CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS “Modulación de la Corriente de Potasio Activada por ACh (IKACh) por el Potencial de Membrana en Células Marcapaso de Corazón de Gato” TÉSIS QUE PARA OBTENER EL TITULO DE MAESTRO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON ESPECIALIDAD EN FARMACOLOGÍA PRESENTA: Q.F.B. José Alberto Rodríguez Paredes DIRECTOR: Dr. Ricardo Antonio Navarro Polanco COASESOR: Dr. Eloy Gerardo Moreno Galindo Colima, Colima, Febrero de 2010. 1 DEDICATORIA A mi mamá Martha, a mi papá José, a mis hermanos Miguel, Nely y Nalleli, al resto de mi familia, especialmente y con mucho cariño a los que radican en E.U.A. y a mis amigos. AGRADECIMIENTOS Agradezco a las personas que me brindaron su ayuda en la realización de este trabajo, que no hubiese sido posible sin su participación. Agradezco al Dr. Eloy Moreno por su cuantiosa ayuda en la parte experimental y su colaboración en la parte del escrito, por todas las buenas ideas que me compartió, por enseñarme la técnica de patchclamp, la preparación de soluciones, la toracotomía bilateral en gato, uso del sistema Langendorff y el uso del software para registrar corrientes y análisis de los datos. Gracias al Dr. Ricardo Navarro por permitirme trabajar en su laboratorio, por toda su ayuda en la realización de este trabajo en la parte de la escritura, su colaboración en la parte experimental y por las cátedras que me impartió todos los días. Gracias al Dr. Arael Arechiga por su ardua colaboración y enseñarme a realizar la disección de aurícula izquierda y NSA de corazón de gato. Especialmente quiero agradecer al Dr. José Antonio Sánchez por permitirme trabajar y utilizar el equipo de disección y el sistema Langendorff montado en su laboratorio. También agradezco a las personas que me ayudaron en el día a día durante el transcurso de las clases y del tiempo en que estuve en el CUIB cursando la maestría. Gracias totales a Daniel, Nayere, Elizabeth, Ana María y Dimas por haber compartido sus conocimientos y por su amistad, ustedes son para mí más que excompañeros de estudios. Además, quiero agradecer al personal del CUIB, a las bibliotecarias Chayito y Lety por su ayuda en la adquisición de libros y artículos científicos y por el excelente trato hacia mi persona, al equipo de secretarias particularmente a Rosy, encargada del posgrado, al personal del bioterio comandados por Don Chucho por la ayuda con los animales. A los sinodales, Dra. Tania Ferrer y Dr. Alejandro Elizalde. Al Dr. Jesús “carnaval” Lara, gracias por su muy valioso aporte, también al CONACyT por la beca de manutención otorgada. Final y muy especialmente quiero agradecer a mi hermana Martha Nalleli por facilitarme la computadora para escribir este trabajo. ÍNDICE Contenido Página DEDICATORIA i AGRADECIMIENTOS ii ÍNDICE iii ÍNDICE DE FIGURAS v RESUMEN vi I. INTRODUCCIÓN 1 El corazón, características mecánicas y fenómeno eléctrico 1 El potencial de acción de NSA 4 Modulación nerviosa del corazón: Sistema nervioso autónomo 8 Regulación simpática de la actividad marcapaso 10 Regulación parasimpática de la actividad marcapaso 11 If: Modulación de los canales-f en la regulación autónoma del NSA Canales KACh y corriente de K+ activada por agonistas muscarínicos (IKACh) en la regulación parasimpática del marcapaso II. ANTECEDENTES 12 Receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) y proteínas G; papel fisiológico Los receptores acoplados a proteínas G son modulados por voltaje III. HIPÓTESIS 14 IV. OBJETIVO GENERAL 18 V. MATERIAL Y MÉTODOS 19 12 14 15 18 Registro en miocitos aislados de nodo senoauricular (NSA) y aurícula izquierda (AI) de corazón de gato. Registros electrofisiológicos de miocitos aislados 19 Sistema de perfusión rápida 21 Curvas concentración-respuesta 21 Análisis estadístico de los datos 22 VI. RESULTADOS Corriente marcapaso 20 23 23 Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por agonistas muscarínicos en miocitos marcapaso cardiacos. Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por agonistas muscarínicos en miocitos de aurícula Densidad de corriente (pA/pF) de cardiomiocitos de NSA y AI 24 27 30 VII. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES 31 VIII. 35 REFERENCIAS ÍNDICE DE FIGURAS Figura Página 1 Sistema de conducción cardiaco 3 2 Componentes del miocardio y su potencial de acción 4 3 Potencial de acción de NSA y corrientes que contribuyen (If, ICa,L, ICa,T, IKr e IKs) 8 4 Modulación directa del canal KACh a través del dímero Gβγ de las proteínas Gi/o por activación del receptor muscarínico M2. 10 5 Registro de la corriente marcapaso, If. 23 6 Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por ACh en miocitos marcapaso de gato 24-25 7 Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por PILO en miocitos marcapaso de gato 26 8 Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por ACh en miocitos auriculares de gato 27-28 9 Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por PILO en miocitos auriculares de gato 29 10 Densidad de corriente en cardiomiocitos marcapaso y auriculares de corazón de gato 30 RESUMEN Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) comprenden una gran familia de proteínas de siete dominios transmembranales que están involucrados en una amplia variedad de procesos fisiológicos y en casi todos los aspectos de la biología cardiovascular. En tiempos recientes se ha mostrado una nueva propiedad de modulación para este tipo de receptores. Su capacidad de percibir el potencial de membrana. En el corazón la automaticidad del nodo senoauricular (NSA) es modulada por el sistema nervioso autónomo a través de GPCRs. La regulación negativa vista como una disminución en la frecuencia de disparo del marcapaso (tono vagal) en NSA es mediada por los receptores muscarínicos colinérgicos del subtipo 2 (M2), los cuales activan una corriente de K+ rectificadora entrante (IKACh) a través de la proteína Gi/o. Recientemente Ben-Chaim y colaboradores (2003) mostraron en un sistema de expresión heterólogo, que el voltaje modifica la afinidad de acetilcolina (ACh) por el receptor M2. Actualmente, en nuestro laboratorio se mostro que en miocitos auriculares aislados el potencial de membrana también modifica la EC50 de ACh (Moreno-Galindo., 2008; Navarro-Polanco et al., 2008). En este trabajo nos propusimos conocer si este fenómeno también ocurre en el sistema responsable de la actividad automática en el corazón, el NSA. Para lo cual registramos IKACh utilizando la técnica de patch-clamp en miocitos aislados de NSA de corazón de gato, utilizando al agonista fisiológico ACh y el agonista parcial pilocarpina (PILO). Al igual que en células auriculares la interacción de ACh y PILO con los receptores M2 de NSA es modulada por el potencial de membrana. Conjuntamente, esta modulación dependiente de voltaje es opuesta; EC50 para ACh es menor a potenciales más positivos mientras para PILO este parámetro es mayor a estos mismos potenciales. Así mismo, nuestros resultados muestran que en presencia de concentraciones fisiológicas de K+ en células nodales, el voltaje transmembrana modula la interacción agonista-receptor de forma similar que en las células auriculares. Sin embargo, la densidad de corriente activada por los agonistas en miocitos marcapaso es significativamente menor que en células auriculares. I. INTRODUCCIÓN El corazón, características mecánicas y fenómeno eléctrico El corazón es una bomba formada de 4 cavidades anatómica y funcionalmente separadas por los tabiques y válvulas aurículo ventriculares (AV). Cada mitad está formada por una aurícula y un ventrículo. Las células que forman el miocardio no son uniformes; se distinguen dos tipos fundamentales de ellas: las que generan tensión y constituyen la mayor parte del tejido cardiaco y las células especializadas en la conducción. Estas células están unidas entre sí por discos intercalares que permiten la comunicación entre ellas (Muñoz-Martínez y García., 1997). El corazón es responsable de bombear la sangre a través de los vasos sanguíneos con una presión (que varía según la fase del ciclo cardiaco) y ritmo constante mediante la contracción (sístole) y relajación (diástole) alternada del tejido que constituye las paredes de las aurículas y los ventrículos conocido como miocardio (James., 2004). Los eventos que conducen a la contracción de esta bomba se deben y son disparados en respuesta a un fenómeno electroquímico responsable de la excitación del miocardio (James., 2004). Este fenómeno excitatorio conocido como potencial de acción se propaga a través de las células cardiacas, adoptando características especificas en cada región del corazón debido a la variedad celular del miocardio (James., 2004; Mangoni y Nargeot., 2008; Dobrev., 2009). La estructura del corazón responsable del disparo de dicha actividad eléctrica es el nodo seno auricular (NSA), el cual es una pequeña región de tejido constituido de células especializadas con actividad automática. En el humano adulto el NSA tiene un área de aproximadamente 15 mm2 con un grosor de 5 mm y se encuentra ubicado en el subepicardio antero-lateral en los dos tercios superiores del surco terminal en la unión de la aurícula derecha (AD), bajo la desembocadura de la vena cava superior. El NSA está delimitado por un tejido en forma de cresta vertical que se encuentra en la pared interior de la AD que yace a la izquierda de la vena cava superior conocido como crista terminalis. El NSA está constituido por miocitos pequeños de 25-30µM de largo y un diámetro menor a 8 µM en promedio (Satoh., 2003). 1 La morfología celular ha sido estudiada en preparaciones aisladas de distintas especies de mamíferos (conejo, cobayo, rata, ratón y otros) y se han clasificado empíricamente en 3 tipos: miocitos de forma de huso, miocitos de forma elongada y miocitos de forma de araña. Bajo microscopia Nomarsky el citoplasma de los miocitos de forma de huso es transparente, con capacitancia de 15 a 30 pF y son pobres en miofilamentos. Los elongados tienen un eje longitudinal más largo y capacitancia entre 35 a 50 pF. Además, los miocitos elongados poseen un citoplasma más oscuro debido a una alta densidad en miofilamentos. Los miocitos en forma de araña tienen un citoplasma ramificado y no se conoce aun la significancia funcional de dicha característica, estas células tienen un potencial diastólico máximo menos negativo en comparación con los otros dos tipos, característica por la que se les denomina los miocitos marcapaso primarios (Mangoni y Nargeot., 2008). La distribución de los diferentes tipos de miocitos varía según la zona del NSA, desde el centro hasta la periferia. De esta forma se considera que los miocitos en forma de araña conforman la parte central del NSA y a medida que se aproxime a la periferia se pueden encontrar los miocitos en forma de huso y elongados, aunque esto no es una regla general ya que han sido encontrados pequeños grupos de miocitos en forma de huso y elongados en la parte central del NSA de ratón (Gernot et al., 2002; Mangoni y Nargeot, 2008). También se han reportado diferencias funcionales entre estos tipos celulares nodales, las células periféricas tienen un potencial diastólico máximo más negativo y un potencial de acción con una fase 0 (despolarización) más rápida lo que repercute en una mayor velocidad de propagación en comparación con las células centrales (Kodama et al., 1999). Conjuntamente al NSA, existen otras dos estructuras en el corazón que también poseen automatismo: el nodo aurículo ventricular (NAV) y las fibras de Purkinje. Estas 3 estructuras trabajan en armonía para brindar las características eléctricas y mecánicas al tejido cardiaco. La frecuencia de disparo intrínseca del NSA es mayor que la del resto de tejidos cardiacos con actividad automática, lo que permite a este tejido comandar la actividad eléctrica del corazón. En ciertas disfunciones que provocan disminución en la frecuencia de disparo del NSA, se generan focos ectópicos en distintas regiones del corazón (Mangoni y Nargeot., 2008). En respuesta a la actividad eléctrica y mecánica se han clasificado 5 propiedades fundamentales de la acción del corazón. 2 El batmotropismo (excitabilidad) describe la capacidad de este órgano para responder al estimulo eléctrico (potencial de acción), el dromotropismo (conductibilidad) se refiere a su capacidad de conducir el potencial de acción, el cronotropismo (automatismo) se define como su capacidad de generar el potencial de acción, el inotropismo (contractilidad) es la capacidad de contracción o sístole y el lusitropismo ó relajación muscular del corazón (el efecto opuesto al inotropismo o diástole). La conducción eléctrica a partir del NSA (Figura 1) se produce a una velocidad de 1 a 1.2 m/s e incluye inicialmente a las paredes auriculares y continua hacia el NAV donde se produce un retardo de 0.10 s debido a su baja velocidad de conducción que es de 0.02 a 0.05 m/s. Este retardo producido por el NAV permite el llenado ventricular después de la contracción auricular antes de iniciar la propagación ventricular vía el sistema de conducción rápida constituido por las ramas derecha e izquierda del haz de His y las fibras de Purkinje y terminando con la excitación en las células de los ventrículos (Schmidt et al., 1987; Barbuti y DiFrancesco., 2008; Mangoni y Nargeot, 2008). Figura 1. Sistema de conducción cardiaco: La línea de color morado indica la ruta de propagación del impulso (potencial de acción), los círculos rojos indican zonas con automatismo. Entre paréntesis se muestra el tiempo (en segundos) en que el impulso es propagado. Las líneas negras alrededor indican la zona de propagación. Iniciando en el NSA el impulso se transmite hacia el NAV en 30 ms aproximadamente. Existe un retraso aproximado de 130 ms en el NAV y en las vías posteriores, tiempo durante el cual la aurícula se contrae completando el llenando los ventrículos. A continuación la propagación del impulso continúa hacia las células de Purkinje y finalmente se transmite hacia las células de la pared ventricular. Modificado de Robbins et al., 2000. 3 El potencial de acción de NSA Los potenciales de acción son diferentes para cada uno de los tipos celulares que conforman el miocardio. Dicho contraste se debe a las diferencias que existen en la expresión de canales iónicos membranales de estos tipos celulares. Para fines prácticos se ha divido el potencial de acción cardiaco en 5 fases (0-4), aunque no todos los potenciales de acción cardiacos las poseen todas (Figura 2). Figura 2. Componentes del miocardio y su potencial de acción: En la parte inferior izquierda se representan las 5 fases de un potencial de acción esquemático no a escala. Las letras en mayúscula señalan los diferentes potenciales de acción en los tejidos del corazón, la barra vertical representa la escala temporal ajustada a 1s y las flechas la ruta de propagación de este impulso eléctrico. A. Potencial de acción de NSA, se dispara en un umbral de ~-40 y se repolariza en 0 mV. Los potenciales de acción espontáneos en miocitos de NSA poseen un potencial diastólico máximo (PDM) que es de -50 a -60 mV, menos negativo que el de los otros tejidos que conforman el miocardio y no cuentan con un potencial de reposo estable. (Satoh., 2003; Dobrev., 2009).B. En aurícula la repolarización ocurre a +30 mV y el potencial de reposo se encuentra a -75mV. C. Potencial de acción de NAV. D. Sistema His-Purkinje. E. Ventrículo. Modificado de Gernot et al., 2002. 4 La fase 0 esta representada por la despolarización que procede al umbral (Figura 3). Esta fase es consecuencia de la apertura de canales de Ca2+ y/o de Na+. La fase 0 en miocitos centrales del NSA se debe fundamentalmente a la apertura de canales de Ca2+ tipo L, cuya subunidad α1 (Cav1.3) es responsable de esta despolarización. En los miocitos nodales periféricos se ha mostrado que además de los canales de Ca2+ tipo L existe una contribución inicialmente pequeña de canales de Na+ para los miocitos más cercanos a la región central, que progresivamente se incrementa hasta ser la corriente dominante en las células nodales ubicadas mas periféricamente (Satoh., 2003; Dobrev., 2009). La fase 1 también conocida como la repolarización rápida ocurre después que los canales de Na+ se han inactivado y la corriente transitoria de K+ (Ito) se activa. Esto se refleja como una repolarización inicial que antecede a la gran meseta característica de los potenciales de acción ventriculares. En algunas especies se ha encontrado que en esta fase puede contribuir una corriente de Cl- dependiente de Ca2+ conocida como Ito2 (Sánchez-Chapula et al., 1994). La fase 1 no está presente en los potenciales de acción de NSA. La fase 2 o de meseta ocurre por una disminución de la conductancia, producto del equilibrio que se genera por la entada de Ca2+ a través de los canales tipo T y las corrientes de K+ con rectificación tardía IKr e IKs. La meseta también está ausente en el potencial de acción de NSA (Satoh., 2003; Dobrev., 2009). La fase 3 es conocida como la fase de repolarización tardía. Esta repolarización que marca el final de la meseta se debe al incremento de la corriente acarreada por los rectificadores tardíos y a la reducción de la corriente entrante resultado de la progresiva inactivación de los canales de Ca2+ tipo L. Adicionalmente, la contribución de una tercera corriente de K+ (IK1) conducida por uno de los miembros de la familia de los rectificadores entrantes (Kir) permiten alcanzar el potencial de reposo que corresponde a la fase 4 del potencial de acción cardiaco. En células nodales IK1 está prácticamente ausente, razón por la cual el potencial diastólico máximo esta desplazado hacia potenciales más positivos respecto a los miocitos ventriculares. En estas células las corrientes repolarizantes más importantes son IKr e IKs. Ito1 por su parte juega un papel importante en la repolarización de las células nodales periféricas pero su participación parece ser menos importante en los miocitos centrales (Mangoni y Nargeot., 2008). 5 Típicamente en las células marcapaso la fase 4 se caracteriza por presentar un proceso despolarizante conocido como despolarización diastólica espontanea (DDE). Dicho proceso despolariza la membrana de estos miocitos hasta alcanzar el umbral, generando el disparo de los potenciales del NSA (Dobrev., 2009). Se sabe que son varios los mecanismos involucrados en la modulación de esta fase y también varios canales iónicos que participan en ella. Los canales de Ca2+ tipo L generan la corriente activada por alto voltaje (ICa,L) que participa en dicha despolarización. Esta corriente se activa en la fase inicial de la DDE aumentando su contribución a medida que se aproxima al potencial umbral, alcanzando su máxima activación en la fase final de la DDE. Se ha encontrado que la actividad de estos canales en las células nodales centrales es mucho más importante que en las células periféricas de NSA, ya que la inhibición de esta corriente por bloqueadores específicos suprime por completo o enlentece la actividad marcapaso en las células centrales y periféricas respectivamente. Otra evidencia de su importancia en la actividad marcapaso se ha obtenido a partir de los ratones knockout para Cav1.3. Estos roedores tienen bradicardia pronunciada y arritmias del NSA. Lo que pone de manifiesto la relevante implicación funcional de este canal en el desarrollo de la actividad marcapaso (Satoh., 2003; Mangoni y Nargeot., 2008). La corriente de Ca2+ tipo T (ICa,T) también presente en las células marcapaso no parece tener un papel tan importante como la corriente de Ca2+ tipo L y su contribución en la fase 4 es controversial. Se ha reportado que inhibidores específicos de esta corriente enlentecen la actividad marcapaso del NSA, sin embargo los ratones knockout para las subunidades Cav3.1 y Cav3.2 formadoras de los canales de Ca2+ tipo T, presentan la respectiva corriente de Ca2+ producto por estos canales y además no muestran alteraciones aparentes en el ECG. Lo que pone de manifiesto que la carencia de estas subunidades no tiene una implicación funcional significativa en la generación y conducción del impulso cardiaco (Mangoni y Nargeot., 2008). Un rasgo distintivo de los miocitos con actividad marcapaso es la expresión del canal HCN (por su descripción en ingles; hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated channels). Los canales HCN generan corrientes activadas por hiperpolarización y son modulados por nucleótidos cíclicos intracelulares como el adenosin monofosfato cíclico (AMPc). Esta corriente fue inicialmente reportada como la corriente chistosa o If (funny) por Brown y colaboradores (1979). 6 Hoy se sabe que la principal subunidad que se expresa en células nodales cardiacas es HCN4, aunque HCN1 y HCN2 también se expresan, lo hacen con muy bajos niveles. La apertura de estos canales sucede en la parte tardía de la DDE (la fase más cercana al PDM), después que se alcanza el umbral de activación de los canales Ca2+ T y L. La contribución de If en la DDE se ha demostrado por distintas aproximaciones experimentales. El bloqueo de esta corriente produce un cambio significativo en la pendiente de la DDE, además los ratones knockout para HCN4 presentan una frecuencia cardiaca lenta y muerte a edad temprana. La presencia de If en las células cardiacas es el criterio más importante para considerarla con actividad marcapaso (Satoh., 2003; Mangoni y Nargeot., 2008). Una última corriente que participa en la modulación de la frecuencia de disparo del potencial de acción durante la fase 4 es la corriente rectificadora entrante activada por ACh (IKACh). La unión de ACh a receptores muscarínicos de la membrana plasmática de las células nodales activa a los canales KACh vía proteínas G del tipo Gi/o. Estos canales se encuentran distribuidos ampliamente en los miocitos del NSA y de las células auriculares. La estimulación vagal disminuye la frecuencia de disparo en el NSA produciendo el característico efecto cronotrópico negativo en el corazón. El sistema nervioso autónomo modula la actividad cardiaca vía la inervación simpática y parasimpática. Esta modulación neural se ejerce modulando canales iónicos vía receptores metabotropicos, If e IKACh son dos de los más importantes efectores que intervienen en esta regulación en las células cardiacas. 7 Figura 3. Potencial de acción de NSA y corrientes que contribuyen (If, ICa,L, ICa,T, IKr e IKs): El potencial de acción de NSA, se encuentra dividido en 3 fases (números rojos 0,3 y 4), la fase 4 es la de despolarización espontanea y es en la que se dispara el potencial de acción, una vez que el potencial de membrana alcanza el umbral entre -40 y -30mV. La fase 0 es la fase de despolarización del potencial de acción y esta seguida de la fase 3 o de repolarización, una vez que la célula está completamente repolarizada alrededor de -60mV, el ciclo se repite espontáneamente. Modificado de Klabunde R.E., 2009 en www.cvphysiology.com. Modulación nerviosa del corazón: Sistema nervioso autónomo El rango de actividad del marcapaso es regulado por el sistema nervioso autónomo, la estimulación β adrenérgica provoca un efecto cronotrópico positivo debido al aumento en la activación de las corrientes iónicas ICaL, If, e IKs Por otro lado la estimulación colinérgica ocasiona la apertura de los canales colinérgicos muscarínicos de K+ (KACh) (Figura 4), causando un efecto cronotrópico negativo. Simultáneamente, dicha activación de los canales KACh reduce ICaL e If (Gernot et al., 2002; Satoh., 2003; Dobrev., 2009). El sistema nervioso autónomo es el mayor determinante extra-cardiaco de la frecuencia y fuerza de contracción cardiaca. El sistema nervioso autónomo simpático incrementa la frecuencia cardiaca, mientras que el sistema nervioso autónomo parasimpático ocasiona lo opuesto (Mangoni y Nargeot., 2008). 8 La parte terminal del sistema nervioso autónomo cardiaco está constituida por el plexo cardiaco intrínseco neuronal que emite proyecciones fibrosas autónomas en abundancia hacia los centros ritmogénicos del corazón (Ardell., 1994). La distribución de las fibras simpáticas y parasimpáticas en el NSA es heterogénea y puede variar de manera ligera, entre individuos o por la edad. La activación simpática y vagal induce un cambio en el sitio donde se lleva a cabo el marcapaso dentro de la estructura del NSA. Comparado con el miocardio auricular el NSA es rico en receptores adrenérgicos y muscarínicos. La densidad de dichos receptores y de los canales iónicos que lo conforman varía regionalmente dentro de su estructura y pueden contribuir al cambio en el marcapaso durante la modulación autónoma. El control in vivo del marcapaso es llevado a cabo por el sistema nervioso autónomo y se basa en la entrada concomitante de las vías simpática y parasimpática, sin embargo, el rango de estas entradas varía según la especie (Mangoni y Nargeot., 2008). En mamíferos la frecuencia cardiaca esta correlacionada con el peso corporal, los mamíferos pequeños tienen un promedio aproximado de 500 latidos/min. Los mamíferos de tamaño medio incluido el humano de 60 a 70 latidos/min (Opthof., 2000). Las dos vías del sistema nervioso autónomo interactúan para generar un equilibrio adaptable, de tal manera que la automaticidad del NSA puede estar bajo el dominio de alguna de las dos. Aunque se ha observado que el efecto del parasimpático se potencia si el NSA se ha estimulado previamente con adrenalina (simpático). A esta interacción simpática - parasimpática se le ha llamado “antagonismo acentuado” (Mangoni y Nargeot, 2008). 9 M2 KACh Figura 4. Modulación directa del canal KACh a través del dímero Gβγ de las proteínas Gi/o por activación del receptor muscarínico M2. Mecanismo de transducción en el que se ven involucrados los GPCRs (receptores muscarínicos de acetilcolina, mAChR) y una proteína G trimérica (i/o), al unirse el ligando (ACh) provoca el intercambio del guanidildifosfato (GDP) por guanidiltrifosfato (GTP) en la subunidad α dejando las subunidades βγ actuar en el sitio de unión de los canales KACh que en repuesta liberan K+ (modificado de Nicholls et al., 2001). Regulación simpática de la actividad marcapaso La activación del receptor β adrenérgico por las catecolaminas produce un efecto cronotrópico positivo. Dichos ligandos fisiológicos aumentan la actividad de los canales iónicos así como la liberación intracelular de Ca2+. Las corrientes propuestas de mayor importancia para el mecanismo del incremento de la frecuencia cardiaca por las catecolaminas son If e ICa,L (DiFrancesco., 1993; Mangoni y Nargeot., 2008). Hasta el presente se han identificado 3 receptores adrenérgicos en mamíferos β1, β2 y β3-AR. En el corazón humano β1 y β2 coexisten, siendo el primero el que predomina en una proporción β1: β2 70% - 30% en aurícula y 80% - 20% en ventrículo, en NSA se conoce también el predomino de β2 sobre β1 (DiFrancesco et al., 1993), mientras que el total de receptores adrenérgicos se encuentran equitativamente distribuidos en la aurícula y el ventrículo. Ambos subtipos, β1 y β2 se encuentran acoplados a la proteína Gs por lo que al activarse elevan los niveles intracelulares de AMPc causando el efecto inotrópico y cronotrópico positivos. 10 En aurícula la estimulación de β1 y β2 provocan incrementos máximos en la fuerza de contracción y frecuencia cardiaca, mientras que en ventrículo solo la estimulación de β1 causa dichos incrementos máximos y la estimulación de β2 incrementos submáximos. Se ha postulado que el efecto de β1 también pudiese promover la apoptosis, además de que también se ha propuesto de que pudiesen ser capaces de activar la vía Gi de manera agonista especifica, ambas hipótesis aun están en discusión (Brodde et al., 1999,2006). Regulación parasimpática de la actividad marcapaso Como señalamos anteriormente, la regulación parasimpática del automatismo cardiaco es mediado por la liberación de ACh de las terminales nerviosas vágales activando a los receptores muscarínicos. Los agonistas colinérgicos inducen un potente efecto cronotrópico negativo sobre la automaticidad cardiaca y la conducción AV in vivo y en preparaciones aisladas. La señalización y los mecanismos iónicos que subyacen a la regulación muscarínica de la frecuencia cardiaca se han estudiado por más de 30 años. Aunque todavía no se establece por completo cuales mecanismos determinan la respuesta de la frecuencia cardiaca (Mangoni y Nargeot., 2008). Un número importante de evidencias soportan la idea de que la forma predominante de los receptores muscarínicos presentes en corazón de varias especies de mamíferos incluyendo al humano es el receptor muscarínico del subtipo 2 (M2) (KREJČÍ et al., 2004). La estimulación de estos receptores provoca los efectos cronotrópico e inotrópico negativos. En aurícula su estimulación causa un efecto cronotrópico negativo y en tejido aislado un efecto inotrópico negativo. En ventrículo el efecto cronotrópico negativo solo puede ser demostrado experimentalmente cuando la fuerza de contracción basal ha aumentado por la aplicación de agentes que aumentan la concentración intracelular de AMPc (Bucchi et al., 2003; Brodde et al., 1999,2006). 11 If: Modulación de los canales-f en la regulación autónoma del NSA Las propiedades de If, descritas hasta ahora, permiten suponer un papel crucial en los mecanismos que subyacen a la modulación de la frecuencia cardiaca. Tanto la estimulación simpática como la parasimpática modulan los niveles de AMPc citoplasmico mediante la activación de los receptores β1 y los muscarínicos M2 respectivamente. La estimulación adrenérgica incrementa los niveles de AMPc a través de las proteínas GS que activan a la adenilato ciclasa resultando ulteriormente, en la producción de AMPc. En cambio la estimulación muscarínica reduce la concentración citoplasmica de AMPc al inhibir la adenilato ciclasa por la activación de una proteína Gi/o. La unión de las moléculas de AMPc al C-terminal de los canales-f incrementa su probabilidad de apertura, lo cual se puede observar en un corrimiento de su curva de activación hacia potenciales positivos. La reducción en la concentración del AMPc da lugar al efecto contrario, un corrimiento hacia potenciales negativos en la curva de activación de los canales-f, reduciendo su probabilidad de apertura. Estos efectos impactan directamente en la pendiente de la DDE en la fase 4 del potencial de acción de NSA, aumentándola o disminuyéndola respectivamente (Barbuti y DiFrancesco., 2008). Canales KACh y corriente de K+ activada por agonistas muscarínicos (IKACh) en la regulación parasimpática del marcapaso Los canales KACh son heterotetrámeros formados con subunidades de la subfamilia Kir 3.0. En los tejidos cardiacos el canal KACh está formado por subunidades Kir 3.1 y 3.4 con en una estequiometria 2:2 (Kubo et al., 2005). Se ha reportado que cada subunidad posee un sitio de unión para las subunidades βγ de la proteína G en los extremos amino y carboxilo terminal del canal. Además, una característica distintiva de estos canales es su mecanismo de rectificación, el cual corresponde a un bloqueo rápido por Mg2+ y poliaminas intracelulares, bloqueo que además es dependiente de voltaje. 12 En los primeros estudios realizados por Hutter y Trautwein (1955) acerca de esta regulación, se observó que la estimulación parasimpática detenía el marcapaso en la vena sinusal de rana y que este efecto era debido al aumento en la conductancia membranal de K+. En células aisladas de NSA de conejo se observó que altas dosis de ACh (1µΜ) producen un desplazamiento en el PDM hacia potenciales mas negativos (hiperpolarización) y eventualmente suprimen la actividad del marcapaso debido a la activación máxima de IKACh, en contraste bajas dosis de ACh (1-10nM) enlentecen la actividad marcapaso al reducir la pendiente en la DDE en ausencia de otros cambios en los parámetros del potencial de acción o del PDM (Shibata et al., 1985). Estudios recientes sobre la importancia de IKACh en la regulación de la frecuencia cardiaca se han obtenido utilizando ratones modificados genéticamente que carecen de los canales Kir3.4 (Kir3.4-/-). Los ratones Kir3.4-/- no poseen de IKACh en la aurícula, además de mostrar una reducción prominente de la regulación autónoma de la frecuencia cardiaca (Wickman et al., 1998). 13 II. ANTECEDENTES Receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) y proteínas G; papel fisiológico Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) o receptores de 7 dominios transmembranales (7TM), constituyen una gran superfamilia de proteínas transductoras de señales que pueden ser activadas por estímulos externos y al hacerlo activan la transducción de señales intracelulares mediante proteínas G (Marinissen, et al., 2001). Los GPCR se encuentran en prácticamente todos los organismos vivos, incluyendo bacterias, levaduras, plantas y animales (King et al., 2003). Los ligandos que se unen y activan estos receptores incluyen compuestos sensibles a la luz, olores, feromonas, hormonas y neurotransmisores, además varían de tamaño desde moléculas pequeñas pasando por péptidos a grandes proteínas. Los GPCR también median señales de algunas enfermedades y son el blanco molecular de alrededor de la mitad de los fármacos actuales (Filmore., 2004). Las proteínas G heterotriméricas forman una familia de proteínas caracterizadas por poseer 3 subunidades (á, â y ã) y por su capacidad para fijar GTP (Guanosín trifosfato) e hidrolizarlo a GDP (Guanosín difosfato) durante su ciclo funcional, a lo cual deben su nombre (Alberts et al., 2002). Existen principalmente dos vías de señalización en las que participan los GPCR: la del AMPc (Adenosín monofosfato cíclico) y la del fosfatidil inositol (PI). Su mecanismo de transducción en el caso de las GPCR y proteínas G heterotriméricas es el siguiente; la unión del ligando a su receptor genera cambios conformacionales que involucran cambios en la posición relativa de las siete á hélices transmembranales, además de cambios en las asas intracelulares. Estos cambios conformacionales que ocurren en los receptores activados impactan a las proteínas G que se encuentran ancladas a la membrana mediante estructuras hidrofóbicas, acopladas a estos en la región intracelular. Dicha interacción receptor-proteína G promueve el intercambio de GDP por GTP en la subunidad Gá. Generalmente se asume que la forma activa Gá-GTP disminuye su afinidad por el dímero Gâã, de tal forma que la proteína G se disocia en Gá-GTP y en el dímero Gâã. Por otro lado, tanto Gá-GTP como Gâã que pueden regular a diversos efectores tales como a la adenilato ciclasa y fosfolipasa C y los canales KACh 14 respectivamente, estos eventos siempre están delimitados a la membrana celular (Bunemmann, et al. 2003). Los receptores acoplados a proteínas G son modulados por voltaje El potencial de reposo a través de las membranas celulares se establece a través de una bicapa lipídica de 3 nm de espesor, por la diferencia del gradiente electroquímico, generando como resultado un campo eléctrico susceptible de influir sobre cualquier elemento cargado en su interior (Hille., 2001). Estudios recientes sobre algunos GPCRs han expuesto que su función es afectada por el voltaje. Evidencias obtenidas en diferentes preparaciones, han mostrado que los receptores 7TM son modulados por el potencial de membrana celular. Los trabajos pioneros acerca de esta propiedad de los GPCRs mostraron que los receptores colinérgicos muscarínicos de células acinares pancreáticas y de musculo liso modulan su actividad en función del potencial de membrana al cual se mantengan (Marty et al., 1989; Ganitkevich e Isenberg., 1993). En este mismo contexto estudios mas recientes han demostrado que los receptores purinergicos (P2Y1), los receptores a tromboxano (A2) y los receptores a serotonina (Martínez-Pinna et al., 2003, 2005), el receptor M1 (Ben-Chaim et al., 2003) y los receptores a glutamato mGlur1a (Ohana et al., 2006) aumentan su actividad cuando se despolariza la preparación. Por otro lado también se ha reportado que la actividad de los receptores M2 (Ben-Chaim et al., 2003) y los receptores mGluR3 (para el transmisor excitatorio glutamato) (Ohana et al., 2006) se reduce con potenciales despolarizantes. Estas evidencias apoyan la idea de la modulación del potencial transmembrana sobre la actividad de los GPCRs. Esta propiedad de “sentir el voltaje” demostrada anteriormente en distintas vías de señalización de distintos GPCRs, implica que esta sensibilidad se pudiese estar dando en alguno de los componentes de la vía (receptor, proteína G u otro elemento de la vía). Algunas proteínas como los canales iónicos activados por voltaje poseen estructuras sensibles a estos cambios en el potencial de membrana. El sensor de voltaje de este tipo de canales lo constituyen varios aminoácidos cargados positiva o negativamente ubicados entre los segmentos transmembrana S1 al S4. Siendo el S4 la región donde se ubica la mayoría de las cargas positivas del sensor. 15 Los cambios en el potencial de membrana inducen movimientos de un sensor de voltaje que a su vez produce los cambios conformacionales que permiten o limitan el flujo iónico en los canales (Jiang et al., 2003). El movimiento de estos residuos cargados (carga asociada a la proteína del canal) genera corrientes capacitivas a las que se han llamado “corrientes de compuerta” (gating currents) y representan el rasgo más distintivo de este tipo de proteínas sensores del potencial de membrana (Armstrong y Bezanilla., 1973). Ben-Chaim y colaboradores (2006) lograron registrar en un sistema de expresión heterólogo corrientes asociadas con movimientos de cargas análogas a las “corrientes de compuerta” de los canales iónicos sensibles a voltaje en el receptor M2. Estas evidencias reportadas en específico por este grupo sugieren que la sensibilidad al voltaje reside en la estructura del receptor y no en su cascada de señalización o vía posterior a la activación del receptor. En nuestro laboratorio encontramos que en miocitos aislados de corazón de mamífero el potencial de membrana modula el efecto de ACh en el proceso de activación de la corriente IKACh. Además, mostramos que esta modulación por voltaje es dependiente de agonista. Colina un agonista muscarínico parcial activa al canal KACh con una dependencia de voltaje opuesta a la reportada para ACh (Moreno-Galindo., 2006). Posteriormente, se mostro que Pilocarpina, otro agonista parcial también posee dependencia de voltaje similar al mostrado por colina (mayor potencia a potenciales más positivos) (Moreno-Galindo., 2008). Interesantemente, esta modulación opuesta del voltaje para varios agonistas también se refleja en los efectos que estos producen sobre el movimiento de carga asociado a la proteína del receptor M2. ACh reduce el movimiento de carga del receptor M2 sugiriendo que el cambio conformacional inducido por este agonista hace más rígido al receptor. Contrariamente, pilocarpina incrementa el movimiento de carga en el receptor lo que supone una conformación con mayor flexibilidad (Navarro-Polanco et al., 2008). Otro grupo ha reportado la modulación dependiente de agonista para otro GPCRs, Sahlholm y colaboradores (2008), mostraron que el receptor a Dopamina humano D2s tiene una dependencia de voltaje específica para Dopamina, Fenetilamina y varios análogos de esta última. 16 El NSA es la estructura encargada de generar el impulso eléctrico (a manera de potenciales de acción) que se propaga por el sistema de conducción del miocardio y que le brindan a su vez las características mecánicas de contracción, es por esto, que el NSA es considerado como el tejido marcapaso en el corazón de mamífero. La función normal de las células del NSA da origen al latido cardiaco, las alteraciones en su función están asociadas a patologías que pueden generar arritmias y síncopes cardiacos. La actividad marcapaso del NSA esta regulada “negativamente” por el sistema nervioso autónomo parasimpático. La liberación de ACh de las terminales nerviosas vágales activan a los receptores muscarínicos. Específicamente a M2 que es el subtipo de receptor muscarínico predominantemente en el NSA de mamífero. A pesar de la relevancia funcional de M2 en la regulación de la actividad nodal, no se han reportado estudios acerca de que la modulación sea dependiente de voltaje y que está a su vez modula la interacción agonista- receptor en este tejido. Por tal razón en este trabajo caracterizamos el efecto modulador del voltaje sobre la interacción agonista-receptor muscarínico en células nodales con actividad marcapaso en corazón de gato. 17 III. HIPÓTESIS El potencial de membrana modula la interacción agonista-receptor muscarínico M2 influyendo en el nivel de activación del canal KACh en miocitos de nodo senoauricular de corazón de mamífero. IV. OBJETIVO GENERAL Estudiar la modulación dependiente de voltaje de la interacción agonistareceptor de la vía de señalización muscarínica (M2-Gi/o-KACh) en cardiomiocitos aislados de nodo seno auricular. OBJETIVOS ESPECIFICOS a) Evaluar la modulación voltaje dependiente de IKACh en cardiomiocitos marcapaso nodales, usando concentraciones fisiológicas de K+, activando la corriente con el agonista fisiológico y el agonista parcial pilocarpina. b) Realizar un estudio comparativo entre las corrientes macroscópicas activadas por los agonistas muscarínicos en células aisladas de nodo senoauricular y de aurícula. 18 V. MATERIAL Y MÉTODOS Registro en miocitos aislados de nodo senoauricular (NSA) y aurícula izquierda (AI) de corazón de gato. Los miocitos cardiacos fueron aislados utilizando el método de perfusión retrógrada tipo Langendorff descrito a continuación: Gatos adultos (hembra o macho, 2 – 3 Kg de peso) fueron heparinizados (1000 U/kg, i.p.) y anestesiados con pentobarbital sódico (35 mg/kg, i.p.). Una vez que el felino se mantuvo en anestesia profunda se le extirpó el corazón mediante una toracotomía bilateral. Inmediatamente después de ser extirpado, el corazón fue colocado en un vaso de precipitados con solución Tyrode (80mL, en mM: NaCl 118, KCl 5.4, MgCl2 1.05, NaHCO3 24, NaH2PO4 0.42, dextrosa 11, CaCl2 1.8, taurina 20, ajustada a pH 7.4 con gas carbógeno; 95% O2 y 5% O2) fría (2 - 6 °C). Una vez colocado en el vaso de precipitados con dicha solución se disecó el corazón y se desechó el pericardio junto con el exceso de tejido adiposo que recubre la aorta. Posteriormente, el corazón fue colgado vía arteria aorta en la punta de una jeringa acoplada al sistema Langendorff. El corazón fue perfundido mediante este sistema con solución Tyrode (37°C) 5-7 min, seguido de solución Tyrode 0 Ca2+ (37°C) por otros 5-7 min. A continuación, se agregaron enzimas para digestión en la misma solución Tyrode 0 Ca2+: primero se agregó colagenasa (0.33 mg/mL, tipo I, Sigma, USA) 4-7 min, después se agregó elastasa (0.044 mg/mL, porcina pancreática, Worthington, USA) 4-6 min y posteriormente se agregó proteasa (0.033 mg/mL, tipo XIV, Sigma, USA) 5-10min. El tiempo total de perfusión enzimática fue de 16 - 20 min. Finalmente, se perfundió por 5 min una solución alta en K+, baja en Na+ y baja en Cl- (para el lavado de las enzimas), nombrada solución medio Kraft-Bruhe a 37°C (KB; en mM: ácido glutámico 80, KCl 40, taurina 20, KH2PO4 10, creatina 0.5, ácido succínico 10, MgSO4 5, dextrosa 10, HEPES-K 10, EGTA-K 0.2, ajustada a pH 7.4 con KOH y burbujeada con O2 100%). En seguida, se descolgó el corazón de la punta de la jeringa del sistema Lagendorff y se colocó en una cámara de disección llena de medio KB. Con el propósito de descubrir la vena cava, se disecaron los ventrículos mediante un corte transversal en el septum auriculoventricular. El NSA fue expuesto mediante un corte transversal sobre la vena cava superior y la vena cava inferior y fue disecado mediante un corte longitudinal sobre el tejido adyacente a la AD y la crista terminalis. 19 La AI fue localizada directamente y disecada con un corte transversal. Los tejidos disecados (NSA y AI) fueron colocados en un vaso de precipitados con medio KB (5 mL, 25 °C) y se dispersaron por agitación mecánica. Los células obtenidas mediante este proceso se mantuvieron en reposo a baja temperatura (2 - 6 °C) por 2 h previas a la experimentación. Registros electrofisiológicos de miocitos aislados Todos los registros fueron llevados a cabo a temperatura ambiente (23-25 °C). Las micropipetas se prepararon a partir de capilares de borosilicato TW150F-6 (WPI Inc., USA) con un estirador P-97 (Sutter Instruments, USA) y una microforja MF-83 (Narishige, Japón) y tuvieron una resistencia de 1.5-3 MΩ cuando eran llenadas con solución intracelular (en mM: L-aspartato 80, KH2PO4 10, MgSO4 1, KCl 40, HEPES 5, BAPTA K+4 5, GTP-Na 0.2 y ATP-Na2 3, pH 7.25 KOH). Las corrientes macroscópicas activadas por la perfusión de los agonistas muscarínicos acetilcolina (ACh) y pilocarpina (PILO) fueron registradas en la configuración de célula completa. Dichos agonistas se disolvieron en solución Ca-Co (en mM: NaCl 136, KCl 4, MgCl2 1, HepesNa 10, CaCl2 0.5, CoCl2 2, y Glucosa 11, pH 7.4) y se aplicaron a través de un sistema de perfusión rápida (descrito más adelante). Las pipetas se colocaron en un sujetador conectado a un preamplificador que estaba montado en un micromanipulador MWO-3 (Narishige, Japón) y a su vez conectado a la entrada de un amplificador Axopatch 200B (Axon Instruments, USA). La capacidad de la membrana y la resistencia en serie fueron compensadas al menos en un 70%. El baño se puso a tierra utilizando un puente agar/KCl. Para el registro de las corrientes se empleó un filtro Bessel pasabajas a 1 kHz. La generación de pulsos y la adquisición y procesamiento de datos fueron realizados utilizando una computadora HP Compaq, conectada a un convertidor A/D (Digidata 1440A, Axon Instruments) y utilizando el programa pClamp (v. 10, Axon Instruments). La frecuencia de adquisición fue de 4 kHz. 20 Sistema de perfusión rápida Las células en la cámara de registros inicialmente fueron bañadas con solución Ca-Co en un flujo establecido por gravedad con un sistema de perfusión convencional a razón de 1mL/min. Una vez realizada la configuración de célula adherida, se activó el sistema de perfusión rápida a través de un sistema multipipetas (SF-77B, Warner Instruments, USA) y se perfundió la célula con solución Ca-Co. Posteriormente ya en la configuración de célula completa, se fijó cada célula a un potencial de mantenimiento (PM) de +20 o -50 mV. La fijación del PM se realizó de manera aleatoria, es decir, para una célula dada primero se experimentó con el PM de +20mV seguido del PM de 50mV y de manera opuesta para la siguiente célula. Entre la fijación de cada PM se dejó reposar la célula por 1-2min a -40mV. Los tiempos de aplicación y lavado del agonista sobre la célula se programaron digitalmente utilizando el programa pClamp (v. 10, Axon Instruments) en la modalidad de Clampex. Curvas concentración- respuesta Se realizaron curvas concentración respuesta (CR) para los dos agonistas muscarínicos probados (ACh y PILO), a los voltajes de -50 y a +20 mV para cada uno. Se utilizó el sistema de perfusión rápida para perfundir concentraciones crecientes del agonista durante el tiempo mínimo requerido para alcanzar la activación máxima de la corriente. Después de cada aplicación de agonista este fue lavado con solución Ca-Co (de 20 a 60s) hasta recuperar la corriente basal. Para construir las curvas CR se midió la activación máxima de la corriente activada por las distintas concentraciones de agonista muscarínico y se dividió entre la corriente activada por la concentración del agonista fisiológico previamente determinada como supramáxima para ambos voltajes (10 µM de ACh) (Navarro-Polanco et al., 2006; Moreno-Galindo., 2008). Los miocitos de NSA se identificaron con la presencia de la corriente marcapaso o If, esta corriente se registró aplicando un pulso hiperpolarizante con duración de 3 segundos a -100mV, partiendo de un potencial de mantenimiento de -35 mV. 21 Análisis estadístico de los datos Las curvas CR se ajustaron a la ecuación de Hill que describe la relación entre la concentración y el efecto, donde la acción de un fármaco se expresa en términos del efecto, E, del agonista, A y de su concentración, [A]. Esta relación entre E y [A] tiene la siguiente forma: Donde Emax es la acción máxima de A, nH es el coeficiente de Hill y [A]50 es la concentración que produce un efecto del 50% de Emax. Para conocer el nivel de significancia de los datos obtenidos con los voltajes de prueba, se ajustaron los datos de cada célula con la ecuación de Hill y se obtuvieron los parámetros EC50, Emáx y n, con los cuales posteriormente se obtuvo la media ± el error para cada parámetro. Para conocer el nivel de significancia de los datos se realizó una prueba estadística t de Student pareada. 22 VI. RESULTADOS Corriente marcapaso Previo al registro de IKACh en cada célula nodal se intento registrar If. Típicamente, If es una corriente entrante de lenta activación que se genera con pulsos hiperpolarizantes. En la figura 5 se muestra un registro representativo de esta corriente donde se puede observar la cinética de activación y desactivación de estos canales en células de NSA. -40mV -35mV -100mV Figura 5. Registro de la corriente marcapaso, If: El registro se realizó en respuesta a un pulso de voltaje a -100mV por 3 s partiendo de un potencial de mantenimiento de -35mV y regresando a un potencial de -40mV para registrar la corriente de cola. Esta corriente es característica de células con actividad marcapaso en corazón de mamíferos como el NSA. 23 Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por agonistas muscarínicos en miocitos marcapaso cardiacos. En la figura 6 se muestran registros representativos de IKACh obtenidos a los potenciales de membrana de -50 mV y +20 mV en un mismo miocito (figura 6A). Para los dos potenciales de membrana la aplicación de concentraciones crecientes de ACh activan corrientes con amplitud progresiva. También, se puede observar que la amplitud relativa de las corrientes, generadas con los pulsos de ACh, es mayor al potencial de membrana negativo (-50 mV) respecto al positivo (+20 mV). Nótese, que los registros obtenidos a -50 mV generan corriente saliente, sin embargo en la figura se muestran invertidos para hacer más clara la comparación a ambos voltajes. Las curvas concentración-respuesta generadas a -50 mV y + 20 mV muestran que el potencial de membrana modifica la potencia de activación significativamente (p < 0.001) (figura 6B). Los valores de EC50 obtenidos a -50 mV y + 20 mV fueron 47±6 nM y 136±28 nM respectivamente (figura 6B). Estos resultados muestran que en células marcapaso del NSA el potencial de membrana modula la activación de IKACh con el agonista fisiológico. A +20mV -50mV 24 B Figura 6. Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por ACh en miocitos marcapaso de gato: A, Registros de corriente representativos a los potenciales de mantenimiento de +20mV y -50mV, indicados en los cuadros de color rojo y negro respectivamente. Las concentraciones de ACh se aplicaron como indican las barras negras horizontales (el tamaño indica el tiempo de activación de IKACh) B, en la curva los símbolos representan la media del grupo y las líneas verticales el error estándar de la media, en círculos negros se muestra el potencial de mantenimiento de -50 mV y más hacia la derecha en círculos rojos el de +20 mV. PILO es un agonista colinérgico muscarínico parcial, es decir; un fármaco que se une al receptor M2 pero que produce respuestas submáximas respecto al agonista fisiológico. Cuando IKACh es activada por concentraciones crecientes del agonista parcial PILO la fracción de corriente generada es mayor para el potencial de membrana positivo que para el negativo (figura 7A). Lo anterior muestra que PILO activa a la corriente con una dependencia de voltaje opuesta a como lo hace ACh. Esta modulación voltaje dependiente de IKACh se ve reflejada en la mayor potencia de activación obtenida en la curva concentración-respuesta a +20 mV (EC50 = 4.5±1 µM) respecto a la obtenida a -50 mV (8.9±0.1 µM) (figura 7B). También, se puede observar que la activación máxima (EMAX) de corriente activada por PILO es modulada por el potencial de membrana. La EMAX obtenida a +20 y -50 mV fue de 0.40± 0 y de 0.27 ± 0 respectivamente. 25 A +20mV -50mV B Figura 7. Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por PILO en miocitos marcapaso de gato: A, Registros de corriente representativos a los potenciales de mantenimiento de -50 mV) y +20 mV, indicados en los cuadros de color rojo y negro respectivamente. En el PM de -50mV se representa IKACh como corriente entrante para fines comparativos, Las concentraciones de PILO y la de ACh se aplicaron como indican las barras negras horizontales (el tamaño indica el tiempo de activación de IKACh) B, en la curva los símbolos representan la media del grupo y las líneas verticales el error estándar, en círculos rojos se muestra el potencial de mantenimiento de +20 mV y más hacia la derecha en cuadros negros el de -50 mV. Este corrimiento de las curvas a dos diferentes voltajes es significativamente diferente, p< 0.05 (*). 26 Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por el agonistas muscarínicos en miocitos de aurícula Anteriormente en nuestro laboratorio se evalúo la modulación voltaje dependiente de la vía del receptor M2 activada por agonistas muscarínicos en miocitos auriculares con una concentración alta de K+ y potenciales de mantenimiento no fisiológicos (Moreno-Galindo., 2008). Aquí de igual forma que en NSA y a manera comparativa, se evalúo la dependencia de voltaje en concentraciones fisiológicas de K+. En la figura 8 se muestran los registros representativos de IKACh activada por ACh en concentraciones crecientes que activan corrientes cada vez mayores. Similarmente a nuestros resultados en NSA (mismas condiciones experimentales) y en los estudios anteriores (Moreno-Galindo., 2008), se encontró que los potenciales negativos favorecen a la generación de corriente por el agonista fisiológico, lo cual se ve reflejado en la amplitud relativa de la corriente que es mayor a -50mV (figura 8A). De igual forma que los resultados preliminares, en la curva CR se observa que el voltaje modifica la potencia de activación significativamente (p< 0.001), lo cual se ve reflejado en la EC50 que fue de 48±12 nM a -50 mV y 116±33 nM a +20 mV (figura 8B). A +20mV -50mV 27 B Figura 8. Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por ACh en miocitos auriculares de gato: A, Registros de corriente representativos a los potenciales de mantenimiento de +20 mV y -50 mV, indicados en los cuadros de color rojo y negro respectivamente. En el PM de -50mV se representa IKACh como corriente entrante para fines comparativos. Las concentraciones de ACh se aplicaron como indican las barras negras horizontales (el tamaño indica el tiempo de activación de IKACh) B, en la curva CR los símbolos representan la media del grupo y las líneas verticales el error estándar de la media, en círculos negros se muestra el potencial de mantenimiento de -50 mV y más hacia la derecha en círculos rojos el de +20 mV. Tras la aplicación de PILO en AI (figura 9), se observa una mayor amplitud relativa de las corrientes generadas al PM de +20mV, lo cual concuerda con los resultados preliminares y aquellos obtenidos en NSA. Similarmente a dichos resultados, PILO en AI con concentraciones fisiológicas de K+, activa IKACh con una dependencia de voltaje opuesta que la mostrada por ACh. La EC50 fue de 9±4 µM a -50 mV y 21±5 µM a +20 mV. Lo que refleja una mayor potencia de activación para a potenciales positivos. La EMAX fue de 0.47 ± 0 para el voltaje negativo y de 0.55 ± 0 para el positivo, indicativo de una activación máxima de la corriente que también es modulada por el voltaje al ser un valor menor para potenciales positivos. 28 A La parte de imagen con el identificador de relación rId28 no se encontró en el archiv o. +20mV -50mV B Figura 9. Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por PILO en miocitos auriculares de gato: A, Registros de corriente representativos a los potenciales de mantenimiento de -50 mV y +20 mV, indicados en los cuadros de color rojo y negro respectivamente. En el PM de -50mV se representa IKACh como corriente entrante para fines comparativos. Las concentraciones de PILO y la de ACh se aplicaron como indican las barras negras horizontales (el tamaño indica el tiempo de activación de IKACh) B, en la curva respuesta, los símbolos representan la media del grupo y las líneas verticales el error estándar, en círculos rojos se muestra el potencial de mantenimiento de +20 mV y más hacia la derecha en cuadros negros el de -50 mV. Este corrimiento de la s curvas es significativamente diferente (p< 0.01**). 29 Densidad de corriente (pA/pF) de cardiomiocitos de NSA y AI. En los resultados obtenidos por la activación de IKACh por agonistas muscarínicos, se puede observar una mayor amplitud relativa de corriente para las células aurículares en comparación con las células del nodo senoauricular. Con el objetivo de obtener un parámetro para hacer la comparación, se obtuvo la densidad de corriente, al dividir la IKACh (pA) que se activo con la concentración supramáxima de ACh (10µM) entre la capacitancia (pF) de cada célula registrada y se construyo un grafico de barras (Figura 10). En el se puede observar que la densidad de corriente es significativamente mayor (p > 0.001) para AI (barras negras) que para NSA (barras rayadas) en el voltaje de -50 mV (figura 10A), de igual forma la densidad de corriente es significativamente mayor (p > 0.001) para AI que para NSA en el P.M. de +20mV (figura 10B) y además, el parámetro es significativamente mayor (p > 0.001) para ambos tejidos en el voltaje positivo comparado con el negativo (figura 10C). La parte de imagen con el identificador de relación rId30 no se encontró en el archiv o. C B A Figura 10. Densidad de corriente en cardiomicitos marcapaso y auriculares de corazón de gato: Densidad de corriente representativa de cada una de las células registradas en los dos tejidos a prueba, la diferencia entre cada tejido y potencial de mantenimiento es significativamente diferente, p > 0.001 (* * *, ###). En el eje vertical se representan las barras con las unidades de densidad de corriente (pA/pF). En el eje horizontal los PM en mV. 30 VII. DISCUCION Y CONCLUSIONES Los resultados en nuestro estudio muestran que en células marcapaso del NSA, el potencial de membrana modula la activación de IKACh con el agonista fisiológico y con el agonista parcial PILO. Sin embargo, en presencia de PILO el potencial de membrana modula opuestamente la activación de la vía de señalización comparada con aquella inducida por ACh. Además nuestros resultados muestran que en células auriculares la dependencia de voltaje y agonista se sigue presentando aun con concentraciones fisiológicas de K+ en la solución extracelular. Finalmente encontramos que la densidad IKACh es significativamente diferente para las células auriculares respecto a la encontrada en células de NSA. Esta diferencia en densidad de corriente también es significativa entre ambos potenciales de membrana probados. El cambio en la potencia inducido por el voltaje y reflejado en el valor de EC50, pueden ser explicado por alteraciones en la afinidad y/o en la eficacia. El incremento de la potencia inducido por la hiperpolarización en presencia de ACh en miocitos del NSA concuerda con evidencias previamente reportadas en sistemas de expresión heterólogos y en células auriculares cardiacas (Ben-Chaim et al., 2003; Moreno-Galindo., 2008). Evidencias adicionales obtenidas con radioligandos mostraron que los cambios en el potencial de membrana modulan la afinidad de ACh por el receptor M2 (Ben-Chaim., 2003). Otros resultados mostraron que la sensibilidad al voltaje radica en al receptor M2 y no en otros elementos de la vía de señalización (proteína G y canal KACh) (Ben-Chaim et al., 2003; Moreno-Galindo., 2008). La evidencia más importante en este sentido fue el registro de corrientes asociadas a la proteína del receptor M2. Estas corrientes son análogas a las “corrientes de compuerta” (corriente de gating) de los canales iónicos sensibles a voltaje y su presencia implica la capacidad de una estructura proteica para sensar los cambios en el potencial de membrana (Ben-Chaim et al., 2006; NavarroPolanco et al., 2008). Los modelos clásicos que explican la activación de los receptores acoplados a proteínas G, proponen que estos receptores existen en equilibrio entre dos estados, un estado de alta afinidad y otro de baja afinidad. Se ha propuesto que la asociación de los receptores con las proteínas G triméricas favorece al estado de alta afinidad y la desunión el de baja afinidad (Ben-Chaim et al., 2006; Parnas y Parnas., 2007). 31 En base a esto se postulo que la despolarización favorece el desacoplamiento entre los receptores M2 y la proteína Gi/o induciendo un estado de baja afinidad mientras que ocurre lo contrario con la hiperpolarización (Moreno-Galindo., 2008). Por lo que en los trabajos además del nuestro, donde se observa una disminución de la potencia para ACh en despolarización, se concluye que; la despolarización induce cambios conformacionales en el receptor que reducen el acople con las proteínas G, lo que promueve el estado de baja afinidad (Navarro-Polanco et al., 2008). No obstante, esta hipótesis no permite explicar nuestros resultados con el agonista parcial PILO. Ya que uno esperaría que la despolarización, al inducir un estado de baja afinidad produjera una disminución en la afinidad de cualesquier agonista por el receptor. PILO por el contrario incrementa la potencia de activación con el voltaje positivo. Una explicación adicional a este fenómeno sugerida por nuestro laboratorio es que el voltaje induce cambios conformacionales que son transmitidos directamente al sitio de unión del agonista en los receptores que favorecen o no la interacción ligandoreceptor, en función de la estructura molecular del agonista. Evidencias recientes muestran que la substitución de varios aminoácidos en el sitio ortoestático del receptor M2, identificados como importantes en la interacción ligando-receptor producen cambios drásticos en la curva carga-voltaje construida a partir de las corrientes asociadas a la proteína del receptor. Además, se ha reportado que ACh reduce el desplazamiento de la carga asociada a la proteína del receptor mientras que PILO la incrementa, lo que sugiere que el voltaje también modula los cambios conformacionales posteriores a la unión del agonista. Esto puede explicar la modulación de la eficacia inducida por el voltaje que observamos en presencia de PILO. Los resultados reportados inicialmente en nuestro laboratorio por MorenoGalindo (2008) fueron obtenidos con una concentración alta de K+ en la solución extracelular (20 mM), al respecto se conoce que las concentraciones catiónicas modulan la actividad de los receptores y de los canales. Nuestros resultados muestran que en miocitos auriculares la dependencia de agonista y voltaje se sigue presentando utilizando concentración fisiológica de K+ (4 mM). Esto sugiere que no es la condición iónica la que establece la dependencia de voltaje sino las características intrínsecas del receptor M2. Bajo estas condiciones experimentales se puede observar que la amplitud de IKACh es claramente de mayor amplitud en los miocitos auriculares respecto a los de NSA. 32 Estas observaciones las corroboramos midiendo la densidad de corriente expresada como pA/pF. Este último resultado sugiere diferencias en la expresión de uno o varios de los componentes que integran esta vía de señalización (M2-Gi/o-KACh). También puede implicar alguna regulación metabólica de alguno de estos componentes que puedan hacer menos sensible esta vía en NSA y que ulteriormente esto se vea reflejado en la disminución de la actividad del canal KACh. Hasta ahora no se tienen evidencias que señalen diferencias en el nivel de expresión de los receptores M2, la proteína Gi/o o las subunidades que forman el canal KACh entre estos dos tejidos. Los pocos reportes que existen al respecto señalan que la expresión de los genes que codifican para el receptor M2 mayor en NSA y aurícula, no así para ventrículo (Gernot et al., 2002). Se conoce que el canal KACh es un heterotetrámero que se compone de las subunidades Kir3.1 y Kir3.4. Referente a esto existen reportes en los que se hace notar una amplia diferencia en la expresión de los genes que codifican para las subunidades de estos canales en las diferentes especies de mamíferos. En NSA de ratón se ha encontrado una baja expresión de la subunidad Kir3.1 (Marionneau et al., 2004), mientras que en NSA de rata, cobayo y hurón se ha encontrado una alta expresión de Kir3.1 (Dobrzynski et al., 2001). En aurícula y NSA de hurón se ha encontrado que la subunidad Kir3.1 esta colocalizada con el receptor M2 (la colocalización es importante debido a que durante la actividad de la vía de dicho receptor es más probable encontrar a estos elementos contiguos). La expresión de Kir3.4 ha sido encontrada abundante en aurícula y en NSA de rata y se desconoce para otras especies (Gernot et al., 2002). Esta evidencia experimental no permite dar una explicación acertada del porque existe una mayor densidad de corriente en AI que en NSA de corazón de gato, se ha reportado que existe una mayor densidad de corriente en aurícula que en ventrículo de rata (McMorn et al., 1993) lo cual puede ser correlacionado con la pobre expresión de ambas subunidades del canal KACh en ventrículo, diferencias que fueron encontradas además, para el corazón de las diferentes especies de mamífero. Pero ante la falta de una evidencia directa de la expresión y colocalización del receptor M2 de las subunidades del canal que relacione una diferencia significativa para corazón de gato, no se puede inferir que la mayor densidad de corriente en AI se debe a una expresión mayor de alguno de los componentes de la vía en estos tejidos. 33 Adicionalmente, una probable explicación de la mayor densidad de corriente encontrada al potencial de +20mV en comparación con el de -50mV, es la mayor contribución de la fuerza electromotriz que opera sobre la corriente registrada al potencial positivo. Dado que el potencial de equilibrio teórico para una conductancia de potasio con las concentraciones internas y externas utilizadas en nuestros experimentos es de ~-90mV. Por lo que el ∆V a -50 mV es de 40 mV mientras este mismo parámetro a +20 mV es de 110 mV, lo cual constituye un poco más del doble entre un potencial de membrana y otro. Finalmente, es importante señalar que esta propiedad de los GPCRs para sensar el voltaje y modular la interacción ligando-receptor puede tener importantes implicaciones funcionales en el tejido rector de la actividad eléctrica cardiaca, mismas que tendrán que dilucidarse en experimentos futuros. Además, esta nueva propiedad también puede tener implicaciones terapéuticas importantes ya que abre una nueva perspectiva en la regulación de la señalización celular dependiente de la estructura molecular de los ligandos. 34 VIII. REFERENCIAS ALBERTS B., JOHNSON A., LEWIS J., RAFF M., ROBERTS K. & WALTER P. (2002). Signaling through G-protein-linked cell-surface receptors. En: Molecular biology of the cell. (4th ed.). USA: Garland Science, 2002, p. 852-853. ARDELL J. L. (1994). Structure and function of mammalian intrinsic cardiac neurons. Oxford Univ. Press, p. 95–114. ARMSTRONG C. M. & BEZANILLA F. (1973). Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. 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