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 Panel de Editores: La Revista de Farmacología de Chile tiene un panel de editores conformado por connotados farmacólogos nacionales que son miembros de la Sociedad de Farmacología de Chile y académicos de las principales universidades chilenas. Comité Editorial: Dr. Ramón Sotomayor‐Zárate, Editor en Jefe Dr. Pablo Jara Picas, Co‐Editor Dr. Hernán E. Lara Dra. Viviana Noriega Dr. Juan Carlos Prieto Dra. Jacqueline Sepúlveda Dr. Juan Pablo G. Huidobro‐Toro Dra. Katia Gysling Dra. Inés Ruiz Dr. Iván Saavedra S. Dr. Alfonso Paredes V. Dr. Rodrigo Castillo P. Dra. Gabriela Díaz‐Véliz Dr. Patricio Iturriaga‐Vásquez Dra. Myriam Orellana Dra. María Elena Quintanilla Dra. Teresa Pelissier S. Dr. Javier Puente Dr. Luis Quiñones Dr. Patricio Saéz‐Briones Dra. Coralia Rivas Dr. Leonel Rojo Dra. Lutske Tampier Dra. Gladys Tapia Dra. M. Antonieta Valenzuela Dra. M. Araceli Valle Dr. Luis Videla Dr. Raúl Vinet Dr. Bruce K. Cassels Dr. Sergio Mora Evaluadores Asociados: Dr. Hugo F. Miranda Dra. María Eugenia Letelier Dr. Frederick Ahumada Dr. Gonzalo Bustos O. Dr. Raúl Corrales V. Dr. Guillermo Díaz‐Araya Dra. Verónica Donoso Dr. Mario Faúndez Dra. Jenny Fiedler Dr. Miguel Reyes‐Parada Dr. Yedy Israel Dr. Ricardo Maccioni Dra. Verónica Kramer Dr. Sergio Lavandero Dr. Juan Diego Maya Dr. Antonio Morello Revista de Farmacología de Chile Derechos Reservados Sociedad de Farmacología de Chile ISSN 0718‐8811 versión impresa ISSN 0718‐882X versión digital Todos los derechos reservados. Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida, almacenada en sistema alguno de tarjetas perforadas o transmitida por otro medio ‐electrónico, mecánico, fotocopiador, registrador, etcétera‐ sin permiso previo por escrito del comité editorial. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 1 Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 2 EDITORIAL Ramón Sotomayor‐Zárate, Ph.D Editor en Jefe Durante en año 2012, la Revista de Farmacología de Chile cumple 4 años de publicaciones seriadas. Sin duda es un esfuerzo muy gratificante que nos ha permitido mantenernos como órgano nacional de la difusión de la farmacología. Este esfuerzo no ha estado exento de dificultades, ya que durante los dos primeros años de la revista el número de trabajos recibidos no eran suficientes para publicar más de un número por año. En la actualidad hemos logrado la edición de volúmenes temáticos que cuentan con artículos originales de investigación y revisión, que nos han permitido publicar 2 a 3 números por año. En este enorme esfuerzo han participado destacados científicos nacionales e internacionales que han enviado manuscritos a publicar en los números de Farmacología Clínica, Neurofarmacología y ahora de Fitofarmacología. Sin embargo, si queremos en un futuro que nuestra revista este indexada en catálogos electrónicos como Scielo debemos duplicar este esfuerzo, ya que el número mínimo de artículos es de 40 publicados por año. En representación del comité editorial de la Revista de Farmacología de Chile agradezco enormemente el esfuerzo desplegado para la edición del segundo número del año 2012 y solo me queda invitarlos nuevamente a enviar artículos o proponer unidades temáticas específicas para próximas publicaciones. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 3 EDITORIAL DE FITOFARMACOLOGÍA
María Eugenia Letelier, MSc. Editor Asociado El desarrollo de la fitoterapia se ha focalizado por décadas en la búsqueda de principios activos aislados presentes en plantas. Este planteamiento está basado en la presunción que una planta tiene uno o muy pocos compuestos que determinan sus efectos terapéuticos. Sin embargo, los sistemas de medicina tradicional más antiguos como la medicina China y la Ayurvédica o también, la Fitoterapia Europea y la medicina nativa Latinoamericana, creen que los distintos compuestos presentes en las plantas actúan sinérgicamente. Por lo tanto, extractos totales o preparados polivalentes herbales presentarían mayor eficacia terapéutica que los principios activos aislados. Actualmente existe un interés creciente por el desarrollo de fitofármacos en base a extractos totales a nivel mundial. Algunas razones que permiten explicar este crecimiento se mencionan a continuación: 1. Se han realizado grandes esfuerzos económicos y de tiempo para aislar y caracterizar diferentes compuestos de plantas y los resultados terapéuticos han sido sólo moderados. 2. Las patologías en general son multifactoriales. Esto implica que diferentes dianas farmacológicas pueden ser cubiertas para mejorar la eficacia terapéutica. La asociación de fármacos antioxidantes, al tratamiento de enfermedades neurodegenerativas es un ejemplo. 3. Fitofármacos están siendo también evaluados en su capacidad de disminuir reacciones adversas de fármacos sintéticos, mejorando también de esta forma la eficacia terapéutica de los fármacos sintéticos. 4. El desarrollo de las nuevas tecnologías “ómicas” como métodos de alto rendimiento abre nuevas posibilidades para evaluar mezclas de compuestos previamente aislados, como también de extractos totales. Así, estas técnicas permitirán estandarizar preparados herbales polivalentes, como también definir los mecanismos de acción de los mismos, debilidades que han permanecido en el tiempo, impidiendo la validación de la acción terapéutica de este tipo de fitofármacos, por falta de estudios clínicos. Latinoamérica es el continente que posee la mayor diversidad de plantas medicinales y Chile, en forma especial, un alto endemismo. Sin embargo, las plantas han sido escasamente exploradas, aunque ellas representan una gran fuente potencial de fármacos. Si a esto le sumamos la necesidad imperiosa de cubrir las necesidades de salud de nuestra población tercermundista, todo está dado para que aunemos fuerzas y lideremos el desarrollo de fitofármacos. Finalmente, gracias a la directiva de la Sociedad de Farmacología de Chile, como también al Comité Editor de la Revista de Farmacología por su iniciativa de editar un número especial de productos naturales. Un sincero agradecimiento también a todos los profesionales que han contribuido con sus trabajos a hacer efectiva esta iniciativa. La diversidad de temas tratados mostrará a los lectores cuan grande es el camino que falta por recorrer y la necesidad que existe de formar equipos multidisciplinarios para enfrentar este desafío. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 4 CONTENIDO Revista de Farmacología de Chile AÑO 2012 VOLUMEN 5 NÚMERO 1 COLUMNA DE OPINIÓN: LEGISLACIÓN EN CHILE SOBRE FITOFÁRMACOS Y PLANTAS MEDICINALES Mirtha Parada V. ARTÍCULOS ORIGINALES: SAFETY PROFILE AND WOUND HEALING PROPERTIES OF A STANDARDIZED Buddleja globosa Hope (MATICO) EXTRACT IN SPRAGUE‐DAWLEY RATS María Eugenia Letelier y cols. USO DE MODELOS ANIMALES EN EL ESTUDIO DE PLANTAS MEDICINALES CON PROPIEDADES ANSIOLÍTICAS Y ANTIDEPRESIVAS. Gabriela Díaz‐Véliz y Sergio Mora. ESTUDIO DE UN EXTRACTO ESTANDARIZADO DE MAQUI RICO EN DELFINIDINAS EN EL MANTENIMIENTO DEL BALANCE DE GLUCOSA. Evelyn Jara y cols. ARTÍCULOS DE REVISIÓN: POLIFENOLES CON EFECTO ANTI‐HELICOBACTER PYLORI: FUENTES DE OBTENCIÓN Y SU POTENCIAL UTILIZACIÓN EN FITOMEDICAMENTOS, NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES Edgar R. Pastene y cols. COMPUESTOS NEUROACTIVOS OBTENIDOS DESDE FUENTES NATURALES: CARACTERIZACIÓN FARMACOLÓGICA DE NEUROMODULADORES DEL SNC. Jorge Fuentealba Arcos y cols. AVANCES EN LAS INVESTIGACIONES FARMACOLÓGICAS Y TOXICOLÓGICAS CON EL EXTRACTO ACUOSO DE LA CORTEZA DEL ÁRBOL DE MANGO (Mangifera indica L.) Gabino Garrido y Marisela Valdés. MAQUI (Aristotelia chilensis): UN NUTRACÉUTICO CHILENO DE RELEVANCIA MEDICINAL Jorge R. Alonso Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 5 Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 6 COLUMNA DE OPINIÓN LEGISLACIÓN EN CHILE SOBRE FITOFÁRMACOS Y PLANTAS MEDICINALES Mirtha Parada V., Ph.D (c). Subdepartamento de Registro, Agencia Nacional de Medicamentos, Instituto de Salud Pública de Chile INTRODUCCIÓN: Las plantas medicinales son un viejo recurso terapéutico y han sido usadas como fuente de preparados medicamentosos, actualmente se sabe que esta práctica se debe a la presencia de principios activos o constituyentes con acción terapéutica que están presentes en ellas. El hombre prehistórico observaba el comportamiento instintivo de los animales a la hora de curar sus heridas o paliar sus enfermedades, también aprendió a distinguir las especies comestibles y las tóxicas, para luego diferenciar entre las plantas que poseían efectos medicinales y las que no, es así como al hombre de Neanderthal se le encontraron en sus pertenecías granos de polen de seis distintas especies vegetales con propiedades medicinales y en América los primeros indicios del uso de plantas medicinales se localiza en Monteverde, sitio arqueológico ubicado a 36 Km de Puerto Montt, donde se encontró vestigios de boldo, una especie no endémica del lugar, lo que indica el conocimiento terapéutico de las plantas. En Chile antes de la llegada de los españoles, los mapuches dentro de sus elementos terapéuticos usaban las hierbas medicinales, y tenían conocimiento de más de 200 plantas con propiedades terapéuticas. de la época como la mejor botica de ese entonces en Santiago, fabricaba un gran número de preparados con plantas medicinales, de estos un porcentaje considerable con plantas autóctonas chilenas, lo que consta en el catastro elaborado en el año 1772 por el hermano José Zeitler quien se quedó por un periodo en la farmacia luego de la expulsión de los jesuitas. En la época de la colonia la botica de los jesuitas, inaugurada en el año 1647, referida por los historiadores En la actualidad, las plantas medicinales de uso más común en Chile reconocen como origen las fuentes nativas usadas por los mapuches principalmente y especies asilvestradas traídas por los europeos y constituyen un importante recurso terapéutico. MARCO REGULATORIO Tanto en los países desarrollados como los que están en vías de desarrollo el uso de medicamentos elaborados con plantas medicinales muestra un crecimiento acelerado en estos últimos años.Estas plantas son empleadas como materia prima por una amplia gama de empresas que utilizan con menor o mayor grado de industrialización los compuestos que se derivan de ellas. Es así como se elaboran infusiones, aceites, extractos, polvos, fragancias, productos para el cuidado personal, suplementos dietéticos, alimentos funcionales, fitofármacos y productos de uso industrial y de aplicación en la agricultura. Se estima que el 30% de los fármacos que se comercializan y el 40% de los que se encuentran en pruebas clínicas, son derivados de plantas medicinales. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Correspondencia a: Q.F. Mirtha Parada V. Candidata a Doctora en Cs Farmacéuticas U de Chile. Subdepartamento Registro, Agencia Nacional de Medicamentos Instituto de Salud Pública de Chile. Marathon 1000, Ñuñoa, Santiago. Teléfono: +56 (2) 5755311 Red Minsal: 255311. Correo electrónico: mparada@ispch.cl Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 7 En el mundo en general se están haciendo esfuerzos para legislar en torno al tema y armonizar criterios en la regulación de los Fitofármacos. Por ejemplo, durante una reunión de la Red Iberoamericana de Productos Fitofarmacéuticos (RIPROFITO), en Guatemala en el año 1996, se reconoció la necesidad de recopilar las dispersas legislaciones iberoamericanas sobre estos productos culminando con una obra que reunió normativas de 15 países. Por otro lado, en Europa, la Comunidad Europea ha elaborado en estos últimos años una reglamentación armonizada para los fitofármacos y los productos naturales. En Chile se han realizado actividades que agrupan a entidades del ámbito privado‐productivo, académico e institucional en relación a las estrategias a seguir en la producción de las plantas medicinales y a la regulación de los productos que de ella derivan. El FIA (Fundación para la Innovación Agraria) agrupó a distintos sectores con el objetivo de establecer un vínculo permanente que permitiera una coordinación y articulación regional de los sectores productivo, académico, industrial y público. Por su parte el Ministerio de Salud ha promovido los cambios reglamentarios para garantizar el uso racional de los medicamentos elaborados con plantas medicinales. En estos últimos años los reglamentos han sido modificados y complementados de acuerdo a los requerimientos actuales. Por ejemplo el Reglamento del Sistema Nacional de Control de Productos Farmacéuticos D.S. Nº 1876/95, fue modificado en 1999 por el DS Nº 855/98 creando la categoría de Producto Farmacéutico Complementarios, decreto que fue posteriormente derogado y reemplazado por el D.S. Nº 286 de 2001 que modificó el DS 1876/95 y creó la categoría de fitofármaco. Actualmente el D.S. 1876 ha sido reemplazado por el D.S. Nº 3/10, que entra en vigencia el 26 de Diciembre de 2011 (que aprueba el Reglamento del Sistema Nacional de Control de Productos Farmacéuticos de Uso Humano), donde se incluyen las definiciones de fitofármacos y los requisitos para su regulación, siendo el Instituto de Salud Pública quien las debe aplicar. El Instituto de Salud Pública de Chile (ISP) es la entidad gubernamental encargada de implementar los cambios reglamentarios, ya que se trata de un servicio público funcionalmente descentralizado, que posee autonomía de gestión y está dotado de personalidad jurídica y de patrimonio propio. Depende del Ministerio de Salud para la aprobación de sus políticas, normas y planes generales de actividades, así como en la supervisión de su ejecución. DEFINICIONES Y REQUISITOS PARA REGISTRO DE FITOFÁRMACOS Y PLANTAS MEDICINALES DS N° 3/10: En el artículo 10º se hace referencia a las especialidades farmacéuticas, de acuerdo a su naturaleza, la letra d) de este artículo se refiere a los fitofármacos. El artículo 14º de este decreto define a los fitofármacos. Cuadro 1: Definición de Fitofármaco Artículo 14º: Son fitofármacos, aquellas especialidades farmacéuticas cuyos ingredientes activos provienen de las partes aéreas o subterráneas de plantas u otro material vegetal y están debidamente estandarizados El artículo 27º hace mención a los medicamentos herbarios tradicionales cuya definición se detalla en el cuadro 2. Cuadro 2: Definición de Medicamentos Herbarios Tradicionales Artículo 27º: Se entenderá por medicamentos herbarios tradicionales, aquellos constituidos por las plantas o partes de plantas, frescas o desecadas, enteras o trituradas, envasadas y etiquetadas artesanalmente y rotuladas con la denominación utilizada por la costumbre popular en el ámbito de las tradiciones culturales chilenas, que hayan sido reconocidas en la respectiva norma técnica aprobada por decreto supremo del Ministerio, a la que alude en el párrafo siguiente. Se entenderán registrados para los efectos de su libre venta y distribución, por el sólo hecho que la SEREMI competente haya autorizado el establecimiento donde se almacenan, elaboran, fraccionan o envasan o se realizan otras actividades propias de su procedimiento, debiendo cumplir las siguientes condiciones: a. Deberán estar en un listado contenido en una norma técnica aprobada por decreto supremo del Ministerio, dictada en uso de sus atribuciones legales técnico normativas, la que señalará la denominación, propiedades terapéuticas y usos de cada una de ellas, debiendo ser empleadas como auxiliares sintomáticos. b. Estar envasadas artesanalmente como especies vegetales aisladas, no mezcladas. c. Consignar en sus rótulos sólo aquellas propiedades reconocidas en el decreto aludido precedentemente En el cuadro 3 se aprecia el listado de plantas autorizadas como medicamentos herbarios tradicionales mediante resoluciones exentas N° 522 y 190, de fechas 16 de agosto de 2007 y 31 de marzo de 2008, respectivamente. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 8 Cuadro 3: Listado de Medicamentos Herbarios Tradicionales 1.
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Acaena splendens Hook. Et Arn. Acantholippia deserticola (Phil.) Moldenke Achillea millefolium L. Agathosma betulina (Bergius)Pill. Aloe barbadensis Mill. Aloysia citrodora Paláu Arctium lappa L. Aristotelia chilensis (Mol.)Stuntz Arnica montana L. Artemisia absinthium L. Bauhinia forficata Link subsp. pruinosa (J.Vogel) Fortunato et Wunderlin Betula pendula Roth Borago officinalis L. Buddleja globosa Hope Calceolaria thyrsiflora Grah. Calendula officinalis L. Capsella bursa‐pastoris (L.) Medik. Chenopodium chilense Schrad. Centaurium cachanlahuen B.L. Rob. Cestrum parqui L’Herit. Cichorium intybus L. Citrus aurantium L. Crataegus monogyna Jacq. Cuscuta chilensis Ker‐Gawl. Cynara scolymus L. Drimys winteri J.R. et G. Forster Durvillea antarctica (Chamissso)Arito Ecballium elaterium (L.) A. Rich. Elytrigia repens (L.)Nevski Ephedra chilensis K. Presl Equisetum bogotense Kunth Eucalyptus globulus Labill. Fabiana imbricata R.et P. Flaveria bidentis (L.) O. Kuntze Foeniculum vulgare Mill. Fuchsia magellanica Lam. Fumaria officinalis L. Geum chiloense Balb. ex Ser. Gunnera tinctoria (Mol.) Mirb. Haplopappus baylahuen Remy Hypericum perforatum L. Juglans regia L. Juniperus communis L. Lampaya medicinalis F. Phil. Laretia acaulis (Cav.) Gill. et Hook. Lavandula angustifolia Mill. Libertia sessiliflora (Poepp.) Skottsb. Linum usitatissimum L. Lomatia hirsuta (Lam.) Diels ex Macbr. Luma chequen (Mol.) A.Gray Malva sylvestris L. Margyricarpus pinnatus Kuntze Marrubium vulgare L. Matricaria recutita L. Maytenus boaria Mol. Melissa officinalis L. Mentha x piperita Mentha pulegium L. Morus nigra L. Muehlenbeckia hastulata I.M.Johnst. 61.
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Ocimum basilicum L. Olea europaea L. Otholobium glandulosum (L.)Grimes Paspalum vaginatum Swartz Persea americana Mill. Petasites fragrans (Vill.)C.Presl Peumus boldus Mol. Pimpinella anisum L. Pinus radiata D.Don Plantago lanceolata L. Plantago major L. Polypodium feuillei Bertero Porlieria chilensis Johnst. Pseudognaphalium viravira (Mol.) A. Anderb. Punica granatum L. Quillaja saponaria Mol. Quinchamalium chilense Mol. Rhamnus frangula L. Ribes cucullatum H. et A. Rosa moschata Herrm. Rosmarinus officinalis L. Rumex conglomeratus Murria. Ruta chalepensis L. Salix humboldtiana Willd. Salvia officinalis L. Sambucus nigra L. Schinus areira L. Senecio fistulosus Poepp. ex Less. Senna alexandrina Miller Senna stipulacea (Aiton)Irv. et Barneby Solanum ligustrinum Lodd. Spartium junceum L. Tanacetum parthenium (L.)Sch.Bip. Taraxacum officinale agg.Weber Thymus vulgaris L. Tilia cordata Mill. Trigonella foenum‐graecum L. Tristerix tetrandrus Mart Tropaelum majus L. Urtica dioica L. Valeriana officinalis L. Verbascum thapsus L. Verbena litoralis H.B.K Zea mayz L. Además en el párrafo segundo de los requisitos del registro sanitario, artículo 28º, se señala: “Las solicitudes de registro sanitario deberán ser presentadas ante el Instituto, cumpliendo con los requisitos generales y especiales que se determinan en este Título. Los requisitos generales de registro comprenden aspectos administrativos, de información técnica, de calidad farmacéutica y de seguridad y eficacia clínica del producto farmacéutico a registrar, que son de común aplicación a todos los registros; por su parte, los requisitos especiales derivan de la naturaleza de ellos y de cuya procedencia y veracidad debe responsabilizarse el profesional que suscribe la solicitud”. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 9 Por su parte el artículo 40º menciona los requisitos especiales que deberán cumplir los fitofármacos, se describen en el cuadro 4. Cuadro 4: Requisitos especiales para fitofármacos. Artículo 40°: Para el registro de fitofármacos atendida su naturaleza, se tendrán en consideración las siguientes precisiones: a. La seguridad deberá ser avalada con la presentación de estudios pre‐clínicos, toxicológicos en animales y clínicos fase I, mientras que la eficacia debe ser avalada con estudios clínicos fase II y III. En los casos en que exista información proveniente de literatura oficial de los diferentes organismos internacionales o extranjeros, tales como OMS, FDA o EMEA; al momento de solicitar un registro sanitario, esta se aceptará como válida en reemplazo de la anterior. b. Las solicitudes de registro deberán ceñirse a lo establecido en los requisitos generales del registro, con las siguientes reglas especiales: b.1. No se requerirá la presentación de estudios de equivalencia terapéutica al momento de su registro o en sus posteriores modificaciones. b.2. Se deberá incluir la descripción del proceso de fabricación. b.3. Su denominación genérica corresponderá a la denominación taxonómica botánica del vegetal que aporta el o los ingredientes activos. b.4. La expresión de su fórmula cuali‐cuantitativa deberá incluir: el tipo de preparación vegetal empleada, tales como extracto seco, extracto fluido, extracto blando, polvo u otro; seguido de la o las partes del vegetal que se emplean, más su nombre científico con su concentración y su equivalencia en un marcador vegetal, cuando corresponda. b.5. No podrán incluir sustancias estupefacientes o psicotrópicas, ni mezclas con medicamentos alopáticos. b.6. La identidad y pureza de los componentes se establecerá de acuerdo con lo que dispongan las farmacopeas o las fuentes de información científica internacionales o extranjeras, debiendo presentarse la correspondiente validación de la metodología analítica propuesta. b.7. La metodología analítica para la evaluación del producto terminado así como sus materias primas deberá aparecer en alguna de las farmacopeas oficialmente aceptadas en nuestro país o en fuentes de información científica extranjeras o se deberá presentar la correspondiente validación de la metodología analítica propuesta. b.8. Deberán cumplir con las especificaciones de producto terminado de acuerdo a la forma farmacéutica en que ellos se presenten, sin embargo podrá exceptuarse la valoración del o los principios activos en el producto terminado, reemplazándose ésta por la valoración del marcador vegetal específico. b.9. No se considerarán fitofármacos los productos que contienen principios activos aislados o sintéticos, aunque sean preparados de materia prima de origen vegetal. TEXTOS OFICIALES UTILIZADOS EN EL PROCESO DE EVALUACIÓN DEL REGISTRO SANITARIO: En el proceso de evaluación del Registro Sanitario se ocupan diversos textos considerados oficiales y que dan cuenta de diferentes aspectos importantes a tener en consideración a la hora de evaluar un registro sanitario de esta naturaleza y asegurar de este modo que cumpla los requisitos de calidad, seguridad y eficacia. Monografías de calidad: Farmacopeas: En la que se encuentra la definición química, características, identificación, ensayos, valoración, conservación. Monografías de eficacia y seguridad Comisión E: La que describe definición, composición, indicación de uso, contraindicaciones, efectos adversos, interacciones, posología, método de administración, acción. Monografías de eficacia y farmacología / toxicología Monografías ESCOP: Donde aparecen advertencias, precauciones, otras formas de interacción, embarazo y lactancia, sobredosis, propiedades farmacológicas, estudios clínicos, farmacocinética, toxicidad. Monografías de calidad, eficacia y farmacología / toxicología Monografías de la OMS: La finalidad de estas monografías es favorecer la armonización en el uso de los fitofármacos en lo referente a niveles de seguridad, eficacia y control de calidad CLASIFICACIÓN DE LOS FITOFÁRMACOS Todo registro sanitario, debe tener un número y una letra que permita distinguir la categoría a la que pertenece, es así como los fitofármacos deben clasificarse de la siguiente manera: N‐Nº correlativo/año registro: distinguirá exclusivamente a fitofármacos. BIBLIOGRAFÍA: 1. 2. 3. 4. Código Sanitario, D.F.L. Nº 725/68. Reglamento de Farmacias, Droguerías, Almacenes Farmacéuticos Botiquines y Depósitos autorizados, D.S. Nº 466 de 1984. Reglamento del Sistema Nacional de Control de Productos Farmacéuticos, Alimentos de Uso Médico y Cosméticos, D.S. Nº 1.876/95. Reglamento del sistema nacional de Control de los productos farmacéuticos de uso humano, DS N°3/10. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 10 5. 6. 7. 8. 9. Fundación para la Innovación Agraria (FIA), “Como producir y procesar plantas medicinales y aromáticas de calidad”, año 2003. 10. SANDOVAL M., CARMEN. Desarrollo de los Estudios de Farmacia en Concepción (Chile), Anal. Real Academia Nacional Farmacéutica, 2002 11. The Complete German Commission E Monographs, Therapeutic Guide to Herbal Medicines, Blumrnthal, Americal Botanical Council Austin, Texas, 1998 12. Colegio Químico Farmacéutico y Bioquímico de Chile A.G., Historia de una profesión 1942 – 60 años, año 2002. 13. Monte Verde: Un asentamiento humano del pleistoceno tardío en el sur. de Chile, Santiago, LOM Ediciones, ISBN 956‐282‐659‐7, 2004. 14. Farga C, Lastra J. Plantas Medicinales de uso común en Chile, PAESMI, 1988. Modificación de los Decretos Supremos Nºs 1.876/95, 977/96 y 855/98. Resolución exenta N° 522/07 y 190/08 Fundación para la Innovación Agraria, “Agenda para la Innovación Agraria, requerimientos y acciones de Innovación para un conjunto de 15 cadenas productivas y temas de agricultura”, año 2006. WHO Monographs on Selected Medicinal Plants – Volume I, II, Geneve, World Health Organization, 2002. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 11 Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 12 ARTÍCULO ORIGINAL SAFETY PROFILE AND WOUND HEALING PROPERTIES OF A STANDARDIZED Buddleja globosa Hope (MATICO) EXTRACT IN SPRAGUE‐DAWLEY RATS María Eugenia Letelier , Rodrigo Jones , Carolina López1, Karina Palma1, Paula Aracena1,2, Iván Razmilic3, Ximena Polanco4, Hermine Vogel5 1
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Laboratory of Pharmacology and Toxicology A, Department of Pharmacological and Toxicological Chemistry, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile, Santiago, Chile. 2
Faculty of Medicine, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepción, Chile. 3
Institute of Chemistry of Natural Resources, Universidad de Talca, Talca, Chile. 4
Laboratorios Ximena Polanco, Santiago, Chile. 5
Department of Horticulture, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Talca, Talca, Chile. ABSTRACT ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Buddleja globosa Hope (matico) is a Chilean plant used by native medicine mainly in the treatment of wound healing and as an anti‐inflammatory agent. We have developed a standardized hydroalcoholic extract from matico leaves, in terms of total polyphenolic content. This extract may be useful in accelerating the wound healing process. To this end, we studied the in vivo effects of this extract in a rat model, in terms of general homeostasis. Data showed that oral treatment of adult male Sprague‐
Dawley rats with this extract, for up to 12 days, did not alter their hemogram and clinical chemistry parameters. In addition, we showed that topical treatment with the same extract was able to accelerate wound healing in these animals, most likely through shortening the inflammatory stage of the healing process. Altogether, our data demonstrate that local effects of this particular standardized matico extract are likely to retain their wound healing properties while not altering the general homeostasis of the animals. We discuss these results in terms of the possible pharmacological applications of this extract. Keywords: Buddleja – Safety – Rats, Sprague‐Dawley – Wound Healing Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ INTRODUCTION Buddleja globosa Hope (matico) is a widely used plant in Chilean traditional medicine, mainly due to its anti‐
inflammatory and wound healing properties (1‐4). In vitro studies report that active principles found in extracts from matico leaves display antioxidant activity. Noteworthy, this antioxidant activity appears to be correlated with the content of polyphenols of these extracts (5, 6). Since oxidative stress is a hallmark of inflammatory processes (7), the anti‐inflammatory activity displayed by matico extracts may be explained in terms of their antioxidant activity. Also, these extracts have been reported to promote fibroblast proliferation in vitro (4), which in addition to the antioxidant activity, may account for the wound healing properties associated with these extracts. There are several studies showing the therapeutic potential of matico extracts (1, 4, 8‐13). On the basis of these studies, it is possible to apply such therapeutic potential of matico extracts to the treatment of diverse pathologies. Nonetheless, development of phytodrugs based on these extracts first requires the use of an extract obtained through a standardized process, in order to obtain reproducible data. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Corresponding author: María Eugenia Letelier, MSc. Laboratory of Pharmacology and Toxicology A, Department of Pharmacological and Toxicological Chemistry, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile. Sergio Livingstone Pohlhammer 1007, Independencia, Santiago, Chile 8380492. Tel: 56‐2‐
9782885, Fax: 56‐2‐9782996, E‐mail: mel@ciq.uchile.cl Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 13 We have obtained a standardized hydroalcoholic extract from matico leaves, using a vegetable drug that displays reproducible total polyphenol content (14, 15). We have also shown that this matico extract behaves as an in vitro antioxidant: i) inhibiting oxygen consumption elicited by Cu2+/ascorbate, a superoxide anion generating system (6), and ii) preventing lipid peroxidation and thiol loss in rat 2+
liver microsomes exposed to Cu /ascorbate (6). In the present work, we conducted an in vivo study to assess the effects of this matico extract on the general homeostasis of a rat model. To this end, adult male Sprague‐Dawley rats were subjected to an acute treatment (up to 12 days) with the extract, administered in three oral doses per day. General homeostasis of the animals was followed in terms of hemogram and clinical chemistry data. Our study showed that this extract failed to elicit alterations of the general animal homeostasis. To evaluate that this matico extract still exhibited therapeutic potential, we assessed its ability to accelerate the wound healing process in vivo. With this purpose, we used a skin wound model in Sprague‐Dawley rats to assess the effect of topical treatment with this matico extract in wound healing time. Animals topically treated with this extract significantly decreased the wound healing time, in comparison with those that did not receive treatment. This effect was apparently due to a shortening of the inflammatory stage, as assessed by COX‐2 levels, and the acceleration of cellular proliferation rate, as evaluated with a proliferation marker (Ki‐67). We discuss the possible relationship between the antioxidant properties of this extract and the observed in vivo benefits. MATERIAL AND METHODS 1. Material. Extracts from Buddleja globosa Hope (matico) leaves were provided by the plant‐based pharmaceutical laboratory, Laboratorios Ximena Polanco (Chile). Extraction process details are proprietary information of the company. General chemical and organoleptic characteristics of these extracts are shown in Table 1. Folin‐Ciocalteu´s reagent and catechin were from Sigma‐
Aldrich (USA). Rabbit antibodies against rat and human Ki‐
67 and COX‐2 were from Affinity BioReagents (USA). All other reagents were of the best grade available. 2. Determination of total polyphenols. The total polyphenol content of the extract was determined as previously described (5), using catechin as a standard. 3. Animals. Male Sprague‐Dawley rats (200‐230g) were fed with normal pellet diet and water ad libitum, in a 12:12 light/dark cycle at 21°C. Animals were maintained in the vivarium of the Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile. All procedures were performed according to the “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” (NRC, USA). 4. Acute toxicity protocol. Dosage of the matico extract was calculated from proprietary information of Laboratorios Ximena Polanco. Doses were diluted in deionized water for oral delivery per gavage. Rats were distributed into 2 experimental groups: Control (deionized water) and matico extract (three daily doses of 18.4µmol‐
equivalents catechin/Kg). Animals were treated with the extract for up to 12 days. At different stages of treatment (detailed in the text), rats from each group were anaesthetized with ether and sacrificed by exsanguination through cardiac puncture. Blood samples were used for hemogram and clinical chemistry. This protocol was approved by the Bioethical Committee of the Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile. 5. Wound healing protocol. Rats were distributed in 2 experimental groups: Control (untreated) and Experimental (matico extract). Animals were anesthetized with i.p. ketamine and xylazine (90 and 10mg/Kg, respectively) and a 1cm skin incision was performed with a #4 blade in the dorso‐cervical area of each animal. The Experimental Group was treated topically with the matico extract, in a dose of 18.4µmol‐equivalents catechin/Kg, every 8 hours for up to 7 days. At different stages of treatment (detailed in the text), rats were sacrificed by decapitation and skin biopsies were obtained for histochemical and immunohistochemical analysis. This protocol was approved by the Bioethical Committee of the Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile. 6. Hemogram study. Hemogram parameters were determined at the Clinical Laboratory Centro Médico Baquedano (Chile). Parameters analyzed were red blood cell count (RBC), hematocrit, hemoglobin, mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular hemoglobin (MCH), mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC), and white blood cell, lymphocyte and platelet counts. 7. Clinical chemistry study. Clinical chemistry parameters were determined at the Clinical Laboratory Centro Médico Baquedano (Chile). Parameters analyzed were: calcium, phosphorus, glucose, blood ureic nitrogen, cholesterol, total protein, albumin, total bilirubin, acid phosphatase (AP), lactate dehydrogenase (LDH), and glutamyl oxaloacetic transaminase (GOT). 8. Histomorphological analyses. Hematoxylin‐eosin staining and analyses were performed in skin biopsies. These samples were also used to measure epidermal thickness at the wound area. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 14 9. Immunohistochemical analysis. COX‐2 and Ki‐67 staining (chromogenic detection) and analyses were performed in skin biopsies. Analysis for positive cells was performed in the wound area (proximal staining) and about 400μm from the wound area (distal staining). Distal staining was used as an internal control for basal COX‐2 and Ki‐67 staining. 10. Statistical Analyses. Results were analyzed on the basis of the normal distribution of data from Control rats for each parameter, which was confirmed by D’Agostino & Pearson normality test. Differences between control ranges for each hemogram and clinical chemistry parameter and ranges obtained by each treatment were analyzed by Wilcoxon Signed Rank tests. Analyses of immunochemical markers were performed using two‐way ANOVA with Bonferroni post‐test. All described statistical analyses were performed using GraphPad Prism 5.0. Significances were set at a 95% confidence level. RESULTS 1. Effects of orally administered matico extract on hemogram and clinical chemistry. Throughout the entire treatment with the matico extract, all hemogram parameters remained unchanged and within normal (control) ranges, as assessed by Wilcoxon Signed Rank tests (p>0.05). Table 2 summarizes these findings, including hemogram data found at the end of each study. Most clinical chemistry parameters also remained unchanged throughout all treatments (p>0.05). These data are summarized in Table 3, which includes results obtained at the end of each study. According to Wilcoxon Signed Rank tests, plasma lactate dehydrogenase (LDH) and aspartate aminotransferase (GOT) were significantly decreased (p<0.05, Table 3) following treatment with the matico extract. 2. Wound healing study 2.1. Macroscopic observations and tissue morphology. Macroscopic progression of the wound healing process during the 7‐day protocol employed is shown in Figure 1. Wound healing of animals treated topically with the matico extract appears to progress at a higher speed than that of untreated animals (Figure 1). Skin biopsies were obtained at different stages of the protocol for histomorphological and immunohistochemical analyses in order to further assess differences between untreated and treated animals. Figure 2 shows hematoxylin‐eosin staining daily images of skin biopsies. This staining demonstrated that there is a significant increase in fibroblast infiltration in the animals treated topically with the extract (arrowheads in Figure 2). This leads to an acceleration of the wound healing that is evident even at the first day of the process. Table 1. Characterization of the matico extract 2.2. Immunohistochemical analyses. We used COX‐2 as an inflammation marker and Ki‐67 as a proliferation marker. To evaluate changes in levels of these markers, the values displayed at 400µm from the wound area (distal) were used as basal expression levels. Figure 3 (COX‐2) and Figure 4 (Ki‐67) show the difference in expression between the proximal (at the wound) and distal areas. COX‐2 levels displayed a peak that was reached at 24 hours following wounding the animals undergoing treatment with the matico extract. This COX‐2 peak was reached at 48 hours in the case of animals without treatment (Figure 3). Noteworthy, COX‐2 levels at the end of the study with the matico extract was significantly lower (p<0.05) than that of untreated animals (p<0.05). Figure 4 shows that Ki‐67 positive nuclei also display peaks at 24 and 48 hours for treated and untreated animals, respectively. Finally, we measured epidermis thickness in animals treated or not with the matico extract. As shown in Figure 5, thickness of the epidermal layer increased in time following wounding of the animals, reaching a maximum after 2 or 3 days in the cases of treated or untreated animals, respectively. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 15 Table 2. Hemogram data following treatment of rats with a standardized matico extract. Table 3. Clinical chemistry data following treatment of rats with a standardized matico extract. Data were obtained from blood samples of 4‐12 rats per group following treatment of animals with the matico extract for 12 days, as detailed in Material and Methods. Ranges presented correspond to the 95% confidence intervals for each parameter. RBC: Red blood cells; MCV: mean corpuscular volume; MCH: mean corpuscular hemoglobin; MCHC: mean corpuscular hemoglobin concentration; ESR: erythrocyte sedimentation rate. p values were obtained from Wilcoxon Signed‐Rank analyses for each parameter. DISCUSSION In order to propose the use of an herbal extract as a therapeutic strategy, several steps must be taken to ensure the safety and efficacy of such extract. Matico extracts have been widely used by Chilean traditional medicine in anti‐inflammatory and wound healing therapies. We have standardized a hydroalcoholic extract from matico leaves, in terms of total polyphenol content. This extract displays reproducible antioxidant properties in biological systems in vitro, as we have previously described (6). The present work was aimed to establish the safety of oral treatment with this matico extract, using an acute toxicity rat model. To this end, we assessed general animal homeostasis, by evaluating hemogram and clinical chemistry at different stages of a 12‐day treatment. Noteworthy, we used a high dose of extract (55.2µmol‐
equivalents of catechin/Kg/day), considering proprietary information from the manufacturer. Data were obtained from serum samples of 4‐12 rats per group following treatment with the extract for 12 days, as detailed in Material and Methods. Ranges presented correspond to the 95% confidence intervals for each parameter. AP: alkaline phosphatase; LDH: lactate dehydrogenase; GOT: aspartate aminotransferase. p values were obtained from Wilcoxon Signed‐Rank analyses for each parameter. *p<0.05 compared to control. This treatment led to negligible changes in general homeostasis, with the exception of a decrease in plasma activities of LDH and GOT. These activities are usually considered as markers of hepatic damage, due to their release to the blood stream from damaged tissue. Thus, their decrease may be the consequence of hepatoprotection provided by this matico extract. It is possible this protection is the result of the antioxidant activity of this extract, as it has been shown for other herbal extracts displaying activities as hepatoprotectors (16, 17). We are currently testing this hypothesis. We also assessed whether the matico extract retained its therapeutic properties. To this end, we evaluated its wound healing properties in a rat model when topically administered. We found no evident adverse effects on the skin of animals topically treated with the extract. Moreover, the extract led to acceleration of the wound healing process that was evident not only macroscopically but also in terms of tissue morphology, and inflammation and proliferation markers. Taken together, our data show that the hydroalcoholic matico extract most likely led to the acceleration of the inflammatory phase, which was accompanied with an acceleration of the proliferation Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 16 phase of wound healing. This process may be associated with the redox state of the skin tissue, since defects in wound repair of skin tissue, usually leading to keloid formation, have been associated to excessive or uncontrolled oxidative stress (18). Our data show that untreated animals displayed delayed wound repair, as assessed by measuring epidermal thickness. Taken together, these results may indicate that the antioxidant nature of the matico extract is likely minimizing oxidative stress processes during wound healing, which leads to a faster repair of the skin. Figure 1. Effect of the matico extract on the macroscopic progression of skin wound healing. Animals subjected to a skin wound protocol were treated topically with the standardized matico extract in three daily doses, as detailed in Material and Methods. Representative photo images (n=4) of untreated (top row) and treated (bottom row) animals are shown, taken at the beginning (Initial) and 2 or 7 days of the treatment. In summary, the standardized hydroalcoholic matico extract was found to be safe and retained its wound healing properties in a rat model. The extract appears to be safe when orally or topically administered, even at a dose higher than that recommended by the manufacturer. This is of particular relevance for herbal extracts, which are mainly administered either orally or topically in traditional medicine. Moreover, it is very possible that the mechanisms underlying these properties are associated to its high content of polyphenols, compounds of acknowledged antioxidant activity. This local effect of the matico extract can be exploited for the treatment other conditions for which matico extracts have been employed for millennia, such as a local anti‐inflammatory agent. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 17 Figure 2. Effect of the matico extract on the skin tissue morphology during the progression of wound healing. Skin biopsies from animals subjected to the wound healing protocol were stained with hematoxylin‐eosin for analysis of tissue morphology, as detailed in Material and Methods. Representative images (n=4) of untreated (top row) and treated (bottom row) of stained biopsies are shown, at different stages of the treatment, as depicted at the top. Arrowheads indicate the sites were cellular proliferation can be observed at the wound region. Figure 3. Effect of the matico extract on skin COX‐2 levels during the progression of wound healing. Figure 4. Effect of the matico extract on skin Ki‐67 levels during the progression of wound healing. Skin biopsies were obtained at different stages of the wound healing protocol and stained with a COX‐2 antibody, as detailed in Material and Methods. Presence of COX‐2 positive cells was recorded at the wound site (proximal region) or at 400 m from the wound site (distal region). Data represent the fold change in the difference of COX‐2 positive cells (proximal minus distal regions), considering the difference observed at the beginning of the treatment as the unit. Data correspond to the mean of at least 4 independent experiments ± SEM. *p<0.05 compared to samples from untreated animals, as evaluated by two‐way ANOVA and Bonferroni post‐test. Skin biopsies were obtained at different stages of the wound healing protocol and stained with a Ki‐67 antibody, as detailed in Material and Methods. Presence of Ki‐67 positive nuclei was recorded at the wound site (proximal region) or at 400 m from the wound site (distal region). Data represent the fold change in the difference of Ki‐67 positive nuclei (proximal minus distal regions), considering the difference observed at the beginning of the treatment as the unit. Data correspond to the mean of at least 4 independent experiments ± SEM. *p<0.05 compared to samples from untreated animals, as evaluated by two‐way ANOVA and Bonferroni post‐test. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 18 5. LETELIER ME, CORTES JF, LEPE AM, JARA JA, MOLINA‐BERRIOS A, RODRIGUEZ C et al. Evaluation of the antioxidant properties and effects on the biotransformation of commercial herbal preparations using rat liver endoplasmic reticulum. Bol Latinoam Caribe Plantas Med Aromat. 2009; 8:110‐120. Figure 5. Effect of the matico extract on epidermal thickness during the progression of wound healing. 6. LETELIER ME, MOLINA‐BERRIOS A, CORTES‐TRONCOSO J, JARA‐
SANDOVAL J, HOLST M, PALMA K et al. DPPH and oxygen free radicals as pro‐oxidant of biomolecules. Toxicol In Vitro 2008; 22:279‐286. 7. DE LA VILLEHUCHET AM, BRACK M, DREYFUS G, OUSSAR Y, BONNEFONT‐ROUSSELOT D, CHAPMAN MJ et al. A machine‐learning approach to the prediction of oxidative stress in chronic inflammatory disease. Redox Rep. 2009; 14:23‐33. 8. BACKHOUSE N, DELPORTE C, APABLAZA C, FARIAS M, GOITY L, ARRAU S, et al. Antinociceptive activity of Buddleja globosa (matico) in several models of pain. J Ethnopharmacol. 2008: 119:160‐165. Skin biopsies were obtained at different stages of the wound healing protocol and stained with hematoxylin‐eosin, as in Figure 2. Data represent the fold change in the difference skin thickness (proximal minus distal regions), considering the difference observed at the beginning of the treatment as the unit. Data correspond to the mean of at least 4 independent experiments ± SEM. *p<0.05 compared to samples from untreated animals, as evaluated by two‐way ANOVA and Bonferroni post‐
test. 9. HOUGHTON PJ. Ethnopharmacology of some Buddleja species. J Ethnopharmacol. 1984; 11:293‐308. 10. LIAO YH, HOUGHTON PJ, HOULT JR. Novel and known constituents from Buddleja species and their activity against leukocyte eicosanoid generation. J Nat Prod. 1999; 62:1241‐1245. 11. MENSAH AY, HOUGHTON PJ, BLOOMFIELD S, VLIETINCK A, VANDEN BERGHE D. Known and novel terpenes from Buddleja globosa displaying selective antifungal activity against dermatophytes J Nat Prod. 2000; 63:1210‐1213. 12. MENSAH AY, SAMPSON J, HOUGHTON PJ, HYLANDS PJ, WESTBROOK J, DUNN M et al. Effects of Buddleja globosa leaf and its constituents relevant to wound healing. J Ethnopharmacol. 2001; 77:219‐226. ACKNOWLEDGMENTS This work was supported by the Agricultural Innovation Fund grant #FIA‐ES‐C‐2005‐1‐A‐042. 13. PARDO F, PERICH F, VILLARROEL L, TORRES R. Isolation of verbascoside, an antimicrobial constituent of Buddleja globosa leaves. J Ethnopharmacol. 1993; 39:221‐222. The authors declare no conflicts of interest. 14. VOGEL H, RAZMILIC I, POLANCO X, LETELIER ME. Effect of different provenances and production conditions on antioxidant properties in Buddleja globosa leaves. Bol Latinoam Caribe Plantas Med Aromat. 2010; 9:333‐342. REFERENCES: 1. BACKHOUSE N, ROSALES L, APABLAZA C, GOITY L, ERAZO S, NEGRETE R et al. Analgesic, anti‐inflammatory and antioxidant properties of Buddleja globosa, Buddlejaceae, J Ethnopharmacol. 2008; 116:263‐269. 15. VOGEL H, JELDRES P, RAZMILIC I, DOLL U. Morphological characters, yields and active principles in wild and cultivated accessions of the Chilean medicinal plant Buddleja globosa Hope. Indust Crops Prod. 2011; 34:1322‐1326. 2. DOLL U, VOGEL H, JELDRES P, MUÑOZ M. Estudios de Propagación Vegetativa en Matico (Buddleja globosa). Ciencia e Investigación Agraria: Revista Latinoamericana de Ciencias de la Agricultura 2003; 30:211‐216. 16. VOGEL H, GONZALEZ M, FAINI F, RAZMILIC I, RODRIGUEZ J, MARTIN JS et al. 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Chile (2012) 5(2): 20 ARTÍCULO ORIGINAL USO DE MODELOS ANIMALES EN EL ESTUDIO DE PLANTAS MEDICINALES CON PROPIEDADES ANSIOLÍTICAS Y ANTIDEPRESIVAS. (The use of animal models in the study of the anxiolytic and antidepressant properties of medicinal plants) Gabriela Díaz‐Véliz, M.Sc., M.Ed. y Sergio Mora, Q.F. Laboratorio de Farmacología del Comportamiento. Programa de Farmacología Molecular y Clínica, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina. Universidad de Chile. RESUMEN ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ La limitada eficacia de los fármacos actualmente en uso para tratar algunos trastornos de ansiedad y depresión ha despertado el interés en la búsqueda de nuevas herramientas terapéuticas en el campo de las plantas medicinales, usadas como tales en le medicina popular. En el presente trabajo se evaluaron las propiedades tipo ansiolítico y/o tipo antidepresivo de tres plantas autóctonas de Latinoamérica, recurriendo a la aplicación de modelos de ansiedad y depresión en ratas. La administración intraperitoneal de Annona muricata provocó efectos ansiolíticos y antidepresivos, Salvia elegans produjo efectos sedantes y antidepresivos, mientras que Acantolippia deserticola demostró propiedades ansiolíticas. Los resultados permiten validar el uso popular de las plantas estudiadas. Palabras Claves: ansiedad, depresión, plantas medicinales, modelos animales, laberinto en cruz elevado, natación forzada. Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ INTRODUCCIÓN La ansiedad y la depresión son consideradas estados emocionales normales que contribuyen a la adaptación y la supervivencia. Sin embargo, constituyen también los trastornos psiquiátricos más frecuentes en la población. Se estima que más del 20% de los adultos sufren de estos trastornos en algún periodo de sus vidas (Buller, B., 2001). La Organización Mundial de la Salud (WHO, 1999) ha predicho que, en el año 2020, la depresión se convertirá en la segunda causa de muerte prematura o incapacidad laboral. A mediados del siglo XX, gracias a numerosos descubrimientos científicos, fue posible disponer de fármacos de acción más selectiva sobre ansiedad y depresión patológicas, lo cual permitió mejorar significativamente la calidad de vida de los pacientes psiquiátricos. Sin embargo, después del gran entusiasmo original, la medicina basada en evidencia se ha enfrentado a muchas desilusiones. Aproximadamente dos tercios de los pacientes ansiosos o deprimidos responden a los tratamientos disponibles en la actualidad aunque la magnitud de la mejoría no siempre es satisfactoria. En los últimos 20 años no se han obtenido fármacos más eficaces que las benzodiacepinas o los antidepresivos inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina. En el campo del tratamiento de la ansiedad, las benzodiacepinas, usadas como tratamiento de primera elección en estados de ansiedad aguda, fallan en estados de ansiedad crónica y han sido paulatinamente desplazadas por los antidepresivos que no solo son eficaces en el tratamiento de la depresión sino que también en el tratamiento a largo plazo de trastornos de ansiedad. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Correspondencia a: Gabriela Díaz‐Véliz, Laboratorio de Farmacología del Comportamiento. Programa de Farmacología Molecular y Clínica, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Av. Salvador 486, teléfono 2741560, fax 2741628, email gdiaz@med.uchile.cl Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 21 Debido a la limitada eficacia, acompañada de numerosas reacciones adversas, de los fármacos ansiolíticos y antidepresivos actualmente en uso, ha surgido la necesidad de desarrollar medicamentos más nuevos, más eficaces y mejor tolerados. Esto ha llevado a que, en los años recientes, se haya reactivado el interés en los productos herbarios como medicinas alternativas o complementarias en el tratamiento de trastornos psiquiátricos. Existe la sensación que algunas de las drogas naturales que fueron injusta e innecesariamente desechadas han vuelto lentamente (Babic, D., 2007). La medicina popular de muchas regiones del mundo ha recurrido desde siempre a las plantas medicinales para aliviar trastornos afectivos o emocionales. Además, la búsqueda y desarrollo de nuevas terapias de trastornos psiquiátricos basadas en plantas medicinales ha progresado significativamente en las últimas décadas (Zhang, Z.J., 2004). Esto se ha visto reflejado en el creciente número de productos herbáceos que han sido introducidos en la práctica psiquiátrica y en el gran número de plantas medicinales cuyo potencial terapéutico ha sido demostrado en una variedad de modelos experimentales de psicopatologías (Zhang, Z.J., 2004). La utilización de los modelos animales ha servido no solo como método de tamizaje de plantas potencialmente eficaces y seguras, sino que también permite validar científicamente el uso en medicina popular de estos productos. En nuestro laboratorio de Farmacología del Comportamiento, hemos estado interesados en verificar las potenciales propiedades ansiolíticas y/o antidepresivas de plantas medicinales autóctonas de Latinoamérica, recurriendo a la aplicación de modelos animales previamente validados en la literatura científica. En el presente estudio se muestran los resultados obtenidos con tres extractos hidroalcohólicos de plantas de diferente procedencia geográfica: Annona muricata (Costa Rica), Salvia elegans (México) y Acantholippia desertícola (Chile). MATERIALES Y MÉTODOS 1. Plantas empleadas: 1.1. Annona muricata (Annonaceae), “guanabana” o “graviola”, es un árbol de hoja perenne endémico del Caribe, México, Centro y Sudamérica, estrechamente relacionado con la chirimoya. En los últimos años, el extracto de guanábana ha sido ampliamente aclamado como posible agente anticancerígeno (Monografía Graviola). Recientes estudios apoyan los efectos antitumorogénicos y antimetastásicos de esta planta (Torres, M.P., 2012; George, V.C., 2012). Los frutos y las hojas de Annona muricata son usados en medicina tradicional por sus propiedades tranquilizantes y sedantes. Además, se ha sugerido que el fruto de esta planta posee efectos antidepresivos posiblemente inducidos por alcaloides isoquinolínicos agonistas de receptores 5HT1A (Hasrat, J.A., 1997). 1.2 Salvia elegans (Lamiaceae), “mirto”, “perritos rojos”, “limoncillo” o “flor del cerro”, es un arbusto perenne nativo de México ampliamente usado en medicina tradicional. Sus partes aéreas se emplean para aliviar trastornos del sistema nervioso central y se le denomina como “tónico del sistema nervioso para liberar estrés y tensión” (Aguilar, A., 1994). 1.3 Acantholippia desertícola (Verbenaceae), “rica‐rica”, es un arbusto menor muy aromático que crece abundantemente en el norte de Chile (2800‐4000 msm). En los pueblos altiplánicos (San Pedro de Atacama, Toconao, Socaire) se utilizan sus ramas y hojas para tratar dolores estomacales, problemas renales y trastornos circulatorios (MHT). Diversas especies del genero Acantholippia han sido usados en medicina popular por sus efectos analgésicos, antiinflamatorios y afrodisiacos (Gómez, R., 1991). Estudios preliminares sugieren propiedades ansiolíticas del infuso de A. desertícola y de sus aceites esenciales (Leoncini., R., 2006). 2. Animales: En los experimentos conductuales se utilizaron ratas Sprague Dawley machos (200‐250 g de peso) procedentes del Bioterio del Programa de Fisiopatología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Estos animales fueron mantenidos en grupos de 6 por caja con libre acceso a comida y agua, temperatura de 22 ± 1 C y ciclo luz/oscuridad de 12/12 horas. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Bioética en Investigación Animal de la Facultad de Medicina, Universidad de Chile. 3. Tratamiento: Los extractos liofilizados de A. muricata, S. elegans y A. desertícola fueron disueltos en agua bidestilada y administrados a las ratas por vía intraperitoneal (ip) en dosis de 12,5, 25 y 50 mg/kg. Diazepam, 1 mg/kg ip, fue usado como ansiolítico de referencia (control positivo), mientras que fluoxetina, 10 mg/kg ip, e imipramina, 12,5 mg/kg ip, fueron utilizados como antidepresivos de referencia. Se administró agua bidestilada (1 ml/kg) como control negativo. 4. Ensayos conductuales 4.1 Monitoreo de la actividad motora espontánea. El registro de la actividad motora espontánea es fundamental para tener una primera aproximación de los eventuales efectos conductuales de una droga desconocida. Esto permite evaluar la respuesta del animal al ser expuesto a un ambiente desconocido donde, según el tratamiento o estado basal, puede desarrollar hipo o hipermotilidad. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 22 Treinta minutos después de la inyección ip, cada rata fue colocada en una caja de acrílico transparente (30 cm x 30 cm x 30 cm) al interior de una cámara aislada de sonido. La caja se colocó sobre una plataforma de actividad (Lafayette Instruments Co., USA) conectada a un amplificador y un contador electromecánico que registraba la motilidad total del animal. El periodo de observación total fue de 30 min, durante el cual se anotó la conducta cada 5 min para tener un registro de la evolución de la actividad motora a través del tiempo. Los resultados se expresan como numero de cuentas durante los 30 min de observación. 4.2 Modelo Animal de Ansiedad laberinto en cruz elevado. Este ensayo ha sido ampliamente validado para medir ansiedad en roedores (Pellow S., 1985; Lister, R.G., 1987). Se basa en la aversión que sienten estos animales por los espacios abiertos y en altura. Se utiliza un aparato en forma de cruz, formado por dos brazos abiertos (50 cm x 10 cm), dos brazos cerrados (50 cm x 10 cm x 40 cm) y una plataforma central (10 cm x 10 cm), dispuesto de tal manera que los brazos del mismo tipo se oponen entre si. El laberinto, construido en acrílico negro, está situado a una altura de 70 cm desde el piso. Una hora después de la inyección ip, cada animal fue colocado en el centro del laberinto, enfrentado a uno de los brazos cerrados. Durante 5 minutos se registra el número de entradas a los brazos abiertos y cerrados del laberinto y el tiempo de permanencia en cada uno de estos brazos (Pellow, S., 1986). La entrada a cada brazo se define como el momento en que el animal coloca las cuatro patas en el brazo respectivo. Los resultados se expresan como porcentaje de entradas a los brazos abiertos y porcentaje de tiempo de permanencia en estos brazos. El aumento de la exploración y la mayor permanencia en los brazos abiertos se consideran como reflejo de una actividad farmacológica tipo ansiolítica. 4.3 Modelo Animal de Depresión de Natación Forzada. Este es, probablemente, el modelo farmacológico más utilizado para evaluar actividad antidepresiva (Cryan, J.F., 2002). Se basa en el principio de la desesperanza aprendida, que establece que todo organismo que es sometido a un evento estresante que no puede controlar y del cual no puede escapar desarrolla, inicialmente, ansiedad y posteriormente, si el evento se mantiene en el tiempo, depresión. Cuando los roedores son colocados en un cilindro con agua, al cabo de cierto tiempo desarrollan inmovilidad la cual reflejaría la cesación de la conducta orientada al escape. El método fue originalmente desarrollado por Porsolt (1977) y modificado por Lucky (1997). El aparato consiste en un cilindro de acrílico transparente (50 cm de alto x 20 cm de diámetro) que se completa hasta los 30 cm de altura con agua a temperatura ambiente (25°C). Habitualmente el ensayo se realiza en dos días; durante el primero, se realiza el entrenamiento o aprendizaje, en el que cada animal es colocado durante 15 minutos en el cilindro, 24 horas antes del ensayo de natación. La droga a ensayar se administra en tres ocasiones: inmediatamente después del periodo de entrenamiento de 15 minutos, 6 y 0,5 horas antes del ensayo de natación. Este último tiene una duración de 5 minutos, tiempo en el cual un observador entrenado mide la duración en segundos de la conducta de escalamiento, definida como el movimiento hacia delante de las patas anteriores sobre las paredes de la cámara, la conducta de natación, definida como el movimiento de desplazamiento en la cámara de natación, incluyendo el cruce de un cuadrante a otro y la inmovilidad, considerada cuando el animal no hace mayores intentos por escapar, excepto los movimientos necesarios para mantener el hocico fuera del agua. Los resultados se expresan en términos de porcentajes de tiempo gastados en escalamiento, natación e inmovilidad. Los aumentos en la duración de las conductas activas, escalamiento y natación, y la consiguiente disminución del tiempo de inmovilidad son considerados como perfiles consistentes con un efecto tipo antidepresivo (Cryan, J.F., 2002). 5. Estadística: Los datos se expresan como el promedio ± error estándar (ES) de 8 a 11 ratas por cada dosis inyectada. Las comparaciones estadísticas entre grupos se hicieron aplicando un ensayo de ANOVA seguido del ensayo a posteriori de Newman‐Keuls. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando p fue igual o menor de 0,05. Tabla 1. Actividad motora espontánea Los datos corresponden al promedio ± ES de 8‐11 ratas en cada dosis inyectada. * p<0,001 comparado con los controles inyectados con agua (ANOVA seguido de Newman‐Keuls para comparaciones múltiples). RESULTADOS Actividad motora espontánea: En la Tabla 1 se muestran los efectos de la administración de los extractos de A. desertícola, A. muricata y S. elegans, sobre la actividad motora espontánea de la rata, comparada con el solvente (agua bidestilada). Todas las dosis de S. elegans produjeron una significativa disminución de la actividad motora sin que se estableciera una relación dosis efecto. Por su parte, los extractos de A. desertícola y A. muricata solo produjeron una disminución significativa de la motilidad con la administración de la dosis más alta (50 mg/kg). Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 23 Exploración del laberinto en cruz elevado: En la figura 1 se presentan los efectos de A. Muricata y A desertícola en el ensayo del laberinto en cruz elevado (LCE). Ambos extractos aumentaron la exploración y la permanencia en los brazos abiertos del LCE. Todas las dosis administradas produjeron efectos significativos sobre estos parámetros conductuales y no se apreciaron diferencias significativas con respecto a los efectos inducidos por diazepam 1 mg/kg. Respecto al extracto de S. elegans, éste no indujo efectos significativos sobre la exploración del LCE. Figura 1. Ensayo de natación forzada: En Tabla 2 se pueden apreciar los efectos de los extractos de las plantas estudiadas, fluoxetina e imipramina sobre la duración de las conductas activas, escalamiento y natación, y sobre el tiempo de inmovilidad en el ensayo de natación forzada. Los extractos de A. muricata y S. elegans produjeron una disminución significativa del tiempo de inmovilidad, de manera similar a fluoxetina e imipramina, acompañada de un aumento significativo de la conducta de natación, semejante al inducido por fluoxetina. La conducta de escalamiento, que aumentó con imipramina, no fue modificada significativamente por ninguno de los extractos. Además, se observa que el extracto de A. desertícola no produjo efectos significativos sobre ninguna de las conductas relacionadas con el ensayo de natación forzada. Tabla 2. Ensayo de nado forzado para evaluar efecto antidepresivo. Ensayo de Laberinto en Cruz Elevado para evaluar efecto ansiolítico. Efecto de los extractos de plantas y diazepam sobre el porcentaje de entradas a los brazos abiertos del laberinto y sobre el porcentaje de tiempo de permanencia en ellos. Los datos corresponden al promedio ± ES de 8‐11 ratas en cada dosis inyectada. * p<0,05 comparado con los controles inyectados con agua (ANOVA seguido de Newman‐Keuls para comparaciones múltiples). Los datos corresponden al promedio ± ES de 8‐11 ratas en cada dosis inyectada. * p<0,05 comparado con los controles inyectados con agua (ANOVA seguido de Newman‐Keuls para comparaciones múltiples). Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 24 DISCUSIÓN En el presente estudio se investigaron los efectos de tres extractos de hojas provenientes de plantas autóctonas de Latinoamérica utilizadas en medicina popular por sus propiedades tranquilizantes y antidepresivas, Annona muricata, Acantholippia desertícola y Salvia elegans. Los resultados del monitoreo de la actividad motora espontánea mostraron marcados efectos depresores en ratas, después de la administración aguda de dosis únicas de 12,5, 25 y 50 mg/kg del extracto de S. elegans, demostrando el notable efecto sedante de esta planta. En cambio, los extractos de A. desertícola y A. muricata disminuyeron significativamente la motilidad solo con la dosis más alta utilizada, es decir 50 mg/kg. A pesar de sus significativos efectos sedantes, el extracto de S. elegans no demostró efectos tipo ansiolítico en el modelo del laberinto en cruz elevado, mientras que los extractos de A. muricata y A. desertícola aumentaron significativamente tanto las entradas como la permanencia en los brazos abiertos del laberinto aun luego de dosis que carecían de efecto depresor sobre la actividad motora. Estos datos sugieren que el modelo animal de ansiedad utilizado en este estudio, el laberinto en cruz elevado, es capaz de discriminar entre efectos sedantes y ansiolíticos. Desconocemos el mecanismo por el cual se producen los efectos ansiolíticos de estas plantas; sin embargo, considerando que el laberinto en cruz ha demostrado ser un buen modelo para evaluar ansiolíticos benzodiacepínicos, como diazepam, podríamos sugerir la mediación del aminoácido GABA en dichos efectos. El modelo de depresión utilizado en este trabajo, la natación forzada, permitió identificar efectos tipo antidepresivo luego de la administración de los extractos de A. muricata y S. elegans. Todas las dosis de ambos extractos disminuyeron el tiempo de inmovilidad y, simultáneamente, aumentaron la conducta de natación sin afectar la conducta de escalamiento. El perfil de los efectos conductuales de los extractos en el ensayo de natación forzada es compatible con el perfil del antidepresivo de referencia fluoxetina. En efecto, tal como había sido observado anteriormente (Page M.E. 1999), la disminución de la inmovilidad inducida por fluoxetina era acompañada por un aumento de la natación, mientras que la conducta de escalamiento no fue afectada por esta droga. Se ha demostrado que la natación en la rata es una conducta sensible a fármacos serotoninérgicos, tales como fluoxetina, inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina. En cambio, la conducta de escalamiento es más sensible a fármacos con acción selectiva sobre la transmisión catecolaminérgica, tales como los antidepresivos tricíclicos del tipo imipramina (Detke, M.J., 1995; Cryan, J.F., 2000). En consecuencia, el modelo de natación forzada permite sugerir la participación de mecanismos serotoninérgicos en los efectos tipo antidepresivos de A. muricata y S. elegans, aunque, obviamente, se requieren otro tipo de estudios para confirmar este mecanismo de acción. En nuestro laboratorio hemos demostrado los posibles efectos antidepresivos de otras plantas aplicando el mismo ensayo de natación forzada. Por ejemplo Casimiroa edulis (Rutaceae) cuyo efecto anti‐inmovilidad va acompañado de aumento del escalamiento y no de la natación (Mora, S., 2005a) y Aloysia polystachya (Verbenaceae) que, junto con disminuir la inmovilidad, aumenta la duración de las dos conductas activas, escalamiento y natación (Mora, S., 2005b). En conclusión, la aplicación de modelos animales nos ha permitido identificar las propiedades psicotrópicas de tres plantas medicinales de uso muy frecuente en la población y, en consecuencia, validar en forma objetiva su uso en el tratamiento de trastornos emocionales como la ansiedad y la depresión. Salvia elegans parece poseer potentes efectos sedantes y antidepresivos, mientras que, Acantholippia desertícola demostró interesantes propiedades tipo ansiolítico en dosis que no provocan sedación y, finalmente, Annona muricata resultó activa como ansiolítico y como antidepresivo, incluso en dosis que no deprimen la actividad motora. Sin duda, se requieren mayores estudios preclínicos para confirmar o extender estos resultado y para evaluar el riesgo de potenciales reacciones adversas en humanos. En la literatura científica se han descrito numerosas plantas usadas en medicina popular como ansiolíticos o antidepresivos. Además, un porcentaje importante de la población recurre a estos productos para aliviar síntomas psiquiátricos con la creencia que por ser “naturales” son alternativas más seguras que los medicamentos psicotrópicos comúnmente usados. Sin embargo, las plantas pueden producir reacciones adversas potencialmente graves o interactuar con otros medicamentos. Probablemente, con la excepción del Hypericum perforatum (hierba de San Juan) para tratar la depresión, Ginkgo biloba, utilizado para deterioros orgánicos cerebrales y Piper methysticum (Kava‐kava), usado como ansiolítico, se considera que la actual evidencia científica es insuficiente para asegurar la eficacia y la seguridad en las demás especies informadas (Medina E.). En muchos casos se continúan realizando investigaciones farmacológicas y clínicas que deberían aumentar nuestro conocimiento en este ámbito y permitirán obtener nuevas herramientas terapéuticas que substituyan o complementen los fármacos actualmente en uso para tratar los trastornos psiquiátricos. Quizás, en un futuro no tan lejanos, el uso de plantas medicinales en Psiquiatría no será visto como algo excepcional. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 25 BIBLIOGRAFÍA: Aguilar A., Camacho J.R., Chino S., Vasquez P., López P. (1994) HerbarioMedicinal del Instituto Mexicano del Seguro Social. 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Morales, C., Poletti, C., De Lima, T.C.M., Herrera‐Ruiz, M., Tortoriello, J. (2005a). Central Nervous System activity of the hydroalcoholic extract of Casimiroa edulis in rats and mice. Pharmacol. Biochem. Behav. 97, 191‐197. Mora, S., Díaz‐Véliz, G., Millán, R., Lungenstrass, H., Quiros, S., Coto‐
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Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 26 ARTÍCULO ORIGINAL ESTUDIO DE UN EXTRACTO ESTANDARIZADO DE MAQUI RICO EN DELFINIDINAS EN EL MANTENIMIENTO DEL BALANCE DE GLUCOSA. (Studies of a standardized extract of Maqui fruit rich in delphinidins in the maintenance of glucose balance) 1
1
Evelyn Jara ,Ph.D, Jorge Hidalgo ,M.D., Carlos Flores2,Ph.D, Moisés Pérez3 B.Q., Alejandro Yáñez3,Ph.D, Angélica Hidalgo1,Ph.D, Luis Quiñones4,Ph.D, Juan Luis Hancke1,Ph.D, Rafael Burgos1,M.V.,M.Sc 2
1
Instituto de Farmacología y Morfofisiología, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. Centro de Estudios Científicos (CECS), Avenida Arturo 3
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Prat 514, Valdivia 5110466, Chile. Instituto de Bioquímica y Microbiología, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. CQF, Centro de Investigaciones Farmacológicas y Toxicológicas ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile. RESUMEN ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Las antocianinas son polifenoles con actividad antioxidante, a las cuales se les ha atribuido una serie de actividades biológicas beneficiosas para la salud humana, las cuales incluyen prevención o reducción del riesgo de enfermedad cardiovascular, diabetes mellitus (DM), artritis y cáncer. En este trabajo se muestra que un extracto estandarizado de Maqui rico en delfinidinas, disminuye los niveles basales de glucosa sanguínea después de 4 meses de tratamiento en un modelo de ratas diabéticas inducido por inyección de estreptozotocina (STZ). Igualmente, este extracto fue capaz de aumentar la sensibilidad a glucosa cuando fue sometido a evaluación en una prueba de tolerancia a la glucosa en ratas diabéticas. Además, en un estudio piloto fase I, el extracto rico en delfinidinas disminuyó la glucosa postprandial y la insulina en pacientes con tolerancia a la glucosa alterada, modificando la forma de las curvas de insulina y glucosa, sugiriendo su uso potencial para pacientes prediabéticos, así como en enfermedades asociadas al metabolismo de carbohidratos. Finalmente, delfinidina, la principal molécula presente en el extracto estandarizado de Maqui, inhibió el transporte de glucosa dependiente de sodio (Na+), lo cual explicaría en parte la disminución de la concentración de glucosa sanguínea en ratas diabéticas inducidas con STZ y en pacientes prediabéticos. Palabras Claves: Antocianinas, Diabetes Mellitus, Test de Tolerancia a la Glucosa. Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ INTRODUCCIÓN La investigación sobre la composición y actividad biológica de frutas y vegetales ha establecido que la ingesta de éstas posee un gran impacto sobre la salud humana, bienestar y la prevención de varias enfermedades [1]. Estas últimas incluyen enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas y otras asociadas con envejecimiento, obesidad y ciertos tipos de cáncer, como esofagial y digestivo [2]. Aunque muchas frutas y vegetales contienen micro y macro nutrientes que incluyen vitaminas, minerales, folato y fibra, sus propiedades biológicas son principalmente debido al alto contenido de polifenoles presentes en ellas. Éstos, están constituidos por flavonoides (antocianinas, flavonoles y flavonoides), taninas condensadas (proantocianidinas), taninas hidrolizables (elagitaninos y galotaninos) y ácidos fenólicos [3]. Dentro de los polifenoles, son las antocianinas las cuales han demostrado poderosos efectos antioxidantes, anticarcinogénicos y antiinflamatorios [4–7]. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Correspondencia a: Dra. Evelyn Jara, Laboratorio de Farmacología Molecular, Instituto de Farmacología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, P.O. Box 567, Valdivia, Chile. Correo Electrónico: jaraevelyn@gmail.com Abreviaciones: Estreptozotocina (STZ), Diabetes Mellitus (DM), Test de Tolerancia Oral a la Glucosa (OGTT) Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 27 Los compuestos fenólicos presentes en berries son bien conocidos por su capacidad antioxidante [8]. De hecho, éstos pueden regular la actividad de enzimas que metabolizan y modulan receptores nucleares, expresión génica y vías de señalización, así como la reparación del daño oxidativo del DNA [8,9]. Aunque las acciones de los berries han sido estudiadas in vitro, sus polifenoles son pobremente absorbidos [10,11]. Sin embargo, éstos pueden ser metabolizados y convertidos por la microflora del colon en otras moléculas relacionadas que pueden persistir in vivo y acumularse en los tejidos, contribuyendo entonces a los diferentes efectos biológicos antes mencionados [12]. Aristotelia chilensis es una planta cuyo fruto es considerado un potente antioxidante natural [13]. A. chilensis se ubica geográficamente desde la IV a la XI región, hasta los 2.500 m.s.n.m., también en el archipiélago de Juan Fernández y Argentina. Habita en lugares con suelo rico en materia orgánica, siendo una especie colonizadora de lugares abiertos. Muchas veces forma comunidades puras las que reciben el nombre de macales. A. chilensis pertenece a la familia Elaeocarpaceae y es comúnmente conocida como ‘‘maqui,’’ ‘‘clon,’’ ‘‘queldron,’’ y ‘‘koelon. Esta fruta contiene más pulpa que otras bayas de esta región, y su sabor es descrito como astringente pero fresco. Tanto las hojas, como los frutos comestibles de A. chilensis se han utilizado para el tratamiento de diversas dolencias como dolor de garganta, úlceras, fiebre, hemorroides, inflamación, diarrea, lesiones, migrañas y para la cura de cicatrices [14, 15, 16]. Los araucanos fabricaban chicha del jugo fermentado, el cual también era utilizado como elemento colorante para dar tinte a vinos. Durante los últimos años, se han realizado algunas investigaciones del fruto encontrándose en el jugo o la fracción fenólica propiedades antioxidantes, pudiendo ser útil como anti‐aterogénico [13]. Las antocianinas presentes en el fruto de maqui constituyen el 0.2% y han sido asociadas a una gran capacidad antioxidante. En el fruto han sido reconocidos ocho pigmentos correspondientes a 3‐glucósidos, 3,5‐diglucósidos, 3‐
sambubiósidos y 3‐sambubiósido‐5‐glucósidos de delfinidina y cianidina, siendo la principal antocianina delfinidina 3‐sambubiósido‐5‐glucósido (34% de antocianinas totales). El promedio total de contenido de antocianinas es 137.6 +/‐ 0.4mg/100g de fruta fresca (211.9 +/‐ 0.6 mg/100g de fruta seca) [17]. El jugo de maqui puede inhibir la oxidación de la lipoproteína de baja densidad (LDL) y proteger a las células endoteliales contra el estrés oxidativo intracelular, siendo considerado útil como anti‐aterogénico [13]. Extractos metabólicos de los frutos de maqui, han mostrado un efecto protector preventivo en estudios in vivo de isquemia/reperfusión en corazón de ratas, que se atribuye a la reducción de la oxidación lipídica y estrés oxidativo [18]. Recientemente, la administración oral de antocianinas y delfinidina 3‐sambubiósido‐5‐glucósido, redujeron de manera dosis dependiente los niveles de glucosa sanguínea en ayunas en un modelo de ratones obesos C57BL/6J, y disminuyó la producción de glucosa en células de hígado de rata. El compuesto puro también fue capaz de incrementar la captación de glucosa en miotubos L6 [19]. En el presente artículo, describimos el efecto de un extracto estandarizado de Maqui, conteniendo un 25% de delfinidinas totales en el mantenimiento del balance de glucosa en un modelo de ratas diabéticas y pacientes prediabéticos. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Extracto de Maqui El extracto de Maqui (Aristotelia chilensis) fue fabricado y proporcionado por Indena SpA, Italia. El extracto fue estandarizado a un mínimo de 35% de antocianinas totales y un 25% de delfinidinas totales. Delfinidina (>98%) fue obtenida desde Extrasynthase (Lyon, France). 2. Estudios en animales 2.1 Inducción de diabetes por inyección de STZ: La diabetes fue inducida mediante una inyección única de STZ (Calbiochem, Darmstadt, Germany) disuelta en tampón citrato (pH 4.5) en una dosis de 55 mg/Kg en Rattus norvegicus machos (250‐300 grs). Los animales controles normales (CN, n = 5) fueron mantenidos en ayunas durante la noche e inyectados con tampón citrato como vehículo. Los animales diabéticos fueron divididos en dos grupos. El Grupo I (n=5) fue analizado 16 semanas después de la inducción de diabetes. El Grupo II fue estudiado después de 16 semanas de inducida la diabetes y luego de la administración de 20 mg/Kg (n=5) de extracto de Maqui. Todos los animales fueron alimentados con dieta estándar de laboratorio y agua ad libitum. Los animales fueron proporcionados por la Pontificia Universidad Católica de Chile y fueron mantenidos en un ciclo de 12 horas luz‐
oscuridad a 22 ºC. 2.2. Test de Tolerancia a la Glucosa: El Test de Tolerancia Oral a la Glucosa (OGTT) fue realizado 30 minutos después del tratamiento con extracto de Maqui en ratas controles normales y en ratas diabéticas inducidas por inyección de STZ. La glucosa (2,0 g/kg de peso corporal) fue administrada vía inyección intraperitoneal después de 12 hrs de ayuno. La glucosa sanguínea fue determinada a los 0, 30, 60, 120 y 240 minutos después del cambio de la concentración de glucosa utilizando el método enzimático de glucosa oxidasa (Wiener lab) a 490 nm. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 28 3. Estudios en humanos Se utilizó un estudio aleatorio, doble ciego, controlado con placebo, que fue aprobado por el Comité de Ética Científica del Servicio de Salud Metropolitano Occidente, Ministerio de Salud de Chile, incluyendo un seguro médico para los pacientes en el Hospital Clínico de la Universidad de Chile, Profesor José Joaquín Aguirre; Hospital San Juan de Dios. El estudio fue realizado en el Centro de Investigaciones Farmacológicas y Toxicológicas (IFT), de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile (www.ift.cl). Todos los pacientes participantes del estudio firmaron un consentimiento informado. Ninguno de ellos fue informado de su código de grupo asignado. Los médicos participantes del estudio no manejaron los productos y no conocieron el tratamiento asignado a cada paciente. Dos sobres conteniendo cada tratamiento por paciente fueron asignados: uno de ellos fue almacenado en caso de emergencia por el Centro de Investigaciones Farmacológicas y Toxicológicas, y otro por el Investigador principal. Los dos sobres permanecieron sellados hasta el día del análisis de los datos. 3.1. Intervención y Procedimientos: Se reclutaron 12 pacientes voluntarios sanos que fueron divididos en 2 grupos, con edades entre 18 y 55 años, que no recibieran ninguna terapia farmacológica aguda ni crónica, un índice de masa corporal (IMC) inferior a 30 Kg/m2, con glucosa plasmática en ayunas < 110 mg/dL y un Test de Tolerancia a la Glucosa alterado (110 a 125 mg/dL), registrado luego de 120 minutos tras la administración de 75 gramos de carbohidratos (cocinados con arroz grado 1) [20‐24]. Los pacientes con antecedentes de drogas y/o abuso de alcohol y fumadores (más de 3 cigarros cada 7 días) fueron excluidos del estudio. También fueron excluidos del estudio los pacientes que tomaban suplementos vitamínicos 7 días antes de la administración de los productos de prueba, aquellos pacientes con un cambio reciente en sus hábitos alimenticios o de ejercicio, con terapia farmacológica crónica o medicamentos que afectaran la actividad enzimática hepática 28 días antes al inicio del estudio, pacientes con alergia a algún medicamento, con Diabetes Mellitus o hospitalizados durante los últimos 60 días o con arritmia o cualquier insuficiencia renal crónica (creatinina sanguínea > 1,5 mg/dL). Además, fueron excluidos del estudio pacientes con alergia al maní y almendras o con cualquier otra enfermedad crónica o limitante, incluyendo alcoholismo o con cualquier otra enfermedad o condición que el médico considerara en que el voluntario no cumplía con las condiciones para participar en el ensayo. Los pacientes cumplieron los criterios de inclusión y fueron divididos aleatoriamente en el grupo tratado con extracto de Maqui o placebo. La apariencia del producto de prueba y el placebo fueron idénticos, siendo imposible su reconocimiento visual o a través de su aroma. El éxito del ensayo doble ciego fue validado antes de comenzar con el estudio en un grupo de 10 voluntarios. Al finalizar el tratamiento, se realizó una encuesta sencilla preguntando a los participantes del estudio si reconocían haber recibido el producto de prueba o el placebo. En cada sesión, los pacientes recibieron un vaso de agua (250 mL) conteniendo el placebo o 200 mg del producto disueltos en agua como dosis única después de un período de 12 h de ayuno. Posteriormente, los pacientes fueron cruzados en un segundo período y recibieron el producto contrario. Cada vez, los grupos tratados con el producto y el placebo recibieron una comida 30 minutos antes de su administración (definida como una cantidad fija de 75 g de arroz blanco grado 1 cocido, preparado por un nutricionista). El estudio fue conducido durante 4 semanas. El período de lavado/intervalo de tiempo entre las diferentes administraciones fue de 6 días (Sesión 1 = Placebo; Sesión 2 = 200 mg extracto de Maqui). Los tratamientos y procedimientos empleados en los pacientes estuvieron en conformidad con los acuerdos internacionales [25] y las buenas prácticas clínicas [26]. En cada sesión se obtuvieron muestras sanguíneas. La primera muestra fue tomada como línea base, 10 minutos antes (tiempo ‐10) del tratamiento con extracto de Maqui o placebo (tiempo 0); la segunda muestra fue tomada 15 minutos después de la ingesta del producto (tiempo +15). La comida fue servida 30 minutos después de la administración de extracto de Maqui o placebo. La tercera muestra sanguínea fue obtenida en el mismo momento (tiempo +30). A continuación, las muestras de sangre fueron tomadas consecutivamente a los tiempos, +60, +90, +120 y +180 minutos después de la administración del producto o placebo. La glucosa sanguínea fue medida en plasma por el método enzimático de GOD‐PAP. Mientras tanto, la insulina fue medida por inmunoensayo (MEIA, Abbott). Las reacciones adversas fueron evaluadas por un médico y todas las observaciones fueron registradas durante el tratamiento, las cuales fueron clasificadas como pocas, moderadas o graves en un formulario asignado para cada paciente con su estado general de salud. 4. Manejo de ratones y aislamiento de tejidos Los ratones C57Bl/6J fueron obtenidos desde Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Los ratones fueron mantenidos en el Centro Libre de Patógenos para ratones del Centro de Estudios Científicos (CECS), Valdivia, Chile. Previo a los experimentos, los ratones tuvieron libre acceso al agua y comida. Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical de acuerdo a las regulaciones de IACUC. El yeyuno fue separado, abierto longitudinalmente Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 29 a lo largo del borde mesentérico y lavado con tampón fosfato salino (PBS). 4.1. Absorción electrogénica de D‐glucosa en yeyuno de ratón: Se montaron dos secciones de yeyuno de ratón en Cámaras de Ussing, los cuales fueron mantenidos en tampón Ussing NaCl, 120 mM; NaHCO3, 25 mM; KH2PO4, 0,8 mM; MgCl2, 1,2 mM; CaCl2, 1,2 mM) suplementado con 10 mM de D‐glucosa en el lado seroso. La temperatura fue mantenida a 37°C y la solución fue constantemente gaseada con CO2 al 5%. Una vez que la preparación entregó un registro estable de los parámetros eléctricos, se agregó 10 mM de D‐glucosa al lado apical de la preparación para estimular el transporte de D‐glucosa acoplado a sodio (SGLT‐1). El efecto de delfinidina sobre el transporte de glucosa acoplado a sodio fue determinado por la aplicación de esta molécula a una concentración de 50 µM en el lado mucoso de la preparación. La diferencia de potencial eléctrico transepitelial (Vm) fue registrada utilizando un amplificador VCC MC2 (Physiological Instruments). Los valores de corriente de cortocircuito (Isc) y resistencia transepitelial (Rte) fueron calculados a partir de los datos experimentales utilizando la ley de Ohm [27]. Los resultados fueron expresados como la intensidad de Isc (µA/cm2). 5. Estadística Para establecer las diferencias entre los parámetros plasmáticos de cada aplicado a los voluntarios, se realizó un test de varianza multifactorial (ANOVA) con una significancia estadística de P≤0,05. Los parámetros de variación considerados en el estudio fueron: producto administrado, período de administración, secuencia y efecto residual. El protocolo siguió las recomendaciones y guía de la FDA, para el diseño y análisis estadístico del estudio. RESULTADOS Extracto de maqui disminuye la hiperglicemia basal en ratas diabéticas después de 4 meses de tratamiento. Recientemente, la atención se ha centrado en los constituyentes de la dieta que pueden ser beneficiosos para la prevención y el tratamiento de la diabetes. Aunque hay algunos fármacos que han sido utilizados como regímenes terapéuticos para las enfermedades metabólicas relacionadas a la obesidad, hay poca evidencia de que los factores alimenticios propios puedan ser directamente beneficiosos para modular la sensibilidad a la insulina [28]. Nosotros observamos, que el extracto de Maqui rico en delfinidinas disminuyó significativamente la concentración basal de glucosa sanguínea en ratas diabéticas inducidas por inyección de STZ con respecto al grupo de animales control después de 4 meses de tratamiento con una concentración de extracto de Maqui de 20 mg/kg (Figura 1). La concentración basal de glucosa disminuyó aproximadamente 4 veces entre el grupo de ratas control (100,25 ± 11,6 mg/dL) y el grupo de ratas diabéticas (475 ± 91,3 mg/dL). Por otra parte, las ratas del grupo control tratadas con extracto de Maqui no presentaron cambios en la concentración de glucosa sanguínea (Figura 1). Figura 1. Extracto de Maqui disminuye la hiperglicemia basal en ratas diabéticas. Ratas diabéticas inducidas con STZ fueron tratadas con 20 mg/Kg de extracto de Maqui durante 4 meses y la concentración de glucosa en suero fue determinada mediante el método de glucosa oxidasa. Los resultados son el promedio ± E.E., n = 5. *P< 0.001. Se realizó un Test de Tolerancia a la Glucosa, en el cual el extracto de Maqui fue administrado 30 minutos antes de la carga de glucosa (2,0 g/kg de peso corporal). En primer lugar, no se observaron cambios en la concentración de glucosa sanguínea de ratas control normales tratadas con 20 mg/Kg de extracto de Maqui luego de la administración de glucosa por medio de inyección intraperitoneal (Figura 2A). Sin embargo, se pudo observar en ratas diabéticas tratadas con 20 mg/Kg de extracto de Maqui una disminución de los niveles de glucosa basales (Figura 2B). Los resultados del Test de Tolerancia a la Glucosa mostraron claramente que el extracto de Maqui es capaz de aliviar la resistencia a la insulina en el grupo de ratas diabéticas. La disminución de la glucosa en sangre fue significativamente mayor en el grupo de ratas diabéticas tratadas con el extracto de Maqui a los 240 minutos luego de la administración de glucosa vía intraperitoneal (Figura Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 30 2B). Por otra parte, el peso corporal de las ratas diabéticas tratadas con el extracto de Maqui no varió con respecto al grupo control, durante 16 semanas de tratamiento (Tabla 1). Adicionalmente, los niveles de triglicéridos en ratas diabéticas tratadas con extracto de Maqui se mantuvieron sin cambios con respecto al grupo control diabético (datos no mostrados). Los resultados obtenidos demuestran que el extracto de Maqui es capaz de reducir la hiperglicemia basal y mejorar la capacidad de metabolizar la glucosa en ratas con diabetes tipo 2. En este sentido, se ha descrito que un alto consumo de frutas y hortalizas, principalmente antocianinas están asociados con una reducción en la incidencia de este tipo de diabetes [29]. Tabla 1. Peso corporal en ratas diabéticas tratadas con vehículo o extracto de Maqui por 4 meses. Figura 2. Efecto del extracto de Maqui (EM) sobre los niveles de glucosa postprandial en ratas control normales y ratas diabéticas. Test de Tolerancia a la Glucosa. Los valores son el promedio ± E.E., n = 5 (A). Niveles de glucosa sanguínea en ratas controles normal (CN) y en ratas control normales tratadas con vehículo o con 20 mg/Kg de extracto de Maqui, respectivamente. (B) Niveles de glucosa en ratas diabéticas (RD) y en ratas diabéticas tratadas con vehículo o con 20 mg/Kg de extracto de Maqui, respectivamente. Los resultados son el promedio ± E.E., n = 5. **P< 0.01. E and G indican la administración de extracto y glucosa, respectivamente. El extracto de Maqui modifica la forma de las curvas de glucosa e insulina. El objetivo de este estudio fue evaluar la eficacia de una administración oral única de extracto Maqui sobre los niveles postprandiales de glucosa e insulina en individuos con intolerancia a la glucosa. Es conocido que pacientes con intolerancia a la glucosa poseen doble riesgo de desarrollar diabetes mellitus tipo 2 y asociado a eventos cardiovasculares [30]. Por lo tanto, las medidas o tratamientos que apunten a reducir la incidencia de la diabetes y los eventos clínicos en estos pacientes son de suma relevancia. Los resultados obtenidos muestran que la administración única del extracto de Maqui conduce a alteraciones en la forma de las curvas de insulina (Figura 3A) y de glucosa (Figura 3B). Sin embargo, la comparación estadística entre el área bajo la curva del extracto de Maqui y placebo no mostró diferencias estadísticamente significativas en las determinaciones de insulina (ANOVA). A pesar de esto, los pacientes que recibieron 200 mg de extracto redujeron significativamente la glucosa postprandial después de 30 minutos de la administración de una comida, en comparación con aquellos pacientes que solo recibieron placebo (Figura 3B). Fue posible también observar, que los resultados cinéticos muestran un retardo en el tiempo en el que se alcanza el máximo en la concentración de insulina y glucosa en los pacientes tratados con extracto de Maqui Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 31 (Figura 3A), lo cual correlaciona con una disminución tardía en los niveles de glucosa (Figura 3B). Figura 3. Efecto del extracto de Maqui sobre las concentraciones de insulina y glucosa postprandiales en pacientes con intolerancia a la glucosa. Test de Tolerancia a la Glucosa. transportador facilitativo de hexosas, GLUT2 [31]. En este trabajo, se utilizaron las mediciones en Cámaras de Ussing para caracterizar el efecto de delfinidina sobre el transporte activo de glucosa intestinal (SGLT‐1). Los yeyunos de ratones fueron montados en las cámaras, hasta que éstos alcanzaron un estado estacionario. A continuación, se adicionó glucosa a una concentración de 10 mM en el lado mucoso, induciendo un aumento en la Isc (máximo después de 3 minutos), representando un incremento en la actividad de SGLT‐1. Cuando delfinidina fue agregada al baño por el lado mucoso, se produjo una marcada inhibición de la Isc (Figura 4A), inhibiendo el transporte de glucosa en aproximadamente 60% (Figura 4B). Figura 4. Delfinidina inhibe el transporte de D‐glucosa acoplado a sodio en yeyuno de ratón. En cada tiempo, ambos grupos placebo y extracto, recibieron 30 minutos antes una comida (definida y fijada en 75 g de arroz grado 1 cocinados). La glucosa plasmática pre‐prandial fue medida en el tiempo base (‐ 10 minutos) y las concentraciones postprandiales (al final de 180 minutos) fueron calculadas usando el Test de Tolerancia de Glucosa Estándar. Las muestras sanguíneas fueron obtenidas en cada sesión. Los resultados son el promedio ± E.E., n = 8. * P< 0.05, con respecto al placebo. A) Registro de voltaje transepitelial (Vte) de una pieza de yeyuno de ratón montado en Cámara de Ussing. En 1 se indica el momento en que la concentración de D‐glucosa en el lado mucoso es aumentada de 0 a 10 mM. La deflexión negativa de Vte refleja el transporte electrogénico de D‐
glucosa acoplado a sodio, donde los cationes que acompañan al monosacárido alcanzan el lado seroso al ser transportados activamente por la Na+/K+ ATPasa. En 2 se indica el momento en que se adiciona delfinina 50 μM en el lado mucoso. B) Resumen de las corrientes de cortocircuito (Isc) para los experimentos ejemplificados en A. Delfinidina produce una disminución cercana al 40% (ii: corriente sensible a delfinidina) de la corriente de sodio inducida por D‐glucosa 10 mM (i). Los valores son el promedio son el promedio ± E.E., n=4 de diferentes animales. Delfinidina inhibe el transporte de glucosa dependiente de sodio. En intestino, la entrada de glucosa puede involucrar al cotransportador de Na+/glucosa, SGLT‐1, o al Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 32 DISCUSIÓN DM es el trastorno endocrino más común, siendo un problema importante de salud en todo el mundo. Este grupo de enfermedades metabólicas se caracterizan por hiperglicemia, resultante de defectos en la secreción y/o acción de insulina. La hiperglicemia crónica se asocia con daño a largo plazo, disfunción e insuficiencia de varios órganos, especialmente los ojos, riñones, nervios, corazón y vasos sanguíneos. Así, el estricto control del nivel de glucosa en sangre se considera esencial para retrasar y/o prevenir el desarrollo de complicaciones de la diabetes [32]. Basándose en los datos presentados en este estudio, el tratamiento con el extracto de Maqui rico en delfinidinas, produjo una reducción significativa de la concentración basal de glucosa en suero en ratas diabéticas después de 4 meses de tratamiento (*P<0,001). Igualmente, los resultados del Test de Tolerancia a la Glucosa mostraron que este extracto es capaz de disminuir los niveles de glucosa en sangre en ratas diabéticas. Los niveles de glucosa sanguínea normales fueron reestablecidos a los 240 minutos después de la administración de glucosa vía intraperitoneal. La diabetes mellitus tipo 2 y la obesidad se encuentran fuertemente asociadas [33]. Recientemente, se ha mostrado que las antocianinas podrían afectar el desarrollo de la obesidad, al menos en algunos modelos animales [34,35]. En este trabajo, nosotros no observamos ningún tipo de protección contra la obesidad en ratas diabéticas inducidas por inyección con STZ. En este estudio, hemos demostrado que el extracto de Maqui rico en delfinidinas redujo significativamente la glucosa en sangre en pacientes con intolerancia a la glucosa. Los resultados muestran una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de glucosa postprandrial a los 60 minutos y diferencia en la distribución de las curvas promedios e individuales de insulina y glucosa, sugiriendo un efecto significativamente potencial del tratamiento con extracto de Maqui. Sin embargo, esto solo puede ser corroborado con un número mayor de pacientes con intolerancia a la glucosa, o bien en un estudio que involucre a pacientes con enfermedades más severas relacionadas al metabolismo de los carbohidratos, como diabetes mellitus o síndrome metabólico. Notablemente, ninguno de los voluntarios que participaron en el estudio mostró reacciones adversas al tratamiento. Solo un paciente informó de reacciones leves, tanto para el extracto de Maqui como para el placebo, sugiriendo que el extracto Maqui es seguro en la dosis a la cual fue administrado. Finalmente, se demostró que delfinidina pura, inhibió el transporte de glucosa (SGLT‐1) en la mucosa de yeyuno de ratón. En el intestino, los enterocitos de la membrana de ribete en cepillo (BBM) son el sitio primario de la absorción de los azúcares de la dieta. El cotransportador de Na+/glucosa SGLT‐1, transporta glucosa y galactosa desde el lumen del intestino hacia los enterocitos [36]. SGLT‐1 es parte funcional del sistema periférico que censa glucosa exógena para mantener la homeostasis energética [37]. La actividad de SGLT‐1 es altamente regulada por algunos péptidos y hormonas en la membrana de la mucosa o serosa [38,39, 40]. La regulación de SGLT‐1 involucra un mecanismo postprandial, seguido por un rápido ajuste de la abundancia de la proteína en BBM y reclutamiento del transportador de glucosa GLUT2, lo cual depende de los niveles de azúcar luminales [37]. La actividad de SGLT‐1 y GLUT2 se encuentra incrementada en diabetes tipo 2 [41,42], probablemente como resultado de su desregulación. Los resultados presentados en este trabajo muestran que el extracto de Maqui rico en delfinidinas posee un efecto potencial en el mantenimiento del balance de glucosa en pacientes prediabéticos. AGRADECIMIENTOS Agradecemos a Indena, SpA, Italia por el extracto estandarizado de Maqui, y a Maqui New Life, S.A. por los fondos para investigación entregados a la Universidad Austral de Chile. BIBLIOGRAFÍA: [1] Zafra‐Stone S, Yasmin T, Bagchi M, Chatterjee A, Vinson JA, Bagchi D. Berry anthocyanins as novel antioxidants in human health and disease prevention. Mol Nutr Food Res. 2007; 51(6):675–83. [2] Seeram NP. Berry fruits: Compositional elements, biochemical activities, and the impact of their intake on human health, performance, and disease. J Agric Food Chem. 2008; 56(3):627‐629. [3] Seeram NP. Bioactive polyphenols from foods and dietary supplements: challenges and opportunities. In Herbs: Challengesin Chemistry and Biology; ACS Symposium Series 925 (Herbs); Ho, C. T., Wang, M., Sang, S., Eds.; Oxford University Press: New York, 2006; Chapter 3, pp 25–38. [4] Seeram NP, Zhang Y, Nair MG. 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42025. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 34 ARTÍCULO DE REVISIÓN POLIFENOLES CON EFECTO ANTI‐HELICOBACTER PYLORI: FUENTES DE OBTENCIÓN Y SU POTENCIAL UTILIZACIÓN EN FITOMEDICAMENTOS, NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES. (Polyphenols with anti‐Helicobacter pylori effect: Sources and its potential use in phytomedicines, nutraceutics and functional foods) Edgar R. Pastene N.1*,Ph.D., Sonja Hebel G.1,2, B.Q. y Apolinaria García C.2,Ph.D. 1
Laboratorio de Farmacognosia, Departamento de Farmacia, Facultad de Farmacia, Universidad de Concepción, Concepción, Chile. 2
Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción. RESUMEN ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Helicobacter pylori (H. pylori) infecta la mucosa gástrica de la mitad de la población mundial, siendo el único microorganismo conocido por su capacidad de colonizar exitosamente el estómago humano. Muchos estudios han permitido establecer que H. pylori es uno de los principales agentes etiológicos de la gastritis crónica, úlcera duodenal y del linfoma MALT. En 1994, la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC/OMS), definió a H. pylori como un agente carcinógeno tipo I, por su directa asociación al cáncer gástrico de origen no genético. En Chile, la infección por H. pylori posee una alta prevalencia (~ 80%) y el régimen de erradicación habitualmente considera la aplicación de una terapia múltiple, la cual combina dos (o tres) antibióticos y un inhibidor de la bomba de protones (PPI). No obstante, se espera que el desarrollo de resistencia a los antibióticos por parte de algunas cepas de H. pylori vaya en aumento. Lo anterior ha incentivado la búsqueda de nuevas substancias con propiedades antibióticas, así como otras que dificulten el asentamiento exitoso de la bacteria en la mucosa gástrica. En esta revisión se presenta brevemente algunos aspectos de la infección por H. pylori y sus mecanismos de daño a la mucosa gástrica, con énfasis en la producción de especies reactivas del oxígeno y el nitrógeno (ERON). Con la descripción de dichos mecanismos, y a la luz de recientes hallazgos en el campo de la fitofarmacología, se persigue dirigir la atención hacia nuevos blancos moleculares poco explorados. En particular, destaca un número importante de productos obtenidos del reino vegetal, pertenecientes a distintos grupos fitoquímicos como los terpenos, alcaloides y los polifenoles, para los cuales se ha descrito efectos anti‐H. pylori a través de diferentes mecanismos. Por su presencia ubicua en muchas plantas que se emplean con fines medicinales y su consumo a través de ciertos alimentos ricos en ellos, en este trabajo se discutirá el rol de los polifenoles con efectos anti‐H. pylori. Estos, no sólo poseen actividad antimicrobiana, antioxidante y gastroprotectora, sino que también juegan un papel como agentes capaces de neutralizar ciertos factores de virulencia de H. pylori. Los antecedentes científicos y los resultados de nuestros estudios sugieren que estos compuestos tendrían una real utilidad al ser administrados como agentes fitoterapéuticos, nutracéuticos o ingredientes funcionales. Palabras Claves: Helicobacter pylori, polifenoles, antioxidantes, ureasa, radicales libres. Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 1. EPIDEMIOLOGÍA Y PRINCIPALES MANIFESTACIONES CLÍNICAS DE LA INFECCIÓN POR Helicobacter pylori. Helicobacter pylori (Hp) fue identificado por primera vez por Marshall y Warren en 1982 como una bacteria flagelada, microaerófila, Gram‐negativa de forma bacilar y espiralada. Hp destaca por su alta capacidad para colonizar el epitelio gástrico humano e in vitro necesita condiciones exigentes de cultivo, multiplicándose de manera lenta (3‐5 días) con una temperatura óptima de 35‐37 ºC, a pH neutro (Warren 1983; Marshall, 1984). ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Correspondencia a: Dr. Edgar R. Pastene, Laboratorio de Farmacognosia, Departamento de Farmacia, Facultad de Farmacia, P.O. Box 237, Universidad de Concepción, Concepción, Chile. email edgar.pastene@gmail.com Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 35 En los países no desarrollados la infección es normalmente adquirida en la niñez y en ausencia de tratamiento puede persistir toda la vida. Hp es un microorganismo cosmopolita, estimándose que más de la mitad de la población mundial está infectada (EUROGAST, 1993). Dicho agente puede ser aislado en personas tanto sintomáticas como asintomáticas. En individuos infectados en forma crónica, Hp constituiría el principal agente etiológico de enfermedades como la gastritis crónica, la úlcera péptica, el adenocarcinoma y el linfoma asociado a la mucosa gástrica (MALT) (Blaser, 2004). El curso de la infección es muy variable y depende tanto de factores propios de la bacteria como del huésped. La infección no sólo altera en forma directa la mucosa gástrica, sino que, además, modifica a nivel del antro gástrico la secreción de polipéptidos gastrointestinales con acción hormonal (p.e. gastrina), generando alteraciones en la fisiopatología gástrica relevantes a la posterior ulceración de la mucosa. En base a los antecedentes epidemiológicos disponibles, la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer clasificó a Hp como un carcinógeno humano clase I (IARC., 1994). El cáncer gástrico ocupa el segundo lugar entre las causas de muerte por neoplasias a nivel mundial, y en Chile representa la primera causa de muerte por tumores malignos en varones, habiéndose estabilizado a partir de la década de los 80´ la tasa de mortalidad cruda en alrededor de 20 por cada 100.000 habitantes (Parkin, 2002; 2005). 1.1. Estrategias de tratamiento y prevención de la infección 1.1.1. Tratamiento farmacológico, IV Consenso de Maastricht. La evaluación de nueva evidencia experimental, así como el tratamiento a utilizar en la erradicación de este patógeno se evalúa cada cuatro o cinco años por expertos en el denominado consenso de Maastricht. La triple terapia convencional que incluye un PPI y los antibióticos claritromicina y amoxicilina o metronidazol recomendado en el primer consenso ha demostrado una pérdida de eficiencia debido a la alta resistencia bacteriana a claritromicina y con frecuencia sólo permite como máximo un 70% de cura en los pacientes. Esta terapia provoca malestar en muchos pacientes, incluyendo cefaleas, náuseas, vómitos y sensación de mareo, siendo responsable del abandono de la misma y contribuyendo así a la resistencia bacteriana. La terapia actual recomendada se basa en la resistencia a claritromicina presente en cada zona geográfica: cuando ésta es menor a un 15 o 20% el tratamiento empírico recomendado de primera línea es el ya mencionado, con la adición de bismuto como alternativa, en cambio cuando la resistencia es mayor, este último componente es altamente recomendable y debe adicionarse si la triple terapia convencional falla, junto al reemplazo de la claritromicina por levofloxacino. Es favorable además, utilizar altas dosis de PPI, dos veces al día y aumentar la duración del tratamiento, de 10 a 14 días, en vez de los 7 recomendados anteriormente (Malfertheiner, 2012). 1.1.2. Vacunas. Los estudios de vacunas utilizando diversos modelos animales han probado que el desarrollo de una estrategia de vacunación es viable y que un candidato vacunal contra Hp es factible (revisado por Harris et al., 2006; Kabir et al., 2007; Del Giudice, 2009), pero aún no se ha tenido éxito. Se han realizado numerosos estudios en animales para determinar el devenir de la infección y para explorar la viabilidad de una vacuna para la prevención o erradicación de la infección por este microorganismo. Sin embargo, los modelos animales, con la posible excepción de los monos, no han servido lo suficiente para aclarar dudas debido a los contradictorios resultados (Kotiw et al., 2012). Según el Departamento de Gestión de Información del Instituto Finlay (Cuba), organización científica que se preocupa de la investigación y producción de vacunas, todos los candidatos vacunales dirigidos contra Hp están en fase experimental, y señalan que son varios los problemas a resolver antes de que se pueda llegar a desarrollar una vacuna contra este patógeno (http://www.finlay.sld.cu/ domingo, 20 de agosto de 2006, 22:39:22). Svennerholm y Lundgren (2007) en su minireview sobre el progreso del desarrollo de vacunas contra Hp concluyen que hay una gran necesidad de clarificar el principal mecanismo inmune protector contra Hp al igual que identificar un cóctel de antígenos protectores fuertes, o cepas bacterianas recombinantes que expresen tales antígenos, los cuales podrían ser administrados mediante un régimen que origine una respuesta inmune efectiva en humanos. Actualmente se sabe que la colonización del estómago por Hp induce una respuesta inmune fuerte pero no protectora, efectuada principalmente por las células Th1. Estas células producen interferon gamma, interleuquina ‐2 y factor de necrosis tumoral‐beta, el cual activa a los macrófagos y es responsable de la inmunidad mediada por células y de la respuesta protectora dependiente de fagocitos. Por el contrario, las células Th2 producen IL‐4, IL‐
5, IL‐10 e IL‐13‐, las que estimulan las síntesis de anticuerpos y la activación de eosinófilos e inhiben varias funciones de los macrófagos, proporcionando una respuesta protectora independiente de los fagocito. Por esto, se cree que la eficiencia de una potencial vacuna contra Hp dependerá de la inducción de la respuesta inmune humoral (Malfertheiner, 2012). 2. CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE LA PATOLOGÍA MOLECULAR DE LA INFECCIÓN POR Helicobacter pylori. 2.1. Evasión de la respuesta inmune e inflamatoria En la interacción huésped‐Hp, el movimiento del patógeno hacia la mucosa gástrica se ve favorecido por la morfología espiralada y los flagelos. Posteriormente, Hp se une a Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 36 ciertos receptores de células del epitelio gástrico (Hessey, 1990; Logan, 1996), a través de adhesinas del tipo BabA, SabA, AlpA, AlpB, OipA y HopZ, desencadenando la producción de interleuquinas, como IL‐8 (pro‐inflamatoria) y de otras quimioquinas, como la ENA‐78 (péptido activador de neutrófilos derivado de células epiteliales) y el GRO‐α (encogen‐α regulado por crecimiento). Un factor endógeno que, adicionalmente facilita la unión de Hp a las células epiteliales, es la glicoproteína denominada DAF (Decay‐accelerating Factor, 70 kDa) (Servin, 2005; O´Brien et al., 2006), la cual en presencia de Hp puede ser up‐
regulada. Tras su adhesión a la mucosa, Hp secreta toxinas de naturaleza peptídica, como VacA y CagA, capaces de actuar localmente sobre el epitelio blanco. Si bien Hp logra asociarse al epitelio gástrico con bastante éxito, una vez ahí debe lidiar con la primera línea de defensa constituida por la inmunidad innata. Este sistema consta de componentes de barrera (epitelios, defensinas y linfocitos T intraepiteliales), células efectoras circulantes (neutrófilos, macrófagos y células NK) y diversas proteínas efectoras circulantes (complemento, colectina, factores de coagulación, proteína C‐reactiva y citoquinas como TNF‐α, IL‐1, 10, 12, 15). Aunque algunos de estos componentes poseen receptores capaces de reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), que llevan a la destrucción del agente extraño, Hp es capaz de vulnerarlos eficazmente. Por ejemplo, el TLR4 (un receptor del tipo Toll), que normalmente reconoce a los LPS bacterianos para activar a NF‐κB, genera frente al LPS de Hp una respuesta que si bien es proinflamatoria, es notablemente más débil en comparación con la de los LPS de otras bacterias entéricas (menor reconocimiento). Del mismo modo, en contraste con las flagelinas secretadas por otros patógenos Gram negativos, como Salmonella o Escherichia coli, que activan consistentemente la respuesta pro‐inflamatoria mediada por los receptores TLR5, la flagelina presente en Hp no es secretada y por ende se considera no inflamatoria (Gewirtz et al., 2004). A su vez, Hp es capaz de interferir con algunas de las respuestas inmunes locales; por ejemplo, inhibiendo la producción de óxido nítrico por parte de macrófagos y down‐regulando la expresión de receptores a quimioquinas en neutrófilos infiltrantes. En forma adicional a la respuesta inmune innata, la infección por Hp induce una respuesta inmune caracterizada por la infiltración de la mucosa con neutrófilos, linfocitos y otras células inflamatorias, y por la producción local y sistémica de anticuerpos y de otros mediadores de la respuesta celular. Si bien las respuestas celulares y humorales son importantes en la patogénesis de Hp, éstas, como tal, son inefectivas para erradicar la infección. Aún más, como resultado de la interacción de linfocitos, neutrófilos, macrófagos y mastocitos, la respuesta inmuno‐celular es conducente a una amplificación de la inflamación inicial en el sitio infectado. Tras ser atraídas al sitio de la lesión, las células infiltrantes liberan mediadores como citoquinas, eicosanoides, y activadores de la cascada del complemento, capaces de perpetuar la inflamación. Junto a dichos mediadores, las células referidas liberan al medio una diversidad de especies reactivas del oxígeno y nitrógeno (ERON), generando una condición de estrés oxidativo crónico en el epitelio afectado. Las respuestas del huésped permiten la activación y diferenciación de linfocitos Th0 (CD4+), los que según el patrón de citoquinas presentes en el medio y de las condiciones inmunes del individuo, logran diferenciarse en Th1, mediando una respuesta de tipo celular, o bien Th2 con una respuesta de tipo humoral. La respuesta de tipo celular es mediada a través de citoquinas tipo Th1 –tales como IFNγ, IL‐2 y TNF‐α, mientras que las citoquinas tipo Th2 –como la IL‐4 e IL‐5‐ promueven una respuesta de tipo humoral. Recientemente se ha comenzado a comprender cómo –a través de mecanismos que permiten a Hp evadir la respuesta inmune‐ la bacteria logra perpetuar la inflamación de la mucosa gástrica (Ganten, et al., 2007). Un ejemplo de esto último lo constituye la habilidad que tienen ciertas cepas de Hp (60190; CagA+; VacA+) para inducir la apoptosis de linfocitos T a través de la vía intrínseca (mitocondrial) y no la extrínseca. Lo anteriormente expuesto se suma a reciente evidencia que pone en el centro del proceso inflamatoria a la citoquina IL‐32 como un factor amplificador de la activación de NF‐kB y producción de IL‐8. Así, considera que el control efectivo del proceso inflamatorio promovido por Hp contribuiría en forma importante en la prevención de muchas complicaciones asociadas, incluyendo al cáncer (Sakitani et al., 2012). 2.2. Helicobacter pylori y evasión del estrés oxidativo Mención aparte merecen las enzimas con que Hp está equipado para combatir las especies reactivas del oxígeno y de nitrógeno liberadas por células del sistema inmune del huésped (revisado por Wang et al., 2006). Entre ellas, la más abundante es la alquilhidroperoxido reductasa (AhpC), una enzima que dada su alta expresión en Hp evita la acumulación de lipoperóxidos al interior del patógeno. Las cepas de Hp mutantes para AhpC presentan una aumentada sensibilidad a diversas condiciones de estrés oxidativo (Olczak et al., 2002), sobre‐expresan la proteína activadora de neutrófilos (Olczak et al., 2003), y presentan una menor actividad catalasa (Wang et al., 2004). Junto a lo anterior, Hp dispone de actividad superóxido dismutasa para la remoción de radicales superóxido generados por células del sistema inmune (Comtois et al., 2003), y es capaz de aumentar la expresión de enzimas antioxidantes como la metionina sulfo‐reductasa, necesaria para corregir la modificación oxidativa de proteínas en sus residuos metionina (Alamuri et al., 2006). Una de las características de la infección por H. pylori es su alto grado de infiltración linfocítica (Allen, 2001). Los neutrófilos y células mononucleares infiltran la mucosa Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 37 estomacal infectada por H. pylori ocasionando inflamación y producción de especies reactivas del oxígeno. Se ha observado que ciertas proteínas acuosolubles de H. pylori son capaces de primar a los neutrófilos, incrementando su capacidad para producir ROS y quimioquinas cuando se usan agentes inductores como el PMA y el fMLP (Shimoyama et al., 2003; Nørgaard et al., 1995). Satin y colaboradores (2000), informaron que la proteína HP‐NAP es uno de los factores que estimulan a la NADPH oxidasa en neutrófilos, si bien, se observó un retardo en el patrón de respuesta (medido como quimioluminiscencia incrementada para luminol), en comparación con los agentes convencionales que inducen el estallido respiratorio. Específicamente, los autores observaron que la producción de ROS alcanzó un máximo entre 40‐60 minutos después de la incubación. Hp induce la migración de los neutrófilos desde los capilares a la lámina propria y a la zona glandular de la mucosa, especialmente en las proximidades de los cuellos glandulares, donde se encuentran las células germinales. Los neutrófilos son activados por factores citotóxicos del propio Hp (como N‐formilmetionil‐leucil‐fenilalanina) y por la IL‐8 procedente de las células del epitelio tras la adhesión bacteriana (Mooney et al., 1991). Aun más relevante es que Hp posee la propiedad única de alterar la distribución de NADPH oxidasa en los neutrofilos (Allen et al., 2005). Lo anterior se explica por un ensamblaje anómalo del complejo funcional NADPH oxidasa en la membrana celular y no en el fagosoma. Específicamente, mientras el flavocitocromo b558 puede ser adquirido por los fagosomas, las subunidades p47phox o p67phox no pueden ser reclutadas eficientemente. Los factores responsables de éste tipo de evasión aun no han podido ser identificados. La evidencia sugiere que se trataría de moléculas sensibles al calor, resistentes al tratamiento con formalina y localizadas en la superficie de H. pylori. Estos últimos factores no serían requeridos para estimular el estallido respiratorio de los neutrófilos. Por otro lado, el resultado de investigaciones previas indican que las citotoxinas CagA y VacA son innecesarias para la activación de los neutrófilos (Danielsson et al., 2000). Otros autores sugieren que la adhesina SabA de H. pylori podría jugar un papel preponderante como factor activador de neutrófilos (Unemo, et al., 2005). De cualquier modo, este mecanismo le permite a H. pylori desviar la producción de anión superóxido hacia el exterior, evitando su acumulación en el fagosoma. De acuerdo a dicho mecanismo, Hp actuaría concertadamente con los neutrófilos para producir ulceración gástrica y además evadir su destrucción una vez fagocitado. Consistente con lo anterior, se ha observado que la densidad de neutrófilos infiltrantes se correlaciona directamente con la habilidad de Hp para causar daño a la mucosa gástrica. Por otra parte, el daño provocado por las ERON sobre las células del epitelio gástrico permite que Hp pueda acceder a una fuente adicional de nutrientes. Respecto a la capacidad que tienen los macrófagos activados en la mucosa gástrica para producir óxido nítrico, especie reactiva que en conjunto con otras persigue la eliminación del patógeno, cabe destacar que Hp puede limitar los efectos bactericidas del NO., tanto in vitro como in vivo, gracias a que expresa (gen rocF) una actividad arginasa capaz de “sifonar” la L‐
arginina lejos de la iNOS del huésped (revisado por Peek, 2005). Un beneficio adicional asociado a la alta actividad arginasa de Hp es la generación de urea (y ornitina) durante la hidrólisis de arginina. Si bien la arginasa puede ser inactivada por diversas ERON (McGee et al., 2006), y desnaturalizada por altas concentraciones de urea, Hp utiliza una tioredoxina (Trx1) como chaperona para recuperar la actividad catalítica de la arginasa. Por tanto, se considera que el sistema arginasa/Trx1 actuaría en forma concertada como sistema de adaptación y defensa contra el estrés oxidativo resultante de la respuesta inmuno‐celular. 2.3. Efectos de la respuesta inmuno‐celular y del estrés oxidativo sobre el huésped Sumado al daño directo inducido por los ERON sobre la mucosa gástrica, los eventos que conducen al proceso inflamatorio anteriormente discutido, llevan a aumentar in vivo (en mucosa gástrica y a nivel sistémico) diversos parámetros de daño oxidativo a lípidos (reflejado como aumento en los niveles de MDA e isoprostanos) (Daví et al., 2005; Drake IM et al., 1998 ) y al DNA (aumentada excreción de 8‐hidroxi‐guanidina) (Smoot et al. 2000; Ladeira et al. 2004; Siomek et al. 2006). La respuesta inmuno‐celular produce, además, ciertos eicosanoides biológicamente activos a través de un mecanismo de peroxidación del ácido araquidónico catalizada por radicales del oxígeno (Davi et al., 2005). Se ha planteado que el daño que en etapas tempranas (niñez y adolescencia) genera Hp sobre el DNA estaría asociado con el desarrollo de varios tipos de cáncer en la etapa adulta (Hatakeyama, 2004). Sin embargo, tal extrapolación no puede ser directa debido a que el desarrollo del cáncer en respuesta a un agente carcinogénico puede tomar entre 20 a 40 años. No obstante, se debe recordar que las ERON son una de las explicaciones más socorridas cuando se trata de buscar la posible asociación entre desarrollo de cáncer y Hp (Kawanishi 2006; Schotterfeld, 2006). Por otra parte, se ha demostrado también un aumento del ácido hipocloroso (HClO) en mucosa gástrica de individuos infectados por Hp (Matthews, 2005). El HClO es un potente pro‐oxidante ‐
generado a partir de H2O2 (en presencia de CI ) por la enzima mieloperoxidasa (MPO), liberada desde neutrófilos activados. El HClO es capaz de reaccionar rápidamente con el NH3 generado a nivel local por la enzima ureasa, para Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 38 formar monocloroamina (NH2Cl). Este último compuesto es altamente lipofílico y por tanto capaz de atravesar fácilmente membranas biológicas, facilitando la oxidación de macromoléculas al interior de las células epiteliales. Se ha observado, además, que NH2Cl es capaz de inducir la infiltración y activación de neutrófilos en la mucosa gástrica de manera similar a lo observado por Hp (Matthews, 2005). A su vez, se ha encontrado que ciertos mecanismos endógenos de defensa antioxidante como el glutatión (GSH) y el ácido ascórbico están disminuidos en mucosas infectadas por este agente (Arend, 2005; Naito, 2002; Ernst, 1999). Más aún, en la mucosa gástrica de pacientes infectados, relativo a pacientes Hp(‐), no solo los niveles de GSH están disminuidos, sino que también los de la enzima GSH‐transferasa (Verhlust et al., 2000; Shirin et al., 2001; Jung et al., 2001). Lo anterior conlleva una mayor producción local de ERON, las que al acumularse pueden ‐vía regulación de ciertos genes, e induciendo daño oxidativo al ADN‐ aumentar el riesgo de desarrollo de cáncer gástrico (Smoot et al., 2000; Pignatelli et al., 1998). Cabe mencionar que bajo condiciones desfavorables (por ejemplo, de estrés oxidativo), Hp es transformado desde la forma bacilar original a la cocoide. Sólo esta última es capaz de generar radicales hidroxilo, reconocidos como la especie de mayor reactividad hacia sustratos biológicos (Nakamura et al., 2000). Se ha descrito que en mucosa gástrica de sujetos asintomáticos, la erradicación de Hp mediante terapia tradicional conduce a una normalización de los niveles de actividad de ciertas enzimas antioxidantes (como iNOS y catalasa) (Felley et al., 2002). 3. ASPECTOS GENERALES A CONSIDERAR EN RELACIÓN CON EL EFECTO DE LOS POLIFENOLES SOBRE Helicobacter pylori. Dado que el estrés oxidativo asociado a la respuesta inmune que sucede a la presencia de este patógeno representa uno de los principales mecanismos de daño al epitelio gástrico, parece muy relevante disponer de eficientes sistemas antioxidantes (tanto endógenos como dietarios) en la zona colonizada por Hp. Sin embargo, las estrategias de supervivencia con que cuenta Hp contra el estrés oxidativo, hacen surgir la interrogante de cuán beneficiosa puede ser la administración o ingesta de antioxidantes. Los antecedentes que a continuación serán revisados sugieren que estos compuestos podrían tener un efecto protector no sólo para el huésped (citoprotegiendo el epitelio), sino también sobre Hp (contribuyendo a sus defensas antioxidantes). Teóricamente, al aumentar la capacidad de Hp para “lidiar” con las ERON generadas por el sistema inmune del huésped, se aumentaría también la posibilidad de que la colonización del epitelio por Hp persista en el tiempo. No obstante, estudios en los cuales se han evaluado extractos de plantas ricos en compuestos antioxidantes dan cuenta de efectos anti‐Hp tanto in vitro como in vivo (vide infra; Nostro et al., 2005; Mahady et al., 2005; Ustun et al., 2006). La actividad anti‐Hp de dichos preparados parece, sin embargo, estar asociada a determinadas especies vegetales de uso médico y/o alimenticio, y por consiguiente pudiera estar limitada a sólo algunas familias fitoquímicas. Ejemplos de esto lo constituyen diferentes bayas (berries ricos en polifenoles), algunas crucíferas (brócoli rico en glucosinolatos), propóleos y especies con aceites esenciales. Sin embargo, dentro de los grupos de fitoquímicos más estudiados destacan los polifenoles. La importancia de estos compuestos en salud humana ha sido ampliamente revisada (Ross, 2002; Hwa‐Young Kim, 2003; Kris‐Etherton et al., 2004; Raumussen et al., 2005; Ramassamy, 2006). No obstante, lo disperso de la información relativa con su absorción, metabolismo, distribución y excreción ha llevado a muchos investigadores a poner en duda algunos de los efectos de los polifenoles a nivel sistémico. De esta forma, se ha sugerido que el primer y principal sitio donde estos compuestos podrían ejercer su acción antioxidante, sería el tracto gastrointestinal (Revisado por Clifford, 2004). De acuerdo a antecedentes de la literatura, algunos compuestos polifenólicos poseen reconocida actividad bactericida, dada probablemente por mecanismos inespecíficos que no necesariamente guardan relación con su actividad antioxidante (citoprotectora) sobre las células del epitelio gástrico (Puupponen‐Pimia et al., 2001). Una de las hipótesis que se ha aceptado como paradigma, es que los polifenoles ejercen parte de su actividad antimicrobiana mediante interacciones inespecíficas con componentes de la membrana plasmática (Mori et al., 1987; Haraguchi et al., 1998; Funatogawa et. al., 2004). Al respecto, se observó un efecto dosis‐dependiente al evaluar el daño provocado por algunos polifenoles en los modelos de integridad de liposomas y de alteraciones en la morfología de Hp (Funatogawa et al., 2004). Sin embargo, este mecanismo es relevante y explica la actividad de taninos hidrolizables del tipo gálico (telimagrandina I y II), para los cuales se determinó valores de MIC hasta 7 ‐ 8 veces inferiores a los obtenidos con los taninos condensados (procianidinas). Dado que sólo algunas de las especies vegetales ricas en polifenoles muestran efectos anti‐Hp, resulta evidente que los vínculos mecanísticos entre las actividades antimicrobiana y antioxidante no son obligados (Correia et al., 2004; Shin et al., 2005). Debido a que, entre las moléculas fitoquímicas bio‐activas, los polifenoles son los de mayor presencia en la dieta humana, se han publicado varios estudios que relacionan su consumo con un efecto sobre Hp (Figura 1). Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 39 Figura 1.
Estructura de diferentes polifenoles con efecto sobre Helicobacter pylori o sus factores de virulencia. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 40 La mayoría de dichos estudios, exceptuando aquellos realizados con té verde y cranberry, han contemplado la evaluación de extractos obtenidos a partir especies vegetales de uso regional, no existentes en Chile. Considerando que la aplicación de las terapias triples y cuádruples es muy costosa, que presenta un alto nivel de reacciones adversas, y que junto a la aparición de resistencia, su uso masivo sería controversial en poblaciones con infección endémica por Hp, se hace crecientemente necesario investigar el potencial que pudieran tener extractos vegetales usados como ingredientes de productos fitoterapéuticos, nutracéuticos, o alimentos funcionales. Dichos productos ricos en antioxidantes polifenólicos podrían usarse en individuos colonizados asintomáticos contribuyendo a disminuir la evolución de otras patologías gástricas y extra‐gástricas. Por otro lado, se ha explorado de manera creciente las potenciales relaciones sinérgicas entre productos naturales y los antimicrobianos usados convencionalmente para la erradicación de Hp. Al respecto, en cepas de Hp con diferente grado se susceptibilidad se ha descrito que el uso combinado de extractos de jengibre o propóleos con claritromicina posee un efecto sinérgico o aditivo sobre la inhibición y el desarrollo de resistencia hacia éste antibiótico, (Nostro et al., 2006). Tal como se describe más adelante (sección 3.1), una serie de estudios en los cuales se ha intentado aislar e identificar los polifenoles presentes en plantas y alimentos, sugieren que la actividad anti‐Hp de los concentrados polifenólicos estaría asociada, mayormente, a los antocianos, flavonoides, taninos hidrolizables (gallotaninos y ellagitaninos) y taninos condensados (procianidinas) como los sub‐grupos más activos (Tómbola et al., 2003). Sin embargo, dentro de un mismo grupo de compuestos fenólicos existen diferentes grados de actividad sobre Hp, lo que sugiere que los mecanismos de acción no son tan inespecíficos como se pensaba. Por ejemplo, numerosos estudios realizados con flavonoides, concluyen que la mayor solubilidad en lípidos se asocia con un efecto bactericida más potente (Hashimoto et al., 1998; Bae et al., 1999, 2001; Shin et al., 2005; Isobe et al., 2006; Ustün et al., 2006; Zhu et al., 2007). Se ha propuesto un nuevo mecanismo mediante el cual ciertos flavonoides de baja polaridad pueden ejercer un efecto anti‐Hp. Así, la actividad bactericida de quercetina [1], apigenina [2] y (S)‐sakuranetina [3], ha sido atribuida a su capacidad de inhibir en forma competitiva a la β‐
hydroxyacyl‐acyl carrier protein dehydratase (HpFabZ) (Zhang et al., 2008). La principal función de HpFabZ es participar en la fase de elongación durante la biosíntesis de ácidos grasos saturados e insaturados. Dicha proteína también es blanco de otros productos naturales como la juglona (hidroxi‐1,4‐naftoquinona, [4]), la cual es capaz de inhibirla en forma competitiva (Park et al., 2006; Kong et al., 2008). 3.1. Antocianos, flavonoides, catequinas, proantocianidinas y taninos hidrolizables. Los pigmentos antociánicos son aquellos polifenoles que confieren el color a las frutas, flores, cereales y algunos tubérculos. Uno de los productos que más concentra antocianos es el jugo de cranberry (Vaccinium macrocarpon). Este último ha sido estudiado, particularmente, por sus propiedades antimicrobianas. Estudios clínicos han demostrado que el consumo sostenido de jugo de cranberry previene las (re)infecciones del tracto urinario en mujeres (Avorn et al., 1995; Henil et al., 2000; Kontiokari et al., 2001; Stothers, 2002; Di Martino et al., 2006). Se ha sugerido que los polifenoles de cranberry actuarían evitando la adhesión de E. coli al uroepitelio (Howell et al., 2002; 2005). Recientemente, las propiedades antimicrobianas de cranberry han sido extendidas a Hp. No obstante, aunque los antocianos contribuyen en forma importante a la capacidad antioxidante del cranberry, se ha demostrado que la inhibición de la adhesión de Hp a la mucosa gástrica humana, se debería más bien a sus constituyentes de alto peso molecular (procianidinas tipo A, [5]) (Burger et al., 2000). Basado en la evidencia arrojada por este último estudio, Zhang et al. (2005) realizaron un ensayo clínico aleatorizado, placebo‐controlado y doble ciego, en una población adulta de Linqu (China). En tal estudio, se demostró que la administración de 250 ml de jugo de cranberry (2 veces al día por 90 días) ayudó a la supresión de Hp en un 14% de la población estudiada. Estudios in vitro han demostrado que el jugo de cranberry asociado con otros extractos (Vitis vinifera; arándano y orégano) inhibe el crecimiento in Vitro de Hp en forma sinérgica, correlacionándose la mayor presencia de polifenoles con una mayor capacidad antioxidante de la “compleja” mezcla ensayada (Lin et al., 2005; Vattem et al., 2005a). Al respecto, se debe considerar que tal complejidad se relaciona con la presencia de otros constituyentes como ácidos fenólicos. Utilizando bioprocesamiento en estado sólido (con los hongos Rhizopus oligosporus y Lentinus edodes), los mismos investigadores lograron aumentar la extracción de los polifenoles de la pomasa de cranberry, obteniendo un producto con mayor efecto anti‐Hp (Vattem et al., 2005b). En una aproximación similar, otros investigadores (Correia et al., 2004) encontraron una actividad anti‐Hp en extractos (ricos en quercetina y estructuras tipo bifenilos) de desechos bioprocesados de la piña (Ananas cosmosus). Sin embargo, en este último estudio no se logró correlacionar la actividad anti‐Hp con la capacidad antioxidante de los extractos empleados; estos últimos concentraban compuestos con una mayor presencia de Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 41 grupos fenólicos (asociados a las propiedades antioxidantes de los polifenoles) (Correia et al., 2004). En otro estudio donde se evaluó la actividad antimicrobiana de 12 tipos de berries nórdicos sobre una serie de patógenos humanos, se encontró que Hp y Bacillus cereus fueron las bacterias más sensibles. Interesantemente, aunque se observó que los niveles totales de polifenoles disminuyeron durante el almacenamiento en frío, la actividad antimicrobiana no fue modificada significativamente (Nohynek et al., 2006). Por otra parte, en atención a su alta concentración de polifenoles, se ha investigado también una posible acción anti‐Hp en diferentes tipos de té. Estudios in vitro realizados con infusiones al 5% de té verde (Lung Chen, cv) demostraron la inhibición de la multiplicación de Hp (Yee et al., 2000), proponiendo que dicha actividad residiría en la presencia de un flavan‐3‐ol conocido como galato de epigalocatequina (EGCG, [6]). El mismo equipo de investigadores, realizó posteriormente un estudio prospectivo entre dos grupos de individuos, infectados con Hp (n = 42) y no infectados (n = 30), comparando el efecto del consumo de té con la presencia de Hp en biopsias gástricas. Se concluyó que habría una relación inversa y significativa entre el consumo de té y la infección por Hp (Yee et al., 2002). A la luz de los antecedentes dados por la etnomedicina, ocasionalmente avalados por estudios experimentales de validación farmacológica, se han buscado diversos modelos para explicar los mecanismos que posiblemente subyacerían a la acción anti‐Hp de los polifenoles presentes en los recursos etnomédicos y alimenticios anteriormente referidos. Dentro de los mecanismos propuestos, se ha explorado la relación entre el tipo de estructura de los polifenoles y su efecto como inhibidores de la actividad de VacA (medida como actividad vacuolizante y el flujo de urea transmembrana en células HeLa) (Tombola et al., 2003; Ruggiero et al., 2006). Así, el resveratrol [7], la morina [8], el ácido tánico [9] y el piceatanol [10] parecen compartir características estructurales que sugieren la existencia de interacciones específicas molécula‐molécula entre ciertos polifenoles y VacA. Otros polifenoles, con alta actividad antioxidante (incluso con mayor presencia de grupos fenólicos), como el ácido ellágico [11] y la miricetina [12], se mostraron total o parcialmente inactivos hacia VacA, respectivamente. Estos últimos compuestos están presentes en cantidades variables en muchos alimentos de origen vegetal y se les puede encontrar en altas concentraciones en el vino, cerveza, chocolate amargo y té verde. Recientemente, un antecedente adicional respecto a la existencia o bien ausencia de relación entre actividad antioxidante de los polifenoles y actividad anti‐Hp (medida como inhibición de vacuolación y del crecimiento de Hp) emergió del estudio de 13 diferentes tipos de estructuras flavonoideas, todas con propiedades antioxidantes (Shin et al., 2005). Dentro de los compuestos evaluados, sólo quercetina [1] y naringenina [13] (dos aglicones) inhibieron la vacuolación inducida por Hp en células HeLa. Como evidencia adicional en favor de la asociación no obligada entre actividad antioxidante y efecto anti‐Hp, Shin et al (2005) demostraron también que antioxidantes de estructuras tan disímiles como el ácido ascórbico, el glutatión, la epicatequina [14] y el trolox (análogo hidrosoluble del α‐tocoferol) tienen en común el ser inefectivos como inhibidores de VacA. Entre estos últimos antioxidantes, se ha evaluado la acción inhibitoria del crecimiento de Hp para epicatequina y vitamina C, siendo activa sólo esta última tanto in vivo como in vitro por un mecanismo aun no esclarecido pero que, en todo caso no estaría asociado al efecto del pH (Zhang et al., 1997; Mabe et al., 1999: Wang et al., 2000). La literatura informa que otro hecho relevante es que algunos polifenoles inhiben la activación de procaspasa‐3 a caspasa‐3 inducida por VacA, sin cambios en la expresión de las proteínas Bax y Bcl‐2 (proteínas antiapoptóticas). Por lo tanto, quercetina puede proteger a las células gástricas de la apoptosis inhibiendo la acción vacuolante de la toxina VacA de Hp. Si bien estas propiedades antioxidantes y citoprotectoras para los compuestos señalados son reconocidas, llama la atención que en otros modelos se observe una capacidad de inducir muerte y/o arresto de la proliferación en líneas celulares inmortalizadas derivadas de tumores (Wang, 2000; Lu et al., 2002). Esta polifuncionalidad por parte de algunos compuestos fenólicos (EGCG por ejemplo), es evidente si se considera que además, éstos podrían generar ambientes oxidativos diferenciales que permitan proteger a las células del huésped de las ERON y por otro lado promover la apoptosis de las células tumorales (Yamamoto, et al., 2003). Una hipótesis recientemente planteada para explicar el por qué solo ciertos antioxidantes polifenólicos se muestran activos contra Hp, considera el potencial efecto prooxidante que muestran ciertos polifenoles. La forma en que los polifenoles podrían actuar como generadores de especies reactivas del oxígeno fue abordada por varios investigadores (Aragawa et al., 2003; Arakawa et al. 2002, 2004; Aoshima et al. 2005), y utilizando como modelo de polifenol, catequinas de té verde (cuya propiedad bactericida es conocida), los autores demostraron que a pH 7‐8 (o superiores), tal tipo de estructura es capaz de generar cantidades significativas de peróxido de hidrógeno. De acuerdo a los autores, la generación de peróxido de hidrógeno podría explicar el efecto bactericida de los flavan‐3‐oles. La habilidad de las catequinas para generar peróxido de hidrógeno sería favorecida por el arreglo de grupos hidroxilo en este tipo de moléculas, lo +
que permitiría la disociación del H en solución y un Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 42 electrón en el fenol que reduce al oxígeno, generándose en consecuencia anión superóxido. El anión superóxido posteriormente sufre reducción por la catequina (ej. EGCG), lo que lleva a la formación de O2 2‐ ; adicionalmente, el protón se combina con el superóxido generando H2O2. Este mecanismo no sólo explicaría la generación de H2O2 producida por catequinas puras sino también por parte de infusiones de té negro, té verde y té Oolong ‐4
‐4 ‐4
correspondientes a 1.5 x 10 , 2.4 x 10 y 0.87 x 10 mol/l respectivamente. Estos niveles de H2O2 serían suficientes para ejercer una acción bactericida en cepas Gram positivas y negativas (Arakawa et al., 2004). Si bien es improbable que la generación de H2O2 ocurra en el medio gástrico, podría especularse que el mayor pH del periplasma de Hp, dado por la actividad ureasa, supondría un “ambiente” favorable a la formación de superóxido en presencia de ciertos polifenoles. Por otra parte, cabe mencionar que cepas de lactobacilos entéricos o gástricos, capaces de producir bacteriocinas, ácido láctico y acético, son también capaces de generar concentraciones bactericidas de H2O2 (Fernández, 2003; García et al., 2009). Interesantemente, los autores observaron que el co‐cultivo de Hp con lactobacilos entéricos o gástricos supone la inhibición del crecimiento de Hp. 4. LA ACTIVIDAD DE LOS POLIFENOLES COMO AGENTES GASTROPROTECTORES EN LA INFECCIÓN POR Helicobacter pylori. Los polifenoles son constituyentes comunes de plantas medicinales y de uso alimenticio cuya principal ventaja radica en la baja toxicidad respecto de otras substancias. Tal como se describió anteriormente, muchos polifenoles en forma aislada han mostrado diferentes grados de actividad anti‐Hp (sección 3). Cabe notar, sin embargo, que la evidencia de que un determinado componente de un extracto es activo contra Hp no necesariamente debe ser interpretada como evidencia de que el extracto, como tal, compartirá también la actividad observada para el componente aislado. Si bien son escasos los estudios dirigidos a evaluar la actividad anti‐Hp de los compuestos aislados, para algunos de los polifenoles se ha demostrado una actividad anti‐ureasa y/o anti‐VacA. Este es el caso para los flavonoides (derivados de quercetina), las procianidinas (tipo‐B, [15]), y la floridzina [16]. En el caso de los flavonoides mencionados, Shin et al., (2005) ha descrito que dichos compuestos inhiben la vacuolación inducida por Hp en células HeLa y que adicionalmente tendrían una moderada actividad inhibitoria de la ureasa. En el caso de las procianidinas, utilizando extractos de Vitis vinifera ricos en procianidinas tipo B y C, Lee et al. (2006) observó que dichos compuestos son particularmente activos inhibiendo la ureasa (ya a una concentración de 0.1 mg/mL). En el caso de la floridzina, se ha encontrado que esta chalcona promueve una acción anti‐Hp inhibiendo la actividad formadora de poros de la toxina VacA. La actividad anti‐VacA (IC50= 273 µM) de floridzina es, sin embargo, extremadamente baja respecto a la del ácido tánico (IC50= 2,7 µM), observado como el polifenol más activo en dicho estudio. Respecto al ácido tánico, se ha establecido que éste (en asociación con N‐propil‐galato) es muy efectivo en inhibir la gastritis en un modelo de ratón infectado por Hp o por VacA (Ruggiero et al., 2006). Adicionalmente, se ha comprobado que ciertos polifenoles de alto peso molecular como las procianidinas oligoméricas extraídas de lúpulo, son capaces de formar complejos con VacA in vitro (Yahiro et al., 2005; aspecto revisado por Friedman, 2007). Yahiro observó que la interacción entre las proantocianidinas oligoméricas (con un grado de polimerización promedio equivalente a 22 unidades de catequina) y la toxina VacA constituye un potencial mecanismo de neutralización de virulencia de la bacteria. Dichos compuestos fueron efectivos bloqueando la unión de VacA a sus receptores RPTPα y RPTPβ, inhibiendo la unión no específica de VacA a la membrana celular, disminuyendo la vacuolación celular in vitro y atenuando en forma significativa la gastritis inducida en ratones por la administración de VacA. De la misma forma, Ruggiero et al, (2007) demostraron que la administración de extractos de vino tinto y/o de té verde a ratones a los cuales se les indujo gastritis por infección con Hp o por administración de la toxina VacA, tienen un claro efecto gastroprotector, sugiriendo que la toxina sería un potencial blanco molecular de los polifenoles presentes en los extractos utilizados. Interesantemente, Hamauzu et al., 2006, observó que en relación a los extractos de pulpa de manzana, extractos de pulpa de membrillo tienen un efecto antiulcerogénico claramente mayor sobre la injuria gástrica inducida por etanol y HCl. Los autores sugieren que la diferencia en la efectividad anti‐ulcerogénica de dichos extractos residiría en la notablemente mayor concentración de procianidinas con un alto grado de polimerización promedio en la pulpa del membrillo (DP=29) relativo a la pulpa de manzana (DP=3). En relación a esto último, Saito et al., (1998) había reportado previamente que extractos de semilla de Vitis vinifera, así como sus procianidinas (de alto PM), tienen un efecto antiulcerogénico; los autores postularon que parte de dicho efecto se debería a la fuerte unión de estos compuestos a proteínas presentes en la mucosa gástrica, permitiendo la formación de una barrera protectora con potencial actividad antioxidante y antiinflamatoria local. En efecto, recientemente se ha establecido que extractos de pulpa de manzana, ricos en polifenoles, promueven una acción antioxidante y citoprotectora en cultivos primarios Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 43 de células de mucosa gástrica (MKN‐28) sometidas a un sistema xantina‐xantino oxidasa, como generador de radicales anión superóxido (Grazziani et al., 2005). El efecto protector de dichos extractos ha sido observado también en un modelo in vivo de injuria a la mucosa gástrica inducida por la administración de indometacina Grazziani et al., 2005). Interesantemente, el daño oxidativo y las lesiones a la mucosa gástrica inducidas por indometacina son exacerbadas por la infección con Hp (Arend et al., 2005). Figura 1. Principales blancos moleculares de los polifenoles sobre H. pylori. En otro estudio, se ha establecido que extractos de cáscara de manzana inhiben, tanto in vitro como in vivo, la activación de AP‐1 y la transformación neoplásica (Ding et al., 2004). La activación del complejo AP‐1 es uno de los eventos claves en la promoción de tumores mediada por la citotoxina CagA de Hp. Al respecto, se ha sugerido que los polifenoles de manzana podrían inhibir la activación de AP‐
1 interfiriendo con la señalización vía MAP kinasas, ERK y JNK. Mediante experimentos de ESR, Ding et al. (2004) confirmaron el efecto estabilizador de los extractos de manzana sobre los radicales OH. y O2.‐. Esto último sería particularmente relevante dado que, ERKs, JNKs y p38 son moléculas activadas en respuesta a estímulos oxidantes. Finalmente, en estudios adicionales conducidos en ratones, los mismos autores demostraron que los extractos también inhiben la inducción de tumores por TPA (éster 12‐O‐tetradecanoil‐forbol‐13‐acetato). El efecto de los polifenoles sobre el estallido respiratorio inducido por PMA y fmlp en neutrófilos ha sido reportado por Limasset y colaboradores (Limasset et al., 1993). Los autores evaluaron el efecto de 34 polifenoles sobre la producción de ROS concluyendo que ésta depende del estímulo, llegando en algunos casos a ser opuesta. Lo anterior sugiere que existen diferentes mecanismos mediante los cuales estos compuestos pueden inhibir la producción de especies reactivas es dicho contexto celular. En otro trabajo, Krol y colaboradores (1992) estudiaron 14 flavonoides, confirmando que un grupo hidroxilo en el C‐3, dos hidroxilos en el anillo B y la presencia de un doble enlace entre C‐2 y C‐3, son de vital importancia para la inhibición de la producción de ROS en neutrófilos. Los mismos investigadores además sugieren que la liposolubilidad podría ser una de las propiedades preponderantes para que la actividad de los flavonoides sea relevante en dicho sistema celular. Posteriormente, Limasset et al., (1999) evaluaron un grupo de 18 polifenoles y algunos de sus metabolitos putativos como algunos ácidos fenólicos. Ellos observaron que los metabolitos resultaron ser inhibidores menos potentes y específicos que los compuestos parentales. Moreira y colaboradores (2007) estudiaron el efecto de cuatro flavonoides (quercetina [1], miricetina [12], canferol [17] y galangina [18]) sobre la producción de ROS en neutrófilos de conejo estimulados con dos receptores del complemento (FcγR, CR). Interesantemente, aunque la actividad de los flavonoides sobre la producción de ROS pareció ser independiente del receptor estimulado, sí mostró estar directamente relacionada con la liposolubilidad del compuesto estudiado e inversamente correlacionada con el número de hidroxilos presentes en el anillo B. Como se indicó previamente, debido a la alteración en el ensamblaje del complejo NADPH oxidasa, la producción de ROS inducida por Hp podría ser responsable de la exacerbación del daño a la mucosa gástrica por lo tanto, la presencia de antioxidantes eficaces en la biofase donde ocurre este fenómeno es muy importante. En estudios realizados por nuestro grupo, los flavonoides presentes en un extracto de manzana (APPE) fueron capaces de neutralizar la producción de ROS y atenuar el daño a la mucosa de animales infectados con Hp (Pastene et al., 2009b). El APPE posee una importante concentración de glicósidos de quercetina (58% del total de polifenoles), siendo la rutina [19], hiperósido [20], isoquercitrina [21] y quercitrina [22] los más importantes. Estos resultados nos permitieron concluir además, que mientras algunos compuestos fenólicos ayudan por sus consabidas propiedades antioxidantes y antiinflamatorias, otros neutralizan factores de virulencia como la ureasa, VacA y las adhesinas de este patógeno (Pastene et al., 2010). En efecto, utilizando el mismo APPE, previamente habíamos descubierto que la ureasa de Hp podía ser inhibida en forma muy eficiente. Sin embargo, tal efecto Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 44 sólo pudo ser asociado al otro grupo de polifenoles identificados en la manzana, las proantocianidinas (Pastene et al., 2009a). Las proantocianidinas se conocen también como taninos condensados y son abundantes en varias plantas medicinales como el Espino blanco, Ginkgo biloba e hipérico pero, además son constituyentes normales de ciertos alimentos como el chocolate, vino tinto, jugo de cranberry y manzana. En dichos frutos, normalmente las cáscaras y/o semillas concentran proantocianidinas y pueden ser utilizados como fuente para su obtención a bajo costo. Así, en otra iniciativa ideada por nuestro laboratorio (PFT‐014, Universidad de Concepción), las cáscaras de paltas fueron aprovechadas para la obtención de un polvo enriquecido en proantocianidias con elevado poder anti‐ureásico (Chávez et al., 2011). Este proyecto dio origen a otro financiado por Innova Bio‐Bio (2012) que tiene por objeto realizar los estudios de diferentes variedades, optimización del rendimiento y desarrollo de operaciones de escalamiento con el fin de calcular la rentabilidad de la producción del extracto de cáscara de palta. Sin embargo, hasta ahora, los estudios llevados a cabo con las procianidinas de manzana y palta sólo nos habían permitido visualizar la importancia del grado de polimerización sobre la actividad inhibitoria de la enzima. Producto de estudios realizados en proantocianidinas obtenidas de otras fuentes vegetales, quedó de manifiesto que la naturaleza de los monómeros que las originan y probablemente las diferentes conformaciones espaciales que adoptan en solución, son factores críticos en su actividad biológica. Tal situación representa un grado de complejidad adicional y que motivó que recientemente nuestro grupo de investigación se adjudicara el proyecto Fondecyt titulado “Structure‐
activity relationship of natural and semi‐synthetic proanthocyanidins as anti‐Helicobacter pylori molecules through the inhibition of its urease activity and adherence to AGS cells” (N°11110442). Esta iniciativa aborda por primera vez en nuestro país la investigación de interacciones químico‐biológicas entre Hp y polifenoles, centrándose en las proantocianidinas extraídas de diversas materias primas como plantas medicinales, orujos de uva, pomasa de cranberries y las cáscaras de manzana y paltas, por nombrar algunas. 5. CONCLUSIONES En virtud de los antecedentes que indican que algunos polifenoles muestran una interesante actividad anti‐Hp (ya sea promoviendo una acción antimicrobiana directa, o bien indirectamente afectando la virulencia y/o sobrevivencia de la bacteria). Tal como se observa en la Figura 2 los potenciales blancos moleculares o sitios de acción que los compuestos polifenólicos pudieran tener como agentes destinados a complementar el manejo de la infección por Hp y/o de sus consecuencias. Algunos de estos blancos moleculares (Ureasa, VacA, flagelos, adhesinas), están siendo estudiados en profundidad por nuestro grupo de investigación. Sin embargo, la inhibición de otros factores altamente relevantes y especializados como la toxina CagA, permanecen aun difíciles de neutralizar. Los productos fitoterapéuticos y alimentos diferenciados (funcionales), debieran estar orientados en primera instancia a la prevención y en segundo lugar a complementar las estrategias terapéuticas existentes. Si bien algunos polifenoles pueden interaccionar específicamente con varios factores de virulencia de la bacteria, incluso comprometiendo su viabilidad, otros lo hacen en forma muy inespecífica. Claramente, se requiere mucha evidencia preclínica y clínica que avale la real contribución de muchos productos enriquecidos en polifenoles en el manejo eficaz de esta infección y sus alcances intra y extragástricos. AGRADECIMIENTOS Proyecto Fondecyt N° 11110442, INNOVA BIOBIO 12.57‐
EM.TES (12.171), CONICYT Programa Formación de Capital Humano Avanzado/ Beca de Magíster en Chile, Año Académico 2012 15550904, Proyecto Interno Universidad de Concepción Nº 212.085.033‐1.0 BIBLIOGRAFÍA: Akhter Y., Ahmed I., Devi M., Ahmed N. The co‐evolved Helicobacter pylori and gastric cancer: trinity of bacterial virulence, host suceptibility and lifestyle. Infectious Agents and Cancer. 2007, 2: 2‐5. Alamuri P., Maier R. Methionine sulfoxide reductase in Helicobacter pylori: Interaction with methionine‐rich proteins and stress‐induced expression. J. Bacteriol. 2006, 188(16): 5839‐5850. Alberto MR., Canavosio MAR., Manca de Nadra MC. Antimicobial effect of polyphenols from apple skins on human bacterial pathogens. Electron. J. Biotechnol. 2006, 9(3): 205‐209. Allen, L.A. The role of neutrophil and phagocytosis in infection caused by Helicobacter pylori. Curr. Opin. Infect. Dis. 2001, 14(3), 273‐277. Allen LA., Beecher BR. Lynch JT., Rohner OV., Wittine LM. Helicobacter pylori disrupt NADPH oxidase targeting in Human neutrophils to induce extracellular superoxide release. J. Immunol. 2005, 3658‐3667. Amieva MR., Vogelmann R., Covacci A., Tompkins LS., Nelson WJ., et al. Disruption of the epithelial apical‐junctional complex by Helicobacter pylori CagA. Science. 2003, 300:1430‐1434. Aragawa M., Shigemitsu T., Suyama K. Production of hydrogen peroxide by polyphenols and polyphenol‐rich beverages under quasi‐physiological conditions. Biosci Biochem Biotech. 2003, 67(12): 2632‐2640. Arakawa H., Kanemitsu M., Tajima N., Maeda M. Chemiluminescence assay for catechin based on generation of hydrogen peroxide in basic solution. Anal. Chim. Acta. 2002, 472: 75‐82. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 45 Arakawa H., Maeda M., Okubo S., Shimamura T. Role of hydrogen peroxide in bactericidal action of catechin. Biol Pharm Bull. 2004, 27(3): 277‐281. Arend A., Loime L., Roosaar P., Soom Marge., Krista L., Sepp E., Aunapuu A., Zilmer K., Selstam G., Zilmer M. Helicobacter pylori sustantially increases oxidative stress in indomethacin‐exposed rat gastric mucosa. Medicina (Kaunas). 2005, 41(4): 343‐347. Atherton JC, Peek RM., Tham KT., Perez‐Perez GI., Blaster MJ. Quantitative culture of Helicobacter pylori in the gastric antrum: association of bacterial density with duodenal ulcer status and infection with cagA positive bacterial strains, and negative association with serum IgG levels. Am. J Gastroenterol. 1994; 89: 1322. Avorn J., Monane M., Gurwitz JH., Glynn RJ., Choodnovsky I., Lipsitz LA. Reduction of bacteriuria and pyuria after ingestion of cranberry juice. JAMA. 1994, 271: 751‐754. Blaser MJ., Atherton JC. Helicobacter pylori persistence: biology and disease. J. Clin Invest. 2004, 113: 321‐333. Burger O., Ofek I., Tabak M., Weiss E., Sharon N., Neeman I. A high molecular mass constituent of cramberry juice inhibits Helicobacter pylori adhesion to human gastric mucus. FEMS Immunol Med. Microbiol. 2000, 29: 295‐301. Chávez, F., Aranda, M., García, A., Pastene, E. Los polifenoles antioxidantes del epicarpio de Palta (Persea americana var. Hass) inhiben la ureasa de Helicobacter pylori. BLACPMA. 2011, 10(3): 265‐280. Clifford MN. Diet‐Derived Phenols in Plasma and Tissues and their Implications for Health. Planta Med. 2004, 70: 1103‐1114. Comtois SL., Gidley MD., Kelly DJ. Role of the thioredoxin system and the thiol‐peroxidases Tpx and Bcp in mediating resistance to oxidative and nitrosative stress in Helicobacter pylori. Microbiology. 2003, 149: 121‐
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Unidad de Screening de Compuestos Neuroactivos, Laboratorio de Neurobiología Molecular, Laboratorio de Neurofisiología, Departamento de Fisiología, Facultad de Cs. Biológicas, Universidad de Concepción, Chile. RESUMEN ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ La búsqueda de compuestos bioactivos presentes en la biosfera, es un esfuerzo milenario de las civilizaciones que se ha enfocado a obtener productos, moléculas y finalmente fármacos que ayuden a aliviar, tratar o recuperar al organismo de una situación patológica o anormal. Desde los egipcios (papiro de Ebers), pasando por los árabes hasta nuestros días, la fuentes naturales presentes en la biomasa nos han proporcionado invaluables recursos, con un alto potencial terapéutico para su uso en medicina humana. Claros ejemplos de irremplazables herramientas farmacológicas, que ha impactado en el desarrollo del ser humano, son las penicilinas, la efedrina, y la cocaína por ejemplo. Moléculas como las mencionadas, han demostrando tener perfiles farmacológicos diversos en efectos y potencias, permitiendo de alguna forma la caracterización de receptores y de otra, el desarrollo de medicamentos de amplio uso (o abuso). Desde la alquimia a nuestros días, el deseo por buscar la fuente de la vida eterna, se ha transferido a la ciencia moderna, como la responsabilidad de encontrar nuevas alternativas farmacológicas capaces de resolver los problemas asociados al envejecimiento, en especial aquellas relacionadas al deterioro fisiológico o patológico del sistema nervioso. Preservar en el tiempo las funciones cognitivas del individuo, o retrasar su deterioro, nos desafían permanente y urgentemente a encontrar soluciones para patologías como el Alzheimer, ELA y Parkinson, que hasta el momento, no tienen una cura definitiva. Este trabajo, revisa los principales hallazgos de nuestras investigaciones, relacionadas con la caracterización farmacológica de compuestos neuroactivos obtenidos desde la naturaleza nativa del país. Cabe mencionar, que de los compuestos estudiados, algunos como la tutina, una sesquiterpenolactona obtenida de Coriaria ruscifolia: se proyecta como un potente agente neuroléptico; NE10, un neuroesteroide obtenido desde un residuo de celulosa (tail oil): como un sedante no hipnótico que potencia los efectos de acepromazina; o un conjunto de polifenoles obtenidos de maqui, que han demostrado una potente actividad neuroprotectora en un modelo de Alzheimer, son parte de los resultados más relevantes comentados en esta revisión. Palabras claves: Neuroprotección, tutina, Alzheimer, Receptor de Glicina, Receptor de GABAA , epilepsia. Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ INTRODUCCIÓN Desde tiempos milenarios, el ser humano ha utilizado sus capacidades cognitivas y racionales para observar la naturaleza y encontrar en ella sustancias, preparados y finalmente fármacos de enorme relevancia para su salud, su bienestar, su desarrollo y evolución. Así ejemplo, el “papiro de Ebers”, es una de la primeras referencias de medicina, donde se recopilan antecedentes de más de 700 sustancias con aplicación terapéutica (Hallmann‐Mikolajczak 2004; York et al. 2010). ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Correspondencia a: Dr. Jorge Fuentealba Arcos, Departamento de Fisiología, Facultad de Cs. Biológicas, Universidad de Concepción. Barrio Universitario s/n Concepción. POBOX 160‐C. Teléfono: 56‐041‐2661082. Correo Electrónico: jorgefuentealba@udec.cl Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 51 Pedacio Dioscórides y Galeno fueron dignos representantes de la medicina griega, que también hicieron significativos aportes al estudio y aplicación de sustancias naturales en el tratamiento de enfermedades. Este proceso de conocimiento y desarrollo, detenido durante la inquisición, reservó el estudio de las propiedades terapéuticas de plantas y otras especies, a conventos y monasterios durante ese período (ej.: El licor monacal y el Benedictino). Los alquimistas (s XVI), fueron los responsables de dar un nuevo impulso al estudio de las sustancias de origen natural, en especial Paracelso, un alquimista pionero en su época. De ahí en adelante, el desarrollo de conocimiento basado en el estudio de los compuestos activos presentes en plantas y diferentes especies de la biomasa conocida, sufre un crecimiento vertiginoso y van apareciendo detallados estudios de principios activos que han marcado la historia de la farmacología, como por ejemplo el acido acetilsalicílico, las penicilinas, la cocaína, y otras sustancias neuroactivas que se describen en la tabla 1. Tabla 1. CNVD: Canales de Sodio Voltaje Dependientes; CCVD: Canales de Calcio Voltaje Dependientes; TRVP: Receptores Vanilloides; RGly: Receptores de Glicina; RGABAA: Receptores de GABA tipo A; RN: Receptor Nicotínico; RM: Receptor Muscarínico; SK: Canales de Potasio activados por Calcio de Baja conductancia. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 52 El estudio y caracterización farmacológica de moléculas, principios activos o preparados de origen natural, con actividad en el sistema nervioso, han contribuido significativamente al entendimiento de los mecanismos celulares y moleculares con que se regulan las funciones neuronales, así la cocaína se transformo en 1884 en el primer anestésico local utilizado en oftalmología (Aguayo et al. 2006), por su acción bloqueadora de canales de Na+ voltaje dependientes (Strichartz 1988) y por ende, de la transmisión del impulso nervioso. Una aplicación similar se dio al curare (S. toxifera), aplicado en anestesia general ya en la década de los 40s (Griffth 1942), pero esta vez con una acción bloqueadora sobre el receptor nicotínico muscular (RNM), lo que inhibe la comunicación entre la moto neurona eferente y el músculo en la placa neuromuscular, y así la contracción muscular (tono). Por otra parte, el bloqueo de Canales de Ca2+ voltaje dependientes (CCVD), por medio del uso de toxinas provenientes de diferentes fuentes, como caracoles marinos y arañas, han permitido la caracterización farmacológica y el entendimiento del rol que cumplen los diferentes subtipos de canales de Ca2+ a nivel neuronal (Olivera et al. 1984; Monje et al. 1993; Olivera et al. 1994); especialmente su contribución en los mecanismos claves de la señalización celular, como por ejemplo la exocitosis (Berridge et al. 2003; Garcia et al. 2006). testigos las reuniones de la Sociedad de Farmacología de Chile. TUTINA UNA POTENTE TOXINA CON POTENCIAL APLICACIÓN COMO NEUROLÉPTICO/ANSIOLÍTICO. La tutina, es una sesquiterpenolactona que fue obtenida y purificada a partir del fruto maduro de Coriaria ruscifolia, y que presenta como farmacóforo un anillo picrotoxoide similar a la clásica picrotoxina (figura 1A). Nuestro interés en estudiarla nació de un reporte clínico de una intoxicación en niños que consumieron este fruto por error, y que tuvo un desenlace fatal en uno de los casos (Hoffmann 1982). Figura 1. El incremento progresivo en la prevalencia de enfermedades neurodegenerativas producto del incremento en las expectativas de vida (Alzheimers‐
Association 2012), nos ha obligado nuevamente a mirar los potenciales que tiene la naturaleza, buscando en ella, alternativas terapéuticas útiles en el tratamiento de enfermedades que hoy en día no tienen una cura definitiva o un tratamiento eficiente; Es el caso de la enfermedad de Alzheimer (EA) o la enfermedad de Parkinson (PK). Considerando que muchos de los compuestos presentes en la naturaleza son altamente selectivos (ver tabla 1) y de altísima potencia (la mayoría actúa en el rango pM‐nM, (Aguayo et al. 2006)), es que resulta atractivo centrar los esfuerzos en obtener nuevos principios activos de origen natural, que nos permitan plantear alternativas en el desarrollo fármacos, o fitofármacos útiles en la modulación del SNC y en el tratamiento de las enfermedades que lo afectan. El objetivo de esta revisión es repasar los principales hallazgos científicos obtenidos en el Laboratorio de Screening de Compuestos Neuroactivos del Departamento de Fisiología de la Universidad de Concepción, en el cual se han caracterizado farmacológicamente, una serie de compuestos neuroactivos con una potencial proyección hacia fitofármacos o formulaciones nutracéuticas útiles en patologías neurodegenerativas con AD y PK. Una Historia de investigación de los últimos 7 años, de la que han sido A. Estructura química de picrotoxina (izquierda) y tutina (derecha), nótese las similitudes estructurales y las diferencias en los epóxidos del anillo biciclo. B corrientes sinápticas espontáneas de neuronas espinales en condiciones control (izquierda) y en presencia de tutina (200 µM) medidas por la técnica de patch clamp (whole cell, voltage clamp)(tomado y modificado de Fuentealba et al., 2007). Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 53 Curiosamente, el fruto de esta planta (aparte de ser venenoso), es dulce, lo que puede atraer la curiosidad sin la necesidad de advertir de su peligro. Esta planta ha sido denominada comúnmente como “maqui del diablo” por sus efectos tóxicos en seres humanos, como mioclonias y cuadros epileptogénicos (Hoffmann 1982); o “matarratones”, por su letalidad para roedores. En un estudio que comenzamos a realizar en 2005, determinamos que tutina (1‐1000 µM) era capaz de bloquear las corrientes glicinérgicas medidas por electrofisiología, en neuronas espinales de ratón; esto provoca un incremento importante en la excitabilidad de la red neuronal (figura 1B), que además mostraba ser concentración dependiente (Fuentealba et al. 2007); Adicionalmente, ambos hallazgos se correlacionaron estrechamente con un incremento en las transitorios de 2+
Ca intracelular (probablemente por un predominio del tono AMPAérgico); y con un incremento de los niveles citosólicos de CREB fosforilado, lo que en su conjunto representaba un drástico incremento de la actividad de la red neuronal. Sin duda, que estos efectos daban sustento a las descripciones de los cuadros de intoxicación observados (mioclonías, convulsiones y ataques epilépticos) en humanos y roedores (Fuentealba et al. 2007). Adicionalmente, en un estudio posterior de caracterización de los efectos de tutina en diferentes subtipos de los receptores de glicina expresados en un modelo heterólogo (células HEK), pudimos establecer la diferente sensibilidad, de los distintos subtipos de receptores de glicina estudiados, a la acción bloqueante de tutina; obteniendo IC50s de 35 µM y 15 µM para α1 y α2 respectivamente (Figura 2A, (Fuentealba et al. 2011)). Este antecedente es sumamente importante, ya que de acuerdo a investigaciones previas, en el proceso de maduración neuronal, los receptores glicinérgicos neuronales (espinales) inmaduros, están conformados fundamentalmente por la subunidad α2 (van Zundert et al. 2004). Figura 2. A. Curva Concentración‐respuesta de tutina en receptores homoméricos de glicina α1 y α2 expresados en células HEK (tomado y modificado de Fuentealba et al., 2011). B. Efectos de potenciación de tutina en un mutante del receptor α1 de glicina resistente a etanol, nótese que en ausencia de potenciación del receptor por etanol, tutina sigue potenciándolo (tomado y modificado de Fuentealba et al., 2011). Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 54 Esto quiere decir que los niños (sistemas neuronales inmaduros) son más sensibles al efecto de la toxina (tutina), debido a la presencia principalmente de receptores α2, lo que al cambiar en el adulto, donde la composición principal de estos receptores esta dado por la subunidad α1, hace a un adulto más resistente o tolerante al efecto de tutina y a los niños mucho más sensibles (Fuentealba et al. 2011). Valiéndonos de herramientas de biología celular, establecimos también, la importancia de algunos residuos en el dominio transmembrana 2 (TM2) del receptor de glicina para la acción inhibitoria de tutina. Al igual que picrotoxina, mutaciones en este dominio cambian las propiedades de conductancia del receptor (Hawthorne et al. 2005), y la susceptibilidad a la inhibición ejercida por tutina. Sin embargo, lo más curioso fue observar que bajas concentraciones de tutina, ésta era capaces de inducir una potenciación de receptores homo y heteroméricos, no observada con picrotoxina, y que este potenciación ocurría por una modulación de un sitio distinto al que utiliza etanol (figura 2B) para potenciar a estos receptores (Castro et al. 2012); esto sugiere la presencia en el receptor de un sitio específico de alta afinidad para esta acción, y otro de baja afinidad para el efecto inhibitorio (Fuentealba et al. 2011). Esta última observación, proporciona un potencial importantísimo a la tutina, que insisto no presenta picrotoxina, y que representa la base para el desarrollo de una familia de moléculas con actividad neuroléptica; donde por ejemplo, por medio de estudios modelamiento (Perez et al. 2011), nos permita conocer en profundidad las estructuras claves del farmacóforo y del receptor, que permitan el desarrollo futuro de principios activos con la mencionada actividad y con la ventaja de ser altamente selectivos. POLIFENOLES, NEUROPROTECCIÓN Y ALZHEIMER La enfermedad de Alzheimer es una patología neurodegenerativa caracterizada por una falla cognitiva compleja y progresiva, que hasta el día de hoy no tiene un tratamiento farmacológico efectivo (Arroyo et al. 2002; Alzheimers‐Association 2012). Los actuales tratamientos, dependiendo de la etapa en que se apliquen, solo pueden contribuir a una disminución en la velocidad de progresión de la enfermedad (Corbett et al.). A pesar de que los voces especializadas apuntan a desarrollar buenos biomarcadores, que permitan “adelantar” el diagnostico de la enfermedad (Hampel et al. 2010), la posibilidad de encontrar en la naturaleza, nuevos compuestos útiles en esta patología, como lo es la galantamina, es una opción que no podemos descartar. La galantamina, es un alcaloide obtenido desde la especie Galantus nivalis (campanilla de nieve), que modula alostéricamente al receptor nicotínico neuronal (α7 y α3β4) (Arroyo et al. 2002) y ha mostrado una eficacia moderada en el tratamiento de las etapas tempranas de la enfermedad (Corbett et al.). En función de ello, nuestro grupo ha centrado sus esfuerzos en el estudio de la fisiopatología de la enfermedad a través del uso de modelos neuronales in vitro, y en ellos hemos caracterizado ampliamente el efecto del péptido βA (Cuevas et al.; Parodi et al. 2010; Sepulveda et al. 2010). Así, focalizamos nuestro interés inicial, en buscar moléculas que puedan modular algunas de las vías alteradas en esta patología, y la generación aumentada de radicales libres en ellas (Adam‐Vizi et al. 2006). De acuerdo a estos antecedentes, moléculas con capacidad antioxidantes de alta potencia, que proporcionasen a la mitocondria, un soporte frente a la generación de radicales libres descrita en la enfermedad, se planteaba como un buen punto de partida. Por lo tanto, trabajamos en obtener un extracto enriquecido en polifenoles desde un fruto que tuviese una alta cantidad de antioxidantes (polifenoles) descrita, como por ejemplo, el arándano (Vaccinium corymbosum). Así, utilizando como modelo de estudio neuronas hipocampales de rata, tratadas con péptido β‐amiloide (βA, oligomeros solubles), ensayamos los efectos neuroprotectores de un extracto de arándanos enriquecido en polifenoles, lo llamamos BB‐4. Incubaciones crónicas con βA (24 h) mostraron una drástica reducción de la actividad sináptica espontánea (medida por electrofisiología), como también del número de vesículas de neurotransmisores contendidos en las células (inmunomarcaje de SV‐2, SNAP‐25, etc); ambos parámetros, fueron revertidos parcialmente por la co‐
incubación del péptido con BB‐4 (0.81 mg/mL), mientras que la actividad de transientes espontáneas de Ca2+ citosólico, experimentaron una recuperación entre 25‐30% (Fuentealba et al. 2011). Adicionalmente, observamos que el péptido βA era capaz de inducir la fuga de ATP desde el citosol al medio extracelular, lo que hasta el momento no había sido descrito. Esta observación, nos instó a redirigir nuestra atención, trabajos previos de nuestro grupo, han demostrado que el péptido βA es capaz de formar un poro de alta conductancia a Ca2+, silenciar la actividad sináptica y depletar los terminales sinápticos de vesículas de neurotransmisores (Parodi et al. 2010; Sepulveda et al. 2010); pero hasta el momento no se había descrito la posibilidad de que moléculas de relevancia fisiológica “escaparan” del citosol a través de este poro; por lo tanto, estudiamos si el extracto BB‐4 podría tener una acción sobre los niveles intra‐ y extracelulares del ATP, de esta forma intentar asociar de alguna forma los mecanismos tóxicos del péptido con la disfunción mitocondrial. Así, en el efecto neuroprotector de BB‐4 mostró ocurrir por un mecanismo diferente a la directa acción sobre el potencial de membrana mitocondrial; de hecho, BB‐4 prevenía eficientemente la acción tóxica de un desacoplante mitocondrial clásico (FCCP, 20 µM) en aproximadamente un 80%, pero era incapaz de revertir el cambio en el Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 55 potencial de membrana mitocondrial inducido por βA. Esto sugería que el efecto de este extracto transcurría por una acción previa al desbalance en la generación de radicales libres (e interferencia con el potencial de membrana mitocondrial). Finalmente pudimos constatar, que BB‐4 ejercía una acción sobre el estado de agregación de las especies oligoméricas del péptido βA, con lo cual alteraba sus propiedades tóxicas (perforantes) y disminuía así, la sobrecarga de Ca2+ citosólico y mitocondrial, la pérdida del potencial de membrana mitocondrial y los efectos tóxicos que llevaban a la muerte a las neuronas hipocamapales (Fuentealba et al. 2011). Sin embargo, esto no descarta que las propiedades antioxidantes de los polifenoles contenidos en el extracto, tengan un efecto antioxidante, y seguramente constituyen un mecanismo adicional de protección en etapas crónicas de uso. Con estos hallazgos pudimos plantear que BB‐4 podría ser un importante complemento nutricional o un coadyuvante en la prevención de la aparición de este tipo de patologías en individuos adultos mayores, los que nos hizo acreedores a un importante premio a nivel nacional. Siguiendo con el razonamiento anterior, respecto a la actividad de los polifenoles contenidos en especies y frutos nativa de Chile, y con una visión de desarrollo que potencie su riqueza, quisimos estudiar unos de los frutos nativos del país que tiene descrito, un alto contenido de moléculas polifenólicas y una potente capacidad antioxidante (Rubilar et al. 2011), y por ello nos enfocamos en el maqui (Aristotelia chilensis). Preparamos como en el caso anterior, con la ayuda del laboratorio de Química de Productos Naturales de la Facultad de Cs. Naturales y Oceanográficas de nuestra Universidad, un extracto a partir de fruto fresco maduro enriquecido en polifenoles (MQ), y ensayamos sus capacidades neuroprotectoras en nuestro modelo neuronal de neurodegeneración. Observamos que MQ era capaz de proteger a las neuronas, manteniendo la viabilidad celular (MTT) en un 95% frente al estimulo tóxico de βA (0.5 µM, 24 h), lo que se asoció a un mantenimiento de la citoestructura neuronal. En paralelo, parámetros de actividad de la red neuronal como 2+
son la frecuencia de oscilaciones transitorias de Ca citosólico (Figura 3A) y la actividad electrofisiológica espontánea (Figura 3B), también presentaron una protección frente al estimulo tóxico de βA; mientras que un efecto similar se observó en el inmunomarcaje de proteínas claves de la exocitosis (SV‐2). Finalmente, estudios cinéticos y de fluorescencia, demostraron que el extracto MQ tiene una alta potencia en cambiar el estado y la velocidad de agregación del péptido βA, impidiendo la formación de especies tóxicas y favoreciendo la sobrevida neuronal con una mayor eficiencia de lo que habíamos observado previamente con BB‐4. Figura 3. A. Registros originales de las oscilaciones transitorias de Ca2+ citosólico registradas por microfluorimetría (Fluo4‐AM) en neuronas hipocampales de rata, en presencia de βA (0,5 µM) y MQ (0,81 mg/mL, B. Corrientes sinápticas espontáneas obtenidas por patch clamp en similares condiciones que en A. (tomado y modificado de Fuentealba et al, 2012). Tomando en consideración estos hallazgos, continuar con el desarrollo de productos naturales que permitan mejorar la calidad de vida de las personas, constituyen un hito relevante, más aún si esto se alcanza con investigación nacional, con fuentes naturales nativas del país, y con recursos públicos de apoyo a la investigación. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 56 Ello proporciona un valor agregado al conocimiento científico generado, y así mismo, a las potencialidades de desarrollo tecnológico e innovativo del país. El uso de extractos enriquecidos en polifenoles, pueden representar una importante utilidad en la prevención de enfermedades neurodegenerativas, por medio de un consumo permanente de frutos o preparados nutracéuticos, de forma de mantener una alta calidad en la ingesta de alimentos, y a la vez nos permite desarrollar un paradigma similar al propuesto al consumo moderado de vino tinto, que se ha establecido como un reductor de riesgo cardiovascular en su consumo crónico. Siguiendo este razonamiento, estamos en condiciones de plantear que el consumo crónico de maqui y sus polifenoles ayudarían a reducir el riesgo de padecer o retrasar la aparición de enfermedades neurodegenerativas tipo Alzheimer. SEDANTES, AGENTES DOPAMINÉRGICOS Y MODULADORES NICOTÍNICOS Sin duda que el espectro de usos y aplicaciones farmacológicas de los compuestos presentes en la naturaleza, con acción en el sistema nervioso central son múltiples; así, hemos desarrollado estudios con un derivado esteroideo de progesterona obtenido desde un residuo industrial forestal, que es capaz de potenciar los efectos sedantes de acepromazina y se proyecta como un posible co‐adyuvante inductor de anestesia en medicina veterinaria. Adicionalmente, un compuesto purificado desde la hoja de un árbol nativo chileno, ha demostrado una acción dopaminérgica muy importante y selectiva, lo que proyecta su uso hacia el desarrollo de análogos con aplicación en la enfermedad de Parkinson. Y por último, nuestras recientes investigaciones nos han permitido caracterizar los efectos de un alcaloide obtenido desde una especie considerada maleza, que crece en nuestros campos, y que tiene una potente acción neuromoduladora y protectora, la cual cursa sus efectos a través de un receptor nicotínico neuronal y que se encuentra aún en fase de estudio. Por tanto, podemos concluir que utilizando los modelos adecuados, y haciendo las “preguntas correctas” a los modelos de estudio, podemos alcanzar resultados con una importante proyección para el desarrollo de nuevos preparados nutracéuticos o fitofármacos de aplicación en la prevención y cuidado de patologías que afectan al SNC. Sin duda la evidencia obtenida por científicos en todo el mundo y los aportes que hemos hecho en nuestro laboratorio, apuntan a que las fuentes naturales nos pueden proporcionar una gama de moléculas neuroactivas altamente potentes y selectivas que potencien el desarrollo de la farmacología desde las fuentes originales: la naturaleza. AGRADECIMIENTOS: La asistencia editorial de Laurie Aguayo, ha sido clave en el desarrollo de estos trabajos. La asociación con el Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas de la Universidad de Concepción, Dres. Claudia Pérez, José Becerra y Mario Silva, ha sido clave en la obtención de los extractos, y por ende, en la consecución de estas investigaciones. Estas investigaciones han contado con el apoyo financiero de Innova Biobío (05‐B1‐397L7), Fondecyt (11090091 JF) y la Universidad de Concepción (DIUC 208.033.102.‐1.0) BIBLIOGRAFÍA: Adam‐Vizi, V. and C. Chinopoulos (2006). 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inflamatoria e inmunomoduladora, analgésica y antialérgica, con un mecanismo de acción relacionado con la capacidad 2+
secuestradora de especies reactivas de oxígeno y de interacción con Fe , la inhibición de la producción de citocinas pro‐
inflamatorias, IgE y eicosanoides, de la actividad de fosfolipasa A2 y ciclooxigenasa 2 y de la activación del NF‐κB. Según los reportes revisados, el extracto es seguro para su administración en humanos debido a su bajo potencial de toxicidad. Se realizaron varios estudios clínicos aleatorizados, estudios piloto, serie y reporte de casos con diferentes formas farmacéuticas que corroboraron los hallazgos encontrados en la fase pre‐clínica o aportaron nuevos conocimientos que le atribuyen al extracto un valor agregado importante. Palabras claves: Mangifera indica, Mango, Vimang, Farmacología, Toxicología, Estrés oxidativo, Inflamación, Dolor Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ INTRODUCCIÓN
El mango (Mangifera indica Linneo, Anacardiaceae) es uno de los frutos más importantes desde el punto de vista económico (FAO, 2012). El producto principal del árbol de mango es el fruto maduro entero, que puede ser consumido crudo o procesado en una variedad de productos que garantizan un suministro constante del fruto durante todo el año (Singh, 1990). Industrialmente, hay tres partes de interés del fruto del mango a saber: la pulpa, la cáscara y la semilla. Tradicionalmente la pulpa de mango es el principal punto focal de la utilización del fruto a escala industrial. Esta es un intermediario importante para la producción de bebidas, como un ingrediente saborizante en la industria láctea y en formulaciones de alimentos para bebés (Nanjundaswamy, 1998). Su composición química varía dependiendo de muchos factores como la variedad, la localidad, el clima, y la etapa de madurez. En el proceso industrial del fruto se obtienen subproductos como la piel y la semilla (carozo y nuez o almendra), que representan aproximadamente el 35‐60% del fruto.
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hipercolesterolémico (Anila & Vijayalakshmi, 2002) e inductor de apoptosis (Kim et al., 2012), entre otros. Por ejemplo, la cáscara de mango es una fuente rica de compuestos bioactivos como los polifenoles, carotenoides, vitaminas C y E, fibra dietética y enzimas. Además, la cáscara de mango podría ser una fuente rica de compuestos bioactivos, y enzimas tales como proteasa, peroxidasa y polifenol oxidasa (Mehrnoush et al., 2012). Esta cáscara, si es convenientemente procesada, podría proporcionar productos útiles con los que se pudieran equilibrar los costes de tratamiento de residuos y también disminuir el costo del producto principal. Por lo tanto, existe un margen para el aislamiento de estos ingredientes activos y también el uso de cáscara de mango como un ingrediente en productos alimentarios procesados. Asimismo, la almendra de la semilla contiene aminoácidos esenciales, proteínas, grasas, carbohidratos, fibra, y es una buena fuente de polifenoles, fitoesteroles como campesterol, β‐sitosterol y tocoferoles y está libre de materiales tóxicos como el ácido cianhídrico (Ajila et al., 2007). Debido a las investigaciones anteriores, se ha sugerido que la almendra de la semilla de mango podría ser utilizado como una fuente potencial de ingredientes alimentarios funcionales (Khammuang & Sarnthima, 2011), que pudieran ser comercialmente valiosos en la industria del aceite vegetal y en confitería, entre otros (Pereira et al., 2011). Las hojas y la corteza del árbol también han sido utilizadas para diferentes fines, fundamentalmente medicinales y sus aplicaciones cubren un amplio espectro de enfermedades, pero las citadas con mayor asiduidad son los dolores (menorrágicos, dentales, musculares y articulares), las infecciones cutáneas (escabiosis, epidermofitosis, micosis), las diarreas, la sífilis, la tuberculosis y algunas enfermedades crónicas, tales como la diabetes y la anemia. El uso de la corteza del árbol de mango como materia prima vegetal para la preparación de extractos acuosos por diferentes vías (maceración, percolación, decocción e infusión), forma parte de la cultura popular en más de 30 países, fundamentalmente de los llamados del Tercer Mundo, según reportes documentados desde hace más de 200 años (Napralert, 2007). En los últimos 12 años ha habido un auge en las publicaciones relacionadas con las actividades farmacológicas de diferentes extractos, obtenidos de diversas partes del árbol de mango, pero ha sido el extracto acuoso de la corteza del árbol el que más ha llamado la atención de un grupo de científicos que ha publicado cerca de 80 artículos relacionados con la tecnología química y farmacéutica, la composición química y, principalmente, la evaluación farmacológica pre‐clínica, la toxicología y los estudios clínicos; así como el papel que desempeña en la actividad farmacológica del extracto la xantona glicosilada mangiferina, que constituye el componente mayoritario dentro de éste. En esta revisión se analizarán los avances realizados en las investigaciones farmacológicas y toxicológicas llevadas a cabo con el extracto acuoso de la corteza del árbol de la especie Mangifera indica (mango) y su utilidad potencial en diferentes patologías. Esta hipótesis es soportada por evidencias pre‐clínicas y clínicas importantes, tanto para el extracto como para la mangiferina presente en éste. ESTUDIOS ETNOBOTÁNICOS Y ETNOMÉDICOS El árbol del mango es perenne y alcanza de 15‐30 m de altura, puede vivir por más de 100 años y desarrollar un tronco con más de 4 m de diámetro. El origen del mango ha sido establecido en Asia, particularmente en la región Indo‐Burmese, en las laderas del Himalaya (Tjiptono et al., 1984). El fruto se cultiva desde los tiempos prehistóricos, hace más de 6 000 años, siendo considerado como el fruto tropical más antiguamente cultivado por el hombre. Aparecen referencias al mango en las Sagradas Escrituras en Sánscrito, las leyendas y el folklore hindú 2 000 años a.C. y se refieren a él como de origen antiguo. En la India, el árbol de mango ha sido objeto de gran veneración (Sawangchote et al., 2009). Las raíces del vocablo, por un lado se señala que la palabra en sánscrito para el mango es amra, lo que significa "de la gente" o "del pueblo", y se señala así porque fue registrado en ese idioma por primera vez en la historia de la humanidad hace más de 4 000 años. Por otra parte, se dice que el nombre del fruto, así como del árbol, deriva del portugués "manga" que se refiere a un Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 60 término malayo que se pronuncia "mangga" o "mangka", asonancias que se encuentran sobre los pendientes del Himalaya y como consecuencia, la transposición en las diferentes lenguas modernas conserva la radical "mango". Por tanto, las diversidades de nombres para el mango en todo el mundo reflejan las culturas y los idiomas hablados por las personas que lo cultivan (Bally, 2006). Muchos de los nombres tienen derivaciones comunes, lo que refleja los orígenes y la propagación del árbol de mango junto con el crecimiento de las comunidades humanas. Por ejemplo, en las islas del Pacífico esta especie es conocida comúnmente como idele (Palau), kangit (Chuuk, Pohnpei), mago (Niue, Samoa, Tuvalu), manako (Hawaii), manggo, am (Fiji), mangko (Kiribati), mango (Inglés), mango (Tonga), mangot, mangue, manguier (Francés), mangueira (Yap) y en otras regiones como aam, am, amb (Hindi), ampleam (Tamil), bobbie manja, kanjanna manja, maggo, manggaboom, manja (Holandés), ma muang (Indochina), mamung (Tailandia), manga, mango (Español), manga, (Portugués), manga, mempelam, ampelam (Malasia), mangga (Tagalog), mangga, mempelam (Indonesia), mango (Ilokano), mango (Nueva Guinea, Pidgin), Mangobaum (Alemán), mwàngx (Laos), paho (Bisaya, Filipinas), svaay (Cambodia), tharyetthi (Myanmar), xoài (Vietnam). Entre los frutos tropicales comercializados internacionalmente, el mango ocupa el tercer lugar sólo superado por el plátano y la piña, tanto en cantidad como en valor (Yaacob & Subhadrabandhu, 1995) y el quinto de la producción total de los cultivos frutales más importantes del mundo (FAO, 2012). La producción mundial de mangos se estima en más de 26 millones de toneladas por año. La India ocupa el primer lugar entre los países productores del fruto de mango en el mundo, que representan el 54,2% del total de estos frutos producidos en todo el mundo y es comercialmente el cultivo frutícola más importante de este país, con más de mil variedades conocidas hasta la fecha. Durante el período 2008‐2009 este país produjo alrededor de 13,6 millones de ton., el segundo lugar lo ocupó China (~4 millones ton.), seguido de Tailandia (2,5 millones de ton.), Indonesia (2,2 millones ton., México (~1,9 millones ton.), Pakistán (~1,8 millones ton.) y Brasil (~1,2 millones toneladas). Otros países productores importantes de mango son: en Asia, China y Filipinas; en África, Nigeria, Egipto, Congo, Costa de Marfil, Sudáfrica y Ghana y en América Latina, Haití, Cuba, Colombia, Venezuela, Ecuador y Perú (FAO, 2012). Las diferentes partes del árbol de mango también se han utilizado por sus propiedades medicinales. Alrededor del 80% de la población mundial, principalmente de los países no desarrollados, tienen en los extractos de productos naturales y sus derivados su primera opción para el tratamiento terapéutico en la Atención Primaria de Salud (Mahadi, 2001). Las hojas de mango en Tonga se usan como infusiones y se utilizan junto con la naranja y otras especies para hacer una poción para el tratamiento de las recaídas durante alguna enfermedad (Thaman & Whistler, 1996). En Ghana se hierven las hojas con frutas cortadas de Citrus aurantifolia contra la malaria (Asase et al., 2010). También en Nigeria se utilizan las hojas contra esta enfermedad (Aiyeloja & Bello, 2006, Ene et al., 2010), como febrífugo (Idu & Onyibe, 2007) y contra la diabetes (Gbolade, 2009). En la India, la diabetes también ha sido tratada con una bebida hecha a partir de la infusión de las hojas frescas (Natarajan et al., 2010). Estas hojas frescas también se utilizan para combatir los vómitos, la diarrea, el dolor estomacal, el agrietamiento de pies (Rout & Panda, 2010) y el cólera (Kar & Borthakur, 2008). El jugo de éstas se aplica localmente en los ojos para la conjuntivitis (Upadhyay et al., 2010), problemas gástricos, úlceras y diarrea. (Das et al., 2008). También la diarrea y la disentería son tratadas con extracto de las hojas (Kalita & Bora, 2008; Biradar & Ghorband, 2010; De Wet et al., 2010; Upadhyay et al., 2010). Además, éstas son usadas para tratar las erupciones de la lengua (Jain et al., 2010), en cataplasma para cicatrizar heridas recientes o crónicas (Agyare et al., 2009) y en forma de polvo para aumentar la fortaleza de los dientes (Natarajan et al., 2010). Hervidas en agua se usan como estimulante, aplicadas en el baño después del parto (Rajith et al., 2010) o para tratar el reumatismo (Silja et al., 2008) y mezcladas con hojas de Ficus bengalensis y Ficus religiosa se usan contra el sangramiento (Ponnusamy et al., 2009). En Brasil se emplean contra infecciones vaginales, sífilis, gripe con tos y congestión (Coelho‐Ferreira, 2009). En Camerún la decocción de las hojas tiernas se aplica contra la tos, el dolor de garganta y el asma (Focho et al., 2009b; Noumi, 2010). En la India y Pakistán se utiliza la pulpa del fruto contra la ictericia y el hepatitis (Khan‐Marwat et al., 2012; Pawar, 2012). También en la India, la pulpa del fruto se reporta para tratar la malnutrición y el desbalance en la dieta (Singh et al., 2007; Pushpangadan & George, 2010), el estreñimiento (Satapathy, 2010), la tos (Gupta et al., 2010) y la picadura de escorpión y como remedio para el agotamiento y el golpe de calor (Upadhyay et al., 2010). La mitad del fruto muy maduro se come con sal y miel y se utiliza para el tratamiento de trastornos gastrointestinales, biliares, de la sangre y el escorbuto. Los mangos maduros son una rica fuente de vitamina A y se utilizan para tratar la deficiencia de esta vitamina, como la ceguera nocturna (Pushpangadan & George, 2010). Muchos de los usos tradicionales medicinales del mango en la India implican comer el fruto verde. Debe tenerse en cuenta que el fruto verde contiene una gran cantidad de la savia tóxica (Rozas‐
Muñoz et al., 2012) que cuando se consume en exceso puede causar dermatitis alérgica, irritación de la garganta, indigestión, disentería y cólicos. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 61 La resina del árbol también se aplica en la India sobre las encías y los dientes dos veces al día contra la piorrea (Shukla et al., 2010), el agrietamiento de pies y piel, vómitos, diarrea y dolor estomacal (Natarajan et al., 2010; Rout & Panda, 2010), extracción de diente (Patil & Patil, 2010), picadura de escorpión (Kulkarni & Adwit, 2011) y desórdenes de la piel (Prashantkumar & Vidyasagar, 2008). Desde el punto de vista etnomédico, en la India, la almendra de la semilla se emplea para tratar la diarrea crónica (Tetali et al., 2009), el asma, para expulsar lombrices y otros gusanos en las úlceras (Rajendran et al., 2008a) y para problemas urinarios (Ballabh et al., 2008). Además, se ha reportado para curar los vómitos y la disentería (Silja et al., 2008). Se ha observado que tradicionalmente en las tribus de la India comen la almendra de la semilla del mango asada durante algún período de inanición, por su contenido de almidón. El polvo de la almendra también es usado como astringente en sangramientos. Por lo tanto, se supone que es adecuado para el consumo humano (Ramteke et al., 1999). La corteza del árbol en Samoa, ha sido un remedio tradicional, como infusión, para las infecciones de la boca en los niños (Thaman & Whistler, 1996). En la India, los extractos acuosos de la corteza se utilizan para la diarrea y en gargarismos para los trastornos de garganta, úlceras bucales y olor fétido bucal (Ganesan, 2008). También la corteza se usa como anticonceptivo (Henry et al., 1996; Bhogaonkar & Kadam, 2006), astringente, aperitivo, antihelmíntico, contra la gonorrea, el asma, afrodisíaco, para prolongar la eyaculación (Kadavul & Dixit, 2009; Jain et al., 2010) y mezclada con otras plantas contra la insolación y el cólera (Pooman & Singh, 2009). La decocción de la corteza fresca (Upadhyay et al., 2010) o seca se emplea contra la diarrea y la disentería (Nath & Choudhury, 2010; Purkayastha et al., 2007) y la difteria (Pawar & Patil, 2007a). El jugo de la corteza se utiliza contra la ictericia (Sarkar & Das, 2010) y la corteza del tallo como cicatrizante (Kuvar & Bapat, 2010). En Camerún, la corteza del tallo se usa contra el asma (Noumi, 2010), el reumatismo (Jiofack et al., 2008) y la sífilis (Focho et al., 2009a), en Nepal contra los dolores abdominales, disentería, diarrea, hepatitis, enfermedades de la piel, como antiparasitario y antiespasmódico (Ghimire & Bastakoti, 2009), en Ghana como cataplasma en heridas recientes o crónicas (Agyare et al., 2009), en Uganda contra la tuberculosis y el VIH‐SIDA (Lamorde et al., 2010; Tabuti et al., 2010), en Nigeria la decocción se usa contra la malaria (Ene et al., 2010) y en Brasil la infusión se aplica en quistes de ovario, mioma uterino y contra la tos (Coelho‐
Ferreira, 2009). USO ETNOMÉDICO EN CUBA Como se ha visto, existe un conocimiento etnomédico documentado del uso de la corteza del árbol de mango en varios países y, en particular, de la experiencia acumulada durante más de 30 años en la población cubana (Guevara‐
García et al., 2004). El uso específico del extracto acuoso de la corteza del árbol de mango (ECAM) en Cuba se ha realizado de manera empírica y mediante la experiencia acumulada por practicantes de la medicina natural y tradicional (Guevara‐
García et al., 2004), cuyo trabajo ha sido el punto de partida para las investigaciones y el desarrollo de una línea de productos naturales denominada Vimang®. A partir de dicho extracto y en dependencia del estado del paciente que se somete a este tratamiento popular, las personas han empleado formulaciones artesanales del ECAM como la decocción con el 2% de sólidos totales, para su ingestión por vía oral en dosis de 30 mL, 3‐4 veces al día; la loción tópica hidro‐alcohólica (alrededor del 5% de etanol), a partir de la decocción, que se aplica sobre las lesiones de la piel, 3‐4 veces al día, con un tiempo de aplicación alrededor de los 30 min; la solución hidro‐alcohólica (alrededor del 2% de etanol), a partir de la misma decocción, que se aplica como un lavado vaginal o un enema rectal (entre 3 y 5 mL), 3‐4 veces al día; y el ungüento hidrófilo que contiene alrededor del 30% de la decocción y que se aplica de forma independiente o posterior a la loción tópica sobre las lesiones de la piel. El tiempo de tratamiento ha sido variable y depende del paciente, con un promedio entre los seis meses y varios años, según el tipo de enfermedad. Estudios etnomédicos, publicados de forma parcial (Tamayo et al., 2001; Núñez‐
Sellés, 2005), han reportado que el extracto fue efectivo en patologías como diabetes mellitus tipo II, hiperplasia prostática benigna, dermatitis, Lupus eritematoso, diferentes tipos de neoplasias, polineuropatías, hemorroides, cervicitis, así como infertilidad (fundamentalmente femenina), en algunos casos con remisión total de la enfermedad. COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL EXTRACTO ACUOSO DE LA CORTEZA DEL ÁRBOL DE MANGO El extracto es preparado por decocción por una hora y posteriormente es concentrado por evaporación y secado por spray died para obtener un polvo fino de color café (ECAM), el cual funde a 210‐215 °C con descomposición (Acosta‐Esquijarosa et al., 2009). El ECAM es el ingrediente farmacéutico activo estandarizado que se utiliza para la fabricación de las formulaciones Vimang® (Arús‐Pampin et al., 2003; Lemus‐Rodríguez et al., 2006). La composición química del extracto ha sido caracterizada por métodos cromatográficos (planar, líquido y gas), espectrometría de masa y espectrofotometría UV‐Vis (Núñez et al., 2002; 2007a,b; Núñez‐Sellés, 2005) y se podría resumir de la manera siguiente: • Polifenoles (35‐45%): mangiferina (componente mayoritario), ácido gálico, ácido 3,4‐ dihidroxibenzoico, Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 62 •
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metil éster del ácido gálico, propil éster del ácido gálico, (+)‐catequina, (‐)‐epicatequina, ácido benzoico y propil éster del ácido benzoico. Terpenoides (25‐30%): β‐elemeno, β‐selineno, α‐
guaieno, aromandreno, hinesol, β‐edesmol, cicloartranoles, ledol, taraxerol, β‐chamigreno y bulnesol. Esteroides (1‐3%): β‐Sitosterol y campestrol. Azúcares libres (5‐8%): galactosa, glucosa, arabinosa y fructosa. Polialcoholes (3‐5%): sorbitol, mioinositol y xilitol. Ácidos grasos (1‐3%): mirístico, palmítico, linoleico, oleico, esteárico, eicosatrienoico, succínico y malónico. Elementos (1%): calcio, magnesio, potasio, hierro, selenio, cobre y zinc. publicaciones relacionadas con el ECAM, también se realizó una búsqueda de artículos en las BD PubMed, Scielo y DOAJ. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Los resultados de la evaluación de las propiedades antioxidantes del ECAM han sido publicados ampliamente (Martínez Sánchez et al., 2000a,b; 2001a,b; 2003; Loy et al., 2002; Garrido et al., 2008). Han sido reportadas acciones de ECAM como: captura de ácido hipocloroso, captura del radical superóxido, captura de radical hidroxilo, acción quelante de hierro, efecto anti‐
oxidante sobre ADN, inhibición de la peroxidación lipídica (IPL) espontánea, IPL catalizada por hierro, IPL microsomal (IPLM), IPLM catalizada por hierro, protección a la pérdida de grupo sulfhidrilo (SH) proteicos, protección a la aparición de grupo carbonilo (CO) proteicos e inhibición del daño por isquemia/reperfusión hepática en ratas y en cerebro de Gerbil. Todas estas acciones fueron logradas a bajas concentraciones del extracto. La comparación de la actividad antioxidante de ECAM con relación a otros compuestos antioxidantes reconocidos tales como las vitaminas C y E, así como el beta‐caroteno, demostró que el extracto es similar (inhibición a la peroxidación lipídica) o superior (protección al daño oxidativo) a dichos compuestos (Martinez‐Sanchez et al., 2000b). La posible explicación del mecanismo molecular a través del cual el ECAM ejerce su efecto antioxidante se muestra en la Figura 1. EVIDENCIAS FARMACOLÓGICAS PRE‐CLÍNICAS REPORTADAS PARA EL EXTRACTO ACUOSO DE LA CORTEZA DEL ÁRBOL DE Mangifera indica. Del total de las publicaciones relacionadas en el área de Farmacología y Toxicología, encontradas en la BD de ISI Web of Knowledge, desde 1988 hasta junio de 2012, alrededor del 35% corresponde a los estudios llevados a cabo con el ECAM, que constituye el ingrediente farmacéutico activo de las formulaciones farmacéuticas que se comercializan en Cuba bajo la marca Vimang® y registradas como nutracéutico y medicamento de origen natural para su uso en procesos inflamatorios y de dolor. Para la obtención de una cobertura más amplia del total de Figura 1. Efecto del extracto de la corteza del árbol del mango (ECAM) sobre el balance redox. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 63 Muchos polifenoles fundamentan su actividad antioxidante no sólo en la capacidad de secuestrar radicales libres, sino en su habilidad de acomplejar el hierro (Perron & Brumaghim, 2009; Chobot & Hadacek, 2010). El hierro es uno de los microelementos de mayor importancia para el organismo humano. Su capacidad de transitar por varios estados de valencia lo convierte en elemento esencial para la actividad biológica de un número relevante de moléculas, de forma particular, aquellas que participan en reacciones de transferencia de electrones. Al mismo tiempo, esta habilidad lo transforma en un elemento con un peligro potencial, al catalizar la formación de ERO, especialmente el radical hidroxilo, a través de la reacción de Fenton‐Haber‐Weiss. El organismo ha desarrollado un mecanismo sensible para regular las concentraciones de hierro y evitar su participación en procesos redox no deseados. En un número importante de patologías, esta delicada maquinaria regulatoria se ve afectada por factores endógenos y exógenos y se producen acumulaciones del metal en tejidos y órganos, con el consiguiente daño oxidativo y alteración de la función de la célula. En estudios recientes (Pardo‐Andreu et al., 2005a), se demostró que el ECAM protegió las membranas mitocondriales del daño oxidativo inducido por Fe2+. La CI50 del extracto frente a la peroxidación lipídica inducida por 2+
Fe fue más de 10 veces inferior a la CI50 cuando en lugar del hierro se utilizó, como inductor, el peróxido de ter‐
butilo (TBOOH). De la misma manera, el ECAM estimuló la autoxidación del Fe2+ a Fe3+ e impidió la reducción de la forma férrica a la ferrosa por el ácido ascórbico. La interacción del ECAM con el hierro, incapacita al metal de participar en la generación del radical libre hidroxilo a través de la reacción de Fenton. Además, el ECAM mostró una potente inhibición de la degradación de la 2‐
3+
deoxiribosa mediada por Fe /EDTA‐ascorbato ó 3+
Fe /EDTA‐hipoxantina/xantina oxidasa. El incremento en la concentración de los ligandos utilizados (EDTA o citrato) causó una disminución significativa en el efecto protector del ECAM (Pardo‐Andreu et al., 2006a). Cuando el ascorbato se reemplazó por el radical anión superóxido (formado por la actividad de la enzima xantina oxidasa/hipoxantina), la eficiencia protectora del ECAM estuvo inversamente relacionada con la concentración de EDTA. Estos resultados indicaron que el ECAM no solo bloqueó la degradación de la 2‐deoxiribosa a través del “secuestro” de radicales hidroxilos, sino que parece actuar principalmente a través del acomplejamiento de iones hierro, lo que previene su participación catalítica en la reacción de Fenton‐Haber‐Weiss. La mangiferina (MF), por su abundancia relativa dentro del ECAM, parece ser la responsable principal de este comportamiento del extracto (Pardo‐Andreu et al., 2005b; 3+
2006a). El complejo MF‐Fe (2:1) incrementó la capacidad secuestradora del radical superóxido y la citoprotección de hepatocitos aislados expuestos a hipoxia‐reoxigenación en comparación con la MF sola. Además, estudios in vivo de sobrecarga de hierro (Pardo‐Andreu, et al., 2008) mostraron que el ECAM y la MF mejoran los indicadores séricos de capacidad antioxidante y daño oxidativo en ratas sometidas a la administración i.p. de Fe‐dextrana; al mismo tiempo que disminuyeron la acumulación hepática de este 3+
metal. Tanto el ECAM como el complejo MF‐Fe también fueron capaces de aumentar la viabilidad celular cuando células de túbulo proximal HK‐2 fueron expuestas a diferentes concentraciones de As (Garrido et al., 2012). Además, se sabe que parte del mecanismo de daño que provoca el As es a través de un componente de estrés oxidativo importante (Flora, 2011). En otro estudio (Remírez et al, 2005), se demostró que el ECAM no resultó citotóxico en hepatocitos aislados de ratas en el rango de concentraciones de 5‐1 000 μg/mL después de 24 h de exposición de las células a éste. En ese modelo celular sólo se observó un efecto citotóxico moderado a las concentraciones de 500 y 1 000 μg/mL cuando los hepatocitos fueron expuestos al extracto durante 72 h. Posteriormente, se publicó el potencial antioxidante del ECAM sobre los hepatocitos en cultivo lo que permitió evidenciar la actividad antioxidante del extracto en ese modelo experimental, como forma de evaluar su efecto sobre dicho órgano (Rodeiro et al., 2007). El ECAM fue capaz de reducir la peroxidación lipídica en el cultivo y revertió significativamente la peroxidación inducida por TBOOH, lo que se comprobó por la disminución de la producción de MDA y un incremento de las concentraciones de GSH a nivel celular. Por otra parte, otros estudios (Pardo‐Andreu et al., 2005c) han mostrado que la acumulación de productos de oxidación de la MF (productos generados a partir de su acción antioxidante) induce la transición de permeabilidad mitocondrial (TPM), debido a la capacidad que tienen de disminuir el contenido de grupos tiólicos de la membrana mitocondrial, así como del glutatión. Estos productos, de posible naturaleza quinónica, son electrófilos débiles con la capacidad de reaccionar con los grupos SH. Resultados similares se obtuvieron también para el ECAM (Pardo‐
Andreu et al., 2006c). Este comportamiento debe beneficiar a aquellas células expuestas a una sobreproducción de ERO, como sucede en algunos tipos de células cancerígenas, en las cuales el desencadenamiento de la apoptosis mediada por TPM podría representar un mecanismo de defensa significativo para el organismo portador. También se ha reportado que la MF manifestó un efecto hepatoprotector contra el daño hepático inducido por tetracloruro de carbono. En este mismo estudio, la MF presentó una fuerte actividad antioxidante mediante el ensayo del 1,1‐difenil‐2‐picrilhidracilo (DPPH) (Pauletti et Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 64 al., 2003; Dar et al., 2005), lo que fundamentó los hallazgos de las propiedades secuestradoras de radicales libres in vitro de este polifenol. Por otra parte, MF ha demostrado efecto secuestrador del radical superóxido producido por los sistemas hipoxantina‐
xantina oxidasa y metosulfato fenazina‐NADH; pero no fue capaz de inhibir la actividad de la xantina oxidasa, determinada por la producción de ácido úrico como sustrato, ni modificar la respuesta contráctil inducida por fenilefrina o ésteres de forbol (como PMA) en anillos aórticos de rata (Leiro et al., 2003). Sin embargo, su aglicona noratiriol inhibió la generación del anión superóxido inducida por formilmetionil‐leucil‐fenilalanina (fMLP) y el consumo de O2 en neutrófilos de rata (Hsu et al., 1997). En un sistema libre de células, generador de radicales de oxígeno, noratiriol inhibió la generación de superóxido durante la autoxidación del ácido dihidroxifumárico y en el sistema xantina‐xantina oxidasa. 2+
Noratiriol inhibió el aumento de Ca inducido por fMLP y la formación de inositol trifosfato, así como las actividades de la fosfolipasa C citosólica de neutrófilos y la NADPH oxidasa. Los autores afirmaron que el noratiriol contribuye a la reducción de radicales superóxido atribuida al bloqueo de la vía fosfolipasa C, la atenuación de la fosforilación de la proteína de tirosina inducida por fMLP y a la supresión de la NADPH oxidasa a través de la interrupción del transporte de electrones. ACTIVIDAD ANTI‐INFLAMATORIA E INMUNOMODULADORA Existen múltiples evidencias que señalan la relación existente entre el balance oxidativo a nivel celular y tisular, la respuesta al dolor y el desarrollo de la inflamación, en la que se muestra que las especies reactivas de oxígeno (ERO) activan las proteína‐cinasas y fosfatasas, así como factores de transcripción que promueven la biosíntesis de citocinas pro‐inflamatorias (Kyriakis & Avruch, 1996; Cuzzocrea et al, 2001). Las citocinas, a su vez, promueven la aparición de nuevas ERO a partir de la activación de diversos factores de regulación transcripcional, entre los que se encuentra el NF‐κB (Karin & Neriah, 2000; Li & Verma, 2002). En estudios recientes se ha comprobado que el ECAM redujo la inflamación inducida por carragenano, en ratas y cobayos, y formalina, en ratones, como modelos agudos inflamatorios (Garrido et al., 2001). En un modelo de inflamación tópica en el que se indujo el edema por agentes irritantes (como el ácido araquidónico o el PMA) en la oreja del ratón, ECAM, administrado de forma tópica (oreja), inhibió la inflamación con una reducción de la actividad de la enzima mieloperoxidasa en el tejido de las orejas tratadas con PMA + ECAM (Garrido et al., 2004a). De la misma manera, en un modelo de enfermedad peridontal inducida en perros (García‐Triana et al., 2005), el ECAM (1%, disuelto en solución salina fisiológica), aplicado dos veces al día durante tres semanas, redujo de manera significativa el índice gingival, la profundidad del surco gingival y la pérdida ósea, por lo que la administración tópica del extracto atenuó el desarrollo de la enfermedad peridontal. Por otra parte, el ECAM inhibió la quimiotaxis de leucocitos polimorfonucleares, lo que permite regular la migración de células inflamatorias al sitio de inflamación e inhibir la expresión de moléculas de adhesión, relacionadas con los procesos de activación del endotelio vascular y los procesos de trasmigración de leucocitos y otras células inflamatorias al tejido inflamado. Además, se pudo comprobar que ECAM inhibe la expresión de la molécula de adhesión ICAM‐1 cuando las células endoteliales son estimuladas con IL‐1 (Delgado et al., 2001; Beltrán et al., 2003). La capacidad quimiotáctica de macrófagos peritoneales de rata también fue inhibida por ECAM (García et al., 2002). También, el ECAM inhibió la producción de eicosanoides tales como prostaglandina E2 (PGE2) y leucotrieno B4 (LTB4), mediadores de procesos inflamatorios relacionados con la activación de la vía metabólica del ácido araquidónico, en macrófagos RAW264.7 y J774 (Garrido et al., 2004a; 2006). Este efecto podría deberse, al menos en parte (PGE2), a que ECAM inhibe la expresión de la enzima inducible encargada de la síntesis de estos mediadores, la ciclooxigenasa 2 (COX‐2), mediante la inhibición del proceso de transcripción de los genes que codifican para esta enzima en macrófagos peritoneales murinos estimulados con lipopolisacárido bacteriano (LPS) e interferón gamma (IFNγ) (Leiro et al., 2004b). En este estudio, ECAM solo redujo, de forma significativa, la concentración de ARNm de la enzima COX‐1 con la mayor concentración evaluada (400 μg/mL), lo que pudiera indicar que el extracto es capaz de inhibir selectivamente la isoforma COX‐2 que se induce en el proceso inflamatorio sin alterar la función biológica de la enzima COX‐1. Adicionalmente, el ECAM inhibió la actividad de la fosfolipasa A2 (PLA2) de secreción sinovial humana (Garrido et al., 2004a). En sistemas experimentales, en los que se emplearon células de musculatura lisa vascular, aisladas de arterias mesentéricas de ratas normotensas y espontáneamente hipertensas, se lograron demostrar los efectos de ECAM y la MF sobre la expresión de las isoformas inducibles de COX‐2 y de iNOS, ambos sistemas enzimáticos involucrados en la hipertensión arterial como enfermedad inflamatoria crónica, en la que desempeñan un papel protagónico los diversos procesos e intermediarios asociados a las funciones básicas del endotelio vascular y la musculatura Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 65 lisa vascular. Se comprobó que ECAM inhibió con mayor efectividad la expresión de iNOS inducida por IL‐1 en ratas hipertensas respecto a las normotensas, mientras que el efecto inhibidor sobre la COX‐2 fue más acentuado en las ratas normotensas (Beltrán et al., 2004). El ECAM redujo la contracción inducida por noradrenalina y otro agente vasoconstrictor (U46619) en arteria mesentérica de rata (Beltrán et al., 2004), efecto este que no se justifica a partir de sus propiedades anti‐
inflamatorias. Sin embargo, la MF no mostró actividad vasodepresora, lo cual sugiere que el efecto de ECAM sobre la vasoconstricción mediada por la expresión de COX‐2 e iNOS, está relacionada con la presencia de otros componentes del ECAM, cuyo efecto aún está por demostrar. En un modelo murino de choque endotóxico inducido por lipopolisacárido (LPS), el ECAM inhibió la producción de TNFα tanto en un modelo de administración aguda como cuando se administró durante una semana por vía oral. Se pudo comprobar que esta inhibición está dada por la acción de ECAM sobre el trascripto primario de esta proteína (ARNm) tanto en hígado como en pulmones de los animales tratados (Garrido et al., 2004b). En los modelos de inducción de edemas auriculares por ácido araquidónico y PMA, por administración aguda oral de ECAM, se obtuvo una inhibición de las concentraciones séricas de TNFα (Garrido et al., 2004a). Además, ECAM y MF inhibieron la producción de esta citocina pro‐inflamatoria en macrófagos RAW 264.7 y N9 activados con LPS e IFNγ (Garrido et al., 2004b). La acción de MF sobre macrófagos residentes del SNC en microglia (como la línea celular N9) pudiera explicar la actividad neuroprotectora detectada en un modelo de neuroinflamación y daño oxidativo inducido por estrés en el cerebro de ratas inmovilizadas (Máquez et al., 2012). El tratamiento previo con esta xantona, por vía oral durante siete días, previno todos los efectos inducidos por el estrés como fueron: el incremento en las concentraciones plasmáticas de glucocorticoides e IL‐1β; la pérdida del balance redox y la reducción de las concentraciones de catalasa cerebral; el incremento de los mediadores pro‐inflamatorios, tales como TNFα y su receptor TNF‐R1, el NF‐κB y la síntesis de enzimas, como iNOS y COX‐2; y el incremento de la peroxidación lipídica. Estos resultados sugieren que la administración de MF (o los extractos ricos en esta xantona) podría constituir una nueva estrategia terapéutica en patologías neurológicas‐
neuropsiquiátricas en las cuales exista una desregulación del eje hipotalámico‐pituitario‐adrenal, neuroinflamación y un daño oxidativo. Por otra parte, se investigaron los efectos del ECAM en un modelo de colitis ulcerativa inducida por sulfato sódico de dextrano (DSS) en ratas (Márquez et al., 2010). Para ello, el ECAM se administró en dos protocolos diferentes: en el primero se administró el ECAM por vía rectal, durante 7 días en co‐tratamiento con DSS, y en el segundo ECAM se administró una vez al día durante 14 días (por sonda oral, 7 días antes de la administración de DSS y rectal por 7 días durante la administración de DSS). Los resultados demostraron que el ECAM tiene propiedades anti‐
inflamatorias que mejoran los signos clínicos, la reducción de la ulceración y la reducción de la actividad MPO cuando se administra antes de DSS. Además, la administración del extracto por 14 días resultó en un aumento de GSH y la reducción de las concentraciones de las sustancias reactivas de ácido tiobarbitúrico (TBARS) y de iNOS y la expresión de COX‐2, TNF‐α y TNF R‐2 en tejido colónico, y una disminución de las concentraciones séricas de IL‐6 y TNFα. Los autores declararon que la administración preventiva de ECAM, en un modelo de colitis inducida por DSS, parece ser el protocolo más efectivo para disminuir el estrés oxidativo y la inflamación en este modelo. Existe una estrecha relación entre la inflamación, el desbalance oxidativo y la respuesta inmune. La producción de ERO puede modular la expresión de numerosas moléculas (citocinas, anticuerpos, factores de transcripción y otras) involucradas en la respuesta inmune, lo que ha permitido relacionar algunos trastornos en la inmunidad con el estrés oxidativo y los mecanismos de defensa antioxidante con las propiedades inmunomoduladoras de los fármacos (Matés et al., 2000). La respuesta inflamatoria es parte y consecuencia de algunos tipos de respuesta inmune y varias de las citocinas producidas por macrófagos, células T y mastocitos conducen al reclutamiento celular, el incremento de la permeabilidad vascular, la vasodilatación y otros eventos característicos de la inflamación. Otro punto en común entre estos fenómenos lo constituye la actividad del propio macrófago, pues es una de las principales fuentes de producción de ERO, de mediadores pro‐inflamatorios y es uno de los ejes centrales en la activación de la respuesta inmune adaptativa que inducen la coestimulación para la activación de las células T. En macrófagos murinos, aislados y estimulados con LPS e IFNγ, ECAM redujo las concentraciones de ARNm de las citocinas TNFα, IL‐1β y GM‐CSF, sin afectar las de IL‐6, e incrementó las de TGFβ. Además, redujo la concentración de TNFα en el sobrenadante de cultivo de macrófagos peritoneales, lo que permitió correlacionar la inhibición del ARNm con la reducción de la proteína (García et al., 2002). Por su parte, la MF inhibió el aumento de iNOS y TNFα en macrófagos de rata estimulados in vivo con tioglicolato y después in vitro con LPS e interferón gamma (Guha et al., 1996). A concentración de 100 mM redujo las concentraciones de sus ARNm. Sin embargo, a esta concentración aumentaron los valores del transcripto primario del factor de crecimiento tumoral‐beta (TGF‐β) (Leiro et al., 2003). El hallazgo de que MF aumente la Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 66 expresión génica de TGF‐β sugiere que este polifenol, o extractos que lo contengan, podría tener algún valor en la prevención del cáncer, enfermedades autoinmunes, aterosclerosis y otras afecciones cardiovasculares. Por otra parte, el ECAM inhibió la producción de óxido nítrico (NO) en macrófagos RAW264.7 (Garrido et al., 2004b), así como en macrófagos peritoneales (García et al., 2002) estimulados con LPS e IFNγ. Se comprobó que esta acción de ECAM está asociada a la reducción de la concentración de ARNm que codifica para la iNOS, lo que conduce a la inhibición de la expresión de esta enzima, encargada de la producción del NO a partir de L‐arginina (Leiro et al., 2004b). El ECAM también inhibió la activación inducida por TNFα del factor de transcripción nuclear NF‐κB en células Hela y Jurkat, con lo cual se impidió la degradación del inhibidor citoplasmático del NF‐κB, o sea IκB. Por tanto, la translocación del NF‐κB al núcleo de la célula y su posterior unión a elementos específicos en regiones promotoras de genes dianas para la producción de proteínas pro‐
inflamatorias, tales como citocinas, moléculas de adhesión y enzimas, entre otros, también fue inhibida (Garrido et al., 2005). Por otra parte, se comprobó que ECAM redujo las concentraciones de ARNm del NF‐κB en macrófagos peritoneales murinos estimulados con LPS e IFN‐γ sin afectar la concentración de IκB, lo que explica que, además de inhibir su activación, reduce la disponibilidad de NF‐κB en el citoplasma celular y garantiza la presencia del inhibidor IκB (Leiro et al., 2004a). Se piensa que uno de los componentes en el ECAM responsable de los efectos anti‐inflamatorio e inmunomodulador sea la MF, por lo que se realizó un estudio para demostrar los mecanismos de acción por los cuales esta xantona ejerce tales efectos (Leiro et al., 2004a). Todo ello se realizó a través de la medición del efecto sobre la expresión de diversos genes relacionados con la vía de señalización del NF‐κB, por lo que se demostró que ésta inhibe la expresión de dos genes de la familia de Rel/NF‐κB/IκB, RelA y RelB, lo que indica un efecto inhibitorio sobre la señal de transducción mediada por NF‐κB; del factor 6 asociado al receptor de TNF (Traf6), lo que pudiera indicar un probable bloqueo de la activación de NF‐κB vía LPS, TNFα o IL‐1; de otras proteínas involucradas en las respuestas a TNF y a la vía apoptótica disparada por daño al ADN, la que incluye el receptor de TNF (TNF‐R), el dominio de muerte asociado al receptor del TNF (TRADD) y la proteína que interactúa con el receptor (RIP); del ligando extracelular de IL‐1α, lo que indica, posiblemente, interferencia con la respuesta a IL‐1; de las citocinas pro‐inflamatorias IL‐1, IL‐6, IL‐12, TNFα y RANTES y citocinas producidas por monocitos y macrófagos como el factor estimulante de colonias de granulocitos (G‐CSF), el factor estimulante de colonias de granulocitos‐macrófagos (GM‐CSF) y el factor estimulante de colonias de macrófagos (M‐CSF); de otras proteínas de receptores toll‐
like (además de Traf6) tales como JNK1, JNK2 y Tab1; de Scya2 (Small Inducible Cytokine A2), una proteína similar a la proteína quimioatrayente de monocitos‐1 (MCP‐1); y de varias moléculas de adhesión intracelular (ICAM) y la molécula de adhesión celular vascular VCAM‐1, la cual se encuentra aumentada en ateromas. La inhibición de JNK1, unido a la estimulación de c‐JUN y a la actividad secuestradora de superóxido anteriormente mencionada, sugiere que la MF podría proteger a las células contra el daño oxidativo y la mutagénesis. Además, MF bloqueó la activación de NF‐κB inducido por TNF y los genes dependientes de NF‐κB como ICAM‐1 y COX‐2 (Sarkar et al., 2004). El efecto estuvo mediado por la inhibición de la activación de IKK y subsiguiente bloqueo de la fosforilación y degradación de IκBα. De igual forma, la MF inhibió la fosforilación de p65 inducida por TNF, así como la translocación al núcleo y la activación de NF‐κB inducida por otros agentes pro‐inflamatorios como PMA, ceramide y LPS. También, inhibió la generación de ERO inducida por TNF e incrementó al doble las concentraciones de GSH (un modulador de las concentraciones de NF‐κB) en comparación con otros antioxidantes. Al mismo tiempo, decrecieron las concentraciones de GSSG e incrementó la actividad de catalasa. MF y, por tanto, el ECAM, podría constituir un fuerte candidato para la terapia antioxidante y anti‐
inflamatoria debido a su capacidad para inhibir la activación de NF‐κB y al incremento de las concentraciones intracelulares de GSH. Todas estas evidencias, tanto de experimentos a nivel molecular como en modelos animales, demostraron la influencia de ECAM sobre especies intermediarias de la reacción inflamatoria, tales como moléculas de adhesión (ICAM‐1), citocinas pro‐inflamatorias (TNFα y sus receptores TNF R‐1 y R‐2, IL‐1, GM‐CSF y TGFβ), enzimas (COX‐2, iNOS, PLA2), mediadores de la cascada del ácido araquidónico (PGE2 y LTB4) y factores de transcripción (NF‐
κB) que constituyen señales de activación intercelular muy relevantes de la respuesta inflamatoria y del sistema inmune, asociadas a los procesos de daño tisular y activación celular que producen la mayor parte de las ERO. De otra parte, los estudios llevados a cabo con MF indican que ésta es un inhibidor de la expresión de genes como iNOS, TNFα y NF‐κB, lo que sugiere que esta xantona presenta un valor potencial en el tratamiento de desórdenes inflamatorios y(o) neurodegenerativos. Estos resultados también indican que la MF modula la expresión de un considerable número de genes que participan en la replicación viral, la regulación de la apoptosis, la tumorogénesis, la inflamación y enfermedades autoinmunes por lo que pudiera ser, en parte, la Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 67 responsable de las actividades anti‐inflamatoria e inmunomoduladora del ECAM. Un resumen de los efectos de ECAM sobre algunos de los mediadores pro‐inflamatorios e inmunológicos se puede apreciar en la Figura 2. Figura 2. TNFα
NF-κB
ECAM
ICAM-1
ADHESIÓN CELULAR
Citoplasma
NF-κB
Núcleo
Fosfolípidos Membrana
ADN
ECAM
GM-CSF
PLA 2
AA
Mediadores Proinflamatorios
ECAM
LOX
COX-2
ECAM
LTB 4
PGE 2
iNOS
IL-1β
TNFα
NO .
O 2-
ECAM
ONOO -
INFLAMACIÓN
CHOQUE ENDOTÓXICO
Mecanismo de acción anti‐inflamatoria del extracto de la corteza del árbol del mango (ECAM). El proceso de inducción de señales, resultado de la activación del factor de transcripción nuclear κB (NF‐κB) por el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) se inhibe por el ECAM. Bajo condiciones patológicas, la activación de NF‐
κB inducida por TNFα estimula la degradación del inhibidor citoplasmático (IκB) del NF‐κB. Después de ese evento, NF‐κB se trasloca al núcleo de la célula para inducir la síntesis de ARNm de algunos mediadores pro‐inflamatorios tales como el TNFα, la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), la ciclooxigenasa 2 (COX‐2), la interleucina 1 (IL‐1) y el factor estimulante de colonias de granulocitos‐macrófagos (GM‐CSF); así como moléculas de adhesión que participan en el proceso de la adhesión celular (como ICAM‐1). El ECAM también es capaz de inhibir otros mediadores importantes del proceso inflamatorio como la fosfolipasa A2 (PLA2), la prostaglandina E2 (PGE2) y el leucotrieno B4 (LTB4). En otros modelos experimentales, se demostró que ECAM moduló la respuesta inmune humoral en ratones, mediante la inhibición de la IgG2a y la IgG2b, inmunoglobulinas características de la respuesta Th1 activadora de macrófagos, pero sin afectar la producción de IgM (García et al., 2003a). Este resultado se corresponde con el efecto inhibitorio de la actividad de macrófagos (García et al., 2002; Leiro et al., 2004b), e indica que ECAM pudiera utilizarse en enfermedades caracterizadas por la sobreproducción de inmunoglobulinas. La activación de los linfocitos T es una etapa crucial de la respuesta inmune que conduce a un incremento rápido en la expresión de genes relacionados con la proliferación y diferenciación de estas células. La desregulación de estos procesos conduce a estados inmunopatológicos como las enfermedades autoinmunes y la inflamación. Cuando los mecanismos de activación de células inmunocompetentes, como los macrófagos y las células T, persisten por permanencia del estímulo antigénico o por desregulación de los mecanismos inhibitorios, se produce un estado de sobreactivación celular que conlleva a la excesiva Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 68 producción de mediadores inflamatorios, lo que conduce a un proceso inflamatorio tal que puede terminar en una lesión tisular. Dichos procesos están altamente implicados en la fisiopatología de enfermedades tales como la artritis reumatoide, las enfermedades inflamatorias intestinales y el lupus eritematoso sistémico, entre otras (Issekutz et al., 1988; Ali et al., 1997). El ECAM también inhibió la proliferación de células T humanas estimuladas por un superantígeno de enterotoxina B de Staphylococcus aureus (Garrido et al., 2005). La activación de los linfocitos T ha sido estudiada, tanto en la inflamación crónica como en la aguda, ya que diferentes poblaciones de células T alteran el balance entre el aclaramiento o eliminación del patógeno y la inducción de daño tisular, lo que depende de los mediadores citocínicos que ellos secretan. La activación por citocinas conduce a un incremento rápido en la expresión de genes relacionados con el crecimiento, la adhesión y diferenciación de estas células. El tratamiento con ECAM inhibió la proliferación celular mediada por el receptor de células T e inducida por SEB. Además, fue estudiado el efecto del extracto sobre la expresión en la superficie celular de los marcadores de activación CD25 en células T primarias, estimuladas con SEB. El extracto inhibió la expresión de este marcador en la superficie celular de los linfocitos T. Como consecuencia de la activación celular, las células T primarias progresan a las fases S y G2‐M del ciclo celular, y en este estudio se evaluó el efecto del ECAM sobre la progresión del ciclo celular en estas células T estimuladas. El tratamiento con el extracto previno la entrada de las células en la fase S del ciclo celular. La muerte celular inducida por activación (AICD, Activation Induced Cell Death) es esencial para la homeostasis del sistema inmune (Krammer et al., 1994) y su desbalance está relacionado con diversas enfermedades tales como las inmunodeficiencias y las autoinmunes (Rieux‐Laucat et al., 2003). La elevada expresión del CD95L asociada al incremento en la sensibilidad a la AICD que se observa en los individuos infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana evidencia que este tipo de muerte celular contribuye, en parte, a la pérdida progresiva de linfocitos T CD4+ infectados y no infectados que conduce a la desregulación del sistema inmune en estos pacientes (Dockrell et al., 1999; Badley et al., 2000; Alimonti et al., 2003). Los resultados experimentales demostraron que ECAM puede regular la sobrevivencia de linfocitos T humanos al inhibir la AICD in vitro. Este efecto se ejerce al disminuir las 2+
concentraciones intracelulares de ERO y Ca , señales tempranas inducidas que estimulan al TCR (T cell receptor). La capacidad de inhibir las ERO se demostró además, por la reducción en la expresión de la enzima manganeso‐
superóxido dismutasa (Mn‐SOD), involucrada en la regulación de los procesos de estrés oxidativo e inducida por la estimulación del TCR (Hernández et al., 2006a). También, el ECAM actuó sobre factores transcripcionales involucrados en la AICD. La disminución de las concentraciones constitutivas de NF‐κB en presencia del extracto determina una menor disponibilidad de este factor en la cascada de señales necesaria para la inducción del CD95L (Hernández et al., 2006b). Por otra parte, el extracto disminuyó la fosforilación de la cinasa de c‐Jun (JNK), lo que repercute en su activación y en consecuencia, en la activación del factor AP‐1 (Hernández et al., 2006a). El conjunto de efectos descritos conduce a la inhibición observada de la expresión del ARNm del CD95L y determina que ECAM inhiba la AICD. En otro estudio (Hernández et al., 2007) se demostró que los principales polifenoles que componen el ECAM, como MF, catequina y epicatequina son responsables, en parte, de la capacidad del extracto de regular la AICD en células T. Esto pudiera explicarse a través de un mecanismo que involucra la disminución de las concentraciones de ERO y Ca2+ inducidos por la activación del TCR. En todos los casos el efecto fue inferior al mostrado por ECAM, lo que fortalece la hipótesis del efecto sinérgico que pudiera ejercer la mezcla de componentes que conforman el extracto. En la Figura 3 se muestra un esquema de los blancos potenciales de acción del ECAM sobre la cascada de señalización del CD95L estimulada durante la AICD en linfocitos T humanos. ACTIVIDAD ANALGÉSICA Los ensayos desarrollados con la finalidad de evaluar la acción anti‐inflamatoria del ECAM, en modelos in vitro e in vivo, mostraron actividad anti‐inflamatoria y analgésica. De forma específica, el ECAM redujo el dolor inducido por formalina en la fase tardía de la reacción dolorosa (Garrido et al., 2001, 2004a,b, 2005, 2006). En la prueba de la formalina se acepta que la primera fase resulta de la activación directa de las fibras aferentes primarias nociceptivas y refleja un dolor de tipo fisiológico o nociceptivo (Vyklicky, 1979; Ren & Dubner, 1999; Wilson et al., 2006). Sin embargo, existen aún dificultades en la comprensión de los mecanismos de la segunda fase. Estudios recientes sugieren que dicha fase resulta de un incremento de la excitabilidad de las neuronas del cuerno dorsal espinal (CDE) y se ha demostrado que la fase I es necesaria para el desarrollo de la fase II (Ren & Dubner, 1999). Este ensayo es considerado como un excelente modelo de dolor persistente de moderada intensidad, que se asemeja al dolor clínico en humanos (Ortega et al., 2002). La actividad del ECAM quedó demostrada para la fase II, de ahí sus potencialidades para el tratamiento del dolor patológico y su acción antihiperalgésica. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 69 En el modelo de dolor inducido por la aplicación i.p. de ácido acético se obtuvo un resultado similar al reducir el número de las contorsiones abdominales (Garrido et al., 2001). Este modelo estudia el dolor visceral o mixto provocado por este irritante que causa inflamación peritoneal e hiperalgesia (Reichert et al., 2001). También la MF ha mostrado efecto analgésico en este modelo y en el del plato caliente en ratones, sin exhibir la actividad anti‐
inflamatoria (Dar et al., 2005). Ambos estudios (mediante la inducción de estímulos nociceptivos por formalina y ácido acético) sugieren la potencialidad del ECAM para tratar las alteraciones del procesamiento nociceptivo en circunstancias patológicas. Figura 3. TCR
ZAP70
Lck
PLCγ2
RE
R
Rh
ho
o//RRaacc
Mn
M
nSSO
ODD
RR
E
OO
S
3
ECAM
1
Æ
Æ Æ
2
C a2 +
MMKKKK 44/
/7
7
4
EC AM
iM
EM
CA
lmoodduulin
linaa
CCaa
lm
p
lcin
ineeuurrin
CCaalc
in aa
JN K
p
ECAM
κB
NNFF-κ
NFAT
Ju n
EC AM
6
T r a n s c r ip c ió n
p ro m o to r C D 9 5 L
A p o p to s is
5
N ú c le o
EC AM
Blancos potenciales de la acción del extracto de la corteza del árbol del mango (ECAM) sobre la cascada de señalización del CD95L estimulada durante la muerte celular inducida por activación (AICD) en linfocitos T humanos. (1) Disminución de las concentraciones de ERO; (2) Disminución de las concentraciones de Ca2+; (3) inhibición de la expresión de Mn‐SOD; (4) inhibición de la fosforilación de JNK; (5) inhibición de la expresión de ARNm del gen CD95L; (6) inhibición de la AICD. RE: retículo endoplasmático. Como se ha mencionado, los resultados en otros modelos in vivo de inflamación complementan los hallazgos anteriormente expuestos ya que el ECAM inhibe el edema de la oreja inducido por ácido araquidónico y los ésteres de forbol (Garrido et a., 2004a), que exploran con cierta selectividad las vías de la lipooxigenasa (LOX) y la COX, respectivamente. Además, estudios bioquímicos adicionales en estos modelos demostraron una reducción sistémica del TNFα (Garrido et al., 2004b), el cual participa primariamente en el establecimiento de la hiperalgesia. La expresión de esta citocina pro‐inflamatoria favorece la liberación de IL‐1, IL‐6 e IL‐8, reduce el umbral de activación de fibras C, induce la liberación de neuropéptidos como la sustancia P (SP) y el péptido relacionado al gen de la calcitonina (PRGC) y desencadena las vías dependientes de la COX, para la formación de prostaglandinas (García et al., 2001; Covey et al., 2002; Wood, 2005; Xu et al., 2006). Además, conjuntamente con el IFNγ, el TNFα amplifica la producción de aniones superóxido por los neutrófilos y la biosíntesis de NO, por aumento de la actividad de todas las isoformas de la NOS (Eliav et al., 2001; Zelenka et al., 2005). En los estudios in vitro (Garrido et al., 2004b), diseñados para profundizar en Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 70 el mecanismo de acción de los efectos descritos anteriormente, el ECAM inhibió la producción de TNFα y NO en líneas celulares de macrófagos RAW264.7 y de manera interesante el mismo resultado fue observado en macrófagos residentes del SNC en microglia (células N9). En macrófagos murinos después de la estimulación con LPS e IFNγ redujo las concentraciones de iNOS y de su ARNm, así como de COX‐2 y su ARNm (sin efectos marcados sobre COX‐1), TNFα; así como PGE2, que posee un reconocido papel como mediador de la hiperalgesia (Kress, 2005), e IL‐
1β. La IL‐1β es considerada una molécula muy importante en el desarrollo de la hiperalgesia inflamatoria, por sus mecanismos indirectos sobre la liberación de PG, la inducción de receptores de bradicinina y el aumento en las concentraciones locales del factor de crecimiento nervioso (Eliav et al., 2001; Zelenka et al., 2005). Se ha documentado que el NO producido por la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) y la iNOS, difunde fácilmente a través de las membranas celulares y viaja a neuronas vecinas, glias y a la terminal nerviosa presináptica, donde puede activar sistemas de segundos mensajeros, con el consiguiente aumento del GMPc que activaría a las proteínas cinasas dependientes de GMPc y estas favorecerían la liberación de glutamato (Vetter et al., 2001). Por otra parte, la PGE2 puede activar a la adenil ciclasa, vía receptor EP2, y aumentar las concentraciones de AMPc, el que activaría a sus proteínas cinasas dependientes, como la proteína cinasa A, la cual induce mayor liberación de glutamato (Lui & Lee, 2004). De esta forma, los procesos presinápticos y postsinápticos se retroalimentan y exageran la señal excitatoria en el CDE. Asimismo, existe una elevación de las concentraciones de PGD2, PGE2, PGF2α, de la COX‐2 y del ácido araquidónico en el SNC. También, existen evidencias en animales y humanos que confirman los efectos antihiperalgésicos centrales de los anti‐inflamatorios no esteroidales durante la inflamación o el daño nervioso (Shi et al., 2006). Estos antecedentes sugieren la posibilidad para la utilización terapéutica del ECAM en estos estados. La evidencia de que el ECAM previno la activación del NF‐
κB inducida por TNFα y que no afecta la expresión de IκB (Garrido et al., 2005), unificó y dio soporte a todos los resultados anteriores. El ECAM pudiera utilizarse en el tratamiento de las alteraciones del procesamiento nociceptivo con las consecuentes implicaciones beneficiosas sobre la inhibición de la cascada inflamatoria y la hiperalgesia. Estudios recientes in vitro (Lemus‐Molina et al., 2009) en oligodendrocitos y en neuronas (muchas de ellas son interneuronas inhibitorias) apoyan los efectos favorecedores en la prevención de la muerte neuronal excitotóxica inducida por receptores N‐metil‐D‐aspartato (NMDA) (Baymgärtner et al., 2002). En estos experimentos se observó una disminución de las concentraciones de glutamato, en presencia del extracto y su xantona aislada, que lo hacen menos biodisponible para la interacción con sus receptores, en especial el NMDA. Múltiples evidencias soportan la participación de la vía postsináptica receptor NMDA‐NO‐GMPc en el proceso de hiperexcitabilidad del CDE que promueve el establecimiento de los estados dolorosos crónicos (Gao et al., 2005, Xu et al., 2007). Además, se ha podido demostrar el decrecimiento de la muerte celular inducida por glutamato en cultivo de de concentraciones neuronas, en presencia submicromolares de MF, las cuales atenuaron la entrada 2+
de Ca mediada por receptores, el estrés oxidativo y la apoptosis (Gottlieb et al., 2006). MF disminuyó la generación de ERO y la pérdida neuronal en células de hipocampo CA1 de ratas que fueron sometidas a isquemia. Las ratas con isquemia y tratadas con MF tuvieron significativamente mejor comportamiento en tres pruebas de conducta dependientes de hipocampo en comparación con las ratas isquémicas no tratadas. En estos estudios (Ibarretxe et al., 2006), se utilizaron concentraciones nanomolares de MF, las que protegieron de forma parcial a los oligodendrocitos; así como a las neuronas corticales de un daño mediano, pero no de uno intenso mediado por receptores AMPA (alfa‐amino‐3‐hidroxi‐5‐metilisoxazol‐4‐
propionato). Además, MF atenuó la sobrecarga intracelular 2+
de Ca subsiguiente a la activación de los receptores AMPA, un mecanismo que puede contribuir a sus propiedades neuroprotectoras. La Figura 4 resume los posibles blancos moleculares de acción del ECAM sobre el evento nociceptivo. ACTIVIDAD ANTI‐ALÉRGICA En un modelo preclínico de alergia inducida por un nemátodo (Trichinellas spiralis) en ratones se demostró el efecto antialérgico y antihelmíntico del ECAM y la MF, la reducción en suero de los anticuerpos IgE específicos, y la actividad inhibitoria sobre la desgranulación de las células mastoides, evaluado mediante ensayos de anafilaxia pasiva cutánea (García et al 2003b). Otros estudios permitieron comprobar con mayor claridad el efecto del ECAM y la MF, sobre diferentes parámetros de la respuesta alérgica, como la producción de IgE, la respuesta anafiláctica, la respuesta cutánea al incremento de la permeabilidad vascular inducida por histamina y OVA, la liberación de histamina de células mastocitarias, mediante un modelo de inflamación alérgica inducido por ovoalbúmina (OVA). Ambos productos demostraron una reducción significativa del edema plantar en un modelo in vivo de inflamación alérgica mediada por mastocitos y la proliferación linfocitaria en respuesta a la OVA en ratones inmunizados. Tanto ECAM como MF inhibieron la liberación de histamina inducida por 48/80 en los mastocitos peritoneales de ratas (García et al., 2006). Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 71 Figura 4. Estímulos
nociceptivos
periféricos
PKA
GMPc
Terminación
nociceptiva C
cinasa
[Ca2+]
AMPc
GMPc
AC
GLUT
GC
EP2
ECAM
PLA2
NMDA
Neurona de
proyección
cuerno dorsal
medular
ECAM
ECAM
[Ca2+]
AA
iNOS
PGE2
nNOS
COX-2
NO
ECAM
Posibles blancos moleculares susceptibles al extracto de la corteza del árbol del mango (ECAM) en el dolor crónico. ECAM podría disminuir la liberación del glutamato (Glu) por la terminal nociceptiva a nivel del cuerno dorsal espinal (CDE); inhibir la activación de la óxido nítrico neuronal (nNOS) promovida por el aumento de las concentraciones del Ca2+ citosólico generado por la apertura del canal del receptor NMDA que aumenta la magnitud de la despolarización y por la activación de los receptores NK1 por la sustancia P (SP); activar la guanilato ciclasa, la cual aumenta las concentraciones de GMPc, cierra canales de K+ y activa cinasas dependientes de GMPc que promueven la liberación de Glu; inhibir la activación de la fosfolipasa A2 (PLA2) y la síntesis de metabolitos del ácido araquidónico (AA), en especial la PGE2 que en estas condiciones interactúa con receptores EP2 presinápticos que aumentan la actividad de adenilato ciclasa con la consiguiente formación de AMPc que activa la PKA, dependiente de AMPc, la cual también induce liberación de Glu; inhibir la síntesis o expresión de citocinas, la iNOS y la COX‐2 mediada por el NF‐κB; e inhibir la activación de NF‐κB. De esta manera ECAM podría inhibir la respuesta neuroinmune y la participación glial en la hiper‐
excitabilidad central. Además, con el objetivo de estudiar los efectos del ECAM y la MF sobre la respuesta a la inflamación pulmonar y la producción de citocinas Th2 se desarrolló un modelo de asma alérgica inducida por OVA en ratones (García‐Rivera et al., 2011). Tanto ECAM como MF produjeron una marcada reducción de la inflamación de las vías aéreas alrededor de los vasos y los bronquios, inhibieron las citocinas IL‐4 e IL‐5 en el fluido broncoalveolar, las concentraciones de IgE y la proliferación de linfocitos. Estos resultados experimentales demostraron las propiedades antialérgicas del ECAM y la MF, como consecuencia de la inhibición de mediadores como la IgE, la histamina y de la capacidad de los linfocitos B y T para contribuir a la respuesta alérgica. EFECTOS PROTECTORES SOBRE LA MOLÉCULA DE ADN (ESTUDIOS DE ANTIMUTAGÉNESIS Y ANTIGENOTOXICIDAD) El potencial antimutagénico de ECAM fue realizado tanto in vitro como ex vivo mediante el ensayo de Ames. En el ensayo in vitro se evaluó la protección del ECAM frente a diferentes compuestos con reconocida actividad mutagénica. Por otro lado, en el estudio ex vivo los animales fueron tratados durante 30 días con dosis orales del ECAM y, a partir de estos animales, se obtuvo la fracción microsomal hepática empleada como activador metabólico en el ensayo de Ames (Morffi et al., 2012). Como resultado de estos estudios se demostró que el ECAM presentó actividad antimutagénica frente a diferentes mutágenos a los cuales se expone comúnmente el hombre (bleomicina, ciclofosfamida, mitomicina C, cisplatino, dimetilnitrosamina, benzo(a)pireno, 2‐
acetilaminofluoreno, azida sódica, ácido picrolínico y 1‐
nitropireno). Además, el ECAM inhibió la actividad microsomal de CYP1A1, por lo que los autores manifestaron que, además de la potente actividad antioxidante que presenta el extracto, éste pudiera ejercer su efecto quimiopreventivo debido a su capacidad de inhibir la actividad de algunas isoformas del citocromo P450. Además, en un estudio in vivo en el que se evaluaron los efectos de ECAM sobre el daño al ADN inducido por la bleomicina (Ensayo Cometa) en ratones NMRI, se demostró que la administración del ECAM durante siete días protegió del daño primario al ADN (Cancino et al., 2001). El efecto radioprotector del ECAM frente a la radiación gamma también ha sido evaluado (Rosario‐Fernández et al., 2010). En esta ocasión se utilizó el ensayo bacteriano SOS Chromotest (dosis de radiación de 150 Gy), así como se evaluó la peroxidación lipídica y la actividad enzimática mitocondrial en eritrocitos (dosis de radiación 250 Gy), que son las células más afectadas durante las sesiones de radioterapia. El ensayo SOS Chromotest indicó que el extracto no fue genotóxico en presencia o no de activación metabólica. Además, se determinó que el ECAM presenta actividad radioprotectora del material genético. Los autores afirmaron que estos resultados demuestran que el extracto es capaz de proteger la estructura celular de los daños inducidos por la radiación gamma a varios niveles: material nuclear, membranas celulares y sistemas enzimáticos mitocondriales. Posiblemente, la MF sea la responsable de la radioprotección demostrada por el extracto, por lo que se diseñó un estudio en el que los ratones se trataron con diferentes dosis de MF, una hora antes de la administración de 10 Gy de radiaciones gamma. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 72 La xantona redujo los síntomas de la enfermedad por irradiación y demoró la aparición de la mortalidad comparado con el grupo no tratado e irradiado (Jagetia & Baliga, 2005). La acción radioprotectora de la MF se incrementó de manera dependiente de la dosis hasta 2 mg/kg y declinó posteriormente hasta 100 mg/kg (dosis máxima utilizada). También se calculó la dosis letal 50 (DL50) para este polifenol, la cual alcanzó los 400 mg/kg p.c. De esta forma MF protegió a los ratones de la enfermedad y la muerte inducidas por irradiación con una dosis protectiva óptima de 2 mg/kg, la cual constituyó 1/200 de la DL50. Asimismo, MF ha sido estudiada por su capacidad para reducir la frecuencia de células binucleadas‐
micronucleadas inducidas por radiación en linfocitos de sangre periférica humana (Jagetia & Venkatesha, 2005). MF elevó, de forma significativa, el índice de proliferación de las células irradiadas y redujo la peroxidación lipídica inducida por H2O2 de modo dependiente de la concentración. De la misma manera, en un sistema libre de células, MF inhibió la inducción de los radicales hidroxilo, superóxido, DPPH y ABTS. Por tanto, se demostró que MF posee propiedades radioprotectoras al suprimir los efectos de los radicales libres que se inducen durante las radiaciones. Por otra parte, el arsénico (As) altera múltiples vías celulares que incluyen la expresión de factores de crecimiento, la supresión de proteínas checkpoint del ciclo celular, promoción y resistencia a la apoptosis, la inhibición de la reparación del ADN, las alteraciones en la metilación del ADN, disminución de la inmunovigilancia, y el aumento de estrés oxidativo, por la alteración del equilibrio prooxidante‐antioxidante (Flora, 2011). Teniendo en cuenta las acciones demostradas tanto para ECAM como MF, sobre el estrés oxidativo y su posible protección contra el daño inducido por As, se diseñó un estudio en el que fueron analizados los posibles efectos protectores del extracto y algunos de sus derivados fenólicos (ácido gálico, catequina, quercetina y MF) sobre la citotoxicidad inducida por arsénico (As3+) en la línea celular de túbulo proximal renal HK‐2 (Garrido et al., 2012). 3+
En células cultivadas durante 24 h en presencia de As , ocurrió una pérdida de la viabilidad celular, dependiente de la concentración, que fue significativamente recuperada por ECAM, seguido de ácido gálico, catequina y MF. El 3+
complejo MF‐Fe demostró ser más eficaz ante dicha problemática que MF sola. Tanto ECAM como los fenoles aumentaron significativamente la fracción de células supervivientes. En las células pretratadas con ECAM o fenoles durante 72 h, la protección conferida por ECAM resultó disminuida en comparación con los experimentos más cortos (24 h). Las células pretratadas con una cantidad sub‐citotóxica de As3+ o cultivadas en presencia continua de baja concentración de MF demostraron ser más 3+
resistentes a As y mostraron un incremento tanto en la cantidad de P‐gp como del ARNm de ABCB1, mientras que las células cultivadas en presencia de albúmina resultaron más sensible. Los autores manifiestan que, debido a que todos los cambios anteriores comparten condiciones con la expresión‐actividad de glicoproteína P (P‐gp), un transportador potencialmente implicado en la resistencia a arsénico, la capacidad de ECAM y sus fenoles para modular 3+
la citotoxicidad inducida por As sería, al menos en parte, dependiente de sus interacciones con P‐gp. ACTIVIDAD ANTICANCERÍGENA Existen reportes en la literatura relacionados con la actividad anticancerígena de extractos de mango que demuestran especificidad celular, aunque pocos que relacionen al ECAM con esta actividad a pesar que el extracto se utiliza en Cuba, desde el punto de vista etnomédico, para el tratamiento del cáncer (Guevara‐
García et al., 2004). Una posible validación de este uso la ha realizado un grupo de investigadores (Delgado‐
Hernández et al., 2012) que evaluaron tanto al ECAM como a la MF en modelos de angiogénesis, teniendo en cuenta que los procesos angiogénicos son esenciales para el crecimiento y la proliferación tumoral (De la Vega et al., 2012). ECAM y MF se evaluaron en dos ensayos antiproliferativos de células endoteliales y tres modelos in vitro de angiogénesis humana como son los explantes de vasos sanguíneos de placenta humana, el gel sobre gel (gel‐over‐gel, tipo sándwich) y ensayos en Matrigel. Tanto el extracto como la xantona inhibieron la formación de tubos capilares en los dos primeros ensayos, mientras que MF abolió la neovascularización en el ensayo tipo sándwich. Ambos productos redujeron la producción de TNFα y la angiogénesis inducida en células B16F10 en un modelo de angiogénesis inducida en Matrigel en ratones. Por otra parte, otros extractos de mango han mostrado protección contra cáncer de próstata en modelos in vivo e in vitro (Prasad et al, 2008) e inhibición del ciclo celular en la fase G0/G1 de células HL‐60 (Percival et al., 2006), mientras que no han sido efectivos contra células de cáncer de mama MCF‐7 (García‐Solís et al., 2009). Posiblemente, la MF o el lupeol (triterpeno), presentes en estos extractos, sean los responsables de esta actividad. La MF ha mostrado protección contra cáncer de pulmón inducido por benzo(a)pireno en ratones (Rajendran et al., 2008b), lo que podría estar relacionado con la inducción de la permeabilidad mitocondrial (Pardo‐Andreu et al., 2006c). Por otra parte, en un estudio a corto plazo, la MF administrada en la dieta de las ratas inhibió el desarrollo de lesiones pre‐neoplásicas inducidas por el carcinógeno azoximetano (Yoshimi et al., 2001). En un estudio a largo plazo tuvo baja incidencia sobre la multiplicidad de la neoplasia intestinal inducida por dicho carcinógeno. Además, la proliferación celular en la mucosa del colon fue reducida en las ratas tratadas con esta xantona. Estos Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 73 experimentos sugieren que MF constituye un potencial agente quimiopreventivo. En otros estudios, MF tuvo una actividad inhibitoria del crecimiento de fibrosarcoma ascítico en ratones (Guha et al., 1996). Mediante tratamientos con MF, tanto in vivo como in vitro, aumentó la citotoxicidad contra células esplénicas y macrófagos de ratones normales y con tumores implantados. El tratamiento in vitro con MF de las células esplénicas de ratones a los que se les implantó el tumor aumentó la citotoxicidad de estas células tumorales, tanto en aquellas sensibles como en las resistentes a células naturales asesinas (NK). De la misma manera, la administración de MF protegió a células N2A (línea celular de neuroblastoma murino) contra la citotoxicidad inducida por MPP+ (el metabolito activo de 1‐metil‐4‐fenil‐1,2,3,6‐tetrahidropiridina), el cual induce síndrome parkinsoniano en animales y humanos a través de un mecanismo de neurotoxicidad comprometido con el estrés oxidativo (Amazzal et al., 2007). MF restauró el contenido de GSH y reguló la expresión del ARNm de la superóxido dismutasa y la catalasa, por lo que los autores plantearon que la MF podría utilizarse en la terapia de enfermedades neurodegenerativas, tales como el Parkinson, en las cuales el estrés oxidativo desempeña un papel crucial. Por otra parte, los terpenoides, como el lupeol y otros relacionados también ejercen una variedad de actividades citotóxicas contra varios tipos de células tumorales como el melanoma murino B16 2F2, leucemia HL‐60, U937, K562, melanoma G36, carcinoma de pulmón humano A‐549 y adenocarcinoma de colon humano DLD‐1 (Chaturvedi et al., 2008), así como en modelos in vivo como la carcinogénesis bucal inducida por 7,12‐
dimetilbenz(a)antraceno en el cachete del hámster (Palanimuthu et al., 2012). Probablemente, el potencial quimiopreventivo del lupeol radica en su actividad antioxidante y secuestradora de radicales libres y moduladora de los posibles efectos sobre las enzimas metabolizadoras de xenobióticos de fases I y II a favor de la excreción de metabolitos carcinogénicos. Además, esta molécula es capaz de actuar sobre otros mediadores moleculares involucrados en esta patología como son: el factor NF‐κB, las enzimas glutatión S‐transferasa, glutatión reductasa, COX‐2, metaloproteinasa de matriz 2 y catalasa, receptor andrógeno, proteína cinasa C alfa, forma celular de la proteína inhibitoria FLICE (cFLIP), receptor de muerte 3 (DR3), entre otros (Siddique & Saleem, 2011). Por otra parte, los ácidos fenólicos como el ácido gálico, que también se han reportado en los extractos de mango (Núñez‐Sellés et al., 2002), han mostrado inhibición del crecimiento celular en líneas celulares humanas de esófago, gástrica, cérvix, mama (MCF‐7), colon (HT‐29, Col201) y murinas como Colon 26 (Faried et al., 2007). De la misma forma, se sabe que los galotaninos presentan actividad contra el cáncer de colon (células T‐84 y HCT‐116) (Gali‐Mahtasib et al., 2001; Oh et al., 2001; Chen & et al., 2003; Chen & Lin, 2004; Al‐Ayyoubi & Gali‐Muhtasib, 2007), células de cáncer de mama (MCF‐7), así como en células T Jurkat (Chen & et al., 2003; Chen & Lin, 2004). ACTIVIDAD SOBRE CITOCROMO P450 Y GLICOPROTEÍNA P. POSIBILIDADES DE INTERACCIÓN CON FÁRMACOS El metabolismo de los fármacos es el mayor determinante del aclaramiento de los medicamentos, las diferencias individuales en la farmacocinética e, indirectamente, la eficacia clínica y la toxicidad de los fármacos. La industria farmacéutica está llamada a comercializar los fármacos más seguros con pocos efectos adversos, propiedades farmacocinéticas predecibles e interacciones cuantificables fármaco‐fármaco, fármaco‐producto herbal o fármaco‐
alimento. El riesgo potencial de las interacciones entre derivados de plantas y fármacos es de particular interés en la actualidad, justamente por el incremento del uso de los primeros. De esta forma, los hepatocitos representan el modelo más apropiado para la evaluación del metabolismo integrado de fármacos, productos herbales o alimentos, las correlaciones metabolismo‐toxicidad, mecanismos de hepatotoxicidad y las interacciones (inhibición e inducción) de xenobióticos y enzimas que metabolizan fármacos. También son más rentables los estudios del perfil y la tasa metabólica, la identificación de los citocromos P450 involucrados, las interacciones potenciales fármaco‐
fármaco o el papel de las enzimas polimórficas antes del inicio de los ensayos clínicos (Gómez‐Lechón et al., 2010). Estudios recientes (Rodeiro et al., 2008a,b) demostraron que la incubación del ECAM con las células hepáticas no modificó la actividad de diferentes citocromos del sistema del CYP‐450 (CYP3A, 2E, 2D6, 2B6, 2C9 y 2C19). Sólo se observó una inhibición significativa, dependiente de la concentración del CYP1A1/2, lo que se puede considerar como un resultado que puede fundamentar una posible actividad quimiopreventiva del ECAM, ya que este citocromo ha sido asociado con la activación de diferentes mutágenos y carcinógenos en el organismo. Además, el ECAM provocó una inducción dos veces mayor de la actividad del CYP2B6 en este sistema celular. Mientras que en otro estudio (Rodeiro et al., 2012) se examinaron los efectos del ECAM y la MF sobre varias enzimas P450 y UDP‐glucuronosiltransferasas (UGTs) en hepatocitos humanos cultivados en el que se observó una disminución, dependiente de la concentración de ambos productos, de la actividad de las cinco enzimas P450 medidas (CYP1A2, 2A6, 2C9, 2D6 y 3A4). Para todas las actividades se observó una reducción de al menos 50% a la concentración más Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 74 alta (250 mg/mL). Además, el ECAM redujo considerablemente la actividad UGT1A9 (alrededor de 60% a 250 mg/mL) y tuvo menos efectos sobre las otras UGTs. En contraste, MF (250 mg/mL) tuvo efectos mayores sobre UGT1A1 y 2B7 que sobre UGT1A9 (aproximadamente 55% frente a 35% de reducción, respectivamente). La cuantificación de ARNm específicos reveló una reducción en el contenido de ARNm de los CYP3A4 y 3A5, y un aumento de los ARNms de CYP1A1, CYP1A2, UGT1A1 y UGT1A9. No fueron observados efectos notables en las concentraciones de CYP2A6, 2B6, 2C9, 2C19, 2D6 y 2E1. Los autores sugirieron que la actividad y(o) expresión de las principales enzimas P450 y UGT es modulada por el ECAM y que pudieran surgir interacciones potenciales con fármacos después de una ingesta combinada de este extracto con los fármacos convencionales. Por lo tanto, si bien es cierto que no siempre se manifiestan estas posibles interacciones cuando se pasa de modelos in vitro a in vivo, deben ser examinados los riesgos potenciales de seguridad del ECAM cuando se co‐administre con otros fármacos. Por otra parte, muchos compuestos derivados de plantas, incluyendo los polifenoles, son capaces de afectar la función de MDR‐1/glicoproteína P (P‐gp ABCB1) transportador de múltiples fármacos, lo que conduce a posibles interacciones hierba‐fármaco (Chieli & Romiti, 2008). Por ello, se realizó un estudio para evaluar los efectos de ECAM y algunos fenoles presentes en él sobre la actividad de P‐gp en una línea celular de túbulo proximal HK‐2, en una sub‐línea celular Caco‐2 (seleccionada por su resistencia a vincristina, Caco‐2/VCR) y la sobreexpresión de P‐gp (Chieli et al., 2009). Todos los compuestos investigados, a excepción de catequina y ácido gálico, inhibieron la actividad de P‐gp en células HK‐2, en el orden de mangiferina <noratiriol <quercetina <ECAM. Efectos similares se obtuvieron en células Caco‐2/VCR resistentes, pero fueron insignificantes en los de tipo salvaje, expresando bajas cantidades de P‐gp. Para profundizar en el mecanismo por el cual ocurre esta inhibición se realizó un estudio en el que se determinó la capacidad potencial de los compuestos en estudio sobre el gen ABCB1 y la expresión de P‐gp en las células HK‐2 que expresan constitutivamente este transportador (Chieli et al., 2010). Mediante western blot se demostró que hubo una disminución dependiente de la concentración de P‐gp en células cultivadas en presencia de ECAM durante 72 h. El ácido gálico y la quercetina también disminuyeron las concentraciones de P‐gp a todas las concentraciones estudiadas, mientras que la catequina fue casi ineficaz. Sin embargo, en las células expuestas a MF la cantidad de P‐gp mostró un incremento dependiente de la concentración y del tiempo, por lo que fue dos veces mayor que los controles después de 72 h. También, noratiriol indujo P‐gp a bajas concentraciones pero el efecto disminuyó a concentraciones superiores. Los cambios en la cantidad de proteína P‐gp se correlacionaron con cambios relativos en el contenido de ARNm de ABCB1 y con la actividad de flujo de salida del transportador. El inhibidor transcripcional 1‐
d‐ribofuranosilbenzimidazole (DRB) inhibió el aumento de la expresión de ABCB1 inducido por MF, lo que sugiere que el aumento podría ser debido a la regulación transcripcional del ARNm de ABCB1. Las células tratadas con MF, que sobreexpresaron el transportador, estaban protegidas frente a la citotoxicidad de ciclosporina A, un sustrato conocido de la P‐gp. El efecto protector también se observó en las células pretratadas con ECAM. Estos resultados demuestran que ECAM y los polifenoles presentes en él también pueden interactuar con ABCB1/P‐
gp a nivel de expresión. Estos resultados demostraron, por primera vez, que ECAM y los polifenoles presentes en el extracto pueden afectar a la actividad del transportador de múltiples fármacos P‐gp ABCB1, lo que sugiere la posibilidad de interacciones hierba‐fármaco que debían ser estudiadas en profundidad, fundamentalmente en modelos in vivo. EVIDENCIAS TOXICOLÓGICAS Estudios de Toxicidad Estudios, realizados en roedores (ratas y ratones), demostraron que el ECAM es un producto que clasifica como No tóxico cuando se administra por dosis única por las vías oral (DL50 > 5000 mg/kg p.c.) y tópica (DL50 > 2000 mg/kg p.c) (Garrido et al., 2009). Mientras que la toxicidad por dosis única, vía intraperitoneal (i.p.), en ratas permitió clasificar al producto como Tóxico, con una toxicidad diferencial entre los sexos, de modo tal que mientras la DL50 en las hembras fue de 166,48 mg/kg p.c en los machos fue > 500 mg/kg p.c., lo que indica que las hembras son más sensibles al producto bajo estas condiciones experimentales. El estudio en ratones demostró que la DL50 para las hembras fue de 273,14 mg/kg y en los machos de 219,67 mg/kg, sin mostrar, en este caso, diferencia entre los sexos. En estos ensayos los síntomas clínicos detectados seguidos a la administración de ECAM fueron consistentes con la clasificación del producto. Estudios de Genotoxicidad El potencial mutagénico y genotóxico del ECAM se realizó mediante una batería de pruebas que incluyeron los estudios propuestos comúnmente por las agencias nacionales e internacionales para investigar los efectos tóxicos del producto de ensayo sobre el material genético. El ECAM fue evaluado en el ensayo de Ames con el empleo de las cepas TA 1535, TA 1537, TA 1538, TA 98 y TA 100, en presencia y ausencia de activación metabólica, pero éste no indujo efecto mutagénico hasta concentraciones de 5 000 μg/placa, límite máximo de evaluación propuesto para este ensayo (Rodeiro et al., 2006). El potencial genotóxico in vivo del ECAM fue determinado por la administración por vía oral (20 ‐ 2 000 mg/kg p.c.) a Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 75 ratones NMRI de ambos sexos. En este estudio de detección de daño primario al ADN no existieron evidencias de toxicidad en el hígado, principal órgano que ha sido demostrado metaboliza la mayoría de los compuestos presentes en el extracto como son los polifenoles, los terpenos y los ácidos grasos (Walle, 2004). A diferencia de lo observado in vitro, el ECAM no indujo daño primario al ADN en leucocitos de sangre periférica, ni en células hepáticas de los animales tratados, a pesar de la dosis máxima utilizada, límite máximo aceptado para este tipo de ensayos. Tampoco se observaron efectos genotóxicos cuando el ECAM se administró por vía i.p. (50 ‐ 200 mg/kg), lo que demostró que tampoco induce daño primario al ADN en leucocitos de sangre periférica, ni en células hepáticas de ratones NMRI de ambos sexos por esta vía de administración, bajo esas condiciones de ensayo (González et al., 2007). El estudio de los efectos del ECAM sobre la inducción de micronúcleos fue realizado en linfocitos humanos de sangre periférica en el que se demostró que el extracto presentó un efecto citotóxico a la concentración máxima ensayada (1 500 μg/mL), pero no indujo clastogenicidad en el rango de concentraciones estudiado (150 ‐ 1 500 μg/mL) después de 3 y 20 h de exposición, en presencia y ausencia de activación metabólica, respectivamente (Rodeiro et al., 2006). En los estudios realizados in vivo se corroboró que el ECAM, administrado por vía oral produjo una ligera citotoxicidad a la dosis máxima evaluada (2 000 mg/kg p.c.). Este evento no presentó repercusión clínica para los animales en el estudio y puede interpretarse como un indicador de evidencias de exposición del órgano diana. Al analizar la frecuencia de MN no existió relación con la dosis de ECAM administrada, por lo que es posible afirmar que, de igual manera que en los ensayos in vitro, el extracto no indujo clastogenicidad a nivel de la médula ósea de ratones NMRI, por lo que el nivel de dosis al que no se observan efectos adversos (NOAEL), bajo estas condiciones de ensayo, fue 2 000 mg/kg/día (González et al., 2007). En adición, la administración i.p. de ECAM (50 ‐ 200 mg/kg) a ratones NMRI de ambos sexos indujo una citotoxicidad moderada sobre el proceso de eritropoyesis a nivel de la médula ósea, pero no sobre los leucocitos de sangre periférica de los animales tratados con el producto y tampoco indujo clastogenicidad en la médula ósea, por lo que el NOAEL en este ensayo fue de 200 mg/kg/día. De manera general, puede apreciarse que no existe relación entre las dosis de ECAM administradas en los estudios realizados y la frecuencia de micronúcleos observada, ni tampoco en la respuesta de daño primario al ADN y el porcentaje de nucleoides altamente dañados en los leucocitos de los animales tratados, lo que soporta la hipótesis que la inducción de daño primario observada, in vitro en el ensayo Cometa, pudiera estar relacionada con la generación de H2O2 en las condiciones de incubación empleadas. La ausencia de genotoxicidad in vivo coincide, además, con lo observado para otros polifenoles como la quercetina (Metodiewa et al., 1999) y la estrecha relación entre el ambiente redox y la actividad genotóxica descrita para algunos polifenoles (Skibola & Smith, 2000; Collins, 2005). De acuerdo a estos resultados, los autores sugirieron que el ECAM presenta un bajo potencial mutagénico y genotóxico in vitro y no es genotóxico in vivo. Estudios de Teratogénesis El potencial teratogénico y(o) embriotóxico del ECAM, administrado por vía oral, fue ensayado durante la organogénesis de ratas Sprague‐Dawley, período de mayor susceptibilidad para la producción de perturbaciones en la morfogénesis normal de los órganos y tejidos del embrión. El ECAM no produjo muertes maternas ni signos clínicos relevantes en los diferentes grupos de tratamiento. Los análisis estadísticos del consumo de alimentos y los incrementos de peso materno durante la gestación no evidenciaron diferencias significativas entre los animales del grupo control y los administrados con ECAM. En relación con los efectos del extracto sobre el desarrollo embrionario, no se obtuvo un incremento de las muertes en útero, retardo en el crecimiento, ni teratogenicidad. El número de madres con fetos no viables y el tamaño de la camada no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre las madres administradas con ECAM y las controles. Tampoco las pérdidas post‐implantación (reabsorciones embrionarias como las muertes fetales) ni el peso de los fetos difirieron de forma significativa entre esos grupos. El análisis de los esqueletos no evidenció malformaciones en el grupo de control, ni en los grupos tratados (González et al., 2007). De acuerdo a estos resultados, el ECAM no es un agente inductor de aberraciones cromosómicas que no provoca alteraciones en la división celular, ni inducción de apoptosis a un nivel tal que cause embriotoxicidad en las condiciones experimentales expuestas, por lo que su NOAEL fue de 2 000 mg/kg/día. En estos estudios el ECAM presentó un bajo potencial teratogénico; sin embrago, es necesario enfatizar que la demostración de la inocuidad de un producto sobre el proceso de la reproducción involucra no sólo la evaluación de su potencial teratogénico, también involucra el estudio de sus posibles efectos sobre otros indicadores como son: el ciclo estral, la conducta en el apareo, la fertilidad, y el desarrollo pre y postnatal de las crías (incluidos los estudios sobre la descendencia) y una evaluación de su función reproductora, lo que permitiría, unido a sus Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 76 propiedades farmacológicas, definir su posible utilización en mujeres gestantes y niños. Otros estudios toxicológicos Los estudios de irritabilidad, tanto del ECAM como de las formulaciones Vimang®, demostraron que se está en presencia de un producto que clasifica como No Irritante por vía oral, tópica, rectal, vaginal y ocular (Garrido et al., 2009). El resumen de los resultados de los estudios toxicológicos realizados al ECAM se muestra en la Figura 5. EVIDENCIAS DE FARMACOLOGÍA CLÍNICA humanas asociadas al estrés oxidativo, inflamación y dolor, sustentada por modelos in vitro e in vivo, así como del conocimiento el perfil toxicológico del extracto, se reportan también los estudios sobre la tecnología química (Acosta‐Esquijarosa et al., 2009a,b, 2010; Nuevas‐Paz et al., 2012) y farmacéutica (Arús‐Pampin et al., 2003; Lemus‐
Rodríguez et al., 2006) que no sólo facilitaron la realización de los ensayos anteriores, también permitieron obtener las diferentes formulaciones que se usarían en la realización de los estudios clínicos (Núñez‐Selles et al., 2007c). Ensayo clínico aleatorizado, a doble ciego, para medir el efecto sobre los indicadores séricos de estrés oxidativo y la calidad de vida en el adulto mayor en la Atención Primaria de Salud. Teniendo en cuenta la efectividad demostrada por el ECAM en el tratamiento y(o) prevención de enfermedades El objetivo del estudio (Pardo‐Andreu et al., 2006d) fue evaluar la mejoría de la calidad de vida mediante la ®
suplementación con Vimang en el Adulto Mayor en la Atención Primaria de Salud, de forma ambulatoria, para lo cual se incluyeron 31 adultos mayores de 65 años, aparentemente sanos (Grupo 1), de forma aleatorizada, a ®
los cuales se les suministró Vimang (tableta, 300 mg, tres veces al día) y se controlaron siete parámetros del estrés oxidativo: la capacidad total antioxidante sérica (CTA), GSH (peroxidasa, reducido y total), sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS), superóxido dismutasa (SOD) y potencial de peroxidación (PP). Los resultados de la evolución del estrés oxidativo en este grupo se compararon con los de un grupo de 30 adultos no ®
suplementados con Vimang (Grupo 2) y un grupo de 30 jóvenes sanos (Grupo 3), con edades entre 25 y 30 años a quienes se le realizaron las mismas determinaciones. Al Grupo 1 se le aplicó el Cuestionario de Salud SF‐36, validado internacionalmente para evaluar la calidad de vida, que contempla nueve funciones: Función física, Rol físico, Rol social, Dolor corporal, Salud general, Vitalidad, Rol emocional y Salud mental. Las determinaciones se realizaron a los tiempos cero (inicio del ensayo), 15, 30 y 60 (final del ensayo) días.
Figura 5. 9 N O T Ó X IC O
(o r a l y tó p ic a )
9 T Ó X IC O (i.p )
(ra ta s y ra to n e s )
9 N O T Ó X IC O
(o r a l, 9 0 d ía s , r a ta s )
D o s is 2 0 0 0 m g /k g
9 N O T Ó X IC O
(o r a l, 1 8 0 d ía s , r a ta s )
D o s is 2 0 0 0 m g /k g
S U B -C R Ó N IC O S
C R Ó N IC O S
AGUDOS
ECAM
IR R IT A B IL ID A D
T E R A T O G É N E S IS
G E N O T O X IC ID A D
9 N O T E R A T O G É N IC O
(o r a l, r a ta s )
D o s is 2 0 0 0 m g /k g
9 N O G E N O T Ó X IC O in v iv o
(o r a l, i.p ., r a to n e s )
D o s is 1 5 0 m g /k g (i.p .)
2 0 0 0 m g /k g (o r a l)
9
9 N O IR R IT A N T E
(p ie l, r e c to y o jo s )
IR R IT A B IL ID A D M ÍN IM A
(v a g in a )
C o n e jo s
Resumen de los estudios toxicológicos realizados al extracto de la corteza del árbol del mango (ECAM). Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 77 La suplementación con Vimang® modificó en el Grupo 1, de forma significativa, cuatro de los siete marcadores del estrés oxidativo evaluados, al ser comparados con el grupo control (Grupo 2) no suplementado con Vimang® a los 60 días de tratamiento: incrementó la actividad de la SOD extracelular y la CTA; al mismo tiempo redujo las concentraciones de TBARS y de glutatión oxidado (GSSG). Fue significativo que los valores de esos marcadores del estrés oxidativo en el grupo tratado alcanzaron los mismos valores que el Grupo 3 (jóvenes entre 25 y 30 años). Con relación a la evaluación de la calidad de vida, la ®
suplementación con Vimang mejoró la autopercepción de la salud en los adultos tratados en ocho de los nueve parámetros evaluados del Cuestionario SF‐36. Lo más significativo de esta evaluación fue la mejoría en el parámetro “Dolor corporal”. Dicho parámetro fue el primero que mostró una diferencia significativa, a los 15 días de iniciado el tratamiento, y tuvo la mayor diferencia al final del ensayo de todos los parámetros evaluados. Sólo un parámetro del Cuestionario SF‐36 (“Rol emocional”) no mostró una diferencia significativa al término del estudio. Los autores manifestaron que la reducción del estrés oxidativo en el adulto mayor, mediante la suplementación con Vimang® implicó una mejoría de la calidad de vida, reflejado, sobre todo, en el alivio de los dolores corporales, una mayor autopercepción de mejoría en el estado general de salud y un desempeño superior de la actividad física. Ensayo clínico aleatorizado, a doble ciego y controlado, para determinar el efecto sobre marcadores de estrés oxidativo y la progresión de la enfermedad VIH‐SIDA El objetivo de este estudio fue evaluar la evolución del estrés oxidativo en pacientes seropositivos VIH en condiciones de atención sanatorial y dieta controlada y su efecto en la progresión de los marcadores inmunológicos de la enfermedad y la evolución clínica de los pacientes (Gil del Valle et al., 2002; Pérez et al., 2003). Para ello, se diseñó un ensayo clínico aleatorizado, a doble ciego y controlado, en el que se evaluó el efecto de las tabletas Vimang® (ocho tabletas de 300 mg, diarias durante seis meses) vs. placebo. Al finalizar el ensayo se pudo evaluar el comportamiento de 68 sujetos: 36 suplementados con tabletas Vimang® y 32 que recibieron placebo en los que se evaluaron variables de estrés oxidativo, hemoquímicas, inmunológicas y nutricionales. Estos resultados se compararon con los obtenidos para un grupo de seronegativos (28 sujetos). ®
El grupo suplementado con las tabletas Vimang tuvo un incremento en plasma de TAS (Total Antioxidant Status), GSH y GPx y una reducción en el potencial de peroxidación, MDA, hidroperóxidos totales en plasma, porcentaje de fragmentación del ADN y SOD. Todas estas variables tuvieron una diferencia estadísticamente significativa respecto al grupo placebo. La mejoría en el estado redox en el grupo suplementado con Vimang® fue del 56,3% con relación al 3,7% del grupo placebo. No hubo diferencias significativas en las variables hemoquímicas y no se observaron efectos tóxicos a nivel plasmático, renal, ni hepático. De las siete variables estudiadas, tres mostraron tendencia a la disminución: eritrosedimentación, transaminasa y ácido úrico. Tampoco se detectaron diferencias significativas entre el conteo de CD4 y CD8/CD38 del grupo tratado respecto al grupo placebo y hubo una tendencia hacia la reducción en el receptor de CD95, aunque no se observó diferencia estadísticamente significativa (p=0,08). En este ensayo, la dieta fue controlada y monitoreada para ambos grupos. El índice nutricional de la ingesta de macro y micronutrientes durante el período de ensayo no mostró diferencias significativas entre los grupos. El aporte de nutrientes dentro de la dieta se mantuvo estable durante el tiempo del estudio, por lo que los autores aseguraron que los resultados sólo se pueden adscribir al efecto del tratamiento. Estos no detectaron reacciones adversas en el grupo suplementado con las tabletas Vimang®. Reporte de casos en asma bronquial Estudios recientes han mostrado evidencias de que las ERO producidas por las células inflamatorias de las vías aéreas desempeñan un papel esencial en la patogénesis del asma bronquial (Nadeem et al., 2003) y que decrece la capacidad endógena antioxidante en pacientes con esta patología (Bowler & Crapo, 2002). Por lo tanto, se administraron cápsulas Vimang® (300 mg, tres veces al día antes de las comidas, durante 12 semanas) a dos pacientes con grados de asma diferentes (Álvarez‐León et al., 2009). El diagnóstico se estableció mediante interrogatorio, examen físico y confirmado por pruebas de ayuda en las que se demostró la presencia de obstrucción bronquial por espirometría basada en el cumplimiento del criterio de FEV1/FVC < 80%. El paciente I (femenina, 39 años) se diagnosticó como asma moderada persistente y el paciente II (masculino, 43 años) se diagnosticó como asma severa persistente. A estos pacientes también se les determinaron inmunoglobulina E (IgE) total en suero, proteína catiónica de eosinófilo (ECP) y la actividad de la metaloproteinasa‐9 (MMP‐9) a las 0, 6 y 12 semanas de tratamiento. Se pudo observar una disminución de la actividad enzimática de MMP‐9 de forma proporcional al tiempo de tratamiento en ambos pacientes. Un comportamiento similar se obtuvo también para la IgE y la ECP. Desde el punto de vista funcional se logró el mismo comportamiento para el volumen expiratorio forzado (FEV1). Hubo una mejoría clínica evidente, dada por el espaciamiento de los síntomas diurnos (disnea, opresión torácica y sibilancia) y nocturnos (tos y sibilancia) a partir de la tercera semana de tratamiento. El paciente II no presentó síntomas agudos Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 78 durante el estudio y tuvo necesidad de usar el salbutamol sólo dos veces (una vez a la segunda semana y otra a la quinta semana). Resultó significativo que ninguno de los dos pacientes consumió esteroides durante las 12 semanas de tratamiento. Estudio piloto para determinar la eficacia en el tratamiento de afecciones dermatológicas de alta incidencia en la Atención Primaria de Salud La piel, como órgano, no escapa a la acción deletérea que pueden ejercer las ERO a nivel subcelular, celular y tisular, cuando por la presencia de patógenos o por alteraciones de su fisiología, se rompe el equilibrio redox, toda vez que existe una íntima relación entre los procesos inflamatorios crónicos o agudos, el envejecimiento, el estrés oxidativo y la protección que ejercen los polifenoles (Afaq & Katiyar, 2011). Teniendo en cuenta estos antecedentes, se estudió la evolución clínica de 345 pacientes portadores de afecciones dermatológicas, atendidos en la Atención Primaria (Guevara et al., 2007) los que usaron la crema Vimang® 1,2%, tres veces al día, en las zonas lesionadas, con el fin de conocer datos que permitieran un diseño más adecuado y establecer su viabilidad en afecciones dermatológicas de alta frecuencia. En este estudio se siguió la evolución de 158 pacientes con patologías de etiología micótica. De ellos, 66 pacientes presentaron pitiriasis versicolor, 34 otras variedades de epidermofitosis, fundamentalmente en los pies; 34 presentaron intertrigo y 24 otras micosis que afectaban la piel y las mucosas ótica, nasal, bucal, vaginal o rectal. La evolución de las micosis, en general, tuvo una tendencia significativa en el 39,2% de los pacientes hacia la Remisión Completa (RC, desaparición de los síntomas y signos de la enfermedad en el curso del tratamiento, remisión completa de la crisis en el caso de afecciones crónicas) y en el 52,2% de ellos Remisión Parcial (RP, alivio significativo de los síntomas y signos de la enfermedad con reducción en más de un 70% de la extensión de las lesiones o regreso de los signos y síntomas a niveles inferiores a los del inicio de la consulta, en el caso de las afecciones crónicas), frente a un 9% de casos en que la afección tuvo una No Remisión (NR, mantenimiento de los signos y síntomas de la enfermedad iguales a los existentes al inicio de la consulta o reducción de la extensión de las lesiones en menos del 70%). Cada patología en particular evolucionó con la misma tendencia hacia la RC o RP. Este resultado podría atribuirse al efecto anti‐inflamatorio de la crema Vimang®. Las atopias y el eczema, como reacciones de hipersensibilidad, tuvieron una tendencia hacia la RC en no más de tres meses y sólo pocos casos evolucionaron hacia la cronicidad. En este estudio, también se siguieron 35 pacientes con dermatitis atópica, de los cuales 22 tuvieron ®
RP, 10 RC y 3 NR con el empleo de la crema Vimang . Además, de los 21 pacientes con psoriasis 15 evolucionaron hacia una RP y de 10 pacientes con eczema, cinco evolucionaron hacia la RC. De modo general, el 59,1% de los pacientes con patologías dermatológicas de etiología inmunológica evolucionó hacia la RP, el 30,3% evolucionó hacia la RC y el 10,5% NR, lo cual se corresponde con las tendencias publicadas acerca de la evolución de estas patologías con el uso de esteroides. Existe, por tanto, la posibilidad de reducir o evitar el empleo de corticoesteroides en estas patologías, con un efecto económico y social muy beneficioso, por los efectos colaterales de este tipo de medicamentos. Por otra parte, en 27 pacientes con acné juvenil, 17 presentaron RP y 7 RC, para un 100% de mejoría en plazos de tratamiento que oscilaron entre los 25 y 60 días. De los 10 pacientes con piodermitis, cinco evolucionaron hacia RP y cuatro hacia RC, para un 90% de mejoría en esta patología. Todos los pacientes con Herpes simplex y Herpes zoster remitieron parcial o totalmente la enfermedad. Esto corrobora resultados anteriores en los que se demostró in vitro (Carballo et al., 2002), la actividad anti‐viral del ECAM frente al Herpes simplex tipo 1 (HSV‐1), no así para el tipo 2 (HSV‐2), así como la evolución satisfactoria registrada en un reporte de caso de una paciente con Herpes zoster (Álvarez et al., 2002). En general, de 49 pacientes con afecciones de origen bacteriano o viral, el 63,3% evolucionó hacia RP y el 30,6% hacia RC, lo cual resultó elevado de forma significativa. En los trastornos de la pigmentación, las arrugas y las quemaduras se observó una evolución favorable hacia la RP o RC de las lesiones hipercrómicas e hipocrómicas (incluyendo el cloasma), en las que el origen es muy diverso y no existe medicación específica. En el caso de las arrugas, de 18 casos tratados, 15 tuvieron RP y 3 RC. De los 345 casos comprendidos en este estudio el 52,5% evolucionó hacia la RP, el 39,7% hacia la RC y el 7,8% NR. Los efectos adversos por la utilización de la crema fueron escasos y fundamentalmente se manifestaron en piel dañada. Los autores consideraron importante señalar que la terapéutica anti‐inflamatoria y antioxidante es inespecífica de estas patologías y puede accionar de modo facilitador sobre su evolución, por lo que los resultados expuestos deben ser interpretados en el sentido de confirmar el importante sustrato inflamatorio y de estrés oxidativo que puede existir en cualquier afección dermatológica o no, con independencia de su etiología. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 79 Reporte y serie de casos en el tratamiento del dolor Hay algunas evidencias que involucran a TNFα en la sensibilización central (Garrido‐Suárez et al., 2010). Las concentraciones de esta citocina pro‐inflamatoria aumentan exponencialmente después de una lesión del nervio y su aplicación intra‐ciática en ratas produce descargas ectópicas en fibras C y Aβ, además, anticuerpos neutralizantes anti‐TNFα o inhibidores de la síntesis de TNFα alivian el dolor neuropático en la lesión de constricción crónica y modelos de ligadura del nervio siático (Zelenka et al., 2005). Por otra parte, los ensayos clínicos han comenzado a demostrar que la inhibición de TNF alivia algunos tipos de dolor neuropático (Rajkumar et al., 2003). TNFα promueve la síntesis de la sustancia P (SP), la adenosina, péptidos relacionados con genes de la calcitonina y el factor de crecimiento nervioso (NGF), así como, modula genes implicados en la expresión de otras citocinas (IL‐1, IL‐2, IL ‐
6, IL‐8 e IFNγ) e induce su síntesis. También, IL‐1β puede contribuir indirectamente al estado excitotóxico, a través de la liberación de NO, ERO, eicosanoides y glutamato. Del mismo modo, se ha reconocido que las ERO, el TNFα y la IL‐
1 pueden inducir daño por inhibir la capacidad de las células gliales para eliminar el glutamato de la hendidura sináptica (De Leo, et al., 2006). Por tanto, las acciones del ECAM y la MF sobre la expresión de TNFα e IL‐1β, previamente demostradas (Garrido et al., 2004b; Leiro et al., 2004a,b), podrían explicar el efecto antialodínico y la disminución de la frecuencia de dolor paroxístico en estudios experimentales (Álvarez et al., 2002; Garrido‐
Suárez et al., 2009). TNFα induce la potenciación a largo plazo de fibras C en el cuerno dorsal espinal en ratas con daño de nervio y los inhibidores de NF‐κB bloquean este efecto (Lin et al., 2007). NF‐κB es expresado constitutivamente en el cerebro; sin embargo, su expresión se incrementa después de una lesión de la médula espinal y puede activarse por diferentes estímulos como citocinas proinflamatorias, NGF, PKC y glutamato. También, NF‐κB regula la expresión de varias proteínas involucradas en la nocicepción y la plasticidad neural tales como citocinas proinflamatorias, quimiocinas, iNOS, COX‐2 y pro‐dinorfina (Romano et al., 2006). La dinorfina podría modular la función immune de la microglia y el astrocito, así como interactuar con el receptos de NMDA en neuronas y producir alodinia (Laughlin et al., 2000). El NF‐κB es también un elemento clave en la regulación de los procesos inflamatorios de células gliales reactivas, su inhibición transgénica atenúa el dolor y la inflamación después del daño nervioso periferal (Fu et al., 2010). Por tanto, los efectos inhibitorios del ECAM, sobre la activación del NF‐κB inducida por TNF (Garrido et al., 2005), podría sugerir un efecto antialodínico del extracto. Además, las ERO también están involucradas en la sensibilización central y se ha supuesto que las concentraciones elevadas de ellas desempeñan un papel importante en la fosforilación de la subunidad 1 del receptor NMDA (pNR1), a través de la activación de PKC y PKA en la médula espinal (Kim et al., 2006; Gao et al., 2007). Todos estos antecedentes, unidos a las actividades farmacológicas demostradas para el ECAM y MF podrían inferir una actividad analgésica importante en ensayos clínicos (Garrido‐Suárez et a., 2010). Para ello, se estudió el caso de una paciente con diagnóstico de Síndrome Doloroso Regional Complejo (SDRC) tipo II, secundario a una lesión del plexo braquial, con sección del nervio radial a nivel humeral que fue provocada por el desplazamiento de la fractura del húmero izquierdo (Garrido‐Suárez et al., 2007). Al acudir a la consulta, la paciente presentaba cuatro meses de evolución, con síntomas sensoriales, dolor persistente quemante y paroxístico, alodinia mecánica, edema, cambios vasomotores hacia la hiperhemia y mano en flexión por pérdida de la función motora de los músculos extensores del antebrazo, con el compromiso de la articulación del carpo y hombro de limitación severa y dolor de valor 5 en una escala numérica de Likert. El estudio de conducción nerviosa mostró alteraciones mielínico‐axonales discretas del nervio mediano y mielínico‐axonales severas del nervio radial. Se instauró el tratamiento con Vimang® (2 tabletas de 300 mg, cada 8 h y aplicación local de crema 1,2%, 3 veces al día) por 4 meses, asociado a los bloqueos simpáticos y somáticos para miembro superior y a la fisioterapia. La evolución clínica y electrofisiológica fue muy favorable. Mediante el seguimiento post‐tratamiento, a los dos meses del alta, después de concluir las 10 sesiones de bloqueos y el tratamiento sistémico con Vimang, no se observó edema ni cambios de coloración en la zona dañada, mejoró el trofismo de la piel, se conservó la flexo‐extensión de los dedos y la flexo‐extensión del carpo fue limitada pero posible. Por otra parte, se determinó la actividad analgésica de la suplementación con formulaciones Vimang® en 15 pacientes con SDRC y la posible mejoría de la capacidad funcional postratamiento (Garrido‐Suárez et al., 2009). Para ello, los pacientes recibieron Vimang® tabletas (1 800 mg, dos tabletas de 300 mg, tres veces al día, antes de las comidas), crema (1,2% en el miembro afectado 3 veces/día) y un bloqueo simpático semanal durante 4 meses. Se introdujo la fisioterapia al mes de tratamiento. Las variables evaluadas fueron las puntuaciones diarias medias de dolor (PDMD) mediante una escala de Likert, el área e intensidad de la alodinia mecánica dinámica, la alodinia al frío, somática profunda y la frecuencia del dolor paroxístico. En los 15 pacientes las PDMD y el resto de las alteraciones sensoriales se redujeron significativamente Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 80 desde la semana 2‐3 de comenzado el tratamiento con respecto a los valores iniciales. La funcionalidad del miembro afectado, medida por la escala de Ennenking et al. modificada, aumentó desde 22,7 a 78,7%. Por otra parte, se realizó un estudio de reporte de casos en el que se determinó el efecto de las formulaciones Vimang® en pacientes con Herpes zoster (Garrido‐Suárez, et al., 2011a). Los pacientes (n=12) recibieron tabletas recubiertas (1 800 mg, dos tabletas de 300 mg, tres veces al día, antes de las comidas, por 30 días) asociadas con bajas dosis de amitriptilina (10‐25 mg/d) y fueron controladas las dosis de rescate del analgésico utilizado (dipirona). Además de las tabletas, ellos utilizaron compresas que contenían una dilución al 2% de Vimang® en las lesiones de la piel. Fueron determinadas las PDMD mediante la escala de Likert y también fueron determinadas las variaciones en las dosis diarias de los fármacos usados concomitantemente. El efecto analgésico fue observado desde la primera semana en relación con los parámetros iniciales y ninguno mostró neuralgia post‐
herpética. También hubo una disminución significativa en la reducción de la medicación antidepresiva y la dosis de rescate analgésica con respecto a las dosis diarias iniciales. No fueron reportados eventos adversos. En otro estudio de serie de casos (Garrido‐Suárez et al., 2011b) fueron analizados los efectos de tabletas Vimang® (1 800 mg, dos tabletas de 300 mg, tres veces al día, antes de las comidas, por 120 días) en 12 pacientes con dolor asociado a zoster (seis con neuralgia herpética subaguda y seis con neuralgia post‐herpética). La terapia complementaria consistió en bajas dosis de amitriptilina (10‐25 mg/día) y crema Vimang® 1,2% aplicada tópicamente. En este estudio se registraron las PDMD a través de la escala de Likert, el área y la intensidad de la alodinia, la intensidad de la alodinia térmica y la frecuencia de ardor espontáneo. Las puntuaciones de dolor y alteraciones sensoriales disminuyeron significativamente desde la cuarta semana, con respecto a los datos iniciales. Tampoco se reportaron eventos adversos. Los autores manifestaron que los resultados obtenidos, tanto en el reporte como en la serie de casos, sugieren que la suplementación con Vimang® sería beneficiosa para prevenir y tratar el dolor neuropático, aunque resulta necesaria la realización de un ensayo clínico controlado para aceptar esta hipótesis. En otro reporte de casos se estudió la actividad analgésica de las tabletas y crema Vimang® en pacientes portadores de osteoartritis (OA) de rodilla y la posible mejoría de la capacidad funcional postratamiento (Valverde et al., 2009). Para ello, se estudiaron 10 pacientes con diagnóstico clínico de imagen de OA de rodilla. La semana previa al inicio del tratamiento sus PDMD eran mayores de 4, según una escala de Likert de 11 puntos. Se aplicó el índice de capacidad funcional de WOMAC (The Westerm Ontario and Mc Master Universities Osteoarthritis Index) en la consulta inicial y al concluir el estudio. Los pacientes fueron asignados aleatoriamente a tres grupos (grupo Vimang® tabletas 900 mg/día [n = 4], grupo Vimang® tabletas 1 800 mg/día [n = 3] y grupo Vimang® tabletas 900 mg/día + crema Vimang 1,2% [n = 3]). La administración de las tabletas se repartió en tres tomas cada 8 h y la crema se aplicó tres veces al día con el mismo intervalo en la rodilla afectada durante tres meses. Todos los pacientes mostraron analgesia satisfactoria a partir de los 15‐21 días hasta los tres meses. Este efecto se relacionó, al menos en parte, con la disminución de la efusión sinovial que se observó en la mayoría de las articulaciones afectadas, pero fue independiente de la disminución del grosor de la sinovial constatada por ultrasonografía. Se observaron ambos efectos, promoción e inhibición de la proliferación sinovial, independientemente de la analgesia. La inhibición de la proliferación de la membrana sinovial con respecto a los valores iniciales sólo fue significativa en el grupo Vimang 900. Los 10 pacientes mejoraron su calidad de vida en relación con el alivio del dolor y el aumento de la capacidad funcional según el índice de WOMAC. De la misma manera que en los reportes o serie de casos anteriores resulta necesaria la realización de ensayos clínicos controlados para confirmar los hallazgos descritos en esas publicaciones. CONCLUSIONES La presencia de una mezcla determinada de polifenoles, terpenoides, ácidos grasos y microelementos, unido a un proceso de estandarización del extracto acuoso de la corteza del árbol de mango (ECAM) le otorgan a este ingrediente farmacéutico activo de las formulaciones Vimang® un importante perfil antioxidante, anti‐
inflamatorio, inmunomodulador y analgésico manifestado en una inhibición de la peroxidación lipídica y una protección al daño oxidativo de la cadena de ADN mediante el mecanismo de secuestro de ERO, probablemente a través de la acción de flavonoides y otros polifenoles. También a través de la disminución de la acumulación de Fe2+ mediante la reacción de acomplejamiento con la mangiferina (MF), lo que puede ejercer un mecanismo preventivo de protección a diferentes órganos. El ECAM protege a la mitocondria celular mediante la acción sobre diversos sistemas enzimáticos, en los que pueden estar involucrados diversos componentes químicos del ECAM que impiden o disminuyen la formación de ERO. Desde el punto de vista de la actividad sobre el sistema inmune, el ECAM inhibe la producción de moléculas pro‐
inflamatorias, tales como NO, PGE2 y LTB4; enzimas involucradas en este proceso, tales como la PLA2, la iNOS y Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 81 la COX‐2 y la expresión de moléculas de adhesión como la ICAM‐1 e incrementa TGFβ. Todo ello vinculado con su efecto modulador sobre la inhibición de importantes funciones como la quimiotaxis; la expresión de las citocinas TNFα y sus receptores TNF R‐1 y R‐2, GM‐CSF e IL‐1β mediante la inhibición de la transcripción de los genes que las codifican, la inhibición de la producción de isotipos específicos de inmunoglobulinas, como la IgG2a y la IgG2b sin afectar la producción de IgM; la inhibición de la proliferación celular mediada por el receptor de IL‐2 en células T, a través de la inhibición de la expresión del marcador de activación CD25 en la superficie de células T primarias; y la inhibición de las vías de señalización intracelular mediadas por NF‐κB en linfocitos T y en macrófagos, lo que conduce a la inhibición de la producción de mediadores moleculares que participan en los procesos inmunológicos, nociceptivos e inflamatorios. El ECAM inhibió la muerte celular inducida por activación (AICD) en células T primarias mediante la disminución de las concentraciones de ERO y Ca2+ inducidas por la activación del receptor de la célula T, la inhibición de la fosforilación de la cinasa de c‐Jun (JNK) que participa en la activación del factor transcripcional AP‐1, la disminución de la expresión del factor transcripcional NF‐κB y la disminución de la expresión del ligando de muerte CD95L. Estos resultados demuestran que el ECAM puede contribuir a prolongar la sobrevivencia de poblaciones de linfocitos T, lo que fundamenta la utilización de las ®
formulaciones Vimang en el tratamiento de patologías en las que el fenómeno de la AICD este incrementado, como es el caso de la inmunodeficiencia asociada al VIH. La actividad analgésica del ECAM quedó manifestada por la inhibición de la fase II de la prueba de la formalina al 1%, lo que sugiere que el ECAM pudiera actuar sobre el proceso de sensibilización periférica, específicamente sobre el componente capsaicina‐sensitivo‐neurogénico; la disminución de la concentración de glutamato y el aumento del número de neuronas viables en un modelo de muerte neuronal excitotóxica inducida por NMDA, lo que sugiere que el ECAM pudiera inhibir la vía postsináptica glutamato‐receptor NMDA‐NO‐GMPc implicada en el proceso de sensibilización central que subyace en los estados dolorosos crónicos. El efecto antialérgico del ECAM también fue evidenciado mediante la reducción de la producción de IgE, la inhibición de la desgranulación de las células mastocitarias, la reducción de la permeabilidad vascular inducida por histamina, así como la liberación de histamina de células mastocitarias, la reducción de la respuesta proliferativa linfocitaria antígeno‐específica y la inhibición de IL‐4 e IL‐5 en un modelo de asma alérgica. Las evidencias clínicas con el uso de formulaciones ®
Vimang , en ensayos clínicos a doble ciego, en estudios pilotos como en series o reportes de casos han demostrado que existe una correlación significativa entre la disminución de los marcadores del estrés oxidativo y de la inflamación, el alivio de los síntomas clínicos, la recuperación de marcadores hemoquímicos y la mejoría de la calidad de vida en varias enfermedades crónicas, así como en la atención al Adulto Mayor. Los resultados de los estudios toxicológicos pre‐clínicos y la ausencia de eventos adversos significativos en los estudios clínicos han demostrado que se trata de un producto que no presenta efectos tóxicos, mutagénicos, genotóxicos, ni teratogénicos en las condiciones experimentales a que ha sido sometido. Resulta necesaria la realización de ensayos clínicos controlados en patologías que transitan por un componente de estrés oxidativo, inflamación o dolor para asegurar la eficacia de las formulaciones que contengan como ingrediente farmacéutico activo al ECAM. BIBLIOGRAFÍA: Abdalla A.E.M., Darwish S.M., Ayad E.H.E., El‐Hamahmy R.M. (2007) Egyptian mango by‐product 2: Antioxidant and antimicrobial activities of extract and oil from mango seed kernel. Food Chem. 103, 1141–
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Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires. Director de posgrado de los cursos de Fitofármacos y Nutracéuticos, Fitodermatología 2
y Alimentos Funcionales y Nutracéuticos. Prof. Adjunto Cátedra de Farmacognosia y Fitofarmacia de la Univ. Maimónides (Argentina). 3
Presidente de la Sociedad Latinoamericana de Fitomedicina. RESUMEN ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Los nutracéuticos conforman un grupo heterogéno de alimentos, que más allá de cumplir con su rol meramente nutricional, se proclaman como poseedores de un efecto beneficioso para la salud humana. Entre estos alimentos, destaca el maqui (Aristotelia chilensis), cuyos frutos han demostrado poseer una importante variedad de efectos biológicos: analgésicos, antiinflamatorios y antioxidantes principalmente, que lo posicionan como abordaje complementario de procesos crónicos. Su alto contenido en antocianidinas y la presencia importante de derivados poliglicosados polares, hacen de los frutos de A. chilensis un interesante recurso para la elaboración de extractos antioxidantes para ser empleados en alimentos y nutracéuticos. Al momento el mercado norteamericano de suplementos dietarios y nutracéuticos cuenta con varios productos en base a extractos de maqui. Palabras claves: nutracéuticos, maqui, Aristotelia chilensis, antioxidante, polifenoles. Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ INTRODUCCIÓN Los nutracéuticos conforman un grupo heterogéneo de alimentos, que más allá de cumplir con funciones nutricionales y energéticas, poseen cualidades benéficas para la prevención de muchas dolencias (especialmente crónicas) así como para el abordaje complementario de las mismas. Un nutracéutico (término acuñado en 1989 por el Dr. Stephen De Felice, Presidente de la Fundación para la Innovación en Medicina, de los EE.UU) se diferencia de un alimento funcional, fundamentalmente en su presentación y forma de suministro hacia el paciente. En ese sentido, el nutracéutico tiene forma de presentación farmacéutica (cápsulas, comprimidos, etc), en tanto el alimento funcional conserva su forma de “alimento”, y puede ser adicionado o enriquecido con diferentes sustancias que realzan sus propiedades biológicas (por ej. yogures con lactobacilos, pan con mayor tenor de fibras, etc). Otros ejemplos los constituyen las uvas rojas (a través de la presencia de resveratrol, un gran antioxidante), la cáscara de la semilla del plantago o psyllum (para reducir hipercolesterolemia y generar menor incidencia de cáncer de colon), el brócoli (por medio del indol‐3‐carbinol, un compuesto con propiedades antitumorales), la soja (a través de sus isoflavonas en el abordaje de trastornos climatéricos), las semillas de chía y lino así como los pescados de mar frío (por su riqueza en aceites Omega‐3), el tomate (por su riqueza en licopeno, otro gran 1
antioxidante), etc . En los últimos años han cobrado mucha vigencia los denominados berries, que conforman un grupo de frutos de color rojo, violáceo, morado, con alto contenido de polifenoles en su interior. Entre ellos destacan los arándanos, el grosellero negro, las frambuesas, las uvas, la murta y en el caso que nos ocupa en este artículo: el maqui. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Correspondencia a: Dr. Jorge R. Alonso. Sociedad Latinoamericana de Fitomedicina. Correo electrónico: fitomedic@gmail.com Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 91 CONSIDERACIONES BOTÁNICAS Y TAXONÓMICAS Reino: Plantae Clasificación: Angiospermas Orden: Oxalidales Familia: Elaeocarpaceae. Género: Aristotelia Especie: chilensis Nombre Científico: Aristotelia chilensis (Molina) Stuntz. Sinonimias: A. glandulosa Ruiz et Pavón, A. glabra Miers, A. macqui L’Her. Nombres populares: maqui, maquei, queldrón, queldón, clon, coclón, koelon (Argentina, Chile), maki (Mapuche), Chilean blackberry (inglés). DESCRIPCIÓN BOTÁNICA Se trata de un arbusto dioico, perennifolio de tronco dividido, que alcanza hasta 4 a 5 metros de altura. Contiene tallos rojizos, con ramas delgadas y flexibles. La corteza es lisa, blanda, siendo fácilmente desprendible. Las hojas son pecioladas, aovado‐lanceoladas, perennes, midiendo entre 4 a 9 cm, con bordes dentados y dispuestas en cruz con respecto al resto de las hojas del tallo. Las flores son pequeñas, blanquecinas, de cinco pétalos, con numerosos estambres, estériles en el caso de pies femeninos, y están siempre reunidas en inflorescencias axilares. Pueden ser hermafroditas o unisexuales (uno de los sexos atrofiado). Sus frutos son bayas pequeñas de 5 mm, de color negro brillante o azuladas, que contienen de 2 a 4 semillas. 2‐3
Florece de noviembre a diciembre y fructifica en verano . Fotografia del Maqui Chileno (Aristotelia chilensis). http://en.wikipedia.org/wiki/File:Maqui_chileno.jpg HÁBITAT – DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Las Eleocarpáceas conforman una familia botánica compuesta de 10 géneros y alrededor de 400 especies, distribuidas en las regiones tropicales y templadas del mundo (salvo el continente africano). El maqui es común hallarle en los parques nacionales Lanín, Nahuel Huapi y Los Alerces (Argentina) así como en los bosques andinos chilenos entre los paralelos 31° y 42°: entre Illapel y Chiloé, tanto en el Valle Central como en 4
ambas cordilleras e Isla Juan Fernández . Crece en terrenos alterados, en general con buena exposición a la luz, siendo una especie importante en el control de la erosión. Se desarrolla como especie secundaria, preferentemente en suelos húmedos, quebradas, faldas de los cerros o márgenes de bosques 3. Suele ser de las primeras especies que invaden terrenos quemados o abandonados. Los bosques de maqui son denominados “macales”, siendo de crecimiento muy rápido en 4.
condiciones de humedad apropiadas HISTORIA En época de la conquista, Alonso de Ovalle (1946) relataba “sus hojas sirven en extremo contra quemaduras y otros accidentes que nacen del calor”. Murillo, en 1889, mencionaba el poder antiinflamatorio del jugo de las hojas en afecciones de garganta. Vicuña Mackenna en 1887, reseñaba: “del benéfico maqui se apovechan los aborígenes para las diarreas como un poderoso astringente, y así úsanla todavía las casas grandes de Santiago” 4. A pesar de su fama, el maqui no formó parte de la famosa “Botica de los Jesuitas”. El maqui es considerado uno de los tres árboles sagrados de los Mapuches. Junto al canelo y la laura forman el Rehue, es decir, el “árbol sagrado” de las rogativas. Es también un símbolo de paz o intención pacífica y benévola y es ampliamente usado en la medicina natural indígena. La denominación “maki” en idioma 5
Mapuche significa fruto . AGROTECNOLOGÍA DE CULTIVO No hay datos de cultivo. Su propagación es por medio de semillas. Fueron llevados a cabo estudios de propagación generativa para A. chilensis, siendo la inmersión de la semilla en agua fría durante 48‐72 hs como el mejor 6
método de pretratamiento . PARTE UTILIZADA Se emplean los frutos y su jugo, principalmente. USOS ETNOMEDICINALES En uso interno, se utilizan los frutos como tónico, Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 92 antidiarreico, desinflamante, cicatrizante, diaforético, digestivo, expectorante, diurético y purgante. También puede usarse la infusión (de las hojas principalmente) como gárgaras o buches en inflamación de la mucosa orofaríngea. La etnia Huilliche de Chile ha empleado los frutos de maqui tradicionalmente en forma de compresas externas para el tratamiento de heridas infectadas. También el polvo de las hojas secas quemadas, como cicatriante de heridas. Los frutos e incluso las partes subterráneas, son ingeridos como alimento. Sus bayas dulces y muy jugosas son ingeridas directamente, o usadas para preparar una especie de chicha llamada “tecu”. En Chiloé emplean el fruto mezclado con zarzamora, para combatir el dolor de garganta. También pueden ser empleadas para hacer jugos frescos con azúcar y agua, o usadas secas y molidas. Actualmente la comunidad Mapuche de Neuquén recolecta sus frutos para hacer jaleas caseras. Con las semillas se prepara un tipo de harina 7‐8
artesanal OTROS USOS Se emplea su madera para labores artesanales, la cual es frágil y sonora, sirviendo por ello para fabricar instrumentos musicales. Su jugo puede ser utilizado en la tinción de lanas de color amarronado para tornarlas rojo‐
violáceas, dado su alta concentración de taninos. La corteza, fácilmente desprendible en tiras, se usa como cordel para amarras. Las ramas son muy utilizadas para prender fuego. Con la fermentación de los frutos suelen 4.
elaborar vino COMPOSICIÓN QUÍMICA Alcaloides indólicos: aristona, aristoletina, aristotelinona, aristotelona, aristotelina, aristotelinina, protopina, serratolina, hobartinol, 8‐oxo‐9‐dehido‐hobartina, makonina, 8‐oxo‐9‐dehidromakomakina, 9‐dehidro‐8‐oxo‐
makomakina 9‐10‐11 Flavonoides: quercetina 5,3'‐dimetiléter, friedelina, malvidina, petunidina y ácido ursólico (extracto diclorometano). Quercetina 3‐O‐β‐D‐glucósido y kempferol fueron identificados en el extracto metanólico 3‐12‐13 Otros: ácidos cafeico y ferúlico 13, 3‐HO‐indol (extracto etanólico), cumarinas 14‐15, antocianidinas (3‐glucósidos, 3,5‐diglucósidos, 3‐sambubiósidos y 3‐sambubiósido‐5‐
glucósidos de delfinidina y cianidina). El componente mayoritario entre las antocianidinas resultó ser delfinidin 3‐
sambubiósido‐5‐glucósido con un 34% del total 16‐17. También se ha reportado la presencia de los ácidos gentísico, gálico, sinápico, p–cumárico, hidroxibenzoico, vaníllico, maconina, 8‐oxo‐9‐dehidrohobartina y 8‐oxo‐9‐
dehidromacomaquina. Figura 1. COMPOSICIÓN NUTRICIONAL Cada 100 g de frutos contiene 150 calorías, 0,8 g de proteínas, 0,8 g de fibra cruda, 1,2 g de cenizas, 87 mg de calcio, 44 mg de fósforo, 30,5 mg de hierro y 296 mg de potasio. Contiene también un considerable porcentaje de vitamina C y oligoelementos, destacando la presencia de Br, 18.
Zn, Cl, Co, Cr , Vn, Tn, y Mo Las hojas maduras del maqui solo se diferencian de las jóvenes por su menor contenido de potasio y mayor de sodio. Cabe señalar que los contenidos de magnesio, cloro, calcio, titanio y vanadio no varían entre hojas de plantas de sitios con diferente pluviosidad anual. FARMACODINAMIA – ACTIVIDADES FARMACOLÓGICAS Actividad analgésica y antiinflamatoria: Tanto el extracto diclorometano como el metanólico de los frutos de A. chilensis han demostrado poseer efectos antiinflamatorios muy importantes, evidenciados por vía tópica en el modelo de inflamación en roedores por inducción con TPA (12‐
deoxiforbol‐13‐decanoato) en el orden del 63,9 y 66% respectivamente. También a nivel tópico demostró efectos muy significativos el extracto acuoso de los frutos, en modelos de inflamación inducidos por ácido araquidónico, Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 93 del orden del 56,2%. Aún más potente resultó la actividad antiinflamatoria de los extractos hexánico y diclorometano (89,2% para ambos). La actividad analgésica a nivel tópico fue demostrada por los extractos acuoso, diclorometano, metanólico y por el extracto crudo purificado en alcaloides, en los modelos de analgesia por formalina y tail‐flick (producción de dolor por factor térmico) en ratas 13‐19‐20. Asimismo, estos extractos lograron reducir la producción de óxido nítrico (3,7 – 25,5%) y prostaglandina E2 (9,1 – 89,1%) y la expresión de óxido‐nítrico‐sintasa inducible (9,8 – 61,8%) y ciclooxigenasa‐2 (16,6 – 62%) en macrófagos 21
RAW 264.7 estimulados por lipopolisacáridos . El mecanismo de acción propuesto para la actividad analgésica de los extractos hexánicos, se considera que estaría modulado por receptores serotonérgicos (5‐HT3), adrenérgicos (a‐1), colinérgico‐muscarínicos (ACh‐M) y por la vía L‐arginina/NO (óxido nítrico). En cambio la actividad antinociceptiva del extracto diclorometano estaría modulada por las vías opioide, serotonérgica, adrenérgica y nitridérgica. En el efecto analgésico del extracto metanólico estarían involucrados los sistemas opioide, adrenérgico, colinérgico muscarínico y L‐arginina/NO. Los alcaloides (aristona, aristotelona, aristotelina y aristotelininia) demostraron relajar la musculatura lisa intestinal, explicando sus acciones antiinflamatorias y antiespasmódicas 22. Actividad antioxidante: Los compuestos polifenólicos de los frutos de maqui han demostrado poseer efectos antioxidantes in vitro 23‐24. El jugo demostró sobre células endoteliales humanas, evitar la peroxidación lipídica inducida por cobre. Dicha actividad protectora endotelial sería atributo principalmente del contenido en polifenoles del jugo y su efecto antioxidante frente a situaciones de estrés oxidativo 25. De igual modo la combinación de jugo de limón y jugo de maqui demostró importantes efectos antioxidantes, frente a los radicales DPPH, anión 26
superóxido y oxhidrilo . Se determinó que el jugo concentrado de maqui presenta mayores contenidos de fenoles (12,32 mm Fe/100 g) y mayores capacidades antioxidantes en comparación con los jugos de mora, arándano, cranberry, frambuesa y frutilla (3,10 mm Fe/100 g). Tanto el extracto acuoso como el metanólico de los frutos de maqui demostraron in vitro efectos antioxidantes en los modelos de inhibición de xantina‐oxidasa y DPPH, en el 13
orden del 52.9 y 62.7% respectivamente . Asimismo, el extracto crudo de las hojas y de los frutos mostraron actividad antioxidante, actuando sus polifenoles en la inhibición de la enzima alfa‐glucosidasa, lo cual es importante por el rol que cumple esta enzima en el metabolismo de los carbohidratos, siendo benéfico este 27
efecto para los pacientes diabéticos . El compuesto 3‐HO‐
indol también demostró importantes efectos antioxidantes 15.
Usos cosméticos: El extracto de maqui fue ensayado como conservante microbiano y antioxidante cosmético. En tal sentido, se estudió la estabilidad físicoquímica, sensorial y microbiana en función del tiempo, en diferentes condiciones de almacenamiento. De los productos elaborados, en ninguno se observó desarrollo bacteriano ni fúngico, y se mantuvieron las características físicoquímicas y sensoriales. Por sus propiedades antioxidantes, se posiciona el maqui como un muy buen producto anti age 28
. Otras actividades de interés: Las hojas y tallos demostraron experimentalmente actividad relajante en músculo liso y actividad antibacteriana frente Sarcinia lutea y Staphylococcus aureus. Extractos totales de maqui evidenciaron in vitro actividad inhibitoria en células KB de 29‐30‐31
. Sobre estómago de rata, carcinoma nasofaríngeo diferentes fracciones de extractos de maqui mostraron efectos gastroprotectores 19. En un estudio reciente se evaluó los efectos de un concentrado de A. chilensis sobre la expresión de ciclooxigenasa (COX)‐2, vías de señalización y viabilidad en células de cáncer de colon. El tratamiento de células Caco‐
2 con A. chilensis por 24 horas redujo la expresión de la proteína y mRNA de COX‐2, y disminuyó la actividad luciferasa regulada por NF‐ĸB o NFAT. El tratamiento de células Caco‐2 por 4 horas con A. chilensis redujo transitoriamente los niveles citoplasmáticos de IĸBα, aumentó la fosforilación de ERK1/2 y Akt y la expresión de c‐fos. Asimismo no se afectó la viabilidad celular, en las concentraciones que redujeron la expresión de COX‐2. Estos resultados sugieren un potencial efecto anticancerígeno y antiinflamatorio de A. chilensis 32. Los taninos del fruto le confieren al maqui propiedades astringentes y antidiarreicas. Por su parte, los polifenoles 27
de las hojas evidenciaron efectos antihemolíticos in vitro . La combinación de jugo de limón y jugo de maqui demostró in vitro reducir la actividad de las enzimas acetilcolinesterasa y butilcolinesterasa, siendo el jugo de 26
limón el componente más activo . Un trabajo experimental evaluó el potencial neuroprotector de un extracto elaborado a partir de polifenoles del maqui (MQ) en un modelo de enfermedad de Alzheimer inducido por oligómeros solubles de ß‐amiloide (Aβ). A tal fin se utilizaron cultivos de neuronas de hipocampo de ratas, pudiéndose observar neuroprotección cuando las neuronas eran incubadas con ß‐amiloide (0.5 μM) más extracto de maqui por 24 hs. En el mecanismo de acción se pudo observar una recuperación en la frecuencia de oscilaciones transitorias de los canales de calcio, comparado al grupo control que recibió solo ß‐amiloide (Aβ = 72 ± 3%; Aβ + MQ = 86 ± 2%; n = 5) lo cual se correlacionó con cambios positivos observados en la actividad sináptica espontánea y en la preservación de las ramificaciones dendríticas, siendo la actividad antioxidante del maqui el principal propulsor 33
de estos cambios . Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 94 En cuanto al extracto metanólico de los frutos maduros, el mismo demostró actividad cardioprotectora frente a modelos de isquemia aguda por reperfusión en un estudio realizado in vivo en ratas34. A nivel metabólico, fue evaluado in vitro la capacidad de algunos extractos de maqui para reducir la adipogénesis y la acumulación de lípidos en adipocitos. Al respecto, los extractos fenólicos demostraron inhibir la acumulación lipídica entre 4 y 10,8% en adipocitos maduros y entre 5,9 y 37,9% a través de diferenciación. De ahí se desprende su utilización en productos reductores de peso 35. EFECTOS ADVERSOS Y/O TOXICOLÓGICOS Se ha reportado que los flavonoides presentes en el extracto acuoso de las hojas, en contacto con sangre humana, generan cambios morfológicos, alterando la forma discoidal del eritrocito hacia una forma equinocítica, lo cual se debería a su interacción con fosfolípidos de la 14. membrana CONTRAINDICACIONES No han sido reportadas. STATUS LEGAL La planta se encuentra dentro del listado de especies reconocidas de uso tradicional medicinal humano por el 36
Ministerio de Salud de Chile . En Argentina no se encuentra en el listado positivo de especies de trámite simplificado para registro de medicamento fitoterápico. FORMAS GALÉNICAS Ante la falta de datos de formas galénicas oficinales, se comentarán a continuación algunas formas de preparación de acuerdo con la medicina tradicional. Infusiones: Los frutos utilizados contra la diarrea y disentería se preparan en base a 10 g de frutos frescos en 1 litro de agua hervida. Se deja reposar (tapado) durante 5 minutos y se procede a beber 2 tazas por día durante 3 días. En afecciones de encías, aftas e inflamaciones de amígdalas, anginas y catarros: se colocan 10 g de partes frescas o 5 g de partes secas de la planta (preferentemente flores) en un litro de agua a punto de hervor. Dejar enfriar, filtrar y beber 3 tazas por día durante 1 semana. Para úlceras internas del sistema digestivo, úlceras, gastritis y enteritis se prepara una infusión con 15 g de hojas frescas o secas, a las que se agrega un litro de agua a punto de hervir. Dejar reposar 5 minutos y filtrar. Uso externo: Se trituran 20 g de hojas secas y se aplican directamente sobre las heridas al menos 2 veces al día. La pomada se elabora en base a 30 g de frutos frescos triturados en mortero, a lo cual se agregan 100 g de crema base y 50 g de cera de abeja. Se procede a mezclar todo y calentar a baño María durante 30 minutos a fuego mínimo. Se utiliza en procesos infecciosos dérmicos y cutáneos. BIBLIOGRAFÍA: 1. Alonso J (2007) Tratado de Fitofármacos y Nutracéuticos. Edit. Corpus, Rosario, Argentina. 2. Correa J, Bernal H (1992) Aristotelia chilensis. En: Especies vegetales promisorias de los países del Convenio Andrés Bello. 1ª. Ed. Edit. Guadalupe Ltda. Colombia. Tomo VII. p. 162‐71. 3. Gupta M. (1996). 270 Plantas Medicinales Iberoamericanas. CYTED. Convenio Andrés Bello. Colombia. 4. Hoffmann A, Farga C, Lastra J, Veghazi E (1992). Plantas medicinales de uso común en Chile. Edic. Fundación Claudio Gay. Chile. 5. Alonso J (2012) Curso on line de Medicina Indígena Americana. Sociedad Latinoamericana de Fitomedicina. Módulo 17: Los Mapuches o Araucanos. p. 08. 6. Doll U, Ibarra G, Muñoz M, Vogel H (1999) Propagación generativa de especies chilenas. 3er. Congreso Internacional de Plantas Chilenas. El Canelo de Nos, Chile. 23‐26 de Octubre. Abstract P‐53. 7. Montes M, Wilkomirsky T (1985). Medicina Tradicional Chilena. Edit. Univ. de Concepción, Chile. 8. Fargas C, Lastra J, Hoffmann A (1988) Plantas medicinales de uso común en Chile. Ediciones Paesmi, Chile. 9. Bhakuni D, Silva M, Matun S, Sammes P (1976) Aristoteline and aristotelone, an usual indole alkaloid from A. chilensis. Phytochemistry 15 (4): 574‐5. 10. Bittner M, Silva M, Gopalakrishna E, Watson W, Zabel V, Matlin S, Sammes P (1978) New alkaloids from Aristotelia chilensis. J Chem Soc Chem Commun 2: 79‐80. 11. Céspedes C, Jakupovic J, Tsichritzis F, Silva M (1990) A new quinoline alkaloid from A. chilensis. Phytochemistry 29 (4): 1354‐6. 12. Schreckinger M, Lotton J, Lila M, de Mejia E. (2010). Berries from South America: a comprehensive review on chemistry, health potential, and commercialization. J Med Food 13(2):233‐46. 13. Muñoz O, Christen P, Cretton S, Backhouse N, Torres V, Correa O, Costa E, Miranda H, Delporte C (2011) Chemical study and anti‐inflammatory, analgesic and antioxidant activities of the leaves of Aristotelia chilensis (Mol.) Stuntz, Elaeocarpaceae J Pharm Pharmacol. 63(6):849‐59. Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 95 14. Suwalsky M, Vargas P, Avello M, Villena F, Sotomayor C (2008) Human erythrocytes are affected in vitro by flavonoids of Aristotelia chilensis (Maqui) leaves. Int J Pharm 363(1‐2):85‐90. 26. Gironés Vilaplana A, Valentao P, Moreno D Ferreres F, García Viguera C, Andrade P (2012) New beverages of lemon juice enriched with the exotic berries Maqui, Açaí, and Blackthorn: bioactive components and in vitro biological properties. J. Agric Food Chem 2012 May 29. [Epub ahead of print]. 15. Céspedes C, Alarcón J, Valdez‐Morales M, Paredes‐López O (2009) Antioxidant activity of an unusual 3‐hydroxyindole derivative isolated from fruits of Aristotelia chilensis (Molina) Stuntz. Z Naturforsch C. 64(9‐10):759‐62. 27. Rubilar M, Jara C, Poo Y, Acevedo F, Gutiérrez C, Sineiro J, Shene C (2011) Extracts od maqui (Aristotelia chilensis and Murta (Ugni molinae Turcz.): sources of antioxidant compounds and α‐Glucosidase/α‐
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