•
± 0.32
11.73
± 0.49
12.45
± 0.37
11.81
± 0.32
Total
4.28•
± 0.27
12.19
± 1.18
20.55+•
± 1.58
75.33+
± 4.64
79.96
± 5.17
95.73•
± 8.13
131.40
± 16.16
151.80
± 15.87
142.60
± 10.29
Aletas
0.08•
± 0.01
0.18
± 0.02
0.33+
± 0.03
1.49+•
± 0.09
1.56
± 0.08
2.09•
± 0.16
2.96
± 0.33
3.37
± 0.31
3.02
± 0.21
Branquias
0.16
± 0.06
0.22+
± 0.02
0.40+
± 0.03
1.28+
± 0.07
1.46
± 0.09
1.73•
± 0.13
2.30
± 0.29
2.69
± 0.29
2.51
± 0.16
Digestivo
0.17•
± 0.01
0.70
± 0.08
1.02+
± 0.07
3.31+•
± 0.25
3.87
± 0.34
3.99+•
± 0.38
6.77•
± 1.13
4.82+
± 0.56
6.73
± 0.59
Hígado
0.06
± 0.01
0.41
± 0.05
0.71•
± 0.07
1.99+•
± 0.25
2.64
± 0.31
2.10•
± 0.26
2.90•
± 0.36
4.28
± 0.49
4.03
± 0.40
Vísceras
0.36•
± 0.03
1.59
± 0.17
2.66
± 0.22
8.89+•
± 0.74
9.68
± 0.85
9.78+•
± 0.93
14.37•
± 2.08
15.22
± 1.85
16.40
± 1.53
Cabeza
1.08•
± 0.06
2.67
± 0.22
4.28+•
± 0.25
15.76•
± 0.88
16.69
± 1.06
20.90•
± 1.52
28.15
± 3.01
31.86
± 2.80
30.46
± 1.93
Riñón
0.02•
± 0.01
0.06
± 0.07
0.09
± 0.01
0.31+•
± 0.37
0.30
± 0.03
0.34•
± 0.03
0.50
± 0.08
0.66
± 0.10
0.52
± 0.06
Filete
0.87•
± 0.10
2.45
± 0.27
4.13•
± 0.36
16.63+
± 1.07
17.13
± 1.47
21.23•
± 1.90
30.13
± 3.85
36.12
± 3.81
29.32
± 2.64
Corazón
n.d.
n.d.
n.d.
0.21+•
± 0.02
0.29+
± 0.03
0.32•
± 0.04
0.39
± 0.05
0.48
± 0.06
0.46
± 0.04
Gónadas
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
0.38•
± 0.08
0.68
± 0.24
1.14
± 0.25
1.04
± 0.24
PESO (g)
+
Los valores son media ± EEM. (N=15) Diferencias significativas entre R1-A y R1-B para una misma medida (P<0.05).
•
Diferencias significativas entre R1 y R2 para una misma medida (P<0.05). n.d.: no determinado.
76
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
Tabla II.1.3.5. Biometría exhaustiva de laboratorio de las corvinas de R1-B
Días de
Cultivo
(fecha)
0
35
68
125
166
263
320
354
(22/06/07)
(27/07/07)
(29/08/07)
(25/07/07)
(05/12/08)
(11/03/08)
(07/05/08)
(10/06/08)
LONGITUD (cm)
Total
7.52•
± 0.13
10.35
± 0.23
13.05+•
± 0.45
16.97+•
± 0.48
19.36
± 1.24
20.70
± 0.37
23.27
± 0.72
23.13
± 0.42
Estándar
6.42•
± 0.15
8.60
± 0.10
11.23+•
± 0.39
14.73+•
± 0.42
16.90
± 0.48
17.89
± 0.33
19.90
± 0.68
20.09
± 0.57
Cefálica
1.84•
± 0.07
2.56
3.20
± 0.03
± 0.11
4.36+•
± 0.12
4.87
± 0.13
5.27
± 0.11
5.87
± 0.17
5.88
± 0.15
Altura
1.82•
± 0.04
2.41
± 0.04
3.21+•
± 0.13
4.06+
± 0.13
4.76
± 0.14
4.88
± 0.11
5.37
± 0.22
5.49
± 0.14
Ágil
3.85•
± 0.08
5.53
± 0.11
6.88
± 0.33
8.74+
± 0.28
10.18
± 0.33
10.39
± 0.18
12.1
± 0.42
11.96
± 0.28
Total
4.09•
± 0.91
12.07
± 0.51
27.88+•
± 2.78
58.35+
± 4.91
86.70
± 7.19
97.87
± 6.37
140.33
± 16.68
145.00
± 10.41
Aletas
0.07•
± 0.003
0.18
± 0.01
0.43+
± 0.04
1.04+•
± 0.08
1.69
± 0.13
2.02
± 0.13
2.96
± 0.28
2.90
± 0.16
Branquias
0.09
± 0.01
0.28+
± 0.02
0.66+
± 0.06
0.97+
± 0.06
1.52
± 0.11
1.67
± 0.11
2.23
± 0.24
2.36
± 0.14
Digestivo
0.17•
± 0.01
0.62
± 0.04
1.44+
± 0.12
2.41+•
± 0.21
3.94
± 0.29
9.67+•
± 0.82
4.73
± 0.61
6.51+
± 0.64
Hígado
0.06
± 0.01
0.40
± 0.04
0.65•
± 0.08
1.45+•
± 0.18
2.53
± 0.32
2.06•
± 0.26
3.78
± 0.58
3.98
± 0.38
Vísceras
0.35
± 0.02
1.42
± 0.09
3.27
± 0.31
6.39+•
± 0.59
9.65
± 0.93
4.01+•
± 0.28
14.36
± 2.17
16.15
± 1.39
Cabeza
1.08•
± 0.05
2.74
± 0.10
5.67+•
± 0.49
12.17•
± 0.89
17.04
± 1.29
20.79
± 1.28
29.24
± 2.84
29.18
± 1.84
Riñón
0.02•
± 0.002
0.05
± 0.01
0.11
± 0.01
0.21+•
± 0.02
0.28
± 0.04
0.30
± 0.05
0.54
± 0.07
0.47
± 0.05
Filete
0.76•
± 0.05
2.36
± 0.11
5.55•
± 0.63
11.80+
± 1.38
18.67
± 1.54
21.97
± 1.57
33.36
± 4.13
33.94
± 2.49
Corazón
n.d.
n.d.
n.d.
0.16+•
± 0.01
0.19+
± 0.01
0.32
± 0.03
0.49
± 0.06
0.43
± 0.03
Gónadas
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
0.51
± 0.11
5.72
± 4.24
1.30
± 0.43
+•
PESO (g)
+
Los valores son media ± EEM. (N=15) Diferencias significativas entre R1-A y R1-B para una misma medida (P<0.05).
•
Diferencias significativas entre R1 y R2 para una misma medida (P<0.05). n.d.: no determinado.
77
Sergio García Mesa
Tabla II.1.3.6. Biometría exhaustiva de laboratorio de las corvinas de R2-A
Días de
Cultivo
(fecha)
0
54
102
189
250
285
(16/08/07)
(09/10/07)
(26/11/07)
(21/02/08)
(22/04/08)
(27/05/08)
LONGITUD (cm)
Total
8.76+•
± 0.23
13.31•
± 0.38
17.13•
± 0.44
19.65
± 0.45
22.64•
± 0.56
23.15
± 0.70
Estándar
7.58+•
± 0.19
11.89•
± 0.29
15.07•
± 0.35
17.22
± 0.42
19.83+•
± 0.46
20.27
± 0.64
Cefálica
2.29+•
± 0.06
3.55•
± 0.08
4.46+•
± 0.08
5.09
± 0.12
5.84•
± 0.09
6.13
± 0.18
Altura
1.90+•
± 0.09
3.31•
± 0.09
4.20
± 0.12
4.54
± 0.10
5.50•
± 0.16
5.64
± 0.19
Ágil
4.39+•
± 0.12
7.59
± 0.19
9.17+
± 0.24
10.11
± 0.24
11.56•
± 0.30
12.04
± 0.38
Total
6.59+•
± 0.50
29.79•
± 2.19
63.18+
± 4.46
81.53
± 5.35
141.93•
± 10.09
157.13
± 15.42
Aletas
0.11+•
± 0.01
0.45
± 0.03
1.11+•
± 0.10
1.55
± 0.08
2.50+•
± 0.17
2.83
± 0.25
Branquias
0.13+
± 0.01
0.68+
± 0.04
1.04
± 0.08
1.51
± 0.07
2.25+•
± 0.14
4.32
± 1.93
Digestivo
0.20+•
± 0.02
1.52
± 0.16
3.72+•
± 0.26
3.70
± 0.26
8.72•
± 0.98
8.43•
± 0.97
Hígado
0.06
± 0.01
0.44•
± 0.06
1.60+•
± 0.19
1.80
± 0.18
3.43+•
± 0.37
4.31•
± 0.48
Vísceras
0.46+•
± 0.04
2.96
± 0.28
7.43+•
± 0.63
8.29
± 0.67
17.82•
± 1.42
19.14•
± 2.21
Cabeza
1.80+•
± 0.14
6.54•
± 0.44
12.96+•
± 0.79
18.04
± 0.98
28.50•
± 1.74
30.78
± 3.02
Riñón
0.05
± 0.02
0.09
± 0.01
0.22+
± 0.02
0.30
± 0.02
0.51+
± 0.04
0.60
± 0.08
Filete
1.28+
± 0.12
5.86
± 0.46
13.75
± 1.03
18.38
± 1.36
32.23+
± 2.32
35.85
± 3.31
Corazón
n.d.
n.d.
0.20
± 0.02
0.30
± 0.05
0.34+
± 0.02
0.43+
± 0.03
Gónadas
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
1.01
± 0.19
1.46
± 0.40
PESO (g)
+
Los valores son media ± EEM. (N=15) Diferencias significativas entre R2-A y R2-B para una misma medida (P<0.05).
•
Diferencias significativas entre R1 y R2 para una misma medida (P<0.05). n.d.: no determinado.
78
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
Tabla II.1.3.7. Biometría exhaustiva de laboratorio de las corvinas de R2-B
Días de
Cultivo
(fecha)
0
53
95
201
264
298
326
(10/08/07)
(2/10/07)
(13/11/07)
(27/02/08)
(30/04/08)
(03/06/08)
(01/07/08)
LONGITUD (cm)
Total
9.56+•
± 0.16
13.37•
± 0.30
16.09•
± 0.50
21.85
± 0.48
23.95•
± 0.37
23.44
± 0.71
25.81
± 0.59
Estándar
8.41+•
± 0.12
11.82•
± 0.25
14.05•
± 0.45
19.21
± 0.40
20.99+•
± 0.34
21.09
± 0.70
22.55
± 0.53
Cefálica
2.55+•
± 0.04
3.48•
± 0.07
4.17+•
± 0.10
5.55
± 0.09
6.01•
± 0.08
5.97
± 0.15
6.74
± 0.13
Altura
2.19+•
± 0.03
2.93•
± 0.18
3.94
± 0.10
5.24
± 0.14
5.80•
± 0.10
5.87
± 0.23
5.96
± 0.17
Ágil
5.08
± 0.06
7.07
± 0.21
8.52+
± 0.20
11.22
± 0.26
12.19•
± 0.18
12.24
± 0.36
13.03
± 0.38
Total
9.14+•
± 0.45
27.69•
± 1.92
51.52+
± 3.58
127.80
± 9.01
165.93•
± 7.50
166.73
± 16.83
194.67
± 14.55
Aletas
0.16+•
± 0.01
0.43
± 0.03
0.89+•
± 0.06
2.24
± 0.14
3.19+•
± 0.14
3.05
± 0.28
3.45
± 0.21
Branquias
0.20+
± 0.01
0.50+
± 0.04
0.97
± 0.07
2.15
± 0.15
2.71+•
± 0.12
2.53
± 0.19
3.16
± 0.26
Digestivo
0.34+•
± 0.02
1.39
± 0.11
2.60+•
± 0.20
5.33
± 0.44
16.06•
± 7.16
8.33
± 0.98
6.41•
± 0.74
Hígado
0.08
± 0.01
0.52•
± 0.06
1.11+•
± 0.11
3.66
± 0.46
5.43+•
± 0.39
5.70
± 0.95
8.34•
± 2.72
Vísceras
0.66+•
± 0.04
2.70
± 0.23
5.16+•
± 0.38
14.59
± 1.50
21.22•
± 1.20
20.53
± 2.86
19.05•
± 2.22
Cabeza
2.39+•
± 0.11
6.23•
± 0.42
10.76+•
± 0.72
25.60
± 1.47
32.28•
± 1.35
33.03
± 2.69
39.11
± 2.43
Riñón
0.06
± 0.02
0.09
± 0.01
0.17+
± 0.01
0.47
± 0.05
0.68+
± 0.04
0.56
± 0.06
0.77
± 0.10
Filete
1.75+
± 0.10
5.84
± 0.44
11.57
± 0.85
30.54
± 2.28
38.27+
± 1.98
39.16
± 4.02
46.57
± 3.45
Corazón
n.d.
n.d.
0.17
± 0.02
0.41
± 0.04
0.53+
± 0.04
0.55+
± 0.05
0.69
± 0.08
Gónadas
n.d.
n.d.
n.d.
1.19
± 0.37
1.09
± 0.20
0.77
± 0.14
1.32
± 0.34
+•
PESO (g)
+
Los valores son media ± EEM. (N=15) Diferencias significativas entre R2-A y R2-B para una misma medida (P<0.05).
Diferencias significativas entre R1 y R2 para una misma medida (P<0.05). n.d.: no determinado
•
79
Sergio García Mesa
Tabla II.1.3.8. Biometría de las corvinas de R1-A: índices derivados
Días de
Cultivo
(fecha)
I. Condición
I. Agilidad
I. Cefálico
Perfil relativo
% Aletas
% Branquias
ICS1
IDS2
IVS3
IHS4
Rendimiento
filete
0
32
61
118
166
257
306
339
378
(22/06/07)
(24/07/07)
(22/08/07)
(18/10/07)
(05/12/07)
0(5/03/08)
(23/04/08)
(26/05/08)
(04/07/08)
0.98a
± 0.01
2.09ab
± 0.04
0.25ab
± 0.01
0.24bc
± 0.002
1.93b
± 0.06
2.37b
± 0.09
25.29
± 0.28
3.94b
± 0.17
8.47a
± 0.29
1.47a
± 0.27
38.94
± 2.18
1.21ab
± 0.04
2.09ab
± 0.03
0.25ab
± 0.003
0.25bc
± 0.004
1.52a
± 0.03
1.83a
± 0.06
22.35
± 0.51
5.72f
± 0.36
12.92 e
± 0.45
3.43f
± 0.29
39.67
± 0.76
1.18ab
± 0.04
2.20ab
± 0.04
0.25a
± 0.002
0.24abc
± 0.003
1.62a
± 0.04
1.97a
± 0.09
21.22
± 0.46
5.03e
± 0.21
12.81de
± 0.28
3.38ef
± 0.21
39.83
± 0.54
1.11ab
± 0.02
2.14ab
± 0.03
0.25ab
± 0.002
0.24abc
± 0.002
1.99bc
± 0.05
1.72a
± 0.07
21.05
± 0.39
4.38bcd
± 0.16
11.75de
± 0.48
2.62bcd
± 0.24
44.08
± 0.50
1.08b
± 0.02
2.05a
± 0.15
0.27b
± 0.02
0.25 c
± 0.01
1.99bc
± 0.06
1.84a
± 0.06
21.06
± 0.65
4.81 de
± 0.22
11.94cde
± 0.43
3.26 def
± 0.30
42.58
± 1.76
1.06ab
± 0.02
2.13ab
± 0.03
0.25ab
± 0.003
0.24ab
± 0.03
2.20 de
± 0.05
1.85a
± 0.05
22.15
± 0.44
4.14bc
± 0.15
10.65bc
± 1.19
2.13b
± 0.17
44.44
± 1.06
1.08ab
± 0.01
2.24 b
± 0.02
0.26ab
± 0.01
0.23a
± 0.002
2.30 e
± 0.05
1.78a
± 0.05
22.01
± 0.43
4.93 de
± 0.25
10.57bc
± 0.34
2.24bc
± 0.15
45.57
± 0.37
1.03a
± 0.02
2.27 b
± 0.04
0.25ab
± 0.003
0.23a
± 0.01
2.26 de
± 0.06
1.77a
± 0.04
21.41
± 0.40
3.13a
± 0.11
9.83ab
± 0.35
2.80cde
± 0.17
47.62
± 0.75
1.18ab
± 0.05
2.14ab
± 0.03
0.26ab
± 0.004
0.24abc
± 0.003
2.12cd
± 0.04
1.78a
± 0.04
21.56
± 0.27
4.71cde
± 0.20
11.27bcd
± 0.49
2.77cd
± 0.14
42.53
± 2.77
Los valores son medias ± EEM. (N=15) Diferentes letras en una misma fila indican diferencias significativas (P<0.05) entre puntos
1
2
3
4
de muestreo de los índices morfométricos. Índice Craneosomático. Índice Digestosomático. Índice Viscerosomático. Índice
hepatotosomático.
En algunos casos, no ha sido posible determinar el peso de alguna víscera en los
animales más pequeños, bien por su reducido tamaño, que dificultaba su extracción
nítida o impedía su detección (corazón y gónadas, respectivamente). Como se observa
en las tablas, en algunos casos se miden o pesan distintos segmentos corporales o
porciones del mismo, accesibles desde el exterior, mientras que en otros hubo que
proceder a una cuidadosa tarea de disección.
Lógicamente, las medidas y pesos absolutos van creciendo a medida que el
cuerpo del animal lo hace por lo que son los índices relativos los que nos pueden
indicar si dicho crecimiento es isométrico (la víscera o segmento corporal en cuestión
lo hace en proporción a la totalidad corporal) o alométrico (lo hace en una proporción
distinta).
80
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
Tabla II.1.3.9. Biometría de las corvinas de R1-B: índices derivados
Días de
cultivo
(fecha)
I. Condición
I. Agilidad
I. Cefálico
Perfil relativo
% Aletas
% Branquias
ICS1
IDS2
IVS3
IHS4
Rendimiento
filete
0
35
68
125
166
263
320
354
(22/06/07)
(27/07/07)
(29/08/07)
(25/10/07)
(05/12/07)
(11/03/08)
(07/05/08)
(10/06/08)
0.95a
± 0.02
2.12a
± 0.03
0.25
± 0.01
0.24ab
± 0.003
1.79b
± 0.05
2.14b
± 0.06
24.88a
± 1.88
4.13a
± 0.16
8.45ab
± 0.36
1.43a
± 0.30
37.01
± 0.70
1.11bc
± 0.05
2.30c
± 0.03
0.25
± 0.004
0.23a
± 0.01
1.51a
± 0.03
2.30bc
± 0.08
22.83a
± 0.32
5.13a
± 0.24
11.72b
± 0.43
3.21b
± 0.28
39.14
± 0.75
1.21c
± 0.02
2.15ab
± 0.07
0.25
± 0.002
0.25b
± 0.01
1.56a
± 0.03
2.37c
± 0.07
20.70a
± 0.44
5.38a
± 0.31
11.79b
± 0.25
2.31ab
± 0.14
39.23
± 0.99
1.16cd
± 0.04
2.15ab
± 0.03
0.26
± 0.002
0.24ab
± 0.003
1.82bc
± 0.06
1.73a
± 0.09
21.16b
± 0.46
4.22b
± 0.27
1 0.89c
± 0.27
2.47c
± 0.14
39.78
± 3.01
1.16cd
± 0.02
2.14ab
± 0.04
0.33
± 0.03
0.33b
± 0.03
1.97cd
± 0.03
1.79a
± 0.07
19.84a
± 0.37
4.65a
± 0.20
11.01ab
± 0.28
2.82ab
± 0.17
43.09
± 0.41
1.08bc
± 0.02
2.14ab
± 0.04
0.25
± 0.003
0.24ab
± 0.004
2.07de
± 0.04
1.72a
± 0.04
21.50a
± 0.69
4.15a
± 0.17
9.75b
± 0.24
2.00ab
± 0.14
44.63
± 0.44
1.05b
± 0.04
2.26bc
± 0.03
0.25
± 0.003
0.23a
± 0.004
2.18c
± 0.05
1.64a
± 0.06
21.58a
± 0.57
3.37a
± 0.12
9.82ab
± 0.39
2.58ab
± 0.16
47.21
± 0.46
1.15cd
± 0.02
2.18abc
± 0.04
0.25
± 0.002
0.24ab
± 0.004
2.04d
± 0.06
1.66a
± 0.05
20.34a
± 0.36
4.44a
± 0.23
11.00ab
± 0.35
2.71ab
± 0.14
46.76
± 0.30
Los valores son medias ± EEM. (N=15) Diferentes letras en una misma fila indican diferencias significativas (P<0.05)
1
2
3
entre puntos de muestreo de los índices morfométricos. Índice Craneosomático. Índice Digestosomático. Índice
4
Viscerosomático. Índice Hepatotosomático.
El índice de condición aumentó con la edad de forma más marcada a la
detectada en los muestreos amplios antes comentados, de forma que, en todos los
lotes, era significativamente mayor al final del periodo controlado (tablas II.1.3.8. a
II.1.3.11.). Esto significaría, como ocurre normalmente en los peces sometidos a
condiciones de cultivo con alimentación basada en dietas ricas en energía, un cierto
“engordamiento” o pérdida de esbeltez del pez. Esa misma imprecisa variable (la
“esbeltez”) del animal puede ser evaluada a partir de los dos índices que relacionan
altura y longitud corporales, a saber el índice de agilidad (cuya disminución significará
un aumento mayor de la altura que de la longitud, es decir, un cierto “redondeo” del
cuerpo) y el perfil relativo (que será mayor en los peces más “redondos”). En ambos
casos detectamos ciertas oscilaciones, más marcadas en el primero de los índices
mencionados, pero sin una tendencia clara ni a lo largo del tiempo ni según
lote/remesa y así, si bien el perfil relativo permaneció prácticamente constante en
torno a un 25% en todos los casos; el Índice de agilidad aumentó ligeramente con el
tiempo en las corvinas de la remesa 1, aunque prácticamente sin significación
estadística, pero cayó, algo más pronunciadamente, en las de la remesa 2. A la espera
de una serie de datos más larga, no estamos en condiciones de proponer una
81
Sergio García Mesa
explicación coherente a estos datos, inclinándonos, por el momento, por no considerar
relevantes estas diferencias.
Tabla II.1.3.10. Biometría de las corvinas de R2-A: índices derivados
Días de
Cultivo
(fecha)
I. Condición
I.Agilidad
I. Cefálico
Perfil relativo
% Aletas
% Branquias
ICS1
IDS2
IVS3
IHS4
Rendimiento
filete
0
54
102
189
250
285
(16/08/07)
(09/10/07)
(26/11/07)
(21/02/08)
(22/04/08)
(27/05/08)
0.96a
± 0.03
2.33b
± 0.06
0.26
± 0.002
0.22
± 0.01
1.82b
± 0.08
2.06
± 0.08
27.54c
± 0.79
3.20a
± 0.13
7.04a
± 0.22
0.96a
± 0.11
38.19
± 0.78
1.24b
± 0.05
2.29ab
± 0.02
0.27
± 0.004
0.25a
± 0.003
1.55a
± 0.06
2.40
± 0.15
22.36b
± 0.77
4.97b
± 0.37
9.73b
± 0.39
1.45b
± 0.19
39.15
± 0.48
1.24b
± 0.05
2.19ab
± 0.04
0.26
± 0.004
0.25
± 0.004
1.76b
± 0.07
1.66
± 0.04
20.72ab
± 0.29
5.93cd
± 0.21
11.63c
± 0.25
2.44cd
± 0.14
43.32
± 0.35
1.05a
± 0.01
2.23ab
± 0.02
0.26
± 0.001
0.23
± 0.002
1.93b
± 0.05
1.90a
± 0.08
22.41b
± 0.44
4.60b
± 0.21
10.08b
± 0.35
2.18c
± 0.16
44.74
± 0.81
1.19b
± 0.02
2.11a
± 0.03
0.26
± 0.01
0.24
± 0.003
1.79b
± 0.07
1.61
± 0.04
20.37a
± 0.43
6.14d
± 0.49
12.48c
± 0.35
2.35cd
± 0.15
45.50
± 0.75
1.22b
± 0.04
2.14a
± 0.03
0.27
± 0.01
0.24
± 0.004
1.83b
± 0.05
1.63
± 0.06
19.64a
± 0.86
5.25bc
± 0.22
11.88c
± 0.33
2.69d
± 0.11
45.82
± 0.41
Los valores son medias ± EEM. (N=15) Diferentes letras en una misma fila indican diferencias
1
significativas (P<0.05) entre puntos de muestreo de los índices morfométricos. Índice Craneosomático.
2
3
4
Índice Digestosomático. Índice Viscerosomático. Índice Hepatosomático.
El peso de la cabeza parece ser una proporción constante del total (25-27%)
algo mayor que la que existe entre las longitudes respectivas.
El peso relativo de las aletas parece aumentar algo al crecer el animal, si bien
eso no es claramente apreciable en todos los lotes, con una serie de altibajos en la
secuencia temporal en otros, por lo que dudamos de que se pueda sostener
rotundamente tal afirmación.
Es curioso que el peso de las branquias sea relativamente más alto en los
primeros muestreos para descender luego hasta valores mínimos, en casi todos los
casos, al final del periodo controlado. Si el peso de las branquias es indicativo de su
área superficial, lo anterior podría justificarse en base a unas mayores necesidades de
oxígeno (directamente relacionadas con las necesidades metabólicas) en peces más
jóvenes. No obstante, cualquier aseveración en este sentido debe hacerse con cuidado
82
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
pues, como se ha indicado repetidamente, los muestreos se han realizado a intervalos
distintos y en momentos del año diferentes, en los que la temperatura del agua y el
oxígeno disuelto en la misma podrían ser tanto o más condicionantes que la edad a la
hora de determinar la tasa metabólica del pez. Finalmente, no debemos olvidar que se
trata de un índice relativo al peso corporal, por lo que una variación en el mismo
puede deberse a cualquiera de los dos, o a los dos, elementos implicados en el cálculo.
También como tendencia general, los índices víscerosomático y
digestosomático tienen los valores más reducidos al principio y luego crecen aunque
no linealmente, siendo en cualquier caso mayores al final del periodo controlado que
al comienzo del mismo. Además de un crecimiento/maduración específico de las
vísceras consideradas en una proporción mayor que el resto del cuerpo no se puede
descartar, aunque no tengamos por el momento datos directos, la posibilidad descrita
en otros peces de un cierto acúmulo graso en, por ejemplo, hígado o compartimento
peridigestivo cuando los juveniles pasan de una dieta con mayor contenido proteico y
uno más reducido de grasas a piensos con menor relación proteína/energía.
En el caso concreto del hígado, esta situación parece evidente a juzgar por la
evolución del índice hepatosomático que duplica su valor en las corvinas de la remesa
1 y lo triplica en las de la remesa 2. ¿Sirve el hígado y, en menor medida relativa, algún
otro componente del paquete visceral, para acumular la grasa que el músculo no
almacena? Más adelante comentaremos los datos de evolución de la composición
corporal y del músculo de las corvinas, que parecen apuntar en esta dirección. Si fuera
así, ¿podría tener eso algún efecto negativo sobre la funcionalidad del hígado y, por
extensión, sobre la salud de los animales a largo plazo? (figura II.1.3.4.).
Se habrían necesitado los datos de muestreos posteriores para ver si esta
tendencia se mantiene y, muy importante, los de composición de vísceras concretas,
sólo posibles, con la metodología disponible cuando éstas alcancen un tamaño
adecuado, para poder establecer alguna conclusión más definitiva a este respecto.
83
Sergio García Mesa
Tabla II.1.3.11. Biometría de las corvinas de R2-B: índices derivados
Días de
Cultivo
(fecha)
I. Condición
I. Agilidad
I. Cefálico
Perfil relativo
% Aletas
% Branquias
ICS1
IDS2
IVS3
IHS4
Rendimiento
filete
0
53
95
201
264
298
326
(10/08/07)
(02/10/07)
(13/11/07)
(27/02/08)
(30/04/08)
(03/06/08)
(01/07/08)
1.04a
± 0.03
2.32
± 0.03
0.27c
± 0.003
0.23ab
± 0.003
1.73b
± 0.05
2.19c
± 0.09
26.25d
± 0.23
3.65a
± 0.11
7.18a
± 0.16
0.86a
± 0.10
38.13
± 0.50
1.14bc
± 0.03
2.31
± 0.05
0.26b
± 0.002
0.22a
± 0.01
1.57a
± 0.04
1.92b
± 0.14
22.85c
± 0.94
5.02a
± 0.31
9.63b
± 0.45
1.81ab
± 0.15
41.91
± 0.48
1.24d
± 0.06
2.17
± 0.02
0.26b
± 0.003
0.25cd
± 0.003
1.74b
± 0.05
1.91b
± 0.08
20.98b
± 0.29
5.13a
± 0.35
10.05bc
± 0.38
2.13ab
± 0.12
44.71
± 0.62
1.20cd
± 0.03
1.19cd
± 0.01
2.11
± 0.03
0.25ab
± 0.001
0.24bcd
± 0.002
1.93c
± 0.03
1.64c
± 0.03
19.54a
± 0.27
5.70b
± 0.23
12.75ce
± 0.30
3.23bc
± 0.13
46.01
± 0.72
1.24d
± 0.02
2.09
± 0.03
0.26ab
± 0.002
0.25d
± 0.003
1.85bc
± 0.05
1.56c
± 0.05
20.31ab
± 0.46
4.92a
± 0.15
11.88e
± 0.42
3.22bc
± 0.22
46.82
± 0.53
1.10ab
± 0.02
2.19
± 0.03
0.26bc
± 0.002
0.23abc
± 0.002
1.81bc
± 0.05
1.62c
± 0.05
20.34ab
± 0.33
3.22a
± 0.14
9.68b
± 0.57
2.87c
± 0.09
47.88
± 0.50
2.15
± 0.05
0.25a
± 0.003
0.24bcd
± 0.003
1.77b
± 0.04
1.69c
± 0.04
20.33ab
± 0.39
4.18a
± 0.18
11.10cd
± 0.40
2.73abc
± 0.18
47.61
± 0.58
Los valores son medias ± EEM. (N=15) Diferentes letras en una misma fila indican diferencias significativas
1
2
(P<0.05) entre puntos de muestreo de los índices morfométricos. Índice Craneosomático. Índice
3
4
Digestosomático. Índice Viscerosomático. Índice Hepatosomático.
El rendimiento del filete (RF) y su composición son dos variables altamente
valoradas cuando el producto de la piscicultura se ofrece al mercado ya que los
compradores y consumidores finales son muy exigentes a este respecto. Obviamente,
estos índices adquieren su máxima relevancia en el momento en que el pescado va a
ser comercializado, pero un seguimiento previo de los mismos, como el aquí
presentado, puede ser útil a la hora de considerar posibles medidas correctoras en las
prácticas de la piscifactoría incluyendo la alimentación de los peces (tipo de dieta,
racionamiento, etc.). El RF es una aproximación de uso muy común a la hora de valorar
la proporción que la parte comestible del pez significa del peso total del mismo. En
este seguimiento, este índice se situó siempre cerca o en el rango 37-47% (tablas
II.1.3.8. a II.1.3.11., figura II.1.3.5.). Se trata de valores algo inferiores a los reportados
por Piccolo et al. (2008) para corvinas de 800 g pero muy cercanos a los hallados por
Poli et al. (2003) en peces de 900 a 1500 g. Aunque este índice está sujeto a un cierto
grado de variación según la metodología concreta usada para la separación del filete
en distintos laboratorios y por diferentes investigadores, podemos considerar estos
valores razonablemente representativos de la corvina en condiciones de cría intensiva.
84
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
Índice hepatosmático (IHS) %
4.0
3.5
3.0
2.5
R1-A
2.0
R1-B
1.5
R2-A
1.0
R2-B
0.5
0.0
0
100
200
300
400
Días de cultivo
Figura II.1.3.4. Evolución del Índice Hepatosomático (%) en las diferentes remesas.
Rendimiento del filete (RF) %
50
45
R1-A
40
R1-B
R2-A
35
R2-B
30
0
100
200
300
400
Días de cultivo
Figura II.1.3.5. Evolución del rendimiento del filete a lo largo del período experimental.
Piccolo et al. (2008) encontraron una relación directa entre el contenido
energético de la dieta y el RF. En nuestro estudio no hemos detectado tal efecto
(muestreos finales de lotes B (Regius®) frente a lotes A (Alphamar®I) y,
sorprendentemente, los peces alimentados con la dieta más rica en lípidos y energía
mostraron un valor algo más bajo (de hecho el valor más bajo encontrado en todo el
periodo de seguimiento). En cualquier caso, las diferencias en la composición de
nuestras dos dietas eran claramente menores que las utilizadas por Piccolo et al.
(2008).
II.1.3.3. Parámetros hemáticos.
La determinación de las constantes eritrocitarias es una práctica habitual en los
cultivos de peces, pues proporciona un índice del estado general de la población
85
Sergio García Mesa
mediante unos procedimientos no excesivamente laboriosos ni caros. Lógicamente,
para que esos índices resulten útiles se debe disponer de una referencia previa,
objetivo al que se dirige esta parte del trabajo.
Nuestros resultados informan (tabla II.1.3.12.) de que las corvinas de esta
edad/peso poseen entre 1.5 y 2 millones de glóbulos rojos por mm3 de sangre, un
hematocrito entre el 30 y el 45% y una cantidad de hemoglobina tan variable como 6 a
15 g/dL. Estos datos proceden de sólo dos muestreos por lote, estando previsto
ampliarlos con los procedentes de otras edades para disponer de un espectro más
amplio y una referencia más sólida; datos de los que nos disponemos por el momento.
A partir de los hasta ahora disponibles, calculamos que los glóbulos rojos de
esta especie tendrían un volumen de entre 200 y 300 μm3 y un contenido individual de
hemoglobina de entre 30 y 70 pg que ocuparía entre el 20 y el 30% de su volumen.
Resulta complicado, a partir de los escasos resultados disponibles, adivinar una
tendencia o evolución con la edad ya que los valores del primer muestreo (animales
más jóvenes) fueron algo mayores que los del segundo, pero esto que ocurre en la
remesa-1, no fue evidente en la 2. Sí es una tónica general que los animales que
primero ingresaron en la piscifactoría (R-1) poseían, en general, unas constantes
eritrocitarias más altas (más hemoglobina en glóbulos rojos de mayor tamaño) que los
incorporados en la segunda tanda (R-2). No obstante esta diferencia, no se ha
trasladado a otros parámetros como la tasa de crecimiento.
La estacionalidad puede significar cambios en la disponibilidad de oxígeno, al
disminuir la capacidad del agua para disolver oxígeno cuando su temperatura
aumenta. Esta disponibilidad de oxígeno podría determinar de alguna forma la tasa de
producción compensatoria de glóbulos rojos y pigmento transportador. No parece ser
esta la situación en nuestros controles ya que en casi todos los casos, los valores
correspondientes al periodo más frío (diciembre para remesa 1 y febrero para la
remesa 2) son más altos que los correspondientes a los de los muestreos en periodo
más cálido (abril para la remesa 1 y julio para la remesa 2). Recordamos que las
oscilaciones térmicas, en cualquier caso no han sido muy marcadas y que a
disponibilidad de oxígeno siempre se mantuvo en valores aceptables a juzgar por
mediciones de temporadas anteriores (ver anexo IX. Metodología).
86
87
•
± 2.53
•
29.67
± 2.48
± 13.93
32.25
70.67
± 6.28
± 10.67
68.50
200.36
± 31.46
± 2.75
45.78
± 1.29
14.72
242.53
± 0.33
43.66
± 1.11
14.53
± 0.15
•*
2.30
± 0.24
R1-B
1.89
R1-A
166
05/12/0
7Alphamar
166
05/12/0
7Alphamar
306
•*
± 4.59
28.59
•
± 21.87
70.79
•
± 54.20
316.92
± 5.92
39.33
± 1.35
10.49
± 0.31
1.18
R1-A
23/04/0
8Alphamar
306
± 1.52
19.27
± 19.18
56.14
± 114.58
313.72
± 3.30
37.94
± 0.72
7.22
± 0.37
1.75
R1-B
23/04/0
8 Regius
189
•
± 4.69
26.01
± 22.54
45.52
± 39.05
200.55
± 4.16
33.23
± 0.83
7.51
•*
± 0.57
1.87
R1-A
21/02/0
8Alphamar
189
± 6.45
18.54
± 16.21
61.11
± 61.73
274.77
± 6.88
32.26
± 0.98
7.28
± 0.41
1.56
R1-B
27/02/0
8Alphamar
320
•
± 6.74
23.06
± 5.02
32.65
•
± 29.98
188.32
± 1.17
30.16
± 0.27
5.24
•*
± 0.26
1.63
R1-A
01/07/0
8Alphamar
326
± 1.77
17.26
± 2.79
42.33
± 25.17
255.12
± 17.68
39.52
± 0.71
6.81
± 0.73
1.63
R1-B
01/07/0
8 Regius
Los valores son media ± EEM (N=6). Indica diferencias significativas (P<0.05) entre R1 y R2 al mismo periodo. * en la
columna de R1 o R2 indican diferencias significativas (P<0.05) entre los dos puntos de muestreo.
CHCM (%)
3
HCM 2 (pg)
VCM1 (µm3)
(%)
Hematocrito
(g/dL)
Hemoglobina
(x106 /µL)
Recuento
Remesa-Lote
Pienso
Fecha
Día de cultivo
Tabla II.1.3.12. Constantes eritrocitarias de las corvinas de los distintos lotes en dos
muestreos diferentes (antes y después del inicio de alimentación diferenciada).
Sergio García Mesa
Por otra parte, y hasta cierto punto independientemente de la concentración
de oxígeno disponible en el entorno, la densidad de animales en las jaulas podría ser
otro determinante de estos parámetros. De los datos que se exponen en el apartado
Animales y Mantenimiento de Material y Métodos, se puede deducir que las cargas en
los momentos de muestreo, aunque diferentes en función del momento de traslado a
jaulas mayores se encontraban en todos los casos por debajo de 7 kg/m 3 (datos de la
empresa), insuficientes como para crear problemas de este tipo. En cualquier caso,
estos comentarios no pasan de ser algo especulativos pues, como se ha indicado antes,
no disponemos de los datos concretos de oxígeno disponible en el período controlado.
Finalmente, la alimentación diferenciada, presente en los segundos muestreos
de ambas remesas, tampoco parece ejercer efecto claro alguno sobre estas constantes
al comparar los datos de los lotes A y B de cada remesa en el segundo muestreo.
También con la idea de iniciar una serie más amplia que, una vez concluida,
nos permita establecer unos valores de referencia, se han determinado algunos
metabolitos sanguíneos clave (tabla II.1.3.13.). Las corvinas, como otros peces (PérezJiménez et al., 2008) muestran unos niveles elevados de triglicéridos en plasma, al
menos si consideramos los de mamíferos como referencia. Las cifras de glucosa,
colesterol y proteínas están asimismo en línea con las encontradas para otras especies
(Pérez-Jiménez et al., 2007; Pérez-Jiménez, 2008). Pero es en estos parámetros en los
que el reducido tamaño de las muestras y su elevada dispersión (ver valores de error
estándar) nos hace más difícil establecer algún tipo de conclusión. Baste con observar
las enormes diferencias detectadas en las dos remesas entre ambos muestreos con
valores notablemente más altos para glucosa, triglicéridos y proteínas en el primero de
ellos. En tanto no dispongamos de resultados adicionales, no nos consideramos en
condiciones de definir una glucemia o proteinemia “típicas” de esta especie. No
obstante, conviene recordar que estos parámetros son muy sensibles a la historia
nutricional o de manejo (estrés) en el período inmediatamente anterior a la extracción
de sangre, factores ambos que, como se ha indicado ya alguna vez anterior, no
estamos en condiciones de garantizar que hayan sido homogéneos ni entre lotes de
una remesa ni entre remesas.
88
89
± 10.40
± 35.97
*
170.77 165.40• 163.67
198.22
*
± 12.68
± 12.89
± 7.39
± 43.70
± 123.72
± 107.44
± 127.50
•
1478.89* 1421.68 1376.10•
± 315.41
355.33
n.d.
± 64.53
*
± 6.59
48.67
R1-A
01/07/0
8Alphamar
± 11.45
± 11.90
± 139.01
± 119.35
± 141.42
781.86
± 15.52
± 139.41
± 97.23
± 116.85
± 97.98
1379.52* 1600.10 1520.03• 1601.16
± 80.30
± 2.02
57.71
R1-B
01/07/0
8 Regius
183.99 124.17• 113.14
± 31.76
97.54
R1-B
27/02/0
8Alphamar
850.66 1116.67 444.67
± 30.24
191.08
± 14.48
91.63*
R1-A
21/02/0
8Alphamar
Los valores son media ± EEM (N=6). n.d. no disponible. Indica diferencias significativas (P<0.05) entre R1 y R2 al mismo
periodo. *en la columna de R1 o R2 indican diferencias significativas (P<0.05) entre los dos puntos de muestreo.
Proteínas
± 267.26
± 14.57
± 8.59
55.67
± 7.51
60.80
90.43
R1-B
23/04/0
8 Regius
85.41*
R1-A
23/04/0
8Alphamar
R1-B
05/12/0
7Alphamar
R1-A
05/12/0
7Alphamar
Triglicéridos 910.86 1005.77 512.20
Colesterol
RemesaLote
Glucosa
Pienso
Fecha
abla II.1.3.13. Niveles plasmáticos (mg/100mL) de diversos metabolitos en las corvinas de
los distintos lotes en dos muestreos diferentes (antes y después del inicio de alimentación
diferenciada)
Día de cultivo
166
166
306
306
189
189
320
326
Sergio García Mesa
II.1.3.4. Composición corporal
Los datos de la composición corporal de los peces de piscifactoría resultan de
gran importancia no sólo como fuente de información sobre el estado general de los
mismos y sus respuestas a posibles modificaciones en las condiciones de cultivo
(ambientales, alimentarias, etc.) sino, y fundamentalmente, porque al tratarse de
“productos” destinados al consumo humano, tanto el piscicultor como el consumidor
deben poseer información lo más exhaustiva posible del contenido nutricional de
aquello que pretenden vender o consumir.
Obviamente, esta segunda circunstancia debe centrarse en los especímenes de
tamaño comercial dirigidos al mercado, circunstancia que está lejos de producirse,
temporalmente hablando, en las corvinas usadas en estos ensayos, pero no es menos
cierto que los datos sobre composición desde fases tempranas pueden ayudar a
anticipar cómo será la futura si no se introducen reformas esenciales en el sistema de
cultivo.
En esta primera aproximación al tema nos hemos centrado
en la
determinación del contenido en agua, proteínas, lípidos y minerales tanto del cuerpo
entero del pez, tabla II.1.3.14., como de la principal fracción comestible, el músculo,
tabla II.1.3.15.; (la zona sombreada de cada tabla corresponde al tramo experimental
donde se produjo la alimentación diferenciada, es decir, las corvinas pasaron a
consumir Regius®). Así mismo nos hemos interesado en las posibles variaciones en el
perfil de ácidos grasos del componente lipídico que resulta especialmente sensible al
del pienso que consumen los peces aunque estos datos se exponen y discuten en el
apartado II.2 de esta Memoria.
El cuerpo entero y molido de las corvinas contiene en torno a un 70% de agua,
cifra que desciende ligeramente y con ciertos altibajos a medida que los peces crecen.
También el contenido proteico se muestra muy constante dentro del rango 17-19%,
estando ausente cualquier influencia clara de la remesa, si bien, en los cuatro lotes
considerados hay un ligero decremento (1-2%) dentro de cada lote al avanzar el
cultivo. Algo parecido cabría decir para las cenizas totales, aunque al ser componente
minoritario, estos descensos son menos marcados.
Ahora bien, la acumulación de esos pequeños descensos, parece “dejar hueco”
para el contenido graso que aumenta de forma notable con el tiempo hasta duplicarse
o más, en todos los lotes. Este aumento del contenido de grasa en el cuerpo es más
90
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
pronunciado, en todos los casos, entre el primer y el segundo muestreo, progresando
luego más lentamente o estabilizándose.
Tabla II.1.3.14. Composición corporal de la corvina en los distintos tratamientos
(% sustancia seca)
R1-A
R1-B
R2-A
R2-B
Fecha
muestreo
Día de
cultivo
Agua
Grasa
Proteína
Ceniza
22/06/07
0
72.37•b ± 0.08
3.17•a ± 0.38
19.62• ± 0.56
3.89•a ± 0.29
5/12/07
166
72.04+b ± 0.37
7.56bc ± 0.30
18.24 ± 0.40
3.88b ± 0.15
5/03/08
257
71.95b ± 0.51
7.64b ± 0.44
17.30 ± 0.11
4.01b ± 0.13
23/04/08
306
72.55b ± 0.46
7.04b ± 0.48
16.62 ± 0.10
3.78b ± 0.09
26/05/08
339
69.70a ± 1.25
9.04c ± 0.54
18.24± 0.28
3.70ab ± 0.36
4/07/08
378
72.00b ± 0.91
7.73b ± 0.38
17.47 ± 0.26
3.86b ± 0.08
22/06/07
0
71.54• ± 0.28
3.36•a ± 0.65
19.62• ± 0.56
4.57• ± 0.07
05/12/07
166
71.21+ ± 0.48
7.89b ± 0.52
17.42 ± 0.13
3.75 ± 0.15
11/03/08
263
71.52 ± 0.95
7.42b ± 0.26
18.01 ± 0.07
4.01 ± 0.15
07/05/08
320
72.01 ± 0.79
7.43ab ± 0.57
17.87 ± 0.11
3.82 ± 0.22
10/06/08
354
70.32 ± 0.92
8.20b ± 0.67
18.18 ± 0.31
4.18 ± 0.21
16/08/07
0
72.12•b ± 1.02
3.29•a ± 0.66
18.62• ± 0.51
4.64•a ± 0.04
21/02/08
189
71.86a ± 0.80
7.13+b ± 0.58
18.27 ± 0.32
3.99b ± 0.14
22/04/08
250
72.77+a ± 0.49
7.87b ± 0.52
16.89± 0.36
3.70b ± 0.14
27/05/08
285
71.63a ± 0.76
8.18ab ± 0.63
17.43 ± 0.22
3.68b ± 0.10
10/08/07
0
72.88•b ± 1.86
3.90•a ± 0.38
18.12• ± 0.50
4.49• ± 0.05
27/02/08
201
70.32a ± 0.51
9.85+c ± 0.44
17.14 ± 0.85
3.89 ± 0.26
30/04/08
264
71.41+a ± 0.34
8.52bc ± 0.50
18.07 ± 0.08
3.66 ± 0.08
03/06/08
298
71.34a ± 0.48
7.46bc ± 0.20
17.98 ± 0.16
3.91 ± 0.12
01/07/08
326
70.94a ± 0.41
7.75ab ± 0.40
17.88 ± 0.40
3.73 ± 0.37
Sin sombrear: muestreos con animales consumiendo pienso Alphamar®; sombreados: muestreos con animales
consumiendo pienso Regius®.
+
Los valores son media ± EEM. (N=5) Diferencias significativas entre R1-A y R1-B o R2-A y R2-B para una misma
•
medida (P<0.05) en el mismo período. Diferencias significativas entre R1 y R2 para una misma medida (P<0.05) en
el mismo período. Diferentes letras en una misma columna indican diferencias significativas (P< 0.05) entre
muestreos para un mismo componente.
91
Sergio García Mesa
Parece indudable que la transición inicial de un tipo de pienso con menos grasa
(el de la hatchery) a otros de engorde con un mayor contenido lipídico, sin descartar el
posible tamaño de la ración diaria, son determinantes de este engrasamiento
significativo que experimentan las corvinas durante sus primeros meses de estancia en
la piscifactoría que coincidió, como se ha indicado antes, con cambios en la tasa de
crecimiento, el perfil corporal y los índices IHS e IDS.
En la figura II.1.3.6. se representan los valores de composición corporal de las
corvinas justo antes de la separación de las 2 dietas y al final del periodo experimental,
cuando los animales se habían alimentado durante bastante tiempo con cada pienso.
Mientras que del mismo modo, en la figura II.1.3.7. se esquematizan los valores de
composición corporal del músculo de las corvinas.
R 1 (Día 166cultivo)
R1-A (Día 339cultivo)
13.90
13.77
Cenizas
27.05
Proteina
65.25
Proteina
62.40
Cenizas
27.63
Proteina
Grasa
12.83
Cenizas
28.85
Proteina
61.44
Grasa
R2-B (Día 326 cultivo)
12.97
Cenizas
Proteina
61.25
Grasa
R2-A (Día 285 cultivo)
14.17
64.92
14.10
Cenizas
27.61
Grasa
R 2 (Día 189 cultivo)
25.32
R1-B (Día 320 cultivo)
Grasa
Cenizas
26.67
Proteina
61.56
Grasa
Figura II.1.3.6. Evolución la composición química (% sustancia seca) del cuerpo entero en corvinas.
Si en vez de considerar el pez en su conjunto, nos centramos en el músculo,
observamos que éste presenta un mayor contenido hídrico con una variación inversa
en el contenido de grasa. Mientras el primero supera ahora claramente el 75%, el de
grasa no llega al 2% como norma. También, como era de esperar al no incluir
esqueleto, el contenido de minerales es sensiblemente menor y el de proteínas algo
mayor que en el pez entero.
Así pues, la parte que va a ser comestible del pez, muestra un aporte proteico
en línea o ligeramente por encima del de otros peces de piscifactoría pero un
contenido lipídico bastante menor, lo que justifica su consideración de pez magro; de
hecho se usa como nombre común para esta especie el de “maigre” en francés o el de
“meagre” en inglés. Es cierto que, como ocurría con el cuerpo entero, se produce un
92
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
cierto engrasamiento con el paso del tiempo, pero éste es, tanto en términos
absolutos como relativos, considerablemente menor y de hecho, en algún lote (R2-B),
inapreciable. Si contrastamos con otros peces de piscifactoría, las diferencias son
claras con respecto a dorada (entre 4 y 11% de grasa en músculo, según edad)
(Grigorakis, 2007); lubina (en torno al 5%, Grigorakis, 2007) o peces dulceacuícolas
como la trucha y el esturión (Furné, 2008).
Tabla II.1.3.15. Composición muscular de la corvina en los distintos tratamientos
(% sustancia seca)
R1-A
R1-B
R2-A
R2-B
Fecha
muestreo
Día de
cultivo
Agua
Grasa
Proteína
Cenizas
05/12/07
166
78.36b ± 0.25
1.18a ± 0.14
19.51 ± 0.32
1.43• ± 0.02
05/03/08
257
77.91b ± 0.23
1.53•bc ± 0.16
20.69 ± 65
1.42 ± 0.04
23/04/08
306
77.88b ± 0.15
1.47b ± 0.14
19.21 ± 0.87
1.32 ± 0.04
26/05/08
339
76.80+a ± 0.20
2.04c ± 0.22
21.04 ± 0.68
1.45 ± 0.02
04/07/08
378
76.97a ± 0.10
1.86bc ± 0.10
20.48 ± 0.16
1.40 ± 0.01
5/12/07
166
78.33b ± 0.50
1.41 ± 0.38
19.38 ± 0.89
1.29•a ± 0.03
11/03/08
263
77.93b ± 0.30
1.34• ± 0.10
19.77 ± 0.50
1.39b ± 0.01
07/05/08
320
76.76b ± 0.31
1.86 ± 0.23
19.48 ± 1.24
1.35ab ± 0.04
10/06/08
354
76.27+a ± 1.15
1.73 ± 0.20
21.38 ± 0.29
1.38ab ± 0.02
21/02/08
189
78.61+b ± 0.38
1.41a ± 0.08
18.75 ± 0.51
1.42• ± 0.05
22/04/08
250
77.46+a ± 0.88
1.78•ab ± 0.22
19.78 ± 0.19
1.34 ± 0.04
27/05/08
285
77.34b ± 0.35
2.03b ± 0.67
19.76 ± 0.14
1.33 ± 0.04
27/02/08
201
77.19+ ± 0.35
1.90 ± 0.30
20.06 ± 0.77
1.36•ab ± 0.03
30/04/08
264
77.51+ ± 0.26
1.93• ± 0.14
19.34 ± 0.21
1.34a ± 0.02
03/06/08
298
76.41 ± 0.69
1.94 ± 0.29
20.68 ± 0.25
1.38ab ± 0.03
01/07/08
326
76.76 ± 0.17
1.70 ± 0.34
20.90 ± 0.25
1.42b ± 0.02
Sin sombrear: muestreos con animales consumiendo pienso Alphamar®; sombreados: muestreos con animales
consumiendo pienso Regius®.
+
Los valores son media ± EEM. (N=15) Diferencias significativas entre R1-A y R1-B o R2-A y R2-B para una misma
•
medida (P<0.05) en el mismo período. Diferencias significativas entre R1 y R2-para una misma medida (P<0.05) en
el mismo período. Diferentes letras en una misma columna indican diferencias significativas (P< 0.05) entre
muestreos para un mismo componente.
93
Sergio García Mesa
De esta circunstancia surge una conclusión obvia, el engrasamiento del pez en
su conjunto debe tener su base en la contribución de otros compartimentos
corporales, presumiblemente la masa visceral y, más concretamente, la peridigestiva
y/o el hígado. Otra, menos aparente, pero con posible significado comercial sería
determinar si esa tendencia, ligera pero evidente en la mayoría de los casos, se va a
mantener con el paso del tiempo y/o con el uso de dietas hiperlipídicas (práctica
habitual en ciertas explotaciones actuales de peces marinos); estando por demostrar
en este caso si el potencial genético de la especie sería capaz de vencer el desafío que
podría suponer una ingesta hipercalórica, dirigida a un crecimiento más rápido y, por
tanto, seguir mereciendo el apelativo de “maigre” . Un estudio comparado con otras
especies de músculo más graso, sobre los procesos metabólicos subyacentes a esta
acumulación, resultaría interesante de abordar en un próximo futuro.
R 1 (Día 166 cultivo)
R1-A (Día 378 cultivo)
Ceniza
Grasa
R 2 (Día 189 cultivo)
87.65
Grasa
R2-A (Día 285 cultivo)
Ceniza
Proteína
Proteína
87.19
Proteína
90.10
Grasa
R2-B (Día 326 cultivo)
7.32 6.11
Ceniza
Grasa
Ceniza
Proteína
88.92
8.98 5.89
6.60 6.21
5.64
Ceniza
Proteína
90.15
7.28
8.08 6.10
5.45 6.59
R1-B (Día 354 cultivo)
Grasa
Ceniza
Proteína
89.33
Grasa
Figura II.1.3.7. Evolución la composición química (% sustancia seca) del músculo en corvina.
El cambio de pienso (Alphamar® a Regius®) en los totes B de ambas remesas no
muestra ningún efecto claro sobre los datos que estamos considerando, pese a que,
según los fabricantes, los contenidos lipídicos de ambas dietas era sensiblemente
diferentes (25% en sustancia fresca para Alphamar®, 18% para Regius®). Nuestros
análisis (tabla II.1.2.2.) muestran que tal diferencia era, en realidad, bastante menor, lo
que ayudaría a explicar la ausencia de diferencias significativas en la composición
corporal de los lotes correspondientes. Lógicamente, está por ver si a más largo plazo,
aparecerían o no diferencias debidas a la composición de las dietas que, como hemos
94
Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina
(Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes.
visto con anterioridad, tampoco parecen haber afectado de forma importante a las
velocidades de crecimiento de los animales correspondientes.
En el apartado II.2. de esta Memoria se exponen y discuten con detalle los
datos iniciales y su evolución del perfil de ácidos grasos del músculo.
II.1.5. RESUMEN
En este experimento se han obtenido, y hacen públicos por primera vez,
numerosos datos referidos a la fisiología y el crecimiento de esta especie durante las
primeras etapas de su ciclo de cultivo intensivo en jaulas que serán útiles como
referencia para futuros estudios con esta especie.
Los índices de crecimiento encontrados no son tan buenos como los reportados
por otros autores en condiciones de cultivo, sin embargo, un estudio de los datos
publicados referentes a experimentos controlados en laboratorio ya no muestran
tantas diferencias. En nuestra opinión, esta discrepancia puede deberse, al menos en
parte, a una diferente calidad de las remesas iniciales con las que se ha iniciado cada
cultivo o a algunas prácticas concretas del mismo, sin descartar que una cosa es el
potencial máximo de crecimiento descrito en algunos casos y otra, a veces muy
diferente, el valor de crecimiento promedio de un lote amplio. En este sentido la
variedad interindividual detectada en las unidades de cultivo ha sido extremadamente
amplia lo que, al no ir acompañado de maniobras de selección y homogenización por
tamaños, puede repercutir negativamente en la marcha general.
Durante el periodo controlado la morfología del pez no ha cambiado de forma
sustancial aunque el uso de dietas comerciales, muy probablemente más ricas en grasa
y con una mayor proporción de aceites vegetales que las suministradas en las
hatcheries, ha modificado algo el contenido de grasa corporal y el perfil de ácidos
grasos (como se expone con más detalle en el apartado II.2.) pese a ello, la corvina se
muestra como una especie particularmente magra y con una buena calidad de su
grasa, al menos, durante la fase controlada en este ensayo.
95
II.2. Evolución del contenido de grasa
y ácidos grasos en el músculo de
corvina (Argyrosomus regius, Asso
1801) durante la fase inicial de cría en
piscifactoría alimentada con dietas
comerciales.
II.2.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS.
La piscicultura pretende reducir la dependencia que el abastecimiento de
pescado para el consumo humano tiene con respecto las pesquerías tradicionales. Para
ello, el producto generado no sólo debe utilizar de una tecnología de reducido impacto
ambiental sino también resultar económico y palatable al consumidor humano y,
finalmente, pero no lo menos importante, debe tener un alto valor nutricional. En este
último aspecto, uno de los determinantes más comúnmente considerados es el
contenido graso del pescado tanto en cantidad como, y especialmente, en calidad.
En efecto, el perfil de ácidos grasos del componente lipídico de la parte
comestible del pescado de origen marino es comúnmente considerado un buen índice
de la calidad del mismo, especialmente en lo que concierne a su contenido de ácidos
grasos insaturados, tanto de la serie n3 como de la n6. Los efectos beneficiosos de tales
ácidos grasos en la dieta humana han sido repetidamente corroborados: forman parte
de las rutas metabólicas que conducen a la síntesis de prostaglandinas y leucotrienos
que juegan un papel en la prevención de ciertas enfermedades y tienen propiedades
antitrombóticas y antiinflamatorias, lo que justifica una menor prevalencia de
enfermedades cardiovasculares en las poblaciones que consumen grandes cantidades
de pescado. Así mismo varios estudios sugieren un efecto positivo de los n3 en la
aparición de artritis reumatoide, así como cáncer y metástasis (Stansby et al., 2000).
La información disponible nos indica que variables ambientales/estacionales
tales como la temperatura o la salinidad pueden repercutir notablemente en el citado
perfil de ácidos grasos pero la dieta habitual de los peces, en concreto su composición
en ácidos grasos, es considerado como el determinante esencial, tanto si el pez se
alimenta en su medio natural como si lo hace en piscifactoría (Leger et al., 1977;
97
Sergio García Mesa
Henderson y Tocher, 1987; Ackman, 1995; Saito et al., 1999; Lie, 2001; Alasalvar et al.,
2002; Shirai et al., 2002; Yildiz, 2008).
En efecto, a diferencia de lo que ocurre con las proteínas, para las que el
patrimonio genético es determinante, de forma que el animal fabrica sus propias
proteínas a partir de los elementos unitarios (aminoácidos) que le proporciona la dieta o
que el propio pez sea capaz de fabricar; para las grasas, tanto las de reserva como, en
menor medida, las estructurales, el peso del componente genético es más reducido de
forma que el pez, en cierto sentido “almacena lo que come”.
Pero también es cierto que, en mayor o menor medida, los peces, como los
demás animales, pueden convertir los ácidos grasos de la dieta en otras formas
moleculares, aunque esta capacidad de conversión, normalmente por insaturación y
elongación, tiene ciertos límites (déficits de equipamiento enzimático no hacen posibles
determinadas conversiones) por lo que algunos ácidos grasos tiene carácter de
esenciales o indispensables (deben ser suministrados con la dieta) pues, aunque el pez
los necesita y utiliza, no puede fabricarlos en la cantidad apropiada (Rodríguez et al.,
2009).
La investigación sobre la nutrición lipídica de los peces de piscifactoría ha
buscado y continúa buscando respuesta a cuestiones como cuál es el nivel adecuado de
grasa en el pienso de cada especie y edad, cuáles son los ácidos grasos que tienen
carácter de esenciales y en qué cantidad los demanda el pez, qué fuentes o materias
primas pueden ser utilizadas para cubrir esas necesidades cuantitativas y cualitativas de
grasa y, más recientemente, cómo se puede controlar la composición de las grasas
corporales del pez, actuando sobre las del pienso, con objeto de generar un producto
que posea a la vez un alto estándar organoléptico y nutricional (Rodríguez et al., 2009).
Así pues, conocer la cantidad de grasa de la parte comestible del pez, su
composición en ácidos grasos, su posible evolución a lo largo del ciclo de producción en
piscifactoría, las posibles repercusiones sobre la misma de la edad, el ambiente y, sobre
todo, la alimentación, son objeto de atención preferente por parte de los investigadores.
En esta línea se incluye esta parte del trabajo de seguimiento de una producción
intensiva de corvinas que pretende ayudara a caracterizar y valorar este aspecto de la
calidad nutricional del producto.
98
Evolución del contenido de grasa y ácidos grasos en el músculo de corvina (Argyrosomus regius, Asso
1801) durante la fase inicial de cría en piscifactoría con dietas comerciales.
II.2.2. MATERIALES Y MÉTODOS.
II.2.2.1. Animales, condiciones experimentales y muestreos.
Este ensayo se llevó a cabo utilizando peces de los lotes R-1A y R1-B del
experimento anterior, esto es, juveniles de corvina (Argyrosomus regius) de un peso
medio inicial de 4.1 ± 0.1 g (80 días de edad) criadas en una piscifactoría basada en
jaulas (Ceutamar S.L., Bahía de Algeciras, Cádiz).
Para los fines específicos de este ensayo se usaron peces procedentes de los
muestreos 1 a 8 del lote R-1A de aquel ensayo, pero con el fin de obtener una
información más exhaustiva del posible efecto de las variables consideradas (ambiente y
dieta) el periodo experimental se prolongó, en este caso, hasta los 503 días momento
en que se efectuó el muestreo 9-A de este ensayo. Estas corvinas estuvieron
consumiendo el pienso Alphamar® durante todo el periodo controlado. Para contrastar
el posible efecto de la composición de la dieta, se incorporaron al estudio corvinas del
lote R1-B correspondientes al muestreo 7 de aquel primer ensayo (esto es, cuando hacía
unos 4 meses que habían pasado de la dieta Alphamar® a la Regius®, ver apartado II.1.).
A este muestreo, por homogenizar, lo designamos ahora como 8-R. Finalmente, se
añadió una nueva toma de muestras (muestreo 9-R de este ensayo) unos 6 meses
después coincidiendo con la del muestreo 9-A del lote R1-A. Así pues, los muestreos 9-A
y 9-R fueron específicos para este ensayo y no figuran en el experimento II.1 (ver tabla
II.2.2.1.).
Tabla II.2.2.1. Calendario de muestreos
Lote R1-A
Muestreo
(días de cultivo)
Pienso
1-A (0)
2-A (32)
3-A(61)
4-A (118)
5-A (166)
6-A (257)
7-A (306)
8-A (339)
9-A (504)
Lote R1-B
Muestreo
(días de cultivo)
Pienso
(días consumo
previo)
8-R (320)
9-R (504)
Regius® (120)
Regius® (315)
Alphamar®
En cualquier caso, durante todo el periodo controlado los animales se sometieron
a las condiciones de producción operantes en la citada factoría y descritas con más
detalle en la sección correspondiente del apartado II.1. Como principales variables
ambientales recordamos que la salinidad de la zona se mantiene prácticamente
99
Sergio García Mesa
constante (en torno a 37 ‰), el oxígeno disuelto nunca fue menor de 5.5 ppm y, gracias
a un control diario, pudimos registrar una temperatura media de 17.9 ± 0.1 °C (rango
14.6-22.5 °C) (figura II.1.2.1.).
Aunque también figuran en el mencionado apartado, reproducimos aquí, por
cuestiones de proximidad, los datos de composición, más relevantes para este
experimento, de los dos piensos utilizados (tabla II.2.2.2.)
Como se indica en la tabla II.2.2.1., los muestreos se llevaron a cabo con
intervalos de 1-2 meses, excepto los últimos de cada lote que se retrasaron unos 5
meses y medio. Cada muestra se basaba en corvinas obtenidas según lo explicado en el
apartado anterior (II.1) sobre las que se efectuaron las medidas expresadas allí. Una
submuestra (N=15) tomada al azar de esas muestras amplias se utilizó para el análisis de
composición corporal y, finalmente, una nueva submuestra de la anterior (N = 5) se
utilizó para determinar la composición del filete incluyendo el perfil de ácidos grasos.
II.2.2.2. Análisis de los peces
Como se ha indicado, los peces utilizados para el análisis del perfil de ácidos
grasos del músculo formaban parte del lote utilizado en el ensayo anterior para
determinación de índices tales como el hepatosomático, el digestosomático y de
rendimiento del filete. Nos remitimos a los apartados IX.1.1. y IX.1.2. para más detalles
del procedimiento. En concreto y en lo que respecta a la obtención del filete, ambos
filetes fueron cuidadosamente diseccionados, se les separó la piel antes de pesarlos y,
finalmente, fueron molidos y liofilizados para la determinación de contenido graso total
y perfil de ácidos grasos.
Los ácidos grasos se extrajeron y transesterificaron a partir de muestras, de dieta
o músculo, según se describe en Rodríguez-Ruiz et al. (1998) y, con más detalle, en el
apartado IX.2.2. de esta Memoria. Para la separación e identificación de los ácidos grasos
de la mezcla se usó cromatografía gas-líquido según procedimientos y equipo descritos
en el citado apartado IX.2.2.
100
Evolución del contenido de grasa y ácidos grasos en el músculo de corvina (Argyrosomus regius, Asso
1801) durante la fase inicial de cría en piscifactoría con dietas comerciales.
Tabla II.2.2.2. Algunos datos de composición de las dietas usadas en este ensayo
Composición
Alphamar®
Regius®
Proteína (% s/sustancia seca)
43.25
46.29
Grasa (% s/sustancia seca)
25.72
22.23
Energía (MJ/Kg)
22.32
21.46
Relación proteína/energía (g/ MJ)
17.94
19.98
14:0
2.5
3.0
16:0
17.4
17.7
18:0
4.7
4.7
16:1n7
3.2
3.8
18:1n9
22.2
21.0
18:1n7
2.3
2.5
20:1n9
2.5
2.6
22:1n11
2.4
2.3
18:2n6
26.2
25.1
18:3n3
3.4
3.1
18:4n3
0.7
0.8
20:4n6
0.5
0.7
20:4n3
0.1
0.0
20:5n3
3.8
4.3
22:5n3
1.0
1.0
22:6n3
6.8
7.5
Total saturados
24.5
25.4
Total monoinsaturados
32.6
32.2
Total poliinsaturados n3
15.9
16.7
Total poliinsaturados n6
26.7
25.8
Relación n3/n6
0.59
0.65
Perfil de ácidos grasos (% sobre lípidos totales)
Saturados
Monoinsaturados
Poliinsaturados
A partir de los datos de composición en ácidos grasos se calcularon el índice de
aterogenicidad (IA) y el índice de trombogenicidad (IT) según Ulbricht y Southgate (1991)
tal como se describe en IX.2.2. El IA indica la relación entre la suma de los ácidos
saturados más representados y la correspondiente de los insaturados, siendo los
primeros considerados como pro-aterogénicos y los segundos como anti-aterogénicos. El
101
Sergio García Mesa
IT muestra la tendencia a formar coágulos en los vasos sanguíneos y se define como la
relación entre los considerados protrombogénicos (los saturados) y los
antitrombogénicos (MUFA, PUFAn6, PUFAn3). El valor de la llamada calidad de los lípidos
del pescado (FLQ) indica la relación porcentual en que los principales ácidos HUFAn3
(EPA y DHA) aparecen en el músculo con respecto al total de ácidos grasos: cuanto
mayor sea este índice mejor se considera la calidad de esos lípidos en la dieta para
humanos (Abrami et al., 1992).
II.2.2.3. Tratamiento estadístico
Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía seguido de comparación de
medias por el test de Duncan (Duncan, 1955). Se consideró un nivel de significación del
95% como indicativo de diferencias significativas. En los resultados expresados como
porcentajes (el caso de los ácidos grasos), estos fueron normalizados previamente
usando la transformación arcoseno de acuerdo con Sokal y Rohlf (1981). Todo el
tratamiento estadístico se llevó a cabo usando el paquete de software SPSS v15.0 para
Windows®.
II.2.3. RESULTADOS.
II.2.3.1. Crecimiento e índices morfométricos.
La tabla II.2.3.1. muestra un resumen recordatorio de algunos parámetros
biométricos medidos a lo largo del experimento y que provienen fundamentalmente de
los lotes R1-A y R1-B del apartado II.1. Los peces, que iniciaron el experimento con un
peso próximo a 4 g, alcanzaron al final del periodo controlado los 211.4 g en el grupo A
(Alphamar®, remesa R1-A) pero sólo 184.1 g en el grupo R (Regius®, remesa R1-B), en
tanto que su longitud aumentaba de 7.5 a 27.4 cm y 26.5 cm, respectivamente. La tabla
II.2.3.2., que muestra la tasa de crecimiento (SGR) de los periodos entre muestreos
expone un leve efecto negativo de la dieta Regius® (lote R) sobre este parámetro en el
periodo común (8-9) con unos valores de 0.26 frente a 0.30.
102
103
39.9abc±2.10
39.7ab±0.73
3.43 ± 0.28
c
5.72 ± 0.34
e
1.14 ±0.01
39.8abc±0.52
3.38 ±0.20
c
5.03 ± 0.20
de
1.18 ±0.01
d
18.85a±0.57
11.60c±0.11
3
A
±0.16
44.1abcd±0.48
2.6 ± 0.22
bc
4.38
bcd
1.07 ±0.01
bc
62.25b±2.00
17.86d±0.19
4
A
±0.21
42.6abcd±1.69
c
3.26 ±0.29
4.81
cde
1.09 ±0.01
c
84.56c±2.43
19.63e±0.17
5
A
±0.15
44.4bcd±1.03
ab
2.13 ± 0.17
4.14
bcd
1.03 ±0.01
b
89.79c±3.44
20.27e±0.23
6
A
45.6cd±0.035
2.24 ±0.14
ab
4.93 ±0.24
de
1.04 ±0.01
d
107.50d±4.43
21.42f±0.24
7
A
47.6d±0.73
2.80 ±0.17
bc
3.13 *±0.15
a
1.05 ±0.01
b
128.20d±6.49
22.73f±0.36
8
A
46.76±0.29
2.71±0.14
4.44±0.22
1.05±0.01
114.32±6.64
21.74±0.35
8
R
38.6a±2.26
1.98 ±0.19
ab
3.69 ±0.20
ab
0.97 ±0.01
a
211.38e*±9.22
27.42g±0.40
9
A
35.5±2.0
2.86±1.86
4.36±0.93
1.05±0.05
184.01±18.28
26.52±0.61
9
R
3.26
Lote R1-A Alphamar®
1.55
2-3
2.10
3-4
0.64
4-5
*basado en peso medio de cada muestreo e intervalo temporal entre ellos
Lote R1-B Regius ®
1-2
Intervalo
0.07
5-6
0.37
6-7
0.53
7-8
Tabla II.2.3.2. Tasa de crecimiento (medido como SGR*) durante los diferentes periodos intermuestreales
0.29
0.30
8-9
Los datos son media ± EEM. Tamaño de las muestras: N ≈ 100 (muestreos # 1-7) and N ≈ 50 (muestreos # 8-9) para peso, longitud total y K. N = 15 en muestreos para biometría
exhaustiva para IDS, IHS y RF (para más información ver experimento 2.1.).
*A: lote R1-A alimentado con Alphamar®, B: lote R1-B alimentado con Regius® para esos muestreos
1
2
3
4
Índice de condición. Índice digestosomático. Índice hepatosomático. Rendimiento del filete.
a, b, c...
Valores con diferentes superíndices indican la existencia de diferencias significativas (p<0.05) atribuibles al periodo de muestreo. * indican diferencias atribuibles a las
diferentes dietas (p<0.05)
RF
4
IHS
1.47 ± 0.26
a
3
3.94 ± 0.16
bc
0.98 ±0.01
12.04a±0.43
4.10a±0.07
d
10.15b±0.10
7.46a±0.05
a
2
A
1
A
2
IDS
K
1
Muestreo #
Lote/Dieta*
Longitud
total (cm)
Peso total (g)
Tabla II.2.3.1. Influencia del periodo de muestreo y del tipo de pienso en algunos parámetros biométricos de la corvina.
Sergio García Mesa
El Índice de Condición (K), que relaciona peso y longitud, permaneció
prácticamente constante y muy próximo a la unidad, sin que el tipo de dieta lo
influyera de forma significativa. Ahora bien, durante los dos primeros meses, la
ganancia de peso fue algo mayor, proporcionalmente, que la de longitud con lo que
este índice aumentó ligeramente pero esta tendencia no se mantuvo en los periodos
posteriores.
Los índices digestosomático (IDS) y hepatosomático (IHS) (tabla II.2.3.1.) que
exhibían valores próximos a 4 y 1.5%, respectivamente, en los peces más jóvenes,
aumentaron de forma significativa durante los primeros meses de estancia en la
piscifactoría. Posteriormente, el primero de ellos tendía a recuperar los valores iniciales
de forma que, al final, no era significativamente diferente del inicial; en cambio esta
recuperación no fue completa en el IHS por lo que los valores finales se mantenían por
encima de los iniciales. Para estos índices, el tipo de dieta sólo tuvo un efecto
moderado en el caso del IDS y el muestreo 8 (339 días en 8-A, 320 días en 8-R), quizá
por el valor mínimo que alcanzó dicho índice en el lote A. El rendimiento del filete (RF)
no cambió significativamente durante el periodo inicial pero aumentó entre los
muestreos 2 y 3 (2-4 meses del cultivo) en el lote A y permaneció en esos valores hasta
el final, cuando se detectó una caída que afectó por igual a ambos lotes.
En lo que respecta al contenido lipídico de la principal porción comestible del
pez, su músculo, la tabla II.2.3.3. muestra que, en el conjunto del periodo controlado,
se produjo un aumento sostenido de dicho parámetro, al menos durante el primer año
de estancia en las jaulas (muestreos 1 a 8-A), posteriormente la proporción de lípidos
en músculo cayó ligeramente, en cualquier caso de forma no significativa.
Los perfiles de ácidos grasos de esos lípidos musculares se muestran en las
tablas II.2.3.3. y II.2.3.4. En los muestreos iniciales del lote A los ácidos grasos más
abundantes eran el palmítico (PA, 16:0) entre los saturados (SFA), el oleico (OA, 18:1n9)
entre los monoinsaturados (MUFA) y el docosahexaenoico (DHA, 22:6n3) entre los
poliinsaturados (PUFA). Esta situación se mantuvo durante todo el ensayo. Por grupos,
los SFA y MUFA estaban en una proporción similar y próxima al 30% mientras que los
más abundantes, los PUFA, alcanzaban en torno a un 39%. Sin consideramos las series,
había un claro predominio de los n3 con valores casi cuatro veces superiores a los n6.
104
105
ab
1.20 ±0.00
b
a
1.03 ±0.01
c
1.39 ±0.13
1.38cd±0.02
c
d
c
bcd
18:3n3
18:4n3
20:4n6
20:4n3
20:5n3
22:5n3
22:6n3
9.50 ±0.50
ab
1.73 ±0.03
b
6.03 ±0.08
c
0.53 ±0.03
b
0.93bc±0.03
1.00 ±0.00
bcd
1.28 ±0.09
b
5.13 ±0.33
cd
0.50 ±0.21
a
1.12cd±0.13
0.61 ±0.14
a
1.18 ±0.11
abc
11.85b±0.50
2.52 ±0.13
d
3.21 ±0.06
bc
3.49± 0.25
20.46 ±0.86
ab
4.82b±0.43
6.49bc±0.39
21.63 ±0.54
cd
2.94bc±0.40
65.31ab±2.37
3
A
0.91a±0.04
a
0.59 ±0.40
a
1.79±1.09
n.d.
0.33a±0.22
±0.3
8
n.d.
1.51
abcd
14.92c±1.41
3.49 ±0.25
e
2.84 ±0.26
ab
n.d.
29.09 ±2.43
d
5.92b±0.50
5.89ab±0.36
23.48 ±1.79
d
n.d
±0.12
bc
1.58 ±0.02
b
4.15 ±0.48
ab
n.d.
0.78ab±0.05
1.47
abcd
16.77c±1.09
1.65 ±0.27
b
2.71 ±0.23
ab
n.d.
24.73 ±1.40
bcd
3.98a±0.10
7.55c±0.50
20.45 ±1.27
bcd
2.22ab±0.11
69.31b±6.59
67.60b
±6.06
3.76c±0.37
5
A
1.18ab ±0.14
4
A
1.38b±0.10
d
1.78 ±0.14
b
4.12 ±0.22
ab
n.d.
1.41ab±0.11
1.62 ±0.0
5
n.d.
cde
19.24c±0.63
1.48 ±0.03
b
2.33 ±0.01
a
21.00 ±0.
98
n.d.
abc
3.08a±0.22
6.62bc±0.22
16.46 ±0.48
a
1.81a±0.10
66.32b±3.39
6
A
1.53c±0.16
±1.1
cd
1.54 ±0.09
b
3.90 ±0.20
ab
n.d.
1.17ab±0.03
n.d.
1.95 ±0.07
d
19.26c±0.83
1.68 ±0.15
b
2.35 ±0.16
a
0
n.d.
23.22
abcd
3.74a±0.13
5.76abc ±0.33
18.16 ±0.37
abc
2.10a±0.05
64.66ab±2.37
7
A
1.47c±0.14
cd
1.64 ±0.04
b
4.18 ±0.14
ab
n.d.
1.37ab±0.11
0.68 ±0.09
a
1.83 ±0.11
cd
17.02c±0.35
1.74 ±0.15
bc
2.76 ±0.80
abc
21.84 ±0.6
1
n.d.
abc
3.92a±0.30
6.16abc±0.44
17.13 ±0.19
a
2.16ab±
66.81b±4.49
8
A
2.04d ±0.21
1.43*±0.05
4.38±0.12
n.d.
1.26±0.09
0.14*±0.14
22.42*±0.3
8
2.17*±0.08
1.18*±0.14
1.99*±0.03
n.d.
20.57±0.54
3.11*±0.08
5.94±0.18
16.90±0.31
1.86±0.15
66.22 ±4.23
8
R
1.73±0.18
bcd
1.46 ±0.02
b
3.59 ±0.08
ab
n.d.
1.52ab±0.07
18.38c±
0.30
1.54abcd±0.0
6
n.d.
1.60 ±0.04
b
2.37 ±0.08
a
26.21 ±0.4
2
n.d.
cd
3.27a± 0.13
4.50a±0.13
17.72a±0.26
1.70a±0.13
67.43b±4.64
9
A
1.86d±0.10
1.53±0.05
3.48±0.08
n.d.
1.82*± 0.09
n.d.
1.44±0.06
19.56±0.66
1.61 ± 0.06
2.01*±0.09
n.d.
24.58±0.81
3.04±0.19
5.96*±0.445
17.34±0.34
1.48±0.10
66,60±7.59
9
R
1.73±0.20
13.00 ±0.9
8.54 ±2.20
10.92 ±0.98 17.13 ±1.28 14.04 ±1.14
14.58 ±0.6
14.58±1.55
14.05 ±0.6
14.91±069
9
5
5
®
®
Los datos son medias ± EEM, N=5. •A: lote R1-A alimentado con Alphamar , B: lote R1-B alimentado con Regius para esos muestreo n.d. = no detectado
a, b, c...
Valores con diferentes superíndices indican la existencia de diferencias significativas (p<0.05) atribuibles al periodo de muestreo. * indican diferencias atribuibles a las diferentes dietas
(p<0.05)
13.74 ±0.48
2.94 ±0.12
10.90 ±0.23
0.81 ±0.03
8.13a±0.13
6.74a±0.13
Poliinsaturados
18:2n6
2.08 ±0.10
0.71 ±0.06
cd
3.40 ±0.20
a
2.56 ±0.10
22:1n11
c
ab
3.52±0.09
18:1n7
23.40 ±0.
01
n.d.
abcd
20:1n9
18.53 ±1.23
18:1n9
7.31c±0.21
Monoinsaturados
16:1n7
a
5.68ab±0.13
5.67abc±0.11
18:0
7.65c±0.05
22.73 ±0.23
d
abcd
±0.37
5.05d±0.10
3.74c±0.17
60.70a±5.52
66.23b±7.36
19.40
1
2
A
0.90a±0.04
1
A
0.79a±0.05
16:0
Saturados
14:0
Muestreo #
Lote/Dieta*
Lípidos totales
AGs (% de
lípidos totales
Tabla II.2.3.1. Influencia del periodo de muestreo y del tipo de pienso en algunos parámetros biométricos de la corvina.
∑PUFA n6
∑PUFA n3
∑PUFA
∑MUFA
∑SFA
Lote/Dieta•
Muestreo #
3.80f±0.19
8.11a±0.30
30.80f±1.01
38.91±1.04
32.63de±1.87
29.22b±0.93
A
1
0.65 f±0.09
2.21e±0.07
9.05a±0.18
19.98c±0.47
29.03±0.51
36.53e±0.32
33.45d±0.77
A
2
0.35 b±0.02
0.49 d±0.13
1.68d±0.15
12.97b±1.11
21.70cd±1.09
34.67±1.72
34.50cd±2.62
31.06c±1.85
A
3
0.50 d±0.05
0.56 e±0.47
0.81a± 0.11
15.56c±1.69
12.43a±1.42
27.99±2.51
41.34f±3.76
33.13d±2.75
A
4
15.07b±1.23
0.37bc±0.06
0.43c±0.43
1.05b±0.21
17.55d±2.46
18.12b±2.93
35.67±4.00
33.07cd±3.07
30.22bc±3.64
A
5
21.25d±1.00
0.25a±0.02
0.32a±0.18
1.20c±0.21
20.65e±1.17
24.65e±3.17
45.30±2.41
27.89a±2.39
24.89a±0.85
A
6
17.94c±0.98
0.29a±0.02
0.36ab±0.20
1.06b±0.16
20.43e±1.79
21.43cd±2.54
41.86±2.97
30.99b±2.64
26.02a±0.97
A
7
18.76c±0.85
0.27a±0.01
0.36ab±0.08
1.25c±0.10
18.39d±0.56
22.91de±1.41
41.30±1.58
30.29ab±2.17
25.45a± 0.98
A
8
18.96±0.78
0.26±0.17
0.33±0.82
0.95±0.32
23.68*±0.07
22.56±1.30
46.24±1.17
26.85±1.22
24.70±0.16
B
8
17.64c±0.95
0.27a±0.20
0.33a±0.15
1.04b±0.10
19.90e± 0.69
20.64 ±1.88
40.54bc±2.12
33.45de± 1.80
23.92a±1.54
B
9
18.39±0.10
0.27 ±0.20
0.31±0.09
1.00±0.12
21.38*±1.23
21.36±1.56
42.74*±1.17
31.24±2.16
24.78±1.50
B
9
Tabla II.2.3.4. Perfil de ácidos grasos de los lípidos de músculo en diversos momentos del ciclo de producción de la corvina (continuación). Los ácidos
grasos se expresan como % del total.
Relación n3/n6
0.48 d±0.07
0.39 c±0.01
10.33a±0.85
3
c
IA
0.25 a±0.01
18.13c±0.96
3
1
2
15.53 b±1.02
IT
24.64 e±1.12
CLP
2
Los datos son medias ± EEM (N=5). •A: lote R1-A alimentado con Alphamar®, B: lote R1-B alimentado con Regius® para esos muestreos
1
Indice de aterogenicidad. Indice de trombogenicidad. Calidad de lípidos de pescado.
a, b, c...
Valores con diferentes superíndices indican la existencia de diferencias significativas (p<0.05) atribuibles al periodo de muestreo. * indican diferencias atribuibles a las diferentes dietas
(p<0.05)
106
Evolución del contenido de grasa y ácidos grasos en el músculo de corvina (Argyrosomus regius, Asso
1801) durante la fase inicial de cría en piscifactoría con dietas comerciales.
Pues bien, a lo largo del ensayo se produjeron cambios significativos en ese perfil
base (tablas II.2.3.3. y II.2.3.4.), aunque muchos de ellos pueden ser considerados como
menores e irrelevantes desde un punto de vista fisiológico. Sí que deben ser tenidos en
cuenta el aumento significativo de la presencia de ácido linoleico (LA, 18:2n6) entre los
PUFA y de ácido oleico (OA, 18:1n9), aunque en menor extensión, entre los MUFA. Entre
los saturados los cambios detectados fueron escasos y sin una tendencia clara. Dado que
el aumento de OA fue menor que la disminución de otros miembros de este grupo (por
ejemplo, el palmitoleico 16:1n7) el total de MUFAs presentó una ligera oscilación con el
tiempo, en torno al 30%, con un pico en el muestreo 4 que coincide con el del OA.
El contenido total de PUFAs varió sustancialmente en esos primeros muestreos,
llegando a superar la cifra del 45% en el muestreo 6 y exhibiendo una tendencia similar
hasta el final del experimento. Dentro de este grupo el aumento en la serie n6, debido
principalmente al de linoleico, fue acompañado por una disminución de la serie n3 que
afectó principalmente al eicosapentaenoico. Estos cambios simultáneos en n3 y n6
condujeron a una caída en la relación n3/n6 de unos valores iniciales de 3.8 a otros
próximos, incluso inferiores, a 1.0. En términos relativos, la mayor reducción en esta
relación ocurrió entre los muestreos 3 y 4, posteriormente se detectó una cierta
recuperación parcial.
II.2.4. DISCUSIÓN
Los expertos en nutrición humana y salud coinciden en la opinión de que la
inclusión de pescado en la dieta diaria puede implicar un efecto preventivo contra ciertas
enfermedades incluyendo algunas cardiovasculares (Pirini et al., 2010). En este caso los
efectos beneficiosos parecen residir en el componente lipídico del pescado y, más
concretamente, en la presencia de ciertos inhibidores de la agregación plaquetaria
(Nasopoulou et al., 2007) y de determinados ácidos grasos mono y poliinsaturados,
especialmente los de la serie n3.
En nuestro seguimiento detectamos que a medida que se prolongaba la estancia
de los peces en la piscifactoría el contenido lipídico de su músculo aumentó de 0.65 a
1.7-2.0% en sustancia fresca. El total de ácidos grasos significaba entre el 60 y el 70% de
los lípidos, lo que coincide con datos previos de hígado y músculo de peces (Kandemir y
Polat, 2007; Guil-Guerrero et al., 2011). Globalmente, los valores de contenido lipídico
fueron claramente menores que los encontrados en otros peces marinos acuicultivados
como la dorada y la lubina (Grigorakis, 2007) tal y como se ha comentado con
anterioridad.
107
Sergio García Mesa
El engrasamiento inicial de los peces más jóvenes de este seguimiento puede
explicarse como debido a la transición de un pienso del tipo de los usados en hatcheries,
rico en proteína y pobre en grasa, a uno de engorde con mayor contenido lipídico del
tipo de Alphamar®. Tanto, Piccolo et al. (2008) como Chatzifotis et al. (2010) detectaron
una mayor proporción de grasa en el músculo de corvina cuando se le alimentó con
dietas ricas en grasa (hasta 21%) pero el valor más alto encontrado de grasa en músculo
solo llegó al 3.6% (corvinas de 800 g, dieta con 20.7% de grasa). Poli et al. (2003) habían
informado previamente que el contenido de grasa del músculo variaba de 2.06% (peces
muestreados en noviembre) a 2.93% (peces muestreados en julio). En una reciente
publicación con corvinas de unos 100 g de peso inicial a las que les suministraron dietas
con diferentes relaciones proteína/grasa, Martínez-Llorens et al. (2011) encontraron una
mejor correlación del contenido graso corporal con la tasa general de crecimiento que
con el nivel lipídico de la dieta. En todos los casos, los bajos valores de grasa confirman la
capacidad de estos peces para mantener una reducida acumulación de la misma en
músculo, pese a ser alimentados con dietas hiperlipídicas lo que podría reflejar una
disposición metabólica particular cuyo estudio se plantea como un tema de mucho
interés.
Para el consumidor humano no solo es importante el contenido graso de la
porción comestible del pez sino, también, su perfil de ácidos grasos. A su llegada a la
piscifactoría, los peces exhibían un patrón de ácidos grasos en músculo (tablas II.2.3.3. y
II.2.3.4.) cuyas características esenciales eran: (a) ácidos palmítico, oleico y
docosahexaenoico como los más abundantes dentro de los grupos respectivos de
saturados, monoinsaturados y poliinsaturados, respectivamente, (b) cada uno de estos
tres grupos representaba, aproximadamente, un tercio del contenido total y (c) entre los
HUFA había una clara prevalencia de los de la serie n3 con respecto a los de la serie n6
(relación n3/n6 >>1). Esta situación podría ser considerada representativa de las especies
de peces marinos (Lanari et al., 1999; Grigorakis et al., 2002; Orban et al., 2003; Özyurt
y Polta, 2005, 2006; Yildiz et al., 2006)) incluyendo a la corvina (Poli et al., 2003;
Hernández et al., 2007; Piccolo et al., 2008). La alta proporción de HUFAn3 es
comúnmente atribuida al predominio de ésos en la red trófica marina (Sargent et al.,
1995).
Muy a menudo, factores como la salinidad del agua, la temperatura y la
composición de la dieta se consideran como los determinantes principales de posibles
cambios en el perfil de ácidos grasos del cuerpo de un pez. En nuestro caso, la salinidad
ambiental no varió en un nivel apreciable a lo largo del experimento, en tanto que la
temperatura lo hizo sólo ligeramente (ver figura II.2.4.1.).
108
Evolución del contenido de grasa y ácidos grasos en el músculo de corvina (Argyrosomus regius, Asso
1801) durante la fase inicial de cría en piscifactoría con dietas comerciales.
Un aumento en la proporción de HUFA en los lípidos de los peces suele
considerarse parte de la adaptación a temperaturas bajas aunque esta circunstancia
tiene una magnitud variable entre especies y entre tipos de lípidos (más patente en los
polares que en los neutros) (Greene y Selivonchick, 1987; Henderson y Tocher, 1987). En
nuestro caso (tablas II.2.3.2. y II.2.3.3.) cuando se comparan las muestras obtenidas en la
estación cálida (muestreos 2-3) con aquellas de la estación más fría no se encontraron
diferencias consistentes ni el nivel de HUFA totales ni en los de EPA, AA (araquidónico,
20:4n6) y DHA. Datos de otras especies mediterráneas (Özyurt y Polat, 2005, 2006; Yildiz
et al., 2006; Senso et al., 2007) coinciden en que las diferencias estacionales en el perfil
de ácidos grasos de los peces de este entorno geográfico son menores o inexistentes, al
menos en lo que concierne a los ácidos grasos individuales o a los grupos comentados
más arriba. Poli et al. (2003) detectaron algunas diferencia en el perfil de ácidos grasos
en corvinas de cultivo recogidas en noviembre con respecto a las muestreadas en juniojulio (aunque los autores informaban de que la temperatura varió, a lo largo de su
ensayo, entre 17.2 y 28.6 °C no proporcionaban datos concretos de la operante cuando
se tomaron las diferentes muestras). En concreto, los PUFAn3, pero también los
saturados, eran más abundantes en la muestra de noviembre en la que los
monoinsaturados estaban más reducidos. Las temperaturas relativamente altas, incluso
en invierno, en el Mediterráneo y áreas atlánticas adyacentes podrían estar en la base de
la ausencia de unos marcados efectos estacionales. De hecho, como se puede observar
en la figura II.2.4.2. las oscilaciones térmicas estacionales no fueron muy marcadas y se
vieron a veces superadas por la magnitud de ciertos cambios de plazo mucho más corto,
muy posiblemente asociados a temporales de viento muy frecuentes en la zona.
Por otra parte, resulta complicado definir con precisión los posibles efectos de la
temperatura del agua sobre el perfil de ácidos grasos del cuerpo de los peces cuando se
pretende determinar ese efecto a partir de muestreos temporales sucesivos de los
mismos desde su medio natural o de una piscifactoría ya que otras variables biológicas
tales como la edad, el estatus reproductivo, los cambios en la composición de la dieta
(presas naturales o alimento artificial) pueden superponer sus efectos a los
estrictamente ambientales abióticos.
En nuestro ensayo (tablas II.2.3.3. y II.2.3.4.), el cambio más relevante, cuando se
considera la totalidad del periodo experimental, es la marcada reducción en la relación
n3/n6 desde un valor inicial próximo a 4.0 hasta uno muy cercano a 1.0. Esta caída se
debe tanto a una reducción de los niveles de PUFAn3, principalmente, EPA, como a una
elevación de los de LA cuya presencia se multiplica por un factor superior a 3. Otros
cambios marcados afectan al grupo de los MUFA, incluyendo una reducción del
palmitoleico (POA, 16:1n7) y un incremento del oleico. Como una tendencia general, los
109
Sergio García Mesa
cambios indicados fueron especialmente notables en la primera parte del experimento,
siendo apreciable con posterioridad una tendencia a la estabilización.
Una vez más, la transición de una dieta de hatchery basada en aceite de pescado
como principal fuente lipídica y muy rica en HUFAn3 a las dietas comerciales aquí
utilizadas y que incorporaban altos niveles de aceites vegetales, especialmente ricos en
oleico y linoleico fue, con toda probabilidad, la causa principal de los cambios
observados (tabla II.2.3.2. y figura II.2.4.1.). Los dos últimos ácidos grasos eran los más
abundantes en los lípidos de las dietas usadas en este experimento, superando en
mucho su nivel habitual en los aceites de pescado comercializados y representando,
entre ambos, casi un 50% del total de ácidos grasos de los piensos resultando una baja
relación n3/n6. Los datos de Martínez-Llorens et al. (2011) con corvinas de unos 100 g de
peso inicial, muestran ya una reducida relación n3/n6 (inferior a la unidad) en los lípidos
del cuerpo entero, también muy probablemente debida al uso previo de piensos ricos en
aceites vegetales. Llama la atención que entre las 4 dietas que estos autores ensayan, en
las dos que procuran mayor crecimiento, junto con un ligeramente mayor contenido
proteico y algo menor de grasa, ésta aporta cifras sustancialmente más elevadas de
HUFAn3 y una mayor relación n3/n6 (1.2 frente a sólo 0.3, aproximadamente) aunque
los autores no hacen mención a esta circunstancia. En nuestro seguimiento, la dieta
suministrada estaba en un valor de 0.6 intermedio entre los dos citados.
14:00
30
n3/n6 (x20)
25
16:00
20
15
22:6n-3
18:00
10
5
Aceite de
pescado
Alphamar®
0
22:5n-3
16:1n-7
20:5n-3
Regius®
18:1n-9
20:4n-6
18:2n-6
Figura II.2.4.1. Perfil de los principales ácidos grasos de las dietas comerciales, frente al aceite
de pescado
Se ha publicado repetidamente que la sustitución de aceite de pescado por
aceites vegetales en los piensos para peces podría reducir los costes y mejorar la
sostenibilidad ambiental de la piscicultura sin efectos negativos sobre el crecimiento de
110
Evolución del contenido de grasa y ácidos grasos en el músculo de corvina (Argyrosomus regius, Asso
1801) durante la fase inicial de cría en piscifactoría con dietas comerciales.
los animales, siempre y cuando los mencionados piensos cubran las necesidades de
ácidos grasos esenciales de estos animales. No obstante, estas manipulaciones de los
ingredientes de la dieta implican cambios en la composición de los lípidos corporales del
pez o, específicamente, en su músculo que tienden a reflejar la de los lípidos de la dieta.
Estos cambios podrían afectar tanto al sabor del pescado y a su aceptación por los
consumidores, como a las propiedades saludables de esta fuente de grasa para el
consumo humano. De hecho, se están probando diversas estrategias, para un
“remodelado” (taylorization) del perfil de ácidos grasos del pez antes de su puesta en
venta cuando el mismo ha sido alimentado con esos piensos ricos en aceites vegetales;
estas estrategias incluyen el uso de dietas especiales durante unas semanas o meses
antes del sacrifico y traslado al mercado (Izquierdo et al., 2005; Grigorakis et al., 2007).
Las figuras II.2.4.2. a II.2.4.4., que presentan la relación “pez a dieta” (P/D) de
varios ácidos grasos individuales o grupos de ellos, muestran claramente la convergencia
entre ambos perfiles de ácidos grasos tanto para el ácido linoleico (el elemento más
abundante de muchos aceites vegetales) como para los HUFAn3 (los más abundantes en
el aceite de pescado). Ambas circunstancias han reducido el cociente P/D de la relación
n3/n6 por un factor próximo a 4 (figura II.2.4.4.); una reducción clara de estas relaciones
también ha sido detectada en el músculo de doradas y lubinas alimentadas con una alta
proporción de aceites vegetales en su dieta (Grigorakis et al., 2007). En lo que respecta a
los HUFAn3 individuales resulta evidente que las corvinas han preservado los niveles de
DHA en valores de aproximadamente el doble que los de la dieta (figura II.2.4.2.),
mientras que la relación P/D del EPA mostró una notable reducción hasta valores
próximos a la unidad. Esta situación podría ser indicativa de una mayor necesidad
específica de DHA que podría ir acompañada de una elongación y desaturación de EPA a
DHA cuando las aportaciones alimentarias de éste último resulten insuficientes para
cubrir las necesidades metabólicas del pez. Es asimismo notable la práctica desaparición
de los ya inicialmente reducidos niveles de otros precursores insaturados Δ6 (18:4 n3,
20:4 n3) quizá también utilizados para sintetizar y mantener esos niveles de DHA. El
posible estrés metabólico asociado a esta situación debería ser tenido en cuenta a la
hora de formular piensos bajos en aceite de pescado/altos en aceites vegetales para el
cultivo de peces ya que podrían verse afectados, no sólo la composición de los lípidos del
animal sino, también, su salud y crecimiento. Resulta muy interesante considerar la
posible inclusión de aceites de algunas semillas de oleaginosas especialmente ricas en
los precursores más cortos de los ácidos grasos insaturados Δ6, como posibles
ingredientes futuros en los piensos para peces marinos.
111
Sergio García Mesa
2
SFA
MUFA
1
PUFAn3
PUFAn6
0
0
33
62
119
167
258
307
340
504
Días de cultivo
Figura II.2.4.2. Evolución de la relación “pez/dieta” de los grupos de ácidos grasos de los lípidos
musculares de las corvinas en distintos momentos del ciclo de producción
3
16:1n7
2
18:1n9
18:2n6
1
20:5n3
22:6n3
0
0
33
62
119
167
258
307
340
504
Días de cultivo
Figura II.2.4.3. Evolución de la relación “pez/dieta” de los principales ácidos grasos de los lípidos
musculares de las corvinas en distintos momentos del ciclo de producción.
7
6
5
4
3
n3/n6
2
1
0
0
33
62
119
167
258
307
340
504
Días de cultivo
Figura II.2.4.4. Evolución de la relación “pez/dieta de la relación n3/n6 en el músculo de las corvinas a
lo largo del ciclo de producción.
112
Evolución del contenido de grasa y ácidos grasos en el músculo de corvina (Argyrosomus regius, Asso
1801) durante la fase inicial de cría en piscifactoría con dietas comerciales.
Al considerar la evolución de los índices de calidad de los lípidos del pescado
utilizados (tabla II.2.3.4.), la situación no aparece definitivamente clara. Por una parte, el
FLQ empeora con el tiempo debido a la reducción de la presencia de EPA, pero cuando el
índice utilizado incluye otros ácidos grasos, tal como ocurre para IA e IT, el efecto
negativo sobre los mismos de la reducción de la relación n3/n6 y del nivel total de
HUFAn3 es parcialmente contrarrestada por los efectos beneficiosos de la reducción de
los saturados y del aumento de monoinsaturados y de los poliinsaturados de la serie n6.
Poli et al. (2003) y Piccolo et al. (2008) reportaron valores de IA de 0.48 a 0.69 y de IT de
0.09 a 0.39 en sus experimentos con corvina, valores que se sitúan dentro del rango de
los encontrados en este seguimiento y para otros peces marinos acuicultivados
(Grigorakis et al., 2007).
Al contrastar los perfiles de ácidos grasos del músculo de corvinas alimentadas
con las dos dietas comerciales utilizadas (Alphamar® y Regius®) las únicas diferencias
encontradas son de poca entidad, lo cual no es de extrañar ya que ambos piensos,
aunque algo diferentes en su contenido lipídico total, no lo eran prácticamente en su
perfil de ácidos grasos (tabla II.2.3.2. y figura II.2.4.1.), muy posiblemente por estar
formuladas con las mismas materias primas lipídicas y en proporciones parecidas. Si,
como parece deducirse de lo anteriormente comentado, el principal determinante de la
composición en ácidos grasos del pez ha sido la correspondiente de la dieta, al no ser
éstas diferencias muy importantes tampoco lo serán las de los peces alimentadas con
ellas (tablas II.2.3.3. y II.2.3.4.).
Un trabajo previo con corvinas de 800 g (Piccolo et al., 2008) prueba los efectos
de dos piensos con diferencias sustanciales en su relación proteína/lípidos y el contenido
energético total, encontrándose diferencias en crecimiento, ciertos rasgos biométricos y
composición general. En cambio las diferencias cualitativas (perfil de ácidos grasos) del
filete son menores reflejando otra vez que las dietas, aunque diferentes en el contenido
graso total, no lo eran tanto en su perfil de ácidos grasos.
En un estudio de más corta duración, algo menos de 6 meses, Martínez-Llorens et
al. (2011) usaron dietas comerciales de diferentes proveedores y, aunque informan que
estaban basadas en todos los casos en las mismas materias primas, existen diferencias
sustanciales en el perfil porcentual de ácidos grasos de su componente lipídico que
afectan tanto a LA, como a OA y HUFAn3. Desafortunadamente, no se incluyen datos
sobre la composición en ácidos grasos de los peces alimentados con las diferentes dietas.
113
Sergio García Mesa
II.2.5. RESUMEN
Los datos de nuestro seguimiento confirman la alta proporción de la parte
comestible del cuerpo del animal, siendo su contenido en grasa total relativamente bajo,
pese al aumento detectado durante el cultivo. Por otra parte, el contenido de ácidos
grasos del músculo puede considerarse beneficioso desde el punto de vista de la salud
del consumidor humano, similar al encontrado en doradas y lubinas de cultivo, aunque
cuando se utilizan piensos con contenido lipídico total elevado y alta proporción de
aceites vegetales dentro del mismo, los sustitutos del aceite de pescado deberían ser
seleccionados cuidadosamente, no descartando la inclusión aceites ricos en 18:4n3 y
20:4n3, ni el uso de “piensos de acabado” ricos en HUFAn3.
114
III. Caracterización preliminar de la
actividad digestiva de la corvina
Argyrosomus regius (Asso, 1801)
cultivada.
III.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS.
La capacidad de los peces para utilizar el alimento es, en buena parte, el
resultado de la actividad de las enzimas digestivas e influye decisivamente sobre su tasa
de crecimiento. Gran cantidad de investigaciones han evaluado esta capacidad de los
animales para digerir los principales nutrientes del alimento, caracterizando la actividad
de las enzimas digestivas (proteasas totales, tripsina, quimotripsina, amilasa y lipasa)
(Guzmán et al., 2001), así como los numerosos factores que influyen dicha actividad (por
ejemplo, especie, edad, hábitat, temperatura y composición del alimento; Hidalgo et al.
(1999).
El desarrollo de dietas para peces pretende la obtención de un máximo
crecimiento al menor coste posible y esto se puede conseguir, entre otras formas,
aumentando el aprovechamiento que el pez hace del alimento. El estudio de la actividad
de las enzimas digestivas en una especie de nuevo cultivo puede ayudar al desarrollo de
piensos específicos, dado que la diferente capacidad digestiva hace que el
aprovechamiento del pienso sea diferente para cada especie (Chakrabarti y Sharma,
2005). También se ha visto que el conocimiento de las condiciones óptimas de
funcionamiento de las actividades enzimáticas puede aumentar la comprensión de la
digestibilidad de los nutrientes en los peces (Kolkovski, 2001).
Las proteasas tienen un especial interés, dado que la proteína es el principal
componente de los piensos y su uso es fundamental para el crecimiento de los peces, en
tanto que este principio inmediato es fuente tanto de aminoácidos como de energía
(Essed et al., 2002; Kaushik y Seiliez, 2010). Los estudios de las enzimas proteolíticas de
los peces han proporcionado información importante para mejorar la utilización de la
proteína del alimento. Lemieux et al. (1999) mostraron que la actividad proteasa estaba
relacionada con un aumento en la eficiencia de la utilización del alimento y,
consecuentemente, con el crecimiento en bacalao del Atlántico (Gadus morhua). En
peces carnívoros se ha determinado que la tripsina y la quimotripsina son enzimas claves
debido a su alta actividad proteolítica, encontrándose una relación directa entre la
115
Sergio García Mesa
actividad de éstas y el crecimiento de los peces. En particular la actividad tripsina es un
potencial factor limitante de la tasa de crecimiento y de la utilización de los nutrientes
del alimento por los peces (Rungruangsak-Torrissen et al., 2006). En trucha arcoíris
(Oncorhynchus mykiss) y salmón atlántico (Salmo salar) se observó una relación lineal
entre la actividad de la tripsina y la digestibilidad de la proteína (Krogdahl et al., 1994,
Rungruangsak-Torrissen et al., 2006). La tripsina es una enzima que, además, activa a
otras proteasas pancreáticas, como la quimotripsina, en mamíferos y peces (Sunde et
al., 2001). Su actividad aumenta en condiciones de rápido crecimiento, mientras que la
quimotripsina juega un papel más importante cuando el crecimiento del pez está
deprimido (Rungruangsak-Torrissen et al., 2006).
A pesar de la importancia de las enzimas proteolíticas, no hay que descartar un
mucho menos el papel de otras enzimas digestivas como lipasas y amilasas que, aunque
han recibido una menor atención por los investigadores, deben ser consideradas
porque, entre otras cosas, se está considerando cada vez más ampliamente la
posibilidad de aumentar el contenido de hidratos de carbono y grasa como fuente de
energía que puede suponer un ahorro de proteína en piensos para peces.
Son pocos los estudios realizados sobre las necesidades nutricionales de la
corvina (Argyrosomus regius); Turano et al., (2002) hablan de un contenido óptimo de
proteína de 44% mientras que Piccolo et al., (2008) establecieron el nivel óptimo de
grasa en el 17%. Martínez-Llorens et al. (2011) han determinado porcentajes de
proteína/grasa (46/20) en la dieta para el crecimiento óptimo de corvinas de 90 g. Sin
embargo, aún existen lagunas importantes relativas a su alimentación. Son pocos los
estudios destinados a conocer su fisiología digestiva, aspecto esencial para optimizar la
utilización de los nutrientes en especies de peces cultivados. Recientemente, Estévez et
al. (2011) han estudiado el efecto de la inclusión de proteínas vegetales en piensos
sobre la actividad digestiva del ribete en cepillo en esta especie.
El presente trabajo pretende la caracterización preliminar de la capacidad
digestiva de la corvina, con objeto de sentar bases para el desarrollo de fórmulas
alimenticias específicas para su cultivo. En este sentido, en primer lugar hemos
procedido a determinar la distribución de las actividades proteasa total, tripsina,
quimotripsina, amilasa y lipasa en el tubo digestivo de esta especie y el efecto del pH
sobre la actividad proteasa total. En segundo lugar se han valorado y discutido las
similitudes y diferencias entre la actividad proteasa de la corvina y las de otras especies
de peces cultivados en condiciones similares.
116
Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801)
cultivada
III.2. MATERIALES Y MÉTODOS.
III.2.1. Animales, condiciones experimentales y muestreos.
Para la primera parte del presente trabajo se han utilizado juveniles de corvina
de 194  5 g criados en las instalaciones del Centro del IFAPA de El Toruño, en el Puerto
de Santa María (Cádiz). Los ejemplares se mantuvieron en tanques de 4 m3 (40 peces por
tanque) con un suministro de agua, previamente filtrada y aireada, de 5-10 L/min con
una temperatura de 22.3 ± 0.1°C. Los peces se alimentaron diariamente mediante
comedero automático con una ración del 1% del peso corporal. Se utilizó un pienso
comercial (SKRETTING, C.V. 6), cuya composición se muestra en la tabla III.2.1.
Tabla III.2.1. Composición del pienso (g/kg, en sustancia seca)
Componente
Proteína bruta
Grasa bruta (extracto etéreo)
Cenizas
Material extractivo libre de nitrógeno (MELN)*
Energía** (MJ/Kg)
Relación Proteína/Energía (g/MJ)
472.0
204.7
77.2
246.1
238.3
198.0
* calculado como 1000 – (Proteína bruta + extracto etéreo + cenizas)
** calculado sobre la base de 24.3, 39.7 y 17.2 KJ/g de proteína, lípidos y
MELN, respectivamente
Al final de un periodo de 2 semanas y tras un ayuno de 24 h para eliminar el
contenido del tubo digestivo, se tomaron 14 corvinas, se sacrificaron según la Directiva
010/63/EU (sobredosis de metacaína), y, tras ser pesados, se diseccionaron para la
determinación de los índices hepatosomático (IHS) y digestosomático (IDS); el tubo
digestivo extraído se dividió en los siguientes tramos: estómago (E), ciegos pilóricos (CP),
intestino proximal (IP) e intestino distal (ID) para determinar, en cada uno de ellos , las
actividades proteasa ácida y alcalina, tripsina, quimotripsina, amilasa y lipasa; además,
para las actividades proteasas ácida y alcalina se estudió el efecto del pH en los distintos
tramos intestinales.
Para la segunda parte del trabajo se utilizaron ejemplares de corvina
(Argyrosomus regius), dorada (Sparus aurata) y mero (Epinephelus marginatus)
cultivados con las mismas condiciones ambientales y de manejo en jaulas de las
instalaciones de Acuisleta S.L. (La Isleta del Moro, Almería). La alimentación se realizó de
forma manual una vez al día, seis días a la semana, con pienso comercial (BIOMAR.
Ecolife 63 CHS 4.5 mm, 44.0% de proteína bruta y 20.0% de grasa) con una ración diaria
117
Sergio García Mesa
equivalente al 1% del peso corporal. Los muestreos se realizaron en el mes de febrero de
2010, cuando la temperatura del agua era de 15 ± 0.1 °C.
Adicionalmente, se incorporaron al estudio ejemplares de tilapia (Oreochromis
niloticus) mantenidas en el acuario emplazado en las instalaciones de la Universidad de
Almería en cubas cilíndricas de fibra de vidrio de 0.3 m3 de capacidad, con aireación
constante, renovación de agua de 300 L/hora, y condiciones naturales de temperatura y
fotoperiodo, en un sistema cerrado de circulación de agua mediante un doble filtro de
arena y biológico. Estos peces se habían alimentado dos veces al día de forma manual
hasta saciedad aparente con un pienso experimental libre de soja (40.2% de proteína,
10.3% de grasa).
La toma de muestras se basó en 5 ejemplares de cada especie siguiendo el
mismo protocolo antes descrito. Los peces sacrificados se envasaron en cajas de
polipropileno, recubiertos con hielo y se transportaron al laboratorio de Producción
Animal de la Universidad de Almería. Se realizó la disección y extracción del tubo
digestivo de forma similar a la indicada en el apartado anterior, determinándose, en
este caso, la actividad proteasa alcalina a diferentes valores de pH en el medio de
reacción.
III.2.2. Procesado de las muestras y análisis de las actividades
digestivas.
Cada fracción digestiva se homogeneizó con agua fría ultrapura en proporción
1:4 (peso:volumen) y se centrifugó a 16000 rpm durante 30 minutos a 4°C. El
sobrenadante obtenido se congeló a -80°C hasta el posterior análisis de las actividades
enzimáticas. El contenido en proteína soluble de los sobrenadantes se determinó por el
método de Bradford (1976), usando seroalbúmina bovina como patrón.
La actividad proteasa ácida se determinó utilizando hemoglobina al 0.5% como
sustrato según Anson (1938). La actividad proteasa alcalina se evaluó usando el método
descrito por Walter (1984), con caseína al 1% como sustrato. El análisis de la actividad
tripsina se realizó según el procedimiento descrito por Erlanger et al. (1961) con algunas
modificaciones de Faulk et al. (2007). La actividad quimotripsina se determinó según el
método descrito por Hummel (1959) modificado por Applebaum y Holt (2003). Para la
determinación de la actividad α-amilasa se utilizó un kit comercial de diagnóstico (Labkit,
30140) basado en el método enzimático-cinético CNPG3 (Ying et al., 1998). La actividad
lipasa se determinó según el método desarrollado por Gjellesvik et al. (1992) con las
modificaciones propuestas por Lazo et al. (2000). Todos los métodos citados están
descritos con detalle en el apartado IX (Metodología) de esta Memoria.
118
Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801)
cultivada
III.3. RESULTADOS.
III.3.1. Influencia del pH sobre la actividad proteasa
La tabla III.3.1. muestra el efecto del pH sobre la actividad proteasa total en
diferentes porciones del digestivo de la corvina. Las proteasas ácidas presentes en el
extracto estomacal mostraron un óptimo de actividad para un pH entre 2.0 y3.0. Por su
parte, las proteasas de los extractos intestinales mostraron un óptimo de actividad en el
rango de pH de 9.0 a 10.0, con un máximo bien definido para este último valor. La
distribución de la actividad proteasa alcalina en las distintas porciones del intestino fue
homogénea.
Tabla III.3.1. Efecto del pH de incubación sobre la actividad proteasa ácida
y alcalina (U/mg proteína) de extractos de estómago y diferentes tramos
del intestino de la corvina.
pH
E
CP
IP
ID
c
27.45 ±1.94
2.0
26.68c±1.98
3.0
20.41b±1.53
4.0
0.42ª±0.05
5.0
0.33ª±0.03
5.29b±0.51
6.21b±0.97
5.96b±0.59
6.0
0.13ª±0.02
4.17b±0.53
6.68b±1.07
7.31b±0.92
7.0
5.80b±0.56
5.28b±0.62
6.87b±0.70
8.0
8.00c±0.74
6.55b±0.55
11.31c±1.09
9.0
14.14d±0.79
13.06c±0.95
16.71d±0.78
10.0
0.03ª±0.00
0.03ª±0.01
0.03ª±0.01
12.0
Los valores son media ± EEM (N=14). Superíndices muestran diferencias significativas (P<0.05) entre
diferentes valores de pH para un mismo fragmento del tracto digestivo.
E: estómago; CP: ciegos pilóricos; IP: intestino proximal; ID: intestino distal.
III.3.2. Distribución anatómica de las actividades digestivas en
la corvina.
Los valores medios de los parámetros biométricos de las corvinas utilizadas para
el ensayo fueron: 194.7 ± 5.1 g peso total; 2.3 ± 0.5 g peso de hígado; 5.1 ± 0.6 g peso de
digestivo; 1.2% ± 0.2 índice hepatosomático; 2.6% ± 0.3 índice digestosomático.
Las actividades enzimáticas en extractos de diferentes porciones del tracto
digestivo de la corvina expresadas como actividad específica (unidades/mg de proteína)
se muestran en tabla III.3.2.
119
Sergio García Mesa
Tabla III.3.2. Actividad específica (U/mg proteína) de enzimas digestivas de extractos
de estómago y diferentes tramos del intestino de corvina.
pH
E
CP
IP
ID
Proteína
15.63±0.46
10.22±0.33
10.02±0.33
11.73±0.54
soluble
(mg/ml)
27.45c±1.94
Proteasa ácida 2.0
Proteasa
14.14d±0.79
13.06c±0.95
16.71d±0.78
8.0
alcalina
1.04a ±0.08
4.32b ±0.23
1.00b ±0.07
1.13a±0.12
Tripsina
8.2
19.34a ±1.53
501.61d±16.25 245.99c±14.37 193.41b ±13.71
Quimotripsina* 7.8
8.62b±0.60
4.05a±0.59
6.73b±0.71
T/QT**
1.09a ±0.07
6.21d ±0.21
4.38c ±0.13
1.99b ±0.20
Lipasa
7.4
0.62a ±0.03
2.65c ±0.10
2.60c ±0.12
1.32b ±0.10
Amilasa
6.0
Los valores son medias ±E EM, N=14. Superíndices muestran diferencias significativas (P<0.05) entre diferentes
porciones del digestivo. E: estómago; CP: ciegos pilóricos; IP: intestino proximal; ID: intestino distal
*Quimotripsina como mU/mg proteína. **T/QT: Relación de actividades Tripsina/Quimotripsina
La actividad proteasa ácida determinada en extractos de estómago incubados a
pH 2.0 con hemoglobina como sustrato mostró valores elevados. Por el contrario, no se
pudo detectar este tipo de actividad en ninguna otra zona del tubo digestivo. El resto de
actividades enzimáticas estudiadas también mostraron cierta presencia en extractos
estomacales, si bien en general muy por debajo de las medidas en tramos intestinales.
La actividad proteasa alcalina determinada en extractos intestinales incubados a
pH 10.0 con caseína como sustrato mostró valores similares a lo largo de todos los
tramos del tracto intestinal estudiados.
En relación con las actividades proteolíticas específicas estudiadas, tanto la
actividad tripsina como quimotripsina fueron claramente superiores en ciegos pilóricos
que en tramos posteriores del intestino. La relación T/Q fue superior en ciegos pilóricos
e intestino distal e inferior en la porción anterior del intestino.
Las actividades lipasa y amilasa también mostraron valores máximos en los
extractos de ciegos pilóricos y disminuyeron a lo largo del tracto digestivo, siendo los
valores marcadamente inferiores en la porción final del mismo.
120
Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801)
cultivada
III.3.3. Actividad proteasa alcalina en diferentes especies
La tabla III.3.3. muestra los parámetros biométricos de los ejemplares de corvina,
dorada, mero y tilapia utilizados para el estudio de la actividad proteasa alcalina. Se
utilizaron individuos de peso aproximado para las corvinas y las doradas (467.4 y 321.6 g
respectivamente), pero no para las otras dos especies, ya que debimos adaptarnos a los
animales disponibles en el momento del muestreo: meros de pesos superiores (817.7 g),
tilapias de menor peso (123.0 g).
Tabla III.3.3. Parámetros biométricos en las distintas especies.
CORVINA
MERO
TILAPIA
321.60 ±5.28
d
817.75 ±83.48
123.00a±14.58
5.34b±0.96
4.23b±0.84
9.66c±1.66
1.1a±0.09
12.72b±0.90
13.41b±1.22
28.44c±5.71
4.95a±0.77
IHS (%)
1.12±0.15
1.33±0.61
1.20±0.21
0.89±0.07
IDS (%)
2.71a±0.11
4.15b±0.30
3.39ab±0.39
3.95b±0.27
c
467.40 ±34.78
Peso hígado (g)
Peso digest. (g)
Peso (g)
DORADA
b
Los valores son media ± EEM. (N=5). Superíndices muestran diferencias significativas (P<0.05) entre diferentes
especies. IHS: índice hepatosomático; IDS: índice digestosomático.
Estas diferencias de peso total entre especies fueron paralelas a las de sus
correspondientes hígados, por lo que el índice hepatosomático fue muy similar entre las
cuatro especies. No se apreció esta circunstancia en lo que concierne a los tubos
digestivos por lo que los índices digestosomáticos resultaron superiores en dorada y
tilapia e inferiores en corvina.
La actividad proteasa alcalina para las distintas especies y fracciones del tracto
digestivo se muestra en la tabla III.3.4. Los resultados muestran valores máximos de
actividad en ciegos pilóricos a pH 10.0 para todas las especies. En los extractos de
intestino anterior y posterior también son máximos los valores a ese pH, siendo muy
similares a los observados en los ciegos pilóricos. Los resultados muestran valores de
actividad proteasa alcalina en corvina similares a los de la dorada e inferiores a los de
mero y tilapia.
121
Sergio García Mesa
Tabla III.3.4. Efecto del pH sobre la actividad proteasa alcalina (U/mg proteína) de
extractos de distintas porciones del intestino en las diferentes especies.
pH
CORVINA
DORADA
MERO
TILAPIA
CP
7.0
8.0
9.0
10.0
12.0
0.82a±0.08
0.98a±0.05
1.41a±0.05
3.21a±0.09
0.45a±0.03
1.30a±0.08
1.42a±0.11
1.49a±0.07
4.68b ±0.04
0.42a±0.08
2.39b±0.13
2.76b±0.04
2.77b±0.16
9.49b±0.34
0.42a±0.04
4.83c±0.43
4.48c ±0.28
4.40c ±0.34
9.39c ±0.43
4.25b ±0.08
IP
7.0
8.0
9.0
10.0
12.0
0.75a±0.06
0.78a±0.03
1.01a±0.06
2.72a±0.11
0.43a±0.02
0.78a±0.09
1.19a±0.12
1.63a±0.26
4.01a±0.15
0.39a±0.05
2.27b±0.29
2.32b±0.18
3.10b±0.10
9.47d±0.13
0.33a±0.01
4.39c±0.49
4.81c±0.44
4.27c±0.36
8.40c±0.28
4.14b±0.09
ID
7.0
8.0
9.0
10.0
12.0
0.83a±0.05
0.95a±0.04
1.02a±0.08
2.46a±0.20
0.51b±0.03
0.79a±0.08
1.25a±0.13
1.54a±0.10
4.91 b ±0.26
0.42ab±0.07
2.13b±0.27
2.33b±0.26
2.64b±0.12
9.28c±0.28
0.28a±0.02
4.47c±0.54
5.01c±0.09
4.34c±0.38
9.08c±0.58
4.16c±0.12
Los valores son media ± EEM. (N=5). Superíndices muestran diferencias significativas (P<0.05) entre
diferentes especies. CP: ciegos pilóricos; IP: intestino proximal; ID: intestino distal.
III.4. DISCUSIÓN.
La corvina es un pez carnívoro que, en su hábitat natural, se alimenta de peces
pelágicos y cefalópodos (Calderón et al., 1997). Su tracto digestivo es típico de peces
carnívoros, estando constituido por un esófago, un estómago de paredes musculosas,
una serie de ciegos pilóricos y un intestino no demasiado largo. El tamaño relativo del
intestino resultó menor en la corvina que en el resto de las especies estudiadas (tabla
III.3.3.), tal y como se refleja en los bajos valores de IDS, propios de peces esencialmente
carnívoros.
Es difícil comparar resultados con referencia a la actividad digestiva entre
distintas especies de peces debido a que los datos proceden de experimentos en los que
se utilizan especímenes de muy distinta procedencia, con diferentes tipos de
alimentación y distintos tipos de preparación de las enzimas (Alarcón et al., 1998). Sin
embargo, el hecho de que los estudios relativos a la capacidad digestiva de la corvina
sean escasos (Estévez et al., 2011), nos obliga a comparar los resultados obtenidos en
nuestro experimento con los realizados en otros peces, con la finalidad de completar la
información sobre la capacidad digestiva de esta especie.
122
Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801)
cultivada
En este sentido, la actividad pepsina, principal responsable de la actividad
proteasa ácida de los peces (Xion et al., 2010), fue inferior en extractos de estómago de
las corvinas a la observada en otras especies de peces carnívoros, como el atún rojo
(Thunus thynnus, Essed et al., 2002) o el atún azul (Thunnus orientalis, Matus de la Parra
et al., 2007) que mostraron valores de 761.3 y 41.3 U/mg proteína respectivamente en
condiciones similares de ensayo.
Las diferencias podrían ser debidas al diferente tipo de alimentación: piensos
comerciales en nuestro experimento frente a una alimentación basada en pescado
fresco en el atún. En efecto, debemos tener presente la elevada capacidad tamponadora
que presentan las proteínas de origen vegetal presentes en la práctica totalidad de los
piensos comerciales. De hecho, el valor óptimo de pH para esta actividad se sitúa
normalmente en un estrecho rango alrededor de 2.0 y disminuye sensiblemente cuando
nos apartamos de él. Pues bien, cuando se mide el pH del contenido estomacal en peces
poco después de la administración del pienso, los valores suelen ser sensiblemente
mayores, alrededor de 4.0 en dentón y dorada (Alarcón, 1997); 4.3 en lubina (Eshel et al.
1993); 5.2 en anguila (Takii et al. 1985), o alrededor de 4.0 en seriola (Caruso y
Genovese, 1992). Si sumamos este hecho a la rápida velocidad de tránsito del contenido
estomacal, cabe plantearse la verdadera importancia de la fase ácida de la digestión en
condiciones reales en peces alimentados con piensos que incorporan proteínas
vegetales, o más bien que ésta se sobreestime (Yúfera et al., 2012). Una situación
diferente se plantea cuando el pez carnívoro se alimenta de su dieta natural, es decir,
basada en proteína animal.
Cuando se comparan los resultados obtenidos en peces alimentados con piensos
comerciales, y, por lo tanto, con proteínas vegetales en su composición, se observan
valores superiores en las corvinas a los obtenidos en otros peces como el lenguado
senegalés, que mostró valores de actividad proteasa ácida inferiores (10.5 U/mg
proteína) (Sáenz de Rodrigáñez et al., 2005). Son muchos los factores que pueden influir
sobre la actividad de las enzimas digestivas, en concreto, la edad de los peces (Kuźmina,
1996), la temperatura y estación del año (Kuźmina et al., 1996) y la composición de la
dieta (Zambonino Infante y Cahu, 2001), son algunos de los más importantes. El motivo
de las diferencias en este caso probablemente ha sido el menor tamaño de los
lenguados, 40 g frente a los casi 200 g de las corvinas de nuestro experimento o el
diferente contenido en proteína del pienso utilizado (47% frente al 55% en el caso de los
lenguados).
En peces carnívoros se ha descrito una estrecha relación inversa entre las
actividades de pepsina gástrica y proteasa alcalina, hecho que parece sugerir una buena
utilización de la proteína por estas especies independientemente de la cantidad y de la
calidad de la misma en la dieta (Essed et al., 2002). Nuestros resultados muestran una
123
Sergio García Mesa
proporción entre los dos tipos de actividades enzimáticas del orden de 5:1, muy por
debajo de la determinada en algunas especies cultivadas como la dorada (Sparus
auratus) o el dentón (Dentex dentex), en que fue del orden de 15:1 (Alarcón et al.,
1998), pero similar a la encontrada en el atún rojo (Essed et al., 2002) y superior a la
hallada en el lenguado senegalés (Sáenz de Rodrigáñez et al., 2005).
El perfil de actividad en función del pH observado en el presente experimento
para la actividad proteasa ácida mostró valores óptimos en el rango de pH 2.0-3.0 (figura
III.4.1.), de manera similar a lo observado en otras especies de peces marinos y
dulceacuícolas como la trucha (Kitamikado y Tachido 1960; Guillaume y Choubert,
1999); el pez gato (Jonas et al., 1983), la tilapia (Yamada et al., 1993), el lenguado, el
rodaballo y el halibut (Glass et al., 1989), la lubina (Eshel et al., 1993), la dorada y el
dentón (Alarcón et al., 1998). Sin embargo, tal y como se ha apuntado con anterioridad,
dichos valores de pH son muy improbables en peces alimentados en condiciones de
cultivo reales, con piensos que incorporan materias vegetales.
35
Estómago
Ciegos pilóricos
Intestino proximal
Intestino distal
U/mg proteína
30
25
20
15
10
5
0
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
pH
Figura III.4.1. Efecto del pH sobre la actividad proteasa ácida/alcalina en los distintos tramos
intestinales
La actividad proteasa alcalina mostró valores similares a lo largo del tracto
intestinal (figura III.4.1.). No obstante, si se considera la misma distribución anatómica
de la actividad tripsina, se observó una clara disminución de la misma en los últimos
tramos del intestino. Dado que la tripsina es la enzima que contribuye en mayor
proporción al total de actividad proteasa alcalina, resulta extraño el comportamiento
antagónico de ambas actividades enzimáticas. Consecuentemente, estos resultados
fueron inesperados y no se ha encontrado una explicación fisiológica razonable para
ellos.
124
Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801)
cultivada
En relación con la influencia del pH en dicha actividad, los valores fueron
máximos a pH 10.0. Estos resultados coinciden con otros que muestran un máximo de
actividad proteasa en un rango de pH entre 8.0 y 10.0 en la carpa (Jonas et al., 1983), el
fletán y el rodaballo (Glass et al., 1989), la lubina (Eshel et al., 1993) y el siluro (Xiong et
al., 2011).
Nuestros resultados muestran una reducida actividad de proteasa alcalina en los
extractos de estómago de las corvinas. Otros autores también han descrito bajos niveles
de proteasas alcalinas como la tripsina y la quimotripsina en extractos de estómago de
peces teleósteos, tal es el caso de Chakrabarti et al. (1995) y Sabapathy y Teo (1993).
Deguara et al. (2003) también encontraron proteasas alcalinas en el estómago de
dorada, probablemente debido a contaminación a partir de la actividad intestinal. A
pesar de no haber realizado un estudio histológico de la mucosa estomacal,
consideramos que es altamente improbable que dichas proteasas se hayan generado en
el propio estómago, y cabe pensar más bien que su presencia se deba a reflujo del
contenido intestinal.
Las actividades tripsina (T) y quimotripsina (QT) presentaron su valor máximo en
los ciegos pilóricos, con una alta relación T/QT (8.05), lo que, de nuevo, pone de
manifiesto el carácter carnívoro de la especie, en coincidencia con lo observado por
Essed et al. (2001), quienes encontraron en especies de peces carnívoros como el atún
rojo una actividad tripsina cuatro veces mayor que la quimotripsina, mientras que en
peces omnívoros, como la carpa se ha descrito justo lo contrario (Jonas et al., 1983).
Otros autores han establecido que la relación T/QT en peces es alta durante los periodos
de crecimiento rápido y baja durante los de crecimiento lento (Rungruangsak-Torrissen
et al., 2006); también se ha observado una relación directa entre este cociente y la
eficiencia de conversión del alimento (Sunde et al., 2001). En cualquier caso, ambos
tipos de proteasas juegan un papel sinérgico en la digestión de la proteína en el tracto
intestinal (Cohen et al., 1981; Uys y Hecht, 1987; Glass et al., 1989), sin duda debido a
las diferentes secuencias de aminoácidos sobre las que actúan.
Se ha establecido que la tripsina es una enzima clave en la utilización del
componente proteico del alimento (Einarsson et al 1997), contribuyendo a un 40-50% de
la digestión proteica (Eshel et al., 1993) y que juega un papel clave en la regulación del
crecimiento de los peces controlando la biodisponibilidad intestinal de aminoácidos
procedentes de la dieta (Torrissen et al., 1994). No parece extraño si se tiene en cuenta
la enorme dependencia de los peces, especialmente carnívoros, de los aminoácidos
como fuente de nitrógeno y de energía, fundamental para determinar el crecimiento
(Kaushik y Seiliez, 2010) razón que explicaría su uso como predictor del crecimiento en
peces como la carpa (Sharma y Chakrabarti, 1999), el bacalao (Lemieux et al., 1999) o el
pez lobo (Lamarre et al., 2004, 2007).
125
Sergio García Mesa
Los resultados obtenidos al comparar la actividad proteasa alcalina de la corvina
con la de otras especies con interés en acuicultura (tabla III.3.4.) han mostrado valores
inferiores a los encontrados en la primera parte del experimento para todos los valores
de pH de incubación, y en los diferentes fragmentos intestinales estudiados. La menor
capacidad proteolítica puede ser debida al mayor tamaño de las corvinas en el segundo
ensayo(467 g frente a 190 g), ya que algunos autores describen una mayor actividad
proteasa en peces pequeños comparados con los de mayor tamaño (Klahan et al., 2009
en tilapia; Bai et al., 2003 en Ancherythroculter nigrocauda); sin embargo, otros autores
han indicado una mayor actividad proteasa alcalina en peces grandes (Tramati et al.,
2005 en el sargo picudo; Jun-Sheng et al., 2006 en tilapia). Estos últimos autores lo
explican como un aumento de la capacidad digestiva de los peces al aumentar su
tamaño, con el consiguiente incremento en su capacidad de crecimiento. Estas
contradicciones entre los diferentes ensayos probablemente se deban a que es la fase
de crecimiento de los peces la que determina su actividad digestiva más que el tamaño
de los mismos.
Otras posibles causas de esta menor actividad proteasa alcalina encontrada en
las corvinas de mayor tamaño pueden ser las diferentes condiciones de cultivo entre los
dos grupos de peces, ya que las corvinas de la primera parte del experimento se
mantuvieron en tanques con agua recirculada a 22 °C y se alimentaron con un pienso de
47% de proteína, mientras que las de la segunda parte del experimento se mantuvieron
en jaulas flotantes con una temperatura de 15 °C (en el momento del muestreo) y
fueron alimentadas con un pienso de 44% de proteína.
Los valores de actividad proteasa alcalina se mantuvieron constantes a lo largo
del intestino, de forma similar a lo observado en las corvinas de menor tamaño.
Frecuentemente se ha observado una disminución de la actividad proteasa y, en general
de todas las actividades digestivas, en las porciones distales del intestino de los peces
(Jun-Sheng et al., 2006, Xiong et al., 2011). El mantenimiento de la actividad proteasa en
esta especie puede ser debido a una especie de “compensación” de su intestino
relativamente corto y un tránsito rápido del alimento.
Los resultados muestran valores de actividad específica proteasa alcalina en la
especie que nos ocupa similares a los de la dorada e inferiores a los de mero y tilapia. La
similitud con la dorada nos indica que se trata de dos especies carnívoras con buena
capacidad para digerir las proteínas del alimento. Los mayores valores observados en el
mero pueden ser debidos a una mayor capacidad de digestión de las proteínas por esta
especie, o bien a que se encuentran en fase de crecimiento más rápido, al tratarse de
una especie de mayor tamaño que las anteriores.
126
Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801)
cultivada
La alta actividad proteasa alcalina observada en la tilapia frente a especies
carnívoras como la dorada y la corvina podría ser también debida a su menor tamaño
(123 g), y, por lo tanto, a encontrarse en una etapa de crecimiento más rápido. También
hay que tener en cuenta que las condiciones de cultivo han sido bastante diferentes.
Adicionalmente, puede haberse puesto de manifiesto un efecto de compensación de la
baja proteína de la dieta natural de peces herbívoros como la tilapia mediante el
aumento de su actividad enzimática (Sabapathy y Teo, 1993; Hidalgo, et al., 1999),
posiblemente para maximizar la eficiencia de utilización de las proteínas (Chan et al.,
2004), aunque en este caso las tilapias se han alimentado con un contenido proteico del
40%.
El menor contenido en proteína de la dieta natural de peces herbívoros también
puede verse compensado por un mayor tamaño del intestino (Stevens, 1988); esto no
ocurre en nuestros resultados que muestran un índice digestosomático similar para
todas las especies, incluso con valores ligeramente inferiores para la tilapia. Se puede
decir, por lo tanto, que esta especie compensa el menor contenido en proteína en su
dieta natural aumentando la actividad proteasa pero manteniendo la longitud del
intestino.
Las diferencias interespecíficas en la actividad de una enzima digestiva,
expresada por unidad de peso de tejido (figura III.4.2.), no siempre significan diferencias
similares en la capacidad total del pez para la digestión del sustrato correspondiente, ya
que posibles diferencias en el peso del órgano podrían compensar o acentuar las
primeras.
U/g tejido pilórico
200
CORVINA
DORADA
MERO
TILAPIA
150
100
50
0
7
8
9
pH
10
11
12
Figura III.4.2. Efecto del pH de incubación sobre la actividad proteolítica de extractos de
ciegos pilóricos en las distintas especies.
En nuestro caso, podemos realizar una aproximación a este aspecto, tomando
como referencias, por una parte, la relación entre las actividades de proteasa alcalina
por gramo de digestivo de las distintas especies, usando como referencia a nuestra
127
Sergio García Mesa
especie de estudio, la corvina (medidas a pH 10.0, que ha proporcionado el máximo de
actividad en todos los casos) y, por otra, las relaciones correspondientes entre los
respectivos índices digestosomáticos. En ese caso, podemos observar que la corvina, no
sólo exhibe una comparativamente menor actividad enzimática por unidad de peso de
digestivo, sino también un digestivo más pequeño, en términos relativos (menores IDS)
lo que acentúa esas diferencias en detrimento de la corvina. Por ejemplo, en relación
con la dorada, la corvina tiene una actividad proteasa alcalina (promediando la de los
diferentes segmentos estudiados, maniobra posible a partir de las escasas diferencias
interterritoriales encontradas en cada especie) casi un 30% inferior si se expresa por
gramo de víscera, pero como también su digestivo (por unidad de peso corporal) es casi
un 35 % menor; el “déficit” de actividad proteasa alcalina llegaría a ser de más de un
50% con respecto a la dorada.
Estas asunciones deben ser consideradas con cierta reserva debido a las
diferencias en la edad/grado de desarrollo existentes entre las especies, lo que podría
reducir sus fundamentos, pero pueden ser útiles a la hora de diseñar piensos específicos
para cada especie/etapa de crecimiento.
La actividad lipasa mostró valores superiores en las primeras porciones del
intestino (tabla III.3.2.), de forma similar a lo observado en otras especies de peces como
el rodaballo (Fu et al., 2005), Boleophthalmus pectinirostris (Wu et al., 2007), la dorada
(Eroldogan et al., 2008), el atún azul (Matus de la Parra et al., 2007) y el siluro (Xiong et
al., 2011). Los valores máximos obtenidos en nuestro experimento han sido en los ciegos
pilóricos (6.2 U/mg proteína); estos valores son bajos si se comparan con los obtenidos
en la misma porción intestinal en el atún azul (Matus de la Parra et al., 2007) que fueron
de 27.5 U/mg proteína. Estas diferencias se han observado también en las demás
actividades enzimáticas estudiadas, a pesar de haberse medido mediante técnicas
similares y podrían ser debidas a la alimentación con pescado fresco del atún frente a la
alimentación con pienso comercial en las corvinas, de forma similar a lo comentado
anteriormente para la actividad proteasa ácida. Los valores también son inferiores a los
observados en otras especies como la trucha y el esturión (Furné et al., 2005) y similares
a los observados en tilapia (Jun-sheng et al., 2006). Esto resulta sorprendente porque
normalmente se han descrito mayores valores de actividad lipasa en peces carnívoros
que en los omnívoros y herbívoros (Chakrabarti et al., 1995; Opuszynski y Shireman,
1995; Tengjaroenkul et al., 2000). Sin embargo, también se han observado bajos niveles
de actividad lipasa en peces con bajo contenido en lípidos musculares (Achionye-Nzeh et
al., 2006), explicándolo por un bajo aprovechamiento de los lípidos de la dieta. Esto
coincide con las bajas actividades observadas en esta especie, caracterizada por su carne
magra (Grigorakis et al., 2011) y por sus bajas necesidades de lípidos dietarios (Piccolo et
al., 2008; Chatzifotis et al., 2010).
128
Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801)
cultivada
La actividad amilasa mostró el mismo patrón observado para la lipasa (tabla
III.3.2.), máximo en ciegos pilóricos e intestino proximal y mínimo en intestino distal, con
valores muy bajos de actividad en extractos de estómago. Estos resultados son similares
a los de otras especies y explican que la digestión del almidón se realiza
preferencialmente en la primera porción del intestino (Kuźmina, 1985; Uys y Hecht,
1987; Lundstedt et al., 2004). Alarcón et al., (2001) demostraron la presencia de
actividad carbohidrasa en diferentes secciones del intestino de la dorada, desde el
estómago hasta el recto, pero fundamentalmente en los ciegos pilóricos e intestino. Un
patrón similar se observó en salmón blanco (Chiu y Benítez, 1981) y salmonete (Establier
et al., 1985). La presencia de actividad amilasa en el estómago ha sido mostrada por
otros autores pero la mayor parte lo explican por una contaminación procedente de la
digestión intestinal (Uys y Hecht, 1987; Xiong et al., 2011).
La digestión de los hidratos de carbono por los peces carnívoros es limitada
debido a la reducida presencia de estos nutrientes en su hábitat alimentario natural y
suele mostrar valores inferiores a los de peces omnívoros (Sabapathy y Teo, 1993); sin
embargo, los valores obtenidos en nuestro estudio son superiores a los observados en
otras especies de peces carnívoros como el siluro (Xiong et al., 2011), ligeramente
superiores a los de dorada, trucha y anguila y muy inferiores a los de especies herbívoras
como carpa, tenca y pez dorado (Hidalgo et al., 1999).
III.5. RESUMEN
El presente estudio demuestra la presencia de unas relativamente altas
actividades de proteasas y amilasa, y una baja actividad lipasa en el digestivo de la
corvina, características que sugieren que esta especie tiene una buena capacidad para
digerir sobre todo los componentes proteicos e hidrocarbonados de la dieta. Posteriores
investigaciones en las que se determine una posible adaptación de las actividades
enzimáticas lipasa y amilasa a cambios en la composición de lípidos e hidratos de
carbono del pienso serían de gran interés para contemplar la posibilidad de incluir estos
componentes en la dieta de esta especie, con objeto de disminuir la utilización de la
proteína como fuente de energía.
129
IV. Efecto del tamaño de la ración
diaria sobre el crecimiento, la
utilización de la dieta, el metabolismo
y el estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius Asso, 1801)
IV.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS.
Uno de los principales determinantes, si no el que más, del éxito de una planta
de cría intensiva de peces es el diseño y puesta en práctica de una adecuada estrategia
de alimentación. En efecto, una vez conocidas, aunque sólo sea en sus rasgos
principales, las necesidades alimentarias de la especie en cuestión, se impone la
definición y aplicación de un sistema de alimentación que compatibilice las
posibilidades/preferencias de los peces con los intereses económicos del piscicultor.
A su vez, una de las variables fundamentales a considerar en el conjunto de esa
estrategia es lo que se conoce como tamaño de la ración, es decir, la cantidad de
alimento que se debe suministrar a la unidad de cultivo (estanque, piscina, jaula) por
unidad de tiempo. Raciones deficitarias pueden generar crecimientos subóptimos y
alteraciones en la salud de los animales en tanto que raciones excesivas pueden
significar, no sólo un desperdicio económico, sino un grave quebranto de la calidad del
medio (Langar y Guillaume, 1994; Sumagaysay, 1998; Ng et al., 2000; Van Ham et al.,
2003). En piscicultura, la forma más habitual de expresar el tamaño de la ración es la
que usa el día como unidad de tiempo y la relación porcentual entre el peso de alimento
y el de la biomasa que lo recibe, como expresión de cantidad.
A la hora de determinar cuál puede ser la ración más adecuada es preciso tener
en cuenta diversas variables que la influyen como son la edad de los animales, la
composición nutricional y energética del pienso, la temperatura y otras variables
ambientales o las posibles actividades de la planta (traslados, tratamientos sanitarios,
etc.) (Brett y Groves, 1979; Van Ham et al., 2003; Desay y Singh, 2009).
Pero, además, para una situación determinada de edad, temperatura, tipo de
pienso, etc., conviene efectuar una previsión de la relación que existe entre el tamaño
de la ración y la ganancia de peso de los animales. Se habla de ración de mantenimiento
131
Sergio García Mesa
como aquella que permite a los peces mantener su peso, es decir la necesaria para
compensar las pérdidas derivadas del metabolismo de los animales. Por encima de la
misma, cualquier aumento debe suponer un crecimiento neto de los peces; ahora bien,
¿es ésta relación indefinida?, parece ser que no, pues se ha determinado con frecuencia
la existencia de una ración máxima como la que provoca una tasa de crecimiento que no
es mejorable por aumentos adicionales de la misma (por decirlo de otra forma, esa
ración “satura” las capacidades de crecimiento del pez en esas condiciones concretas).
Se puede añadir otra cuestión: en el intervalo entre ración de mantenimiento y ración
máxima, ¿es lineal la relación entre el tamaño de la misma y la tasa de crecimiento? Si
no es así, y esta parece ser una situación bien descrita, pueden aparecer “cambios de
ritmo” e incluso “puntos de inflexión” que obliguen al piscicultor a plantearse la
necesidad de definir como ración óptima aquella que, aún procurando un crecimiento
submáximo, puede ser la más rentable teniendo en cuenta la inversión en pienso y el
rendimiento en biomasa comercializable de la explotación (Brett y Shelbourn, 1975;
Wurtsbaugh y Davis, 1977; Brett y Groves 1979; Malard et al., 1995; Xie et al., 1997; Ng
et al., 2000).
Son numerosísimos los trabajos que han explorado estas posibilidades
procurando determinar la relación entre tamaño de ración y crecimiento (Livingston y
Goiney, 1984) pero, también, entre tamaño de ración e índices de utilización del
alimento por los peces a fin de que el piscicultor disponga de información suficiente para
tomar una decisión razonable sobre este aspecto de la estrategia alimentaria.
Los efectos que el tamaño de la ración pueda tener sobre el crecimiento y la
salud de los peces vienen mediatizados por los que sobre su metabolismo intermediario
pueden significar esos aportes diferentes de nutrientes y energía que van en la ración
diaria. Consideramos pues, muy interesante que la valoración de diferentes raciones no
se base exclusivamente en datos de crecimiento/rendimiento sino que explore más en
profundidad las bases de esos datos. Por otra parte, el aporte de diferentes dosis diarias
de nutrientes y energía y sus posibles efectos sobre el metabolismo general de los peces
(Tacon y Cowey, 1985; Talbot, 1985; Metón et al., 1999, 2003; Tang et al., 2003) no sólo
afectarán al crecimiento de los mismos sino que, muy probablemente, también lo haga
sobre la composición corporal (magnitud de reservas de proteína y grasas, cantidad de
agua, etc., en distintas fracciones corporales) (Khan et al., 2004; Sun et al., 2006;
Ashmed, 2007) lo que es particularmente relevante en casos, como el que nos ocupa, en
que el destino final de esta industria es la alimentación humana. En otras palabras, el
tamaño de la ración no sólo puede condicionar el metabolismo y la salud de los animales
y, a través de ellos, su crecimiento, sino que también puede repercutir sobre la calidad
(aceptación) del producto ofertado.
132
Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés
oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
En los últimos años se ha desarrollado una creciente atención por el estudio de
los mecanismos implicados en la defensa antioxidante en los peces tanto por el interés
de los datos que pueden aportar para el estudio de la evolución filogenética de estos
importantísimos mecanismos de protección frente al estrés oxidativo como por su
aplicación en la detección de diversas fuentes de contaminación ambiental (Rabie et al.,
1972; Smith, 1976; Radi et al., 1985a, b; Roberts et al., 1987; Di Giulio et al., 1989;
Nakano et al., 1992; Filho et al., 1993; Filho y Boveris, 1993; Ross et al., 2001; Basha y
Rani, 2003; Berntssen et al., 2003; Avci et al., 2005; Martínez-Álvarez et al., 2005). Es
previsible que, entre las maniobras que puedan generar alguna forma de estrés de este
tipo se encuentre la subalimentación, parcial o total, por lo que consideramos muy
interesante realizar una aproximación a la naturaleza de estos mecanismos en la
corvina, especie para la que no existe por el momento dicha información, así como
determinar el posible efecto que distintos tamaños de ración (este ensayo) o el
ayuno/realimentación (capítulo siguiente) puedan tener sobre algunos elementos clave
de la batería de defensas antioxidantes.
En este experimento y teniendo en cuenta datos previos con ésta (Bajandas et
al., 2009a; Velazco et al., 2009) y otras especies próximas, pretendemos una
aproximación a la definición de una ración óptima para la cría de corvinas, así como los
posibles efectos del tamaño de la ración sobre el metabolismo y la composición de los
animales y el estado de estrés oxidativo. Para ello se ensayan tres tamaños de ración en
lotes duplicados de corvinas jóvenes y se valoran sus efectos cobre crecimiento,
biometría, composición de los animales, actividad de varios enzimas claves de las
principales rutas metabólicas y sobre algunos elementos del pool de defensas frente al
mencionado estrés.
VI.2. MATERIALES Y MÉTODOS.
IV.2.1. Animales, condiciones experimentales y muestreos
Los animales experimentales procedían de una puesta en cautividad, provocada
en el Centro del IFAPA “El Toruño”, a partir de progenitores salvajes mediante inducción
hormonal según el método descrito por Grau et al. (2007). El experimento se desarrolló
en las instalaciones de dicho centro con un total de 600 individuos (62.1 ± 0.5 g de peso
medio inicial) que fueron distribuidos al azar en 6 tanques, correspondientes a los 3
tratamientos experimentales por duplicado. Antes del comienzo del ensayo, los peces se
mantuvieron durante dos semanas en los tanques experimentales para su aclimatación.
133
Durante 120 días se probaron, en lotes duplicados, tres tamaños de ración diaria:
bajo (0.6% del peso corporal, lotes F06), intermedio (1.1 % del peso corporal, lotes F11)
y alto (1.6% del peso corporal, lotes F16), con el fin de determinar el efecto de la tasa de
alimentación sobre el crecimiento y la fisiología de la corvina. Los peces se alimentaron
por la mañana. Simultáneamente, en otros dos lotes, se midió la influencia del ayuno y
la realimentación con unos lotes adicionales según se describe en el siguiente
experimento (apartado V).
El pienso empleado fue uno comercial (SKRETTING, tipo C.V.6), específico para
corvina, con un tamaño de grano adecuado al de nuestros animales. La composición del
pienso aparece detallada en la tabla IV.2.1.
Tabla IV.2.1. Composición del pienso (g/kg, en sustancia seca)
Componente
Proteína bruta
Grasa bruta (extracto etéreo)
Cenizas
Material extractivo libre de nitrógeno (MELN)*
Energía** (MJ/Kg)
Relación Proteína/Energía (g/MJ)
472.0
204.7
77.2
246.1
238.3
198.0
* calculado como 1000 – (proteína bruta + extracto etéreo + cenizas)
** calculado sobre la base de 24.3, 39.7 y 17.2 KJ/g de proteína, lípidos y MELN,
respectivamente
Los tanques experimentales eran cuadrangulares, de fibra de vidrio, con una
capacidad de 4 m3, y estaban abastecidos con agua de mar (37‰ de salinidad), en un
circuito con un flujo continuo de 5 L/min (dos renovaciones completas por día). El
fotoperíodo operante durante el experimento fue el natural. La aireación se realizaba a
través de un sistema general de la instalación gracias a grupos electrosoplantes, que
conducía el aire a cada tanque. La concentración de oxígeno durante todo el
experimento estuvo por encima de 6 mg/L (ppm) (niveles de saturación superiores al
87%). La temperatura media del agua a lo largo del periodo experimental fue 18.9 ± 0.1
°C. Además, las cantidades de amonio y nitrito se mantuvieron siempre muy por debajo
de las concentraciones consideradas perjudiciales (2 ppm), gracias a la alta tasa de
renovación y buena calidad del agua empleada, así como a las buenas prácticas de
mantenimiento.
Para el mantenimiento de los peces se procedía a una limpieza diaria. Cada uno
de los tanques contaba con un rebosadero y una red de protección, para evitar que los
animales saltaran fuera del tanque de forma accidental.
134
Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés
oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
Los animales se pesaron individualmente al inicio del periodo de aclimatación.
Durante las dos semanas de ese periodo todos los lotes fueron alimentados con la
misma ración diaria. El día del inicio del experimento propiamente dicho, se realizaron
medidas biométricas externas de 20 individuos por lote (tras anestesia ligera con 2fenoxietanol 0.1 mg/L) determinándose el peso, la longitud total y la altura máxima. De
los 20 individuos por lote destinados a medidas externas, 3 de ellos (6 por tratamiento)
se sacrificaron con una dosis letal de anestésico (2-fenoxietanol 0.35 mg/L), y se
diseccionaron para determinar el peso de hígado, digestivo, paquete visceral y del filete
del lado derecho. A continuación se implantó el racionamiento diferenciado antes
mencionado. Muestreos similares al descrito se llevaron a cabo los días 20, 40, 60, 80,
100 y 120 del experimento. A partir de la estimación de la biomasa total presente en
cada tanque en los días de muestreo se recalculó la ración total a suministrar a cada uno
para mantenerla lo más homogénea y ajustada a los valores previstos.
A partir del día 60 del experimento, además de los muestreos y determinaciones
de rutina antes citados, el músculo del lado derecho del pez se reservó para determinar
su composición bioquímica, el hígado y una porción del músculo del lado izquierdo se
destinaron a la determinación de actividades enzimáticas, tanto del metabolismo
intermediario, como de los indicadores del estrés oxidativo.
IV.2.2. Procesado de las muestras.
Los días indicados y, tras un ayuno de 24 horas, se sacrificaron los peces
integrantes de cada muestra.
El hígado y una porción de músculo blanco de la parte anterior dorsal de los
peces fueron diseccionados, congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80 °C
hasta que se usaron para los estudios metabólicos en las instalaciones de la UGR. Los
tejidos se homogenizaron según se detalla en el apartado IX de esta Memoria.
IV.2.3. Parámetros biométricos y composición química
A partir de los datos de esos muestreos, se calcularon el incremento de peso
(GAP) de los peces, así como varios índices de crecimiento y utilización de la dieta, como
son IRP, SGR, TCA o FCR, TEA o FER e índices biométricos, K, IHS, IVS, IDS y RF (ver
apartado IX).
Los peces muestreados para análisis de la composición química fueron
almacenados en hielo y transportados hasta las instalaciones de la UGR. Se diseccionó la
135
parte derecha del músculo y se procedió a la determinación de la composición según se
detalla en el apartado IX Metodología.
IV.2.4. Análisis de la actividad enzimática
Los ensayos enzimáticos en hígado y músculo se realizaron según se detalla en el
citado apartado IX: Metodología de esta Memoria. Se determinaron las siguientes
actividades enzimáticas relacionadas con el metabolismo intermediario: Acetoacetil CoA
Tiolasa (ACoAT; EC 2.3.1.9), Citrato Sintasa (CS; EC 4.1.3.7), Enzima Málico (EM; EC
1.1.1.40) Fructosa 1,6-bisfosfatasa (FBPasa; EC 3.1.3.11), Glucosa 6-fosfato
Deshidrogenasa (G6PDH; EC 1.1.1.49), Glutamato Dehidrogenasa (GDH; EC 1.4.1.2),
Glutamato Oxalacetato Transaminasa (GOT; EC 2.6.1.1), Glutamato Piruvato
Transaminasa (GPT; EC 2.6.1.2), Glicerol Kinasa (GyK; EC 2.7.1.30), Hexokinasa (HK; EC
2.7.1.1), β-Hidroxiacil CoA Deshidrogenasa (HOAD; EC 1.1.1.35), Lactato Deshidrogenasa
(LDH; EC 1.1.1.27) y Piruvato Kinasa (PK; EC 2.7.1.40), Además, se valoraron las
siguientes relacionadas con el estrés oxidativo: Catalasa (CAT; EC 1.11.1.6.), DT-diaforasa
(DTD; 1.6.99.2.), Glutation Peroxidasa (GPX; EC 1.11.1.9.), Glutation Reductasa (GR;
1.6.4.2.), Glutation Transferasa (GST; 2.5.1.18), Superóxido Dismutasa (SOD; 1.15.1.1.) y
la presencia de Sustancias Reactivas al Ácido Tiobarbitúrico (TBARs) o Malondialdehído
(MDA) como índice de daño oxidativo. También se determinó el contenido en glucógeno
en hígado y músculo blanco.
IV.2.5. Análisis estadístico
Para valorar estadísticamente el efecto de los tratamientos y, dentro de cada
tratamiento, la posible evolución temporal de los distintos parámetros, se utilizó el
análisis de la varianza de una vía (ANOVA) seguido el test de Duncan (Duncan, 1955) (P <
0.05) usando el paquete estadístico SPSS 15.0 para Windows.
IV.3. RESULTADOS
IV.3.1. Crecimiento
En las tablas IV.3.1. y IV.3.2. se exponen algunos datos de crecimiento y
aprovechamiento de la dieta para las corvinas alimentadas con los distintos tamaños de
ración diaria; el tratamiento F06 provocó un menor crecimiento, pues los peces
alcanzaron un menor peso final y longitud total, estas diferencias se comenzaron a
observar transcurridos tan sólo 20 días de experimento. Los tratamientos F11 y F16 no
provocaron diferencias significativas de estos índices al final del periodo experimental.
136
Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés
oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
En la tabla IV.3.2. se observa, como se ha indicado antes, el mayor crecimiento
de las corvinas con las raciones F11 y F16, sin embargo se detectó un mejor
aprovechamiento de la dieta en aquellas que se alimentaron al 0.6% peso/día (F06), en
este caso, el F16 (ración más alta) fue el tratamiento que presentó los peores índices de
aprovechamiento.
Tabla IV.3.1. Evolución temporal de varios índices biométricos de las corvinas
alimentadas, durante 120 días, con distintas raciones diarias: F06 (0.6% peso/día), F11
(1.1% peso/día) y F16 (1.6% peso/día).
Días
0
20
40
60
80
100
120
F06
Longitud
Total (cm)
F11
F16
F06
Peso (g)
F11
F16
F06
K
F11
F16
19.03a
19.72b,1
20.35c,1
21.47d
22.20e
23.26f.1
23.51f,1
0.17
0.16
0.108
0.19
0.21
0.24
0.16
18.88a
20.20b,2
20.98.c,2
21.94d
22.51e
24.01f.2
24.30f,2
0.19
0.14
0.133
0.16
0.25
0.18
0.18
18.78a
19.93b,1-2
20.56c,1
21.90d
22.87e
23.35e.1
24.19f,2
0.19
0.12
0.14
0.18
0.23
0.27
0.17
79.42a
87.57ab,1
94.45b,1
104.70c,1
112.60c,1
123.87d,1
135.14d,1
1.850
1.55
1.69
2.93
3.30
4.30
2.96
79.87a
95.20b,2
104.20b,2
114.75c,2
124.25c,2
135.57d,2
146.90d,2
2.457
2.171
2.15
2.89
4.24
3.43
3.68
77.45a
90.95b,1-2
97.37b,1
113.27c,2
126.17d,2
133.5d,2
144.75e,2
2.632
1.86
2.14
3.11
3.95
4.51
3.29
1.15b
1.13b
1.11b
1.05a,1
1.02a,1
1.04a
1.03a
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
1.17f
1.14e
1.11d
1.08c,2
1.07c,2
1.05b
1.01a
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
1.15f
1.14e
1.10d
1.07c,1-2
1.05c,1-2
1.03b
1.01a
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
Los valores son media ± EEM (N=20) para todos los muestreos excepto para el día 120, donde N=40. Diferentes letras
indican diferencias significativas (P<0.05) a lo largo del tiempo. Diferentes números indican diferencias
significativas(P<0.05) entre tratamientos.
K: Índice de condición.
Tabla IV.3.2. Crecimiento y eficacia de utilización del alimento de las
corvinas alimentadas, durante 120 días, con distintas raciones
alimentarias, F06 (0.6% peso/día), F11 (1.1% peso/día) y F16 (1.6%
peso/día).
F06
GAP
55.71
IRP
70.42
SGR
0.44
TCA
1.321
FER
0.763
PER
1.613
3.04
6.73
0.03
0.07
0.04
0.08
F11
67.03
83.97
0.51
2.392
0.422
0.892
3.93
5.73
0.03
0.16
0.03
0.06
F16
67.30
87.30
0.52
3.123
0.321
0.681
3.30
8.43
0.04
0.19
0.02
0.04
Los valores son media ± EEM de dos lotes experimentales. Diferentes números indican diferencias
significativas (P<0.05) entre tratamientos.
GAP: Ganancia Absoluta de Peso; IRP: Incremento Relativo de Peso; SGR: Tasa de Crecimiento
Específico; TCA: Tasa de Conversión del Alimento; FER: Tasa de Eficiencia Alimentaria; PER:
Coeficiente de Eficiencia Proteica;
137
IV.3.2. Índices biométricos
En la tabla IV.3.3. se expone el efecto de los distintos tamaños de ración diaria
sobre algunos parámetros biométricos.
Los índices viscerosomático (IVS), digestosomático (IDS) y de rendimiento del
filete (RF) no presentaron diferencias más allá de las ocurridas durante el crecimiento de
los individuos, es decir, los distintos niveles de ración no los afectaron. No obstante, se
observó que el tamaño de ración sí tuvo un efecto sobre el índice hepatosomático (IHS):
en la mayor parte del periodo experimental, este índice fue superior para el tratamiento
F11 y F16, siendo incluso significativamente mayor en F11 al final del periodo
experimental.
Tabla IV.3.3. Evolución temporal de algunos índices biométricos de las corvinas
alimentadas, durante 120 días, con distintas raciones alimentarias, F06 (0.6%
peso/día), F11 (1.1% peso/día) y F16 (1.6% peso/día).
0
20
40
60
80
100
120
F06
IHS
F11
F16
F06
IVS
F11
F16
F06
IDS
F11
F16
F06
RF
F11
F16
2.83b
3.15b.12
2.70b
2.24a
1.76a
1.70a,1
1.87a,1
0.20
0.20
0.28
0.10
0.15
0.23
0.12
2.77c
3.22c.2
2.76c
2.29b
2.04ab
1.76a,1
2.13ab,2
0.14
0.14
0.11
0.11
0.15
0.21
0.08
2.97c
2.82c.1
2.62c
2.43bc
2.16ab
2.07ab,2
1.76a,1
0.23
0.23
0.49
0.11
0.16
0.10
0.13
11.01
11.21
10.88
10.54
9.17
10.42
9.17
0.65
0.46
0.73
0.99
0.54
0.87
1.34
11.94d
12.64d
11.06c
9.47ab
9.84b
8.77ab
8.29a
0.22
0.42
0.28
0.28
0.23
0.61
0.34
11.78bc
12.58c
11.86b
11.14b
9.18ab
9.19ab
8.19a
0.78
0.88
0.78
0.68
0.59
0.27
0.52
2.39b
2.35ab
2.30ab
2.28a
2.05a
2.03ª
1.87ª
0.18
0.15
0.25
0.14
0.17
0.17
0.03
2.22b
2.23b
2.21b
2.14b
2.00ab
2.12b
1.78a
0.30
0.16
0.14
0.07
0.09
0.08
0.09
2.49b
2.50b
2.43b
2.31b
2.02a
2.07a
1.99a
0.26
0.21
0.13
0.09
0.08
0.08
0.04
39.54a
40.11a
41.22ab
42.49b
40.88ab
45.02c
44.44c
1.50
2.03
1.94
3.57
1.09
0.46
0.48
39.19a
41.61ab
42.35b
46.57c
42.28b
44.31bc
44.10bc
1.00
1.99
1.57
5.33
0.68
0.95
0.36
39.32a
40.21a
41.32ab
40.21a
42.17b
44.63c
44.36c
1.03
2.34
1.35
3.78
0.32
0.49
0.29
Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) a lo largo del tiempo.
Diferentes números indican diferencias significativas (P<0.05) entre tratamientos.
IHS: Índice hepatosomático; IVS: Índice viscerosomático; IDS: Índice digestosomático; RF: Rendimiento del filete
Se pudo observar una disminución significativa de los índices IHS, IVS e IDS a lo
largo del periodo experimental, mientras que el RF mostró una tendencia a aumentar.
138
Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés
oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
IV.3.3. Composición
En cuanto a la composición del músculo e hígado de las corvinas sometidas a
distintas raciones diarias (tabla IV.3.4.) se observaron pocos cambios que, en cualquier
caso sólo se hicieron patentes el día 120 o último del ensayo. No obstante, las corvinas
alimentadas con una ración diaria del 1.1% peso/día presentaron menor proporción de
agua, lípidos y cenizas y mayor proporción de glucógeno y proteínas en músculo, aunque
estas diferencias fueron significativas sólo para agua y cenizas al final del periodo
experimental.
En lo que respecta glucógeno hepático se observó una tendencia a disminuir con
el avance del experimento en todos los tratamientos, encontrándose, al final, diferencias
significativas entre tratamientos, siendo los valores en los lotes F11 los más altos.
IV.3.4. Actividades enzimáticas del metabolismo intermediario
Las actividades de algunas enzimas indicadoras del metabolismo intermediario se
determinaron los días 60 y 120 del experimento (tablas IV.3.5. y IV.3.6.). Se pudo
apreciar que el metabolismo pareció verse afectado por el tamaño de la ración
suministrada, de modo que el día 60 de experimento aparecieron diferencias en las
actividades de algunas de las enzimas indicadas, mientras que al día 120, o final del
experimento, estas diferencias persistieron y aparecieron algunas otras.
En líneas generales, en el tratamiento F11 se hace patente el mantenimiento de
las actividades de la mayoría de las enzimas del metabolismo intermediario entre los
días 60 y 120; siendo las corvinas alimentadas con las dos raciones más extremas las que
presentaron mayores diferencias.
IV.3.4.1. HÍGADO
Al días 60 del experimento, la hexokinasa (HK) mostró una mayor actividad en los
peces que recibieron menor ración, mientras que el día 120 se detectó la situación
contraria. La lactato deshidrogenasa (LDH) también se vio afectada desde el día 60 de
experimento, de modo que la ración más alta provocó una menor actividad de esta
enzima, situación que se prolongó hasta el día 120. La actividad piruvato kinasa (PK)
presentó una relación directa con los niveles dietarios el día 60; sin embargo, el día 120
se encontró que la relación era inversa. La fructosa 1,6 bisfosfatasa (FBPasa) se vio
influida por el tamaño de ración desde el día 60 en la misma forma en que lo fue la HK.
139
La actividad de glicerol kinasa (GyK) no se vio afectada en los primeros 60 días de
experimento, siendo constatables los efectos del tamaño de ración el día 120, en el que
el menor tamaño de ración se correspondió con una menor actividad de este esta
enzima. La 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa (HOAD) no pareció verse influida en ningún
momento por el tamaño de la ración.
Las actividades de enzima málico (EM) y de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa
(G6PDH), presentaron comportamientos similares el día 120 del experimento, siendo
significativamente mayores en los animales que recibieron la ración más alta. La
actividad G6PDH estaba aumentada en esos mismos animales, mientras que la actividad
del EM era menor en los F06.
La glutamato deshidrogenasa (GDH) es otra enzima que no se vio influenciada el
día 60 del experimento pero, al final del mismo, esa actividad era mayor en aquellas
corvinas que recibieron un mayor tamaño de ración.
Las actividades de glutamato oxalacetato transaminasa (GOT) y de glutamato
piruvato transaminasa (GPT) presentaron la misma tendencia: el día 60 ya se hicieron
patentes los efectos positivos del aumento del nivel dietario; pero el día 120 se observó
que la actividad de estas enzimas disminuyó para F06 y aumentó para F16.
Las actividades de acetoacetil-CoA tiolasa (ACoAT) y citrato sintasa (CS) no se
vieron afectadas en ningún momento por el tamaño de la ración.
IV.3.4.2. MÚSCULO
Aunque el tamaño de la ración pareció afectar a la actividad de bastantes
enzimas hepáticas, dichos efectos fueron mucho menores en músculo. No obstante, sí
que se detectaron algunos cambios, sobre todo en aquellas enzimas relacionadas con el
metabolismo de los carbohidratos (tabla IV.3.6.).
Previamente, debemos destacar la incapacidad de detectar la actividad G6PDH
en el músculo de las corvinas, ya que parece ser tan baja que no nos fue posible medirla
con la técnica empleada.
El día 60 del experimento, LDH, PK y FBPasa presentaron las mayores actividades
en el tratamiento F11 y las menores en F16, mientras que la HK mostró su actividad más
baja en F06. Sin embargo, el día 120 las tres primeras enzimas presentaron sus máximos
para las corvinas alimentadas al 0.6% mientras que la HK no se vio afectada.
140
F16
F11
F06
F16
F11
F06
Lípidos
6.87
0.55
7.32
0.53
7.13
0.80
6.84
0.31
6.44
0.58
6.74
0.67
Humedad
77.85
0.13
77.30
0.27
77.48
0.23
77.86xy
0.15
77.37x
0.22
78.06y
0.17
3.99
87.51
4.32
88.41
2.06
87.86
4.11
86.42
3.15
87.09
2.98
87.93
Proteínas
Músculo
0.05
6.00y
0.06
5.84x
0.03
6.09y
0.13
5.97
0.13
6.13
0.06
6.09
Cenizas
0.04
1.83
0.08
1.83
0.06
1.76
0.04
1.87
0.03
1.88
0.06
1.97
Glucógeno
3.52
54.11x
4.18
67.85y
4.93
57.09xy
11.12
81.08
5.70
90.16
5.94
96.53
Glucógeno
3.01
62.82
2.40
57.18
4.18
62.12
1.17
53.08
5.99
62.95
5.43
58.93
Proteínas
Hígado
Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) entre tratamientos, día 60 (a,b,c…) y día 120 (x,y,z…).
Humedad: % agua. Lípidos: % extracto etéreo en sustancia seca. Cenizas: % cenizas en sustancia seca. Proteínas: % en sustancia seca. Glucógeno: mg/g
de tejido.
120
60
Día
Tabla IV.3.4. Efecto del tamaño de la ración diaria (F06: 0.6% peso, F11:1.1% peso y F16: 1.6% peso) sobre la
composición del músculo e hígado de corvinas.
Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés
oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
El tamaño de la ración sí que influyó sobre la actividad GDH al final del ensayo,
siendo mayor en aquellos animales alimentados con la ración de menor tamaño.
141
Tabla IV.3.5. Efecto del tamaño de la ración diaria (F06: 0.6% peso, F11: 1.1% peso y F16: 1.6% peso) sobre la actividad específica
F11
F06
F16
F11
F06
FBPasa
G6PDH
GDH
HK
0.57
9.48ab
HOAD
3.64
88.16b
LDH
1.24
39.33a
PK
3.92
GyK
EM
0.40
3.26b
GPT
CS
80.82 414.52b 103.85b 25.03
GOT
ACoAT
1.70
21.18b
22.66
312.11a 68.13a
24.95
3.26
29.06
34.41
10.54
6.55
6.48
16.34
2.92
0.93
11.70b
9.42
0.28
5.19
55.76b
2.55b
5.02
64.42a
2.14
0.86
9.09a
10.30
1.94
13.97
1.53
107.15x 23.69x
5.79
113.65x 39.49y
11.64
154.76y 26.21x
0.13
0.86
9.87
1.33
0.08
1.61x
1.02
11.28
1.04
0.22
1.07
12.78
2.11xy
0.23
1.87
1.72
2.28y
20.37y
15.11x
1.36a
21.53
2.10
0.91
12.31b
5.87
82.44
10.48
0.83
8.50b
2.09
20.09b
14.75
2.41
22.40
1.08
11.25b
6.51
3.55
0.40
4.03a
12.14
111.12y 433.51y 161.14y 21.64y
5.63
73.45x 374.20xy 82.09x
7.25
80.18x 306.97x 75.58x
7.79
88.72 414.76b 113.74b 21.24
1.11
0.95
11.85a
19.23
0.78
7.99a
3.67
0.82
7.07b
48.14
2.15
1.01
17.87x
20.95
1.12
11.55x
2.23
0.21
3.00x
43.95
1.51
19.39
2.00
22.37x
4.13
0.93
12.90x
42.42
0.48
4.25x
2.70
29.31y
1.26
1.69
17.74y
19.63
0.57
6.04y
1.93
1.58
23.33
42.24
4.87
50.36
101.24b 34.44a
48.45
(mU/mg de proteína) de algunas enzimas implicadas en el metabolismo intermediario del hígado de corvinas.
Día
60
120
F16
Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) entre tratamientos, día 60 (a,b,c…) y día 120 (x,y,z…).
ACoAT: Acetoacetil CoA Tiolasa; CS: Citrato Sintasa; EM: Enzima Málico; FBPasa; Fructosa Bisfosfatasa; G6PDH: Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa; GDH: Glutamato Deshidrogenasa;
GOT: Glutamato Oxalacetato Transaminasa; GPT Glutamato Piruvato Transaminasa; GyK: Glicerol Kinasa; HK: Hexokinasa; HOAD: 3-hidroxiacil CoA Deshidrogenasa; LDH: Lactato
Deshidrogenasa; PK: Piruvato Kinasa.
142
143
F16
F11
F06
F16
F11
F06
CS
20.90
1.02
21.01
1.77
19.82
1.03
21.11
1.94
19.53
1.61
23.68
2.33
ACoAT
1.83
0.08
1.52
0.13
1.56
0.13
1.71
0.05
1.74
0.14
1.70
0.09
0.19
1.10
0.09
1.06
0.15
1.18
0.41
4.80y
0.37
2.50x
0.81
n.d
n.d
1.15
13.34x
1.29
20.92y
1.72
23.08y
n.d
4.63y
24.30
1.97
22.11
1.63
24.41
GDH
2.04
n.d
n.d.
n.d.
G6PDH
0.08
1.57a
1.47ab
0.15
0.20
2.16b
1.05a
0.16
0.13
1.52a
1.59b
0.14
FBPasa
EM
10.66
110.39
9.35
102.30
6.17
103.83
11.81
117.49
11.57
119.45
9.25
112.45
GOT
0.85
9.89
0.99
10.79
1.19
12.39
0.69
9.31
0.97
10.17
0.76
8.99
GPT
4.57
46.73
4.47
47.25
5.29
57.10
3.37
40.58
4.08
48.97
2.81
43.33
GyK
0.13
1.17
0.09
1.29
0.10
1.38
0.12
1.16b
0.13
1.13b
0.07
0.61a
HK
0.19
2.15
0.21
2.01
0.20
2.31
0.19
2.39
0.23
2.33
0.12
2.30
HOAD
4.28
775.17x
121.97
1473.58y
178.12
1944.18z
62.31
972.25a
129.69
1441.73b
111.61
1175.15ab
LDH
85.41
1113.63xy
51.13
1006.55x
99.58
1302.82y
43.32
465.03a
58.04
736.10b
43.32
620.43ab
PK
Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) entre tratmientos, día 60 (a,b,c…) y día 120 (x,y,z…).. n.d.: no detectada.
ACoAT: Acetoacetil CoA Tiolasa; CS: Citrato Sintasa; EM: Enzima Málico; FBPasa; Fructosa Bisfosfatasa; G6PDH: Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa; GDH: Glutamato Deshidrogenasa;
GOT: Glutamato Oxalacetato Transaminasa; GPT Glutamato Piruvato Transaminasa; GyK: Glicerol Kinasa; HK: Hexokinasa; HOAD: 3-hidroxiacil CoA Deshidrogenasa; LDH: Lactato
Deshidrogenasa; PK: Piruvato Kinasa.
120
60
Día
Tabla IV.3.6. Efecto del tamaño de la ración diaria (F06: 0.6% peso, F11: 1.1% peso y F16: 1.6% peso) sobre la actividad
específica (mU/mg de proteína) de algunas enzimas implicadas en el metabolismo intermediario del músculo de corvinas.
Sergio García Mesa
IV.3.5. Estrés oxidativo
IV.3.5. 1. HÍGADO
El tamaño de la ración pareció influir en algunos parámetros indicadores del
estrés oxidativo en el hígado de las corvinas (tabla IV.3.7.).
TablaIV.3.7. Efecto del tamaño de la ración diaria (F06: 0.6% peso, F11: 1.1%
peso y F16: 1.6% peso) sobre la actividad de algunas enzimas indicadoras del
estrés oxidativo y nivel de peroxidación lipídica en el hígado de corvinas.
Día
F06
60
F11
F16
F06
120
F11
F16
CAT1
DTD2
GPX2
GR2
GST2
SOD1
TBARs3
48.81ab
5.91b
90.26
5.18
52.07b
60.89
44.19
4.11
0.58
7.36
0.49
4.45
5.20
3.06
53.71b
3.07a
81.59
4.43
36.71a
57.62
50.00
4.03
0.30
6.27
0.35
2.88
5.03
2.60
38.84a
4.91b
91.04
5.32
45.54ab
57.95
61.21
2.62
0.36
2.91
0.40
2.59
3.88
4.04
44.34xy
5.62y
78.95y
3.84y
75.69z
59.31y
35.52x
4.05
0.51
5.60
0.24
3.64
3.48
1.54
48.91y
4.25x
72.42y
4.01y
34.37y
52.15xy
45.57x
3.82
0.43
6.00
0.22
1.33
3.87
3.31
36.64x
3.45x
52.29x
3.11x
24.40x
46.07x
78.57y
1.98
0.34
3.12
0.20
1.89
4.37
6.88
Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) entre
tratamientos, 60 (a,b,c…) y día 120 (x,y,z…).
1
2
3
Expresado como U/mg proteína. Expresado como mU/mg proteína. Expresado como nmol MDA/g tejido.
CAT: catalasa; DTD: DT-diaforasa; GPX: glutation peroxidasa; GR: glutation reductasa; GST: glutation
transferasa; SOD: superóxido dismutasa; TBARs: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico
De forma general se observó que las corvinas sometidas a raciones más
restrictivas presentaban mayores niveles de actividad en algunas enzimas antioxidantes.
Esta situación se acentuó y extendió a todas las actividades enzimáticas el día 120,
presentando F06 los mayores registros para las defensas antioxidantes, que fueron
intermedios para F11 y menores en F16. Por lo tanto, los valores de daño oxidativo
fueron superiores para F16 y menores para F06.
IV.3.5.2. MÚSCULO
En músculo, en el que no pudimos detectar actividad catalasa con la técnica
empleada, el efecto del tamaño de la ración sobre los otros parámetros indicativos de
estrés oxidativo (tabla IV.3.8.) no fue tan significativo como en el hígado.
Así, conviene destacar el poco efecto de los tamaños de ración sobre la actividad
de las enzimas antioxidantes determinada en el día 60. Al final del experimento, tan sólo
144
Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés
oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
se observó un efecto de los niveles dietarios en dos enzimas, la DT-diaforasa (DTD) y la
glutation reductasa (GR), que responde a las tendencias que se ha destacado, mayor
actividad en aquellos tratamientos en que la restricción alimentaria era mayor. No
obstante el daño oxidativo (medido por la determinación de TBARs) no presentó
diferencias significativas atribuibles al tamaño de la ración.
.
Tabla IV.3.8. Efecto del tamaño de la ración diaria (F06: 0.6% peso, F11: 1.1%
peso y F16: 1.6% peso) sobre la actividad de algunas enzimas indicadoras del
estrés oxidativo y nivel de peroxidación lipídica en el músculo de corvinas.
CAT1
Día
F06
60
120
F11
GR2
GST2
SOD1
TBARs3
2.32
12.32
0.27
5.03
13.36a
31.34a
n.d.
n.d.
F06
n.d.
F16
GPX2
n.d.
F16
F11
DTD2
n.d.
n.d.
0.09
0.66
0.02
0.50
0.72
5.66
1.91
14.77
0.33
4.90
15.71b
39.72a
0.18
1.02
0.03
0.28
0.75
2.52
1.96
13.61
0.32
5.13
15.33b
13.36b
0.11
0.80
0.01
0.36
0.38
0.54
2.20xy
13.39
0.36y
4.32
15.51
15.98
0.12
0.56
0.03
0.27
1.25
1.05
1.69x
12.19
0.31y
4.24
12.59
19.04
0.17
0.86
0.02
0.35
0.91
1.88
2.37y
13.53
0.49x
4.20
14.77
18.94
0.21
0.96
0.04
0.34
1.08
1.68
Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) entre
tratamientos, 60 (a,b,c…) y día 120 (x,y,z…).
1
2
3
Expresado como U/mg proteína. Expresado como mU/mg proteína. Expresado como nmol MDA/g tejido.
CAT: catalasa; DTD: DT-diaforasa; GPX: glutation peroxidasa; GR: glutation reductasa; GST: glutation
transferasa; SOD: superóxido dismutasa; TBARs: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico. n.d.. no
detectada.
IV.4. DISCUSIÓN
La gestión de la alimentación en términos de la optimización de la tasa
alimentaria se ha convertido en una exigencia en el cultivo de peces siendo una de las
áreas cruciales de investigación en piscicultura. Controlando la ración alimentaria
óptima definida, según Brett et al., (1969) y Elliot (1975), como la ración que
proporciona el mejor crecimiento con la menor ingesta de alimento, los piscicultores
pueden reducir el coste del alimento y maximizar el crecimiento y también son capaces
de mejorar otros factores como la variación del tamaño de los individuos y la calidad del
agua (Marimuthu et al., 2001). Al tratarse de una especie relativamente nueva en
piscicultura, aún son necesarios estudios sobre este tema en el caso de la corvina.
Los resultados de este experimento (tabla IV.3.1.) indican que las corvinas
alimentadas con la ración más baja de las ensayadas (0.6% peso corporal/día, lotes F06)
145
Sergio García Mesa
presentaron un crecimiento más reducido, sin embargo éste fue prácticamente similar
para los lotes que recibieron las raciones intermedia (1.1 %peso corporal/día, lotes F11)
y alta (1.6% peso corporal/día, lotes F16) lo que parece indicar un peor
aprovechamiento del alimento en estas últimas en relación con F11.
Es normal en peces y otros animales que la relación entre tamaño de ración y
crecimiento no sea lineal, sino curvilínea, del tipo de la que se expone en la figura IV.4.1.
La no proporcionalidad entre ración y crecimiento significa que el grado de utilización
del mismo varía según el tamaño de aquella. En nuestro caso observamos como el FER
va cayendo (peor uso del pienso para crecimiento) a medida que la ración aumenta; en
otras palabras, el crecimiento (SGR) y la utilización del alimento (FER o TCA) no son los
mejores a la misma ración (Xie et al., 1997; Fang et al., 2010). En nuestro caso las
corvinas que mejor crecen no son la que mejor utilizan el alimento y viceversa.
1
0.60
0.55
0.8
0.50
0.6
0.45
0.4
0.40
0.2
0.35
0
0.30
0.5
0.7
0.9
1.1
1.3
1.5
1.7
Tamaños de ración (% peso biomasa/día)
Figura IV.4.1. Efecto del tamaño de la ración sobre SGR ( ), eje de la izquierda,
y FER ( ), eje de la derecha).
En principio, y desde el punto de vista comercial, la ración F11 sería la más
conveniente (óptima) en este caso ya que los peces alimentados con ella crecen
prácticamente lo mismo que los que consumen una ración casi un 50% mayor (F16). La
ración F06, pese a ser muy bien aprovechada no es suficiente para producir un
crecimiento aceptable. La definición de una ración óptima no sólo es de interés
comercial sino también ecológico, pues muy probablemente reduzca los desechos
sólidos al medio (Brett et al., 1969; Elliot, 1975; Khan et al., 2004; Desai et al., 2009). Son
numerosos los estudios que indican que las mejor utilización del alimento se da para
raciones submáximas (Wurstbaugh y Davis, 1977; Cox y Coutant, 1981; Cui y Wooton,
146
Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés
oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
1998; Hasan y Macintosh, 1991; Li y Lovell, 1992; Van Ham et al., 2003 y Sun et al.,
2006).
En cuanto a la retención proteica (PER) (tabla IV.3.2.), dado que todos los peces
fueron alimentados con el mismo pienso, los datos son reflejo de los de utilización
general del pienso, esto es, significativamente mejores para el tratamiento F06,
presentado F11 valores intermedios, en torno a 1, lo que indica que, en este caso, las
corvinas ganan un gramo de peso por cada gramo de proteína que consumen.
En un experimento de Bajandas et al., (2009a, b), las corvinas presentaron un
crecimiento óptimo con raciones de 2.5-5% peso corporal/día pero, en ese caso, se
trataba de corvinas más jóvenes (6 y 20 gramos) y es bien sabido que en la mayoría de
los peces de acuicultura, el tamaño de la ración óptima (cuando se expresa en relación al
peso del animal) disminuye al crecer el pez (Niimi y Beamish, 1974; Staples y Nomura,
1976; Xie et al., 1997).
A la hora de comparar los resultados de crecimiento de este experimento con los
obtenidos en otros ensayos encontramos datos algo variables. En efecto los SGR en este
caso (0.4-0.5) son inferiores a los reportados por otros autores como Piccolo et al.
(2008) o Chatzifotis et al. (2011) pero superiores a los de Ortega y De la Gándara (2007).
Otros experimentos recogidos en esta Memoria presentan un SGR para corvina del
rango 0.5-0.6. Es obvio que para que estas comparaciones sean válidas deberían tener
en cuenta factores tan importantes como la composición del pienso, el tamaño de la
ración, la edad de los animales, las condiciones ambientales, la raza o variedad, etc. Sin
embargo, los índices de crecimiento y eficiencia alimentaria aquí descritos son similares
a los presentados por otros especies de peces marinos cultivados (Company et al., 1999;
Peres y Oliva-Teles, 1999; Chou et al., 2001; Regost et al., 2001; Wang et al., 2005;
Espinós et al., 2003).
Algunos autores (Goddard, 1996; Puvanendran et al., 2003) indican que si los
peces se alimentan con raciones reducidas, los más grandes y/o agresivos comen a
expensas de los más pequeños. Es decir, diferencias en el tamaño corporal podrían tener
un impacto significativo en la capacidad de los peces para competir socialmente lo que
podría reflejarse en un menor crecimiento global del grupo. En este experimento no se
ha observado esta posible jerarquización, pues los coeficientes de variación obtenidos
en los distintos lotes son muy similares (F16: 21%; F11: 23% y F06: 21%).
A menudo, algunos índices como el de condición (K), el hepatosmático (IHS) y el
digestosomático (IDS) (tablas IV.3.1. y IV.3.3) se usan para valorar el estado nutricional
147
Sergio García Mesa
de los peces, porque se pueden determinar fácil y rápidamente (Rueda et al., 1998;
Gaylord y Gatlin, 2000; Qian et al., 2000; Zhu et al., 2001; Cho et al., 2006). En nuestro
caso, como se indica antes, ni K ni el IDS presentaron efecto alguno derivado por los
distintos tamaños de ración administrados, lo que indica que dentro de cada lote los
animales están creciendo isométricamente.
Con respecto a la composición química del animal, Shearer (1994) revisó varios
trabajos desarrollados en salmónidos, prestando especial atención a la composición
proximal en función del tamaño de ración que recibían concluyendo que los niveles de
proteína y cenizas venían determinados por el tamaño del animal (endógenamente
controlado), que los lípidos dependían de factores endógenos y exógenos (tamaño del
pez, dieta, demanda metabólica) y que la humedad está inversamente relacionada con
el contenido de lípidos corporales. Estos postulados están de acuerdo con los resultados
obtenidos por otros autores (Van Ham et al., 2003; Khan et al., 2004; Ahmed, 2007),
aunque también se ha descrito que distintos tamaños de ración no tienen efecto en la
composición de los nutrientes corporales (Xie et al., 2001).
En este experimento encontramos poco efecto del tamaño de ración sobre la
composición proximal del músculo e hígado. No obstante, las corvinas del tratamiento
F11 presentaban un menor contenido de agua, aunque tal hecho no se reflejó en la
proporción de lípidos en músculo, sí se acompañó de un descenso del contenido de
cenizas en este tejido, hecho descrito anteriormente en aquellas raciones citadas como
óptimas en Cirrhinus mrigala (Khan et al., 2004).
En cuanto al hígado se observó que el contenido de glucógeno fue
significativamente superior en las corvinas F11, lo que coincidía con un IHS
significativamente mayor en las mismas al final del experimento. La explicación de un
mayor contenido de glucógeno hepático en aquellas corvinas alimentadas a una ración
intermedia, podría estar en que esta ración, más próxima al óptimo, provoca que las
reservas energéticas estén disponibles en proporciones equilibradas, al contrario de lo
que se podría encontrar en peces alimentados por encima y por debajo de este nivel,
produciendo las reservas lipídicas un desplazamiento de las de glucógeno; tal hipótesis
debería someterse a más verificación, prestando atención a estas fracciones de reserva,
pues se ha descrito tanto que, en algunas ocasiones, la restricción parcial o total de
alimento produce una acumulación de lípidos en hígado (Pérez-Jiménez, 2008) como
que raciones mayores provocan siempre una mayor acumulación de lípidos en general
(Khan et al., 2004; Ahmed et al., 2007).
148
Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés
oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
Distintos tamaños de ración diaria significan un diferente aporte de sustratos a
las distintas rutas metabólicas, por lo que podría pensarse que eso repercutiera en la
actividad de diversos enzimas clave de esas rutas. En la tabla IV.3.5. se exponen los
datos obtenidos a este respecto con los tres tamaños de ración ensayados. En términos
generales, aunque a los 60 días del inicio de la alimentación diferenciada ya se
observaron algunos efectos, estos fueron más notables a los 120 días (figura IV.4.3.).
El aumento del tamaño de ración implica uno parejo de los distintos
componentes que forman el pienso. En la mayoría de los estudios, sin embargo, se
investiga el efecto de la mayor o menor presencia de uno de los componentes del pienso
en el metabolismo intermediario, de modo que el efecto de la adición/reducción de
carbohidratos, proteínas y lípidos se ha estudiado de forma separada.
La actividad de las enzimas del metabolismo intermediario medidas en corvina
están dentro del rango encontrado en otras especies cultivadas como trucha arcoíris,
esturión, dentón, dorada y lubina (Peres y Oliva-Teles, 2006; Pérez-Jiménez et al., 2007;
Moreira et al., 2008; Enes et al., 2008a, b; Pérez-Jiménez et al., 2009; Furné et al.,
2009a). Por otra parte hemos detectado un considerablemente mayor efecto del
tamaño de la ración sobre el metabolismo hepático que sobre el muscular, lo que nos
indica que el primero es más sensible a esos cambios en la magnitud del aporte diario de
nutrientes y energía.
Efectivamente, en el caso del hígado, pudimos observar que tras 120 días de
recibir la alimentación diferenciada, existía una cierta relación directa entre cantidad
ingerida de alimento y actividad de la mayoría de las enzimas (figura IV.4.2.). Cuando
tomamos como referencia los valores correspondientes a los lotes F11 que,
previamente, hemos considerado como los alimentados con la ración que podríamos
considerar óptima; observamos que las corvinas alimentadas con la ración más alta
exhiben una mayor actividad enzimática mientras que la alimentadas con la ración más
baja la presentaban igual o inferior. Es excepción la actividad de LDH para la que la
relación anterior se invierte.
Existe en la literatura una serie de trabajos (Beamish, 1964; Love, 1970, 1980;
Blaxter y Ehrlich, 1974; Jobling, 1980; Johnston, 1981; Du Preez et al., 1986 a, b; Wieser
et al., 1992; Navarro y Gutiérrez, 1995; Metón et al., 1999, 2003; Hemre et al., 2002;
Furné et al., 2012), que exponen algo relacionado con los resultados del experimento
que se describe en la siguiente sección, y es que la privación de alimento tiene un efecto
depresor general sobre el metabolismo intermediario. Podríamos extender este
argumento a restricciones sólo parciales en la disponibilidad de alimento de forma que
149
Sergio García Mesa
los peces alimentados con la ración más alta fueron los que exhibieron una mayor
actividad general de las rutas del metabolismo intermediario.
Sin embargo, tras los primeros 60 días de alimentación diferenciada se observó
que las corvinas alimentadas al 0.6% presentan mayor actividad en muchas de las
enzimas determinadas, de forma significativa en EM, FBPasa, G6PDH, GOT, GPT, HOAD y
LDH), por lo que parece que el metabolismo se encuentra acelerado por la menor
ingesta de alimento, pero al día 120, son éstas las corvinas del tratamiento F06 las que
presentan menor actividad en prácticamente la totalidad de las enzimas del
metabolismo intermediario, posiblemente porque se hayan adaptado a esta situación de
restricción alimentaria y la menor actividad metabólica se centre a un mejor
aprovechamiento de la energía de la dieta (tabla IV.3.2, figura IV.4.1.) y de hecho son
estos animales, los que, en términos relativos mejor usan el pienso ingerido o, dicho de
otra forma, las que menos lo “desperdician” para otros fines, pues la tasa de eficiencia
alimentaria (FER) es significativamente superior en estas corvinas F06.
Al final del experimento, se observó en las corvinas alimentadas a tasas más
bajas una cierta adaptación mediante un incremento de producción de energía por la vía
anaerobia, puesto que se detectó un aumento significativo de la actividad LDH hepática
(figura IV.4.2.). Este aumento ha sido descrito en otras especies sometidas a condiciones
adversas que implican una reducción de la ingesta (Ibarz et al., 2009) y cursa con una
reducción en la actividad motora; este aumento coincidía con una reducción en la
actividad de la CS, hecho que también detectamos en la corvina aunque, en nuestro
caso, esa reducción no fue significativa; pese a ello, la relación entre las actividades de
ambas enzimas (en cierta forma, entre las tasas de metabolismo aeróbico y anaeróbico)
muestra una relación inversa con el tamaño de la ración (tabla IV.4.1).
Tabla IV.4.1. Relación entre actividades de distintas enzimas del
metabolismo intermediario en hígado de corvinas sometidas a distintos
tamaños de ración
GOT/GPT HOAD/CS
PK/CS
LDH/CS
GOT/CS
4.06
0.51
1.35
7.98
15.83
F06
4.55
0.57
2.01
5.79
19.06
F11
2.69
0.54
1.01
4.59
18.58
F16
Siguiendo con este sistema de análisis de datos basado en la relación entre las
actividades de diferentes enzimas, podemos inferir de lo expuesto en la citada tabla un
mayor uso de los carbohidratos con fines energéticos (deducido de la relación PK/CS)
por las corvinas alimentadas con la ración intermedia (F11), lo que podría suponer un
cierto efecto de protección de la proteína ingerida, en consonancia con el mejor índice
150
Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés
oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
de PER (tabla IV.3.2.), acompañado de un crecimiento aceptable, que tienen estos
animales con respecto a los alimentados con la ración más alta.
Si estudiamos los datos de actividad de las enzimas consideradas como
indicadoras de la tasa de catabolismo de aminoácidos (GDH, GOT y GPT), observamos
(figura IV.4.2.) que son claramente mayores en los animales que recibieron la ración más
alta y, por tanto, la mayor provisión de proteínas; esta situación podría ser indicativa de
una mayor tasa de uso de proteínas con fines energéticos por estos animales, lo que se
reflejaría en un menor grado de utilización de las mismas para crecimiento (PER); como,
además, no hemos detectado cambios en el contenido de proteína muscular (el
compartimento corporal donde más se acumula en términos absolutos), podríamos
considerar razonablemente que el índice PPV (que mide la proporción de la proteína
retenida en relación con la ingerida) también sería menor en este grupo. Según Metón
et al. (1999), una menor ración alimentaria conduce a una menor actividad GPT en
doradas, de forma similar a lo observado en corvinas (figura IV.4.2.).
ACoAT
CS
EM
FBPasa G6PDH GDH
GOT
GPT
GyK
HK
HOAD
LDH
PK
120
100
80
% variación
60
40
20
0
-20
-40
-60
F16
F06
Figura IV.4.2. Efecto del tamaño de ración sobre los niveles de actividad de enzimas del metabolismo
intermediario hepático en corvinas. Los datos son representados como % de variación respecto al F11.
A partir de la relación de actividades GOT/GPT (tabla IV.4.1) se puede deducir
que las corvinas alimentadas con las raciones más bajas son más dependientes de
aspartato, mientras que las F16 utilizan proporcionalmente más alanina. A diferencia de
lo descrito por Metón et al. (1999), con la dorada, la GOT y GPT hepática de las corvinas
son igualmente sensibles al tamaño de ración.
En conclusión, se podría afirmar que la ración más alta (recordamos, ingesta
proteica más elevada) supone un mayor uso de las proteínas con fines energéticos lo
151
Sergio García Mesa
que, al coincidir con una menor contribución de los carbohidratos al aporte energético
(menor relación PK/CS), no se manifiesta ningún efecto de ahorro proteico. Fernández et
al. (2007) consideraban que la mayor de actividades PK y GPT es indicadora de tal tipo
de ahorro.
Los distintos tamaños de ración no parecen afectar la tasa de β-oxidación de los
ácidos grasos, indicada por la HOAD (figura IV.4.2.), algo similar ocurre para la CS y por
tanto para la relación HOAD/CS. Ello implicaría la utilización completa del acetil CoA por
lo que la célula no se encuentra en la situación de formar cuerpos cetónicos de forma
diferenciada en las tres situaciones, de ahí que tampoco se hallen diferencias en la
actividad ACoAT.
En hígado, el papel de la glucolisis está ligado a la provisión de precursores de
procesos de biosíntesis más que para proporcionar pirúvico para la oxidación. En peces
alimentados, la oxidación de los α-cetoácidos (derivados del catabolismo de
aminoácidos) por el ciclo TCA podría ser la principal ruta de producción de energía en el
hígado de trucha con alguna contribución de la β-oxidación de los ácidos grasos (Walton
y Cowey, 1982). Cuando los carbohidratos no se presentan en la dieta, la proteína es
catabolizada para la síntesis de glucosa (Suárez y Mommsen, 1987). Es importante
proporcionar niveles adecuados de carbohidratos en la dieta para asegurar una
utilización eficiente de los otros nutrientes (Wilson, 1994).
En lo que concierne a las dos enzimas habitualmente consideradas indicadoras
de la magnitud de la glucolisis, encontramos resultados algo dispares. En efecto, si bien
ambas enzimas aumentan su actividad al hacerlo la ración entre la F06 y F11 (lo que
implica una ingesta mayor de carbohidratos), esta situación no se produce al aumentar
la ración hasta el tamaño F16; donde la actividad HK prácticamente se mantiene, pero la
PK incluso disminuye. Algunas variables como la temperatura o el contenido de
carbohidratos en la dieta no provocan un efecto claro sobre la actividad HK en dorada y
lubina (Panserat et al., 2000; Enes et al., 2006a, b; Enes et al., 2008a; Couto et al., 2008),
sin embargo en nuestro caso sí detectamos el efecto antes descrito, igual que, como
luego veremos, con una actividad reducida en corvinas en ayunas. El tamaño de ración sí
tiene un efecto claro sobre la utilización de la glucosa y parece establecerse una relación
entre la administración de alimento y la actividad de esta enzima, de modo que ésta es
significativamente menor en F06, análogamente a lo que se observaría en el ayuno, pero
similar entre F11 y F16, lo que indicaría un mayor uso proporcional de los carbohidratos
en F11. Se piensa que la HK es una enzima que emplea de forma limitada la glucosa en
peces (Newsholme y Start, 1973) lo que explicaría que no se produzca un aumento en su
actividad paralelo al de la ración, al pasar de la intermedia a la más alta. La situación de
152
Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés
oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
la PK es más difícil de explicar; es cierto que varios autores han descrito, en diferentes
especies de peces, que esta actividad es inducible (Panserat et al., 2000; Fernández et
al., 2007; Enes et al., 2006a, b; Couto et al., 2008; Enes et al., 2008a, b). En nuestras
corvinas, una mejora en la utilización de los carbohidratos con fines energéticos (ración
intermedia, F11) puede ser debida a un aporte diario más adecuado de estos nutrientes,
circunstancia que no se produciría con las raciones extremas.
Los estudios sobre las repercusiones del volumen de la ingesta de carbohidratos
sobre la actividad FBPasa no son coincidentes, ya que la relación inversa entre ambos
que detectan algunos (Panserat et al., 2002, en dorada) no es apreciada en otros
experimentos (Suárez et al., 1995; Enes et al., 2006a; Couto et al., 2008; Moreira et al.,
2008). En nuestro caso, al aumentar el tamaño de la ración de F06 a F11 no detectamos
cambios en esta actividad (como veremos en el próximo apartado, tampoco un ayuno
absoluto y prolongado pareció afectarla), lo que reforzaría la idea de una regulación
poco eficiente de la misma. No obstante, las corvinas alimentadas con la ración más alta
sí que mostraron una mayor actividad; la única explicación que se nos ocurre es que tal
circunstancia se debe a un mayor aporte de sustratos gluconeogénicos generado por la
mayor actividad de las enzimas implicadas en el catabolismo de los aminoácidos y que
antes hemos comentado. En los peces alimentados con la ración más baja, una menor
actividad FBPasa unida a una, también menor, actividad HK podría contribuir al
mantenimiento de la glucemia.
La G6PDH y EM son enzimas implicadas en la generación de NADPH (Arnesen et
al., 1993; Bouraoi et al., 2011) que puede ser usado para la síntesis de lípidos. En
nuestro experimento, la actividad de ambas enzimas aumenta con el tamaño de ración,
al igual que ocurría en dorada (Metón et al., 1999) con la G6PDH. Es previsible que esto
conduzca a una mayor depósito de lípidos en hígado ya que una mayor tasa lipogénica
se traduce en un mayor contenido de lípidos en hígado (Enes et al., 2006b; Enes et al.,
2008a; Moreira et al., 2008; Ibarz et al., 2009) pero no disponemos de datos a este
respecto en el caso de la corvina.
Aunque hemos indicado antes que la actividad HOAD no se encuentra
significativamente afectada por el tamaño de ración, sí que observamos que la actividad
GyK hepática era menor en las corvinas F06, lo que podría implicar una menor tasa de
movilización de lípidos cuando se restringe el tamaño de la ración.
Ya hemos indicado al inicio de este apartado que, globalmente, el tamaño de la
ración afectó poco al metabolismo muscular, de hecho sólo se detectaron algunas
153
Sergio García Mesa
diferencias en algunas enzimas indicadoras del metabolismo de hidratos de carbono (PK,
LDH y FBPasa) (figura IV.4.3.).
La mayor actividad, tanto de PK como de LDH en F06 (figura IV.4.3.) indicaría un
mayor grado de utilización anaeróbica de glucosa, propia de músculo blanco y que
podríamos asociar a una mayor frecuencia de episodios de natación explosiva quizá en
busca de un alimento poco abundante. Globalmente el aumento de estas actividades
unido al mantenimiento de la CS (esto es mayores relaciones PK/CS y LDH/CS, tablas
IV.3.6 y IV.4.2.) hace pensar en una mayor dependencia del metabolismo anaerobio en
estas corvinas subalimentadas tal como ocurría en el hígado.
Al igual que en esa víscera, en músculo no hubo variación en la relación HOAD/CS
como consecuencia del tamaño de la ración; esto es, el uso de energía de lípidos con
relación al total no se vio afectado.
ACoAT
CS
EM FBPasa GDH
GOT
GPT
GyK
HK
HOAD LDH
PK
100
80
% variación
60
40
20
0
-20
-40
-60
F16
F06
Figura IV.4.3. Efecto del tamaño de la ración sobre los niveles de actividad de enzimas del metabolismo
intermediario en músculo de corvinas. Los datos son representados como % de variación respecto al F11.
Tabla IV.4.2. Relación entre actividades de distintas enzimas del
metabolismo intermediario en músculo de corvinas sometidas a distintos
tamaños de ración.
GOT/GPT HOAD/CS
PK/CS
LDH/CS
GOT/CS
8.38
0.11
61.71
92.10
4.92
F06
9.48
0.10
51.54
75.45
5.24
F11
11.16
0.09
47.03
32.73
4.66
F16
154
Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés
oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
La actividad gluconeogénica muscular (indicada por FBPasa) está activada en las
corvinas que presentan los regímenes de alimentación más extremos, F06 y F16 (figura
IV.4.3.). Muy posiblemente, ello sea debido al aumento de la actividad LDH y PK
muscular, las cuales proporcionas sustratos para este proceso (Suárez et al., 1995; Furné
et al., 2012).
Como en otros experimentos incluidos en esta Memoria, tampoco en este caso
hemos podido detectar, con la técnica empleada, actividad alguna de G6PDH en
músculo. Como otros autores (Furné, 2008; Pérez-Jiménez, 2008) sí han encontrado esta
actividad en otras especies usando la misma técnica, podemos asumir que, en la corvina,
la actividad G6PDH es, en cualquier caso, extremadamente baja. Ello provocaría un
déficit en la provisión de NADPH para lipogénesis lo que coincide con las escasas
reservas musculares de grasa en esta especie.
En resumen, el tamaño de ración supuso un aumento de la obtención de energía
por vía anaerobia, además de un ahorro proteico por la mejor utilización de los
carbohidratos en las corvinas alimentadas con tasas menores y una priorización de
obtención de energía a partir de proteína en las corvinas F16.
Además de evaluar el crecimiento, la composición química y las enzimas del
metabolismo intermediario, se determinaron los posibles efectos que puedan tener
diferentes tamaños de ración en el estado oxidativo de las corvinas, centrándose en la
determinación de biomarcadores que normalmente responden a la generación de estrés
oxidativo, como son la actividad de algunas enzimas (CAT, DTD, GPX, GR, GST y SOD),
además de los niveles de peroxidación lipídica que se ha usado como bioindicador del
daño oxidativo, a través de la concentración de uno de los productos de rotura de los
lipoperóxidos por parte de los radicales libres, el malondialdehído (MDA) (figura IV.4.4.).
La SOD cataliza la dismutación del radical superóxido (O2 -1) en H2O y H2O2 y es la
primera en canalizar la eliminación de los radicales libres. El aumento de la actividad
SOD fue paralelo a la restricción alimentaria, de esta forma podríamos considerar que en
las corvinas subalimentadas, F06, estaba teniendo lugar una mayor producción de
radicales superóxido que serían neutralizado a H2O2, que a su vez será catalizado por
CAT y GPX, eliminando el potencial daño oxidativo. Una situación análoga se detectó en
dorada (Pascual et al., 2003) y Salmo trutta (Bayir et al., 2010) alimentadas con distintos
tamaños de ración.
155
Sergio García Mesa
% variación
CAT
DTD
GPX
GR
GST
SOD
TBARs
140
120
100
80
60
40
20
0
-20
-40
F16
F06
Figura V.4.4. Efecto del tamaño de la ración sobre los niveles de actividad de las
enzimas del estrés oxidativo y daño lipídico hepático en corvinas. Los datos son
representados como % de variación respecto al F11.
La GPX depende del glutation reducido (GSH) generado por acción de la GR. Por
ello, las actividades de estas enzimas están directamente relacionadas, presentando
mayores valores en F06 y F11.
La actividad del enzima antioxidante GR depende de NADPH. Las corvinas con la
ración más elevada (F16) presentan las mayores actividades de enzimas generadoras de
dicho NADPH y, sin embargo, es en estos lotes donde detectamos menor actividad GR.
Esta aparente incongruencia podría encontrar una explicación, al menos parcial, en el
sentido de que una mayor actividad G6PDH no sólo puede estar motivada por una
mayor necesidad de NADPH, sino que también sería útil para proporcionar precursores
de nucleótidos (ribosa 5-fosfato), lo que implicaría una mayor síntesis proteica (Bastrop
et al., 1991; Vigliano et al., 2002). Como hemos indicado antes, en estas corvinas
sobrealimentadas, están activadas enzimas implicadas en el catabolismo de los
aminoácidos (GDH, GOT y GPT), por lo que se produciría un aumento general de la
renovación proteica.
La enzima DT-diaforasa, también utiliza como cofactor el NADPH, presentó la
misma tendencia descrita para GR y GPX, esto es, las corvinas F06 y F11 presentaban
mayor actividad lo que permite una mayor protección de las membranas celulares por la
formación de hidroquinonas.
La GST posee un papel crítico frente al daño oxidativo que pueden sufrir los
ácidos nucleicos y lipídos (George, 1994; Elia et al., 2003), reduciendo los hidroperóxidos
(Jackson et al., 2002). Esta actividad es más elevada en las corvinas alimentadas con las
156
Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés
oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
dos raciones más bajas ayudando a prevenir el daño citado. Pascual et al. (2003), sin
embargo, no detectaron influencia del tamaño de ración en la actividad GST en dorada.
Así pues, la mayor actividad de las enzimas implicadas en la defensa antioxidante
detectada en los peces alimentados con las raciones restringidas parece ser lo
suficientemente eficaz para neutralizar dicho daño y de hecho, los niveles de
peroxidación lipídica (TBARs) son significativamente menores en los tratamientos
citados. El efecto beneficioso de una ración restringida a la hora de evitar daño oxidativo
es un lugar común pero, como veremos en el siguiente apartado, la situación de
restricción extrema (ayuno total y prolongado) puede tener los efectos contrarios
En músculo, los efectos del tamaño de la ración sobre los indicadores del estrés
oxidativo son menores que en el hígado, al igual que sucedía con el metabolismo
intermediario (figura IV.4.5.). La actividad CAT no fue detectada en músculo con la
técnica empleada.
% variación
GR
GPX
GST
SOD
TBARs
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
F16
F06
Figura IV.4.5. Efecto del tamaño de la ración sobre los niveles de actividad de las
enzimas del estrés oxidativo y daño lipídico muscular en corvinas. Los datos son
representados como % de variación respecto al grupo control F11.
De hecho, no se detectó efecto alguno de la ración sobre la actividad de las
enzimas SOD, GPX y GST así como en los niveles de daño oxidativo, medidos por TBARs.
Aquí, a diferencia de lo que ocurría en hígado, existe una relación directa entre el
tamaño de la ración y actividades de DTD y GR; no estamos en condiciones de explicar
esta situación aparentemente “anómala”, por otra parte la no disponibilidad de
antecedentes en la literatura sobre el posible efecto del tamaño de ración sobre estos
procesos en músculo, nos impide contrastar y valorar los resultados obtenidos. De
cualquier forma, la menor presencia de metabolismo oxidativo en este compartimento
157
Sergio García Mesa
corporal en relación con el hígado, es previsible que genere una menor necesidad de
estos sistemas de defensa y que éstos sean menos sensibles a cambios inducidos.
IV.5. RESUMEN.
En nuestras condiciones experimentales, el tamaño de ración diaria más
favorable para la cría de corvina de esa edad/tamaño es la que supone un 1.1 % de su
peso corporal, que provoca una mejora notable en crecimiento con respecto a la 0.6 % y
un mejor aprovechamiento del pienso con respecto a la que significa un 1.6 %.
La ración diaria más restringida (0.6 % del peso corporal) provoca ciertos cambios
metabólicos notables quizá reflejo de una cierta adaptación a la restricción alimentaria
(menor movilización de lípidos, ahorro energético) así como una mayor dependencia del
metabolismo anaerobio en el músculo, posiblemente derivada de una actividad
natatoria más intensa en relación con una mayor competencia por el alimento.
A partir del análisis de las actividades enzimáticas correspondiente se detecta un
cierto efecto de la ingesta diría de alimento sobre el uso preferencial de ciertos sustratos
energéticos; carbohidratos para la ración más reducida, proteína para la más elevada, lo
que supone, en éste último caso un uso más reducido de este nutriente con fines
plásticos por lo que el crecimiento se resiente en comparación con la ración intermedia.
La restricción alimentaria que supone la ración más baja genera una situación
prooxidante que se ha visto neutralizada por el aumento de las actividades de las
enzimas implicadas en la defensa antioxidante.
158
V. Efecto del ayuno y posterior
realimentación sobre el crecimiento,
metabolismo y estrés oxidativo en la
corvina (Argyrosomus regius Asso,
1801)
V.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS
Pese a que los procesos vitales significan una demanda continua de energía,
todos los animales pasan por periodos más o menos largos de interrupción de la
alimentación, su única fuente externa de la misma, durante los cuales dependen de la
que hayan podido almacenar con anterioridad. Estos periodos de cese de la
alimentación deberán ser tanto más cortos cuanto más elevadas sean las necesidades de
energía tal como ocurre en los endotermos (horas, días, salvo situaciones como la
hibernación en la que se deprimen notablemente las necesidades energéticas). En
cambio, los ectotermos, al tener, por lo común, tasas metabólicas más reducidas,
pueden permitirse periodos de ayuno bastante más largos (días, semanas, incluso, años)
que pasan a integrarse como algo habitual en su peripecia vital.
Los peces pueden verse sometidos, en su medio natural, a variaciones en la
disponibilidad de alimento o a “impulsos” comportamentales (reproducción,
migraciones) en los que son comunes periodos más o menos dilatados de cese total de
la actividad alimentaria y en repetidas ocasiones. Es por eso que, evolutivamente, estos
animales han desarrollado respuestas fisiológicas, en definitiva metabólicas, y de
conducta a fin de adaptarse y sobrevivir a estas situaciones desfavorables (Bastrop et al.,
1991; Méndez y Wieser, 1993). Tanto es así, que algunos son capaces de sobrevivir
meses sin alimentarse: Boetius y Boetius (1985) registraron un ayuno de 1594 días en
anguila europea (Anguilla anguilla).
Sin llegar a estos extremos, en piscicultura es relativamente frecuente introducir
periodos de ayuno en la dinámica general de la producción relacionados con ciertas
prácticas de la misma que los hacen aconsejables (traslados, tratamientos sanitarios,
etc.), empeoramientos imprevistos de las condiciones del medio (temperatura,
disponibilidad de oxígeno, presencia de tóxicos, temporales, etc.), preparación de los
ejemplares para el sacrificio y comercialización (“acabado”) y, como se está ensayando
159
Sergio García Mesa
recientemente, ayunos enfocados al aprovechamiento de lo que se conoce como
“crecimiento compensatorio” que se produce durante la realimentación tras un ayuno y
que puede significar un mejor aprovechamiento de la comida ofrecida.
Por esa doble razón, interés por conocer mejor esta peculiaridad fisiológica de los
peces y su posible aplicación a la piscicultura, las repercusiones del ayuno o del ayunorealimentación son un campo de estudio muy solicitado por los investigadores.
La respuesta fisiológica al ayuno va a depender de unos factores intrínsecos,
como son la propia especie, la edad, el tamaño, y otros extrínsecos, como la
temperatura o el fotoperiodo (Shimeno et al., 1990; Méndez y Wieser, 1993; Navarro y
Gutiérrez, 1995).
Para hacer frente a esta situación desfavorable, los peces comienzan a movilizar
sus reservas corporales y tienden a reducir su gasto energético, con tal de mantener las
constantes vitales que aseguren la supervivencia (Holecek et al., 2001; Furné et al.,
2012). Es decir, con el fin de mantener la homeostasis, los peces se adaptan
metabólicamente a la situación de ayuno, apareciendo cambios en las principales rutas
metabólicas (Walton y Cowey, 1982; Bastrop et al., 1991). Estos cambios afectan, por
ejemplo, a la glucemia (Gutiérrez et al., 1991; Pérez-Jiménez et al., 2007; Furné et
al.,2012), a través de cambios en las rutas glucogenolíticas y gluconeogénicas (Machado
et al., 1988; Navarro y Gutiérrez, 1995; Metón et al., 2003; Pérez-Jiménez et al., 2007;
Furné, 2008; McCue, 2010) .
Si el ayuno se prolonga se va a producir la movilización de las reservas lipídicas
con lo que se generan glicerol, otro sustrato para la gluconeogénesis, y ácidos grasos de
los triglicéridos para proporcionar energía (Machado et al., 1988). Aunque, según
Zammit y Newsholme (1979), a diferencia de los mamíferos, los peces no dependen de
los cuerpos cetónicos como fuente de energía.
La última reserva que se moviliza durante el ayuno son las proteínas corporales lo
que se pone de manifiesto en cambios en la actividad de enzimas implicados y de la
propia composición corporal; los aminoácidos generados podrán ser usados como
combustible inmediato o como sustrato de gluconeogénesis (Black y Love, 1986;
Soengas et al., 1997; Sánchez-Muros et al., 1996; Vigliano et al., 2002).
Esta secuencia de utilización de reservas provoca que la magnitud de las mismas
se altere de forma diferencial según la duración de ese periodo de privación de alimento
en relación, además, con los factores antes mencionados (edad, hábitat alimentario,
160
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
estado nutricional previo, temperatura del agua, etc.) por lo que los efectos sobre la
pérdida de peso (del pez entero y de sus vísceras) y los posibles cambios en la
composición corporal podrán ser muy variables (Shimeno et al., 1990; Soengas et al.,
1996). Por otra parte, la implicación de los distintos territorios puede ser muy diferente,
en este sentido, la mayoría de los estudios se han llevado a cabo en hígado y músculo
(Weatherley y Gill, 1981; Black y Love, 1986; Lim y Ip, 1989; Méndez y Weiser, 1993;
Pérez-Jiménez et al., 2012; Furné et al., 2012).
Como es previsible, el ayuno debe disminuir la actividad de las rutas metabólicas
implicadas en el almacenamiento de reservas energéticas (Shimeno, 1990; Bastrop et al.,
1991; Vigliano et al., 2002).
Cuando el pez puede realimentarse tras un periodo de ayuno se enfrenta a un
nuevo reajuste metabólico que también ha sido estudiado ampliamente (Machado et
al., 1988; Shimeno et al., 1990; Méndez y Wieser, 1993; Metón et al., 2003; PérezJiménez et al., 2012; Furné et al., 2012). Esos reajustes, unidos a los digestivos, suelen
conducir a una mejora de la tasa de crecimiento (lo que se conoce como “crecimiento
compensatorio”) que también está siendo estudiado con detalle (Weatherley y Gill,
1981; Wieser et al., 1992; Nicieza y Metcalfe, 1997; Ali et al., 2003; Xie et al., 2001; Zhu
et al., 2004; Cho et al., 2005; Eroldogan et al., 2006; Ferrando et al., 2009).
El ayuno, sea cual sea su duración, genera una situación de estrés metabólico
que puede repercutir en la tasa de producción de radicales libres y/o en la actividad de
los sistemas de defensa antioxidante por lo que la influencia de aquel en la génesis de
situaciones de estrés oxidativo también ha sido estudiado en diversas especies de peces
(Pascual et al., 2003; Morales et al., 2004; Furné et al., 2010; Bayir et al., 2011).
Teniendo en cuenta, los antecedentes mencionados, se diseñó y realizó este
experimento en el que dos lotes de corvinas se sometieron a un ayuno absoluto de 60
días seguido de un periodo de realimentación de otros 60 días. Durante los 4 meses del
experimento se realizó un seguimiento de determinadas variables biométricas y de
composición, otras metabólicas y, finalmente, algunas relacionadas con el estrés
oxidativo. Este experimento se realizó simultáneamente con el descrito en el capítulo
anterior, de forma que, para todos los casos se usaron como referencia sendos lotes
control alimentados de forma continua de entre los usados en aquel experimento.
161
Sergio García Mesa
V.2. MATERIAL Y MÉTODOS
V.2.1. Animales, condiciones experimentales y muestreos
Los animales empleados así como las condiciones experimentales se describen
con más detalle en la sección de Material y Métodos del apartado IV.
Con el fin de determinar el efecto del ayuno y la posterior realimentación sobre
el crecimiento y la fisiología de la corvina se constituyeron dos lotes de 100 animales
cada uno, a los que se privó completamente del alimento durante 60 días; al final de ese
periodo de ayuno, los peces empezaron a alimentarse con una ración diaria del 1.1 % del
peso corporal y se prolongó el seguimiento durante 60 días más. Este experimento se
realizó simultáneamente al descrito en el apartado IV (efecto del tamaño de la ración),
usando los lotes F11 de aquél, también alimentados con una ración diaria del 1.1 % del
peso corporal, como controles para éste.
El pienso empleado fue de la marca SKRETING, en concreto el tipo C.V.6,
específico para corvina, con un tamaño de grano adecuado al de nuestros animales. La
composición del pienso aparece detallada en la tabla V.2.1.
Tabla V.2.1. Composición del pienso (g/kg, en sustancia seca)
Componente
Proteína bruta
Extracto etéreo
Cenizas
Material extractivo libre de nitrógeno (MELN)*
Energía** (MJ/Kg)
Relación Proteína/Energía (g/MJ)
472.0
204.7
77.2
246.1
238.3
198.0
* calculado como 1000 – (Proteína bruta + extracto etéreo + cenizas)
** calculado sobre la base de 24.3, 39.7 y 17.2 KJ/g de proteína, lípidos y
MELN, respectivamente
A partir de una estimación de la biomasa total presente en cada tanque, basada
en los muestreos en los días 60, 80, 100 y 120 del experimento se calculó la ración total
a suministrar a cada uno de los dos tanques para mantener la ración diaria lo más
homogénea y ajustada a los valores previstos durante este periodo de realimentación.
162
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
V.2.2.Procesado de las muestras
En los días señalados, se sacrificaron algunos peces, tomados al azar de cada lote,
tras un ayuno previo de 24 horas.
El hígado y una porción de músculo blanco de la parte anterior dorsal de los
peces fueron diseccionados, congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80 °C
hasta que se usaron para los estudios metabólicos en las instalaciones de la UGR. Los
tejidos se homogenizaron según se detalla en el apartado IX de esta Memoria.
V.2.3. Parámetros biométricos y composición química.
A partir de datos de esos muestreos, se calcularon el incremento de peso (GAP)
de los peces, así como varios índices de crecimiento y utilización de la dieta, como son
IRP, SGR, TCA o FCR, TEA o FER e índices biométricos, K, IHS, IVS, IDS y RF.
Los peces destinados al estudio de la composición química se almacenaron en
hielo y se transportaron rápidamente hasta las instalaciones de la UGR. Se diseccionó la
parte derecha del músculo y se procedió a la determinación de la composición según se
detalla en el apartado IX Metodología.
V.2.4. Análisis de la actividad enzimática
Los ensayos enzimáticos en hígado y músculo se realizaron según se detalla en el
anexo IX (Metodología) de esta memoria. Se determinaron las siguientes actividades
enzimáticas: Acetoacetil CoA Tiolasa (ACoAT; EC 2.3.1.9.), Citrato Sintasa (CS; EC 4.1.3.7),
Enzima Málico (EM; EC 1.1.1.40.) Fructosa 1,6-bisfosfatasa (FBPasa; EC 3.1.3.11), Glucosa
6-fosfato Deshidrogenasa (G6PDH; EC 1.1.1.49), Glutamato Deshidrogenasa (GDH; EC
1.4.1.2), Glutamato Oxalacetato Transaminasa (GOT; EC 2.6.1.1.), Glutamato Piruvato
Transaminasa (GPT; EC 2.6.1.2.), Glicerol Kinasa (GyK; EC 2.7.1.30.), Hexokinasa (HK; EC
2.7.1.1.), β-Hidroxiacil CoA Deshidrogenasa (HOAD; EC 1.1.1.35), Lactato Deshidrogenasa
(LDH; EC 1.1.1.27) y Piruvato Kinasa (PK; EC 2.7.1.40), relacionadas con el metabolismo
intermediario, y Catalasa (CAT; EC 1.11.1.6.), DT-Diaforasa (DTD; 1.6.99.2.), Glutation
Peroxidasa (GPX; EC 1.11.1.9.), Glutation Reductasa (GR; 1.6.4.2.), Glutation tTansferasa
(GST; 2.5.1.18), Superóxido Dismutasa (SOD; 1.15.1.1.) y Sustancias Reactivas al Ácido
Tiobarbitúrico (TBARs) o Malondialdehído (MDA), relacionadas con el estrés oxidativo.
También se determinó el contenido en glucógeno en hígado y músculo blanco.
163
Sergio García Mesa
V.2.5. Análisis estadístico
Se utilizó el análisis de la varianza de una vía (ANOVA) usando el software SPSS
15.0 para Windows. La diferencias significativas (P<0.05) entre los distintos tratamientos
y puntos de muestreo de determinaron por el test de Duncan (Duncan, 1955).
V.3. RESULTADOS
V.3.1. Crecimiento
En la tabla V.3.1 se exponen los valores de algunos parámetros biométricos de las
corvinas que sufrieron un periodo de ayuno seguido de un periodo de realimentación
(S/RF11), comparados con los del tratamiento que se consideró como control (F11).
El ayuno de los peces se acompañó de una pérdida de peso asociada a una
disminución del índice de condición (K).
Con la realimentación se produjo un aumento rápido de los tres parámetros
citados, pero no alcanzaron los valores del control, salvo para el K se igualó a los valores
control a los 40 días de realimentación.
Tabla V.3.1. Evolución temporal de varios índices biométricos de las corvinas sometidas
a 60 días de ayuno y 60 días de realimentación (S/RF11) frente a las alimentadas de
forma continuada (F11).
Días de cultivo
Longitud
total (cm)
S/RF11
F11
S/RF11
Peso (g)
F11
K1
S/RF11
F11
0
20
40
60
80
100
120
18.72a
19.08ab*
18.91a*
19.55b*
20.21c*
21.29d*
22.24e*
0.19
0.19
0.20
0.17
0.19
0.20
0.17
18.88a
20.10b
20.48b
21.94cd
22.51d
24.02e
24.30e
0.19
0.19
0.23
0.15
0.25
0.19
0.18
77.10bc
73.38ab*
67.28a*
67.20a*
82.08c*
102.08d*
114.03e*
2.40
2.24
2.33
1.83
2.41
2.92
2.48
79.88a
92.33b
103.36c
114.75c
124.25d
135.58e
146.90f
2.46
2.86
3.34
2.89
4.25
3.43
3.69
1.16f
1.00d*
0.98c*
0.89a*
0.99c*
1.05e
1.02d
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
1.17e
1.14d
1.12d
1.08c
1.07c
1.04b
1.01a
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
Los valores son media ± EEM (N=20) para todos los muestreos excepto para el día 120, donde N=40. Diferentes
letras indican diferencias significativas (P<0.05) a lo largo del tiempo. * Indica diferencias significativas (P<0.05)
1
entre S/RF11 y su control (F11). Índice de condición.
164
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
En la tabla V.3.2. se muestran los índices de crecimiento y aprovechamiento del
alimento de las corvinas. Como es lógico, durante el ayuno todos los índices de
crecimiento fueron negativos. Con la realimentación (60-120 días), las corvinas
comenzaron a crecer a un ritmo mayor que las controles, aunque se alimentaran con un
tamaño de ración similar y así presentaron un crecimiento específico (SGR) muy
superior, además de una mejor conversión del alimento.
Tabla V.3.2. Crecimiento y utilización del alimento en corvinas ayunadas/realimentadas
(S/RF11) y alimentadas continuamente (F11). Para los lotes S/RF11 se exponen los datos de
los dos subperiodos: ayuno (días 0-60) y realimentación (días 60-120).
GAP1
0-60
IRP2
60-120
0-60
60-120
SGR3
0-60
TCA4
60-120
0-60
PER5
60-120
0-60
60-120
FER6
0-60
60-120
0.97*
2.20*
1.04*
S/RF11 -9.90* 46.83* -12.84* 69.67* -0.23* 0.88*
0.45
1.28
0.47
1.64
0.01
0.02
0.05
0.12
0.06
67.03
83.97
0.51
2.39
0.89
0.42
F11
3.93
5.73
0.03
0.16
0.06
0.03
Los valores son media ± EEM de dos lotes experimentales. * Indica diferencias significativas (P<0.05) entre S/RF11 y su
1
2
3
4
control (F11). Ganancia Absoluta de Peso; Incremento Relativo de Peso; Tasa de Crecimiento Específico; Tasa de
5
6
Conversión del Alimento; Coeficiente de Eficiencia Proteica; Tasa de Eficiencia Alimentaria.
V.3.2. Índices biométricos
En la tabla V.3.3. se recoge el efecto del ayuno y la realimentación sobre algunos
parámetros biométricos frente al grupo considerado como control (F11). El ayuno
prácticamente no afectó a los índices Víscerosomático (IVS), Digestosomático (IDS) y de
Rendimiento del Filete (RF), pero sí provocó una disminución importante del Índice
Hepatosomático (IHS) en cada periodo evaluado.
Tabla V.3.3. Evolución temporal de algunos índices biométricos de las corvinas
sometidas a 60 días de ayuno y 60 días de realimentación (S/RF11) frente a las
alimentadas de forma continuada (F11).
IHS1
IVS2
IDS3
RF4
0
20
40
60
80
100
120
S/RF11
2.71c
1.33b*
0.99a*
0.65ab*
1.77b*
2.56c*
2.58c*
0.20
0.20
0.36
0.08
0.19
0.10
0.05
F11
2.77c
3.22c
2.76c
2.29b
2.04ab
1.77a
2.13ab
0.14
0.14
0.11
0.11
0.15
0.21
0.08
S/RF11
11.78ab
10.28ab*
10.31ab*
10.33ab*
10.33ab
11.14b*
9.45a*
0.53
0.63
0.50
0.37
0.59
0.45
0.35
F11
11.95d
12.65d
11.06c
9.47ab
9.84b
8.77ab
8.29a
0.22
0.42
0.28
0.28
0.23
0.60
0.34
S/RF11
2.25ab
2.19a
2.24ab
2.12a
3.00c*
2.82bc*
2.38ab*
0.10
0.20
0.05
0.03
0.31
0.14
0.11
F11
2.23b
2.23b
2.21b
2.14b
2.00ab
2.12b
1.78a
0.30
0.16
0.14
0.07
0.09
0.08
0.087
S/RF11
39.27ab
38.60ab*
38.01a*
37.85a*
38.69ab*
42.19c
43.20d
1.41
1.35
2.02
2.04
1.04
0.65
0.62
F11
39.19a
41.61ab
42.35b
46.57c
42.28b
44.32bc
44.10bc
1.00
1.99
1.57
5.33
0.68
0.95
0.37
Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) a lo largo del
1
tiempo. * Indica diferencias significativas (P<0.05) entre S/RF11 y su control (F11). Índice hepatosomático;
2
3
4
Índice viscerosomático; Índice digestosomático; Rendimiento del filete
165
Sergio García Mesa
La realimentación dio lugar a que todos los índices aumentaran, este aumento
fue más lento para IVS y RF (el día 100 pareció recuperarse e igualar al control) y muy
significativo y rápido para IHS e IDS (a los 20 días de realimentación se superaron o
igualaron los del grupo control), de modo que durante el resto del período de
realimentación se encontraron muy por encima de los valores presentados en los
controles F11.
Nota: En la mayoría de los resultados que se presentan a continuación
(tablas V.3.4 en adelante), se realiza una exposición doble: en primer
lugar se presentan los datos obtenidos el día final del ayuno de los lotes
S/RF11 junto a los de los lotes F11 considerados como sus controles (se
visualiza así el efecto del ayuno). A continuación se presenta la
evolución de esos datos durante los 60 días de realimentación para los
lotes S/RF11 (para visualizar así el efecto de la realimentación).
V.3.3. Composición
El efecto del ayuno durante 60 días sobre la composición de las corvinas (S/RF11)
se recoge en la tabla V.3.4. donde se compara con el grupo control (F11). La tabla V.3.5.
muestra los datos de composición de músculo e hígado de corvinas del tratamiento
S/RF11 en los diferentes periodos evaluados.
Tabla V.3.4. Efecto del ayuno de 60 días (lote S/RF11) sobre la composición de músculo e
hígado de la corvina tomando como referencia el grupo control alimentado (F11).
Humedad
Lípidos
Músculo
Proteínas
Cenizas
Glucógeno
S/RF11-60
79.96*
5.38*
76.34*
6.69*
1.99
26.23*
0.21
0.27
2.26
0.12
0.07
0.67
5.19
F11-60
77.30
7.32
87.09
6.13
1.88
90.16
62.95
0.27
0.53
3.06
0.13
0.03
5.70
5.99
Grupo
Hígado
Glucógeno Proteínas
68.02
Los valores son media ± EEM (N=6). * Indica diferencias significativas (P<0.05) entre S/RF11 y su control (F11).
Humedad: % agua. Lípidos: % extracto etéreo en sustancia seca. Cenizas: % cenizas en sustancia seca. Proteínas: % en
sustancia seca. Glucógeno: mg/g tejido.
En cuanto a la composición del músculo, el contenido de agua aumentó con el
ayuno y se mantuvo elevado durante las primeras fases de realimentación, no obstante
descendió al final del período experimental y las diferencias significativas con F11
desparecieron. El contenido de lípidos disminuyó durante el ayuno pero se recuperó
rápidamente en el músculo por lo que en tan sólo 20 días desaparecieron las diferencias
con el lote control. El contenido en minerales fue significativamente mayor en las
corvinas en ayunas frente a las alimentadas, la realimentación dio lugar a que
desaparecieran rápidamente estas diferencias, los valores de esta fracción muscular
fueron bastante constantes a lo largo de esta segunda etapa.
166
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
El contenido en proteína disminuyó con el ayuno, aumentando lentamente a lo
largo de la realimentación hasta igualarse al del grupo control. La privación de alimento
no afectó a la cantidad de glucógeno muscular, sin embargo, a los 40 días de
realimentación aumentó este contenido para volver a disminuir al final del periodo de
realimentación.
Tabla V.3.5. Evolución temporal de la composición muscular y hepática de las corvinas
durante un periodo de 60 días de realimentación tras uno de ayuno de 60 días (día 60:
inicio de la realimentación).
Día
Humedad
c
Lípidos
a
Músculo
Proteínas Glucógeno
a
60
79.96
5.38
48.20
0.21
0.27
2.26
80
78.54
100
78.29
120
b
6.36
b
0.31
3.32
7.15
51.84
a
0.51
4.32
77.69
6.74
0.10
0.33
0.28
0.18
ab
b
b
1.99
ab
0.07
a
1.80
a
62.74
b
1.79
2.81
0.04
47.68
Minerales
b
68.02
b
72.25
26.23
0.12
0.67
6.46
0.04
b
0.20
2.20
6.14
a
a
6.69
a
0.11
Hígado
Glucógeno Proteínas
ab
77.75
6.09
a
110.92
6.19
a
76.16
0.07
3.84
0.05
10.43
c
b
5.19
4.05
67.87
2.79
75.19
5.88
Los valores son media ± EEM (N=6) Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) a lo largo del tiempo.
Humedad: % agua. Lípidos: % extracto etéreo en sustancia seca. Cenizas: % cenizas en sustancia seca. Proteínas: % en
sustancia seca. Glucógeno: mg glucógeno/ g tejido.
Las reservas glucogénicas hepáticas estaban muy disminuidas tras 60 días de
ayuno; no obstante, en tan sólo 20 días de realimentación triplicaron su valor
acercándose a los valores de las controles, por su parte, la proteína hepática no reflejó
efecto alguno del ayuno ni de la realimentación.
V.3.4. Actividades enzimáticas del metabolismo intermediario
V.3.4.1. HÍGADO
En las tablas V.3.6. y V.3.7. aparecen las actividades enzimáticas del hígado de las
corvinas al final del periodo de ayuno de 60 días y durante la posterior realimentación.
El ayuno supuso la inhibición significativa de la mayoría de las actividades
enzimáticas medidas frente a los valores observados en las corvinas controles. Algunas
de ellas se recuperaron durante la realimentación (ACoAT, EM, G6PDH, GyK y PK)
mientras que otras se mantuvieron en valores inferiores a los controles durante todo
este periodo (CS y LDH).
Las actividades hexokinasa (HK), piruvato kinasa (PK) y fructosa 1,6 bifosfatasa
(FBPasa) se vieron disminuidas por la privación de alimento, pero la realimentación
167
Sergio García Mesa
produjo una recuperación de las mismas de forma que al final de este periodo
presentaban valores similares a los controles HK y FBPasa o ligeramente inferiores (PK).
El ayuno también produjo una reducción de la actividad de lactato
deshidrogenasa (LDH) y de la citrato sintasa (CS), pero en este caso, esas actividades no
se recuperaron durante la realimentación.
Las actividades de glicerol kinasa (GyK), enzima málico (EM), glucosa 6-fosfato
deshidrogenasa (G6PDH) y acetoacetil-CoA tiolasa (ACoAT) mostraron un descenso
significativo durante el ayuno, todas ellas se recuperaron durante la realimentación,
aunque con distinta secuencia temporal: 20 días para la GyK y EM, 40 días para la G6PDH
y ACoAT.
La 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa (HOAD) no se afectó por el ayuno. En el
periodo de realimentación, se detectó una disminución de la actividad, manteniéndose
esta situación hasta el final del periodo experimental. La glutamato deshidrogenasa
(GDH) tampoco presentó efectos del ayuno, pero en este caso se detectaron valores
inferiores tras una realimentación de 20 días, valores que se recuperaron
posteriormente. Una tendencia similar se encontró para la actividad glutamato
oxalacetato transaminasa (GOT). En cambio glutamato piruvato transaminasa (GPT)
mostró un aumento significativo de su actividad durante el ayuno que desapareció tras
20 días de realimentación, aunque se detectó un nuevo aumento al final de este
periodo.
168
169
CS
15.61*
1.16
19.23
1.11
ACoAT
12.61*
1.05
48.14
3.67
0.40
4.03
0.16
1.30*
EM
1.08
11.25
0.80
10.01*
FBPasa
2.09
20.09
0.45
7.20*
G6PDH
5.87
82.44
6.20
88.85
GDH
22.66
312.11
10.12
340.40
GOT
3.92
68.13
4.73
105.18*
GPT
2.14
21.53
0.22
3.16*
GyK
0.28
2.55
0.18
2.04*
HK
0.93
11.70
1.01
12.84
HOAD
2.92
34.44
0.68
17.71*
LDH
9.42
101.24
3.87
63.57*
PK
CS
15.61*
1.16
13.89
1.18
14.94
2.08
14.93
1.11
ACoAT
12.61*
1.05
25.56b
1.72
53.18d
3.29
43.38c
3.89
0.35
4.96c
0.17
3.47b
0.38
4.05b
0.16
1.30*
EM
0.78
13.14b
0.97
17.19c
0.55
10.78a
0.80
10.01*
FBPasa
1.70
19.59c
1.49
18.01bc
1.43
14.30b
0.45
7.20*
G6PDH
10.24
121.72c
7.21
77.01ab
4.90
60.29a
6.20
88.85
GDH
16.12
300.38ab
17.03
435.12c
23.02
254.30a
10.12
340.40
GOT
12.06
141.80c
9.77
142.00c
5.26
66.33a
4.73
105.18*
GPT
1.99
21.98b
1.20
20.70b
1.92
21.10b
0.22
3.16*
GyK
Los valores son media ± EEM (N=6) Diferentes letras indican diferencias significativas a lo largo del tiempo (P<0.05).
120
100
80
60
Día
0.21
2.60b
0.12
1.42a
0.38
3.14c
0.18
2.04*
HK
0.65
6.75a
0.80
8.30a
0.62
6.84a
1.01
12.84
HOAD
1.29
15.90b
0.55
8.50a
1.43
17.98b
0.68
17.71*
LDH
5.05
72.19ab
6.82
91.51bc
10.62
105.51c
3.87
63.57*
PK
Tabla V.3.7. Evolución temporal de la actividad específica (mU/mg proteína) de algunas enzimas clave del el metabolismo
intermediario en el hígado de corvinas durante un periodo de realimentación de 60 días tras un ayuno de 60 días. (día 60:
inicio de la realimentación).
Los valores son media ± EEM (N=6) * Indica diferencias significativas (P<0.05) entre S/RF11 y su control (F11).
ACoAT: Acetoacetil CoA Tiolasa; CS: Citrato Sintasa; EM: Enzima Málico; FBPasa; Fructosa Bisfosfatasa; G6PDH: Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa; GDH: Glutamato
Deshidrogenasa; GOT: Glutamato Oxalacetato Transaminasa; GPT Glutamato Piruvato Transaminasa; GyK: Glicerol Kinasa; HK: Hexokinasa; HOAD: 3-hidroxiacil CoA
Deshidrogenasa; LDH: Lactato Deshidrogenasa; PK: Piruvato Kinasa.
F11-60
S/RF11-60
Grupo
Tabla V.3.6. Efecto del ayuno de 60 días (lote S/RF11) sobre la actividad específica (mU/mg de proteína) de algunas
enzimas clave del metabolismo intermediario en el hígado de la corvina tomando como referencia el grupo control
alimentado (F11).
Sergio García Mesa
V.3.4.2. MÚSCULO
El metabolismo del músculo también se vio afectado por el ayuno de 60 días y la
posterior realimentación, sin embargo, los cambios fueron diferentes a los observados
en hígado (tablas V.3.8. y V.3.9.).
Previamente, debemos destacar que con la técnica utilizada no pudimos detectar
actividad alguna de G6PDH en este tejido.
La actividad HK muscular no mostró efecto del ayuno, con la realimentación se
detectó un aumento de la misma, aunque los valores volvieron a disminuir al final del
periodo controlado. Tampoco se observó un efecto del ayuno sobre la actividad de la
FBPasa, la realimentación conllevó un aumento de la misma, pero tal efecto desapareció
al final del periodo experimental. Este mismo efecto se observó sobre las actividades
GPT y EM.
La actividad ACoAT muscular, a diferencia de la hepática, mostró un aumento
significativo al final del ayuno. Durante las primeras etapas de la realimentación
siguieron aumentando los valores para disminuir de forma significativa en las últimas.
También la actividad de la HOAD muscular aumentó con el ayuno; durante la
realimentación, esta actividad fue cayendo paulatinamente hasta el final del
experimento, llegando a ser menor a la de los controles. Un efecto similar del ayuno y
realimentación se observó para las actividades CS, GyK y GOT.
El ayuno tuvo un efecto inhibidor sobre la actividad, tanto de PK como de GDH,
mientras que la realimentación supuso la total y completa recuperación de la misma
desde los primeros 20 días. De la misma forma, hubo un descenso significativo en la
actividad de la LDH con el ayuno mientras que la realimentación produjo un aumento
gradual de dicha actividad hasta valores superiores a los controles.
170
171
2.56
21.01
1.77
0.14
1.52
0.13
0.16
1.05
0.06
0.68
EM
0.20
2.16
0.17
1.94
FBPasa
n.d
n.d
G6PDH
1.97
22.11
1.32
15.37*
GDH
11.57
119.45
11.47
144.96*
GOT
0.97
10.17
4.08
48.97
0.09
0.87
69.32*
3.89
GyK
GPT
0.13
1.13
0.55
7.62*
HK
0.23
2.33
1.01
12.84
HOAD
158.84
1441.73
044.55
554.84*
LDH
PK
CS
31.02*
2.56
36.06b
2.92
19.87a
1.71
20.23a
1.52
ACoAT
2.20*
0.14
2.82c
0.29
2.14ab
0.09
1.54a
0.11
0.05
0.79a
0.08
1.29b
0.15
1.08b
0.06
0.68
EM
0.06
1.18a
0.29
2.99c
0.30
3.45c
0.17
1.94
FBPasa
n.d
n.d
n.d
n.d
G6PDH
2.19
24.75b
1.67
23.02b
2.38
25.40b
1.32
15.37*
GDH
10.63
119.14b
8.29
87.87a
9.93
133.86b
11.47
144.96*
GOT
0.91
12.04b
1.02
15.82c
1.50
15.17bc
3.79
47.39a
5.94
67.06b
3.81
66.85b
0.09
0.87
69.32*
3.89
GyK
GPT
0.09
1.05a
0.17
1.95b
0.08
0.79a
0.55
7.62*
HK
0.11
1.58a
0.24
2.26a
0.49
6.53b
1.01
12.84
HOAD
Los valores son media ± EEM (N=6) Diferentes letras indican diferencias significativas a lo largo del tiempo (P<0.05). n.d. no detectada
120
100
80
60
Día
199.22
2232.70c
77.45
1762.87ab
71.97
1007.72b
044.55
554.84*
LDH
54.71
637.48b
76.41
769.11bc
71.72
875.09c
11.55
191.57*
PK
Tabla V.3.7. Evolución temporal de la actividad específica (mU/mg proteína) de algunas enzimas clave del el metabolismo
intermediario en el hígado de corvinas durante un periodo de realimentación de 60 días tras un ayuno de 60 días. (día 60:
inicio de la realimentación).
71.45
736.10
11.55
191.57*
Los valores son media ± EEM (N=6) * Indica diferencias significativas (P<0.05) entre S/RF11 y su control (F11). n.d. no detectada.
ACoAT: Acetoacetil CoA Tiolasa; CS: Citrato Sintasa; EM: Enzima Málico; FBPasa; Fructosa Bisfosfatasa; G6PDH: Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa; GDH: Glutamato
Deshidrogenasa; GOT: Glutamato Oxalacetato Transaminasa; GPT Glutamato Piruvato Transaminasa; GyK: Glicerol Kinasa; HK: Hexokinasa; HOAD: 3-hidroxiacil CoA
Deshidrogenasa; LDH: Lactato Deshidrogenasa; PK: Piruvato Kinasa.
F11-60
31.02*
2.20*
S/RF1160
CS
ACoAT
Grupo
Tabla V.3.8. Efecto del ayuno de 60 días (lote S/RF11) sobre la actividad de algunos enzimas clave del metabolismo
intermediario en el músculo de la corvina tomando como referencia el grupo control alimentado (F11).
Sergio García Mesa
V.3.5. Estrés oxidativo
Los efectos del ayuno sobre las defensas enzimáticas antioxidantes y el posible
daño oxidativo de los lípidos en el hígado en las corvinas sometidas a ayuno (S/RF11) se
presentan en la tabla V.3.10. donde se contrastan con el grupo control alimentado (F11).
En la tabla V.3.11 se exponen los resultados de la evolución de estos parámetros
durante la realimentación en los lotes S/RF11. Idéntica disposición, pero con los datos
del músculo, se presenta en las tablas V.3.12. y V.3.13. respectivamente.
V.3.5.1. HÍGADO
Tabla V.3.10. Efecto del ayuno de 60 días (lote S/RF11) sobre la actividad de
algunas enzimas indicadoras del estrés oxidativo y nivel de peroxidación lipídica
en el hígado de la corvina tomando como referencia el grupo control alimentado
(F11).
CAT1
DTD2
GPX2
GR2
GST2
SOD1
TBARs3
S/RF11-60
35.29*
2.13*
64.15*
5.55
13.93*
49.52
302.80*
1.62
0.19
3.17
0.42
1.07
1.08
29.06
F11-60
53.71
3.07
81.59
4.43
36.71
57.62
50.00
4.03
0.30
6.27
0.35
2.88
5.03
2.60
Grupo
Los valores son media ± EEM (N=6). * Indica diferencias significativas (P<0.05) entre S/RF11 y su control
(F11).
1
2
3
Expresado como U/mg proteína. Expresado como mU/mg proteína. Expresado como nmol MDA/g tejido.
CAT: catalasa; DTD: DT-diaforasa; GPX: glutation peroxidasa; GR: glutation reductasa; GST: glutation
transferasa; SOD: superóxido dismutasa; TBARs: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico
Tabla V.3.11. Evolución temporal de la actividad de algunas enzimas
indicadoras del estrés oxidativo y nivel de peroxidación lipídica en el hígado de la
corvina durante un periodo de realimentación de 60 días tras un ayuno de 60
días. (día 60: inicio de la realimentación).
Día
60
80
100
120
CAT1
35.29
a
DTD2
2.13
a
GPX2
64.15
b
GR2
5.55
c
GST2
13.93
a
SOD1
TBARs3
b
302,80b
49.52
1.62
0.19
3.17
0.42
1.07
1.08
29,06
33.03a
3.86b
51.09a
3.69a
44.55c
35.55a
47,58a
3.11
0.35
1.98
0.27
3.75
2.75
3,22
41.35a
8.59d
110.43c
4.87bc
75.65d
66.71c
40,97a
2.67
0.75
3.79
0.39
5.92
4.53
3,19
55.43b
7.06c
64.20b
3.98ab
31.45b
49.52ab
40,63a
4.90
0.35
4.54
0.12
2.95
1.08
3,61
Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas a lo largo del tiempo
(P<0.05).
1
2
3
Expresado como U/mg proteína. Expresado como mU/mg proteína. Expresado como nmol MDA/g tejido.
CAT: catalasa; DTD: DT-diaforasa; GPX: glutation peroxidasa; GR: glutation reductasa; GST: glutation
transferasa; SOD: superóxido dismutasa; TBARs: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico
En general se observó un descenso significativo de las actividades antioxidantes
determinadas en hígado al final del periodo de ayuno, tal es el caso de las actividades
catalasa (CAT), DT-diaforasa (DTD), glutation peroxidasa (GPX) y glutation transferasa
(GST). En la primera de ellas se produjo una recuperación al cabo de 60 días de
172
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
realimentación; en las demás esta recuperación llevó a valores más altos el día 100 para
después alcanzar valores similares o superiores a las controles.
El ayuno afectó a las actividades glutation reductasa (GR) y superóxido dismutasa
(SOD), pero mientras que en la primera se observó un descenso con la realimentación,
en la segunda produjo un aumento de la actividad el día 100, con un descenso posterior
hasta valores similares al control.
El ayuno de 60 días provocó un daño oxidativo de lípidos del hígado. La
realimentación trajo consigo una disminución significativa del mismo de forma que, en
tan sólo 20 días, los valores de TBARs disminuyeron hasta valores similares al control y
luego se estabilizó.
V.3.5.2. MÚSCULO
Tabla V.3.12. Efecto del ayuno de 60 días (lote S/RF11) sobre la actividad de
algunos enzimas indicadores del estrés oxidativo y nivel de peroxidación lipídica
en el músculo de la corvina tomando como referencia el grupo control
alimentado (F11).
CAT1
DTD2
GPX2
GR2
GST2
SOD1
TBARs3
Grupo
S/RF11-60
F11-60
n.d.
1.33*
18.99*
0.48*
7.30*
21.23*
0.09
0.79
0.03
0.37
1.42
22.90*
0.52
n.d.
1.91
14.77
0.33
4.90
15.71
39.72
0.18
1.02
0.03
0.28
0.75
2.52
Los valores son media ± EEM (N=6). * Indica diferencias significativas (P<0.05) entre S/RF11 y su control
(F11).
1
2
3
Expresado como U/mg proteína. Expresado como mU/mg proteína. Expresado como nmol MDA/g tejido.
CAT: catalasa; DTD: DT-diaforasa; GPX: glutation peroxidasa; GR: glutation reductasa; GST: glutation
transferasa; SOD: superóxido dismutasa; TBARs: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico
Tabla V.3.13. Evolución temporal de la actividad de algunas enzimas indicadoras
del estrés oxidativo y nivel de peroxidación lipídica en el músculo de la corvina
durante un periodo de realimentación de 60 días tras un ayuno de 60 días. (día
60: inicio de la realimentación).
Día
CAT1
DTD2
GPX2
GR2
GST2
SOD1
TBARs3
60
n.d.
1.33a
18.99b
0.48b
7.30b
21.23b
22.90a
0.09
0.79
0.03
0.37
1.42
0.52
n.d.
2.20b
19.50b
0.53b
7.29b
19.35b
21.31a
0.17
1.94
0.04
0.73
0.57
1.83
n.d.
3.47c
21.47b
0.48b
7.28b
18.83b
35.85b
0.26
1.38
0.04
0.57
1.74
3.71
n.d.
2.28b
11.86a
0.30a
3.68a
11.45a
23.56a
0.16
0.45
0.02
0.12
0.98
2.15
80
100
120
Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas a lo largo del tiempo
(P<0.05)
1
2
3
Expresado como U/mg proteína. Expresado como mU/mg proteína. Expresado como nmol MDA/g tejido.
CAT: catalasa; DTD: DT-diaforasa; GPX: glutation peroxidasa; GR: glutation reductasa; GST: glutation
transferasa; SOD: superóxido dismutasa; TBARs: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico
173
Sergio García Mesa
En la tabla V.3.12. se comparan los datos referentes al estatus oxidativo en
músculo de los animales que han soportado un ayuno de 60 días (S/RF11) frente al
grupo control (F11). Los valores de las actividades específicas de enzimas relacionadas
con el estrés oxidativo y el nivel de peroxidación lipídica en músculo aparecen en la tabla
V.3.13. No pudimos determinar actividad CAT en este tejido con la técnica empleada.
V.4. DISCUSIÓN
V.4.1. Efectos del ayuno
SOBRE EL CRECIMIENTO, LA BIOMETRÍA Y LA COMPOSICIÓN.
El ayuno de organismos heterótrofos se ha definido como la insuficiencia de una
ración determinada para compensar las pérdidas metabólicas (Bayne, 1973), lo que
conduce a la pérdida de peso, posiblemente el signo más obvio y con mayor frecuencia
documentado como respuesta al ayuno. La pérdida de masa orgánica durante el ayuno
es inevitable y, simplemente, una consecuencia de las primera y segunda leyes de la
termodinámica (McCue, 2010).
Durante el ayuno, los peces parecen usar estrategias para conservar la energía
corporal, la cual debe satisfacer sus necesidades calóricas, minimizando la pérdida de la
misma (Navarro y Gutiérrez, 1995; Figueroa et al., 2000). Reducir el gasto energético
debería lograrse por cambios fisiológicos y/o comportamentales.
La tasa a la que los animales pierden peso es muy variable dependiendo de dos
factores generales. Primero, los animales difieren en lo que respecta al total de
necesidades energéticas, que dependen del peso, la temperatura corporal y la posición
filogenética (Garland et al., 2005; Muñoz-García y Williams, 2005). Segundo, los
animales también difieren en cómo administran sus reservas energéticas durante el
ayuno (Coulson y Hernández, 1968; Bryden y Stokes, 1969; Lindstedt y Boyce, 1985;
Navarro y Gutiérrez, 1995; McCue, 2007).
En el presente estudio los peces ayunados disminuyeron su peso corporal en un
12% tomando como referencia los animales que se alimentaron con una ración 1.1 %
(peso corporal/día). Estas pérdidas de peso (0.21%/día) fueron muy inferiores a las que
se encontraron en dorada (0.63%/día) o trucha (0.82%/día) (Power et al., 2000;
Pottinger et al., 2003), también sometidas a ayuno. La capacidad de resistir a la pérdida
de masa corporal podría ser una adaptación plausible al ayuno (figura V.4.1.).
174
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
% Variación
GAP
IRP
SGR
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
-40
Figura V.4.1. Efecto del ayuno sobre Ganancia
Absoluta de Peso (GAP), Incremento Relativo de
Peso (IRP) y Tasa de Crecimiento Específico
(SGR). Los datos son representados como % de
variación de los distintos parámetros en los
animales sometidos a ayuno respecto a su
grupo control F11.
Muchos autores han encontrado que durante el ayuno los peces pierden peso
según una determinada secuencia temporal, primero la pérdida es más rápida y luego
sigue una fase de pérdida lenta volviendo, finalmente, a una nueva aceleración de la
misma (Kristoffersson y Broberg, 1971; Moon, 1983; Hervant y Renault, 2002; Comoglio
et al., 2004; McCue, 2010). Se podría considerar que el cambio entre las dos primeras
fases citadas significa algún tipo de aclimatación, en el que la tasa metabólica se regula
hacia abajo (Hepher et al., 1983; Ali et al., 2003). Echevarría et al. (1997) propusieron
que la disminución en el peso de lubinas ayunadas se desarrolla en 2 fases, con un punto
de inflexión a los 50 días de ayuno. Esto sugiere, en principio, una primera fase en la que
predomina la movilización de las reservas energéticas, y una segunda en la que el factor
predominante es la movilización de las estructuras (principalmente, músculo). No
obstante, en este experimento el punto de inflexión se hallaría a los 40 días de ayuno,
siendo la tasa de pérdida de peso mucho más lenta desde ese momento hasta el final
del periodo de ayuno (figura V.4.2).
130
gramos
120
110
S/RF11
100
F11
90
80
Figura V.4.2. Evolución del peso de las
corvinas ayunadas (S/RF11) frente al grupo
control alimentado (F11).
70
60
0
20 Días
40
60
Power et al. (2000) encontraron en lubina que el ayuno de 3 semanas causó un
descenso significativo del peso, sin embargo no se produjeron cambios en el índice de
condición (K), coincidiendo con Love (1980) en que este índice es una medida fisiológica
inadecuada de ayuno. Por el contrario, otros autores lo consideran una herramienta
rápida y eficaz para valorar el estado nutricional de los peces (Rueda et al., 1998; Gaylor
y Gatlin, 2000; Qian et al., 2000; Xie et al., 2001; Zhu et al., 2001; Cho et al., 2006) ya
175
Sergio García Mesa
que su descenso se correlaciona con la privación de alimento, lo que está de acuerdo
con los resultados obtenidos en este estudio, en el que K es significativamente menor a
los 60 días de ayuno (figura V.4.3.).
K
IHS
IDS
IVS
RF
20
% variación
0
-20
-40
-60
-80
Figura V.4.3. Efecto del ayuno sobre
distintos índices biométricos en corvina.
Los datos se representan como % de
variación de los distintos parámetros en
los animales sometidos a ayuno
respecto a su grupo control F11
Otros índices que se pueden emplear como indicadores del estado fisiológico de
los peces, son el hepatosomático (IHS) y el disgestomático (IDS) (figura V.4.3.), pues la
disminución de peso de estos compartimentos corporales provoca que los peces se
“estilicen” y, consecuente, K se vea afectado también (Creach y Bouche, 1969; Renaud y
Moon, 1980; Black y Love, 1986; Foster y Moon, 1991; Farbridge y Leatherland, 1992;
Grigorakis y Alexis, 2005).
Durante el ayuno, la dinámica de la utilización de la energía endógena puede
diferir entre especies (Takahashi et al., 2011), pues algunos peces movilizan en primera
instancia las reservas de carbohidratos, mientras que otros hacen lo propio con los
lípidos, en cualquier caso la degradación de la proteínas parece ser el último recurso
(Black y Love, 1986; Castellini y Rea, 1992; Navarro y Gutiérrez, 1995; Bines, 1999;
Hervant et al., 2001; Caloin, 2004).
El hígado es uno de los órganos más afectados por el ayuno y normalmente el
glucógeno (cuyo almacén principal en peces es esta víscera) es la primera reserva que
se usa como fuente de energía (Kamra, 1966; Sakaguchi, 1976; Renaud y Moon, 1980;
Morata et al., 1982; Foster y Moon, 1991; Navarro y Gutiérrez, 1995; Echevarría et al.,
1997; Metón et al., 2003). Sin embargo se ha registrado en algunas especies, como la
carpa (C. carpio), el mantenimiento del contenido de glucógeno hepático tras 67 días de
ayuno (Navarro y Gutiérrez, 1995), ya que en estas especies se mantiene para ser capaz
de sobrevivir en condiciones de anoxia. El que las corvinas privadas de alimento
conserven, tras 60 días, el 28% del glucógeno hepático con respecto a las alimentadas
(figura V.4.4.A.), podría indicar, al igual que en otras especies (Navarro y Gutiérrez, 1995;
Hung et al., 1997; Shimeno et al., 1997; Power et al., 2000; Figuereido-Garutti et al.,
176
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
2002; Metón et al., 2003; Pérez-Jiménez et al., 2007; Furné et al., 2012), que pueda
sobrevivir un periodo más prolongado de 60 días de ayuno, tal como Chrysophrys major,
en la que no se agota el glucógeno hepático hasta pasados 92 días de ayuno (Yamauchi
et al., 1975).
En general, el ayuno ejerce poca influencia en la tasa de síntesis proteica
hepática en peces, aunque la de degradación aumenta bajo tales condiciones (Cowey y
Walton, 1989; Navarro y Gutiérrez, 1995). En Macquaria ambigua, si la privación de
alimento se prolonga 60 días, se produce un descenso en el contenido de las proteínas
hepáticas (Collins y Anderson, 1995). En las corvinas las proteínas hepáticas no parecen
afectarse por un ayuno de esta duración (figura V.4.4.A.), posiblemente porque estos
animales desarrollen estrategias fisiológicas para reciclar las proteínas endógenas,
reduciendo los requerimientos gluconeogénicos o minimizando de otra manera la
pérdida neta de proteínas durante el ayuno. Este ahorro proteico podría servir al
mantenimiento de las funciones vitales (Nelson, 1987; Hoffer y Forse, 1990; Cherel et al.
1991; Battley et al., 2001; Holecek et al., 2001).
A
B
%Glucógeno %Proteínas
-40
-60
-80
% variación
% variación
-20
%Minerales %Glucógeno %Proteínas
10
20
0
%Lípidos
0
-10
-20
-30
Figura V.4.4. A, efecto del ayuno sobre la composición del hígado de las corvinas. B, efecto del ayuno sobre la
composición del músculo de las corvinas. Los datos son representados como % de variación de los distintos
parámetros en los animales sometidos a ayuno respecto a los de su grupo control, F11.
Al ser el componente más abundante (más de la mitad del peso corporal según
Mommsen, 2001), el músculo esquelético sirve de reservorio de proteínas en algunos
animales durante el ayuno (Cherel et al., 1991; Houlihan, 1991; Piersma et al., 1999;
Bauchinger y Biebach, 2001; McCue, 2010) pero, a menudo, la locomoción obliga a que
se diferencien qué grupos musculares se pueden atrofiar (Yacoe, 1983; Nelson, 1987;
Parker y Holm, 1990; Cherel et al., 1991; Piersma et al., 1999; Bauchinger y Biebach,
2005).
El índice rendimiento del filete (RF) señala la importancia del músculo
esquelético en relación al peso del animal. Como indica la figura V.4.3., el ayuno conlleva
177
Sergio García Mesa
que este índice disminuya de forma considerable, cosa no se detectó en otras especies
(Dubost et al., 1997; Nagai y Ikeda, 1971; Rasmussen et al., 2000). El descenso del RF,
debido muy probablemente a la degradación del músculo blanco (Blasco et al., 1992;
van Dijik et al., 2005), junto con el descenso del IHS, contribuyó a que el valor de K
disminuyera tras el ayuno.
En peces, el metabolismo está fundamentalmente basado en los lípidos y las
proteínas, en particular en carnívoros (Jobling, 1994), en los que lípidos a menudo
constituyen la principal fuente para el mantenimiento en condiciones adversas
(Weatherley y Gill, 1987; Bull y Metcalfe, 1997). Si éstas se prolongan, aumenta la
proteolisis muscular y la movilización de los aminoácidos derivados de las proteínas
musculares para la utilización en otros tejidos más vitales (Navarro y Gutiérrez, 1995).
Los datos de composición del músculo (figura V.4.4.B.) muestran importantes
cambios en el mismo durante el ayuno. Se observa un aumento del contenido de agua y
minerales acompañado de un descenso de los lípidos y proteínas, de forma similar a lo
que encontraron Quinton y Blake (1990) en trucha arcoíris ayunada 3 semanas.
Love (1970) encontró en el bacalao (G. morhua) en ayunas que el aumento del
contenido de agua en músculo, por encima del valor control de 81%, correspondía con la
cantidad de proteína utilizada. Las pérdidas de materia orgánicas en los animales
sometidos a ayuno pueden confundirse con cambios similares en el contenido de agua
en tejidos y órganos. Se sabe que el contenido de agua aumenta en los tejidos y órganos
durante el ayuno (Grably y Peiery, 1981; Woo y Murat, 1981; Moon, 1983; Blasco et al.,
1992; Yi y Chang, 1994; Hervant et al., 2001; Frick et al., 2008a). Un aumento de la
hidratación de los tejidos juega un papel en la limitación de la pérdida o mantenimiento
del peso húmedo corporal durante el ayuno (Love, 1970). En la figura V.4.5. se
representa una estimación de la pérdida de músculo debida al ayuno (calculada a partir
del peso de los animales y de los correspondientes RF), observándose diferencias al
expresarlo tanto en % en sustancia fresca como % en sustancia seca. Vemos que la
pérdida de masa muscular es menor si se expresa en sustancia seca, o sea, la hidratación
del músculo de las corvinas ayunadas podría hacer que la magnitud de la pérdida
corporal total fuera menor la pérdida de peso corporal y esto enmascararía
parcialmente el verdadero descenso de peso “orgánico” de los animales. Un descenso
drástico en el peso de los peces puede suponer un grave riesgo en su supervivencia, más
allá de las cuestiones metabólicas, pues un brusco descenso del mismo podría provocar,
incluso, problemas de flotabilidad.
178
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
∆ Peso músculo
0
-10
-20
Figura V.4.5. Variación del peso del músculo de
las corvinas tras el ayuno de 60 días, expresado en
% sustancia fresca y % sustancia seca
-30
-40
% Sust. fresca
% Sust. seca
La sustitución de la materia orgánica perdida por agua no está completamente
entendida (Navarro y Gutiérrez, 1995), pero una posible explicación es la de que el
incremento del contenido de agua en los tejidos resulta de una aumento de la presión
osmótica de los mismos que deriva, a su vez, del de los niveles de metabolitos. Una
segunda posibilidad es la de que las células reemplacen la materia orgánica con agua
para mantener el tamaño y, por lo tanto, la funcionalidad durante el ayuno (McCue,
2010).
El contenido graso del músculo de las corvinas disminuye tras el ayuno; este
descenso, aunque significativo, es menor al que cabría esperar, lo que podría ser debido
al bajo contenido en grasa de la corvina. En especies con alto contenido en grasa
muscular, la movilización de los lípidos intramusculares se inicia en cuanto cesa la
alimentación. Rhamdia hilarii, al igual que la corvina, no presenta un tejido adiposo
organizado o visible en la cavidad abdominal y durante el ayuno los lípidos
intramusculares (5% del peso fresco) juegan un papel importante en las necesidades
energéticas totales (Machado et al., 1988). En esta especie, tras 30 días de ayuno, la
grasa muscular se redujo una quinta parte, lo que, considerando que el músculo
constituye el 60-70% del peso, representa una importante fuente de energía. Los lípidos
se utilizan de diferente forma para proporcionar la energía requerida para el
metabolismo fundamental durante el ayuno (Gaylord y Gatlin, 2000; Zhu et al., 2001;
Takahashi et al., 2011). Descensos similares en el contenido de lípidos en músculo se
han registrado en esturión, dorada, lubina y dentón (Grigorakis y Alexis, 2005; Furné et
al., 2012; Pérez-Jiménez et al., 2012, respectivamente).
Las proteínas musculares se ven notablemente afectadas en una especie magra
como la corvina, cuyo músculo, como hemos indicado, presenta unos bajos porcentajes
de grasa y glucógeno. Durante periodos de ayuno largos, se inicia el catabolismo de las
proteínas musculares y los aminoácidos resultantes pasan a ser las principales fuentes
de energía de los peces (Love, 1970; Walton y Cowey, 1982). Según Nagai y Ikeda, (1971)
el ayuno de 2 meses en perca produjo un descenso del RF y de las proteínas musculares,
de modo que el contenido de las proteínas en el cuerpo entero cayó un 22%, frente a la
179
Sergio García Mesa
caída del 30% encontrada en las proteínas del músculo de corvina en el mismo periodo
de ayuno.
Lowery y Somero (1990) demostraron que el ayuno prolongado en Paralabrax
nebulifer resultó en un descenso de la concentración de las proteínas del músculo
blanco. Además, estos autores pusieron de manifiesto un control selectivo en la síntesis
proteica durante el ayuno, sugiriendo que la regulación podría servir para mantener el
equilibrio entre la actividad relativa de las enzimas musculares. Cuando las proteínas
musculares se degradan, se eliminan preferentemente algunas de las proteínas
contráctiles y solubles (Navarro y Gutiérrez, 1995). Estudios posteriores confirmaron la
movilización de proteínas de la fracción miofibrilar a la sarcoplasmática en el músculo
del bacalao (Beaulieu y Guderley, 1998).
En cualquier caso, la movilización de las proteínas del músculo esquelético a
consecuencia del ayuno ha sido descrita en numerosas especies de peces (Stirling, 1976;
Alliot et al., 1984; Pastoureaud, 1991; Echevarría et al., 1997; Pérez-Jiménez et al.,
2007).
El contenido de glucógeno muscular apenas se ve afectado por el ayuno en
algunas especies de peces (Dave et al., 1975; Gutiérrez et al., 1991; Blasco et al., 1992;
Barcellos et al., 2010; Furné et al., 2012), lo que indica que es un sustrato poco utilizado
por el músculo blanco en tales condiciones. Generalmente se asume que el glucógeno
muscular de los peces contribuye poco al gasto energético total (Machado et al., 1988)
ya que se emplea en los episodios de natación explosiva, relacionados con conductas de
escape o captura de alimento, en las que dicho músculo utiliza el glucógeno de forma
anaerobia (Wood, 1991; Moon y Foster, 1995). Debe tenerse en cuenta, por su
inmediata participación en la actividad muscular, que el glucógeno es aquí un
compuesto muy inestable y que su movilización está más relacionada con el aumento de
la actividad muscular que con los procesos de ayuno.
El aumento relativo de minerales observado en el músculo durante el ayuno
(figura V.4.4.B.) podría deberse al mantenimiento de los valores absolutos de éstos
añadido a la disminución del contenido lipídico y proteico. Un beneficio potencial de
mantener los micronutrientes esenciales en el músculo sería la posibilidad de un
crecimiento más rápido ante la reversión de la situación de ayuno (Prunescu et al., 2003;
McCue, 2010).
El almacenamiento alternativo de algunas sustancias como lípidos y glucógeno
presenta inconvenientes en el medio acuoso. Aunque los lípidos proporcionan el mayor
contenido energético por unidad de peso entre los compuestos de almacenamiento, sus
180
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
ventajas energéticas deben valorarse conjuntamente con sus contribuciones positivas a
la flotabilidad y su relativamente lenta tasa de movilización comparada con la de
glucógeno o proteínas. En los respiradores acuáticos que tienen que trabajar dentro de
las limitaciones impuestas por la relativamente baja solubilidad del oxígeno en el agua,
el uso energético de los lípidos podrían interpretarse como un inconveniente, dado su
menor coeficiente respiratorio (< 0.7 J/unidad de O2 para lípidos, frente a >0.9 J/ unidad
de O2 para proteínas) apuntando de nuevo a las proteínas como sustrato oxidativo
primario (Mommsen, 2001). Esto podría explicar, en parte, porque los peces en general
sometidos a un periodo de ayuno tan prolongado no agotan sus reservas lipídicas ni
glucogénicas antes de comenzar a movilizar sus reservas proteicas.
SOBRE EL METABOLISMO INTERMEDIARIO
Como se ha comentado anteriormente, el ayuno supone un reajuste que atañe
tanto a aspectos fisiológicos como comportamentales. Entre los aspectos fisiológicos, el
metabolismo intermediario entrañará el empleo y/o regulación de unas rutas
metabólicas frente a otras a partir de las reservas corporales. La disminución de la tasa
metabólica general durante la restricción alimentaria de los peces se ha descrito por
numerosos autores (Beamish, 1964; Love, 1970, 1980; Blaxter y Ehrlich, 1974; Jobling,
1980; Johnston, 1981; Du Preez et al., 1986 a, b; Wieser et al., 1992; Navarro y
Gutiérrez, 1995; Hemre et al., 2002; Furné et al., 2012).
Según Moon y Foster, 1995, se han identificado dos etapas durante el ayuno en
lo que concierne al metabolismo, una inicial con pocos cambios metabólicos seguido de
otra con cambios más intensos, razón por la que se decidió analizar los niveles de las
enzimas del metabolismo intermediario en corvina tras un ayuno largo de 60 días.
Los cambios en el metabolismo de los carbohidratos durante el ayuno pueden
estudiarse a través de la determinación de la actividad de enzimas implicadas en la
glucolisis como hexokinasa (HK) y piruvato kinasa (PK) (Moon, 1983; Méndez y Wieser,
1993; Soengas et al., 1996, 1998), en la gluconeogénesis como la fructosa
1,6,bisfosfatasa (F16Pasa), así como varias transaminasas (Klain et al., 1977; Moon,
1983; Foster y Moon, 1991; Soengas et al., 1996; Segner et al., 1997).
En diversas especies de peces se ha puesto de manifiesto que tanto la
glucogenolisis hepática como el menor uso de la glucosa circulante contribuyen al
mantenimiento de la glucemia durante el ayuno (Hung et al., 1997; Shimeno et al., 1997;
Power et al., 2000; Figuereido-Garutti et al., 2002; Metón et al., 2003; Pottinger et al.,
2003; Polakof et al., 2007; Furné et al., 2012). Nuestros resultados han mostrado una
inhibición de las actividades PK y HK hepáticas durante el ayuno de las corvinas (figura
181
Sergio García Mesa
V.4.6.), en línea con lo descrito previamente por otros autores (Shimeno et al., 1997;
Kirchner et al., 2005; Furné et al., 2012; Pérez-Jiménez et al., 2012), que también
detectan una disminución de estas actividades. Dado que la PK está situada “más abajo”
en la ruta glucolítica, podríamos pensar que la misma se encuentra bastante inhibida en
el ayuno. La menor disminución de la actividad HK podría proveer de glucosa fosforilada
para otros fines. A su vez, una baja tasa de glucolisis podría influir sobre la tasa de
glucogenolisis, que pese a ser importante (figura V.4.4.A.), no llega a agotar estas
reservas pese a lo prolongado del ayuno, tal y como se ha comentado antes.
ACoAT
CS
EM FBPasaG6PDH GDH
GOT
GPT
GyK
HK
HOAD LDH
PK
80
60
% variación
40
20
0
-20
-40
-60
-80
-100
Figura V.4.6. Efecto del ayuno sobre los niveles de actividad de las enzimas del metabolismo intermediario
hepático en corvinas. Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en los
animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control alimentado, F11
La gluconeogénesis hepática, indicada por la actividad de la FBPasa, aunque algo
menor a las corvinas ayunadas, prácticamente se mantiene con respecto al control. Esto
ya fue detectado en otras especies por Pérez-Jiménez et al. (2012) y Furné et al. (2012)
lo que, unido la inhibición de la HK hepática descrita anteriormente podría indicar un
mantenimiento de la glucemia en estos animales, tal como encontraron Moon et al.
(1989) en trucha arcoíris o Navarro et al. (1992) en la trucha Salmo trutta. No obstante,
algunos autores han observado un incremento de la actividad FBPasa en otras especies
de peces (Navarro y Gutiérrez, 1995; Soengas et al., 1996; Segner et al., 1997; Metón et
al., 2003; Kirchner et al., 2005) para contribuir al mantenimiento de la glucemia. En
nuestro caso, de los posibles sustratos gluconeogénicos, los aminoácidos y derivados de
la oxidación de ácidos grasos son los que parecen adquirir más importancia, como lo
demuestra el mantenimiento de las actividades de GDH y de GOT y la elevada actividad
de GPT por un lado y el mantenimiento de la de HOAD por otro, como más adelante se
expondrá; en cambio, podemos descartar el posible uso de otros sustratos
182
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
gluconeogénicos como el lactato o el glicerol, dada la disminución de las actividades LDH
y GyK (figura V.4.6.).
La actividad de la CS, enzima implicada en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos
(CAT), es considerada como reflejo de la capacidad aeróbica de un organismo por lo que
el análisis de la misma puede arrojar luz sobre si se producen cambios en la citada
capacidad de los peces durante condiciones adversas (Frick et al., 2008b). El descenso de
la actividad CS hepática detectado en la corvina en ayunas (figura V.4.6.) supone que el
metabolismo aerobio se ha reducido, lo que puede ser considerado una medida de
ahorro energético para la supervivencia de los animales, de modo que sus necesidades
metabólicas estén ahora por debajo de las que imperan en animales alimentados. Esta
reducción podría explicar la relativamente leve pérdida de peso y el no agotamiento de
las reservas corporales a los que antes nos hemos referido.
Durante el ayuno de las corvinas se ha observado una disminución significativa
de la actividad de dos de las enzimas implicadas en la síntesis de lípidos, la G6PDH
citoplasmática y la EM mitocondrial, lo que también ocurre en trucha arcoíris (Bastrop et
al., 1991), dentón (Pérez-Jiménez et al., 2012) y esturión (Furné et al., 2012). Ambas
enzimas generan poder reductor en forma de NADPH necesario para la lipogénesis
(Arnesen et al., 1993; Bouraoi et al., 2011). Esta disminución coincide con la observada
en el contenido en lípidos del músculo de las corvinas ayunadas, debido a que el hígado
es el órgano más importante para la síntesis de ácidos grasos (Lin et al., 1977; Likimani y
Wilson, 1982).
El descenso del contenido lipídico de músculo también está relacionado con el
mantenimiento de la actividad HOAD (figura V.4.6.), ya que si se mantiene la lipolisis en
niveles parecidos a situaciones control y se inhibe la lipogénesis, el balance del
contenido muscular de lípidos será negativo, lo que indicaría la movilización de las
reservas lipídicas musculares con fines energéticos.
El ayuno genera en mamíferos una situación cetogénica asociada con una
utilización acelerada de los ácidos grasos, mejorando la gluconeogénesis (Cahill, 1970).
En teleósteos, los datos sobre el metabolismo de los cuerpos cetónicos en ayunas
proporciona resultados controvertidos. Zammit y Newsholme (1979) especulaban que el
ayuno, a diferencia de lo que ocurre en mamíferos, no genera una dependencia de los
cuerpos cetónicos pero sí de los ácidos grasos. Nuestros datos sobre la actividad ACoAT
irían en línea con ello y con lo encontrado por Pérez-Jiménez et al. (2012).
183
Sergio García Mesa
Numerosos autores han descrito que el aumento de la β-oxidación suministra un
exceso de acetil CoA que podría desequilibrar el ciclo de Krebs, pues el acetil CoA se
fusiona con el oxalacetato por medio de la CS; este exceso de acetil CoA podría colapsar
el ciclo e inhibir el metabolismo oxidativo; para evitarlo, se produce un aumento de la
actividad HOAD paralelo al de la actividad CS y alguna enzima que proporcione
intermediarios del ciclo de Krebs, con la finalidad de que ésta cumpla su objetivo (Frick
et al., 2008b; Pérez-Jiménez et al., 2009; Furné et al., 2012). En las corvinas ayunadas la
actividad CS disminuye a pesar de que la HOAD se mantiene en valores similares a los de
los peces alimentados (figura V.4.6.), esto podría indicar que el acetil CoA generado por
la β-oxidación se derivaría hacia gluconeogénesis (que también mantiene los valores
similares a los de las corvinas alimentadas), ya que como se ha indicado antes la
cetogénesis hepática está disminuida (inhibición de la actividad de ACoAT) (figura
V.4.6.).
Se ha podido observar en las corvinas sometidas a ayuno el mantenimiento de las
actividades de GOT y GDH (figura V.4.6.), encargadas de la producción de oxalacetato y
α-cetoglutarato, respectivamente, ambos intermediarios del ciclo de Krebs. También se
ha producido un aumento significativo de la transaminasa hepática GPT encargada de la
producción de piruvato a partir de alanina. Estos resultados indican la utilización de las
proteínas musculares para el mantenimiento de la glucemia en los peces en ayunas. Se
ha descrito por numerosos autores que el aumento de las actividades de FBPasa, GDH,
GPT y GOT favorece la vía gluconeogénica a partir de aminoácidos (Suárez y Mommsen,
1987; Larsson y Lewander, 1973; Cowey et al., 1977; Sakamoto et al., 1978; French et al.,
1981; Lupiáñez et al., 1989; Vieira et al., 2005; Furné et al., 2012; Pérez-Jiménez et al.,
2012).
En resumen, los resultados muestran que las corvinas en situación de ayuno
prolongado obtienen la energía de las proteínas y lípidos corporales, que se movilizan
hasta el hígado para la obtención de energía y producción de la glucosa necesaria para
aquellos órganos en los que esta molécula es un sustrato preferente.
En el músculo blanco (figura V.4.7.) nos encontramos un ajuste metabólico frente
al ayuno diferente al del hígado.
La ruta glucolítica (actividades HK y PK) del músculo (figura V.4.7.) está
disminuida tras 60 días de ayuno, el descenso del empleo de los carbohidratos con fines
energéticos estaría de acuerdo con un menor uso del glucógeno muscular durante el
ayuno (Dave et al., 1975; Gutiérrez et al., 1991; Blasco et al., 1992), reservándose con
otros fines, como sería la producción de energía en anaerobiosis durante la natación
184
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
explosiva para, por ejemplo, escapar de depredadores. En especies como la trucha
arcoíris (Furné et al., 2012) y el dentón (Pérez-Jiménez et al., 2012), el ayuno provoca un
aumento significativo de la actividad de la PK muscular, que se correlaciona con un
descenso en el contenido de glucógeno. Pero en corvina en situación de ayuno
prolongado, el catabolismo de los carbohidratos no parece tener tanta importancia en la
producción de energía metabólica, ya que la actividad LDH de músculo blanco también
se encuentra disminuida, con un 50% de inhibición con respecto al control. Por tanto, la
contribución del músculo a las necesidades energéticas durante el ayuno prolongado se
basará preferentemente en la degradación de proteínas y lípidos.
ACoAT
CS
EM FBPasa GDH
GOT
GPT
GyK
HK
HOAD LDH
PK
220
% variación
170
120
70
20
-30
-80
Figura V.4.7. Efecto del ayuno sobre los niveles de actividad de las enzimas del metabolismo intermediario
muscular en corvinas. Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en los
animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control F11
La actividad gluconeogénica (FBPasa) muscular se mantiene durante el ayuno
(figura V.4.7.) al igual que ocurría en el hígado, lo que pone de nuevo de manifiesto la
importancia de la glucosa en determinados tejidos. Pero en el caso del músculo, el
sustrato gluconeogénico principal podría ser el glicerol, pues de los sustratos posibles, la
actividad enzimática relacionada que aumenta es la GyK (figura V.4.7.) tal como ocurre
en el dentón (Pérez-Jiménez et al., 2009).
La reducida proporción de lípidos en músculo en esta especie se asocia a una
menor actividad lipogénica durante el ayuno (deducida a partir de la inhibición de la EM,
y de la escasa, si alguna, actividad G6PDH) y a una mayor actividad de las enzimas
lipolíticas, HOAD y GyK (figura V.4.7.) dando lugar a que ésta sea la ruta prioritaria para
la obtención de energía y movilización de sustratos a otros órganos. Este descenso del
contenido de lípidos musculares y el aumento de las actividades de enzimas lipolíticas ha
185
Sergio García Mesa
sido descrito en trucha y esturión (Furné et al., 2012), dentón (Pérez-Jiménez et al.,
2012) y lubina (Pérez-Jiménez et al., 2007); en este último caso, las lubinas sometidas a
ayuno presentaron una reducción del contenido lipídico muscular y de la actividad
HOAD, indicando que los lípidos musculares eran exportados a otros tejidos para ser
metabolizados (Moon y Foster, 1995). En corvina en ayunas hemos detectado un
aumento superior al 200% de la actividad HOAD con respecto a las controles, esta gran
activación podría suplir tanto las necesidades metabólicas del músculo como del hígado,
dado que en este órgano los niveles de esta enzima se mantenían en los mismos niveles
que los peces controles.
El aumento de la actividad de CS proporcionaría una vía de utilización del acetil
CoA generado por esta oxidación aumentada de los ácidos grasos. Ahora bien, la
reacción de la CS también requiere ácido oxalacético para continuar y que no se colapse
el ciclo; el piruvato es el principal precursor del oxalacético, por lo que la actividad de
GPT hepática y GOT muscular podría satisfacer esta demanda. No obstante, una parte
del acetilCoA proporcionado por la β-oxidación se utilizará para dar cuerpos cetónicos
(3-β hidroxibutirato o acetoacetilCoA) como indica el aumento de la actividad ACoAT
(figura V.4.7.).
El mantenimiento y/o aumento de las actividades transaminasas junto con el
descenso de la proporción de las proteínas musculares parecen indicar el uso de este
sustrato con fines energéticos (Blasco et al., 1992; Furné, et al. 2012).
Cabría esperar que el ayuno prolongado aumentase la proteolisis muscular,
además de disminuir la tasa de síntesis proteica. En nuestro estudio el aumento de la
proteolisis se pone de manifiesto por la disminución del contenido proteico muscular
observado, que da lugar a que el balance final de proteínas musculares sea negativo, sin
embargo, no tenemos evidencia metabólica sobre la tasa de síntesis proteica.
En definitiva, durante el ayuno se encuentran inhibidas las rutas glucolíticas del
músculo, reservándose el glucógeno muscular para otros fines. La vía prioritaria para la
obtención de energía en músculo se centra en el metabolismo de ácidos grasos, que se
acompaña de un aumento de la capacidad aerobia del músculo, además de la
degradación de las proteínas musculares para obtener energía.
186
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
SOBRE EL STATUS OXIDATIVO.
Las actividades de las enzimas CAT, DTD, GPX, GR, GST, SOD y el índice de
peroxidación lipídica (TBARs) se han descrito como biomarcadores útiles de la situación
prooxidante en mamíferos (Robinson et al., 1997; Gomi y Matsuo, 1998; Domenicali et
al., 2001) y en peces (Stephensen et al., 2002; Pandey et al., 2003; Pascual et al., 2003;
Morales et al., 2004; Trenzado et al., 2006; Furné et al., 2009b; Bayir et al., 2011); por
otra parte, es sabido que el ayuno puede afectar a las defensas antioxidantes en peces
(Pascual et al., 2003; Morales et al., 2004; Furné et al., 2009b).
En nuestro estudio, el ayuno prolongado de 60 días conlleva un descenso general
de las actividades enzimáticas antioxidantes (figura V.4.8.), debido posiblemente a que
el metabolismo oxidativo está muy disminuido y la energía obtenida a partir de las
reservas corporales se destina a la supervivencia de los individuos en detrimento del
status oxidativo, dándose una situación de conflicto energético en el que prima la
subsistencia de los animales (Guderley et al., 2003; Furné et al., 2012).
En general se ha constatado una mayor actividad de las enzimas antioxidantes en
hígado que en músculo (tablas V.3.11. y V.3.13.), muy posiblemente por ser el órgano de
mayor importancia en mantener la homeostasis corporal.
La peroxidación lipídica se ha usado comúnmente como indicador del daño
oxidativo y así, los niveles de MDA (TBARs), uno de los productos de la rotura de los
lipoperóxidos por los radicales libres (Griffiths et al., 2002) nos sirven para evaluar el
efecto del ayuno a largo plazo sobre este parámetro.
El ayuno aumentó notablemente los niveles de peroxidación lipídica en hígado de
corvina, lo que coincide con lo encontrado en trabajos realizados en otras especies
(Pascual et al., 2003; Morales et al., 2004; Furné et al., 2009b; Bayir et al., 2011). La
privación de alimento debe provocar un aumento de formación de especies reactivas del
oxígeno (ROS) y una disminución de la actividad de las defensas antioxidantes que
resultarán insuficientes para la eliminación de esos ROS, lo que conduce a la aparición
de lipoperóxidos (Bayir et al., 2011).
187
Sergio García Mesa
CAT
DTD
GPX
GR
GST
SOD
TBARs
500
% variación
400
300
200
100
0
-100
Figura V.4.8. Efecto del ayuno sobre los niveles de actividad de las enzimas del
estrés oxidativo y daño lipídico hepático en corvinas. Los datos son representados
como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a
ayuno respecto a su grupo control F11.
Los datos obtenidos por otros autores en cuanto al efecto del ayuno sobre las
actividades de las enzimas antioxidantes son muy dispersos: en bacalao del Atlántico se
observó un aumento de dicha actividad en el hígado (Guderley et al., 2003); Pascual et
al. (2003) observaron en dorada sometida a un periodo de ayuno, un descenso de la
actividad CAT y aumento de las de SOD, GR y GPX; en dentón, Morales et al. (2004)
encontraron que cinco semanas de ayuno provocaron un aumento de las actividades de
SOD, CAT y GPX hepáticas; en esturión y trucha se observó un descenso de las
actividades de SOD, CAT, GR y GPX hepáticas, pero no para la GR que se mantuvo en
trucha (Furné et al., 2009b); en Salmo trutta la privación de alimento provocó una mayor
actividad de CAT, SOD, GR y CAT y un descenso del 23% de la de GST frente a un grupo
control alimentado a saciedad (Bayir et al., 2011).
En este estudio, la actividad de SOD hepática no vio afectada por el ayuno, lo que
indica un mantenimiento en la producción de radicales superóxido. Como se ha descrito
anteriormente (figura V.4.6.), el ayuno provocó un descenso del metabolismo oxidativo,
indicado por la menor actividad CS hepática, por lo tanto cabría esperar una menor
producción de radicales libres y menor actividad SOD. Sin embargo, algunos
investigadores han encontrado que durante el ayuno aumentan la actividad HOAD
(situación que se da en las corvinas) y la producción de peróxidos de hidrógeno
(Kerckaert et al., 1982; Ishii et al., 1980; van der Branden et al., 1984), por lo que la
actividad SOD hepática sería insuficiente para eliminar los radicales libres generados
durante el ayuno, produciéndose y acumulándose daño oxidativo en las membranas
celulares, según indican los niveles de peroxidación lipídica (figura V.4.8.).
188
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
El daño oxidativo podría haber sido menor en las corvinas ayunadas, pues el H 2O2
producido por la SOD puede catalizarse por otras enzimas, CAT y GPX, sin embargo la
disminución de actividad de estas dos enzimas (figura V.4.8.) da lugar a que la cascada
de oxidación continúe en las biomoléculas. La menor actividad CAT (34%) implica una
menor descomposición del H2O2, éste a su vez, en combinación de radicales superóxido
(producidos por el metabolismo oxidativo y la β-oxidación), da lugar a radicales hidroxilo
(Brownlee et al., 1977) y oxígeno singlete (1O2) (Misra y Fridovich, 1972). La actividad
GPX (21% menor en corvinas ayunadas), además de descomponer el H2O2, parece tener
un papel importante en la protección y detoxificación a los lipoperóxidos (Little y
O’Brien, 1968; Nakano et al., 1999; Díaz et al., 2010), por lo que la cascada reactiva
continúa en los tejidos y además no se detoxifican los lipoperóxidos.
De la misma forma en que se ha descrito en estudios previos (Blom et al., 2000;
Pascual et al., 2003; Bayir et al., 2011), la actividad GST hepática de las corvina en ayuno
fue menor (64%) que en las que habías sido alimentadas. La GST posee un papel crítico
frente al daño oxidativo (George, 1994; Elia et al., 2003), pues previene el daño oxidativo
en los ácidos nucleicos y lipídicos, reduciendo los hidroperóxidos (Jackson et al., 2002).
Se ha propuesto que la vía de las pentosas fosfato es la ruta predominante que
genera NADPH, necesario para las defensas antioxidantes (Pandolfi et al., 1995; Gaetani
et al., 1994; Tian et al., 1999; Kirkman et al., 1999; Leopold y Loscalzo, 2000; Morales et
al., 2004); se podría pensar que la inhibición de la actividad G6PDH y EM observada en el
hígado de las corvinas ayunadas sea la causa de la inhibición generalizada observada en
las enzimas implicadas en esas defensas en el hígado. Por ejemplo, el posible déficit de
NADPH afecta la actividad GR, implicada en la génesis de GSH, necesario, a su vez, para
la actividad de GPX, que también se vería disminuida. De hecho se ha detectado en
peces en condiciones de ayuno (Benuck et al., 1995; Papadopoulos et al., 1997;
Robinson et al., 1997; Vendemiale et al., 2001; Pascual et al., 2003; Morales et al., 2004)
una menor tasa de reciclaje de GSH.
La actividad de la DTD hepática (enzima que protege a las membranas de
posibles daños por peroxidación lipídica) también se vio afectada negativamente por el
ayuno, siendo un 30% menor que en las corvinas usadas como controles. Como la
reacción de DTD depende del cofactor reducido NADPH, se podría invocar para este
descenso la misma razón que en los casos anteriores.
No sólo la mayor producción de radicales superóxido, sino también la de H 2O2 y
la menor actividad de las defensas antioxidantes enzimáticas, provocan que la tasa de
189
Sergio García Mesa
peroxidación de los lípidos sea un 500% superior en el hígado de las corvinas ayunadas,
con el consiguiente daño potencial del sistema de membranas de estas células.
Ha sido el hígado la principal diana de los estudios de estrés oxidativo, de ahí que
la bibliografía existente acerca de la influencia del ayuno en los indicadores del estrés
oxidativo en músculo y otros componentes corporales sea bastante más escasa.
Como hemos indicado antes, en nuestro estudio, las actividades de las enzimas
antioxidantes de músculo son notablemente inferiores a las encontradas en hígado
(figura V.4.9.). Por otra parte, a diferencia de lo que ocurría en aquella víscera, en este
caso hay un aumento general de la actividad de las defensas antioxidantes en respuesta
al ayuno y, en consecuencia, disminuye el nivel de peroxidación lipídica.
DTD
GPX
GR
GST
SOD
MDA
60
% variación
40
20
0
-20
-40
-60
Figura V.4.9. Efecto del ayuno sobre los niveles de actividad de las enzimas del
estrés oxidativo y daño lipídico muscular en corvinas. Los datos son representados
como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a
ayuno respecto a su grupo control F11.
El mantenimiento y/o aumento general de las actividades antioxidantes
musculares durante el ayuno se ha descrito con anterioridad en otras especies de peces
(Guderley et al., 2003 en bacalao del Atlántico; Furné et al., 2009b, en esturión y trucha),
éstos últimos observaron también un descenso de las mismas en el hígado, una
situación similar a la descrita para la corvina. En el último caso, esta situación se explica
sobre la base de que el músculo puede ser considerado como un tejido de reserva
energética que se moviliza en situación de ayuno (Guderley et al., 2003; Furné et al.,
2009b) por lo que sería lógico esperar un aumento de la actividad de sus defensas
antioxidantes con el fin de neutralizar el efecto prooxidante del ayuno y mantener estas
reservas hasta su degradación, lo que lleva a estos autores a considerar al hígado como
un mejor indicador ante posibles situaciones de estrés oxidativo.
190
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
La única enzima muscular, que como ocurría en el hígado, se deprime durante el
ayuno es la DT-diaforasa muscular, posiblemente por encontrarse en la célula con una
menor disponibilidad de NADPH derivada, en este caso, de una menor actividad de EM
(figura V.4.8.). Tal vez haya una preferencia por emplear el escaso NADPH celular en la
reducción del glutation (GSH), pues la enzima que se encarga de su reducción (GR) no se
encuentra inhibida, ni tampoco la que emplea este GSH (la GPX), en detrimento de la
actividad DT-diaforasa.
En resumen, hemos detectado importantes efectos del ayuno prolongado en las
rutas metabólicas del hígado de las corvinas. El metabolismo oxidativo disminuye con la
privación prolongada de alimento, lo que se puede interpretar como reflejo de una
reducción de las necesidades metabólicas lo que, a su vez, reduce el impacto sobre la
pérdida de peso y la magnitud de algunas reservas corporales. Se detectó el empleo de
las reservas glucogénicas del hígado aunque no se han agotado totalmente. También
hemos podido observar que esta especie obtiene energía durante el ayuno a partir de
lípidos y proteínas hepáticas y musculares, que se emplean como sustratos
gluconeogénicos en hígado para proporcionar glucosa a aquellos tejidos en los que es un
sustrato preferente.
Con respecto a las actividades implicadas en la defensa contra el estrés oxidativo,
se han detectado tendencias opuestas; así, la mayor parte de las enzimas se han
inhibido en hígado mientras que se han activado en el músculo; esto ha supuesto un
aumento en el daño oxidativo de los lípidos hepáticos y no en los musculares.
V.4.2. Efectos de la realimentación
SOBRE EL CRECIMIENTO, LA BIOMETRÍA Y LA COMPOSICIÓN.
Muchos animales muestran, durante la realimentación que sigue a un periodo de
ayuno, una mayor tasa de crecimiento que sus coespecíficos alimentados de forma
continuada (Wilson y Osbourn, 1960; Dobson y Holmes, 1984; Jobling, 1994; Ali et al.,
2003; Ferrando et al., 2009). Se piensa que esta tendencia pretende restaurar el tamaño
original y, por eso, se le llama crecimiento compensatorio (Ali et al., 2003). En el caso de
las corvinas, la realimentación supuso, desde el principio, una mejora en los índices de
crecimiento, GAP, IRP y SGR, (figura V.4.10.) teniendo más importancia este crecimiento
compensatorio los primeros 40 días de realimentación, pues es cuando se obtienen los
mejores valores de crecimiento, mientras que los siguientes 20 días de realimentación la
tasa de crecimiento cae hasta aproximarse al de las corvinas control.
191
Sergio García Mesa
GAP
IRP
SGR
200
150
100
50
0
-50
-100
-150
-200
% variación
Figura V.4.10. Efecto de la realimentación tras el
ayuno sobre Ganancia Absoluta de Peso (GAP),
Incremento Relativo de Peso (IRP) y Tasa de
Crecimiento Específico (SGR). Los datos son
representados como % de variación de los
distintos parámetros en los animales sometidos a
ayuno respecto a su grupo control F11.
60
80
100
120 Días experimento
El crecimiento compensatorio adquiere mucha importancia en los peces incluidos
como especies de interés económico por su explotación comercial. Una consecuencia
importante del crecimiento compensatorio es la convergencia de las trayectorias de
crecimiento de los individuos, lo que refleja la búsqueda del consecuente
“sobrecrecimiento” (Ali et al., 2003). En función del grado de crecimiento
compensatorio, éste se puede clasificar en: i) completo cuando los animales alcanzan
finalmente el mismo tamaño que los que han sido alimentados continuamente; ii)
parcial si los animales privados de alimento no logran igualar el tamaño de los que se
han alimentado normalmente, pero muestran tasas de crecimiento relativamente
rápidas y pueden tener mejores tasas de conversión de alimento durante el periodo de
realimentación y iii) sobrecompensación cuando los animales que han experimentado
una restricción de alimento alcanzan, durante la realimentación, un tamaño que supera
al de los animales que no han sufrido tal restricción.
La posibilidad del crecimiento compensatorio completo de los peces varía
dependiendo de la especie, el tamaño, el protocolo alimentario, la temperatura del
agua, la ingesta de nutrientes, la duración del experimento, etc. (Bilton y Robins, 1973;
Jobling y Koskela, 1996; Rueda et al., 1998; Saether y Jobling, 1999; Gaylord y Gatlin,
2000, 2001; Tian y Qin, 2004; Zhu et al., 2004; Cho 2005; Cho y Jo, 2005).
Las corvinas, tras la realimentación de 60 días, presentaron un crecimiento
compensatorio sólo parcial (figura V.4.11.); normalmente los ciclos simétricos de
ayuno/realimentación producen una compensación parcial (Aranyakananda et al., 1996;
Christensen y McLean, 1998), tal como se observó en bacalao (G. morhua) (Jobling,
1994) o trucha alpina (Salvelinus alpinus) (Jobling, 1993).
192
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
160
140
gramos
120
S/RF11
100
F11
80
Figura V.4.11. Evolución del peso de las
corvinas ayunadas (línea continua) /
realimentadas (línea discontinua) (S/RF11)
frente al grupo control (F11)).
60
40
20
0
0
20
40
60
80
Días experimento
100
120
El crecimiento compensatorio se ha descrito también en otros salmónidos (Bilton
y Robins, 1973; Miglavs y Jobling, 1989a, b; Quinton y Blake, 1990; Jobling y Koskela,
1996; Damsgaard y Dill, 1998), Ictalurus punctatus (Gaylord y Gatlin, 2000; 2001), carpín
dorado (Xie et al., 2001; Zhu et al., 2004), pargo (Rueda et al., 1998), el pez plano
Paralichthys olivaceus L. (Cho 2005) y lubina (Ferrando et al., 2009).
Las bases fisiológicas del crecimiento compensatorio no están completamente
esclarecidas; normalmente, en paralelo con el mismo se observa un aumento de la
ingesta, que puede cursar, además, con una mejora en la conversión y eficiencia del
alimento (Dobson y Holmes, 1984; Quinton y Blake, 1990; Russell y Wootton, 1992;
Hayward et al., 1997; Gaylord y Gatlin, 2001; Ali et al., 2003); aunque en algunos
estudios se ha encontrado que esto no es así y que el crecimiento compensatorio se
debe únicamente a la hiperfagia (Miglavs y Jobling, 1989a; Hayward et al., 1997; Nikki et
al., 2004) pero Boujard et al. (2000) sugieren en trucha arcoíris que la hiperfagia era una
respuesta a la restricción de alimento mientras que la privación total del mismo genera,
además, una mejora en la utilización del alimento durante la realimentación. Con el fin
de demostrar esta segunda posibilidad en el caso de las corvinas realimentadas tras un
ayuno con respecto a las alimentadas de forma continua, ambos grupos recibieron la
misma ración, evaluándose los cambios en la tasa de conversión del alimento y
eficiencia alimentaria y de uso de la proteína (figura V.4.12.)
3.5
3.0
F11 (0-60)
F11 (60-120)
S/RF11 (60-120)
Figura V.4.12. Efecto de la realimentación
tras el ayuno sobre índices de crecimiento y
aprovechamiento de la dieta Tasa de
conversión de alimento (FCR), Tasa de
eficiencia alimentaria (FER) y Tasa de
eficiencia proteica (PER). Para F11 el periodo
0-60 días y 60-120 días y S/RF11 el periodo
60-120.
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
FCR
FER
PER
193
Sergio García Mesa
Las eficiencias alimentarias mejoraron con la realimentación, FCR y FER
presentaron valores próximos a 1, indicando un muy buen aprovechamiento. El PER
también fue muy superior durante esta fase, lo que significa un mayor incremento de
biomasa por unidad de proteína ingerida, tal y como han demostrado varios autores
(Bilton y Robins, 1973; Dobson y Holmes, 1984 Miglavs y Jobling, 1989a, b; Jobling et al.,
1994; Qian et al., 2000; Gaylord y Gatlin, 2001) en distintas especies. La mejora del PER y
el FER podría ser indicativa de una mejora metabólica durante la realimentación, como
se discutirá más adelante. En cualquier caso, periodos de privación de alimento se
podrían emplear exitosamente en corvina para aprovechar el beneficio que supone el
crecimiento compensatorio y optimizar la producción en una explotación comercial,
gracias al ahorro en pienso que supone el periodo de ayuno pero, también, a la
reducción de los costes en mano de obra y la mejora de la calidad del agua (Hayward et
al., 1997; Cho, 2005; Reigh et al., 2006).
El término “crecimiento compensatorio” se ha empleado normalmente para
describir incrementos en las tasas de crecimiento en longitud o peso corporal. Sin
embargo, el crecimiento relativo de los distintos componentes corporales pueden ser
diferente durante el mismo, produciendo modificación en la forma del pez (deducido
por el índice K) (Emerson, 1986). Por otra parte, la magnitud y la dinámica del
crecimiento compensatorio también pueden variar en función de la duración del ayuno
y el tiempo de realimentación (Nicieza y Metcalfe, 1997).
K
IHS
IDS
IVS
RF
60
% variación
40
20
Figura V.4.13. Efecto de la realimentación
tras el ayuno sobre distintos índices
biométricos en corvina. Los datos se
representan como % de variación de los
distintos parámetros en los animales
sometidos a ayuno respecto a su grupo
control F11.
0
-20
-40
-60
-80
60
80
100
120 Días experimento
El índice K se afectó negativamente por el ayuno pero aumentó con la
realimentación, recuperándose completamente a los 40 días de la misma (figura
V.4.13.), sin producirse una distorsión de la forma por el posible crecimiento
compensatorio de otros órganos.
194
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
El patrón de crecimiento compensatorio varía entre compartimentos corporales
(Weatherley y Gill, 1981, 1987). El indice hepatosomático (IHS) es un buen indicador del
crecimiento compensatorio de Paralichthys olivaceus L. según Cho, (2005); en el caso de
las corvinas realimentadas hemos detectado un sobrecrecimiento del hígado, debido en
gran parte al acopio de sustancias de reserva como es el glucógeno hepático (figura
V.4.14.A.); sin descartar la posible contribución de los lípidos, aunque no disponemos de
esos datos. En Salvelinus alpinus, Miglavs y Jobling (1989a) encontraron un aumento
relativo del tamaño del hígado y un mayor contenido de glucógeno con la
realimentación. El índice de rendimiento del filete (RF) se recuperó progresivamente
durante la realimentación para presentar valores similares al control a los dos meses;
Nagai y Ikeda, (1971) detectaron la misma recuperación, también en 60 días, en perca.
Durante el ayuno, el descenso del IHS y del RF podrían ser los principales responsables
de la disminución del K; parece que la recuperación de estos dos índices por lo que,
durante la realimentación deberían implicar en mayor medida la recuperación del K. En
trucha arcoíris, la realimentación tras un periodo de ayuno se asocia con un rápido
restablecimiento del tamaño relativo de los órganos (Weatherley y Gill, 1981, 1987).
La realimentación supuso un cambio muy notable en el Índice Digestosomático
(IDS); debido a que, tanto las estructuras digestivas como su equipamiento enzimático,
deben aumentar con la nueva situación para intentar conseguir el máximo
aprovechamiento de los nutrientes.
A continuación, nos planteamos valorar si los parámetros de composición de
hígado y músculo a que se vieron afectados por el ayuno, se recuperan con la
realimentación (figura V.4.14.A y B).
B
%Glucógeno %Proteínas
% variación
%Lípidos
%Minerales %Glucógeno %Proteínas
20
20
60
0
80
-20
100
-40
120
10
% variación
A
40
0
60
-10
80
-20
100
-30
120
-60
-40
-80
-50
Figura V.4.14. A, efecto de la realimentación tras el ayuno sobre la composición del hígado de las corvinas
(S/RF11). B, efecto de la realimentación tras el ayuno sobre la composición del músculo de las corvinas
(S/RF11). Los datos se representan como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos
a ayuno respecto a su grupo control, F11.
195
Sergio García Mesa
El contenido de glucógeno hepático aumentó notablemente con la
realimentación (figura V.4.14.A.), sobrepasando los valores del control el día 40 de
realimentación, al igual que observaron Méndez y Weiser (1993) en Rutilus rutilus, para
posteriormente decrecer hasta valores similares al control. Como se ha comentado
anteriormente, el incremento del IHS de la corvinas realimentadas se debe en gran parte
a la mayor acumulación de glucógeno en el hígado, coincidiendo la mayor proporción
hígado/cuerpo con el mayor contenido de glucógeno. Este hecho está bien
documentado en otras especies como la perca (Nagai e Ikeda, 1971), Macquria ambigua
(Collins y Anderson, 1995), el salmón atlántico (Soengas et al., 1996), la dorada (Power
et al., 2000; Metón et al., 2003), la trucha arcoíris (Pottinguer et al., 2003) y la lubina
(Pérez-Jiménez et al., 2007).
Al igual que durante el ayuno, tampoco la realimentación modificó el contenido
de proteínas en el hígado (figura V.4.14.A.); esto estaría de acuerdo con lo comentado
anteriormente: las proteínas hepáticas son imprescindibles para desarrollar las
funciones vitales (Cherel et al. 1991; Battley et al., 2001; Holecek et al., 2001). Sin
embargo, durante la realimentación se recuperaron los niveles de proteínas y lípidos
musculares que cayeron durante el ayuno (figura V.4.14.B.), de acuerdo con lo descrito
en otras especies como salmón atlántico (Metcalfe y Thorpe, 1992; Bull et al., 1996; Bull
y Metcalfe, 1997) o perca (Blasco et al., 1992); esta recuperación se puede asociar con el
aumento de la tasa de lipogénesis y el descenso de la de lipolisis observados tanto en
músculo como en hígado, como se comentará más adelante. La recuperación ha sido
más lenta para las proteínas que para los lípidos, al igual que se encontró en la perca
(Blasco et al., 1992).
Como hemos indicado antes, el aumento del contenido relativo de minerales en
músculo (figura V. 4.14.B.) encontrado durante el ayuno podría tener un efecto
beneficioso durante la realimentación y contribuir al crecimiento compensatorio del
músculo, pues se podrían requerir en estos animales para un mayor crecimiento
(Prunescu et al., 2003).
En general se ha observado que el crecimiento compensatorio cesa a los 40 días
de realimentación, puesto que, a partir de ese momento, los índices de crecimiento, se
asemejan a los de los controles; recordamos que también para ese día la composición
del músculo e hígado se igualaban con ellos. Según van Dijik et al. (2005) el crecimiento
compensatorio cesa tan pronto como las reservas se restauran y el pez está preparado
para hacer frente a otro, potencial, periodo de privación de alimento.
196
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
SOBRE EL METABOLISMO INTERMEDIARIO
La mayor parte de las actividades enzimáticas hepáticas estudiadas han vuelto a
los valores controles durante el periodo de realimentación, como se ha descrito en la
mayoría de estudios realizados en peces (Méndez y Weiser, 1993; Soengas et al., 1996;
Collins y Anderson, 1997; Metón et al., 2003; Polakof et al., 2007; Pérez-Jiménez et al.,
2012; Furné et al., 2012).
Los valores de HK y PK hepáticas fueron superiores tras 20 días de
realimentación, probablemente por la necesidad de mejorar el procesamiento del
componente hidrocarbonado del alimento, tal como han descrito Soengas et al. (2006),
Polakof et al. (2007) o Pérez-Jiménez et al. (2012); sin embargo, se ha observado un
retraso en el aumento de la utilización de los aminoácidos dietarios para uso energético,
deducible a partir del retardo (segundo periodo de realimentación) que se ha producido
la recuperación de las actividades implicadas en los procesos gluconeogénicos (FBPasa,
GOT y GPT). De cualquier forma, el exceso de producción de glucosa por estas vías se ha
acumulado en forma de glucógeno hepático (figura V.4.14.A.), que ha aumentado su
contenido en este periodo de forma significativa.
ACoAT
CS
EM
FBPasa G6PDH GDH
GOT
GPT
GyK
HK
HOAD
LDH
PK
110
85
60
% variación
60
35
10
80
100
120
-15
-40
-65
-90
Figura V.4.15. Efecto de la realimentación tras el ayuno sobre los niveles de actividad de las enzimas del
metabolismo intermediario hepático en corvinas. Los datos son representados como % de variación de los
distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno - realimentación respecto a su grupo control F11
Las actividades enzimáticas relacionadas con el metabolismo de lípidos también
se recuperan con la realimentación (figura V.4.15.). La enzima HOAD disminuye su
actividad una vez que se restablece la alimentación, lo que entraña una menor
degradación de los lípidos corporales con el fin de restablecer las reservas energéticas.
197
Sergio García Mesa
Las enzimas lipogénicas, EM y G6PDH, que se habían inhibido durante el ayuno, se
recuperan progresivamente, hasta valores iguales (G6PDH) o superiores (EM) a los
controles al final del periodo de realimentación; esto supone un aumento en la
producción de NADPH que, junto con la mayor actividad de las transaminasas hepáticas,
favorecen los procesos lipogénicos a partir de sustratos proteicos ingeridos con el
alimento. En doradas sometidas a ayuno/realimentación (Metón et al., 2003) se observó
durante la realimentación una mejora de la glucolisis y de la vía de las pentosas fosfato,
en línea con lo expuesto.
No obstante, algunas actividades enzimáticas no se recuperaron durante la
realimentación (CS, LDH, figura V.4.15.). El mantenimiento de la reducida actividad CS,
podría indicar el de una reducida tasa metabólica oxidativa, al menos durante un
tiempo, lo que permitiría una máxima utilización de los nutrientes de la dieta para el
crecimiento compensatorio. También la obtención anaerobia de energía (LDH) se
mantendría con el mismo fin.
Así pues, en la corvina, tal como se ha descrito en otras especies (Beamish 1964;
Love, 1970; Blaxter y Ehrlich, 1974; Jobling, 1980; Wieser et al., 1992; Ali et al., 2003),
podría existir un mecanismo de supervivencia, en el que los animales mejoran el perfil
metabólico para obtener un máximo crecimiento tras un periodo de deficiencia
alimentaria.
La recuperación de las actividades enzimáticas específicas parece ser más lenta
en el músculo que en el hígado (figura V.4.16.); de hecho, en la mayor parte de ellas no
se han observado valores similares a los controles hasta los 60 días de realimentación.
ACoAT
CS
EM FBPasa GDH
GOT
GPT
GyK
HK
HOAD LDH
PK
220
170
%variación
120
70
60
80
100
120
20
-30
-80
Figura V.4.16. Efecto de la realimentación tras el ayuno sobre los niveles de actividad de las enzimas del
metabolismo intermediario muscular en corvinas. Los datos son representados como % de variación de los
distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno - realimentación respecto a su grupo control F11
198
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
De forma excepcional, las actividades PK, FBPasa, GDH y GPT sí se recuperan en
los primeros 20 días de realimentación, contribuyendo, posiblemente, al proceso de
aprovechamiento del alimento comentado anteriormente en el caso de las enzimas
hepáticas; en este caso, la energía obtenida no se ha utilizado para síntesis de
glucógeno, cuyos valores no se han visto afectados por la realimentación al igual que
tampoco se vieron afectados por el ayuno.
Los procesos lipolíticos (actividades GyK y HOAD) permanecieron activados
durante las primeras etapas de la realimentación, mostrando valores similares a los del
ayuno durante los primeros 80 (HOAD) o 100 días (GyK), a partir de entonces
disminuyen hasta valores similares o inferiores a los controles. Este retraso se ha
observado también en otras especies de peces (Furné et al., 2012; Pérez-Jiménez et al.,
2012). También se ha detectado un retraso en la restauración de los valores de ACoAT,
lo que podría deberse a la degradación de los cuerpos cetónicos que se han acumulado
en este tejido a lo lardo de todo el periodo de ayuno (Zammit y Newshome, 1979).
La actividad LDH, que se había inhibido por el ayuno, también recupera los
valores de los controles, incluso aumenta de forma significativa al final del periodo de
realimentación. Este aumento puede ser reflejo de una mayor actividad natatoria, pues
disminuir la misma no dejaba de ser una adaptación comportamental para disminuir el
gasto energético durante el ayuno previo.
SOBRE EL STATUS OXIDATIVO.
Los indicadores del estrés oxidativo medidos durante el ayuno tienden a
recuperar sus valores con la realimentación (figura V.4.17.).
CAT
DTD
GPX
GR
GST
SOD TBARs
% variación
500
400
60
300
80
200
100
120
100
0
-100
Figura V.4.17. Efecto de la realimentación tras el ayuno sobre los niveles de
actividad de las enzimas del estrés oxidativo y daño lipídico hepático en corvinas.
Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en
los animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control F11.
199
Sergio García Mesa
Los valores de peroxidación lipídica, que habían aumentado de forma
significativa con el ayuno, disminuyen hasta hacerse similares a los controles durante los
primeros 20 días de realimentación, al igual a lo que se ha descrito en otras especies
(Pascual et al., 2003; Morales et al., 2004; Furné et al., 2009; Bayir et al., 2011).
De nuevo la literatura recoge un comportamiento menos uniforme de las
defensas antioxidantes enzimáticas durante la realimentación: en dorada se observó una
recuperación de las actividades SOD y CAT, un descenso de GPX y GST y aumento de GR
(Pascual et al., 2003) tras 21 días de realimentación; en dentón, tres semanas de
realimentación fueron suficientes para la completa recuperación de las actividades
antioxidantes CAT, SOD, GPX y GR (Morales et al., 2004); tras 60 días de realimentación
se detectó la recuperación de la actividad de CAT en trucha, además de la recuperación
de la de SOD en esturión (Furné et al., 2009b); en Salmo trutta se observó que 21 días de
realimentación provocaban un aumento de la actividad SOD, GPX, CAT y GR y una
recuperación de la GST (Bayir et al., 2011).
La variabilidad en los resultados de la actividad de las enzimas antioxidantes
puede ser debida a un insuficiente periodo de realimentación; en las corvinas
realimentadas 20 días, la actividad de las enzimas CAT, GPX, SOD y GR no se recuperó,
tan sólo lo hace DTD y GST, de ahí la importancia de prolongar el periodo de
realimentación.
La desaparición del daño oxidativo, determinado por la tasa de peroxidación
lipídica, tras 20 días de realimentación puede deberse a una menor producción de
radicales libres, pues se observa que ese mismo día, las enzimas metabólicas
anteriormente señaladas como generadoras de radicales superóxido (CS) y peróxidos de
hidrógeno (HOAD) presentan una actividad mucho menor al control (figura V.4.15.),
situación que junto con el aporte de energía de los nutrientes metabolizados conduciría
a que el daño oxidativo desapareciera.
Si los estudios del efecto del ayuno sobre el estrés oxidativo en músculo son
escasos, el efecto de la realimentación también ha sido poco estudiada (Pérez-Jiménez,
2008; Furné et al., 2009). En la figura V.4.18. se expone la evolución de los indicadores
del estrés oxidativo en este compartimento durante la realimentación.
Los reducidos niveles de peroxidación en músculo se mantienen a lo largo de
todo el período de realimentación, lo que indica que los lípidos musculares son una
reserva energética apreciada que debe salvaguardarse de los agentes prooxidantes.
200
Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina
(Argyrosomus regius, Asso 1801).
DTD
GPX
GR
GST
SOD
TBARs
100
% variación
80
60
60
40
80
20
100
0
120
-20
-40
-60
Figura V.4.18. Efecto de la realimentación tras el ayuno sobre los niveles de
actividad de las enzimas del estrés oxidativo y daño lipídico muscular en corvinas.
Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en
los animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control F11.
La actividad de todas las enzimas antioxidantes musculares se mantienen
elevadas hasta el día 40 de realimentación, día que se ha indicado anteriormente como
de cese del crecimiento compensatorio. Pudiera ser que durante el crecimiento
compensatorio se dé una situación de protección oxidativa de los sustratos susceptibles
del ataque de los radicales libres, estos sustratos como se ha indicado incluyen a los
ácidos grasos altamente insaturados (PUFA). Durante este crecimiento compensatorio la
proporción de lípidos en músculo aumenta, por lo que la protección de éstos también
debe hacerlo. A diferencia de lo descrito en esturión y trucha (Furné et al., 2009b), el
aumento de los lípidos musculares con la realimentación no se acompañó de un
aumento de las defensas antioxidantes, por lo que finalmente encontraron daño
oxidativo durante la realimentación.
A modo de resumen, la realimentación supuso la completa recuperación de las
reservas corporales y actividades enzimáticas relacionadas con el metabolismo. En
hígado y músculo, de forma general se produce inicialmente un descenso de las rutas
catabólicas y aumento de las anabólicas, con la finalidad de la rápida recuperación de las
reservas energéticas, una vez alcanzadas, las actividades enzimáticas presentan valores
similares al control. Del mismo modo, mejora el status oxidativo, eliminándose el daño
producido en las membranas celulares hepáticas durante el periodo de ayuno y
manteniendo bajo el daño oxidativo en músculo.
201
Sergio García Mesa
V.5. RESUMEN
Se ha descrito una relativamente buena adaptación de las corvinas al ayuno,
pues tras un periodo de 60 días sorprende la poca pérdida de peso corporal, que se vio
acompañada de una paralela de algunos compartimentos corporales, sobre todo del
hígado y de la fracción muscular, debidas, muy probablemente a movilización de
glucógeno hepático, así como los lípidos y proteínas musculares que se emplean con
fines energéticos.
Durante el ayuno se produjo un reajuste fisiológico que afecta a prácticamente
todas la rutas metabólicas. En hígado y músculo se detectó una inhibición general de la
glucolisis y el mantenimiento de la gluconeogénesis a partir de aminoácidos y ácidos
grasos, por lo que es predecible que se mantenga la glucemia. Otra adaptación al ayuno
fue la reducción del metabolismo oxidativo observada en el hígado. En músculo
aumentó notablemente la actividad lipolítica, destacando como ruta prioritaria para la
obtención de energía, lo que se acompañó de un aumento del metabolismo oxidativo
muscular, con el fin de utilizar los productos finales de la β-oxidación en el ciclo de
Krebs; en relación con ello, también se detectó un aumento del metabolismo proteico
quizá con el fin de proporcionar intermediarios para que el ciclo continúe.
El ayuno se ha descrito como una situación claramente prooxidante que, al ir
acompañada en las corvinas por un descenso general de la actividad de las enzimas
antioxidantes y de la generación de cofactores reducidos necesarios para su actividad,
provocó cierto daño oxidativo. Sin embargo en músculo, quizá debido a su carácter de
reserva energética cuantitativamente mayoritaria basada en lípidos que se movilizan en
esta situación de ayuno, primó una situación de protección anti-oxidativa encaminada a
permitir la integridad de la misma.
Con la realimentación se observó un crecimiento compensatorio parcial, debido
con seguridad a un mejor uso del alimento recibido. Durante el mismo se restituyeron
las reservas energéticas gracias a la modulación en las actividades correspondientes del
metabolismo intermediario, observándose una mayor actividad de aquellas enzimas
relacionadas con procesos anabólicos.
Además, la realimentación supuso la desaparición del daño oxidativo hepático,
tanto por una previsible menor producción de radicales libres como por un aumento
cierto de las actividades enzimáticas antioxidantes en esa víscera.
202
VI. Estudio de diferentes frecuencias
de alimentación semanal en la
corvina (Argyrosomus regius Asso,
1801). Implicaciones productivas,
fisiológicas y sobre la calidad.
VI.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS.
El manejo de la alimentación en términos de la optimización de la tasa y
frecuencia de alimentación es muy importante en el cultivo de peces marinos
habiéndose convertido en una de las áreas de investigación más importantes en el
mundo de la piscicultura. La sobrealimentación y el alimento no consumido alteran la
calidad del agua (Ng et al., 2000) mientras que el inadecuado suministro del mismo
tienen un impacto directo sobre los costes de producción (Mihelakakis et al., 2002).
Una estrategia alimentaria adecuada mejora el crecimiento, supervivencia y utilización
del alimento reduciendo su desperdicio y la dispersión de la talla de los peces por lo
que aumenta la eficiencia de la producción (Güroy et al., 2006).
El efecto de la frecuencia de alimentación sobre el crecimiento y los índices de
conversión del alimento por los peces han sido estudiados para distintas especies con
resultados similares a pesar de incluir especies que presentaban diferencias en el
comportamiento alimentario. Por citar algunos, tilapias (O. niloticus) alimentadas 6
días a la semana crecían de forma similar y mostraron mejores índices de conversión
que las alimentadas 7 días a la semana (El Sayed et al., 2005); resultados similares
obtuvieron Eroldogan et al., (2006) en dorada, aunque el crecimiento fue menor en los
peces alimentados 5 días a la semana comparados con los alimentados los 7 días; por
su parte, Wu et al., (2004) mostraron que, cuando se alimentaba a saciedad, el pez
gato (I. punctatus) tenía tasas de crecimiento e índices de utilización de la dieta
similares independientemente de si se alimentaba 6 o 7 días a la semana, por la
mañana o por la tarde; finalmente, Rodríguez et al., (2005) encontraron en el
lenguado senegalés ganancias de peso similares cuando los peces se alimentaron
durante el día que durante la noche.
El protocolo de alimentación puede afectar a la cantidad de alimento
consumida por el pez habiéndose mostrado una estrecha relación entre la actividad de
203
Sergio García Mesa
algunos enzimas del metabolismo energético y la disponibilidad del alimento (Sullivan
y Somero, 1983), debido a que los nutrientes procedentes de la digestión del alimento
están disponibles para las rutas metabólicas de producción de energía. De la misma
forma, la actividad de esos enzimas está correlacionada con las tasas de crecimiento.
Algunos autores han mostrado una fuerte correlación positiva entre la tasa de
crecimiento y la actividad de enzimas glucolíticas en el músculo blanco de los peces:
Pelletier et al. (1993) en bacalao atlántico o Lamarre et al. (2004) en pez lobo
(Anarhichas lupus). Las actividad citrato sintasa (CS) en músculo blanco también refleja
las tasas de crecimiento en dos especies de gádidos, bacalao atlántico y carbonero
Pollachius virens (Foster et al., 1993; Mathers et al., 1992).
La textura es uno de los principales parámetros de calidad considerados en
peces cultivados y depende del contenido de grasa muscular y su distribución en el
músculo (Regost et al., 2001; Espe et al., 2004; Hagen et al., 2007; Poli et al., 2009;
Hardy y Lee, 2010; Sándor et al., 2011). Los lípidos y el colágeno son dos
constituyentes del músculo que influyen de forma opuesta sobre la textura de la carne
del pescado (Thakur et al. 2002, 2003).
El ablandamiento de la carne es uno de los principales síntomas en que se
manifiesta la pérdida de frescura y, por tanto, de calidad de los peces cultivados. Se
han realizado gran cantidad de estudios que demuestran que los cambios texturales
ocurridos en el músculo del pescado durante el almacenamiento post-mortem son
resultado de la degradación de los componentes miofibrilares por proteolisis
(Delbarre-Ladrat, et al., 2006). Los fragmentos proteicos liberados como consecuencia
de ésta pueden ser utilizados como marcadores de la desorganización en el músculo
de pescado. El tipo de fragmento proteico liberado es dependiente del tiempo y de la
temperatura, pero el índice de liberación es dependiente de la especie (Papa et al.,
1996). La utilización de técnicas bioquímicas y electroforéticas (SDS-PAGE) para
estudiar los cambios cualitativos y cuantitativos en las proteínas sarcoplásmicas y
miofibrilares del músculo de corvinas con posterioridad a su sacrificio nos daría mucha
información sobre las características de calidad del músculo en esta especie.
El presente estudio se propone establecer el efecto y la evolución de los
cambios producidos por distintas frecuencias de alimentación semanal sobre los
parámetros de crecimiento y sus posibles consecuencias metabólicas en tres
fracciones corporales de la corvina: sangre, hígado y músculo blanco, estos últimos,
principales órganos implicados en el metabolismo intermediario, conversión y
distribución de la energía del alimento en el organismo. También se evaluará la
influencia de las variaciones en la frecuencia de alimentación sobre los parámetros de
204
Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso
1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad.
calidad de su carne y el patrón electroforético de las proteínas musculares como una
primera aproximación al tema del efecto del periodo de conservación post-mortem
sobre la calidad de este pescado.
VI.2. MATERIALES Y MÉTODOS
VI.2.1. Animales, condiciones experimentales y muestreos
Para la realización de estos ensayos se han utilizado juveniles de corvina de 170
g de peso inicial, criados en las instalaciones del Centro del IFAPA de El Toruño, en el
Puerto de Santa María (Cádiz). Los ejemplares se distribuyeron en 8 tanques de 4 m3
(40 peces por tanque) y se mantuvieron durante un periodo experimental de 90 días,
tras un periodo de adaptación de 14 días, con un suministro de agua previamente
filtrada y aireada a razón de 5-10 L/min con una temperatura de 23.1 ± 0.1 °C.
Se ensayaron, por duplicado, cuatro regímenes alimenticios, a saber, 7, 6 y 5
días a la semana por la mañana (el dispensador se activaba a las 9:00; lotes 7M, 6M y
5M, respectivamente) y 5 días a la semana por la tarde (el dispensador se activaba a
las 14:00; lotes 5T); los lotes 6M no recibieron alimento los domingos, mientras que los
lotes 5M y 5T tampoco se alimentaron los sábados. Todos los lotes recibieron ración
semanal total calculada sobre la base de un 0.7% del peso corporal por día para los
lotes 7M. Esta ración es algo inferior establecida como óptima para corvinas de este
tamaño (Cárdenas, 2010) con el objeto de asegurar, en lo posible, la ingesta de todo el
alimento ofrecido. Se utilizó un pienso comercial (SKRETTING, C.V. 6) específico para
corvina, cuya composición se muestra en la tabla VI.2.1. El contenido en energía bruta
se calculó aplicando los factores de conversión estándar recomendado por Brett y
Groves (1979). Se utilizaron dispensadores automáticos de alimento y, cuando fue
necesario, el no consumido se recogió mediante un colector, se filtró y una cantidad
similar fue añadida al lote correspondiente el día siguiente.
205
Sergio García Mesa
Tabla III.2.1. Composición del pienso (g/kg, en sustancia seca).
Componente
Proteína bruta
Grasa bruta (extracto etéreo)
Cenizas
Material extractivo libre de nitrógeno (MELN)*
Energía** (MJ/Kg)
Relación Proteína/Energía (g/MJ)
472.0
204.7
77.2
246.1
238.3
198.0
* calculado como 1000 – (proteína bruta + extracto etéreo +
cenizas)
** calculado sobre la base de 24.3, 39.7 y 17.2 KJ/g de proteína,
lípidos y MELN, respectivamente
Al principio del experimento (día 0), se tomaron 12 peces al azar de un tanque
reservorio común que se sedaron de acuerdo la normativa para uso de animales
(2010/63/EU; 2-fenoxietanol 0.35 mL/L) para definir los parámetros iniciales: seis de
ellos fueron utilizados para determinar metabolitos en plasma y actividad enzimática
en hígado y músculo blanco, los otros seis fueron destinados al estudio de la
composición corporal y biometría (extracción y peso del hígado, músculo y digestivo).
A continuación se tomaron del mismo reservorio 40 peces para cada uno de los ocho
tanques experimentales. Como parámetro de crecimiento se consideró el peso de
todos los peces del lote; para la determinación de los parámetros biométricos se
determinaron el peso y la longitud total (parámetros externos) de 20 peces. Los días 45
y 90 del ensayo, se muestrearon veinte peces de cada tanque para la determinación de
parámetros externos y seis de ellos se sacrificaron, tres para análisis de composición
del plasma, actividad enzimática y contenido en glucógeno; y los otros tres para
determinación de parámetros biométricos y composición bioquímica.
El tamaño de la ración se ajustó periódicamente en función de los datos de
evolución de peso. El crecimiento y la eficiencia alimentaria se determinaron
calculando la ganancia absoluta de peso, el incremento relativo de peso, la tasa de
crecimiento específico, el índice de conversión del alimento, el coeficiente de
eficiencia proteica y el valor productivo de la proteína (para más detalles ver apartado
IX de esta Memoria).
206
Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso
1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad.
VI.2.2.Procesado de la sangre y los tejidos
Tras un periodo de ayuno previo de 24 horas, se sacrificaron los peces según
XXXX. Las muestras de sangre se tomaron rápidamente tal como se indica en el
apartado IX Metodología.
El hígado y una porción de músculo blanco de la parte anterior dorsal de los
peces fueron diseccionados, congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80 °C
hasta que se usaron para los estudios metabólicos en las instalaciones de la UGR. Los
tejidos se homogenizaron según se detalla en el apartado IX de esta Memoria.
VI.2.3. Parámetros biométricos y composición química
Los peces utilizados para este propósito fueron almacenados en hielo y
transportados hasta las instalaciones de la UGR. Todos los peces se pesaron y
midieron, a continuación se diseccionaron el músculo y las vísceras para la
determinación de los índices de condición, hepatosomático, digestosomático,
rendimiento de filete, según se describe en el apartado IX. Posteriormente, el cuerpo
de los peces en su conjunto, así como la parte derecha del músculo se usaron para
determinación de la composición química según se detalla en el citado apartado IX.
VI.2.4. Análisis de metabolitos plasmáticos y actividad
enzimática
Se determinaron los niveles plasmáticos de glucosa, lípidos totales, triglicéridos,
colesterol y proteínas totales usando las técnicas descritas en el apartado IX.
Los ensayos enzimáticos en hígado y músculo se realizaron según se detalla en
el mismo apartadoIX. Se determinaron las siguientes actividades enzimáticas: Piruvato
Kinasa (PK; EC 2.7.1.40), Lactato Deshidrogenasa (LDH; EC 1.1.1.27), Fructosa 1,6Bisfosfatasa (FBPasa; EC 3.1.3.11), Glucosa 6-fosfato Deshidrogenasa (G6PDH; EC
1.1.1.49), Glutamato Deshidrogenasa (GDH; EC 1.4.1.2), Citrato Sintasa (CS; EC 4.1.3.7)
y β-Hidroxiacil CoA Deshidrogenasa (HOAD; EC 1.1.1.35). También se determinó el
contenido en glucógeno en hígado y músculo blanco.
VI.2.5. Estudio de la calidad del músculo
Los peces utilizados para este propósito fueron envasados en cajas de
polipropileno, recubiertos con hielo y transportados al laboratorio de Producción
207
Sergio García Mesa
Animal de la UAL para la realización de los análisis pertinentes. Una vez allí, se
almacenaron en cámara fría a 4 °C, envueltos en papel de aluminio. Para el estudio de
la evolución post-mortem se tomaron muestras de 6 corvinas a las 24, 48, 72 y 144
horas después de su sacrificio.
En cada individuo se determinó la firmeza del pez completo y el pH, a
continuación se obtuvieron muestras de la parte anterior del músculo dorsal de la
parte izquierda del pez. Una parte se usó para determinación de la capacidad de
retención de agua (CRA); el resto de la muestra de músculo se congeló en nitrógeno
líquido y se almacenó a -80 °C hasta la realización de ulteriores análisis de extracción y
valoración de diferentes fracciones proteicas.
Los métodos de determinación de firmeza, pH y CRA, así como los de extracción
de las fracciones de proteínas sarcoplásmicas y miofibrilares y su cuantificación y
separación electroforética también se detallan en el apartado de IX de esta Memoria
VI.2.6. Análisis estadístico
El efecto de cada tratamiento sobre las variables estudiadas se realizó
mediante ANOVA de una vía seguido de comparación de las medias mediante el
procedimiento de Duncan (1955). Cuando no se especifica otro, se consideró el nivel
de significación del 95 % para indicar diferencias significativas (P<0.05). Cuando los
resultados se expresan como un porcentaje (por ejemplo la densitometría) los datos
fueron normalizados usando la transformación del arcotangente y su raíz cuadrada
previo al análisis estadístico, según Sokal y Rohlf (1981). Todos los análisis estadísticos
fueron realizados usando un software específico (SPSS).
VI.3. RESULTADOS
VI.3.1. Crecimiento e índices morfométricos
La tabla VI.3.1. muestra la ganancia de peso de los diferentes lotes
experimentales expresada según diversos índices. Las corvinas alimentadas 6 días a la
semana (lotes 6M) exhibieron los mejores valores de estos índices al aumentar su peso
inicial en torno a un 80 %. Por el contrario, las alimentadas 5 días a la semana por la
tarde (lotes 5T) mostraron la menor ganancia de peso, aunque las diferencias entre
tratamientos no fueron estadísticamente significativas en ninguno de los casos. Puesto
que todos los lotes recibieron la misma cantidad de alimento, los índices de conversión
exhibieron una tendencia inversa a la mostrada por las ganancias de peso, los mejores
208
Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso
1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad.
resultados para los lotes 6M y los peores para los 5T. De nuevo las diferencias no
fueron estadísticamente significativas. En cuanto al grado de utilización de la proteína
de la dieta para incremento de peso y retención de proteína corporal (PER y VPP
respectivamente), tampoco se observaron diferencias estadísticas entre tratamientos,
pero los mayores valores de PER se encontraron en los lotes 6M mientras que los lotes
7M mostraron los máximos para el VPP. Los lotes alimentados sólo 5 días a la semana
por la tarde mostraron los valores más bajos para ambos índices.
Tabla VI.3.1. Influencia de la frecuencia de alimentación sobre los parámetros de
crecimiento y utilización del alimento en las corvinas.
Frecuencia
alimentaria
GAP
IRP
SGR
TCA
FER
PER
VPP
5M
116.8
69.77
0.59
1.12
0.90
1.91
29.39
14.72
9.06
0.09
0.08
0.06
0.19
0.55
5T
109.14
63.61
0.54
1.24
0.82
1.76
25.21
15.21
11.67
0.08
0.19
0.13
0.27
5.82
6M
133.11
78.10
0.64
1.04
0.96
2.04
33.59
2.05
1.42
0.01
0.03
0.02
0.05
3.22
7M
115.60
66.37
0.57
1.15
0.87
1.85
35.67
1.82
3.06
0.01
0.01
0.01
0.01
4.72
5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M:
7días/semana por la mañana.
GAP: Ganancia Absoluta de Peso; IRP: Incremento Relativo de Peso; SGR: Tasa de Crecimiento Específico;
TCA: Tasa de Conversión del Alimento; PER: Coeficiente de Eficiencia Proteica; FER: Tasa de Eficiencia
Alimentaria. VPP: Valor Productivo de la Proteína.
Los datos de parámetros biométricos de los respectivos lotes se muestran en la
tabla VI.3.2. Todos los peces aumentaron su peso y longitud a lo largo del experimento
pero no se observó un efecto significativo de los diferentes regímenes el día 45. Al final
del experimento, día 90, los peces 6M eran algo más largos y pesados que los demás.
Los otros índices biométricos determinados no se afectaron ni por el tiempo ni por el
régimen dietario, al menos de forma significativa, por lo que la morfología general de
los peces (K) se mantuvo sin cambios, mientras que no se detectó un posible
crecimiento diferencial del hígado, tracto digestivo y músculo (IHS, IDS y RF).
VI.3.2. Composición corporal
La composición química del cuerpo y el músculo de las corvinas se muestra en
la tabla VI.3.3. El contenido corporal de agua y cenizas de los peces permaneció muy
estable a lo largo del experimento, no detectándose efectos del régimen dietario.
Durante el desarrollo del experimento, se apreció una ligera pero general tendencia a
reducir el porcentaje de proteína corporal acompañada por un igualmente ligero
209
Sergio García Mesa
aumento de los depósitos de lípidos, de forma que los lotes 5M y 7M presentaron
mayor contenido en lípidos y menor en proteína el día 45 de cultivo. Es de destacar
que al final del experimento, los lotes 6M y 7M exhibieron mayor contenido proteico
que los 5M y 5T, mientras el contenido en lípidos fue más parecido entre grupos,
aunque los peces 6M mostraron los valores más bajos.
Tabla VI.3.2. Influencia de la frecuencia de alimentación sobre los parámetros
biométricos en corvinas a los 0, 45 y 90 días de experimento.
Longitud
total* (cm)
Peso
Total* (g)
K*
IHS◊
IDS◊
RF◊
25.82
171.2
1.005
1.47
1.88
44.60
0.07
1.50
0.002
0.16
0.06
2.49
5M
27.06
210.29
1.06
1.29
1.84
44.85
0.30
7.10
0.01
0.08
0.03
0.90
5T
27.42
216.90
1.04
1.45
1.99
46.56
0.38
10.75
0.01
0.11
0.03
0.61
6M
27.44
226.28
1.10
1.58
1.91
46.49
0.27
9.54
0.06
0.14
0.06
0.60
7M
27.31
212.98
1.04
1.46
2.05
45.43
Días
0
45
5M
5T
90
6M
7M
0.40
10.80
0.07
0.11
0.07
0.61
30.05xy
285.5xy
1.06
1.40
1.88
45.11
0.26
6.43
0.03
0.16
0.12
0.53
29.18x
277.61x
1.03
1.30
1.90
44.44
0.22
6.42
0.01
0.10
0.05
0.96
30.81y
303.63y
1.03
1.51
1.80
46.21
1.18
5.31
0.01
0.14
0.12
3.07
30.23xy
289.83xy
1.04
1.58
1.78
45.79
0.20
5.93
0.04
0.08
0.16
0.74
Los valores son medias ± EEM (*N=160 en el día 0 y 40 por tratamiento en el día 45 y 90; ◊N=6). Valores con
x,y,z...
a,b,c...
diferentes superíndices indican diferencias atribuíbles a la frecuencia alimentaria a los 45 (
) y 90 (
) días
(P<0.05).
5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M:
7días/semana por la mañana.
K: Índice de condición. IHS: Índice hepatosomatico. IDS: Índice digestosomatico. RF: Rendimiento de filete.
En cuanto al músculo, mientras que el contenido en cenizas no se afectó
significativamente ni por el tiempo ni por el régimen alimentario, los contenidos de
agua y proteína sufrieron una ligera reducción en todos los grupos; estos cambios
fueron acompañados por un ligero incremento en el contenido lipídico. Sobre el
posible efecto del régimen alimentario, la única diferencia significativa detectada se
refiere al contenido en proteína, mostrando los peces 5T mayores valores y los 5M y
6M los menores, al final del experimento.
210
211
71.41±0.47
70.30±0.68
6M
7M
23.02a±0.51
25.05ab±0.73
62.27c±0.24
25.37ab±0.92
56.95a±0.37
70.36±0.36
5T
61.32c±0.44
28.32b±1.22
58.83b±0.42
70.76±0.64
5M
7M
23.90y±0.52
71.15±0.07
6M
60.16x ±1.03
20.70x±0.52
63.23xy±0.64
71.37±0.12
23.02y±0.32
60.57x±0.91
22.35xy±0.56
23.28±0.97
62.38±1.18
65.57y ±1.44
70.96±1.34
5T
Lípidos
Proteína
12.57±0.36
12.28±0.20
11.97±0.14
12.46±0.60
12.65±0.53
13.35±0.21
13.57±0.51
13.27±0.32
11.76±0.60
Cenizas
76.53±0.25
76.85±0.18
76.78±0.29
76.52±0.33
77.33±0.39
77.6±0.39
77.53±0.27
77.08±0.09
78.49±0.13
Agua
80.25ab±0.75
78.98a±0.63
82.62b±0.82
78.67a±1.3
84.67±2.57
87.16±2.66
86.81±2.11
83.68±1.35
90.96±0.66
Proteína
5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M: 7días/semana por la mañana.
) y 90 (
x,y,z...
a,b,c...
8.11±0.77
7.49±0.77
6.98±0.51
7.83±0.57
6.18±0.29
5.55±0.55
5.52±0.51
5.11±0.4
5.65±0.34
Lípidos
Composición del músculo
Los valores son medias ± EEM (N=6).Valores con diferentes superíndices indican diferencias atribuibles a la frecuencia alimentaria a los 45 (
90
45
70.70±0.66
70.22±1.29
0
5M
Agua
Días
Composición corporal
) días (P<0.05).
5.85±0.22
5.91±0.09
5.99±0.07
5.78±0.15
5.78y±0.09
6.22x±0.07
6.30x±0.10
6.28x±0.06
6.19±0.05
Cenizas
Tabla VI.3.3. Influencia de la frecuencia de alimentación sobre la composición corporal y del músculo (% ss) de las corvinas a
los 0, 45 y 90 días de experimento
Sergio García Mesa
Tabla VI.3.4. Efecto del tiempo de experimento
sobre algunos parámetros (diferencias estadísticas
se muestran con diferentes números (1,2,3)
(P<0.05)).
lotes
Días
5M
0-45-90
5T
6M
7M
0-45-90
0-45-90
0-45-90
1-2-3
1-2-3
1-2-1
n.s.
n.s.
n.s.
1-2-3
1-2-3
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
1-2-3
1-2-3
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
2-2-1
1,2-1-2
1-2-1,2
n.s.
1,2-2-1
n.s.
1-2-1,2
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
2-1-1
2-1,2-1
n.s
1,2-2-1
2-1-1
2-2-1
1,2-1-2
2-2-1
2-1-1
2-1-1
1-1-2
2-1-1,2
Parámetros Biométricos
Longitud Total
Peso Total
K
HIS
IDS
RF
1-2-3
1-2-3
1-2-2
n.s.
n.s.
n.s.
Composición corporal
Agua
Proteína
Lípidos
Cenizas
n.s.
2-1,2-1
1-1-2
n.s.
Composición músculo
Agua
Proteína
Lípidos
Cenizas
2-1-1
3-2-1
1-1-2
2-2-1
5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde.
6M: 6 días/semana por la mañana. 7M: 7días/semana por la
mañana.
n.s.: diferencias no significativas
VI.3.3. Metabolitos plasmáticos
El análisis de los metabolitos plasmáticos se realizó al principio y al final del
experimento (tabla VI.3.5.). No se detectaron cambios significativos en los niveles de
glucosa y lípidos totales desde el principio hasta el final del experimento. Los contenidos
en colesterol y triglicéridos mostraron una tendencia significativa a disminuir, sólo en los
lotes 7M para el colesterol y en los 5T, 6M y 7M para los triglicéridos. El contenido en
proteína aumentó en todos los tratamientos excepto en los peces 7M.
La frecuencia de alimentación influyó significativamente sobre el nivel de lípidos
totales y proteína: los lípidos totales fueron mayores en peces alimentados 7 días a la
semana y más bajos en los alimentados sólo 5 días por semana, independientemente de
la hora a que se suministrara el alimento a estos últimos. El nivel de proteínas mostró
una tendencia opuesta, los valores más altos se encontraron en los peces alimentados 5
días (5M y 5T) y los menores en los peces 7M.
212
Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad.
Tabla VI.3.5. Influencia de la frecuencia de alimentación sobre la composición
del plasma (mg /100 mL) de las corvinas a los 0 y 90 días de experimento.
Días
Glucosa
Colesterol
Triglicéridos
Lípidos
Totales
Proteínas
0
81.33
90.66
173.89
1619.65
1899.91
7.00
3.77
11.55
121.34
183.61
5M
85.85
77.32
135.39
1391.05a
3235.59*b
6.69
4.10
12.57
83.04
289.18
5T
93.88
78.97
119.82*
1427.14a
3049.10*ab
4.58
2.89
11.37
93.44
76.83
6M
81.93
77.32
109.95*
1584.73a-b
2909.58*ab
6.65
3.25
10.94
82.55
210.15
7M
89.85
72.68*
97.80*
1889.34b
2184.89a
4.54
9.39
83.04
174.99
90
5.83
a,b,c...
Los valores son medias ± EEM (N=6)
Valores con diferentes superíndices indican diferencias
atribuibles a la frecuencia alimentaria a los 90 días (p<0.05).
* Indica diferencias significativas atribuibles al tiempo de cultivo (día 0 vs. día 90) (p<0.05).
5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la
mañana. 7M: 7días/semana por la mañana.
VI.3.4. Actividades enzimáticas en hígado y músculo
En la tabla VI.3.6. se muestra el efecto de la frecuencia de alimentación y la
duración del experimento sobre la actividad metabólica y el contenido de glucógeno en
el hígado; las diferencias significativas atribuibles a la segunda variable se muestran en la
tabla VI.3.8.
Considerando el tiempo de experimento (tabla VI.3.8.), se detectó una ligera
tendencia a disminuir la actividad enzimática desde el principio hasta los 45 y 90 días,
aunque esta tendencia sólo fue estadísticamente significativa para CS, GDH y HOAD. La
actividad G6PDH se mantuvo constante para todos los tratamientos, excepto 6M en que
disminuyó significativamente a los 90 días. El contenido hepático en glucógeno aumentó
de forma significativa desde el día 0 hasta el 45 y, a partir de entonces, se mantuvo
excepto para los peces alimentados 7 días a la semana en que fue significativamente
superior.
La frecuencia de alimentación (tabla VI.3.6.) no influyó significativamente sobre
las actividades FBPasa y GDH. A los 45 días, los valores de CS, G6PDH, HOAD y PK fueron
menores en los peces alimentados 5 días a la semana frente a los alimentados 6 y 7 días
por semana, mientras que la actividad de la LDH mostró mayores valores para los lotes
6M. A los 90 días algunas de las actividades enzimáticas parecían haber sido afectadas
por la frecuencia alimentaria, solo las correspondientes a CS y HOAD mostraron
213
Sergio García Mesa
menores valores para 5M y G6PDH para 6M. El contenido en glucógeno fue similar para
todos los tratamientos a los 45 días y significativamente superior en lotes 7M a los 90
días.
Tabla VI.3.6. Influencia de la frecuencia de alimenatción sobre actividades enzimáticas
(mU/mg proteína) y contenido en glucógeno (mg glucógeno/g tejido) en el hígado de
las corvinas a los 0, 45 y 90 días de experimento
Días
CS
FBPasa
GDH
G6PDH
HOAD
LDH
PK
Glucógeno
0
17.62
22.95
114.99
30.02
18.17
87.47
32.77
64.67
0.84
2.12
10.17
2.89
1.68
8.01
2.83
6.92
x
5M
13.30
19.99
65.98
24.25
0.75
1.90
4.50
2.44
x
5T
45
6M
7M
5M
5T
90
6M
7M
x
xy
86.34
11.76
xy
0.60
x
80.82
xy
5.55
27.53
xy
2.42
x
101.33
5.41
x
103.8
13.45
18.93
25.53
9.98
74.19
0.88
1.63
6.17
0.72
0.70
6.55
25.94
2.34
9.53
18.07y
19.18
96.22y
29.07
14.26yz
102.97y
36.78y
87.16
0.84
1.72
5.59
3.41
1.14
7.61
3.12
1.36
17.97y
21.32
101.17y
29.40
15.73z
65.31x
33.88xy
89.53
0.74
1.88
6.79
0.71
1.12
5.70
1.15
1.36
11.15a
20.14
73.72
32.90b
8.95a
113.06
23.34
89.43a
0.89
1.99
6.74
1.47
0.66
11.21
2.21
5.12
15.24b
21.52
69.04
36.55b
11.61ab
90.05
25.80
85.01a
0.77
2.08
2.91
2.72
0.64
5.19
1.74
5.63
14.91b
17.15
68.87
24.27a
12.90b
97.65
27.11
82.94a
0.26
1.58
5.38
1.54
0.76
5.82
2.34
3.15
14.49ab
17.17
68.60
33.91b
12.19b
104.14
27.70
110.32b
1.30
1.00
3.86
2.46
0.68
9.87
2.36
2.57
Los valores son medias ± EEM (N=6). Valores con diferentes superíndices indican diferencias atribuibles a la
x,y,z...
a,b,c...
frecuencia alimentaria a los 45 (
) y 90 (
) días (P<0.05).
5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M:
7días/semana por la mañana.
CS: Citrato Sintasa; FBPasa; Fructosa Bisfosfatasa; G6PDH: Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa; GDH: Glutamato
Deshidrogenasa; HOAD: 3-hidroxiacil CoA Deshidrogenasa; LDH: Lactato Deshidrogenasa; PK: Piruvato Kinasa.
Los valores de la actividad específica de las enzimas metabólicas y el contenido
en glucógeno en el músculo blanco de las corvinas (tabla VI.3.7.) mostraron cambios
diferentes a los ocurridos en el hígado a lo largo del experimento, y al igual se sucedió
en experimentos previos, la actividad G6PDH no fue posible determinarla.
El tiempo de experimento influyó significativamente sobre las actividades CS,
HOAD y PK musculares (tabla VI.3.8.), la actividad CS disminuyó a partir del día 0 hasta
los 45 y 90 días en todos los tratamientos, la actividad HOAD sólo para los lotes 5M
mientras que la actividad PK aumentó en todos excepto 7M. Los valores de glucógeno
también disminuyeron significativamente desde el principio hasta el final del
experimento.
214
Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad.
La frecuencia alimentaria no pareció influir sobre la actividad enzimática a los 45
días del experimento pero al final del mismo, las actividades GDH y FBPasa mostraron
valores significativamente mayores en los peces 6M y 5T, respectivamente, mientras
que las actividades LDH y PK fueron significativamente menores en 7M y la HOAD en
5M. No se observaron cambios significativos en las demás actividades enzimáticas en
función del tratamiento el día final del experimento.
Tabla VI.3.7. Influencia de la frecuencia de alimentación sobre actividades enzimáticas
(mU/mg proteína) y contenido en glucógeno (mg glucógeno/g tejido) en el músculo de
las corvinas a los 0, 45 y 90 días de experimento
Días
CS
22.04
FBPasa
2.98
GDH
46.47
1.98
0.27
3.66
5M
14.20
2.49
39.96
0.89
0.21
3.77
5T
15.03
2.02
41.58
1.07
0.20
4.16
6M
15.41
2.07
38.53
1.03
0.17
3.25
7M
14.88
2.03
48.69
1.22
0.17
3.59
0
45
5M
5T
90
10.97
0.89
11.72
0.75
a
2.79
37.95
0.22
2.97
b
4.1
0.41
ab
3.15
G6PDH
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
a
n.d.
ab
43.76
n.d.
4.01
b
6M
12.68
53.32
0.91
0.32
4.63
7M
14.51
3.48ab
46.73ab
1.41
0.31
2.29
n.d.
n.d.
HOAD
7.54
LDH
1530.72
PK
1045.69
Glucógeno
4.62
0.69
112.47
89.64
0.36
7.75
1483.68
1092.66
1.85x
0.67
161.62
83.98
0.05
5.59
2069.11
1114.41
3.95y
0.25
198.43
110.67
0.23
6.95
1753.59
1032.24
3.27y
0.66
150.78
96.74
0.31
6.46
2056.37
1280.59
3.46y
0.59
151.22
83.98
0.31
a
1858.06
0.24
180.64
2.86
5.22
b
0.48
9.51
c
ab
88.93
2443.56
b
227.54
1865.39
1434.21
ab
0.13
1587.88
b
141.18
ab
1415.10
1.67a
1.89ab
0.18
ab
1.36a
0.68
132.6
102.09
0.11
5.80b
1368.65a
1151.21a
2.30b
0.46
129.81
81.47
0.13
Los valores son medias ± EEM (N=6). Valores con diferentes superíndices indican diferencias atribuibles a la frecuencia
x,y,z...
a,b,c...
alimentaria a los 45 (
) y 90 (
) días (P<0.05).n.d.= no detectada.
5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M:
7días/semana por la mañana.
CS: Citrato Sintasa; FBPasa; Fructosa Bisfosfatasa; G6PDH: Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa; GDH: Glutamato
Deshidrogenasa; HOAD: 3-hidroxiacil CoA Deshidrogenasa; LDH: Lactato Deshidrogenasa; PK: Piruvato Kinasa.
Los peces alimentados 5 días a la semana por la mañana (5M) mostraron un
contenido en glucógeno muscular significativamente menor a los 45 días, a los 90
disminuyeron en los otros tratamientos, siendo significativamente mayores los valores
de 7M.
215
Sergio García Mesa
Tabla VI.3.8. Efecto del tiempo de experimento sobre algunos parámetros
(diferencias significativas se muestran con diferentes números (1,2,3) (P<0.05)
lotes
días
Enzimas del hígado
CS
FBPasa
GDH
G6PDH
HOAD
LDH
PK
Glucógeno
5M
5T
6M
7M
0-45-90
0-45-90
0-45-90
0-45-90
2-1-1
n.s.
2-1-1
n.s.
2-1-1
n.s.
n.s.
1-2-1,2
2-1-1,2
n.s.
2-1,2-1
1,2-1-2
2-1-1
n.s.
n.s.
1-2-1,2
1,2-2-1
n.s.
2-1,2-1
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
2-1,2-1
n.s.
2-1,2-1
1,2-1-2
n.s.
1-1,2-2
2-1-1
n.s.
n.s.
2-2-1
n.s.
1-1,2-2
2-1-1
2-1-1
1,2-1-2
n.s.
n.s.
1-1,2-2
1-1-2
2-2-1
2-1,2-1
1,2-1-2
n.s.
n.s.
n.s.
1,2-1-2
2-2-1
2-1,2-1
1,2-1-2
n.s.
n.s.
1-2-1
n.s.
2-1,2-1
Enzimas del músculo
CS
FBPasa
GDH
HOAD
LDH
PK
Glucógeno
5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M:
7días/semana por la mañana.
n.s.: diferencias no significativas.
CS: Citrato Sintasa; FBPasa; Fructosa Bisfosfatasa; G6PDH: Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa; GDH:
Glutamato Deshidrogenasa; HOAD: 3-hidroxiacil CoA Deshidrogenasa; LDH: Lactato Deshidrogenasa; PK:
Piruvato Kinasa.
VI.3.4. Firmeza, pH y capacidad de retención de agua (CRA)
En la tabla VI.3.1.9. y en la figura VI.4.1. se muestra la evolución post-mortem de
la firmeza, pH y CRA (capacidad de retención de agua) del músculo de las corvinas
sometidas a las distintas frecuencias alimentarias. Tanto éstas como el tiempo de
almacenamiento, influyeron significativamente sobre los tres parámetros estudiados.
Con respecto a la firmeza, se detectó una relación directa con la frecuencia de
alimentación semanal, circunstancia que se mantuvo a lo largo del periodo de
conservación post-mortem de 144 horas (144 hpm). Los peces alimentados 5 días a la
semana y por la mañana (5M) mostraron valores similares de firmeza las primeras horas
post-mortem, pero al final del periodo de almacenamiento exhibían valores inferiores
los alimentados por la tarde. El tiempo de almacenamiento supuso, a su vez, una
disminución de este parámetro en todas las frecuencias alimentarias estudiadas.
Los valores de pH mostraron un efecto opuesto a los de firmeza, al inicio del
periodo de conservación (24 hpm), los valores de las corvinas alimentadas 5 días a la
semana (5M y 5T) eran superiores a los de los otros peces (6M y 7M). Durante el
216
Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad.
almacenamiento se detectó una disminución, en todos los lotes, de los valores de este
parámetro a las 48 hpm y un posterior aumento a partir de las 72 hpm.
Con respecto a la capacidad de retención de agua (CRA), las corvinas alimentadas
por la tarde (5T) mostraban valores más altos que las alimentas por la mañana, no
detectándose diferencias significativas entre éstas. Esta diferencia se vio atenuada
durante el almacenamiento, que provocó una disminución de los valores de este
parámetro para todos los tratamientos estudiados.
Tabla VI.3.9. Efecto de la frecuencia alimentaria en la firmeza, pH
y capacidad de retención de agua (CRA) en las corvinas tras el
sacrificio.
Hpm
24
5M
5T
6M
7M
35.16ab,3
34.61a,3
41.78c,3
39.00bc,3
6.87
6.19
3.46
1.81
a,2
Firmeza
(N)
48
24.67
4.74
2.83
b,1
72
144
24
48
pH
72
144
24
CRA
(%)
26.33
48
72
144
22.50
20.24
a,2
37.50
c,2
1.39
a,1
34.87
33.19b,2
3.91
d,2
30.83c,2
2.26
2.21
2.38
3.75
22.45b,1
19.90a,1
30.88c,1
26.68bc,1
2.24
1.93
7.07
4.98
6.79
2
0.10
6.24
2
6.90
0.38
2
6.15
6.56
a1
0.07
2
6.26
6.39 a2
0.09
b1
5.96 ab2
0.16
0.10
0.10
0.06
6.562
6.422
6.49 b1
6.44 bc3
0.16
0.11
0.14
0.09
6.54
2
6.53
2
6.48
b1
6.47 c3
0.10
0.11
0.11
0.17
70.80b3
70.50a2
69.31a3
68.81a4
0.63
0.34
0.58
0.65
70.41
b3
0.48
69.40
69.90
b2
0.44
c2
69.83
c12
68.78
a23
0.65
67.50
67.97a3
0.52
b1
66.06a2
0.30
0.66
0.57
0.34
66.98a1
68.00b1
68.38b12
66.98a2
0.66
0.83
0.54
0.35
a,b..
Los valores son media ± EEM (N=6).
Muestran diferencias estadísticamente
significativas (P<0.05) debidas a las frecuencias de alimentación.
5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana
por la mañana. 7M: 7días/semana por la mañana.
FA: frecuencia alimentaria; Hpm: horas post-mortem.
VI.3.5. Contenido en proteínas
En la tabla VI.3.10. se muestra la evolución post-mortem del contenido de
diferentes tipos de proteínas musculares de las corvinas alimentadas con distintas
1,2…
Muestran diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) debidas al tiempo de
almacenamiento.
217
Sergio García Mesa
frecuencias semanal. Los resultados obtenidos no mostraron influencia significativa ni de
éstas ni del tiempo de almacenamiento.
Se ha podido observar una tendencia a aumentar las proteínas sarcoplasmáticas
(PSP) al disminuir la frecuencia alimentaria semanal; así, los lotes 7M mostraron
menores contenidos en proteínas sarcoplásmicas que los 6M, 5M y 5T aunque esas
diferencias no fueron estadísticamente significativas. De la misma forma, las proteínas
miofibrilares (PMF) mostraron una tendencia a disminuir cuando los peces se
alimentaban 5 días frente a los alimentados 6 y 7 días por semana y también con el
tiempo de almacenamiento; sin embargo, las diferencias tampoco son significativas
posiblemente debido a la alta dispersión de los datos individuales.
Tabla VI.3.10. Influencia del tamaño de frecuencia alimentaria sobre el contenido de
proteínas totales (PT), sarcoplásmicas (PSP) y miofibrilares (PMF) y aminoácidos (AAs)
(mg/g de músculo seco) a diferentes tiempos después del sacrificio.
6M
Hpm
5M
5T
7M
24
28.96±4.40
25.23±4.15
27.53±4.51
22.57±2.87
144
29.66±2.59
28.18±2.00
27.35±3.08
24.53±2.05
24
68.02±7.72
68.31±2.93
74.09±7.13
74.06±7.39
144
69.91±6.54
61.55±6.69
71.80±4.05
71.64±11.49
24
96.98±5.68
93.54±1.25
101.62±7.87
96.62±8.71
144
99.57±5.76
89.73±7.74
99.16±6.71
96.16±10.76
24
26.03±5.72
26.89±6.09
28.39±5.93
25.52±4.08
144
31.51±5.73
25.44±3.95
24.45±4.02
26.30±3.41
PSP
PMF
PT
AAS
Los valores son media ± EEM (N=6). No se han encontrado diferencias estadísticamente significativas (P<0.05) debidas
a las frecuencias de alimentación ni al tiempo de almacenamiento.
5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M:
7días/semana por la mañana.
Hpm: horas post-mortem.
VI.3.6. Análisis electroforético de las proteínas sarcoplasmáticas
(PSP)
La figura VI.3.1. muestra el resultado de la separación en geles SDS-PAGE de las
fracciones proteicas de los extractos de las proteínas sarcoplásmicas del músculo de la
corvina. La densidad óptica relativa (DOR) de las distintas bandas (expresada en % sobre
la densidad óptica relativa total de cada carril) se expone en la tabla VI.3.11.
218
Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad.
Tras la separación electroforética se obtuvieron 12 bandas principales a partir de
los extractos de proteínas sarcoplásmicas que, cuando se comparan con el patrón, se
identifican con proteínas de pesos moleculares relativos de 97, 58, 50, 45, 43, 40, 38, 36,
28, 26, 24 y 16 kDa.
La banda B-43 mostró los mayores porcentajes (por encima del 20 %); seguida de
la banda de 16 kDa que mostró valores entre el 12 y el 14 %, las bandas B-45 y B-40 que
constituyeron entre el 10 y 12 % del total; a continuación las bandas, B-38 y B-36 sobre
un 8% cada una. El resto de las bandas tuvieron una importancia similar en el conjunto
de los carriles: B-96, B-58, B-50, B-28, B-26, siendo la B-24 la que menor densidad óptica
presentó.
205kDa
116 kDa
97.4 kDa
97 kDa
66 kDa
58 kDa
50kDa
45kDa
43kDa
40kDa
38 kDa
36 kDa
45 kDa
29 kDa
28 kDa
26 kDa
24 kDa
16 kDa
P
7M
6M
5T
5M
------------------------------------24 hpm
7M
6M
5T
5M
--------------------------------------144 hpm
Figura VI.3.1. Patrón electroforético de la proteínas sarcoplasmáticas del músculo de
corvinas, alimentadas con diferentes frecuencias alimentarias, a las 24 y 144 horas postmorten.
El análisis estadístico de los datos muestra que los valores obtenidos no se han
visto afectados de forma significativa por las diferentes frecuencias alimentarias;
además, la mayoría de las bandas se mantuvieron casi sin cambios durante el
almacenamiento; solamente se han observado diferencias estadísticamente
significativas en las banda B-43 que han disminuido para todas las frecuencias
alimentarias entre las 24 y 144 hpm (aunque las diferencias solamente son significativas
para las corvinas 5M y 5T) y la banda B-36 que experimenta un cambio contrario en los
tratamientos 7M y 6M.
219
Sergio García Mesa
Tabla VI.3.11. Efecto de la frecuencia de alimentación y tiempos de almacenamiento
sobre la densidad óptica relativa (DOR) de cada banda expresada en % sobre el total de
la densidad óptica de las proteínas sarcoplasmáticas en las corvinas.
Hpm
24
144
Fracciones
proteicas
5M
5T
6M
7M
B-96
4.71±0.90
5.06±1.32
5.13±0.81
5.19±0.39
B-58
5.54±0.22
5.82±0.45
5.45±0.75
5.04±0.83
B-50
5.86±0.60
6.15±0.66
5.47±1.19
6.07±0.76
B-45
11.95±0.61
11.77±0.69
12.32±0.88
11.86±0.47
B-43
24.28±1.13
23.85±0.73
23.61±0.86
23.51±0.75
B-40
10.60±1.73
10.67±0.43
11.53±0.84
11.46±0.31
B-38
7.47±1.03
6.52±1.26
7.29±0.89
7.78±0.79
B-36
6.70±2.05
6.67±1.07
5.83±0.37
5.88±1.18
B-28
3.92±0.58
4.04±0.90
3.87±0.66
3.32±0.20
B-26
3.18±0.59
3.88±0.74
3.31±0.75
3.40±0.88
B-24
2.88±0.41
2.68±0.23
2.72±0.83
3.00±0.64
B-16
12.83±0.92
13.39±0.60
14.08±0.36
13.68±0.78
B-96
4.68±0.50
4.63±0.55
4.35±0.89
5.01±0.52
B-58
5.78±1.04
5.09±0.93
5.34±1.32
5.65±1.11
B-50
4.89±1.01
5.24±1.17
5.89±0.45
5.36*±0.96
B-45
11.76±0.59
12.76±1.18
12.18±1.42
11.18±0.33
B-43
22.83*±0.30
22.08*±0.55
22.41±1.98
22.38±1.18
B-40
11.33±0.65
11.04±0.78
10.79±0.94
11.81±0.37
B-38
6.92±0.40
6.93±1.11
6.72±1.54
6.65±0.36
B-36
6.59±0.49
6.93±1.03
6.61*±0.30
6.94*±0.54
B-28
4.91±0.59
5.07±0.58
5.57±0.31
4.94±0.97
B-26
3.82±0.36
4.20±0.96
4.67±0.71
4.09±0.91
B-24
3.03±0.36
3.00±0.63
3.21±0.27
2.67±0.99
B-16
13.40±0.51
13.27±1.11
12.61±1.29
13.01±0.58
Los valores son media ± EEM (N=6). *Muestran diferencias estadísticamente significativas (P<0.05) debidas al
tiempo de almacenamiento.
Hpm: horas post-mortem.
5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M:
7días/semana por la mañana.
220
Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad.
VI.3.7. Análisis electroforético de las proteínas miofibrilares (PMF)
En los geles se muestran las fracciones obtenidas tras la separación
electroforética de las proteínas miofibrilares (figura VI.3.2.), así como la cuantificación
de su densidad óptica relativa (DOR) (tabla VI.3.12), se han observado diversas bandas,
entre las cuáles se identifican, según la literatura consultada, como cadena pesada de
miosina (200kDa), Proteína C (146 kDa), actina (45 kDa), Troponina-T (38 kDa), banda de
35 kDa y péptido de 30 kDa, que ha aparecido solo en los extractos realizados a las 144
hpm.
Tabla VI.3.12. Efecto de la frecuencia de alimentación y tiempo de
almacenamiento sobre la densidad óptica relativa (DOR) de cada banda
expresada en % sobre el total de la densidad óptica de las proteínas
miofibrilares de las corvinas.
Fracciones
Hpm
5M
5T
6M
7M
proteicas
24
144
200 kDa1
37.13a±0.18
39.32b±0.42
37.51a±1.46
37.74a±0.68
146 kDa2
1.17a±0.23
1.61ab±0.52
2.61c±0.34
1.91b±0.60
45 kDa3
30.71b±0.29
28.74a±0.55
30.15ab±1.68
31.35b±1.32
38 kDa4
29.01b±0.58
27.38a±0.76
27.27a±0.85
26.34a±0.66
35 kDa
2.44a±0.32
3.26b±0.51
2.71ab±0.25
3.06b±0.42
30 kDa
-
-
-
-
200 kDa1
37.02ab±0.66
35.07*a±0.82
37.21b±2.88
37.79b±0.75
146 kDa2
3.09*c±0.63
2.66*bc±0.19
2.42 b±0.16
1.82 a±0.23
45 kDa3
27.90*±0.99
30.23*±0.91
28.80±0.77
30.58±0.22
38 kDa4
28.73 b±0.38
28.91*b±0.71
28.93 b±1.98
27.25*a±0.39
35 kDa
1.61*b±0.41
1.74*b±0.27
0.84*b±0.21
0.64*a±0.10
30 kDa
1.65*b±0.70
1.52*b±0.70
1.79*a±0.45
2.08*a±0.06
a,b..
Los valores son media ± EEM (N=6).
Muestran diferencias estadísticamente significativas (P<0,05)
debidas a las frecuencias alimentarias; *Muestran diferencias estadísticamente significativas (P<0,05)
debidas al tiempo de almacenamiento.
1
2
3
4
200 kDA: Cadena Pesada de miosina; 146 kDA: Proteína C; 45 kDa: actina; 38 kDa: Troponina-T.
FA: frecuencia alimentaria; Hpm: horas post-mortem.
5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana.
7M: 7días/semana por la mañana.
221
Sergio García Mesa
Las fracciones proteicas mayoritarias han sido la actina y la miosina, con
aproximadamente un 30 y un 40% del total de la proteína de cada carril,
respectivamente. La Troponina-T ha mostrado valores aproximados de entre el 24 y 29
% del total. Las bandas correspondientes a la proteína C y la de 35 kDa han tenido poca
importancia relativa en el conjunto, no superando el 6% entre las dos.
205kDa
200kDa
146kDa
116 kDa
97.4 kDa
66 kDa
45kDa
38 kDa
45 kDa
35 kDa
30 kDa
29 kDa
P
7M 6M
5T
5M
7M 6M 5T
5M
--------------------------------------- ----------------------------------24 hpm
144 hpm
Figura VI.3.2. Patrón electroforético de las proteínas miofibrilares del músculo
de corvinas, alimentadas con diferentes frecuencias alimentarias, a las 24 y 144
horas post-morten.
El análisis de los datos demostró, a las 24 hpm, un aumento de la banda de
miosina y una disminución de la de actina en los peces alimentados cinco días a la
semana por la tarde. También se observaron cambios opuestos en la Troponina-T, que
aumentó, y la banda de 35 kDa, que disminuyó en los peces 5M con respecto a los
demás. La banda de la proteína C era menor en los lotes 5M y 5T que en los lotes 7M y
6M.
A las 144 hpm se observaban tendencias diferentes a las detectadas 24 hpm,
disminuyendo las bandas de miosina y de 30 kDa en las corvinas 5T y aumentando la
proteína C y la banda de 35 kDa en los tratamientos 6M, 5M y 5T frente a las corvinas
alimentadas 7 días a la semana.
El tiempo de almacenamiento afectó de forma significativa a la densidad óptica
relativa de la banda de miosina en las corvinas 5T, las bandas de proteína C y actina
para las 5M y para las 5T. La banda de 35 kDa disminuyó drásticamente en todas las
222
Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad.
frecuencias alimentarias, apareciendo la banda de 30 kDa que, de hecho, no se observó
a las 24 hpm.
VI.4. DISCUSIÓN
Existe una creciente evidencia de que el éxito de la alimentación de un cultivo
intensivo de peces depende no solo de ¿qué? come el pez, sino también de otros
aspectos de la estrategia alimentaria como son ¿cuándo? y ¿con qué frecuencia deben
ser alimentados? Por lo tanto, cuestiones como cuál es la hora para suministrar el
alimento (¿por la mañana o por la tarde?, ¿en ambas?), o la de si los peces deben ser
alimentados todos los días o puede resultar favorable o, al menos, no muy desfavorable,
intercalar ayunos cortos o, finalmente, si la ración diaria se debe suministrar de una sola
vez o fraccionada en varias tomas diarias, devienen particularmente relevantes. Una
definición correcta de estos aspectos puede afectar positivamente tanto al crecimiento y
utilización del alimento por el pez (economía) como al impacto medioambiental
(ecología) (Lee et al., 2000a; Bolliet et al., 2001; Madrid et al., 2001; Türker, 2006;
Marimuthu et al., 2010).
La introducción de uno o más días de ayuno por semana durante la fase de
engorde de los peces en una granja se ha probado repetidamente con resultados
diversos. En nuestro caso, los peces alimentados 5 o 6 días a la semana crecieron de
forma muy similar a los alimentados todos los días (tabla VI.3.1.). De hecho, los lotes
ayunados un día a la semana (6M) lo hicieron algo más que los demás. Es necesario
destacar que en este experimento todos los lotes recibían la misma ración semanal total
lo que implica que la tasa de crecimiento no refleja diferencias en la ingesta si no, en
cualquier caso, en la utilización del alimento.
Resultados previos con otras especies muestran repetidamente que un aumento
en la frecuencia de alimentación produce un incremento en la tasa de crecimiento del
pez, principalmente debido a un correspondiente incremento en la cantidad de alimento
ingerido. También se ha mostrado que esta tendencia exhibe un máximo y así
frecuencias mayores que éste no implican un mejora adicional del crecimiento o
utilización del alimento (Lee et al., 2000a; Türker, 2006; Marimuthu et al., 2010). Estos
hallazgos han demostrado que los resultados de estas maniobras dependen de muchas
variables como la especie, la edad (uno de los factores determinantes más importantes:
para peces jóvenes se recomiendan mayores frecuencias alimentarias), el tipo y la
composición del alimento (sobre todo el contenido en energía), las condiciones
ambientales (sobre todo temperatura), etc.
223
Sergio García Mesa
Okumus y Bascinar (2001) establecieron que truchas que comían todos los días
(F7) crecieron más que las alimentadas sólo cinco días a la semana (F5) o cada dos días
(FEOD), pero también que las F5 utilizaban mejor el alimento ingerido (mejor índice de
conversión) minimizando las diferencias en crecimiento con respecto a F7. El Sayed et
al., (2009) mostraron que tilapias alimentadas 6 días a la semana (T6) ingerían la misma
cantidad de alimento (los peces se alimentaron ad libitum) y crecían de forma similar
que otros peces alimentados siete días a la semana (T7), mientras que los peces
alimentados sólo 5 ó 4 días a la semana exhibían resultados más pobres. Una vez más,
los peces privados de alimentación un día a la semana (T6) exhibieron el mejor índice de
conversión. Como en nuestro caso, la pausa de un día, parece provocar que la
maquinaria comportamental, digestiva y metabólica implicada en la ingesta y utilización
del alimento resulte más favorable para los propósitos de crecimiento y utilización del
alimento. También debe ser tenida en cuenta la posibilidad de ahorro en costes de
personal asociado a esta estrategia alimentaria.
Como hemos indicado, las corvinas alimentadas 5 días a la semana crecieron con
una tasa similar a la de las alimentadas 6 o 7 días a la semana, aunque, cuando los peces
se alimentaron por la tarde (es decir, con un horario diferente al que previamente se
había usado con estos peces), la tasa de crecimiento fue la más baja (tabla VI.2.1.).
Como se ha comentado anteriormente, el ayuno de dos días a la semana implica una
reducción en el crecimiento de la trucha (Okumus y Bascinar, 2001) y la tilapia (El Sayed
et al., 2005), pero en esos casos coincidió con una reducción de la ingesta (los peces
fueron alimentados hasta saciedad aparente); como hemos señalado antes, en nuestro
experimento y para poder descartar el posible efecto de una diferente cantidad de
alimento ingerido se suministró una ración semanal idéntica a todos los peces, por lo
que parece que la forma de suministro de esta cantidad de alimento a lo largo de la
semana tiene sólo una influencia secundaria. Estos resultados coinciden con los de
Robinson y Li (1996) y Wu et al. (2004) con juveniles de pez gato criados en tanques, que
se alimentaron hasta saciedad; en este caso, alimentarlos 6 o 7 días a la semana resultó
irrelevante para propósitos de crecimiento. De confirmarse y generalizarse esta
posibilidad, ello daría más opciones al acuicultor.
Puesto que todos los peces se alimentaron con el mismo pienso y ración
semanal, es decir, consumieron la misma cantidad de proteína, los efectos sobre el PER
son reflejo exacto de los que hemos descrito para crecimiento. El Sayed et al. (2005)
tampoco encontraron diferencias significativas en PER en el anteriormente comentado
experimento con tilapia. El índice VPP contempla tanto el aumento de peso como el
contenido en proteína corporal; nuestros datos reflejan mejores índices de VPP en peces
224
Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad.
alimentados 6 o 7 días a la semana, que crecieron algo más y retuvieron más cantidad de
proteína.
Durante el experimento no cambió el índice de condición (K) de las corvinas
(tabla VI.2.2.) que en todos los casos fue de un valor cercano a 1.0, en línea con lo
aportado previamente por otros autores (Poli et al., 2003; Piccolo et al., 2008;
Chatzifotis et al., 2010) y nosotros mismos en otros apartados de esta Memoria, para
esta especie y a diferentes edades. Este es un valor de K típico de un pez delgado (un
rasgo físico usualmente valorado por los consumidores de peces cultivados). Otros
índices biométricos como la proporción relativa del peso de hígado, tracto digestivo y
filete con respecto al peso corporal total de los peces no variaron durante el
experimento o por efecto del régimen alimentario (tabla VI.2.2.). Cuando se han
probado diferentes regímenes alimentarios permitiendo la ingesta de alimento hasta
saciedad, hay una tendencia general (Lee et al., 2000a,b; Marimuthu et al., 2010) a que
un aumento en la frecuencia alimentara implique algunos cambios en la composición
corporal, sobre todo en el contenido de grasa y proteína, lo que puede modificar de
forma diferencial el peso de las reservas asociadas al hígado, tracto digestivo o músculo
y, por lo tanto, alterar los correspondientes IHS, IDS y RF, respectivamente. Este no es
nuestro caso, aunque una acumulación diferencial de grasa en otros compartimentos
(por ejemplo grasa perivisceral o hígado) no debe ser descartada si se consideran los
datos de composición del pez completo (valores significativamente menores del
contenido en lípidos totales se observaron en corvinas 6M y de proteína en 5T a los 90
días).
Tanto los peces salvajes como los mantenidos en el laboratorio o la granja
exhiben patrones, más o menos pronunciados, de preferencias con respecto a la hora de
alimentación a lo largo del día. Así, algunas especies son diurnas, otras nocturnas y,
finalmente, otras comen de forma continuada. Estas variaciones diarias en el apetito
pueden coincidir con una mejor predisposición digestiva y metabólica para usar con
éxito el alimento ingerido y, por tanto, deben ser tenidas en cuenta en el protocolo de
alimentación semanal (ver revisión de Bolliet et al., 2001). No hay datos publicados
sobre las preferencias de horario de alimentación de la corvina, pero parece que en su
hábitat natural se alimenta preferentemente durante las horas de luz como ocurre con
los peces de este ensayo a lo largo del periodo experimental. Incluimos unos lotes
alimentados por la tarde para ver si su hábito es realmente diurno como comúnmente
se cree.
225
Sergio García Mesa
Así pues, con respecto a los lotes 7M, los 5T estuvieron sometidos no sólo a una
reducción en el número de días por semana en que reciben alimento sino también a un
cambio en el horario previo de suministro del mismo.
La ligera reducción en la utilización del alimento observada en el grupo 5T
(peores valores de índice de conversión) puede ser atribuida, al menos en parte, a esta
doble fuente de novedad. No obstante, no debe descartarse una aptitud más favorable
para el uso del alimento cuando se ingiere durante la fotofase temprana (lotes M) que
podría reflejar un rasgo intrínseco de esta especie y/o un tipo de habituación al
programa de alimentación previo.
Normalmente a lo largo de un cultivo intensivo se observa un aumento del rango
del tamaño de los peces, este aumento de la variación del tamaño se explica por el
establecimiento de una jerarquía y dominancia social de algunos de algunos individuos
que monopolizan el alimento disponible (Thomassen y Fjaera, 1996). Una estrategia
alimentaria adecuada resultaría en una reducción en el rango de tamaños, evitándose,
incluso, el canibalismo que suele aparecer asociado a grupos heterogéneos (Fontaine et
al., 1997; Marimuthu et al., 2010). En las corvinas alimentadas con distinta frecuencia
alimentaria semanal se apreciaron diferencias en la distribución de las poblaciónes, pues
el coeficiente de variación del tamaño de los individuos de 6M (12.9%) resultó
claramente inferior al encontrado en los otros tres tratamiento (15.5 a 17.%) es apenas
90 días de experimento. Así pues, la misma frecuencia alimentaria que resultaba algo
más favorable en base a datos de crecimiento y aprovechamiento de la dieta y
composición corporal, sería la más adecuada para obtener una distribución de pesos
más homogénea. Aunque los datos de coeficiente de variación presentados en los
distintos lotes no son aún alarmantes, no olvidemos que se han originado durante sólo
90 días por lo que es previsible que, con el paso del tiempo, las diferencias fueran
amentando especialmente en los lotes alimentados 5 días a la semana lo que podría
provocar la acentuación de esos fenómenos de jerarquía/dominancia a la hora del
reparto del alimento entrando en un bucle de agravamiento del problema, sólo
neutralizable, en parte, mediante selecciones frecuentes de animales por tamaños y
traslados, tarea que demanda dedicación de personal y suele afectar notablemente a los
peces que la sufre. Ya en 1977, Grayton y Beamish describieron que una ración
restringida al 2% proporcionaba un patrón de crecimiento más homogéneo entre
individuos, cuando se comparaba con un sistema de alimentación a saciedad.
Para comprobar la posibilidad de una progresiva adaptación metabólica a las
diferentes frecuencias alimentarias como una influencia en la disponibilidad de alimento
(Sullivan y Somero, 1983), se ha realizado el estudio de diversas actividades enzimáticas
226
Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad.
hepáticas y musculares indicativas del estado metabólico de los peces (tablas VI.3.6. y
VI.3.7.) en distintos tiempos de cultivo (0, 45 y 90 días), dada la posibilidad de que
puedan suponer alteraciones con consecuencias negativas sobre la rentabilidad del
cultivo a largo plazo.
Se ha comprobado que el metabolismo intermediario de los peces puede
adaptarse a factores como la actividad física (Lushchak et al., 2001) o los ciclos de
luz/oscuridad (Polakof et al., 2007) y, sobre todo, a aspectos de la estrategia alimentaria
como son la composición de la dieta y su contenido en energía (Regost, 2001; Suárez et
al., 2002; Kolditz et al., 2008; Moreira et al., 2008; Pérez Jiménez et al., 2009; Enes et
al., 2009), el ayuno o la restricción del alimento (Shikata et al., 1993; Navarro y
Gutiérrez, 1995; Regost, 2001; Pérez Jiménez et al., 2007) o la reducción de la frecuencia
alimentaria (Nakagawa et al., 1995).
El hígado es el órgano de mayor importancia en el metabolismo intermediario, ya
que en él se centralizan los sistemas de almacén y/o distribución de los nutrientes y de
la energía (Gatlin, 2010). En este estudio se observó una inhibición de la mayoría de las
enzimas cuya actividad se midió en los peces alimentados 5 días a la semana,
posiblemente motivada por una estrategia de ahorro de las reservas energéticas como
respuesta al hecho de no obtener alimento todos los días. Los cambios se produjeron de
forma secuencial, a los 45 días de cultivo se detectó una disminución de prácticamente
todas las actividades enzimáticas en las corvinas 5M y 5T; a los 90 días se habían
recuperado los valores en las corvinas 5T mientras que las 5M seguían mostrando
valores inferiores al resto de los tratamientos.
Efectivamente, las actividades de CS y HOAD fueron significativamente inferiores
en las corvinas alimentadas 5 días. La actividad enzimática CS es indicativa de la tasa de
metabolismo aeróbico, puesto que todas las vías de degradación dan como producto
final los sustratos o los intermediarios del ciclo de Krebs, del cual este enzima forma
parte, mientras que la HOAD está implicada en el catabolismo de los lípidos (βoxidación). Estudios realizados en dentón (Morales et al., 2004) y pez lobo (Lamarre et
al., 2007) sometidos a ayuno mostraron una activación significativa de estos dos
enzimas debido posiblemente a la movilización de la grasa de depósito y generación de
acetil-CoA y su utilización en el ciclo de Krebs. Sin embargo, otros autores encontraron
una disminución en la actividad de estos dos enzimas en peces ayunados (Foster y
Moon, 1991), lo que fue interpretado como una reducción de la tasa metabólica
hepática en respuesta a la privación de alimento ya que estos dos enzimas se consideran
indicativas (sobre todo la CS, Tripathi y Verma, 2003) de la tasa metabólica general del
pez.
227
Sergio García Mesa
Así, aunque la falta de alimentación durante dos días a la semana no significa una
verdadera situación de ayuno y, por lo tanto, no es suficiente para inducir un cambio
metabólico global y amplio en los peces, es posible que los que no reciben alimento
todos los días, especialmente 5M y 5T, hayan adaptado su metabolismo a una situación
parecida a la del ayuno y hayan desarrollado una estrategia de ahorro energético similar
a la comentada anteriormente.
Análogamente, la PK, enzima clave que cataliza la última etapa de la glucolisis,
muestra una disminución significativa de su actividad en hígado de trucha y dorada en
situaciones de ayuno (Metón et al., 1999, 2003; Kirchner et al., 2003) y una lenta
recuperación durante la realimentación (Metón et al., 2003). Esto coincide con los
menores niveles de actividad PK encontrados en los lotes de corvinas alimentados 5 días
a la semana y pueden reflejar una utilización preferencial de los carbohidratos del
alimento para recuperación de los niveles de glucógeno agotados en los días de ayuno
más que para obtención de energía, lo cual podría suceder pues en estos mismos
tratamientos se observa una mayor actividad gluconeogénica (FBPasa) y los niveles de
glucógeno hepático son bastante similares entre tratamientos. El contenido en
glucógeno hepático es ligeramente superior en estos peces a los 45 días. La importancia
del glucógeno como fuente de energía durante el ayuno varía según la especie. Algunas,
como lubina, dorada o trucha, lo consumen durante la primera fase de ayuno y lo
recuperan rápidamente durante los primeros días de la realimentación (Navarro y
Gutiérrez, 1995; Metón et al., 2003; Soengas et al., 2006; Pérez-Jiménez et al., 2007),
pero otras, como la carpa, anguila americana y salmón atlántico utilizan
preferentemente los almacenes lipídicos durante el ayuno mientras que el glucógeno no
se modifica (Sundby et al., 1991). El mantenimiento de la concentración de glucosa
plasmática y de los niveles de glucógeno hepático en las corvinas podría indicar que
pertenecen a este último grupo.
Diversos autores han observado en peces en ayunas una marcada disminución en
la actividad de los enzimas de la vía de las pentosas fosfato, G6PDH y 6PGDH (Hung et
al., 1997; Shimeno et al., 1997), lo que conlleva un descenso en la síntesis de lípidos por
no contar la célula con suficiente poder reductor en forma de NADPH (Vigliano et al.,
2002). Las corvinas alimentadas todos los días (7M) mostraron valores altos de la
actividad G6PDH junto con un mayor contenido lipídico corporal y altos niveles de
lípidos circulantes. En comparación con ellas, se observó una disminución de la actividad
de esta enzima y del contenido lipídico corporal en las corvinas 6M (tabla VI.3.3.), pero
este no fue el caso de los lotes alimentados 5 días a la semana, que mostraron valores
similares a las 7M. Nos resulta complicado explicar esta situación. Es posible que la
mayor ingesta de estos peces durante los días en que sí se alimentan con respecto a los
228
Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad.
otros lotes haya provocado una alta actividad lipogénica dada la limitada capacidad de
los hepatocitos para usar ácidos grasos para provisión de energía (Vigliano et al., 2002).
Esta supuesta mayor tasa de síntesis de lípidos coincide con un mayor contenido
en lípidos corporales al final del experimento, probablemente acumulados en hígado o
en forma de grasa perivisceral; sin embargo, los niveles de lípidos circulantes en estas
corvinas son inferiores a los de las demás, lo que podría reflejar una mayor captación de
estos metabolitos desde el torrente sanguíneo.
Los menores valores de lípidos corporales medidos en las corvinas 6M así como
la menor actividad G6PDH en las mismas podrían ser reflejo de una frecuencia de
alimentación más favorable para los animales. La corvina es un pez magro que, incluso
cuando se alimenta con piensos de alto contenido lipídico, no muestra tendencia a
modificar su grasa corporal (Piccolo et al., 2008), por lo tanto, una elevada tasa de
síntesis de lípidos en esta especie puede ser indicio de un desequilibrio nutricional; de
hecho, se ha relacionado frecuentemente el aumento en la síntesis de lípidos y su
almacenamiento en el hígado o depósito perivisceral con una alimentación
desequilibrada (Caballero et al., 2004). También Nakagawa et al., (1995) observaron
inhibición de las actividades lipogénicas y disminución del depósito de lípidos en pargos
alimentados con altas frecuencias de alimentación, que fueron las que mejores
resultados de crecimiento produjeron.
Las actividades enzimáticas mediadas en músculo (tabla VI.3.7.) mostraron
tendencias diferentes a las observadas en hígado. La actividad CS, relacionada con la
capacidad del pez para un ejercicio aeróbico sostenido (Hochachka y Somero, 1984), fue
menor en este órgano en las corvinas 5M, 5T y 6M. Esta disminución coincide con un
aumento en la tasa metabólica anaerobia, indicada por las mayores actividades de LDH,
como proveedora de sustrato para la anterior, la PK. La activación de estoa enzimas está
asociada a movimientos rápidos y vigorosos relacionados con la actividad alimentaria y
que se realizan gracias al consumo del glucógeno muscular (Lushchak et al., 2001).
Algunos autores las han utilizado como marcadores para el estudio del comportamiento
alimentario de los peces de vida libre (Schulte et al., 2000), siendo más baja en peces
que viven en aguas profundas con poca actividad locomotora (Sullivan et al., 1983).
Los resultados de nuestro experimento muestran actividades más altas de estas
dos enzimas en el músculo de las corvinas alimentadas 5 y 6 días a la semana con
respecto a las alimentadas todos los días que, además, mostraron mayor contenido en
glucógeno. La causa podría haber sido un mayor esfuerzo en la consecución de la
cantidad de alimento deseado, fundamentalmente en las corvinas 5T que recibieron el
229
Sergio García Mesa
alimento a una hora inusual, coincidiendo con una mayor actividad gluconeogénica
(mayores valores de FBPasa) en estos peces. Algunos autores interpretan este aumento
de actividad como un factor estresante que supone un consumo de energía extra y
repercute negativamente en el crecimiento de los peces (Alanärä, 1992), lo que coincide
con los peores resultados de crecimiento e índices de conversión detectados en los
peces 5M y, sobre todo, en los 5T.
En cuanto a los mayores valores de actividad HOAD, y por lo tanto, de
degradación lipídica, mostrados por los peces 6M frente al resto de los tratamientos,
contribuyen al menor contenido lipídico corporal de estos peces comentado en los
apartados anteriores, que también puede estar motivado por los mayores valores
observados para la actividad enzimática GDH.
La firmeza (figura VI.4.1.) del músculo de los peces es uno de los principales
parámetros de calidad ya que disminuye rápidamente después del sacrificio, además, es
un índice del proceso de rigor post-mortem que tiene lugar en el músculo de estos
animales. La disminución de la frecuencia de alimentación semanal tuvo efectos
negativos sobre la firmeza del músculo de las corvinas, que fue menor en las
alimentadas 5 días a la semana, independientemente de la hora. También se pudieron
observar valores más altos de pH (figura VI.4.2.) al inicio de la conservación en el
músculo de las corvinas 5M y 5T que en las 7M y 6M, sin embargo, estas diferencias se
atenuaron a partir de las 48 hpm, no habiéndose observado influencia del tratamiento
sobre este parámetro.
La CRA de las corvinas (figura VI.4.3.) mostró valores muy similares para todos los
tratamientos, solamente han sido estadísticamente superiores los correspondientes a
las corvinas alimentadas 5 días a la semana por la tarde que, sin embargo, se igualaron al
resto durante el almacenamiento.
Uno de los factores más importantes que influyen en las características del
músculo de los peces es la integridad de las proteínas miofibrilares (PMF) responsables
de la contracción muscular. La disminución de la frecuencia de alimentación semanal
provocó un aumento en el contenido de proteínas solubles (PSP) y de aminoácidos
libres, y una disminución simultánea en el contenido de PMF en el músculo de las
corvinas a las 24 hpm. Estas diferencias fueron escasas y, posiblemente debido a la
dispersión de los datos, no significativas; sin embargo, pueden interpretarse como que
dichas condiciones había aumentado ligeramente la susceptibilidad del músculo a la
proteólisis. Esta mayor susceptibilidad a la proteólisis puede haber sido la causa de la
menor firmeza y la mayor CRA observadas en las corvinas 5T. Estudios similares
230
Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad.
realizados en otras especies de peces sí observan una disminución en el contenido de
proteínas sarcoplásmicas cuando se disminuye el aporte dietario como ocurre en el
salmón (Einen et al., 1999) o en el bacalao (Beaulieu y Guderley, 1998), si bien este
consumo ocurre en periodos largos de ayuno o restricciones alimentarias intensas.
7M
Firmeza (N)
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
24
6M
5M
5T
48
72
96
120
Tiempo (horas post-morten)
144
Figura VI.4.1. Evolución post-mortem de la firmeza del músculo de las
corvinas alimentadas con distintas frecuencias alimentarias
7M
7.5
6M
5M
5T
7.0
pH
6.5
6.0
5.5
0
24
48
72
96
120
Tiempo (horas post-morten)
144
Figura VI.4.2. Evolución post-mortem del pH del músculo las corvinas
alimentadas con distintas frecuencias alimentarias
7M
75
6M
5M
5T
CRA
70
65
60
0
24
48
72
96
120
Tiempo (horas post-morten)
144
Figura VI.4.3. Evolución post-mortem de la capacidad de retención del
agua (C.R.A.) del músculo las corvinas alimentadas con distintas
frecuencias alimentarias
231
Sergio García Mesa
También se ha podido observar una tendencia no significativa a disminuir el
contenido de proteínas estructurales (PMF) durante el almacenamiento. Si atendemos a
las PSP (tabla VI.3.11.), éstas se mantuvieron prácticamente inalteradas, mientras que el
contenido en aminoácidos totales no siguió una tendencia clara. La disminución de las
PMF (tabla VI.3.12.) se puede atribuir a la proteolisis de esta fracción durante el
almacenamiento del pescado, que se refleja nuevamente en la disminución de la firmeza
observada durante el almacenamiento en todos los tratamientos.
Las proteínas sarcoplásmicas están constituidas principalmente por las
implicadas en el metabolismo muscular (Picariello et al., 2006). Algunas de las bandas
obtenidas en este ensayo coincidieron con las identificadas por Savage et al. (1990) y
Picariello et al. (2006) en carne de cerdo: el péptido de 97 kDa lo identificaron con el
enzima glucógeno fosforilasa; el de 58 kDa con la piruvato kinasa, el de 46 kDa con la
enolasa, el de 43 kDa con la creatina kinasa, el de 40 kDa con la aldolasa, el de 38 kDa
con la lactato deshidrogenada, el de 36 kDa con la gliceraldehido 3-fosfato
deshidrogenasa y el de 16 kDa con la mioglobina. Chéret et al., (2006) las describieron
de forma similar para el músculo de lubina. Otras bandas encontradas poseen una masa
molecular relativa de 34, 27, 25, 21.5 y 17 kDa; por último se observaron también dos
bandas de bajo peso molecular, 13 y 12 kDa.
El patrón electroforético de estas proteínas (cuantificado en la tabla VI.3.11. y
representado en la figura VI.3.1.) no se vio afectado por la frecuencia alimentaria.
Tampoco se detectó una hidrólisis importante de las mismas durante el almacenamiento
post-mortem, indicando una gran estabilidad de esta fracción proteica en la corvina. El
papel que juegan estos enzimas en el metabolismo post-mortem no está aun
suficientemente estudiado, y menos aún en el músculo de los peces.
Con respecto a las PMF (figura VI.3.2. y tabla VI.3.12), las fracciones separadas
por SDS-PAGE se han agrupado (de acuerdo con los valores encontrados en la literatura
consultada) de la siguiente forma: cadena pesada de miosina (200 kDa), proteína C (146
kDa), actina (45 kDa), troponina-T (Tn-T, 38 kDa), una banda de 35 kDa y otra banda de
30 kDa. La banda de miosina ha sido la que ha contribuido de forma mayoritaria a la
densidad óptica total de cada carril, con más del 30 %, seguida de las bandas actina y
troponina-T, con algo menos del 30 % cada una.
En el músculo de lubina se han descrito 8 bandas principales dentro de esta
fracción proteica (Chéret et al., 2006), dos más de las observadas por nosotros en
corvina: α-actinina (100 kD) y desmina (55 kD). También Michalczyk y Surowka (2007)
identificaron en trucha arcoíris, además de las observadas en nuestro experimento,
232
Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801).
Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad.
otras fracciones con masas moleculares de 180 kDa (proteína M); 102 y 107 kDa (actinina); 39,5 kDa (-tropomiosina); 35.6 kDa (-tropomiosina); y una serie de bandas
desde 35 a 17.6 kDa que identificaron con la cadena ligera de miosina. Las dos bandas
ausentes en nuestros geles, α-actinina (100 kD) y desmina (55 kD), se han encontrado en
dorada (Suárez et al., 2009a, 2010) y en dentón (Suárez et al., 2009b).
A diferencia de lo observado para las PSP, la frecuencia de alimentación semanal
sí ha tenido una influencia importante sobre el perfil electroforético de esta fracción
proteica, que podría ser responsable de los menores cambios observados en las
propiedades texturales. Así, las corvinas alimentadas 5 días a la semana mostraban
valores inferiores para la banda de 146 kDa con respecto a los encontrados en las
alimentadas 6 y 7 días. También las corvinas 5T exhibieron alteraciones en la proporción
relativa de las bandas de miosina y de actina cuando se comparan con los demás
tratamientos, mientras que las 5M las mostraron en las bandas de 38 (troponina-T) y 35
kDa.
El principal cambio en el patrón electroforético de las PMF durante el
almacenamiento post-mortem fue la aparición de una banda de 30 kDa a las 144 hpm
que coincidió con la disminución significativa de la DOR de la banda de 35 kDa. También
se ha observado una disminución significativa de la banda de miosina en las corvinas 6M
y 5M y de la Proteína C en 6M y un aumento de la misma en 5T y 5M, que podría estar
relacionado con la menor ingesta de alimento aunque estudios realizados en cabritos
mostraron una importante degradación de la proteína C y α-actinina cuando se
sometieron a restricción dietaria (Almeida et al., 2004). Esto se puede relacionar con el
mayor esfuerzo en la consecución de la cantidad de alimento deseado, interpretado
como un factor estresante.
Diversos autores han indicado que tanto la desmina (55 kDa) (Koohmaraie et al.,
1995) como la troponina T (38 kDa) (Huff-Lonergan et al., 1996) son fragmentos
proteicos sensibles a la degradación post-mortem y numerosos estudios han mostrado,
en el músculo de la mayor parte de las especies, la aparición de un péptido de 30 kDa
durante el almacenamiento post-mortem, hasta el punto de haber sido considerado por
muchos autores como índice de proteolisis muscular (Nagaraj et al., 2005) y, por lo
tanto, de ablandamiento de la carne (Olson et al., 1977). En salmón, Geesink et al.,
(2000) también identificaron la aparición de un producto de 31 kDa en el precipitado
obtenido a partir de miofibrillas del músculo durante el almacenamiento en
refrigeración; también Ladrat et al., (2003), observaron la degradación de la troponina T
de la lubina por las catepsinas B y L y que aparecía la banda de 30 kDa. En cambio,
233
Sergio García Mesa
Toyohara et al., (1990) encontraron un producto de la degradación de 38 kDa como
marcador de la textura de la trucha.
En nuestro experimento, a las 24 hpm no se ha podido apreciar la banda de
desmina y a las 144 hpm no se han observado cambios en la troponina T frente a los
valores observados a las 24 hpm, ambas circunstancias podrían ser debidas a la
degradación de estos componentes con anterioridad a la realización de los análisis. Sin
embargo, la aparición del péptido de 30 kDa a los 6 días de almacenamiento indica la
proteólisis de componentes musculares con posterioridad a las 24 hpm.
VI.5. RESUMEN
Frecuencias alimentarias de 5, 6 o 7 días por semana, con una ración semanal
idéntica, parecen tener relativamente poca influencia sobre el crecimiento y la
utilización de la dieta en las corvinas en cultivo. No obstante, el régimen de 6 días
alimentación:1 día de ayuno puede ser considerado más favorable desde el punto de
vista del crecimiento y la composición corporal, además del posible ahorro que
supondría en personal.
La introducción de dos días seguidos de ayuno por semana provoca algún efecto
en el metabolismo hepático de los peces en línea con una respuesta a este ayuno parcial
que, a la larga, puede afectar negativamente al crecimiento, la composición corporal y la
firmeza del músculo de los peces.
Pequeños cambios detectados en el metabolismo del músculo de los peces
alimentados 5 días a la semana por la tarde pueden ser consecuencia de la novedad que
supone el horario para estos peces, que con anterioridad se habían alimentado por la
mañana, y que muestran signos que pueden estar asociados a condición de estrés, lo
que implica peores índices productivos en comparación con los lotes alimentados con la
misma frecuencia pero por la mañana.
Se ha podido describir por primera vez el perfil electroforético de las proteínas
musculares de la corvina, habiéndose encontrado algunas alteraciones en el de las
proteínas miofibrilares que se reflejan en una menor firmeza y alteraciones en las
propiedades de retención de agua precisamente en los peces de los lotes 5T.
234
VII. Conclusiones
1.- Los índices de crecimiento obtenidos, durante las primeras etapas de una prueba
piloto de cría de corvina en jaulas, son claramente inferiores a los reportados por
experiencias anteriores con la misma especie lo que podría atribuirse a diversas
circunstancias como “calidad” de las remesas de juveniles, condiciones ambientales
adversas y/o algún fallo en las prácticas de producción utilizadas. No obstante, el que
nuestros índices estén en línea con los publicados por otros grupos de investigadores,
nos hace pensar que se debe actuar con prudencia a la hora de emprender una
explotación comercial masiva de esta especie y que sería necesaria más investigación
sobre estos asuntos.
2.- La corvina se ha revelado como un pez magro que mantiene un reducido acúmulo de
grasa en su porción comestible (músculo) pese a ser alimentada durante el cultivo con
piensos ricos en grasa. Esto significa una peculiaridad metabólica con respecto a otras
especies que cabria explorar en profundidad. Por otra parte, el perfil de ácidos grasos de
los lípidos musculares de la corvina sufre cambios importantes a lo largo del ciclo de
cultivo tendiendo a concluir con el de las grasas del pienso que recibe; pese a ello, se
mantienen unos índices de calidad lipídica satisfactorios.
3.- La actividad digestiva de la corvina presenta unas relativamente altas actividades
proteásica y amilásica, superiores a la lipásica, aunque, sorprendentemente, la proteasa
intestinal muestra valores inferiores a los otras especies cultivadas. Pese a ello, podemos
deducir que esta especie tiene una buena capacidad para digerir sobre todo los
componentes proteicos e hidrocarbonados de la dieta, conocimento que puede resultar
útil para el diseño de futuros piensos específicos.
4.- En base a los índices de crecimiento y utilización del alimento obtenidos, una ración
diaria de 1.1% del peso corporal se ha mostrado más favorable que una inferior (0.6%) o
superior (1.6%) en corvinas durante las etapas iniciales de engorde.
5.- A partir del análisis de las actividades enzimáticas metabólicas correspondientes, se
detecta un efecto del volumen de la ingesta diaria de alimento sobre el uso preferencial
de ciertos sustratos energéticos; carbohidratos para la ración más reducida y proteínas
para la más elevada, lo que supone, en este último caso, un menor uso de este nutriente
con fines plásticos y, por lo tanto hace desaconsejable el uso de raciones muy altas salvo
en casos de una extrema necesidad de conseguir crecimientos máximos.
6.- Situaciones como la restricción del tamaño de la ración o el cambio en los horarios
habituales de alimentación suponen una mayor dependencia del músculo de estos peces
con respecto a la ruta metabólica anaeróbica, probablemente debido a que ambas
235
Sergio García Mesa
situaciones entrañan una mayor frecuencia de episodios de natación intensa y
repentina.
7.- Durante el ayuno prolongado la corvina pierde peso en menor proporción que otras
especies próximas lo que parece conformar la posesión de ciertas peculiaridades
metabólicas. La realimentación posterior induce un episodio de crecimiento
compensatorio que, en nuestro caso, se debe achacar a un mejor uso del alimento ya
que se basó en una ración prefijada lo que descarta el posible papel de una hiperfagia
compensadora.
8.- En cualquier caso, el ayuno provoca una clara movilización de proteínas y lípidos al
mismo tiempo que se mantienen las rutas gluconeogénicas. La realimentación posterior
supone la rápida recuperación de las reservas citadas y un retorno de la actividad de los
enzimas implicados en el metabolismo intermediario a los valores previos, algo más
lenta en el músculo que en el hígado.
9.- Tanto la restricción alimentaria parcial (ración subóptima) como total (ayuno) afectan
al balance del proceso ataque prooxidante/defensa antioxidante aunque de forma
diferente. El ataque prooxidante en individuos que reducen parcialmente el aporte de
alimento es neutralizado por una activación general de las defensas antioxidantes. En
cambio, durante el ayuno total y aunque el descenso de la tasa metabólica global podría
significar una menor generación de radicales libres, la situación de precariedad
energética extrema provoca un debilitamiento generalizado de las citadas defensas por
lo que, en este caso, sí que se genera daño oxidativo.
La realimentación revierte rápidamente dicha situación, desapareciendo los indicios de
dicho daño.
10.- Si los peces reciben una ración semanal total predeterminada, el que ésta se
distribuya en 5, 6 ó 7 días, parece tener poco efecto, si bien, los ligeramente mejores
índices de crecimiento y utilización del alimento obtenidos cuando se incluye un día de
ayuno a la semana, unidos a la reducción de costes y mejora de la calidad del medio que
dicha maniobra presumiblemente entraña, la podrían hacer aconsejable en
piscifactorías.
11.- Cuando la frecuencia alimentaria se basó en la introducción de 2 días de ayuno a la
semana, se detectaron algunos efectos sobre la composición corporal y las propiedades
texturales de los peces, lo que puede afectar negativamente a su aceptación por los
consumidores.
236
VIII. BIBLIOGRAFÍA.
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269
X. Anexo metodología.
IX. ANEXO METODOLOGÍA. ..................................................................................... 1
IX.1. ÍNDICES BIOMÉTRICOS, DE CRECIMIENTO Y DE UTILIZACIÓN DE LA DIETA ........ 2
IX.1.1. Índices biométricos ........................................................................................................ 2
IX.1.2. Índices de crecimiento y utilización de la dieta. ............................................................ 4
IX.2. ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PECES Y PIENSOS ................... 6
IX.2.1. Composición bioquímica elemental. ............................................................................. 6
IX.2.2. Determinación del contenido en lípidos y perfil de ácidos grasos en piensos y peces. 7
IX.2.3. Determinación del perfil de aminoácidos en muestras de piensos. .............................. 9
IX.3. DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS SANGUÍNEOS ......................................... 10
IX.3.1. Hemograma (constantes eritrocitarias) ....................................................................... 10
IX.3.2. Bioquímica sanguínea .................................................................................................. 11
IX.4. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS DIGESTIVAS ........................ 12
IX.4.2. Determinación de la actividad tripsina. ....................................................................... 15
IX.4.3. Determinación de la actividad quimotripsina.............................................................. 15
IX.4.4. Determinación de la actividad α-amilasa. ................................................................... 16
IX.4.5. Determinación de la actividad lipasa. .......................................................................... 17
IX.4.6. Determinación de la proteína soluble. ........................................................................ 17
IX.5. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS EN HÍGADO Y MÚSCULO. ... 18
IX.5.1. Determinación de las actividades de enzimas del metabolismo intermediario. ......... 19
IX.5.2. Determinación de parámetros y enzimas indicadoras del estrés oxidativo ................ 28
IX.5.3. Determinación de glucógeno tisular ............................................................................ 34
IX.6. DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS DE CALIDAD DEL MÚSCULO. ................... 36
IX.6.1. Determinación de la firmeza. ...................................................................................... 36
IX.6.2. Determinación del pH. ................................................................................................. 36
IX.6.3. Determinación de la capacidad de retención de agua (CRA) ...................................... 37
IX.6.4. Extracción de proteínas sarcoplasmáticas y iofibrilares. ............................................. 37
IX.6.6. Determinación del contenido de aminoácidos. ........................................................... 39
IX.7.6. Técnica de electroforesis SDS-PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecil sulfato de sodio) ....................................................................................................................... 39
IX.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO .................................................................................. 40
1|Anexo Metodología
IX.1. ÍNDICES BIOMÉTRICOS, DE CRECIMIENTO Y
DE UTILIZACIÓN DE LA DIETA
Para su determinación es preciso, en unos casos, sedar a los animales y, en otros,
proceder a su sacrificio. Para ello se siguió el protocolo indicado en la directiva 2010/63/EU del
European Council, tras lo cual se hicieron, en cada caso, medidas de longitud y peso de distintas
secciones corporales. En el caso de los muestreos a pie de jaula (experimento II.1.) los animales
se sacrificaron por choque térmico, sumergiéndolos en agua con hielo.
IX.1.1. Índices biométricos
Para la determinación de los índices biométricos individuales se usaron ictiómetros, con
aproximación a 1 mm, y balanzas, con aproximación a 0.01 g. Las medidas de las diferentes
zonas corporales de interés se hicieron según la figura IX.1.1.
LONGITUD ÁGIL
ALTURA
MÁXIMA
CABEZA
LONGITUD ESTÁNDAR
LONGITUD TOTAL
Figura IX.1.1. Esquema de las medidas de longitud determinadas en la corvina
A partir de las medidas indicadas y del peso de los animales se determinaron:
Índice de Condición (K)
Se calcula como la relación entre el peso y la longitud de los animales
2|Anexo Metodología
Perfil Relativo (PR)
Relaciona la altura máxima y la longitud total
Índice de Agilidad (IA)
Expresa la relación entre longitud, descartadas cabeza y cola, y la altura.
siendo la longitud ágil, la distancia entre en plano de la altura máxima y el pedúnculo de
la aleta caudal.
Índice Cefálico (IC)
Relaciona la longitud de la cabeza con la longitud total del pez
En algunos peces, tras su sacrificio y disección, se pesaron distintas fracciones
corporales, cabeza, paquete visceral, hígado, tracto digestivo y el filete del lado derecho,
eliminando previamente la piel. Con estos datos se determinaron los índices:
Índice Cráneo-Somático (ICS)
Indica la relación porcentual existente entre el peso de la cabeza y el peso corporal.
Índice Víscero-Somático (IVS)
Indica la relación porcentual existente entre el peso del paquete visceral y el peso
corporal, entendiéndose como paquete visceral el conjunto de tracto digestivo, hígado, vejiga
natatoria y bazo.
Índice Hepato-Somático (IHS)
Indica la relación porcentual existente entre el peso del hígado y el peso corporal.
3|Anexo Metodología
Índice Digesto-Somático (IDS)
Indica el porcentaje existente entre el peso del tracto digestivo y el peso corporal
Rendimiento del Filete (RF)
Expresa el porcentaje que significa el peso del filete lateral en el peso total del pez. Es
una estimación indirecta de la fracción comestible del animal.
Puesto que en nuestras determinaciones sólo hemos pesado el filete lateral derecho,
para obtener el porcentaje de fracción comestible multiplicamos por 2.
IX.1.2. Índices de crecimiento y utilización de la dieta.
Estos índices se calculan con los datos de crecimiento y composición de un número
amplio de animales de cada lote experimental, por lo que son considerados representativos del
lote en cuestión y se relacionan, cuando es preciso, con la cantidad de pienso ingerida por la
totalidad del lote pues es imposible determinar la ingesta de cada pez individual.
Ganancia Absoluta de Peso (GAP)
La ganancia de peso se calcula como la diferencia entre el peso final y el peso inicial del
lote o del individuo.
Incremento Relativo de Peso (IRP)
Se calculó como el porcentaje que la ganancia de peso representa del peso inicial.
Tasa de Crecimiento Específico (TCE, en inglés SGR)
Refleja el porcentaje de crecimiento diario de los animales y se calcula a partir de los
pesos inicial y final de los peces y la duración (días) del experimento
4|Anexo Metodología
Coeficiente de crecimiento térmico (CCT)
Estima el crecimiento de los peces según el perfil térmico.
Donde Pf es el peso final, Pi es el peso inicial y
es la suma de la temperatura
media diaria, dentro del período considerado, restada en 10 ⁰C, ya que a temperaturas por
debajo de 10⁰C el animal no crece, si no que se mantiene, según Cho (1992).
Tasa de Conversión de Alimento (TCA, en inglés FCR)
Es un índice de conversión del alimento ingerido en biomasa. Se calcula por el cociente
entre el alimento ingerido y la ganancia absoluta de peso
Tasa de Eficiencia Alimentaria (TEA, en inglés FER)
Evalúa la eficiencia de la dieta para promover el crecimiento de los animales. Se calcula
por el cociente entre la ganancia absoluta de peso y el alimento ingerido, por lo que equivale a la
inversa del índice anterior
Coeficiente de Eficiencia Proteica (CEP, en inglés PER)
Es un índice de aprovechamiento de la proteína para crecimiento que se calcula a partir
de los valores de ganancia de peso y de proteína ingerida durante el periodo experimental.
Valor Productivo de la Proteína (VPP)
Es un índice del aprovechamiento proteico pues relaciona porcentualmente la ganancia
de proteína corporal o proteína retenida con la proteína ingerida.
5|Anexo Metodología
IX.2. ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA
DE PECES Y PIENSOS
IX.2.1. Composición bioquímica elemental.
Los métodos que se describe en este apartado se aplicaron a muestras de piensos, peces
enteros o fracciones corporales de los mismos, previamente almacenados en frío. En esencia,
estos análisis se realizaron de acuerdo con los métodos establecidos por la AOAC (2006).
Humedad
El contenido de agua de una muestra se determina a partir de la diferencia de peso de la
misma antes y después de su desecación en la estufa a 105 °C, hasta peso constante.
Tras esta desecación, algunas muestras fueron trituradas con un molino mecánico para
obtener una harina homogénea, que se almacenó en botes herméticamente cerrados, hasta la
realización de análisis adicionales correspondientes.
Cenizas
Por incineración de la muestras en horno-mufla (Heraeus) a 500 °C, 12 horas, que
provoca la desaparición de la materia orgánica, quedando como remanente las cenizas.
Proteínas
El análisis del contenido proteico se realiza por el método Kjeldahl, mediante la digestión
ácida de la muestra con ácido sulfúrico al 96%, utilizando como catalizador una mezcla de sulfato
potásico, sulfato cúprico y selenio (100:6:1), en un digestor NitroKjel Dra. Una vez enfriada la
muestra, se lleva a un matraz de 100 mL enrasando con agua destilada. Tras la destilación de un
volumen de muestra junto con NaOH al 40%, el amoniaco formado se recoge en un matraz que
contiene 10 mL de indicador Büchi. Finalmente el destilado se valora con ácido clorhídrico
0.01N. Como factor de conversión del nitrógeno a proteína se emplea 6.25.
Grasas
La grasa contenida en la muestra se determina gravimétricamente por el método
Soxhlet, mediante un aparato (BUCHI 810) de extracción continua con éter dietílico. Las
muestras se colocan en cartuchos de papel de filtro con SO4Na2 anhidro para facilitar la
desecación de las mismas y se someten a ciclos de extracción continua de la fracción lipídica.
6|Anexo Metodología
MELN (Material Extractivo Libre de Nitrógeno)
El cálculo del contenido en MELN (asimilable, en primera instancia al de hidratos de
carbono) se basó en la diferencia entre 100 y la suma de los valores correspondientes de
proteínas, lípidos y cenizas, según la siguiente expresión:
IX.2.2. Determinación del contenido en lípidos y perfil de ácidos
grasos en piensos y peces.
Determinación de lípidos totales
Fundamento
Para la determinación de los lípidos totales se utiliza el método de Folch (1957).
Reactivos

Mezcla extractora, cloroformo:metanol (2:1) (v/v)

Solución de HCl 0.1N

Solución de MgCl2 0.5%
Procedimiento
A unos 150 mg de harina obtenida por trituración del pienso y/o los peces previamente
desecados, se añaden 3 mL de una mezcla extractora cloroformo:metanol 2:1 (v/v).
Posteriormente se añaden 3 mL de HCl 0.1 N y 0.3 mL de MgCl 2 0.5 % para que se produzca la
precipitación de las proteínas.
Después de agitar y centrifugar (2000 xg, 5 min) se separa el extracto lipídico usando una
pipeta Pasteur. Sobre el residuo obtenido, se realiza una segunda extracción, reuniendo la fase
orgánica resultante con la obtenida anteriormente en un tubo previamente tarado que se lleva a
una estufa (2 días, 45 °C) para evaporar el disolvente. Tras enfriamiento, se vuelve a pesar el
tubo, obteniendo por diferencia el peso de los lípidos totales contenidos en la muestra seca.
Determinación del perfil de ácidos grasos
Fundamento
Los ácidos grasos se metilan usando el método de Rodríguez-Ruiz et al., (1998) y,
posteriormente, se separan e identifican en un cromatógrafo de gases. Para la identificación de
picos se utiliza un estándar comercial (Sigma, Aldrich).
Reactivos


N-hexano
Mezcla metilante: metanol:cloruro de acetilo 20:1(v:v)
7|Anexo Metodología

Ácido heptadecanoico (C17:0)10 mg/mL
Procedimiento
Para la determinación del contenido en ácidos grasos de músculo del pez y del pienso, se
parte de liofilizados de los mismos. En tubos de ensayo con tapón de rosca se pesan
aproximadamente 20 mg de muestra a los que se añade 1 mL de n-hexano tapándolos
inmediatamente para evitar la evaporación de éste. A continuación se añaden a cada tubo 100
L de una disolución de patrón interno (ácido heptadecanoico, C17:0).
Seguidamente, se adiciona a cada tubo 1 mL de mezcla metilante, volviendo a tapar los
tubos, que se colocaron en un thermoblock a 100 °C durante 30 minutos. El papel de la mezcla
metilante en las condiciones de reacción anteriores consiste en fragmentar los triglicéridos en
glicerol y ésteres metílicos de los ácidos grasos (FAMEs). Estos FAMEs son los que
posteriormente serán identificados y cuantificados por cromatografía gas-líquido (GLC).
Una vez concluida la metilación, y tras dejar enfriar los tubos a temperatura ambiente,
se añade 1 mL de agua destilada con el objetivo de limpiar la fase hexánica y arrastrar las
posibles impurezas. Posteriormente, se procede a centrifugar los tubos (9000 rpm, 5 min) para
eliminar impurezas de tipo físico, se extrae la fase hexánica que contiene los FAMEs de las
muestras y del patrón interno y se introducen y concervan en viales numerados para su análisis
cromatográfico posterior. Se realizan tres extracciones adicionales con hexano para asegurar el
completo arrastre de los FAMEs.
Análisis cromatográfico
El equipo utilizado fue un cromatógrafo de gases HP modelo 5890 serie II (Hewlett
Packard, Palo Alto, CA, USA) equipado con un autoinyector (modelo HP 6890) y un detector de
ionización de llama (FID). La separación de los FAMEs se lleva a cabo en una columna capilar
Omegawax 250 (30 m x 0.25 mm d.i. x 0.25 μm de grosor de película (Supelco, Bellefonte, PA,
USA). La temperatura inicial del inyector es de 250 °C y se aplica una rampa de 6 °C /min hasta
240 °C (9 min), calentando un período total de 25 min. Se emplea una relación de split 50:1 y
nitrógeno (flujo de 1 mL/min) como gas portador. Usando una mezcla estándar de ácidos grasos
(Sigma, Aldrich) se determina el tipo de FAME, comparando con el tiempo de retención del
estándar. Los valores de ácidos grasos se expresan como % de los lípidos totales.
Índices de calidad lipídica
A partir de los datos de composición en ácidos grasos se calculan (Senso et al., 2007):
Índice aterogénico (IA): estudia la relación que existe entre la suma de los principales
ácidos grasos saturados (14:0 y 16:0) y la suma de los principales PUFAs n-3 (EPA y DHA), siendo
los primeros considerados pro-aterogénicos (favorecen la adhesión de los lípidos a células de los
sistemas inmunológico y circulatorio) y los segundos anti-aterogénicos (inhiben la agregación
plaquetaria y disminuyen los niveles de ácidos grasos esterificados, colesterol y fosfolípidos, lo
que previene la aparición de enfermedades micro y macrocoronarias).
8|Anexo Metodología
Índice de trombogenicidad (IT): de alguna forma predice la tendencia que existe a la
formación de coágulos de sangre en los vasos sanguíneos. Se define como la relación que existe
entre
los ácidos grasos considerados “pro-trombogénicos” (saturados) y los “antitrombogénicos” (MUFAs, PUFAs n-6 y PUFAs n-3).
Calidad de los lípidos del pescado (CLP): es la relación en la que los principales PUFAs n3 (EPA y DHA) aparecen en el músculo respecto a la totalidad de los lípidos. Cuanto mayor sea el
valor de este índice, mayor es la calidad de la fuente lipídica de la dieta.
IX.2.3. Determinación del aminograma en muestras de piensos.
Fundamento
El contenido en aminoácidos se determinó mediante el método de AccQ-Tag, que se
basa en el uso de un reactivo de derivatización desarrollado específicamente para el análisis de
aminoácidos, el reactivo AccQ-Fluor de la firma comercial Waters. Se usa ácido γ-aminobutírico
como patrón interno.
Reactivos



Ácido clorhídrico 6N
Ácido γ-aminobutírico 2.5 mM
Kit AccQ-Fluor, constituido por 6-Aminoquinolil-N-Hidroxisuccinimidil carbamato (AQC)
diluido en acetonitrilo y disolución tampón borato sódico 0.2 mM, pH 8.8
Procedimiento
Se hidrolizan las muestras (50 mg) con 10 mL de HCl 6 N en atmósfera libre de oxígeno
(usando nitrógeno gaseoso) en estufa a 112 °C durante un período de 22 horas. Tras la digestión
ácida, se incorporan 5 mL de ácido α-aminobutírico 2.5 mM, y se lleva a un volumen de 50 mL
con HCl 25 mM; la mezcla se filtra, con ayuda de vacío, por un tamaño de poro de 0.45 mm. De
la mezcla se toman 2 alícuotas de 100 μL que son liofilizadas hasta su análisis.
El análisis se inicia con la reacción de derivatización de las muestras, añadiendo 20 μL de
la solución AQC a 20μL de la mezcla prederivatización previamente mezclados con 60 μL de la
disolución tampón de borato sódico. Así, los aminoácidos forman un compuesto altamente
estable y fluorescente a 345 nm.
El equipo de cromatografía líquida utilizado fue un sistema Waters mod. 2695 (Milford,
MA, USA) constituido por: horno de columna termostatizado, bomba Waters 600, inyector
automático Waters 717, detector de fluorescencia (Waters 474) y detector de diodos (Waters
9|Anexo Metodología
996). La columna es Luna Cl8 250 x 4.6 mm. La detección se llevó a cabo por fluorescencia (λ de
excitación: 250 nm y λ de emisión: 345 nm).
La identificación y cuantificación de los aminoácidos se realiza por comparación con los
tiempos de retención del estándar AA 18 de Sigma-Aldrich.
IX.3. DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS SANGUÍNEOS
La sangre se extrajo de la vena caudal de peces, previamente sedados, con jeringas
heparinizadas y se conservó en condiciones de frío en tubos heparinizados. Tras separar las
alícuotas correspondientes para determinación de hematocrito, recuento eritrocitario y
contenido en hemoglobina, se procede, en el resto de la muestra, a la separación del plasma de
los glóbulos rojos mediante centrifugación (2500 rpm, 10 min). El plasma sobrenadante se
separa y se almacena a -20 °C hasta posterior análisis.
IX.3.1. Hemograma (constantes eritrocitarias)
Hematocrito
El índice hematocrito, que expresa el procentaje que el volumen de glóbulos rojos
significa del total de sangre, se determina por centrifugación de la sangre en microcapilares (
3000 rpm, 10 min). Posteriormente, se miden las longitudes de la banda de glóbulos rojos
separada de la fracción plasmática y la del total de la sangre en el capilar y se calcula la relación
porcentual entre ellas.
Hemoglobina
Para la determinación de la concentración de hemoglobina se emplea un kit comercial
basado en el método colorimétrico de la cianmetahemoglobina utilizando el reactivo de Drabkin.
La hemoglobina, en presencia de ferrocianuro, se oxida a metahemoglobina que, a su vez,
reacciona con iones de cianuro a pH 7.2 para dar cianmetahemoglobina (Drabkin y Austin, 1935).
La absorbancia de la muestra, proporcional al contenido en hemoglobina de la misma, se mide a
540 nm y los resultados se expresan en g/dL.
Recuento de eritrocitos
Para realizar el recuento de glóbulos rojos se realiza previamente una dilución de la
muestra de sangre con solución isotónica de Hendrick (1:200). La muestra diluida se situa en una
cámara de recuento de Neubauer al microscopio, contabilizando el número de glóbulos rojos
por unidad de superficie de la misma.
10 | A n e x o M e t o d o l o g í a
Donde A es el número de células contadas, v el volumen de sangre diluida situada sobre
cadal cuadrado de la cámara de recuento (2.5·10-4 mm3), n el número de cuadros contados y f el
factor de dilución.
Índices hematológicos
A partir de las anteriores constantes eritrocitarias se calcularon:
Volumen Corpuscular Medio (VCM): indica el volumen promedio de un glóbulo rojo.
Hemoglobina Corpuscular Media (HCM): expresa el contenido de hemoglobina que, por
término medio, hay en cada eritrocito.
Concentración de Hemoglobina Corpuscular Media (CHCM): indica la fracción del
volumen eritrocitario ocupado por la hemoglobina.
IX.3.2. Bioquímica sanguínea (plasma)
Glucosa
La determinación de la glucosa se lleva a cabo usando un kit comercial de diagnóstico
(Labkit, 30236) basado en el método enzimático colorimétrico GOD-POD (Trinder, 1969). Este
método utiliza las reacciones acopladas de la hexoquinasa y glucosa-6-fosfato deshidrogensa. La
abosorbancia de la muestra se midió a 505 nm frente a blanco de reactivo. Se usa una solución
patrón de concentración conocida y los resultados se expresan en mg/100 mL.
Lípidos totales
La determinación de los lípidos totales se realiza utilizando un kit comercial (Labkit,
30345), basado en el método colorimétrico de la sulfafosfovainillina (Cottet y Etienne, 1965) y
compuesto por dos reactivos, H2SO4 y fosfovainillina, y una solución estándar de concentración
lipídica conocida.
Los lípidos insaturados de la muestra forman iones carbonio al reaccionar con el ácido
sulfúrico a alta temperatura. Éstos producen, en presencia de la fosfovainillina, una coloración
11 | A n e x o M e t o d o l o g í a
rosada cuya intensidad es proporcional a la concentración de lípidos presentes en la muestra,
valorada a 520 nm frente a blanco de reactivo. Los resultados se expresan en mg/100 mL.
Triglicéridos
Se utiliza un kit comercial para diagnóstico (Labkit, 30360), siguiendo un método
enzimático colorimétrico GOD-POD (Buccolo y David, 1973), Los triglicéridos de la muestra, al ser
tratados con una lipasa, liberan glicerol y ácidos grasos. El glicerol por una serie de reacciones
libera H2O2, el cual, a través de la acción de una peroxidasa, genera 4-aminofenazona y pclorofenol que producen una coloración rojiza cuya intensidad de color es proporcional a la
concentración de triglicéridos presentes en la muestra. La absorbancia de la muestra se mide a
505 nm frente a blanco de reactivo. Los resultados se expresan en mg/100 mL.
Colesterol total
Se utiliza un kit comercial de diagnóstico (Labkit, 30184) basado en el método
enzimático-colorimétrico CHOD-POD (Meiattini et al., 1978). La enzima colesterol esterasa
escinde los ésteres de colesterol en ácidos grasos y colesterol. Éste último es transformado por
la colesterol oxidasa en 4-colestenona y H2O2. El H2O2 junto con fenol y 4-aminofenazona, por
acción de la peroxidasa, produce una coloración proporcional a la concentración de colesterol
total en la muestra. La absorbancia de la muestra se mide a 505 nm frente a blanco de reactivo.
Los resultados se expresan en mg/100 mL.
IX.4. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE
ENZIMAS DIGESTIVAS
Tras el sacrificio, los peces se diseccionaron rápidamente para extraer el digestivo
completo que, seguidamente, se sumergió en nitrógeno líquido. Las muestras se conservaron a
-80°C hasta su posterior procesado y análisis.
El tubo digestivo es dividido en 4 partes: estómago (E), ciegos pilóricos (CP), intestino
anterior (IA) e intestino posterior (IP) (Figura IX.4.1.), midiéndose las actividades enzimáticas en
cada una de ellas, para lo cual se homogeneizan por separado con un homogeneizador eléctrico
“Polytron” modelo PT 2100, usando agua fría purificada en proporción 1:4 (p:v), evitando
siempre que se rompa la cadena de frío.
Los homogeneizados se centrifugan (16000 rpm, 30 min, 4 °C) en una centrífuga
“SIGMA” modelo 3K30. Tras la centrifugación se recoge el sobrenadante que se congela a -80°C
hasta el posterior análisis de las actividades enzimáticas.
12 | A n e x o M e t o d o l o g í a
Intestino
Anterior
Intestino
Posterior
Estómago
Ciegos
Pilóricos
Figura IX.4.1. Anatomía del tubo digestivo de la corvina
IX.4.1. Determinación de la actividad proteasa.
Determinación de las actividades de las proteasas alcalinas.
Fundamento
La actividad proteolítica alcalina se estimó siguiendo el método de la hidrólisis de la
caseína de Kunitz (1947), modificado por Walter (1984). La caseína se transforma en péptidos y
aminoácidos libres por la acción de las proteasas de la muestra. Los péptidos resultantes se
miden en estado soluble, tras su separación del sustrato proteico, llevada a cabo por el ácido
tricloroacético que, previamente, ha paralizado la reacción por precipitación de las proteínas.
Reactivos



Tampón universal madre Stauffer (Stauffer, 1989): ácido bórico 57 mM, ácido cítrico
monohidratado 33mM, NaH2PO4 33mM y NaOH 31mM
Ácido tricloroacético (TCA) 20% (p/v)
Solución de caseína al 1%. Se debe llevar la solución a pH básico con NaOH para su
completa disolución y, posteriormente, se ajusta el pH con HCl
Procedimiento
El tampón de trabajo Stauffer se obtiene a partir de 20 mL de tampón universal madre
Stauffer, ajustado el pH con HCl y llevándolo a un volumen final de 100 mL. El rango de pHs
ensayados fue desde 2 a 12.
Caseína (μL)
Tampón (μL)
TCA (μL)
Extracto (μL)
Control
500
500
500
20
Test
500
500
500
20
13 | A n e x o M e t o d o l o g í a
Para el análisis de cada muestra se hacen controles por duplicado, que actuarán como
blancos de la reacción problema (test), estos últimos determinados por triplicado.
La mezcla de caseína, tampón y extracto se incuba durante 20 minutos a 37 °C. En los
controles, el extracto se añade al final de la incubación, justo antes de añadir el TCA. Con la
adición del TCA, parada de la reacción, tanto test como controles, se mantienen 30 minutos a
4 °C para favorecer la precipitación de la caseína no hidrolizada. Las muestras se centrifugan
(10000 rpm, 15 min, 4°C), se toman 200 μL y se mide la absorbancia a 280 nm.
Determinación de la actividad proteasa ácida.
Fundamento
Se determina según la metodología de Anson (1938), que mide la proteólisis ácida de la
hemoglobina. Por acción de la proteasas, la hemoglobina se hidroliza en péptidos y aminoácidos,
siendo la fracción no hidrolizada precipìtada por acción del TCA y midiéndose la fracción soluble.
Reactivos



Tampón universal madre Stauffer (Stauffer, 1989): ácido bórico 57mM, ácido cítrico
monohidratado 33mM, NaH2PO4 33mM y NaOH 31mM
Ácido tricloroacético (TCA) al 20% (p/v)
Solución de hemoglobina al 0.5% (p/v)
Procedimiento
Hemoglobina (μL)
Tampón (μL)
TCA (μL)
Extracto (μL)
Control
500
500
500
20
Test
500
500
500
20
Los controles se hacen por duplicado y los tests por triplicado, siguiendo el mismo
procedimiento anteriormente descrito.
CÁLCULOS
Se define una Unidad de Actividad Proteolítica (U) como la actividad de enzima que
libera 1 mM de tirosina por minuto y por miligramo de proteína, calculándose de acuerdo a la
siguiente fórmula:
14 | A n e x o M e t o d o l o g í a
Siendo:
∆D.O.: D.O. test – D.O. control
V: volumen total en mL
T: tiempo de incubación, 20 min
v: volumen de extracto en mL
P: mg proteína por mL
ε280: coeficiente de extinción molar de la tirosina a 280 nm (0.008 /cm M)
IX.4.2. Determinación de la actividad tripsina.
Fundamento
El análisis de la actividad tripsina se realiza según el procedimiento descrito por Erlanger
et al., (1961) con algunas modificaciones de Faulk et al. (2007). Este método está basado en el
registro de la producción de p-nitroanilina, un producto de la acción de la tripsina de la muestra
sobre el sustrato BAPNA.
N-benzoil-DL-arginina 4-nitroanilida
Tripsina
4-nitroanilina
Reactivos



Tampón Tris-HCl 50 mM pH 8.2
CaCl2 20 mM
N-benzoil-DL-arginina 4-nitroanilida (BAPNA) 1 mM (sustrato)
Procedimiento
A 20 μL de muestra se añaden 100 μL del tampón y el sustrato (BAPNA). Se determina la
producción de 4-nitroanilina monitorizada como variación de densidad óptica a 410 nm, cada 30
segundos, durante 30 minutos, a 30 °C.
IX.4.3. Determinación de la actividad quimotripsina.
Fundamento
La actividad quimotripsina se determina según el método descrito por Hummel (1959)
modificado por Applebaum y Holt (2003). Este método está basado en la monitorización de la
hidrólisis del N-benzoil-L-tirosina etil éter (BTEE) con producción de tirosina.
N-benzoil-L-tirosina etil éter
Quimotripsina
p-tirosina
15 | A n e x o M e t o d o l o g í a
Reactivos



Tampón Tris-HCl 0.1 M pH 7.8
CaCl2 25 mM
N-benzoil-L-tirosina etil éter (BTEE) 0.566 mM (sustrato)
Procedimiento
A 20 μL de muestra se añaden 140 μL del tampón de reacción mezclado con el sustrato.
Se determina la producción de p-tirosina como variación de absorbancia a 256 nm, cada 20
segundos, durante 20 minutos, a 37 °C.
IX.4.4. Determinación de la actividad α-amilasa.
Fundamento
Se utiliza un kit comercial de diagnóstico (Labkit, 30140) basado en el método
enzimático-cinético CNPG3 (Ying et al., 1998). La enzima α-amilasa hidroliza el 2-cloro-4nitrofenil-α-D-maltotriosido (CNPG3) a 2-cloro-4-nitrofenol (CNP) y forma 2-cloro-4nitrofenil-a-Dmaltosido (CNPG2), maltotriosa (G3) y glucosa (G). La velocidad de formación de CNP,
determinado fotométricamente, es proporcional a la concentración catalítica de α-amilasa en la
muestra.
10 CNPG3
α-amilasa
9 CNP + CNPG2 + G3 + G
Reactivos





Ácido 2-(N morfolino)etanosulfónico pH 6.0
NaCl 350 mM
Acetato cálcico 6mM
Tiocianato potásico 900 mM
CNPG3 2.25 mM (sustrato)
Procedimiento
Según pruebas preliminares, a 30 μL de homogenizados de estómago y 20 μL de los de
de ciegos pilóricos, intestino anterior y posterior, se añaden 200 μL de solución reactiva. Se
determina la producción de CNP como variación de densidad óptica a 405 nm, durante 3
minutos, cada 12 segundos, a 37 °C.
16 | A n e x o M e t o d o l o g í a
IX.4.5. Determinación de la actividad lipasa.
Fundamento
La actividad lipásica se determina según el método desarrollado por Gjellesvik et al.,
(1992), modificado por Lazo et al. (2000) midiéndose, espectrofotométricamente (400 nm), la
producción de nitrofenil a partir de 4-nitrofenil octanoato
4-nitrofenil octanoato
Lipasa
Nitrofenil + Octanoato
Reactivos




Tampón Tris-HCl 0.5 mM pH 7.4
Taurocolato sódico 6 mM
NaCl 1M
4-nitrofenil octanoato 0.35 mM (sustrato)
Procedimiento
Se colocan 10 µL de homogeneizado en el pocillo y se inicia la reacción con la adición de
200 µL de mezcla de reacción. Se determina la producción de nitrofenil como variación de
densidad óptica a 400 nm, cada 30 segundos, durante 30 minutos, a 30 °C.
IX.4.6. Determinación de la proteína soluble.
Fundamento
Para poder expresar la actividad de los enzimas por miligramo de proteína presente en la
muestra, se determina la concentración de proteínas solubles de la misma según la técnica de
Bradford (1976), basada en la unión directa del colorante azul de Coomassie a la estructura
terciaria de las proteínas.
Reactivos


Reactivo de Bradford comercial (kit Bio-Rad)
Solución patrón de albúmina bovina al 0.06%
Procedimiento
Curva patrón:
[albúmina]
µg/mL
0
3
6
12
24
48
Sol. Madre
Agua destilada
Kit Bio-Rad
Vol. Final
0
5
10
20
40
80
800
795
790
780
760
720
200
200
200
200
200
200
1000
1000
1000
1000
1000
1000
17 | A n e x o M e t o d o l o g í a
A 5 μL de extracto diluido de cada muestra se añade la cantidad necesaria de agua
destilada para ajustar el volumen a 800 μL y finalmente se añaden 200 μL de reactivo de
Bradford.
Una vez mezclados todos los componentes por agitación, se dejan reposar 5 minutos y
se determina su densidad óptica a 595 nm, frente a blanco de reactivo.
La concentración de proteína soluble en las muestras se calculó a partir de la curva
patrón, en la que se asocian concentraciones conocidas de albúmina, con la densidad óptica
correspondiente. Los resultados se expresan en mg proteína/mL.
CÁLCULOS DE LAS ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS
La actividad específica (U) de los diferentes enzimas se expresó como la capaz de
transformar un μmol de sustrato por minuto y por miligramo de proteína, calculándose de
acuerdo con la siguiente fórmula:
Siendo:
∆D.O./∆t: decremento de densidad óptica/min
V: volumen total en mL
v: volumen de extracto en mL
d: longitud de paso de luz, para estas microplacas es 0.6 cm
10-6: factor de conversión a μM
103: conversión de litros a mililitros
P: mg proteína/mL
ε 410: coeficiente de extinción molar del 4-nitroanilina a 410 nm (8800/ cm M)
ε 256: coeficiente de extinción molar del BTEE a 256 nm (964/ cm M)
ε 405: coeficiente de extinción molar del CNP a 405 nm (12.83/ cm M)
ε 400: coeficiente de extinción molar del nitrofenil a 400 nm (16300/ cm M)
IX.5. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE
ENZIMAS EN HÍGADO Y MÚSCULO.
Los animales recién sacrificados se diseccionaron rápidamente para extraer el hígado
completo y/o una porción del músculo blanco, del área dorsal anterior izquierda, que se
sumergieron en nitrógeno líquido. Las muestras se conservaron a -80°C hasta posterior
procesado y análisis.
En el momento oportuno, las muestras de hígado y músculo se homogeneizan en un
homogeneizador eléctrico “Polytron” modelo PT 2100, siempre evitando que se rompa la
18 | A n e x o M e t o d o l o g í a
cadena de frío. Para la homogeneización se usa tampón Tris-HCl 100 mM, EDTA 0.1 mM, tritón
X-100 0.1% (detergente que facilita la rotura de las membranas celulares), PMSF (fluoruro de
fenilmetil sulfonilo) 0.5 mM, pH 7.8 en una proporción de 1:9 (p:v).
Posteriormente, los homogeneizados se centrifugan de 16000 rpm durante 30 minutos a
4 °C en una centrífuga “SIGMA” modelo 3K30. Tras la centrifugación se recoge el sobrenadante
que se congela y mantiene a -80°C hasta el posterior análisis de las actividades enzimáticas.
IX.5.1. Determinación de las actividades de enzimas del
metabolismo intermediario.
La determinación de la actividad de todos los enzimas analizados implicados en el
metabolismo intermediario se realizó mediante la lectura de cambios en la absorbancia EN una
determinada “mezcla de reacción”, diferente según el enzima a analizar. Para ello se usó un
espectrofotómetro lector de microplacas PowerWavex de Bio-Tek Instruments Inc. (USA). La
concentración óptima de sustrato así como la dilución más apropiada del extracto de un
determinado tejido, se establecieron con anterioridad mediante una serie de análisis
preliminares. La reacción enzimática se inicia siempre por adición del extracto de la muestra a la
mezcla de reacción correspondiente. Todas las soluciones se elaboran con agua destilada, salvo
en los casos en que se indica algo diferente.
La actividad específica de los diferentes enzimas se considera como la capaz de
transformar un milimol de sustrato por minuto y por miligramo de proteína. La cantidad de
proteína de los extractos se calcula, en todos los casos, como se describe en el apartado IX.4.6
(método de Bradford).
XI.5.1.1. HEXOQUINASA (HK; E.C. 2.7.1.1)
Fundamento
Se determinó la actividad hexoquinasa según el método empleado por Vijayan et al.,
(1990). Este método está basado en el registro espectrofotométrico de la reducción del NADP +
por una reacción acoplada de la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) de la siguiente
forma:
Glucosa
ATP
HK
Glucosa 6- fosfato
ADP
NADP
G6PDH
6-fosfogluconato
NADPH+H
+
Procedimiento
Se mide el incremento de densidad óptica a 340 nm, durante 5 minutos, cada 12
segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es:
19 | A n e x o M e t o d o l o g í a
Concentración
en pocillo (mM)
50
2.5
5
0.4
2 U/mL
10
Reactivo
Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4
ATP 50 mM
MgCl2 100 mM
NADP 8 mM
G6PDH
Glucosa 200 mM (sustrato)
Muestra
Volumen en
pocillo (μL)
140
10
10
10
0.57
10
20
XI.5.1.2. PIRUVATO KINASA (PK; E.C. 2.7.1.40)
Fundamento
La actividad PK se determinó siguiendo el método descrito por Morales et al., (1990),
que se basa en la determinación espectrofotométrica de la oxidación del NADPH en una reacción
acoplada con el enzima lactato deshidrogenasa (LDH).
PK
PEP
ATP
Piruvato
ADP
LDH
NADH + H+
Lactato
NADH
Procedimiento
Se mide la disminución de densidad óptica a 340 nm, durante 5 minutos, cada 15
segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es:
Reactivo
Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4
KCl 2 M
MgCl2 100 mM
NADH 3 mM
ADP 20 mM
LDH
PEP 40 mM (sustrato)
Muestra
Concentración
en pocillo (mM)
50
100
5
0.15
1
2 U/mL
2
Volumen en
pocillo (μL)
140
10
10
10
10
0.15
10
10
IX.5.1.3. FRUCTOSA BISFOSFATASA (FBPasa; E.C. 3.1.3.11)
Fundamento
La determinación de la actividad FBPasa se llevó a cabo siguiendo el método propuesto
por Latzko y Gibbs (1970) algo modificado. Se basa en la determinación del NADP después de
tres reacciones en cadena iniciadas con la actuación de la FBPasa y en las que intervienen
fosfoglucoisomerasa (PGI) y G6PDH.
20 | A n e x o M e t o d o l o g í a
F(1,6)BP
FBPasa
PGI
F6P
G6PD
6PG
HHHH
+
NADP HHHNAPH + H+
G6P
Procedimiento
Se mide el incremento de densidad óptica a 340 nm, durante 4 minutos, cada 12
segundos, a 25 °C en una serie de pocillos cuyo contenido es:
Concentración
en pocillo (mM)
42.84
5
0.5
12
2 U/mL
2 U/mL
Reactivo
Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4
MgCl2 100 mM
NADP 10 mM
β-mercaptoetanol 240 mM
PGI
G6PDH
Agua destilada
F(1,6)BP 5 mM (sustrato)
Muestra
0.5
Volumen en
pocillo (μL)
120
10
10
10
0.57
0.57
20
20
10
IX.5.1.4. LACTATO DESHIDROGENASA (LDH; E.C. 1.1.1.27)
Fundamento
La actividad lactato deshidrogenasa se determinó siguiendo el método de Singer et al.,
(1990) basado en la detección en la variación de densidad óptica debida a la oxidación del
cofactor NADH.
Piruvato
LDH
NADH + H
+
Lactato
+
NAD
Procedimiento
Se mide la disminución de densidad óptica a 340 nm, durante 3 minutos, cada 12
segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es:
Reactivo
Tampón Imidazol 83.3 mM pH 7.4
NADH 3.2 mM
Agua destilada
Piruvato 20 mM (sustrato)
Muestra
Concentración
en pocillo (mM)
50
0.16
1
Volumen en
pocillo (μL)
140
10
30
10
10
21 | A n e x o M e t o d o l o g í a
IX.5.1.5. GLICEROL KINASA (GyK; E.C. 2.7.1.30)
Fundamento
La actividad glicerol quinasa se determinó según el método propuesto por Vijayan et al.,
(1990), en el cual se mide el decremento de densidad óptica debido a la oxidación del NADH de
acuerdo con las siguientes reacciones en las que también intervienen piruvatokinasa (PK) y LDH:
GyK
Glicerol
ATP
Glicerol 3-fosfato
ADP
+
PEP
Procedimiento
PK
Piruvat
o
NADH +
ATP
H
LDH
+
Lactato
+
NAD
Se mide el descenso de densidad óptica a 340 nm, durante 6 minutos, cada 12 segundos,
a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es:
Concentración
en pocillo (mM)
50
0.75
5
5
10
4 U/mL
4 U/mL
2.5
Reactivo
Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4
NADH 15 mM
ATP 100 mM
MgCl2 100 mM
PEP 200 mM
PK
LDH
Glicerol 50 mM (sustrato)
Muestra
Volumen en
pocillo (μL)
140
10
10
10
10
0.80
0.30
10
10
IX.5.1.6. 3-HIDROXIACIL CoA DESHIDROGENASA (HOAD; 1.1.1.35)
Fundamento
La actividad 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa se determinó siguiendo el método de
Singer et al., (1990) en el que se valora, espectrofotométricamente, la tasa de oxidación de
NADH de acuerdo con la siguiente reacción:
AcetoacetilCoA
HOAD
NADH + H
+
3 hidroxiacetilCoA
NAD
+
Procedimiento
Se mide la disminución de densidad óptica a 340 nm, durante 4 minutos, cada 12
segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es:
22 | A n e x o M e t o d o l o g í a
Reactivo
Tampón Imidazol 71.4 mM pH 8
NADH 2 mM
Agua destilada
Acetoacetil CoA 2 mM (sustrato)
Muestra
Concentración
en pocillo (mM)
50
0.1
0.1
Volumen en
pocillo (μL)
140
10
30
10
10
IX.5.1.7. CITRATO SINTASA (CS; E.C. 2.3.1.9)
Fundamento
La actividad citrato sintasa se determinó según el método descrito por Thibault et al.,
(1997), e el que se registra el incremento de densidad óptica a 412 nm producido por la
reducción del DTNB.
CS
AcetilCoA + OAA + H2O
CoA –SH + H+ + Citrato
DTNB + CoA –SH
TNB + CoA –S-S-TNB
Procedimiento
Se mide el decremento de densidad óptica a 412 nm, durante 5 minutos, cada 12
segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es:
Reactivo
Tampón Imidazol 71.4 mM pH 8.0
DTNB 2 mM
Acetil-CoA 4 mM
Agua destilada
OAA 4 mM (sustrato)
Muestra
Concentración
en pocillo (mM)
50
0.1
0.2
0.2
Volumen en
pocillo (μL)
140
10
10
20
10
10
IX.5.1.8. ENZIMA MÁLICO (EM; E.C. 1.1.1.40)
Fundamento
El enzima málico se determinó siguiendo el método propuesto por Singer et al., (1990)
basado en la medida de la variación de densidad óptica producida por la reducción del NADP+ de
acuerdo con la siguiente reacción:
EM
Malato
NADP
+
Piruvato + CO2
NADPH + H
+
23 | A n e x o M e t o d o l o g í a
Procedimiento
Se mide el incremento de densidad óptica a 340 nm, durante 4 minutos cada 12
segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es:
Concentración
en pocillo (mM)
50
5
0.4
Reactivo
Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4
MgCl2 100 mM
NADP 8 mM
Agua destilada
Glicerol 40 mM (sustrato)
Muestra
2
Volumen en
pocillo (μL)
140
10
10
10
10
20
IX.5.1.9. GLUCOSA 6-FOSFATO DESHIDROGENASA (G6PDH; E.C. 1.1.1.49)
Fundamento
La actividad glucosa 6-fosfato deshidrogenasa se determinó siguiendo el método
descrito por Morales et al., (2004), basado en la variación de densidad óptica como
consecuencia de la reducción de NADP+. La actividad enzimática registrada mediante esta
técnica sería la suma de las actividades G6PDH y 6PGDH (6-fosfogluconato deshidrogenasa)
G6PDH
G6P
NADP
+
NAPH + H
6PGDH
6PG
+
NADP
+
NAPH + H
Ribulosa 5-fosfato + CO2
+
Procedimiento
Se mide el incremento de densidad óptica (D.O.) a 340 nm, durante 10 minutos, cada 15
segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es:
Reactivo
Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4
MgCl2 100 mM
*NADP 20 mM
G6P 10 mM (sustrato)
Muestra
Concentración
en pocillo (mM)
50
5
2
1
Volumen en
pocillo (μL)
140
10
20
20
10
*NADP disuelto en HCO3Na 119 mM (en cubeta, 11.9 mM)
24 | A n e x o M e t o d o l o g í a
IX.5.1.10. GLUTAMATO OXALACETATO TRANSAMINASA (GOT; E.C. 2.6.1.1)
Fundamento
La actividad glutamato oxalacetato transaminasa se determinó según el método descrito
por Singer et al., (1990), en el cual se mide la tasa de oxidación del NADH acoplado a las
siguientes reacciones:
GOT
Aspartato
αKG
MDH
Oxalacetato
Glutamato
NADH + H
Malato
+
+
NAD
Procedimiento
Se mide el decremento de densidad óptica a 340 nm, durante 3 minutos, cada 12
segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es:
Concentración
en pocillo (mM)
50
5
0.3
0.05
3 U/mL
Reactivo
Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4
αKG 200 mM
NADH 6 mM
Piridoxal fosfato 1 mM
MDH
Agua destilada
L-aspartato 500 mM (sustrato)
Muestra
Volumen en
pocillo (μL)
140
10
10
10
0.10
10
10
10
25
IX.5.1.11. GLUTAMATO PIRUVATO TRANSAMINASA (GPT; E.C. 2.6.1.2)
Fundamento
La técnica empleada está basada en el método utilizada por Morales et al., (2004),
siguiendo espectrofotométricamente la disminución de la densidad óptica causada por la
desaparición del NADH acoplado a las siguientes reacciones:
GPT
L-alanina
αKG
LDH
Piruvato
Glutamato
NADH + H
+
Lactato
+
NAD
Procedimiento
Se mide el decremento de densidad óptica (D.O.) a 340 nm, durante 3 minutos, cada 12
segundos, a 25 °C temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es:
25 | A n e x o M e t o d o l o g í a
Concentración
en pocillo (mM)
50
10
0.2
0.05
2 U/ml
25
Reactivo
Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4
αKG 200 mM
NADH 4 mM
Piridoxal fosfato 1mM
LDH
L-alanina 250 mM (sustrato)
Muestra
Volumen en
pocillo (μL)
140
10
10
10
0.15
20
10
IX.5.1.12. GLUTAMATO DESHIDROGENASA (GDH; E.C. 1.4.1.2)
Fundamento
La determinación de la actividad glutamato deshidrogenasa está basada en el
seguimiento de la desaparición de NADH valorada por espectrofotometría (Morales et al., 1990).
La reacción catalizada por la enzima es la siguiente:
GDH
+
αKG + NH4
NADH + H
+
Glutamato + H2O
+
NAD
Procedimiento
Se mide la disminución de densidad óptica a 340 nm, durante 3 minutos, cada 6
segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es:
Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4
NADH/ADP 2.9/14.3 mM
Acetato amónico 3.3 M
LDH
αKG 200 mM (sustrato)
Muestra
Concentración
en pocillo (mM)
50
0.2/1
100
2 U/mL
10
Volumen en
pocillo (μL)
140
14
6
0.15
10
30
IX.5.1.13. ACETOACETIL CoA TIOLASA (ACoAT; E.C. 2.3.1.9)
Fundamento
La determinación de la actividad acetoacetil CoA tiolasa se llevó a cabo siguiendo el
método descrito por Singer et al., (1990), en el que se mide la tasa de aparición de acetilCoA de
acuerdo con la siguiente reacción:
AcetoacetilCoA + CoA
26 | A n e x o M e t o d o l o g í a
ACoAT
2 AcetilCoA
Procedimiento
Se mide el decremento de densidad óptica a 313 nm, durante 5 minutos, cada 12
segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es:
Reactivo
Tampón Imidazol 71.4 mM pH 8.0
MgCl2 100 mM
Acetoacetil CoA 2.8 mM
Agua destilada
CoA 4.8 mM (sustrato)
Muestra
Concentración
en pocillo (mM)
50
5
0.14
0.24
Volumen en
pocillo (μL)
140
10
10
20
10
10
CÁLCULO DE LAS ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS
La actividad específica (mU) de los diferentes enzimas se expresó como la capaz de
transformar un nanomol de sustrato por minuto y por miligramo de proteína, calculándose de
acuerdo con la siguiente fórmula:
Siendo:
∆D.O./∆t: variación de densidad óptica por unidad de tiempo
V: volumen total en mL
v: volumen de extracto en mL
d: espesor de la cubeta. Para microplacas 0.6 cm
10-9: factor de conversión a nM
103: conversión de litros a mililitros
P: mg proteína /mL
ε x: coeficiente de extinción molar:
ε 340 nm: 6220/ cm M
ε 412 nm: 13600/ cm M
ε 313 nm: 20500/ cm M
27 | A n e x o M e t o d o l o g í a
IX.5.2. Determinación de Parámetros y Enzimas del Estrés
Oxidativo
IX.5.2.1 NIVELES DE PEROXIDACIÓN LIPÍDICA
Fundamento
La técnica se basa en la medición de la formación de malondialdehido (MDA) tras la
oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados por la acción de los radicales libres ·OH. El MDA,
en presencia de ácido tiobarbitúrico (TBA), da lugar a un producto rosado que absorbe luz a 535
nm (Buege y Aust, 1978).
Reactivos





Ácido tricloroacético (TCA) 15% (p/v)
Ácido tiobarbitúrico (TBA) 0.375% (p/v)
HCl 0.25 N
Hidroxitolueno butilado (BHT) 0.01% (p/v)
Malondialdehido (MDA) 0.1 M
Procedimiento
Se prepara el siguiente reactivo extemporáneo: 15 g de TCA en 80 mL de HCl, una vez
disuelto se añaden 0.375 g de TBA calentando ligeramente. La mezcla resultante se lleva a 100
mL con agua miliQ y se añaden 0.01 g de BHT disolviéndose mediante agitación y calentamiento
ligero durante 2 horas.
Se realizó una curva patrón a partir de una solución madre de MDA con las siguientes
concentraciones:
[MDA]
(μM)
0.1
0.25
1
5
10
15
20
Solución Madre
(μL)
10
25
100
500
1000
1500
2000
Agua miliQ
(ml)
9.990
9.975
9.900
9.500
9.000
8.500
8.000
Volumen Total
(ml)
10
10
10
10
10
10
10
Para llevar a cabo la reacción, se mezclaron 0.1 mL de muestra (extractor y patrones)
con 0.5 mL de reactivo. Tras una agitación vigorosa, se incubó durante 15 minutos a 100 °C. A
continuación se dejó enfriar y se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos. Se tomaron 0.2 mL
del sobrenadante y se midió la absorbancia a 535 nm a 25 °C frente al blanco de reactivo.
28 | A n e x o M e t o d o l o g í a
CÁLCULOS
Los datos de absorbancia obtenidos se interpolan en la recta de regresión construida a
partir de la curva patrón. Los niveles de peroxidación lipídica se expresaron como nM de MDA =
nmol de MDA/g tejido
IX.5.2.2 CATALASA (CAT; E.C. 1.11.1.6)
Fundamento
La determinación de la actividad catalasa se llevó a cabo usando el método de Aebi
(1984). La catalasa puede ejercer una doble función, catalítica y peroxidásica.
En este caso, se determinó la actividad catalítica midiendo la desaparición de H2O2
registrada espectrofotométricamente como disminución de densidad óptica.
2 H2O2
2 H2O + O2
Reactivos


Tampón fosfato potásico 50 mM pH 7.0
Solución extemporánea de peróxido de hidrógeno 10.6 mM en tampón fosfato potásico
50 mM pH 7.0 (sustrato)
Procedimiento
Se determinó el decremento de densidad óptica a 240 nm durante 3 minutos, cada 12
segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos:
H2O2 10.6 mM
Muestra
Concentración
en pocillo (mM)
0.53
Volumen en
pocillo (μL)
190
10
CÁLCULOS
Para el cálculo de la actividad catalasa se utilizó la fórmula:
Siendo:
∆D.O./∆t: decremento de densidad óptica/min
V: volumen total en mL
v: volumen de extracto en mL
d: longitud de paso de luz. Para microplacas es 0.6 cm
10-6: factor de conversión a μM
29 | A n e x o M e t o d o l o g í a
103: conversión de litros a mililitros
P: mg proteína / mL
ε 240: coeficiente de extinción molar del H2O2 a 240 nm (39.58/ cm M)
IX.5.2.3 GLUTATION PEROXIDASA (GPX; E.C. 1.11.1.9)
Fundamento
La actividad de la glutation peroxidasa (GPX) se valoró indirectamente, según Paglia y
Valentine (1967), mediante un sistema de ensayo en el que el glutation oxidado (GSSG), formado
durante la reacción catalizada por este enzima, es reducido instantánea y continuamente por un
exceso de glutation reductasa (GR), produciéndose un nivel constante de glutation reducido
(GSH). Así para determinar la actividad de la GPX se mide el descenso de absorbancia a 340 nm
debido a la oxidación del NADPH que interviene en la reducción del GSSG a GSH:
H2cumeno + 2 GSH
GR
GPX
GSSG
H2O
GSH
NADPH+H
+
NADP
+
Procedimiento
Para evitar una sobreestimación de la actividad enzimática real, ya que el hidroperóxido
de cumeno reacciona aún en ausencia de enzima, se debe realizar una reacción en ausencia de
muestra (no catalizada) o control.
Se registra el decremento de densidad óptica a 340 nm durante 3 minutos, cada 15
segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es:
Tampón fosfato potásico 50 mM pH 7.1
Azida sódica 4.3 mM
EDTA 1 mM
GSH 4 mM
NADPH 0.2 mM
Glutation reductasa
Hidroperóxido de cumeno 25.5 mM (sustrato)
Muestra
Concentración
en pocillo (mM)
35
0.23
0.05
0.2
0.01
1.1 U/ml
1.81
Volumen en
pocillo (μL)
140
10
10
10
10
0.14
10
10
 Reacción control (no catalizada):
Se realizan al menos tres determinaciones, en cada pocillo se adicionan 180 μL de
solución reactiva y 10 μL de hidroperóxido de cumeno.
 Reacción problema
En cada pocillo se adicionan 180 μL de solución reactiva, 10 μL de hidroperóxido de
cumeno y 10 μL de muestra.
30 | A n e x o M e t o d o l o g í a
CÁLCULOS
Al valor de variación de densidad óptica en el tiempo obtenido para cada muestra, se
resta el correspondiente a la reacción control (no catalizada). La actividad enzimática glutation
peroxidasa se expresa como nanomoles de NADPH oxidados a NADP por minuto y miligramo de
proteína según la fórmula general descrita para el cálculo de las actividades enzimáticas
específicas.
IX.5.2.4. SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD; 1.15.1.1)
Fundamento
La determinación de la actividad SOD se realizó siguiendo el método descrito por
McCord y Fridovich (1969), basado en la medida de la tasa de inhibición, por parte de la SOD, en
el proceso de reducción del citocromo C por los radicales superóxidos O2-, generados por el
sistema enzimático xantina – xantina oxidasa
XOD
Xantina
Cit ox
Ácido úrico +
Cit red
O2-
SOD
H2O + O2
Inhibido
por SOD
Procedimiento
Reactivos
Tampón fosfato potásico 50 mM pH 7.8 EDTA 0.1 mM
Citocromo C 1 mM
Xantina 1 mM
Concentración
en pocillo (mM)
44.5
0.10
0.01
Volumen en
pocillo (μL)
178
19
3
Esta mezcla reactiva se mantiene a 25 °C protegida de la luz y con aireación durante 50
minutos para conseguir la total oxidación del citocromo C
 Comprobación de la solución de reacción:
Se le adiciona un poco de hidrosulfito sódico a 200 μL de solución reactiva. Previa
agitación se mide la absorbancia a 550nm. Se comprueba la reducción total del citocromo C al
obtener valores de D.O. comprendidos entre 0.20 y 0.24.
 Reacción control:
Se realizan tres réplicas adicionando al pocillo 200 μL de solución reactiva y 5 μL de
xantina oxidasa (XOD). Se lleva a cabo una lectura espectrofotométrica a 550 nm en intervalos
de 13 segundos durante 3 minutos a 25 °C. La tasa de reducción del citocromo C de la reacción
control debe estar comprendida entre 0.023 – 0.028 unidades.
31 | A n e x o M e t o d o l o g í a
 Reacción problema:
En cada pocillo se adicionan 200 μL de cóctel de reacción, 5 μL de XOD y 5 μL de muestra
problema. Se determina el incremento de absorbancia (550 nm) durante 3 minutos, a intervalos
de 13 segundos y a una temperatura de 25 °C.
CÁLCULOS
IX.5.2.5. GLUTATION REDUCTASA (GR; E.C. 1.6.4.2)
Fundamento
La actividad GR se determinó según el método de Carlberg y Mannervik (1975) con
algunas modificaciones, registrándose el descenso de absorbancia producido por la oxidación
del NADPH utilizado por la glutation reductasa en el paso de GSSG a GSH.
GR
GSSG
GSH
NADPH+H
+
NADP
+
Procedimiento
Se registró el decremento de densidad óptica producido por la oxidación del NADPH a
340 nm durante 10 minutos cada 18 segundos a 25 °C. En cada pocillo se adicionó lo siguiente:
Reactivos
NADPH 0.66 mM
GSSG 3.25 mM (sustrato)
Muestra
Concentración
en pocillo (mM)
0.63
0.15
Volumen en
pocillo (μL)
190
10
10
CÁLCULOS
La actividad se expresó como nanomoles de NADPH oxidados a NADP por minuto y
miligramo de proteína según la fórmula general descrita para el cálculo de las actividades
enzimáticas específicas.
32 | A n e x o M e t o d o l o g í a
IX.5.2.6. GLUTATION S-TRANSFERASA (GST; E.C. 2.5.1.18)
Fundamento
La actividad GST se determinó según el método de Habig et al., (1974), modificado por
Frasco et al., (2002). La reacción consiste en la formación de un conjugado de glutation y cloro
dinitrobenceno (CDNB) por mediación de la enzima glutation S-transferasa.
GSH + CDNB
GST
GS-CDNB
Glutation conjugado
Procedimiento
Se mide el decremento de densidad óptica producido por la formación del conjugado de
glutation y CDNB a 340 nm, cada 20 segundos durante 5 minutos, a 25 °C de temperatura en una
serie de pocillos cuyo contenido es:
Reactivos
Tampón fosfato potásico 0.1 M
GSH 10 mM
CDNB 60 mM (sustrato)
Muestra
Concentración
en pocillo (mM)
77.5
1.2
1.23
Volumen en
pocillo (μL)
155
25
5
10
CÁLCULOS
La unidad de actividad enzimática glutation s-transferasa se expresa como la cantidad de
enzima que cataliza la formación de un mol de producto (conjugado de CDNB con GSH) por
minuto y miligramo proteína, según la fórmula general descrita para el cálculo de las actividades
enzimáticas específicas. El coeficiente de extinción molar es de 9.6 /mM cm.
IX.5.2.7. DT DIAFORASA (NAD(P)H QUINONA OXIDOREDUCTASA) (NQO1;
EC 1.6.99.2)
Fundamento
La determinación de la actividad DT diaforasa se realizó según Sturve et al., (2005). La
función antioxidante de la DTD radica en su capacidad única para reducir quinonas a
hidroquinonas mediante la aceptación de dos electrones que son cedidos obligatoriamente por
NADH o NADPH. La trasferencia de electrones se realizaría desde el NAD(P)H hasta el grupo FAD
del centro activo, formándose FADH2 y de aquí pasarían a la quinona reduciéndola. Esto rompe
el ciclo redox prooxidante previniendo la formación de radicales superóxido dependiente de la
quinonas que, a su vez, puede llevar a la formación de peróxido de hidrógeno y radicales
hidroxilo.
In vitro la transferencia de los electrones del FADH2 pasan al diclorofenol indofenol
(DCPIP), registrándose la variación de color debido a su reducción.
33 | A n e x o M e t o d o l o g í a
Procedimiento
Para evitar una sobreestimación real de la actividad enzimática, se debe realizar una
reacción sin muestra (no catalizada) o control.
Se midió la variación de densidad óptica producido por la reducción del DCPIP a 600 nm,
cada 20 segundos durante 5 minutos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo
contenido es:
Reactivos
Tampón Tris-HCl 50 mM
NADH 5 mM
Albúmina 0.147%
DCPIP 0.42 mM (sustrato)
Muestra
Concentración
en pocillo (mM)
36.25
0.49
0.05
Volumen en
pocillo (μL)
145
20
10
25
10
 Reacción control.
Se realizan al menos tres determinaciones, en cada pocillo se adicionan 165 μL de
solución reactiva, 10 μL de albúmina, 25 μL de DCPIP y 10 μL de agua, sustituyendo a la muestra.
 Reacción problema.
En cada pocillo se adicionan 165 μL de solución reactiva, 10 μL de albúmina, 25 μL de
DCPIP y 10 μL de muestra.
CÁLCULOS
Al valor de variación de densidad óptica en el tiempo obtenido para cada muestra, se
resta el correspondiente a la reacción control (no catalizada). La unidad de actividad enzimática
DT diaforasa se expresa como la cantidad de enzima que cataliza la formación de un mol de
producto (DCPIP reducido) por minuto y miligramo de proteína, según la fórmula general
descrita para el cálculo de las actividades enzimáticas específicas. El coeficiente de extinción
molar es de 21/mM cm.
IX.5.3. Determinación de Glucógeno Tisular
Para la determinación del glucógeno muscular y hepático se tomaron porciones de
ambos tejidos, que fueron homogeneizadas con agua fría purificada en proporción 1:4 (p:v). Las
muestras se mantuvieron a -80 °C hasta su posterior análisis.
Fundamento
El método consiste en una hidrólisis enzimática del glucógeno con amiloglucosidasa
según el método de Roehrig y Allerd (1974) modificado. La actividad hidrolítica del enzima es a la
34 | A n e x o M e t o d o l o g í a
altura de las uniones α-D (1→4) y α-D (1→6) del glucógeno, liberándose glucosa. Esta enzima es
específica y, por tanto, no es necesario aislar el glucógeno para llevar a cabo la hidrólisis.
Glucógeno
Amiloglucosidasa
(Glucosa)n
Reactivos



Amiloglucosidasa comercial (E. C. 3.2.1.3)
Tampón acetato 0.05M, pH 4.5
Glucógeno comercial
Procedimiento
Hidrólisis del glucógeno
A 25 μL de homogenado de cada muestra se añaden, junto con 425 μL de agua destilada,
50 μL de una solución de amiloglucosidasa en tampón acetato (35 U/mL). Se mezcla e incuba a
55 °C durante 10 minutos.
El mismo tratamiento enzimático y de incubación se aplica a las muestras de la curva
patrón construida con concentraciones conocidas de glucógeno, a partir de una solución
estándar de 800 μg de glucógeno / 400 μL de agua destilada.
[Glucógeno] μg /400μL
Agua destilada (μL)
Solución estándar (μL)
0
400
0
25
387.5
12.5
50
375
25
100
350
50
200
300
100
300
250
150
400
200
200
Determinación de glucógeno en estado de glucosa libre
Pasado el período de tiempo señalado se determina el contenido en glucosa en 10 µL de
la mezcla reacción según el método descrito en el punto IX.3.2.
CÁLCULOS
La concentración de glucógeno en las muestras se calcula a partir de la curva patrón en
la que se asocian concentraciones de glucógeno conocidas con la densidad óptica
correspondiente, obtenida al medir la glucosa libre. Los resultados se expresan en mg
glucógeno/g tejido.
35 | A n e x o M e t o d o l o g í a
IX.6.
DETERMINACIÓN
DE
PARÁMETROS
DE
CALIDAD DEL MÚSCULO.
IX.6.1. Determinación de la Firmeza.
Fundamento
Se realizó mediante la técnica de compresión – relajación, presionando con una sonda al
pez con una velocidad de desplazamiento constante que pretende simular la acción de un dedo
al presionar sobre el pescado.
La firmeza, que se expresa en Newtons (N), se considera como la fuerza necesaria para
comprimir la muestra y producir el mayor pico durante la compresión; mide la resistencia de las
fibras del músculo a la compresión sin rotura.
Procedimiento
Para la determinación de la firmeza se ha empleado un texturómetro TXT2 plus “Stable
Mycro System” que posee una célula de carga de 5 kN y está provisto de un brazo móvil,
acoplado al cual se dispone una sonda cilíndrica de punta plana de 20 mm de diámetro. La
superficie plana de la sonda presiona la superficie del pez, perpendicular al eje de las fibras
musculares. La presión de la sonda sobre el pez se realiza con una velocidad de 1 mm/s, durante
5 s. La profundidad de penetración es de 5 cm, previa a la rotura de las fibras musculares.
El equipo se encoontraba en un laboratorio en el que la temperatura ambiental durante
los ensayos fue de 18 ± 2 °C. Durante el tiempo que duraron las determinaciones, los peces se
mantuvieron en una bandeja con hielo.
La firmeza se mide en la parte anterior dorsal coincidiendo con el inicio de la aleta dorsal
de las corvinas según se indica en la figura.
Figura IX.6.1. Punto de determinación
de la firmeza en la corvina.
IX.6.2. Determinación del pH.
La medida del pH se realiza directamente mediante la inserción en el músculo dorsal de
los peces de un electrodo de penetración Crison cat. nº 52-32 previamente calibrado y un pHmetro GLP 21 Crison. Se toman dos medidas de pH por pez realizadas, aproximadamente, en el
mismo punto donde se evaluó la firmeza.
36 | A n e x o M e t o d o l o g í a
IX.6.3. Determinación de la Capacidad de Retención de Agua (CRA)
Fundamento
La capacidad de retención del agua se determinó según el método gravimétrico de
Pastoriza et al., (1998), adaptándolo a las características particulares del músculo de la corvina.
Procedimiento
Para la medición de la CRA se emplean trozos de músculo, de aproximadamente 1 g, que
se introducen en un tubo de centrífuga, dentro del cual hay otro, más pequeño ,invertido, de esa
forma se evitaba que el agua eliminada durante la centrifugación esté en contacto con la
muestra. Las muestras se centrifugan a 2500 rpm durante 30 minutos, a 15 °C.
CÁLCULOS
El porcentaje de agua libre se calcula como la cantidad de agua perdida en la
centrifugación, expresada como porcentaje de la masa inicial de la muestra:
La CRA se calcula como el porcentaje de agua retenida por 100g de músculo fresco:
siendo la humedad inicial, la determinada según se describe en el apartado IX.2.1.
(determinación de composición corporal).
IX.6.4.
Extracción
de
Proteínas
Sarcoplasmáticas
y
Miofibrilares.
Extracto de proteínas sarcoplásmicas.
Reactivos

Tampón de baja fuerza iónica (BFI) NaHCO3 10 mM, EGTA 1mM.
Procedimiento
Se realiza la homogenización de la muestra de músculo liofilizado con el tampón de baja
fuerza iónica a una concentración de 1.5 mg/mL, utilizando un homogenizador mecánico (PT2100, Polytron), en tres periodos de 15 segundos, separados por pausas de 15 segundos para
evitar el calentamiento excesivo de las muestras.
A continuación se centrifuga el homogenado (10000 xg, 20 minutos, 4 °C) y se recupera
el sobrenadante. Al precipitado se le añaden 5 mL de tampón BFI y se resuspende mediante
agitación durante 30 minutos, tras lo cual se vuelve a centrifugar. El sobrenadante obtenido tras
37 | A n e x o M e t o d o l o g í a
esta segunda centrifugación se añade al obtenido en la primera, constituyendo ambos la
fracción sarcoplásmica, la cual se almacena en alícuotas a -20 °C.
Extracto de proteínas miofibrilares.
Reactivos

Tampón miofibrilar urea 8 M, tritón X-100 (2% v/v), ditiotreitol (DTT) 2 mM, Tris-HCl 50
mM pH 7,2
Procedimiento
Al precipitado obtenido tras la separación de las proteínas sarcoplásmicas, se le añaden
5 mL de tampón miofibrilar (TM), se resuspende y se agita durante 30 minutos, tras lo cual se
centrifuga nuevamente(10000 xg, 20 minutos, 4 °C). Se recoge el sobrenadante y al precipitado
se le añaden 5 mL de tampón TM, para resuspenderlo mediante agitación durante 30 minutos y
se vuelve a centrifugar bajo las mismas condiciones indicadas. El sobrenadante se añadió al
obtenido tras la primera centrifugación, y ambos constituyeron la fracción miofibrilar, que se
almacena a -20 °C.
IX.6.5. Determinación del contenido en proteína de los extractos
La cantidad de proteína contenida en los extractos se determinó mediante dos
procedimientos distintos, dependiendo tanto de la cantidad de proteína soluble presente, como
de sus limitaciones cuando se utilizan tampones que contienen detergentes. La concentración de
proteína en los extractos sarcoplásmicos se midió según el método de Bradford (1976), descrito
en el apartado IX.4.6.
La concentración de proteínas miofibrilares de los extractos se determinó por el método
del Biuret (Reactivo de Biorad Protein Assay) (Gornall et al., 1949), basado en una reacción
colorimétrica.
Fundamento
Los enlaces peptídicos en un medio alcalino reaccionan con iones cúpricos para formar
complejos que absorben luz de 540 nm. Las proteínas toman un intenso color violeta azulado en
presencia de estas sales de cobre, siendo la intensidad del color proporcional a la concentración
de proteína total en la muestra ensayada. La razón para utilizar este procedimiento es que el
método de Biuret, al contrario que el de Bradford, es compatible con la presencia de
detergentes en los tampones de extracción de proteínas, como ocurre con el Triton X-100 en el
extracto de proteínas miofibrilares.
Reactivos
El reactivo de Biuret está compuesto por tartrato sódico potásico 15 mM, yoduro sódico
100 mM, yoduro de potasio 5 mM, sulfato de cobre (II) 19 mM, ya preparados para su uso y una
solución de seroalbúmina bovina como estándar.
38 | A n e x o M e t o d o l o g í a
Procedimiento
En cada pocillo se añaden 40 µL de la muestra y 160 µL del reactivo; se mezclan e
incuban durante 5 minutos a 37 °C ó 10 minutos a temperatura ambiente.
IX.6.6. Determinación del contenido de aminoácidos.
Fundamento
Se realizó según el método descrito por Church et al. (1983), basando en la reacción del
orto-ftalaldialdehído (OPA) y el -mercaptoetanol con las aminas primarias. Los grupos -amino
liberados en la hidrólisis proteica reaccionan con el OPA y con el -mercaptoetanol para dar
lugar a un complejo que absorbe fuertemente a 340 nm. La absorbancia es similar para todos los
grupos -amino.
Reactivos


Reactivo de orto-ftalaldialdehído (OPA), tetraborato sódico 50 mM, SDS al 4% (v/v), OPA
mM y β-mercaptoetanol mM.
Tricloroacético (TCA) al 20% (p/v)
Procedimiento
A los extractos de proteínas sarcoplásmincas, previamente desproteinizados con TCA, se
añade el reactivo OPA y se mide la absorbancia a 340 nm en el lector de microplacas.
CÁLCULOS
La concentración de aminoácidos en las muestras se calcula a partir de una curva patrón
en la que se asocian concentraciones de L-leucina conocidas con su correspondiente densidad
óptica. Los resultados se expresan en μg aminoácido / g tejido.
IX.7.6. Técnica de electroforesis SDS-PAGE (Electroforesis en
gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio)
Fundamento
Con objeto de visualizar las posibles diferencias en la degradación de las distintas
fracciones de las proteínas sarcoplásmicas y miofibrilares, se llevaron a cabo separaciones
electroforéticas en geles de poliacrilamida (PAA) en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE),
utilizando el sistema discontinuo de tampones descrito por Laemmli (1970).
39 | A n e x o M e t o d o l o g í a
Reactivos

Tampón de muestra para electroforesis Tris 0.125M, glicerol 20% (v/v), azul de
bromofenol 0.04% (v/v), SDS 2% (p/v), β-mercaptoetanol 20% (v/v)

Patrón molecular SDS6H2 (Sigma-Aldrich, 30-200 KDa)

Solución de tinción, azul de Coomassie al 0.1% (p/v) en una solución de metanol, ácido
acético y agua (35:10:55, respectivamente)

Solución desteñidora: metanol, ácido acético y agua (35:10:55)
Procedimiento
A partir de los extractos de proteínas sarcoplásmicas y miofibrilares se hace una dilución
(1:1) con tampón de muestra para electroforesis que se hirvió durante 2 minutos.
La electroforesis se realiza en geles de 10 x 10.5 cm, con un espesor de 0.75 mm. Para las
proteínas miofibrilares se utilizan geles con un 10% de poliacrilamida, mientras que para
aumentar la resolución de las bandas en las proteínas sarcoplásmicas se optó por geles de un
12%. Se utilizan los carriles para introducir muestras (20 µL para las proteínas sarcoplásmicas y
10 µL para las miofibrilares) y se reserva un carril para el patrón molecular.
Los geles se someten a una diferencia de potencial constante de 200 V cada uno,
durante un tiempo de 75 minutos. Finalizada la separación, los geles permanecen sumergidos
durante toda una noche en solución de tinción a temperatura ambiente., tras lo cual se destiñen
con la solución desteñidora antes de ser fotografiados. Las fotografías se analizaron con el
software Genesnap versión 6.80 (Synoptics).
La asignación de masas moleculares relativas y la cuantificación de la contribución de
cada fracción proteica teñida separada electroforéticamente al total de proteína contenida en
cada carril, se lleva a cabo mediante densitometría, utilizando para ello un programa específico
de análisis de geles de electroforesis (Genetools versión 3.07, Synoptics).
La contribución porcentual de las distintas fracciones proteicas separadas al conjunto de
la proteína presente en cada carril se calcula comparando el área densitométrica de cada
proteína, con el área total resultante de la suma de todas las áreas individuales.
La identificación de cada fracción se basa en su masa molecular relativa y se le asigna
una denominación de acuerdo con los valores consultados en bibliografía.
IX.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El análisis estadístico de los datos se ha realizado con el paquete estadístico SPSS versión
15.0 para Windows.
Para la estimación de los posibles efectos del tratamiento impuesto se realizó el Análisis
de la Varianza de una vía (ANOVA) Cuando el análisis de la varianza confirmó la existencia de
diferencias significativas se aplicó el test de Duncan. El nivel de significación empleado fue del
95% (P<0.05). Todos los resultados se expresaron como media ± error estándar.
Los resultados expresados como porcentaje fueron normalizados previamente,
utilizando la transformación del arco de seno de su raíz cuadrada, según Sokal y Rohlf (1981).
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