Síntesis de un mimético del antígeno Tn que incorpora flúor Trabajo

TRABAJO FIN DE GRADO
Título
Síntesis de un mimético del antígeno Tn que incorpora
flúor
Autor/es
Miguel Alonso de la Peña
Director/es
Jesús Manuel Peregrina García y Alberto Avenoza Aznar
Facultad
Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Titulación
Grado en Química
Departamento
Curso Académico
2014-2015
Síntesis de un mimético del antígeno Tn que incorpora flúor, trabajo fin de grado
de Miguel Alonso de la Peña, dirigido por Jesús Manuel Peregrina García y Alberto Avenoza
Aznar (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia
Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.
Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los
titulares del copyright.
©
©
El autor
Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2015
publicaciones.unirioja.es
E-mail: publicaciones@unirioja.es
UNIVERSIDAD DE LA RIOJA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
ÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA
Síntesis de un mimético del
antígeno Tn que incorpora flúor
Trabajo Fin de Grado
Miguel Alonso de la Peña
Junio 2015
Tutores:
JESÚS MANUEL PEREGRINA GARCÍA
ALBERTO AVENOZA AZNAR
JESÚS MANUEL PEREGRINA GARCÍA, Catedrático de Química Orgánica del
Departamento de Química de la Universidad de La Rioja y
ALBERTO AVENOZA AZNAR, Catedrático de Química Orgánica
Departamento de Química de la Universidad de La Rioja.
del
HACEN CONSTAR:
Que la memoria "Síntesis de un mimético del antígeno Tn que
incorpora flúor" ha sido realizada por Miguel Alonso de la Peña en el
Departamento de Química de la Universidad de La Rioja, bajo su
inmediata dirección y reúne las condiciones exigidas para conseguir los
15 créditos ECTS correspondientes al período de investigación del
Trabajo fin de Grado.
Logroño, Junio 2015
Fdo.: Jesús Manuel Peregrina García
Fdo.: Alberto Avenoza Aznar
Agradecimientos a:
Universidad de la Rioja por haber financiado mi trabajo en el laboratorio y
Grupo de investigación en Química Biológica por guiarme en el laboratorio
Índice
Abreviaturas
I
1. Resumen
1
2. Introducción y objetivos
4
3. Antecedentes
9
3.1 Efecto anomérico
3.2 Formación de enlaces O-glicosídicos
4. Discusión de resultados
4.1 Síntesis del glicosil aminoácido
4.2 Caracterización del compuesto final
11
17
19
22
29
5. Conclusiones
33
6. Parte Experimental
35
Anexo: Espectros de RMN
59
Abreviaturas
δ
µL
ºC
1
H RMN
13
C RMN
19
F RMN
Ac
Ac2O
Allyl
Boc
COSY
d
dd
DIEA
Fmoc
g
GalNac
h
Hz
HSQC
J
m
mg
min
mL
mmol
m/z
M
MeCN
MUC1
ppm
R
RMN
s
Ser
desplazamiento químico
microlitro
grado Celsius
resonancia magnética nuclear de protón
resonancia magnética nuclear de carbono-13
resonancia magnética nuclear de flúor-19
acetilo
anhídrido trifluoroacético
alilo
terc-butoxicarbonilo
COrrelated SpectroscopY
doblete
doblete de dobletes
diisopropiletilamina
(9H-fluoren-9-il)metil carbamato
gramo
α-O-D-tri-O-acetil-N-trifluoroacetilgalactosaminil
hora
hertz
Heteronuclear Single Quantum Correlation
constante de acoplamiento
multiplete
miligramo
minuto
mililitro
milimol
relación masa/carga
molaridad
acetonitrilo
mucina 1
partes por millón
alquilo, arilo
resonancia magnética nuclear
singlete
serina
I
Abreviaturas
Suc
t
t
Bu
Thr
TFAA
THF
TMS
Succinimida
pseudotriplete, triplete, tiempo
terc-butilo
treonina
anhídrido de ácido trifluoroacético
tetrahidrofurano
tetrametilsilano
II
1.- Resumen
Resumen / Abstract
2
Las mucinas son glicoproteínas que en estos últimos años han protagonizado
gran número de investigaciones debido a su relación con el cáncer, una de las
enfermedades con mayor índice de mortalidad en la actualidad. Las células
cancerosas poseen mucinas modificadas que dejan desprotegidos ciertos
antígenos que pueden ser reconocidos por los anticuerpos del sistema
inmune. La modificación de una mucina llamada mucina 1 (MUC1) presenta en
su estructura el antígeno Tn (N-acetilgalactosamina unido a residuos de
treonina o serina mediante un enlace α-O-glicosídico).
La incorporación del antígeno Tn a epítopos (fragmentos que son reconocidos
por el sistema inmune) de la MUC1, juega un papel relevante en el
reconocimiento por parte de los anticuerpos anti-MUC1. Es por ello que se
está trabajando a nivel mundial sobre la posibilidad de utilizar fragmentos de
la MUC1 como vacuna contra algunos tipos de cáncer así como la detección
precoz de esta enfermedad.
Este trabajo se centra en la síntesis del building block N-Fmoc-Thr(α-OGalN(COCF3))-O-Allyl, un derivado fluorado del antígeno Tn, mediante una
α-O-glicosilación siguiendo una metodología Koenigs-Knorr. Para ello se parte
del aminoácido treonina y el carbohidrato galactosa ambos debidamente
protegidos. Lo novedoso de este glicoaminoácido es la incorporación de
átomos de flúor mediante la formación de una amida del ácido
trifluoroacético. La corroboración de la estructura de la estructura se realizó
mediante diferentes técnicas de Resonancia Magnética Nuclear (RMN).
Este aminoácido será incorporado, fuera del ámbito de este estudio, a un
epítopo de la MUC1. El objetivo es generar una variante estructural que pueda
significar una mayor especificidad ante el reconocimiento de los anticuerpos.
Resumen / Abstract
3
Mucins are glicoproteins which in the last years, have acquired great interest
because researchers have found a relationship with cancer, one of the most
mortal illnesses in our days. Cancer cells have modified mucins that let visible
some antigens which can be recognized by human antibodies. The
modification of mucin 1 (MUC1) exhibit a particular antigen called Tn antigen.
The presence of the Tn antigen have an essential role in the recognition of
MUC1 by anti-MUC1 antibodies. In fact, there are a great interest in the
develop of cáncer vacccines related to MUC1.
This work is focused on the synthesis of the building block N-Fmoc-Thr(α-OGalN(COCF3))-O-Allyl, a mimetic of Tn antigen that incorporates fluor atoms.
The key step is the reaction called Koenigs-Knorr which allows an α-Oglycosylation. The amino acid threonine and peracetylated galactose, both o
them protected, are needed as primary reagents. The novelty of this
procedure is the incorporation of the fluor atoms for formation of a
trifluoroacetic amide. Corroboration of the structure was performed by
different NMR techniques.
Out of scope of this work,the glycoamino acid will be incorporated in a MUC1
epitope with the objective of achieving conformational alterations in the
protein structure. This fact couldimprove the molecular recognition of this
epitope by antibodies.
2.- Introducción y objetivos
Introducción y objetivos
6
Las glicoproteínas están constituidas por una parte protéica (cadena de
aminoácidos) y residuos de carbohidratos. Estos residuos dotan a estas
macromoléculas de una mayor
mayor estabilidad proteica, es decir, las hacen menos
vulnerables a la degradación tanto enzimática como química.
Figura 2.1. Estructura 3D de una glicoproteína del virus del dengue
(www.rcsb.orgpdbexplore-explore.dostructureId=1OAN.web)
El enlace entre ambas partes se llama enlace glicosídico, siendo la unión a
través de un átomo de oxígeno (O-glicosídico) la forma más habitual. Una de
las principales O-glicoproteínas son las denominadas mucinas, responsables de
numerosos procesos biológicos entre los que destacan la respuesta inmune, la
inflamación y la comunicación intercelular.
Dentro de este tipo de glicoproteínas, destaca la mucina humana MUC1. Esta
mucina se encuentra presente en la membrana de numerosas células
epiteliales y posee glicanos de alto peso molecular. Sin embargo, en las
células tumorales la MUC1 se encuentra sobreexpresada y glicosilada de
Introducción y objetivos
7
forma deficiente (mal funcionamiento de las glicosil tranferasas). Este hecho
dota a la célula tumoral de la capacidad de metástasis.
No obstante, la deficiente glicosilación deja expuestos ciertos antígenos
(compuestos que desarrollan respuesta inmune) que en células sanas quedan
enmascarados por los glicanos de alto peso molecular. Uno de ellos es el
antígeno Tn, formado por el carbohidrato GalNAc unido mediante enlace α-Oglicosídico a una serina o una treonina.
Antígenos
enmascarados
Antígenos
expuestos
MUC1
a)
b)
Figura 2.3. a) Antígeno Tn, b) Diferencia de las mucinas en células sanas y
tumorales
Este fenómeno ha generado que las mucinas estén siendo consideradas como
parte de posibles tratamientos contra el cáncer, más en concreto, como serias
candidatas a vacunas contra el cáncer.1
1
a) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112; b) Dziadek, S.; Kunz,
H. The Chem. Rec. 2004, 3, 308-321; c) Danishefsky, S. J.; Allen, J. R. Angew. Chem. Int.
Ed. 2000, 39, 836-863; d) Slovin, S. F.; Ragupathi, G.; Musselli, C.; Olkiewicz, K.; Verbel,
D.; Kuduk, S. D.; Schwarz, J. B.; Sames, D.; Danishefsky, S. J.; Livingston, P. O.; Scher,
H. I. J. Clin. Oncol. 2003, 21, 4292-4298; e) Chen, X.; Lee, G. S.; Zettl, A.; Bertozzi, C. R.
Introducción y objetivos
8
La MUC1 está formada por la repetición de la secuencia de los veinte
aminoácidos que se muestran a continuación:
AHGVTSAPDTRPAPGSTAPP
Esta secuencia de repetición posee cinco puntos donde es posible la
glicosilación (tres Thr y dos Ser) y, con ello, la formación del antígeno Tn.
Además, se pueden realizar pequeñas modificaciones estructurales en el
antígeno para variar las interacciones a nivel atómico. Ya se han realizado
miméticos, por ejemplo, intercambiando el enlace O-glicosídico por un enlace
S-glicosídico.2
El objetivo de este Trabajo de Fin de Grado es la síntesis, purificación y
caracterización de un nuevo análogo del antígeno Tn. La excepcionalidad de
este compuesto es la incorporación de átomos de flúor mediante la formación
de una amida del ácido trifluoroacético en vez de la amida del ácido acético.
Figura 2.3. Derivado del antígeno Tn: -Fmoc-Thr(α-O-GalN(COCF3))-O-Allyl
Lo que se pretende es crear un building block variando ligeramente la
estructura del antígeno Tn. Además, debe incorporar grupos protectores
adecuados que le permitan ser utilizado en síntesis automática de péptidos en
fase sólida. De este modo, el grupo amino debe estar protegido como
carbamato de Fmoc, el ácido como éster alílico y los hidroxilos del
carbohidrato como acetatos. En etapas posteriores al trabajo realizado, se
Angew.Chem. Int. Ed. 2004, 43, 6111-6116; f) Galonic, D. P.; Gin, D. Y. Nature. 2007,
446, 1000-1007; g) Hang, H. C.; Bertozzi, C. R. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5021-5034.
2
a) Desiree A. Thayer; Henry N; Yu,M; Carmen Galan; Chi-Huey Wong. Angew. Chem.
Int. Ed. 2005, 44, 4596-4599
Introducción y objetivos
9
pretende crear la secuencia de repetición de la MUC1 incorporando esta
treonina glicosilada. Con ello se pretende estudiar si la incorporación de
átomos de flúor puede llegar a mejorar la unión de la mucina con los
anticuerpos mediante posibles interacciones entre partes positivas del
anticuerpo y los átomos de flúor, muy electronegativos, de este nuevo
análogo del antígeno Tn.
El mimético fluorado del antígeno Tn está formado por un derivado del
sacárido galactosa y un aminoácido (treonina). Ambas partes deben tratarse
antes de realizar el acoplamiento (enlace α-O-glicosídico). La treonina es un
producto comercial y barato al ser uno de los veinte aminoácidos naturales
que forman las proteínas. Su tratamiento consiste en proteger los grupos
amino y carboxilo. Sin embargo, en la parte del carbohidrato hay que sintetizar
un intermedio que sea un buen donor glicosídico y que lleve en su estructura
un precursor del grupo amino (azida). Esto implica una serie de reacciones
intermedias ya que se parte de galactosa peracetilada.
Le etapa clave de la síntesis es la formación del enlace α-O-glicosídico. A la
hora de generar un enlace glicosídico pueden formarse dos posibles
esteroisómeros (α y β) regidos por el efecto anomérico, muy representativo
de la química de los carbohidratos. En el siguiente apartado se comentarán
tanto el efecto anomérico como las distintas metodologías de formación de
enlaces α-O-glicosídicos.
3.- Antecedentes
Antecedentes
12
3.1 Efecto anomérico
Los azúcares poseen un centro anomérico (C1). Dependiendo de la disposición
de los sustituyentes de este carbono, se diferencian dos estereoisómeros más
conocidos como anómeros. Si el sustituyente se encuentra en posición axial se
denomina anómero α y si, por el contrario, está en posición ecuatorial se
conoce como anómero β.
Figura 3.1. Representación de los distintos tipos de anómeros
Para los azúcares, no se puede generalizar que los compuestos con
sustituyentes en ecuatorial sean más estables, es decir, que
termodinámicamente estén favorecidos con respecto a los que poseen
sustituyentes en axial. Ciertas características estructurales hacen que un
anómero se estabilice más respecto al otro, dependiendo del sustituyente de
la posición C1.
Si se tiene un hemiacetal (R=H), el anómero β está más estabilizado puesto
que se crea un enlace de hidrógeno entre uno de los orbitales no enlazantes
del oxígeno que forma el ciclo y el hidrógeno del grupo OH. Esto no ocurre
para α, ya que al estar el grupo OH en posición axial se encuentra muy alejado
de los orbitales no enlazantes.3
Figura 3.2. Enlace de H en un hemiacetal
3
Demchenko, A.V. Synlett, 2003, 1225–1240.
Antecedentes
13
Sin embargo, ocurre todo lo contrario cuando el grupo R es una cadena
carbonada (acetal) como ocurre en los enlaces O-glicosídicos.4,5 En este caso,
se estabiliza el anómero α. Este fenómeno fue descubierto por Edward y
definido por Lemieux como efecto anomérico.6,7 Este fenómeno ocurre por
dos motivos:
1) Para sustituyentes en posición ecuatorial, puede haber interacciones
repulsivas entre los electrones no enlazantes del oxígeno del ciclo y los
del oxígeno del sustituyente. Esto no ocurre en la posición axial debido
a la lejanía de estos pares de electrones.
2) El anómero α se estabiliza por hiperconjugación: los orbitales no
enlazantes del oxígeno del anillo ceden densidad electrónica a un
orbital antienlazante del C1 (orientación periplanar)
Figura 3.3. Representación del efecto anomérico
4
Wolfe, S.; Whangbo, M.H.; Mitchell, D.J. Carbohydr. Res., 1979, 69, 1–26.
Box, V.G.S. Heterocycles, 1990, 31, 1157–1181.
6
Edward, J.T. Chemistry & Industry, 1955,1102–1104.
7
Lemieux, R.U. Pure Appl. Chem., 1971, 25, 527–548.
5
Antecedentes
14
3.2 Formación de enlaces O-glicosídicos
La reacción de glicosilación convencional tiene un mecanismo SN1. El
sustituyente del carbono anomérico es eliminado y el nucleófilo (en este caso
un compuesto con un átomo de O como atacante) puede unirse tanto por la
posición α como por la β. Sin embargo, hay una cierta estereoselectividad en
la que prima α sobre β (efecto anomérico).
O
RO
:
:
O
O
GS
OR
RO
HO
R
+
RO
O
RO
OR
(mayoritario)
Esquema 3.1. Mecanismo de glicosilación convencional
No obstante, esta estereoselectividad se puede perder debido a la presencia
de grupos con pares de electrones no enlazantes. El ejemplo más importante
es el del grupo acilo. En este caso, el O que forma el doble enlace ataca a la
posición α del intermedio catiónico formando un biciclo.
Figura 3.4. Intermedio bicíclico
Este biciclo intermedio se encuentra en equilibrio con el intermedio catiónico.
Como consecuencia, la única vía por la que el nucleófilo puede atacar al
carbohidrato mientras esté presente el biciclo intermedio es la posición β (la
Antecedentes
15
posición α se encuentra ocupada impedida al formar parte del biciclo). Por
esta razón es por lo que el anómero β es el mayoritario.
En la mayoría de las glicoproteínas, los carbohidratos se encuentran unidos a
los aminoácidos de la cadena peptídica mediante enlaces O-glicosídicos,
aunque son frecuentes derivados sintéticos con azufre o incluso carbono. Esta
unión es un paso fundamental en la obtención de un glicosilaminoácido. Esta
metodología es más eficiente que la glicosilación directa de un péptido o
proteína.
En este trabajo, se ha sintetizado un building block que presenta un enlace αO-glicosídico entre el aminoácido treonina y el derivado del carbohidrato
galactosa GalN(COCF3). Las metodologías para la formación de este enlace son
las mismas que para la formación del enlace α-O-glicosídico con GalNAc. Esto
se debe a que la etapa diferenciadora (trifluoroacetilación en vez de
acetilación) es posterior a la formación de dicho enlace. Hasta ese momento,
los compuestos intermedios son idénticos.
En todas las metodologías, el grupo amido se lleva enmascarado ya sea en
forma de azida (para evitar la formación del intermedio bicíclico para
mecanismos convencionales) o bien en forma de nitro (aceptor para una
reacción de Michael) y la treonina se encuentra debidamente protegida. A
continuación, se revisan varios métodos que permiten la formación de enlaces
O-glicosídicos.
Metodología del tricloroacetimidato
Este método fue desarrollado por Wong y colaboradores.8 Se basa en la
utilización de tricloacetimidato como precursor como activador para la
glicosilación. Es una metodología de dos pasos en la que se consigue una
proporción de anómeros α/β de 2:1 con un rendimiento moderado.
8
Payne, R. C.; Flicht S.; Tang S.; Brik A.; Yang Y.-Y.; Case D.A.; Wong C.-H. J. Am.
Chem. Soc. 2007, 129, 13527-13536.
Antecedentes
16
Esquema 3.5
Metodología de Schmidt
Fue desarrollada por el grupo de Schmidt.9,10 Se basa en la adición tipo
Michael (no es SN1) del alcohol de la treonina al 2-nitro-D-galactal en
presencia de medio básico (en este caso el grupo protector del amino de la
treonina es Boc).
Esquema 3.6
Es una metodología muy versátil puesto que el uso de una base u otra nos
permite obtener un anómero u otro en mayor proporción. Si la base es fuerte
9
Das, J.; Smichdt, R.R. Eur. J. Chem. 1998, 1609-1613.
Kogan, T.P.; Gatea, F.C.A. Synthesis 1988, 706-707.
10
Antecedentes
17
(tBuOK) se obtiene el anómero α como mayoritario. En cambio, se puede
obtener el anómero β de forma mayoritaria si se utilizan bases tipo amina,
como NEt3.
Metodología Koenigs-Knorr
Es uno de los procedimientos más antiguos de glicosilación.11 Está basado en
el empleo de haluros de carbohidratos como grupos dadores y un alcohol
como aceptor. Liebe y Kunz utilizaron este método para sintetizar un antígeno
(GalNAc) asociado a tumores (esquema 3.7).12
Esquema 3.7
Este ha sido el procedimiento escogido para la realización del trabajo puesto
que permite el escalado a gramos y es más sencillo. Un ejemplo de la mayor
dificultad de la metodología de Schmidt es la reducción posterior de nitro a
amino con amalgama de níquel platinado.
No obstante, el proceso ha sido ligeramente modificado. Estos cambios han
sido la utilización de cloroazidas en lugar de bromoazidas de galactosa y la
protección del grupo carboxilo de la treonina con éster alílico.
11
12
Koenigs, W,; Knorr, E. Chem. Ver. 1901, 34, 957-981.
Liebe, B.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618-621.
4.- Discusión de resultados
Discusión de
resultados
20
4.1 Síntesis del glicosilaminoácido
Este estudio tiene como objetivo la síntesis de un análogo fluorado del
antígeno Tn con treonina (Figura 4.1). El antígeno Tn consiste en un
aminoácido (serina o treonina) glicosilado con un derivado de la galactosa
denominado N-acetil-O-galactosaminil (GalNAc). Lo novedoso de la síntesis es
la incorporación de flúor mediante la trifluoroacetilación en vez de la
acetilación convencional.
Figura 4.1. Compuesto final: antígeno Tn trifluoroacetilado
Por un lado, se parte del aminoácido treonina (compuesto 1). En primer lugar,
se protege el grupo amina con Fmoc, puesto que varios procesos posteriores
requieren medio ácido. Para ello, el aminoácido comercial se hace reaccionar
con Fmoc-OSuc en medio básico, siguiendo la metodología descrita en la
literatura (esquema 4.1).13
Esquema 4.1
13
Cai, H; Huang, Z.-H.;Shi, L.; Zou, P.; Zhao, Y.-F.; Kunz, H.: Li, Y.-M. Eur. J. Org.
Chem. 2011, 3685-3689.
Discusión de
resultados
21
Para proteger el grupo ácido, se opta por el éster alílico en vez del éster tercbutílico convencional puesto que resiste mejor la agresividad de la etapa final
(trifluoroacetilación). Para ello, el compuesto 2 se hace reaccionar con
bromuro de alilo. El proceso que se lleva a cabo es una síntesis en dos fases en
las que es necesario un surfactante, que en este caso es Aliquat 336.14
Esquema 4.2
Por otro lado, se parte de galactosa peracetilada (compuesto 4). Se consigue
bromarla en el C1 por reacción con ácido bromhídrico en diclorometano
(esquema 4.3).15
Esquema 4.3
A continuación, la galactosa bromada (compuesto 5) se trata con Zn en
presencia de NaH2PO4 y utilizando acetona como disolvente para formar un
doble enlace mediante un proceso de eliminación (esquema 4.4).16
14
Goguen, B.N.; Aemissegger, A; Imperiali,B. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 1103811041
15
Ravindranathan Kartha, K. P.; Jennings, H. J.; J. Carbohydr. Chem. 1990, 9, 777-781.
16
Plattner, C.; Höfner, M.; Sewald, N. Org. Lett. 2011, 13, 545-547.
Discusión de
resultados
22
Esquema 4.4
El siguiente paso es la introducción del grupo azida en la posición 2 de la
galactosa y de un átomo de cloro en el carbono anomérico (posición 1). Para
ello, el compuesto 6 se hace reaccionar con azida de sodio y cloruro de hierro
(III) en presencia de peróxido de hidrógeno (esquema 4.5).16
Esquema 4.5
El siguiente paso es la glicosilación del aminoácido. La reacción se lleva
mediante un proceso conocido como Koenigs-Knorr (un halosacárido es
atacado por un nucleófilo). El grupo OH de la treonina actúa como nucleófilo
atacando el C1 del monosacárido. Las sales de plata son añadidas para
aumentar la electrofilia del C1 arrancando el Br de esa posición: el AgBr es
muy insoluble y desplaza el equilibrio. La reacción es estereoselectiva: se
obtiene un producto mayoritario por ataque en α (compuesto requerido) y
otro por ataque en β con una proporción de 65/35 favorable al anómero α
(esquema 4.6).17 Ambos anómeros fueron separados mediante cromatografía
de columna.
17
Elofsson, M.; A. Salvador, L.; Kihlberg, J. Tetrahedron. 1997, 53, 369-390.
Discusión de
resultados
23
Esquema 4.6
A continuación, se reduce la azida del compuesto 8α a amina. Para
conseguirlo, se hace reaccionar con Zn en presencia de un medio ácido
controlando la temperatura (esquema 4.7).
Esquema 4.7
Discusión de
resultados
24
Por último, la amina libre del glicoaminoácido se trifluoroacetila. Esto requiere
la presencia de una base. Se utiliza DIEA como base puesto que es voluminosa
y no demasiado fuerte para impedir la eliminación del grupo protector Fmoc
(esquema 4.8). Esta última etapa está pendiente de optimización, con idea de
mejorar el rendimiento.
Esquema 4.8
Discusión de
resultados
25
4.2 Caracterización del compuesto final
A continuación se lleva a cabo la caracterización del análogo del antígeno Tn
(compuesto 10). Para ello, se realizaron los correspondientes espectros de
RMN de 1H, 13C y 19F. Las bandas han sido asignadas con la ayuda de técnicas
bidimensionales (COSY y HSQC). Estos espectros así como las correspondientes
ampliaciones aparecen representados en las Figuras 4.2 a 4.8.
La comprobación de que el enlace O-glicosídico corresponde a la posición α
(axial) se obtiene a partir de la constante de acoplamiento entre H1 y H2. El
acoplamiento entre ambos protones no es muy fuerte (J = 2.5 Hz), lo que
confirma que se encuentran en una posición espacial tipo cis uno con respecto
del otro.
Figura 4.2. Espectro de RMN de 1H
Discusión de
resultados
Figura 4.3. Espectro de RMN de 13C
Figura 4.4. Espectro de RMN 1H-1H (COSY)
26
Discusión de
resultados
Figura 4.5. Espectro de RMN 1H-13C (HSQC)
COCF3
Figura 4.6. Espectro de RMN de 19F
27
Discusión de
resultados
1
H
OCOCH3 galactosa
CH3 thr
1
H
CH Fmoc
CH2 Allyl,
H2
2H6,H5,
Hα, Hβ
CH2 Fmoc
Figura 4.7. Ampliaciones del espectro de RMN de 1H
28
Discusión de
resultados
1
H
=CH2 Allyl,
H3, H4
7.04
7.07
7.26
7.35
7.33
7.31
7.42
7.41
7.39
7.61
H1
7.63
7.77
7.78
CH Allyl,
NH Fmoc
8 CH Ph
Fmoc
NHCOCF3
Figura 4.7. Ampliaciones del espectro de RMN de 1H
1
H
29
Discusión de
resultados
13
C
3 CH3CO
CH3 Thr
13
C
CH2 Allyl
CH Fmoc
C4,C3,
C6, Cβ
CH2 Fmoc
Cα
C5
C2
Figura 4.8. Ampliaciones del espectro de RMN de 13C
30
Discusión de
resultados
13
C
CH Arom Fmoc
2 CH Arom Fmoc
CH Arom Fmoc,
= CH2 Allyl
CH= Allyl
C1
13
C
2 C Arom Fmoc
4 COO
NCOO, NCOCF3
Figura 4.8. Ampliaciones del espectro de RMN de 13C
31
5.- Conclusiones
Conclusiones
34
Se ha llevado a cabo la síntesis de un derivado fluorado del antígeno Tn. Su
obtención es similar a la síntesis convencional del antígeno Tn exceptuando el
último paso en el que, en vez de utilizar Ac2O para formar la amida, se hace
uso de anhídrido trifluoroacético (TFAA). Así se consigue una amida del ácido
trifluoroacético.
Por un lado, el aminoácido treonina (Thr) se ha tratado para proteger tanto la
amina como el grupo carboxilo. El grupo amino se ha protegido con Fmoc, que
aparte de soportar medios ácidos, permite la incorporación de este
aminoácido glicosilado en una futura cadena peptídica utilizando la síntesis
automática de péptidos en fase sólida.
Por otro lado, se parte de galactosa peracetilada para obtener una cloroazida
de galactosa (la azida es la precursora del grupo amino). La glicosilación se ha
llevado a cabo por una reacción conocida como Koenigs-Knorr y la estructura
se ha confirmado gracias a técnicas de RMN, tanto unidmensionales como
bidimensionales.
Fuera del ámbito del Trabajo de Fin de Grado, se pretende crear un péptido,
más en concreto un epítopo de la mucina 1 (MUC1) que incorpore esta
treonina glicosilada. Este péptido servirá como base para el estudio de la
afinidad a los anticuerpos y, más en concreto, si los átomos de flúor
incorporados intervienen positivamente en dicha afinidad.
6.- Parte experimental
Parte experimental
38
Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear de 1H y 13C se realizaron en un
espectrómetro Bruker Avance-400 para todos los compuestos. Los
desplazamientos químicos se expresaron en ppm en la escala δ y las
constantes de acoplamiento (J) en Hz. Se utilizaron como disolventes
deuterados cloroformo, con TMS como referencia interna y agua deuterada,
con referencia interna del propio disolvente.
La cromatografía de capa fina se llevó a cabo en placas de silicagel (Polychrom
SI F254) sobre soporte de poliéster y para su visualización se utilizó luz
ultravioleta, disolución reveladora de H2SO4 al 5% en etanol y revelador de
ácido fosfomolíbdico en etanol.
La cromatografía de columna se realizó utilizando silicagel de 0.04-0.06 mm
(230-240 mesh).
Parte experimental
39
Fmoc-L-Thr-OH (2)
En un mismo matraz de reacción, se añaden Ltreonina (compuesto 1; 10 g, 83.97 mmol), FmocOSuc (42.48 g, 125.9 mmol) e bicarbonato de sodio
(21.15 g, 251.8 mmol). Todo ello se disuelve en una
mexcla de acetonitrilo/agua (300 mL de proporción
2:1 respectivamente) y se mantiene la mezcla a
temperatura ambiente.
La reacción se sigue mediante CCF (hexano/acetato de etilo, 6:4)
Cuando finaliza la reacción, la mezcla se adiciona en un embudo de extracción
y se lava con acetato de etilo (el producto queda en la fase orgánica puesto
que el medio es básico y el ácido se desprotona). Posteriormente, se añade
ácido clorhídrico 2 M hasta que el pH sea neutro y se extrae con una mezcla de
cloroformo/isopropanol (3:1). La fase orgánica se seca con sulfato de sodio
anhidro, se filtra y se evapora en rotavapor.
Los datos espectroscópicos coinciden con los descritos en la literatura.13
Fmoc-L-Thr-OAllyl (3)
Esta reacción se realiza mediante una técnica de
dos fases. Todos los reactivos se añaden en el
mismo matraz pero unos se disuelven en fase
orgánica y otros en acuosa. El compuesto 2 (3 g,
13.68 mmol) y el bicarbonato de sodio (1.15 g,
13.68 mmol) se disuelven en agua (75 mL) y el
bromuro de alilo (1.66 g, 13.68 mmol) en diclorometano (75 mL). Es necesario
añadir un surfactante que cree micelas: Aliquat-336 (5.529 g, 13.68 mmol) y la
mezcla se mantiene a temperatura ambiente.
La reacción se sigue mediante CCF (hexano/acetato de etilo, 7:3)
Una vez haya finalizado la extracción, se extrae con una mezcla de cloroformo/
isopropanol (3:1), se añade sulfato de sodio anhidro y se filtra. La mezcla se
Parte experimental
40
evapora en rotavapor y se purifica mediante columna cromatográfica
(hexano/acetato de etilo,7:3).
Los datos espectroscópicos coinciden con los descritos en la literatura.14
α-D-Tetra-O-acetil-1-bromogalactopiranosa (5)
AcO
AcO
En un matraz de fondo redondo se añaden galactosa
peracetilada (compuesto 4; 20 g, 51 mmol) y bromuro
O
de hidrógeno al 33% en ácido acético (30 mL).
Posteriormente, todo ello se disuelve en 100 mL de
AcO
diclorometano. La duración de la reacción es de 3 a 4
Br horas a temperatura ambiente.
OAc
(5)
Se sigue la reacción mediante cromatografía de capa fina usando como
eluyente una mezcla de hexano/acetato de etilo (6:4).
Una vez finalizada, se adiciona lentamente una disolución saturada de
bicarbonato de sodio hasta que el crudo se neutralice. Una vez se tenga una
mezcla neutra, se trasvasa a un embudo de extracción (importante que no
queden restos de ácido puesto que el dióxido de carbono que se forma puede
hacer explotar el embudo de extracción). Se extrae con diclorometano o éter.
Por último, los restos de agua de la fase orgánica son retenidos mediante la
adición de sulfato de sodio anhidro, se filtra y se evapora la disolución en un
rotavapor.
Los datos espectroscópicos coinciden con los descritos en la literatura.15
3,4,6-Tri-O-acetil-D-galactal (6)
El compuesto 5 se disuelve en acetona (300 ml) y
posteriormente se añade cinc activado (40 g, 611.6 mmol)
Parte experimental
41
y dihidrogenofosfato de sodio (2 g en sólido y 20 ml de una disolución
saturada). La mezcla se deja reaccionar durante 12 h a temperatura ambiente.
Se sigue mediante CCF utilizando como eluyente hexano/acetato de etilo (6:4).
La señal es de un color negro muy característico.
Cuando ha finalizado, se realiza una filtración en tierra de diatomeas y se
reduce el volumen hasta aproximadamente 200 mL. A continuación, se añade
en un embudo de extracción y se lava con una disolución saturada de cloruro
de sodio. Se eliminan los restos de agua con sulfato de sodio anhidro y se
filtra. Por último, se purifica el producto mediante columna cromatográfica
(hexano/acetato de etilo, 6:4). El producto puro tiene apariencia de aceite.
Los datos espectroscópicos coinciden con los descritos en la literatura.16
α-D-Tri-O-acetil-2-azido-1-cloro-2-desoxigalactopiranosa (7)
En un matraz de fondo esférico se añaden el
compuesto 6 (8.3 g, 22 mmol), azida de sodio (4.26 g,
48.48 mmol) y tricloruro de hierro hexahidrato (6.96 g,
17.62 mmol). Como disolvente se utiliza acetonitrilo. A
continuación, se adiciona peróxido de hidrógeno al
30% (8 mL) y la mezcla se mantiene a -20 ºC.
La reacción se sigue por CCF (hexano/acetato de etilo 6:4)
El crudo de reacción se lava con una disolución saturada de
hidrogenocarbonato de sodio, se eliminan los restos de agua con sulfato de
sodio anhidro y se evapora la fase orgánica en un rotavapor habiendo antes
filtrado. Por último, se lleva a cabo la purificación del producto mediante
columna cromatográfica (hexano/acetato de etilo, 6:4).
Los datos espectroscópicos coinciden con los descritos en la literatura.16
Parte experimental
42
Fmoc-L-Thr(α-O-D-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxigalactopiranosil)-OAllyl (8)
En un schlenk se introduce el tamiz
molecular de 4 Å (se activa en una mufla
durante 6 h) y se le aplica atmósfera de
argón. Posteriormente, se adiciona el
compuesto 3 (608 mg, 1.594 mmol)
disuelto en una mezcla de disolventes
secos (diclorometano 10 mL, tolueno 10
mL). Tras 1 h, se añaden las sales de
plata: carbonato de plata (572 mg, 2.072
mmol) y perclorato de plata (50 mg, 0.24
mmol). Es importante proteger el schlenk
de la luz (cubierta de papel de aluminio) puesto que el catión Ag+ es
fotosensible. Se esperan 30 min y se procede a adicionar el compuesto 7 (780
mg, 2.23 mmol) disuelto en una mezcla de disolventes secos (diclorometano 8
mL, tolueno 5 mL) y se deja reaccionar durante 12 h a temperatura ambiente
siguiendo la metodología descrita en la bibliografía.17
La reacción se sigue por CCF (eluyente hexano/acetato de etilo, 6.5:3.5).
Un vez haya concluido la reacción, se diluye con diclorometano y se filtra
sobre tierra de diatomeas. El disolvente se evapora en un rotavapor y se
realiza una columna cromatográfica (eluyente tolueno/acetona, 9:1) con una
cadencia de goteo especialmente baja.
PF = 51.5 − 53.5 ºC
α
= + 62.7º (c = 1, CHCl )
1
H RMN (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1.36 (d, 3H, J = 6.0 Hz, CH3 Thr), 2.04 (s,
3H, COCH3), 2.07 (s, 3H, COCH3), 2.15 (s, 3H, COCH3), 3.67 (dd, 1H, J = 11.2 Hz,
H2), 4.09 (d, J = 6.4 Hz, 2H, CH2 Fmoc), 4.26 - 4.30 (m, 2H, H5, CH Fmoc), 4.34 4.48 (m, 4H, Hα, Hβ, 2H6), 4.69 (d, J = 5.7 Hz, 2H, CH2Allyl), 5.05 (d, J = 3.4 Hz,
1H, H1), 5.26 - 5.39 (m, 3H, H3, CH=CH2 Allyl), 5.46 (‘s’, 1H, H4), 5.68 d, J = 9.5
Hz, 1H, NH), 5.88 - 6.00 (m, 1H, CH=CH2 Allyl), 7.32 - 7.38 (m, 2H, Fmoc Arom.),
7.38 - 7.42 (m, 2H, Fmoc Arom.), 7.62 - 7.66 (m, 2H, Fmoc Arom.), 7.76 - 7.78
(m, 2H, Fmoc Arom.).
Parte experimental
43
13
C RMN (75 MHz, CDCl3) δ (ppm): 18.6 (CH3 Thr), 20.7 (CH3CO), 47.2 (CH
Fmoc), 48.2 (C2), 58.0 (Cα), 61.9 (CH2 Fmoc), 66.7 (CH2 Allyl), 67.2 (C5), 67.6
(C4), 67.7 (C6), 68.2 (C3), 77.1 (Cβ), 99.2 (C1), 119.5 (=CH2 allyl), 120.1 (CH Fmoc
Arom, =CH2 Allyl), 125.3 (CH Fmoc Arom), 127.3 (CH Fmoc Arom), 127.4 (CH
Fmoc Arom), 131.5 (CH= Allyl), 141.4 (CH Fmoc Arom), 144.0 (C Fmoc Arom),
156.9 (NCOO), 169.8 – 170.6 (COO).
Fmoc-L-Thr(α-O-D-tri-O-acetil-2-galactosaminil)-OAllyl (9)
En un matraz se adiciona el compuesto 8
(500 mg, 0.718 mmol) y se disuelve en
THF (58 mL) y agua (20 mL). El matraz de
reacción se coloca en baño de hielo (0
ºC) y seguidamente se añaden los
reactivos bajo agitación: Zn en polvo
(1.13 g, 17.27 mmol), disolución acuosa
de ácido clorhídrico 33% (1.66 mL) y
ácido acético glacial (12.5 mL). Es
importante activar previamente el Zn
(baño ácido y lavado con éter).
El sistema se deja reaccionar aproximadamente 2 h.
La reacción se sigue por CCF (hexano/acetato de etilo, 6:4).
El crudo se filtra en tierra de diatomeas y se extrae con disolución saturada de
hidrogenocarbonato de sodio. No es necesaria la purificación de este
compuesto ya que se utiliza en la siguiente etapa sin realizar columna
cromatográfica.
Parte experimental
44
Fmoc-L-Thr(α-O-D-tri-O-acetil-N-trifluoroacetilgalactosaminil)-OAllyl (10)
En un matraz de fondo redondo se añade
el crudo de reacción del compuesto 9
(340 mg, 0.508 mmol) disuelto en 25 mL
de diclorometano. A continuación, se
adiciona DIEA (177.89 µL, 1.017 mmol) y
se deja la agitando mezcla 45 min. Una
vez transcurrido el tiempo, se adiciona
TFAA (141 µL, 1.017 mmol). La mezcla se
deja reaccionar durante 3 h.
La reacción se sigue mediante CCF
(hexano/acetato de etilo, 1:1).
El compuesto se purifica por columna cromatográfica (hexano/acetato de
etilo, 6:4). El reactivo que no ha reaccionado es muy polar (amina primaria) y
se recoge utilizando un eluyente muy polar (acetato de etilo/metanol, 9:1) una
vez que el producto ha salido de la columna.
PF = 70.5 − 71.9 ºC
α
= + 49.9º (c = 1, CHCl )
1
H RMN (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1.32 (d, 3H, J = 6.1 Hz, CH3 Thr), 1.96 (s, 3H,
COCH3), 2.03 (s, 3H, COCH3), 2.17 (s, 3H, COCH3), 4.11 (m, 2H, CH2 Fmoc), 4.26
(m, H, CH Fmoc), 4.30 - 4.54 (m, 5H, Hα, Hβ, H5, 2H6), 4.54 - 4.67 (m, 3H, CH2
Allyl, H2), 5.01 (d, J = 2.5 Hz, 1H, H1), 5.16 – 5.45 (m, 4H, H3, H4, CH=CH2), (d, J
= 3.4 Hz, 1H, H1), 5.80 - 5.93 (m, 2H, NH Fmoc, CH=CH2), 7.05 (d, J = 9.5 Hz, 1H,
NHCOCF3), 7.29 - 7.44 (m, 4H, Fmoc Arom.), 7.58 - 7.65 (m, 2H, Fmoc Arom.),
7.74 - 7.81 (m, 2H, Fmoc Arom.)
13
C RMN (75 MHz, CDCl3) δ (ppm): 18.1 (CH3 Thr), 20.7 (CH3CO), 47.2 (CH
Fmoc), 48.5 (C2), 58.4 (Cα), 62.1 (CH2 Fmoc), 66.6 (CH2 Allyl), 67.1 – 67.8 (C4, C5
C6), 68.2 (C3), 77.3 (Cβ), 98.91 (C1), 120.1 (CH Fmoc Arom, =CH2 Allyl), 125.2 (CH
Fmoc Arom), 127.2 (CH Fmoc Arom), 127.9 (CH Fmoc Arom), 131.0 (CH= Allyl),
141.4 (CH Fmoc Arom), 143.8 (C Fmoc Arom), 156.3 - 158.6 (NCOO, NCOCF3),
170.0 - 171.7 (COO).
19
F
RMN
(282
MHz,
CDCl3)
δ
(ppm):
-75.54
(s,
3F,
CF3).
Anexo: espectros de RMN
Anexo: espectros de RMN
49
Espectros de RMN (1H, 13C, COSY y HSQC en orden) que corresponden con el
compuesto 8.
1
H
Anexo: espectros de RMN
50
13
C
f1 (ppm)
COSY
Anexo: espectros de RMN
HSQC
51