Control del flujo metabólico - digital

Control del flujo metabólico de α‐cetoácidos mediante la inactivación del gen panE en estirpes de Lactococcus lactis con actividad GDH
Tomás García‐Cayuela1, Luz P. Gómez de Cadiñanos1, Mireille Yvon2, Carmen Peláez1 y Teresa Requena1*
CIAL
1Departamento de Biotecnología
2
y Microbiología de Alimentos (CSIC‐UAM), Madrid, Spain. *Email: t.requena@csic.es
INRA, UR 477 Biochimie Bactérienne, F‐78350 Jouy‐en‐Josas, Francia
INTRODUCCIÓN
Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las enzimas hidroxiácido deshidrogenasas (HA‐DH) son oxidorreductasas dependientes de NAD(H)
que catalizan la síntesis estereoespecífica de α‐hidroxiácidos. Además, están negativamente
relacionadas con la formación de aroma debido a que compiten por los α‐cetoácidos, que son los
precursores de compuestos volátiles.
Pérdida de la actividad hidroxiisocaproato deshidrogenasa por inactivación del gen panE
Actividad Hic‐DH (U/mg)
8
La principal actividad HA‐DH de Lactococcus lactis, la actividad hidroxiisocaproato deshidrogenasa
(Hic‐DH), ha sido identificada mediante mutagénesis en el producto codificado por el gen panE .
La enzima GDH, poco frecuente en L. lactis, cataliza la reacción reversible de desaminación oxidativa
del glutamato en α‐cetoglutarato y amonio.
6
IFPL953
TIL46
IFPL953∆panE
4
•Este resultado confirmó el hecho de que PanE es la única
enzima responsable de la reducción de los α‐cetoácidos
de cadena ramificada en L. lactis.
2
*
0
•La cepa L. lactis IFPL953∆panE presenta una pérdida total
de actividad Hic‐DH a consecuencia del reemplazamiento
del gen panE por el gen mutado ∆panE.
KIV
KIC
ArAAs y BCAAs
α‐Cetoglutarato
ATs
Actividad Hic‐DH del contenido intracelular (CFE) frente a α‐cetoisocaproato (KIC). Una unidad (U) de actividad Hic‐DH se definió como la cantidad de enzima
que cataliza la oxidación de 1 µmol de NADH por min y por mg de proteína en el CFE (U/mg) a 37 °C. Los datos se corresponden al valor medio ± desviación
estándar de seis réplicas independientes. *, P<0,05.
GDH
Efecto de la mutación del gen panE sobre el crecimiento y la capacidad de acidificación
Glutámico
El control del flujo metabólico de α‐cetoácidos para su
conversión eficiente hasta compuestos volátiles podría
conseguirse:
CRECIMIENTO EN LECHE Y CAPACIDAD DE ACIDIFICACIÓN
CRECIMIENTO EN CDM
α‐Cetoácidos
Hic‐DH (panE)
4
1,5
Hidroxiácidos
IFPL953
1
IFPL953∆panE
Compuestos aromáticos
(ácidos carboxílicos, aldehídos, alcoholes, etc)
•Aumentando la disponibilidad de α‐cetoglutarato como
aceptor de grupos amino en la reacción de transaminación a
través de la actividad GDH
Esquema simplificado del catabolismo de aminoácidos a
partir de aminoácidos aromáticos (ArAAs) y de cadena
ramificada (BCAAs). ATs, aminotransferasas; GDH,
glutamato deshidrogenasa; Hic‐DH, hidroxiisocaproato
deshidrogenasa.
Se procedió a la mutación del gen panE en la cepa silvestre L. lactis IFPL953 y se
evaluó la capacidad de la estirpe mutante obtenida para formar compuestos volátiles.
6
3
DO480
DO480
•Bloqueando la ruta de conversión de α‐cetoácidos a los
correspondientes hidroxiácidos mediante la inactivación del
gen panE
6,5
5
2
5,5
2
0,5
5
1
0
0
0
5
10
15
20
25
pH
La cepa L. lactis IFPL953 se caracteriza por presentar
actividad GDH, además de actividades clave relacionadas con
el catabolismo de aminoácidos, como aminotransferasa (AraT
y BcaT) y cetoácido descarboxilasa (KivD).
4,5
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (h)
Tiempo (h)
Curvas de crecimiento (símbolos rellenos) y de acidificación (símbolos vacíos) de L. lactis IFPL953 e IFPL953∆panE. Incubaciones realizadas a 30 °C. Curvas
obtenidas mediante la lectura de DO480 a partir de 3 repeticiones biológicas con cada medio. Crecimiento en medio químicamente definido (CDM) durante
24 h (izquierda) y crecimiento en leche y acidificación del pH durante 12 h (derecha).
•Las diferencias de crecimiento entre las dos cepas, silvestre y mutante, no fueron significativas, aunque sí se pudo
observar un ligero retardo en el crecimiento en ambos medios (CDM tamponado y leche no tamponada) de la cepa
IFPL953panE con respecto a la cepa IFPL953. Del mismo modo, pudimos observar un retardo en la capacidad
acidificante de la cepa mutante en leche con respecto a la silvestre.
•Los resultados confirmaron que la mutación del gen panE no tuvo una repercusión significativa en el crecimiento y
la capacidad de acidificación de la cepa IFPL953panE
MATERIALES Y MÉTODOS
Efecto de la mutación del gen panE sobre la producción de compuestos orgánicos volátiles (COVs)
Se inactivó el gen panE en L. lactis
IFPL953 mediante mutagénesis por doble
sobrecruzamiento.
IFPL953 ‐ IFPL953ΔpanE
CDM
LECHE
18
Fw‐Int
Em R
Rv‐Int
Fw‐Int
Ts Ori
Pg92
pG+9::∆panE
Secuencia ( 5’→3’ )
Región a amplificar
TCTTATTATTGAACTGACTTT
ADN genómico IFPL953 AACAGAAACTGGAGTAGA
TCTTATTATTGAACTGACTTT Integración pG+9::∆panE en L. lactis IFPL953
ACTGACAGCTTCCAAGGA
Descripción de los productos de amplificación
a) 1645 pb; Integración del gen ∆panE
b) 2053 pb; Genotipo silvestre
a) 1662 pb; Recombinación por F1 b) 2070 pb; Recombinación por F2
(5,1 kb) 50
40
30
20
10
0
*
*
*
Abundancia relativa al CI (%)
Cebadores
Abundancia relativa al CI (%)
60
16
*
14
12
10
8
*
6
4
2
*
*
*
*
0
∆panE
F2
F1
F1
panE
ADN genómico de L. Lactis IFPL953
F2
Integración a 37 °C
F1
Recombinación a través de F1
F1
F2
•Frecuencia de integración: ratio de
unidades formadoras de colonias (UFC) en
presencia de Em respecto al número de
UFC en ausencia de Em = 2,38 ± 0,8 x 10‐3
F2
∆panE
Recombinación a través de F2
Excisión a 28 °C
F2
F1
F1
F2
∆panE
F1
•Cebadores Fw‐Int/Pg92: 1662 pb
F2
∆panE
L. lactis IFPL953ΔpanE
L. lactis con una delección de 408 pb en el gen panE
Verificación de la mutación
•Secuenciación con cebadores Fw‐Int/Rv‐Int: 1645 pb
•Pérdida de la actividad Hic‐DH
Se evaluó la actividad Hic‐DH midiendo la reducción del α‐cetoisocaproato (cetoácido de la leucina; KIC) a α‐
hidroxiicaproato en las cepas L. lactis IFPL953, L. lactis IFPL953ΔpanE y L. lactis TIL46 (control positivo).
Se investigó la producción de compuestos orgánivos volátiles (COVs) a partir del crecimiento de las cepas L. lactis
IFPL953 y L. lactis IFPL953ΔpanE, empleando un medio químicamente definido (CDM) y leche.
La evolución del crecimiento durante 24 h e incubación a 30 °C se siguió mediante medidas de densidad óptica a 480
nm (DO480) y pH.
Los COVs producidos por las cepas IFPL953 e IFPL953panE, tras 30 h de incubación (fase estacionaria tardía) en
CDM y leche fueron analizados en el espacio de cabeza mediante microextracción en fase solida (SPME) acoplada a
cromatografía de gases (GC) y espectrometría de masas (MS)
Compuestos volátiles más representativos producidos por L. lactis IFPL953 y L. lactis IFPL953ΔpanE tras 30 h de cultivo a 30 °C en medio químicamente
definido (CDM) y en leche. Los datos representan las abundancias relativas (%) respecto del 4‐metil‐2‐pentanol (control interno, CI) procedentes de 3
repeticiones biológicas. Las diferencias significativas (P <0.05) son representadas con un asterisco (*)
•El análisis por SPME‐GC‐MS permitió la identificación de un amplio rango de COVs, generando ambas cepas un mayor
número cuando fueron crecidas en leche frente a los producidos cuando crecieron en CDM.
•La cepa silvestre IFPL953 dio lugar a un menor número de COVs que la cepa mutante IFPL953∆panE, aunque solo se
detectaron diferencias significativas (P<0,05) entre las dos cepas en algunos compuestos.
•Se encontraron en el cultivo en leche de la cepa mutante cantidades superiores (P<0,05) de 3‐metilbutanal (derivado
de la leucina) y 2‐metilbutanal (derivado de la isoleucina) a las encontradas en el de la cepa silvestre, indicando una
mayor conversión de α‐cetoácidos ramificados a aldehídos por IFPL953ΔpanE debido a la ausencia de actividad Hic‐
DH. De igual manera, el contenido en 3‐metibutanol fue significativamente superior (P<0,05) en la cepa mutante que
en la cepa silvestre.
CONCLUSIONES
La mutación del gen panE no dificulta el crecimiento de L. lactis IFPL953ΔpanE en
medio de cultivo y en leche.
La supresión de la actividad Hic‐DH en una cepa de L. lactis con actividades GDH,
AraT, BcaT y KivD da lugar a la acumulación de α‐cetoisocaproato y favorece su
posterior conversión hacia compuestos volátiles.
L. lactis IFPL953ΔpanE es más eficiente que su cepa parental en la formación de
compuestos volátiles relacionados con el aroma del queso.
Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (Proyectos: AGL2009‐13361‐C02‐02, RM2011‐00003‐00‐00 y Consolider Ingenio 2010 FUN‐C‐FOOD‐CSD2007‐00063) y la Comunidad de Madrid (Proyecto: ALIBIRD P2009/AGR‐1469)