Volumen actual - Pontificia Universidad Católica del Ecuador

ISSN - 0034 - 9313
REVISTA ECUATORIANA DE
MEDICINA Y
CIENCIAS BIOLÓGICAS
(REMCB)
VOLUMEN XXXVI - Nº 2 - NOVIEMBRE 2015
Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas
Volumen XXXVI - Nº 2, noviembre 2015
ISSN - 0034 - 9313
Pontificia Universidad Católica del Ecuador
Av. 12 de Octubre 1076 y Roca, Quito, Ecuador
Corrección de estilo y ortografía: Alfonso Sánchez
Asistente de edición: Lic. Maria Jose Salazar Nicholls
Impresión, diseño y diagramación:
QualityPrint Cía. Ltda., Quito, Ecuador
Fotografía portada: Jorge A. Castillo-Castro.
“La biodiversidad en los bosques tropicales, sobre todo en el Yasuní, es sorprendente. La vida se abre campo aprovechando todos los sustratos
posibles. Un brote de helecho crece de entre una cama de musgos y hepáticas que cubren las ramas de las plantas. Las briofitas (musgos y
hepáticas y antocerotes) son considerados como los reservorios más importantes de agua así como también los sustratos más importantes para
la colonización de nuevos sustratos”
REVISTA ECUATORIANA
DE MEDICINA Y CIENCIAS BIOLÓGICAS
Pontificia Universidad Católica del Ecuador
Rector: Dr. Fernando Ponce León S.J.
Casa de la Cultura Ecuatoriana Benjamín Carrión
Presidente: Sr. Raúl Pérez Torres
Sociedad Ecuatoriana de Ciencias Biológicas, Núcleo de Pichincha
Presidente: Dr. Jaime Costales Cordero
Editores:
Dra. Doris Vela Peralta1 (Ciencias Biológicas)
Dr. Tjitte de Vries1 (Ciencias Biológicas)
1
Pontificia Universidad Católica del Ecuador
Freddy G. Carrión Suárez MD. Psq. 1,2 (Medicina)
1
Pontificia Universidad Católica del Ecuador
2
Asociación Ecuatoriana de Psiquiatría
Coeditores:
Dr. Carlos A. Soria Proaño1
Dr. Rommel Montufar Galárraga1
1
Pontificia Universidad Católica del Ecuador
La Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas (REMCB) (ISSN 0034-9313)
es un órgano de difusión científica auspiciada por la Casa de la Cultura Ecuatoriana
Benjamín Carrión, la Pontificia Universidad Católica del Ecuador y la Sociedad
Ecuatoriana de Biología, Núcleo de Pichincha. La REMCB se encuentra incluida en
el Latin Index, se publica semestralmente y está dirigida a los científicos nacionales e
internacionales así como a estudiantes de Ciencias de la Vida.
El contenido de los artículos científicos y de las publicaciones que aparecen en la revista
son responsabilidad exclusiva de sus autores o de los auspiciantes y no representan
necesariamente el sentir de los editores de la REMCB, quienes no se responsabilizan por
errores o por las consecuencias surgidas por el uso del material que aparece publicado
en la misma.
ÍNDICE
EDITORIAL
7
MEDICINA
Relación entre la Cardiopatía Isquémica y la Proteína C Reactiva
9
Rosa Colina, Rommel Espinoza de los Monteros, James Franco, Bolívar Saenz, Luis Alejandro Cárdenas
QUÍMICA
Determinación computacional de la afinidad y eficiencia de enlace de antinflamatorios no
esteroideos inhibidores de la ciclooxigenasa-2
17
Lorena Meneses y Sebastián Cuesta
CIENCIAS BIOLÓGICAS
Rasgos morfológicos de frutos, semillas y embriones de Cinchona officinalis L. (RUBIACEAE)
en el Sur del Ecuador
27
Celulasas presentes en el tracto digestivo del camarón Litopenaeus vannamei
37
Tratamiento de un efluente derivado de una planta procesadora de pieles para extracción de
gelatina mediante la tecnología de ficorremediación
47
Caracterización molecular de péptidos antimicrobianos a partir de muestras de piel de Agalychnis
spurrelli (Anura: Hylidae)
57
Sensibilidad antimicrobiana y detección de genes de virulencia en aislados clínicos de Shigella spp.
67
José Miguel Romero-Saritama
Claudia Segovia-Salcedo, Alexandra Narváez-Trujillo, Fernando Espinoza-Fuentes
Diana Ontaneda Andrade, Mabel Cadena Zumárraga, Ana González, Ever Morales Avendaño
Andrea P. Vargas, Oscar Pérez, David Ortega, Myrian Rivera
Irina Villacrés, Iliana Alcocer, Jeannete Zurita y Mercedes Rodríguez-Riglos
NOTA CIENTÍFICA
Redescubrimiento de Sigmodon inopinatus (Rodentia: Cricetidae) en los Andes occidentales de la
provincia de Tungurahua, Ecuador
77
Diego G. Tirira y Andrea Vallejo-Vargas
COLECCIONES DE MUSEO
Las colecciones biológicas: Los tesoros escondidos de un país mega-diverso
83
INSTRUCTIVO PARA AUTORES
89
FE DE ERRATAS
95
Claudia Segovia-Salcedo, Luis Carrasco y Néstor Acosta Buenaño
Aislamiento, cultivo, viabilidad y evaluación de un consorcio cianobacteria-miroalga como
acondicionador de suelos
Raquel Martínez Pérez, Gianina Suárez Rodríguez y Ever Morales Avedaño
EDITORIAL
Contestar preguntas como ¿Cuán importante es la forma, el color, el tamaño o la textura de una semilla
para permitir su dispersión y germinación?, ¿Cuál es la estructura que debe tener una molécula para
incrementar su eficiencia? ó ¿Cuáles son los factores que determinan que una persona desarrolle o no una
enfermedad? Son verdaderos retos científicos que pueden llevar toda una vida de investigación.
Llegar a una respuesta –que la mayoría de las veces nos llevará a otra pregunta– requiere de tiempo y
mucho trabajo riguroso, es por ello que cada resultado que es reportado, a través de un artículo científico,
se convierte en un peldaño fundamental en la construcción del conocimiento.
Los artículos científicos que se publican en este número de la REMCB son una muestra de este proceso de
construcción del conocimiento, y de cómo la investigación en el Ecuador se está diversificando y abarcando
nuevas áreas en las cuales la diversidad biológica es la materia prima inagotable para la investigación y una
vertiente de conocimiento para las generaciones del futuro.
Por ejemplo, caracterizar nuevas sustancias producidas naturalmente por animales o plantas es una labor
compleja, ejemplo de ello es el trabajo realizado con los péptidos provenientes de la piel de los sapos, al
igual que la detección de celulasas en el camarón. También se evidencia preocupación por el estado de
nuestro entorno y las posibles soluciones a través de la recuperación del recurso natural más importante,
el agua. Para ello la misma naturaleza provee de microorganismos que, utilizados adecuadamente, pueden
permitir el tratamiento y la recuperación de este recurso.
Mejorar la calidad de vida de las personas también es un tema central para la investigación científica y
este proceso puede iniciarse, por ejemplo, a partir de la descripción de estructuras químicas que mejoren
la eficiencia de las moléculas, la implementación de nuevos procedimientos médicos para el diagnóstico
de enfermedades, la detección de cepas virulentas y sus cualidades de resistencia a antibióticos o la
caracterización genética y molecular de proteínas, como se muestra en algunos de los artículos incluidos.
Además, en este número de la REMCB se presenta un reporte sobre las colecciones biológicas en nuestro
país; con este artículo queremos dar relevancia a la diversidad biológica que ha sido preservada en dichas
colecciones y que además se convierten en una fuente de investigación. En la actualidad, los museos, los
herbarios, los bancos de germoplasma o bancos de tejidos, son reservorios de material invaluable y su
importancia radica en la información que guardan para las siguientes generaciones. Este material, que en
algunos casos se creía perdido, ha permitido desarrollar estudios tanto de carácter taxonómico y sistemático,
así como generar inferencias respecto al cambio climático o a eventos epidemiológicos, y en algunos casos
ha resuelto problemas de salud pública; por tanto es importante mirarlos como una fuente de información
y un patrimonio natural.
Es así que cada resultado generado en un estudio científico se convierte en una herramienta que permitirá la
continuidad de la investigación científica y la construcción del conocimiento científico. Por tanto la REMCB
les invita a ser partícipes en la construcción de este conocimiento y a dejarse cautivar por el contenido de
este volumen.
Dra. Doris Vela Peralta
Editora Científica
Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas
9
MEDICINA
Relación entre cardiopatía isquémica
y la proteína C reactiva
Rosa Colina Cifuentes¹, Rommel Espinoza de los Monteros², James Franco2, Bolívar
Saenz3, Luis Alejandro Cárdenas4
¹Laboratorio de Investigación en Biología Molecular, Facultad de Medicina,
Pontificia Universidad Católica del Ecuador. Quito, Ecuador.
²Servicio de Cirugía Cardiotorácica, hospital de Especialidades de las FF.AA. N°1 Quito,
Pontificia Universidad Católica del Ecuador. espinozarommel@hotmail.com
Servicio de Cardiología, hospital de Especialidades de las FF.AA. N°1 Quito.
3
4
Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Facultad de Medicina. Quito, Ecuador.
Recibido: 2015-06-08; aceptado: 2015-09-29
RESUMEN.- Las enfermedades cardiovasculares están relacionadas con procesos inflamatorios
prolongados o persistentes que causan el aumento de los niveles de reactantes de fase aguda como la
proteína C reactiva (PCR), el fibrinógeno y las interleucinas IL-1 e IL-6. Desde este punto es importante
saber si existen en los ecuatorianos polimorfismos genéticos ya establecidos para otras poblaciones, en
especial en las citosinas IL-1 e IL-6. El objetivo del estudio fue relacionar la proteína C reactiva ultrasensible
(PCR-us) en pacientes con cardiopatía isquémica. Se analizaron un total de 91 personas: 50 pacientes con
criterios de inclusión para el diagnóstico de cardiopatía isquémica y 41 pacientes sin criterios de inclusión
o síntomas de cardiopatía isquémica, escogidos en el área de consulta externa y hospitalización de los
Servicios de Cardiología del hospital de Especialidades de las FF.AA. N° 1- Quito y del hospital Carlos
Andrade Marín (hospital IESS - Quito).
Entre los hábitos, en el grupo de casos prevaleció el tabaquismo 11 pacientes (22 %) seguidos por el
alcoholismo y tabaquismo juntos 9 (18 %). 25 individuos (50 %) de este grupo manifestó no tener hábito
alguno, debemos mencionar que muchos de estos pacientes acudían a consulta externa de cardiología
donde recibían educación médica.
El nivel de glicemia en ayunas mayor a 100 mg/dl encontró asociación de padecer cardiopatía isquémica
(OR = 4.13, IC 95 %: 1.54 – 11.0), (p = 0.03).
Los niveles de LDL, colesterol, triglicéridos y de glicemia en el grupo de los casos fueron superiores en
relación con el grupo control.
La lectura inmediata de la PCR-us no tuvo una diferencia significativa: p = 0.20 IC del 95 % entre los dos
grupos de estudio. Igualmente la lectura de la PCR-us a los 30 minutos: p = 0.21 IC del 95 %.
Existe gran interés clínico y fisiopatológico en el desarrollo de nuevos marcadores que nos permitan un
diagnóstico rápido y preciso en personas con mayor riesgo de desarrollar futuros eventos cardiovasculares.
PALABRAS CLAVES: cardiopatía isquémica, inflamación, interleucinas, proteínas de fase aguda,
proteína C reactiva.
ABSTRACT.- The cardiovascular diseases are associated with prolonged or persistent inflammatory
processes causing the increased levels of C-reactive protein (CRP) as acute phase reactants. The objective of
the study was to relate the Hscrp in patients with ischemic heart disease. We analysed a total of 91 people, 50
patients with inclusion criteria for the diagnosis of ischemic heart disease and 41 patients with no inclusion
Cardiopatía Isquémica y PCR
Colina et al.
10
criteria, chosen in the area of outpatient and hospitalization of the services of Cardiology of the Hospital of
specialties of the armed forces. N ° 1 - Quito and Carlos Andrade Marin Hospital (Hospital IESS - Quito).
Among the habits in the Group of cases prevailed 11 smoking (22 %) followed by alcoholism and smoking
together 9 (18 %). 25 (50 %) of this group said have any habit.
Level of glycemic in fasting more than 100 mg/dl found Association of ischemic heart disease (OR = 4.13,
95 % CI: 1.54-11.0), (p = 0.03).
The immediate reading of the PCR-us had no significant difference, p = 0.20 CI 95 % between the two study
groups, the reading of the PCR-us 30 minutes p = 0.21 CI of 95 %.
KEYWORDS: ischemic heart disease, inflammation, interleukins, proteins of acute phase, C-reactive protein.
INTRODUCCIÓN
Según reporte 2013 de la OMS las enfermedades
cardiovasculares (ECV) son la causa del 30 % de
muertes en el mundo, afectan tanto a hombres
como a mujeres. Como parte de ECV está la
cardiopatía isquémica (CI), definida como el
conjunto de trastornos relacionados íntimamente
donde existe un desequilibrio entre el suministro
de oxígeno y los sustratos frente a la demanda
cardíaca acompañada. Generalmente se debe a una
disminución en el calibre de las arterias coronarias.
A estas cardiopatías se las ha relacionado
directamente con el proceso ateroesclerótico en
donde suceden dos procesos principales: a) la
aterosis, que no es más que el proceso inflamatorio
de la íntima y b) la esclerosis conocida como el
endurecimiento y taponamiento de la luz del vaso.
Entre las manifestaciones clínicas de la cardiopatía
isquémica están: la angina estable, angina inestable
y el infarto al miocardio (Braunwald’s, 2011).
Los procesos inflamatorios de la ateroesclerosis son
procesos prolongados o persistentes (inflamaciones
crónicas), que causan el aumento de los niveles
de reactantes de fase aguda (marcadores de
inflamación) como la proteína C reactiva, el
fibrinógeno y las citosinas como la interleucina IL-1
e IL-6 (Andrade et al., 2011).
La PCR es una proteína sintetizada por los
hepatocitos (células del hígado), descubierta en 1930
y llamada así por la reacción con el polisacárido C
Pneumococico, es parte de la familia de las proteínas
pentraxina y está formada por cinco subunidades,
es bastante estable y posee una vida media en el
plasma de 18-20 horas (Barba, 2007).
La proteína C reactiva al ser un reactante de fase
aguda es un marcador de inflamación activa sensible
pero inespecífico (García et al., 1999). Es inespecífico
REMCB 36 (2), 2015
porque reacciona en cualquier proceso infeccioso
e inflamatorio, sin embargo, en algunos estudios
se le menciona como un marcador pronóstico de
infarto al miocardio (IM) en personas sanas y con
angina inestable, cuando sus valores están sobre los
3 mg/L hasta 10 mg/L o más (García J y Kaski JC,
1999). Según varios ensayos y determinando PCR
con alta sensibilidad en personas sanas, valores
menores a 1 mg/L no tienen riesgo de eventos
cardiovasculares. Entre 1 mg/L y 3 mg/L, la
posibilidad que ocurra un evento cardiovascular es
moderada y la probabilidad alta para un evento se
observa cuando la concentración de PCR supera los
3 mg/L (Barba, 2007).
En los estudios actuales se ha logrado establecer
que la proteína C reactiva no solo es un marcador
de la inflamación, sino que también juega un papel
activo en la inflamación porque reacciona con
receptores de la superficie celular, facilitando la
opsonización y fagocitosis (Braunwald’s, 2011).
MATERIALES Y MÉTODOS
Población de estudio.- Este estudio se realizó en dos
grupos de personas adultas; un grupo con criterios de
inclusión para el diagnóstico de cardiopatía isquémica
(casos) y otro grupo de individuos (controles),
sin los criterios de inclusión para el diagnóstico
de cardiopatía isquémica, escogidos en el área de
consulta externa y hospitalización de los Servicios
de Cardiología del hospital de Especialidades de las
FF.AA. N° 1- Quito y del hospital Carlos Andrade
Marín (hospital IESS - Quito).
En los casos, se analizaron hombres y mujeres entre
los 37 a 91 años que presentaron tres o más factores
de riesgo cardiovascular (Tabla 1), con dolor
precordial como la angina de pecho, definida a
través de dolor torácico agudo típico, y alteraciones
de los registros electrocardiográficos (ECG) como
11
el descenso del ST, la inversión de la onda T. Se
revisaron las coronariografías de los pacientes a
quienes se les había realizado este tipo de estudio.
Tabla 1. Factores de riesgo presentes en el grupo de estudio
Factores
Parámetros
Edad
Sexo
Hipertensión arterial
Presión arterial L ≥ 140/90
mmHg
Diabetes mellitus tipo II
Glicemia en ayunas ≥ 100
mg/dl
Tabaquismo
SI / NO
Colesterol total
≥ 100 mg/dl
LDL ambos sexos
≥ 100 mg/dl
Triglicéridos
≥ 150 mg/dl
Cambios en el EKG
Cambios para cardiopatía
isquemica
Cambios en la
corionariografía
Cambios para coronariopatía
atersoclerótica
Troponinas elevadas
Compatibles con cardiopatía
isquémica
El grupo control incluyó personas de ambos
sexos, entre los 37 y 91 años sin los síntomas
mencionados anteriormente o sin el diagnóstico
de cardiopatía isquémica.
Muestra.- Se analizaron un total de 91 individuos:
50 casos y 41 controles. El tamaño de la muestra se
calculó a base de nivel de confianza 95 %, poder del
estudio 80 %. La frecuencia esperada de exposición
en los no enfermos 20 %, frecuencia esperada de
exposición en los enfermos 60 % y se le añadió un
20 % más considerando pérdida o error.
Análisis Estadístico.- Se desarrolló un estudio
observacional analítico longitudinal de casos y
controles. El análisis estadístico se realizó en el
programa SPSS V21.
Criterios de Inclusión:
Grupo de casos
- Hombres y mujeres mayores de 35 años con 3
o más factores de riesgo cardiovascular para la
cardiopatía isquémica
- Pacientes con diagnóstico de cardiopatía
isquémica
- Pacientes que voluntariamente desearon
participar en el estudio y que reunían los
criterios de inclusión
Grupo de controles
- Personas masculinas y femeninas sin Factores
de Riesgo Cardiovascular
- Personas de ambos sexos mayores de 35 años
de edad
- Personas que voluntariamente desearon
participar en el estudio
Criterios de Exclusión:
- Pacientes menores de 35 años
- Antecedentes de infarto agudo de miocardio
- Enfermedades infecciosas menores de 6 meses
de evolución
-Embarazo
-Neoplasias
- Cardiopatías valvulares o portadores de
marcapasos
- Antecedentes de enfermedad cerebral o
hemorragia
Para el análisis estadístico descriptivo se emplearon:
porcentajes, tablas de frecuencia, medidas de
tendencia central y dispersión en función de las
distintas variables en estudio. Para la comparación
de los grupos en estudio se empleó el OR como
medida de asociación ajustado a un intervalo de
confianza (IC del 95 %) y valor de P < 0.005 como
medida de significancia.
MATERIALES Y MÉTODOS
Una vez determinada la muestra, para los análisis
de laboratorio se obtuvo sangre venosa por medio
de venopunción directa para cuantificar niveles de
glicemia, colesterol total, LDL y Triglicéridos.
En tubos de EDTA se tomó un mínimo de 3 ml
de sangre venosa, la cual se centrifugó dentro de
las dos horas posteriores a la extracción. Una vez
centrifugada se separó el plasma para analizar la
PCR-us, mediante la técnica de ELISA (Araque, 2009).
Para cuantificar Proteína C reactiva humana
ultrasensible se usó ELISA Kit marca INVITROGEN
catálogo KHA0031. Este ensayo utiliza un
anticuerpo específico para PCR en un plato de 96
muestras con Ac anti PCR (Assay Kits, 2014).
Se utilizó el Equipo Molecular Devices 2001. Kinetic
Microplate Reader. Versión: Sofware, SOFT may
PRO 4.0 EXE.
La extracción y el transporte de las muestras
se realizaron de acuerdo con los protocolos
establecidos y usados para el estudio.
Cardiopatía Isquémica y PCR
Colina et al.
12
RESULTADOS
Se receptaron la información de 91 pacientes, y sus
historias clínicas, los cuales cumplían con todos
los criterios de inclusión y exclusión anteriormente
descritos. El estudio se realizó en el hospital de
Especialidades de las FF. AA. de Quito N° 1 y en el
hospital del IESS, Carlos Andrade Marín, en el período
comprendido entre febrero a noviembre del año 2013.
El sexo prevalente fue el masculino en el grupo de
casos 44 (88 %) y controles 33 (80.5 %), comparado
con un 6 (12 %) del femenino en los casos y 8 (19.5
%) en los controles. La edad de los 91 integrantes
del estudio tuvo una media de 61.34 ± 13 años y un
rango de edad entre los 37 a 92 años (Tabla 1).
Entre los antecedentes patológicos en el grupo de
casos se reportaron 32 (64 %) hipertensos, 10 (20 %)
diabéticos, y 2 (4 %) casos de dislipidemia.
Dentro de los hábitos estudiados en el grupo de
casos se encontró: alcoholismo 5 (10 %), tabaquismo
11 (22 %), alcoholismo y tabaquismo juntos 9 (18
%), ningún hábito 25 (50 %). Grupo control 41 (100
%) no reportaron tener malos hábitos (Tabla 2).
Para el nivel de glicemia en ayunas mayor a
100 mg/dl se encontró asociación de padecer
cardiopatía isquémica (p = 0.03) (OR = 4.13 IC 95
%: 1.54 – 11.0), así como también para los niveles de
LDL mayor a 100 mg/dl (p = 0.00) (OR = 57.7 IC 95
%: 14.5 – 229.1), triglicéridos superiores a 150 mg/
dl (p = 0,00) (OR = 22.1 IC 95 %: 6.6 – 74.2), y de
colesterol sobre los 100 mg/dl (p = 0,00) (OR = 11
IC 95 %: 4.1 – 29), respectivamente.
La presencia de HTA con cifras mayores a 140/90
mmHg (p = 0,00) (OR = 12.4 IC 95 %: 4.5 – 33.5)
estadísticamente significativa como factor de riesgo
para cardiopatía isquémica (Tabla 3).
En cuanto se refiere al registro electrocardiográfico
en 16 (32 %) pacientes del grupo de los
casos presentaron cambios en el registro
electrocardiográfico, positivos para enfermedad
coronaria. En 37 (90 %) no se evidenciaron cambios
en el trazo del electrocardiograma sugestivos de
cardiopatía isquémica aguda o crónica. (OR = 0.051
- IC 95 % 0.015 – 0.16).
Únicamente en 9 (18 %) pacientes con diagnóstico
de cardiopatía isquémica se evidenció elevación de
troponinas (OR = 0.11 IC 95 % 0.014 – 0.94) y en los
pacientes a quienes se les practicó coronariografía
como método de diagnóstico para descartar
coronariopatía, 13 (26 %) individuos mostraron
cambios significativos en la anatomía de las arterias
coronarias (OR = 6.85 IC 95 % 1.44 – 32.4) (Tabla 4).
Tabla 2. Características generales de los casos y controles
Variables
Casos n = 50
Controles n = 41
Edad
61.34 ± 13
61.34 ± 13
Masculino
44 (88 %)
33 (80.5 %)
Femenino
6 (12 %)
8 (19.5 %)
Hipertensos
32 (64 %)
0
Diabéticos
10 (20 %)
0
Dislipidemia
2 (4 %)
0
Hábitos
Alcoholismo
5
(10 %)
0
Tabaquismo
11 (22 %)
0
Alcoholismo y tabaquismo
Ningún hábito
9
(18 %)
25 (50 %)
0
41 (100 %)
Química sanguínea
Glicemia menor a 100 mg/dl
9 (18 %)
35 (85.4 %)
Glicemia mayor a 100 mg/dl
41 (82 %)
6 (14.6 %)
Colesterol menor a 100 mg/dl
10 (20 %)
37 (90.2 %)
Colesterol mayor a 100 mg/dl
40 (80 %)
4 (9.8 %)
Trigliceridos menor a 150 mg/dl
4 (8 %)
27 (65.9 %)
Trigliceridos mayor a 150 mg/dl
46 (92 %)
14 (34.1 %)
LDL menor a 100 mg/dl
9 (18 %)
38 (92.7 %)
LDL mayor a 100 mg/dl
41 (82 %)
3 (7.3 %)
REMCB 36 (2), 2015
13
Tabla 3. Valores medios observados para las variables medidas
Variables
n = 91
Casos n = 50
Controles n = 41
Colesterol
139.72 ± 20.2
100.4 ± 19.9
Triglicéridos
141.28 ± 25.55
138.26 ± 23.37
Colesterol LDL
176.06 ± 29.6
118.41 ± 17.68
Glicemia
106.9 ± 25.59
92.87 ± 8.88
PCR inmediato
2.99 ± 0.35
2.87 ± 0.52
PCR a los 30
minutos
3.02 ± 0.36
2.30 ± 0.49
Tabla 4. Evaluación de la enfermedad coronaria
Examen
Casos n = 50
Controles n = 41
Cambios
ctrocardiográficos
16 (32%)
37 (90%)
Presencia de
troponinas
elevadas
9 (18%)
1 (2.4%)
Coronariografía
positiva
13 (26%)
2 (4%)
La medición de la PCR-us inmediato en el grupo
control tuvo una media de 2.99 mg/L, una desviación
típica de 0.35 un rango de 2.04 mg/L (1.21 – 3.25
mg/L). Mientras que la lectura de la PCR-us en el
grupo de los casos tuvo una media de 2.87 mg/L,
una desviación típica 0.52 un rango de 2.21 mg/L
(1.29 – 3.50 mg/L). Mediante cruce de variables
con la prueba de t de student no se encontró una
diferencia estadísticamente significativa entre los
dos grupos p = 0.20 IC del 95 %.
La lectura de la PCR-us a los 30 minutos en el
grupo control, tuvo una media de 3.02 mg/L, una
desviación típica de 0.36 un rango de 2.21 mg/L
(1.29 – 3.50 mg/L). En el grupo de casos la PCR-us
tuvo una media de 2.30 mg/L, una desviación típica
de 0.49 un rango de 2.25 mg/L (1.30 – 3.55 mg/L).
Mediante la prueba de t de student no se encontró
una diferencia estadísticamente significativa entre
los dos grupos p = 0.21 IC del 95 %.
DISCUSIÓN
En este estudio preliminar, presentamos los
resultados obtenidos de un pequeño grupo de
estudio. La información obtenida en los diferentes
trabajos que se han publicado hasta el momento
no es homogénea, debido seguramente a una
falta de puntos de corte aceptados para definir los
valores entre normales o patológicos. Los datos de
referencia en la literatura médica se encuentran
entre 2 a 10 veces superiores a los de los varones
aparentemente normales que desarrollan un
infarto cardíaco. Si se aplicara la variabilidad
intraindividual muchos valores significativos entre
los casos y los controles se solaparían entre sí.
En el estudio MRFIT (Multiple Risk Factor
Intervention Trial) (Jeremiah et al., 2008) y en
el estudio MONICA (Monitoring Trends and
determinants in Cardiovascular Disease) en 1999,
revelaron una relación significativa entre los
niveles altos de PCR-us y la mortalidad por eventos
coronarios y cardiovasculares.
En nuestro estudio, en el grupo de casos el sexo
masculino fue mayor 44 (88 %) frente a 6 (12 %)
femenino, lo que se explica por la mayor presencia
de la cardiopatía isquémica en los hombres como
se viene reportado en la literatura médica con
respecto a la cardiopatía isquémica (Garziano et al.,
2011; Malacrida et al., 1999).
La hipertensión arterial 32 (64 %) siempre presente
en este tipo de estudios, también prevaleció
notablemente seguida de la diabetes 10 (20 %) y la
dislipidemia 2 (4 %) o en su defecto juntas.
Con respecto a los hábitos, en el grupo de casos
prevaleció el tabaquismo 11 (22 %) seguida por
el alcoholismo y tabaquismo juntas 9 (18 %).
Debemos mencionar que muchos de los pacientes
del grupo de los casos, acudían a consulta externa
de cardiología por lo que una buena parte de ellos
manifestó haber dejado algún hábito 25 (50 %).
Los niveles de LDL, colesterol, triglicéridos y de
glicemia en el grupo de los casos fueron superiores
en relación con el grupo control. La lectura inmediata
de la PCR-us no tuvo una diferencia significativa, p
= 0.20 IC del 95 % entre los dos grupos de estudio,
igualmente la lectura de la PCR-us a los 30 minutos
p = 0.21 IC del 95 %. Sin embargo, nuestros datos
son muy parecidos sino iguales a los encontrados
por otros investigadores al respecto.
En pacientes sin enfermedad arterial coronaria
las concentraciones medias de PCR son < 1
mg/L, mientras que en pacientes con tres arterias
coronarias afectadas son: > 1.4 mg/L. A base de los
niveles plasmáticos de PCR, las Guías publicadas
por el Centro de Control/Asociación Cardiaca
Americana (AHA) han determinado las cifras de
corte para determinar un riesgo cardiovascular bajo
(< 1.0 mg/L), medio (1-3 mg/L) y alto (> 3.0 mg/L)
en pacientes con un riesgo de cardiopatía isquémica
a diez años del 10-20 % según la escala de riesgo
del estudio Framingham Risk Score. Si se alcanzan
niveles ≥ 10 mg/L se debe repetir la determinación
y descartar la posible existencia de una inflamación
o infección (García y Kaski, 1999).
Cardiopatía Isquémica y PCR
Colina et al.
14
El estudio Multiple Risk Factor Intervention
Trial (MRFIT) es un gran estudio con diseño
anidado en el cual se seleccionaron 12 866 varones
aparentemente sanos, con un seguimiento de 17
años. La concentración de PCR no fue diferente
en los varones sin eventos (2.0 mg/L), con infarto
de miocardio durante el seguimiento (2.7 mg/L) o
que fallecieron por causa cardíaca (3.4 mg/L), no
obstante, se observó una asociación significativa
entre PCR y la mortalidad por cardiopatía
isquémica. La razón de riesgo (odds ratio) de
los varones en el cuartil más elevado de PCR
comparado con los del cuartil más bajo fue de 2.8
(1.4-5.4) (Jeremiah et al., 2008).
Un segundo estudio sobre el valor pronóstico de
la PCR en varones aparentemente sanos, fue el
Physicians Health Study (PHS). Se trata de un
estudio con diseño anidado, con una población
original de 22 071 varones, de los cuales 543
tuvieron eventos cardiovasculares (accidente
cerebrovascular isquémico o hemorrágico,
trombosis venosa profunda, infarto agudo de
miocardio o muerte de origen cardíaco) y 543
controles ajustados por edad y tabaquismo.
Ambos grupos habían sido aleatorizados
previamente a recibir aspirina o placebo. Los
varones aparentemente sanos que no tuvieron
eventos (controles) tenían una PCR basal de 1.13
mg/L comparado con 1.40 mg/L en los varones
aparentemente sanos, que tuvieron eventos
cardiovasculares (p < 0,001) (Ridker et al., 1997).
significativa, el grupo de casos siempre presentó
más elevada (3.02 mg/L) la presencia de la PCR,
frente a los controles (2.30 mg/L), y confirmó
como marcador inflamatorio en presencia de
cardiopatía isquémica.
•La PCR es un marcador sensible de la
inflamación, pero inespecífico según nuestros
resultados y la bibliografía.
•Creemos que el tiempo utilizado para el
desarrollo de este tipo de investigación, fue
muy corto y el tamaño de la muestra debe
ser ampliado significativamente para obtener
mejores resultados.
•Se recomienda realizar estudios con otros
marcadores o predictores en este tipo de
patología cardíaca.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Andrade E, Waras R, Couto F, Couto R. 2011.
Triglycerides/HDL-C ratio and high sensible
C-reactive protein to the evaluation of
cardiovascular risk. Jornal Brasileiro de Patologia
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Arqué M. 2009. Obtención, procesado y
almacenaje de muestras de plasma sanguíneo.
Centro de investigación biomédica en red
enfermedades respiratorias.
Sabemos que la edad, la presencia de hipertensión,
la diabetes y otros procesos inflamatorios presentes
en los dos grupos estudiados y al ser la PCR
utilizada la ultrasensible, no nos permitió encontrar
una diferencia estadísticamente significativa entre
los dos grupos, pero sí podemos afirmar que
obtuvimos mediciones de PRC-us muy parecidos a
los reportados por la literatura médica y recalcamos
que nuestro estudio es un estudio piloto.
Braunwald’s 2011. Heart Disease: A Textbook of
Cardiovascular Medicine. Novena Edición.
Philadelphia. Pa: Saunders Elsevie: 49 pp.
Existe un gran interés clínico y fisiopatológico en el
desarrollo de nuevos marcadores que nos permitan
un diagnóstico más rápido y preciso de aquellos
individuos con un mayor riesgo de desarrollar
futuros eventos cardiovasculares.
Danesh J, Collins R, Appleby P, Peto R. 1998.
Association of fibrinogen, C-reactive protein,
albumin, or leukocyte with coronary heart
disease. The Journal of the American Medical
Association, 279: 1477-1482.
CONCLUSIONES
García J y Kaski JC. 1999. Cardiopatía Isquémica:
marcadores de inflamación y riesgo
cardiovascular. Revista Española de Cardiología,
52: 990-1003
•En nuestro estudio piloto, no se encontró
diferencia significativa entre los dos grupos
analizados (casos y controles) con respecto a la
medición de la PCR-us.
•Si bien la medición del PCR-us en los dos
grupos investigados no fue estadísticamente
REMCB 36 (2), 2015
Assay Max human C reactive Protein ELISA Kit,
ASSAYPRO, Catalog No. EC1001-1. 2014.
Barba JR. 2007. Síndrome coronario agudo. Revista
Mexicana de Patología Clínica, 54 (3): 116-135.
Graciani A, Zuluaga M. 2008. Mortalidad
cardiovascular atribuible a la presión arterial
elevada en la población española de 50 años o
más. Medicina Clínica, 131: 125-129.
15
Jeremiah S, James D y Neaton. 2008. The Multiple
Risk Factor Intervention Trial (MRFIT)
Importance Then and Now. The Journal of the
American Medical Association, 300(11):1343-1345.
Ridker PM, Cushman M, Stampfer MJ, Tracy
RP, Hennekens CH. 1997. For systemic
inflammation, in 543 apparently healthy men
participating in the Physicians’ Health Study.
The New England Journal of Medicine, 337(5):356.
Cardiopatía Isquémica y PCR
Colina et al.
16
REMCB 36 (2), 2015
17
QUÍMICA
Determinación Computacional de la Afinidad y Eficiencia
de Enlace de Antinflamatorios No Esteroideos Inhibidores
de la Ciclooxigenasa-2
Lorena Meneses1 y Sebastián Cuesta1
1Laboratorio de Química Computacional, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,
Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito, Ecuador. lmmeneses@puce.edu.ec
Recibido: 2015-06-16; aceptado: 2015-08-07
RESUMEN.- El presente es un estudio computacional de la interacción de diferentes antinflamatorios
no esteroideos con la enzima Ciclooxigenasa 2 (COX-2). El objetivo fue determinar la afinidad con
la cual los inhibidores estudiados se enlazan con el sitio activo de la enzima y calcular la eficiencia de
enlace de los mismos. Además, comprobar la aplicabilidad de los métodos de acoplamiento molecular,
en la determinación de moléculas prometedoras, que aceleren los estudios de descubrimiento de nuevos
fármacos. Se utilizaron métodos de dinámica molecular, para modelar las interacciones entre la enzima
COX-2 y los sustratos celecoxib, diclofenaco, etoricoxib, indometacina, ibuprofeno, meloxicam y naproxeno,
por medio del programa Autodock VINA. Los resultados muestran que la molécula que posee una mayor
afinidad con la COX-2 es el celecoxib, con una energía de enlace de -10.8 kcal/mol y una constante de
equilibrio Ki de 1.21x10-8 M. El ibuprofeno y el naproxeno son las moléculas con mayor eficiencia de enlace,
con un valor mayor a -0.48 kcal/mol/átomos (no hidrógeno). Esto demuestra que una molécula que tiene
una buena afinidad, no necesariamente debe tener una buena eficiencia de enlace. Estos valores dan una
pauta para poder elegir la mejor molécula para inhibir la enzima COX-2 y en casos de descubrimiento
de fármacos, la molécula idónea para invertir en su mejoramiento y optimización, para convertirla en un
fármaco aprobado.
PALABRAS CLAVES: Afinidad, antinflamatorios no esteroideos, Autodock VINA, COX-2, eficiencia de enlace.
ABSTRACT.- A computational study of the interaction of nonsteroidal antiinflammatory drugs with
Cyclooxygenase 2 (COX-2) enzyme is shown. The objective was to determine the affinity of the inhibitors
studied with the active site of the enzyme and calculate their binding efficiency. Furthermore, it is intended
to check the applicability of the methods of molecular docking in determining promising molecules in order
to accelerate drug discovery research. Molecular dynamics methods, using Autodock VINA, were used to
model the interactions between the COX-2 enzyme with celecoxib, diclofenac, etoricoxib, indomethacin,
ibuprofen, naproxen, and meloxicam. Results show that the molecule with higher affinity for COX-2 is
celecoxib with a binding energy of -10.8 kcal/mol and an equilibrium constant Ki of 1.21x10-8 M. Ibuprofen
and naproxen are the molecules with higher binding efficiency with a values greater than -0.48 kcal/mol/
atoms (other than hydrogen). This shows that a molecule having a good affinity, not necessarily will have
a good binding efficiency. These values give researchers a guideline to choose the best molecule to inhibit
COX-2 enzyme and in cases of drug discovery processes, the ideal molecule to invest in their improvement
and optimization to make it an approved drug.
KEYWORDS: Affinity, Autodock VINA, binding efficiency, COX-2, NSAIDs.
INTRODUCCIÓN
En la última década, hemos sido testigos de cambios
dramáticos en la forma de entender el dolor. En
lugar de considerar el dolor como un síntoma de
un traumatismo, una infección, una inflamación, o
una cirugía, ahora lo tomamos como una entidad
patológica discreta que altera fundamentalmente
Afinidad y Eficiencia de enlace
Meneses y Cuesta
18
todo el sistema nervioso. Avances en tecnologías
de neuroimagen, han permitido localizar zonas
del cerebro donde se percibe el dolor y por
ende, proponer formas más efectivas de tratarlo
(Standford Medicine, 2005).
Entre los medicamentos más comunes en el mundo
se encuentran los AINEs (Anti Inflamatorios No
Esteroideos). Cada día, más de 30 millones de
estadounidenses los usan para tratar dolores de
cabeza, esguinces, síntomas de la artritis y cualquier
otro tipo de molestia (McMurry, 2004).
A un nivel básico, el dolor no es más que el
resultado de una señal eléctrica enviada por los
nervios al cerebro. Este proceso va acompañado
de una liberación de prostaglandinas que ante
una lesión, hacen que el tejido se hinche. Estos
mediadores químicos amplifican la señal eléctrica
procedente de los nervios, causando el dolor
(Griffin, 2015). La función de los AINEs es bloquear
las enzimas Prostaglandina H2 sintasas, que son
las causantes de producir prostaglandinas en el
proceso inflamatorio (Hall et al., 2001).
Los mamíferos tienen dos isoformas de la
prostaglandina H2 sintasa, la Ciclooxigenasa 1
(COX1) y la Ciclooxigenasa 2 (COX-2). Ambas poseen
en su estructura más de 600 aminoácidos y, aunque
tienen similar secuencia de aminoácidos (60 a 65 %),
poseen diferentes funciones (Nelson y Cox, 2008).
La COX-2 es la enzima que produce prostaglandinas
adicionales que intervienen y causan los efectos en
un proceso inflamatorio. Su función es mediar en
los procesos de inflamación. Es parte fundamental
en el sistema nervioso central (SNC) y el riñón (Hall
et al., 2001). No es constitutiva en todos los tejidos,
pero puede ser inducida en el sitio de inflamación,
manteniendo los mecanismos inflamatorios y
amplificando las señales dolorosas (Hall et al., 2001).
En el mercado, existe una gran variedad de
medicamentos AINEs. La elección depende
entre otros aspectos, del nivel del dolor y
la farmacocinética de cada uno (Brunton y
Parker, 2008). Dentro del estudio de nuevos
medicamentos, se busca que sean eficaces a bajas
concentraciones, con alta selectividad y alivio al
dolor (Davies y Skjodt, 2000).
El objetivo de un programa de descubrimiento de
medicamentos es, generalmente, encontrar una
molécula que se una a la proteína deseada, a bajas
concentraciones. Cuando un medicamento tiene
el valor de la constante de disociación (Ki) muy
pequeño, indica que éste y su objetivo biológico
se unen fuertemente. Valores ideales de Ki están
REMCB 36 (2), 2015
en el rango de nanomolar (nM). Los valores de
Ki y la concentración inhibitoria media (IC50),
están relacionados con la potencia de un inhibidor
(Stevens, 2014). El IC50 representa la concentración
de un medicamento requerida para una inhibición
del objetivo biológico del 50 % en pruebas in vitro.
Además, la afinidad está relacionada con la energía
de enlace, que puede ser determinada a partir de la
constante de equilibrio. El valor de esta constante
permite además, calcular la energía libre de Gibbs
para la unión del complejo medicamento-sitio
activo (ecuación 1) (Stevens, 2012).
E-I
Ki=
E+I
(1)
En los últimos años, se ha vuelto común expresar
la energías de unión en términos de eficiencia de
enlace (LE). La eficiencia de enlace y propiedades
termodinámicas constitutivas del ΔG (ΔH y ΔS),
pueden proporcionar información sobre la unión
de una molécula con su ligando, que van más allá
de simples comparaciones de potencia inhibitoria
(Reynolds y Holloway, 2011).
La energía libre estándar (ΔG°) de unión del
complejo enzima-sustrato, puede ser calculada
utilizando la ecuación 2. La temperatura usada
normalmente es 298 K (25° C). Valores más
negativos indican mayores energías de unión
(Stevens, 2014).
ΔG° = -2.3RT log (1/Ki) = 2.3RT log (Ki)
(2)
Los cambios de entalpía (ΔH) y de entropía (ΔS),
deben ser considerados en la evaluación de la
energía de unión (ecuación 3). Interacciones que
son controladas por la entalpía, son los puentes
de hidrógeno formados entre el medicamento
y la enzima, mientras que efectos hidrofóbicos
controlan los cambios en entropía (Stevens, 2014).
Cuando un compuesto no polar se encuentra en
solución acuosa, las moléculas de agua forman una
capa altamente ordenada alrededor de las porciones
no polares del compuesto (efecto hidrofóbico)
(Stevens, 2012). Una vez que el compuesto entra y
se une al sitio activo, algunas moléculas de agua
de solvatación pasarán nuevamente a la solución.
Las moléculas de agua que están libres en solución
tienen más libertad de movimiento que las que
están solvatadas. Por lo tanto, la unión de una
molécula no polar en un bolsillo lipofílico aumenta
el desorden del sistema global (Stevens, 2012).
19
ΔG = ΔH – TΔS
(3)
En el diseño de fármacos, el valor de ΔG permite
evaluar si la modificación de un medicamento
aumenta o disminuye la afinidad con su objetivo
biológico, estimando la estabilidad relativa de los
diferentes compuestos. En síntesis, se puede utilizar
para determinar si el sistema está en equilibrio, o qué
tan rápido y en qué medida es probable que se dé la
reacción de asociación (Stevens, 2012). La importancia
descriptiva de ΔG, hace que sea interesante determinar
su valor mediante métodos computacionales.
Otro enfoque es analizar el valor de la eficiencia
de enlace (LE). LE es una medida que relaciona la
energía libre de unión con el tamaño de la molécula.
Es importante examinar cómo cambian los valores
de LE a medida que se realizan cambios en diferentes
partes de la molécula (Murray et al., 2014). La LE
se obtiene de dividir la energía libre de unión de
cada molécula por el número de átomos (n) no
hidrógenos presentes en la estructura (ecuación 4).
LE =
(4)
A medida que aumenta la eficiencia de enlace,
disminuye el peso molecular del medicamento
final (Graham, 2001). La eficiencia de enlace es
uno de los índices más usados en la actualidad
y se expresa en kcal/mol/átomos que no son
hidrógeno (Stevens, 2014). Proporciona una idea de
la cantidad de energía de enlace por átomo distinto
al de hidrógeno. Hay que tener en cuenta que el
valor para la eficiencia de enlace debe ser negativo,
ya que la energía libre de unión es negativa.
Fundamentalmente, LE ayuda a controlar el tamaño
molecular de una serie durante la optimización, y
da una pauta para decidir entre dos series, cuál es
la más prometedora (Murray et al., 2014).
En esta investigación se trabajó con el “software”
Autodock VINA. Autodock está diseñado como
una herramienta de acoplamiento molecular en la
que, mediante modelos matemáticos, se predice
la estructura o estructuras de los complejos
intermoleculares formados entre dos o más
estructuras. Docking, como también se lo llama, es
ampliamente usado para sugerir enlaces e inhibir
proteínas (Atkinson y Abernethy, 2007). Esta
herramienta permite predecir mediante cálculos
teóricos, cómo moléculas pequeñas, cómo sustratos
y candidatos de fármacos, pueden actuar como
ligandos, y se unen a estructuras tridimensionales
conocidas, biológicamente importantes (The
Scripps Research Institute, 2013).
Al realizar el cálculo del acoplamiento, el software
muestra diez resultados diferentes. Cada resultado
representa al ligando en una posición espacial
distinta. En cada posición se obtiene la afinidad
entre la macromolécula y el ligando. El programa
muestra las posibles conformaciones del ligando
ordenadas según su estabilidad. Para este trabajo, se
tomó para cada molécula la conformación de menor
energía, que se corresponde con mayor afinidad
y por ende, la que tiene mayor probabilidad que
suceda en la realidad.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se realizó el modelamiento computacional de la
interacción de la enzima COX-2 con moléculas
pertenecientes a la misma familia de AINEs
(ibuprofeno, naproxeno), diferentes familias
(indometacina,
diclofenaco,
meloxicam)
e
inhibidores selectivos de la COX-2 (celecoxib,
etoricoxib). Se utilizó el programa Autodock VINA.
Los AINEs ejercen su acción antinflamatoria,
uniéndose al sitio activo ciclooxigenasa, ubicado
en la parte inferior de la enzima COX-2. En la
Figura 1 se muestra la estructura tridimensional
de la COX-2 unida al celecoxib en su sitio activo.
La estructura tridimensional (estructura ternaria)
de esta enzima, fue obtenida experimentalmente
mediante la técnica de rayos X por otros autores,
y sus parámetros estructurales colocados en un
Figura 1. Estructura experimental de la unión de celecoxib con
la enzima Ciclooxigenasa-2.
Afinidad y Eficiencia de enlace
Meneses y Cuesta
20
banco de proteínas (Protein Data Banks), de donde
se descargó (Berman et al., 2000), (Figura 1). Para
obtener la energía de enlace, se hizo interactuar
al ligando con el sitio activo de la macromolécula
(COX-2). El programa calcula la energía y produce
como resultado varias conformaciones posibles.
Los criterios usados para determinar si una
conformación es aceptada, o para comparar dos
conformaciones, son la energía libre y la distancia
media cuadrática (RMSD por sus siglas en inglés)
(Kitchen et al., 2004). Dos conformaciones son
consideradas idénticas, cuando la diferencia de
energía entre ellas está por debajo de las 3kcal/mol
y su RMSD es menor o igual al RMSD promedio
menos la desviación estándar. Para conformaciones
iguales, las de energías más altas son eliminadas
(Ermondi et al., 2004). Con este criterio, se escogió
la conformación con la menor energía libre para
cada molécula en estudio.
- Los resultados se visualizaron utilizando el
programa Autodock Tools.
RESULTADOS
En la Figura 2 se muestran las estructuras de todos los
ligandos que fueron sometidos al estudio.
El programa Autodock permite seleccionar, para
el cálculo de acoplamiento molecular, cualquier
zona de la enzima. En este estudio, se seleccionó
el sitio activo ciclooxigenasa de la enzima. El
procedimiento que se siguió para cada principio
activo fue el siguiente:
- Se obtuvieron las coordenadas de posición de
la enzima, del banco de datos de proteínas en
formato PDB.
-Mediante el programa Chimera 1.7, se
identificaron todos los residuos que no
pertenecían a la proteína para poder eliminarlos
y que no afecten en los cálculos de docking
(Pettersen et al., 2004).
- En Autodock, se abrió Autodock Tools, se
escogió la enzima como macromolécula y se
la preparó para los estudios, en donde los
ligandos, moléculas de solvente y otros residuos
fueron removidos del sitio activo de la enzima
(Abdel-Azeem et al., 2009). Los átomos de
hidrógeno fueron agregados a la estructura con
la opción Hydrogen Polar only. Posteriormente,
se escogió cada principio activo como ligando y
se estableció el área de acoplamiento.
-Finalmente, con los datos obtenidos en
Autodock Tools, se creó un archivo de entrada
para Autodock VINA (Atkinson y Abernethy,
2007) y se realizó el cálculo. Autodock usa tres
métodos para la determinación del sitio activo: un
algoritmo genético, un método de búsqueda local
y un método global-local adaptado basado en el
algoritmo genético de Lamarck en conjunto con
campos de fuerza empíricos que permiten obtener
las energías libres de unión. (Pouplana et al., 2002).
REMCB 36 (2), 2015
Figura 2. Representación estructural en modelo de bolas de los
antinflamatorios no esteroideos estudiados.
Las conformaciones calculadas de cada principio
activo, fueron comparadas con un modelo
experimental de la interacción entre la COX-2 del
ratón común con el medicamento celecoxib, por
superposición de las estructuras. El resultado de la
comparación se presenta en la Figura 3, donde se
pueden observar las conformaciones calculadas de
menor energía en color verde para el celecoxib, celeste
para el etoricoxib, amarillo para el ibuprofeno, azul
para el naproxeno, rojo para el diclofenaco, celeste
para el meloxicam y morado para la indometacina.
La molécula obtenida de la interacción experimental
se muestra de color gris para los átomos de carbono,
amarillo para los de azufre, azul para los de
nitrógeno y rojo para los de oxígeno.
Con estas conformaciones se obtuvo la energía
libre de Gibbs para la unión entre el medicamento
y la enzima, que es calculada por el programa
y presentada en forma de afinidad. Mediante la
21
Como se puede observar en la Figura 3, todas las
conformaciones calculadas de mínima energía,
se encuentran superpuestas con la estructura
obtenida experimentalmente. En el caso del
celecoxib, la molécula se encuentra exactamente
en la misma posición que la experimental, lo que
nos demuestra la buena correlación de los cálculos
computacionales con los experimentales, ya que
no solo se encontró el sitio activo, sino también la
posición espacial en que la molécula va a entrar e
interaccionar con este sitio activo.
En la Tabla 1 se muestra la energía libre de Gibbs
para el complejo enzima-sustrato. La afinidad de
enlace, representada en la energía libre de Gibbs de
un ligando con un receptor, depende de la fuerza
de atracción entre los ligandos y sus sitios de unión
al receptor. La afinidad de enlace es la fuerza de
la interacción entre dos moléculas que se unen
de forma reversible (Stevens, 2012). En la Tabla
1 se puede observar que el principio activo que
posee mayor afinidad con la enzima COX-2 es el
celecoxib, con una energía de enlace de -10.8 kcal/
mol. Luego se encuentra el etoricoxib, seguido del
naproxeno, el diclofenaco, el ibuprofeno y al final
el meloxicam y la indometacina. El celecoxib tiene
también la menor constante de disociación, que se
encuentra en el rango nanomolar.
Figura 3. Comparación de la conformación de celecoxib obtenida
experimentalmente (gris), con las obtenidas computacionalmente
para diferentes antinflamatorios no esteroideos.
utilización de la ecuación 2 se obtuvo la constante
de equilibrio para cada una de las interacciones. Con
la ecuación 4 se obtuvieron los valores teóricos para
la eficiencia de enlace. Los valores para estos dos
indicadores de afinidad se muestran en la Tabla 1.
Algunos estudios similares se han realizado
utilizando el mismo “software”, versiones
anteriores de “Autodock” e inclusive diferente
“software”, obteniendo resultados equivalentes.
Tabla 1. Energía libre de Gibbs y constantes de disociación y eficiencia de enlace para diferentes antiinflamatorios no esteroideos estudiados
Principio activo
Fórmula
ΔG (kcal/mol)
Ki (M)
LE kcal/mol/átomos
(no hidrógeno)
Celecoxib
C17H14N3F3O2S
-10.8
1.21*10-8
-0.415
-7
-0.383
Etoricoxib
C18H15N2ClO2S
-9.2
1.80*10
Ibuprofeno
C13H18O2
-7.7
2.26*10-6
-0.513
Naproxeno
C14H14O3
-8.4
6.94*10
-7
-0.494
Diclofenaco
C14H11NCl2O2
-8.1
1.15*10
-6
-0.426
Meloxicam
C14H13N3O4S2
-6.2
2.85*10-5
-0.270
Indometacina
C19H16NClO4
-5.3
1.30*10
-0.212
DISCUSIÓN
Estudios previos demuestran que las enzimas
Ciclooxigenasa poseen dos sitios activos
ciclooxigenasa y dos peroxidasa en su estructura
(DeWitt, 1999). Los AINEs inhiben los sitios
activos ciclooxigenasa que se encuentran en la
parte inferior de la enzima. Por este motivo, el
modelamiento molecular se enfocó únicamente en
la zona del sitio activo ciclooxigenasa.
-4
Al comparar el resultado obtenido con el ibuprofeno
(-7.7 kcal/mol) con el resultado obtenido en otro estudio
con la utilización del programa “Autodock 4” (-6.21
kcal/mo) (Savic et al., 2011), se puede observar que la
diferencia de energía entre ambas estructuras es de tan
solo 1.49 kcal/mol. Tal como se explicó, estructuras se
consideran homólogas cuando sus energías difieren en
menos de 3 kcal/mol. Aunque no se puede obtener el
RMSD, este pequeño cambio en la energía nos da una
pauta de la reproducibilidad en los datos.
Afinidad y Eficiencia de enlace
Meneses y Cuesta
22
En un estudio diferente (Pouplana et al., 2002),
utilizando Autodock 3, los autores obtuvieron
energías de -11.04 kcal/mol para naproxeno,
-11.09kcal/mol para diclofenaco y -10.19 kcal/mol
para indometacina. Aunque los valores difieren en
mayor proporción a los obtenidos en este estudio,
con excepción de la indometacina, ninguno de los
valores sobrepasa la diferencia de 3 kcal/mol. La
diferencia en los resultados es comprensible ya que
el “software” utilizado es una versión anterior por
lo cual algoritmos y cálculos matemáticos pueden
ser diferentes. A pesar de esto, se observa buena
relación entre resultados con el mismo programa,
ya que el naproxeno y el diclofenaco tienen energías
similares y la indometacina posee una energía
menor en los dos estudios.
Con el programa Merck Molecular Force Field
MMFF94x, se obtuvieron energías de -11.20 kcal/
mol para el ibuprofeno y -12.65 kcal/mol para
el naproxeno (Abdel-Azeem et al., 2009). Las
diferencias se dan ya que entre diferentes marcas
de “software”, se utilizan diferentes algoritmos
matemáticos en el cálculo de las conformaciones.
Aunque las energías son diferentes, estas no
pasan de los 5 kcal/mol. De la misma manera,
los resultados son equivalentes entre “softwares”
mostrando que el naproxeno tiene una menor
energía de enlace que el ibuprofeno en ambos casos.
La afinidad tiene repercusiones en la potencia
inhibitoria de la molécula en la enzima (Graham,
2001). Esto es vital en los estudios farmacológicos
para determinar la dosis ideal para el medicamento.
En las pruebas preliminares para medicamentos,
existe un rango muy pequeño donde se alcanza
el efecto deseado. Concentraciones elevadas
producen
toxicidad
por
sobredosificación,
mientras que concentraciones por debajo del rango
terapéutico, no llegan a tener ningún efecto en el
paciente. Datos de afinidad, sumados a pruebas
clínicas, ayudan a determinar la cantidad y el
intervalo entre dosificaciones, consiguiendo así, un
tratamiento efectivo y seguro.
En la creación de nuevos medicamentos, estos
datos son de gran importancia, ya que la mayoría
de inhibiciones se dan por competencia entre
el sustrato y el medicamento (Murray et al.,
2003). En este tipo de competencia, la constante
de disociación determina la concentración del
medicamento necesaria para lograr una inhibición
exitosa de la enzima y el beneficio terapéutico para
el paciente. Estos valores ayudan a escoger un
compuesto líder, entre un conjunto de potenciales
moléculas, para invertir en el desarrollo de nuevos
fármacos (Stevens, 2014).
REMCB 36 (2), 2015
Los datos de afinidad y constante solas, no
determinan la potencia global de un medicamento.
La potencia es el resultado de la compleja interacción
tanto de la afinidad de unión como de la eficiencia
de enlace. La eficiencia de enlace es la capacidad
del ligando para producir una respuesta biológica
a la unión al receptor de destino y la magnitud
cuantitativa de esta respuesta (Abad-Zapatero y
Metz, 2005). Es una medida de la energía de enlace
por átomo de un ligando a su pareja de unión,
tal como un receptor o enzima. Al observar estos
valores para las moléculas analizadas, podemos
ver que el ibuprofeno es la molécula que posee un
mayor valor para la eficiencia de enlace, aunque su
afinidad no sea la más alta. Esto también sucede
con el naproxeno y el diclofenaco. Los inhibidores
de COX-2, diclofenaco y naproxeno, aunque tienen
LE menores en relación con el ibuprofeno, también
son valores que entran dentro de los aceptables,
para considerar a una molécula con propiedades
farmacológicas interesantes (llamada hit) para
estudios posteriores. Con esto se puede normalizar
las afinidades de los “hits” para identificar los
mejores puntos de partida para la optimización.
Normalizar se refiere a identificar aquellos con
los más altos valores de LE, en igualdad de
condiciones. A pesar de sus bajas afinidades,
fragmentos de los hits seleccionados a menudo
tienen LE relativamente buenas (> 0,4) a excelentes.
Estudios en medicamentos que ya están a la venta
(Hopkins et al., 2014), determinaron un LE para los
medicamentos orales de -0.52 kcal/mol/átomos
(no hidrógeno) lo cual está dentro del rango de los
resultados obtenidos en este estudio. Además, se
muestra como va cambiando la LE a medida que
avanza el proceso de descubrimiento siendo para
hits -0,41, compuestos líderes -0.39 y compuestos
en Fase 2 -0.42 kcal/mol/átomos (no hidrógeno).
Transformar estos “hits” en compuestos líderes es
un desafío que a menudo requiere la adición de
15-20 átomos pesados para aumentar la afinidad.
Esto presenta una oportunidad para utilizar
diferentes ligandos y la eficiencia de grupos
para controlar cuidadosamente las propiedades
químicas (Hopkins et al., 2014). La eficiencia de
ligando es bastante dependiente del tamaño
de la molécula donde ligandos de menor peso
molecular van a tener mejores eficiencias en
promedio que ligandos más grandes. La principal
causa para esto es que a medida que el ligando
crece en tamaño se reduce la calidad de la unión
entre este y el receptor, ya que ligandos más
grandes y complejos complican la entrada hasta
el sitio activo del receptor (Reynolds et al., 2008).
23
Existen varias limitaciones en el uso de estos
descriptores de afinidad. En primer lugar, todos los
átomos que no son hidrógeno tienen el mismo peso,
por lo que la introducción de un CH3, NH2, OH, F, Cl,
Br creará el mismo cambio en valores de LE, sin tomar
en cuenta las ventajas y desventajas de introducir
moléculas polares o especies cargadas en la molécula.
Esto supone un riesgo en la utilización de LE, sin
considerar otras propiedades tales como la potencia,
eficiencia de enlace lipofílico (LLE), solubilidad,
farmacocinética, entre otros (Murray et al., 2014).
Algunos autores sugieren que existen mejores
indicadores de eficiencia ligando, como son el
índice porcentual o eficiencia-potencia (PEI,
por sus siglas en inglés), el índice de eficiencia
de unión (BEI, por sus siglas en inglés), porque
son más fáciles de calcular y tienen en cuenta las
diferencias entre los elementos en diferentes filas
de la tabla periódica (Abad-Zapatero, 2005). La
eficiencia de enlace lipofílico (LLE), por otro lado,
es un parámetro extremadamente importante que
se debe tomar en cuenta durante la optimización
de compuestos. LLE considera explícitamente el
equilibrio entre la lipofilia y la potencia inhibitoria.
Sin embargo, a pesar de sus puntos fuertes, LLE no
es tan idóneo cuando se quiere comparar moléculas
de diferentes tamaños. También, LLE no es útil
cuando el objetivo biológico requiere moléculas
muy polares (Murray et al., 2014).
No existe un descriptor de afinidad que sea la solución
a todos los problemas y que lleven al éxito. Sin embargo,
el concepto de LE es importante en investigaciones,
para guiar las estrategias basadas en los fragmentos,
para acelerar el descubrimiento de fármacos y en la
toma de decisiones (Murray et al., 2014). También se ha
utilizado para diseccionar el fragmento más eficiente
en moléculas grandes obtenidas de productos
naturales (Abad-Zapatero et al., 2010).
La diversidad de mecanismos de enlace de la
COX-2 demostrados para diferentes compuestos
es impresionante. La habilidad de la enzima
de acomodarse estructuralmente a diferentes
inhibidores es notable, ya que no existe evidencia
de cambios considerables en la conformación de
las proteínas en la interacción con AINEs (Blobaum
y Marnet, 2007). Los AINEs estudiados, como
mostraron los resultados, bloquean la unión entre el
ácido araquidónico con el sitio activo ciclooxigenasa
de la enzima (impidiendo la formación de
la prostaglandina). Esta inhibición se da por
competencia, por lo que esta puede ser revertida
al diluir el inhibidor, o aumentando la cantidad
de sustrato (Nelson y Cox, 2008). La cantidad de
antinflamatorio necesaria para lograr la inhibición
depende de los valores de afinidad obtenidos
en el cálculo, así como de otras propiedades
farmacocinéticas como biodisponibilidad, unión
proteica, vida media y de la interacción del fármaco
con otros sistemas biológicos del cuerpo. Tomando
en cuenta los datos obtenidos, se puede determinar
que los inhibidores selectivos de la COX-2, debido
a sus energías más bajas, van a ser más útiles para
tratar dolores más agudos, en comparación al resto
de AINEs estudiados. Así, mientras se necesitan 120
mg (3x10-4 moles) de etoricoxib al día, para tratar
dolores como artritis gotosa aguda, tratamientos
con ibuprofeno pueden llegar a los 800 mg (4x10-3
moles) al día (American Society of Health-System
Pharmacists, 2015).
Al comparar el ibuprofeno con el meloxicam,
podemos observar que aunque el ibuprofeno posee
valores más favorables de energía libre de Gibbs y
de eficiencia de enlace, la dosis diaria de meloxicam
es de tan solo 15 mg, mientras la del ibuprofeno es de
400 a 600 mg. Esto se debe a la influencia que tienen
otras propiedades farmacocinéticas, en este caso la
vida media del medicamento, que mientras en el
ibuprofeno es de tan solo 1.8 horas, en el meloxicam
puede llegar a las 20 horas, siendo necesario menor
cantidad del medicamento para lograr mantener la
dosis terapéutica en el cuerpo (American Society of
Health-System Pharmacists, 2015).
Las comparaciones analizadas son útiles para
determinar la aplicabilidad y exactitud de los
resultados
obtenidos
mediante
programas
computacionales, en la búsqueda de sitios activos,
compuestos con propiedades farmacológicas
interesantes y enlaces enzima-sustrato de objetivos
biológicos y enzimas de interés.
CONCLUSIONES
•El principio activo que posee mayor afinidad
con la enzima COX-2 es el celecoxib, con una
energía de enlace de -10.8 kcal/mol y una
constante de equilibrio Ki de 1.21x10-8 M.
•El ibuprofeno y el naproxeno son las moléculas con
mayor valor de eficiencia de enlace que sobrepasa
los -0.48 kcal/mol/átomos (no hidrógeno).
•Aunque los datos de ΔG, Ki y LE son
fundamentales para iniciar un estudio en una
molécula determinada, otras propiedades
como biodisponibilidad, tiempo de vida
media y unión proteica, son importantes en el
momento de definir la dosis del medicamento
para el paciente, por lo cual este estudio debería
complementarse con pruebas clínicas en el
laboratorio, para poder determinar seguridad y
dosis terapéutica.
Afinidad y Eficiencia de enlace
Meneses y Cuesta
24
AGRADECIMIENTOS
A la DGA-PUCE, a través del proyecto “Estudio
téorico y experimental en síntesis orgánica
(Ibuprofeno)”, con código J13075.
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Consultada 03-junio-2015.
Afinidad y Eficiencia de enlace
Meneses y Cuesta
26
REMCB 36 (2), 2015
27
CIENCIAS BIOLÓGICAS
Rasgos morfológicos de frutos, semillas y embriones de
Cinchona officinalis L. (RUBIACEAE) en el sur del Ecuador
José Miguel Romero-Saritama
Departamento de Ciencias Naturales, Banco de Germoplasma
Universidad Técnica Particular de Loja jmromero@utpl.edu.ec
Recibido: 2015-06-11; aceptado: 2015-08-25
RESUMEN.- El estudio de rasgos morfológicos funcionales es importante para comprender el rol
de las especies en las comunidades vegetales. El objetivo del trabajo fue generar información de rasgos
morfológicos cuantitativos y cualitativos de frutos, semillas y embriones de Cinchona officinalis, L. que nos
permita mejorar el conocimiento, manejo, germinación y conservación ex situ de la especie. Colectamos
200 frutos maduros de cinco individuos presentes en un remanente de bosque montano en la provincia de
Loja– Ecuador. Se seleccionaron 50 cápsulas y evaluamos 13 rasgos morfológicos. Los resultados mostraron
que la especie posee cápsulas polispérmicas de 29 mm de largo x 9.5 mm de ancho con alta variación en
el número de semillas por fruto, pericarpio de consistencia leñoso con superficie fisurada. Las semillas
de C. officinalis están entre las más pequeñas del género Cinchona en Ecuador, son aladas de superficie
membranosa que terminan en pequeñas y finas puntas microscópicas semejantes a tricomas simples de
color café amarillento, miden un promedio de 5.1 mm de largo x 2.47 mm de ancho con un peso promedio de
3.30e-04 gramos por semilla. Embriones diminutos de color crema, foliados y espatulados con cotiledones
redondeados rodeados de endospermo. El largo del embrión mostró asociación significativa con el ancho
de las semillas y de los cotiledones.
PALABRAS CLAVES: Asociaciones morfológicas, Cinchona officinalis, conservación, especies
medicinales, morfología de semillas.
ABSTRACT.- Understanding the functional role of plant seed, fruits and embryos morphological traits is
essential in order to devise the ecological relevance of single species for the assembly of plant communities.
In the present study we generated information concerning qualitative and quantitative traits of Cinchona
officinalis L. seeds, fruits and embryo. A total of 200 mature fruits were collected from five individuals of
this species in a mountain forest of Loja province, southern Ecuador. Thirteen morphological traits were
evaluated in 50 capsules. Or results revealed that the species possesses polyspermic capsules with an
averaged length of 29 mm and an averaged width of 9.5 mm. There was a high variability in the number of
seeds per fruit. The fruits of the species have a pericarp of woody consistency and a fissured surface. The
C. officinalis seeds are within the smallest ones of the Chinchona genus in Ecuador. Seeds are winged with
a membranous surface and sharp endings that resemble trichomes. Seeds have an averaged length of 5.1
mm, an averaged width of 2.47 mm their average weight is of 3.30e-04 grams. The C. officinalis embryos are
tiny, foliated and spatulate with rounded cotyledons surrounded by endosperm. Embryos length showed
a significant association with seed and cotyledon width.
KEYWORDS: Cinchona officinalis, conservation, medicinal species, morphological associations,
morphology seeds.
INTRODUCCIÓN
Las semillas empiezan su desarrollo después de
que ha ocurrido la fertilización, momento en que se
iniciarán un sinnúmero de cambios morfológicos
y fisiológicos hasta alcanzar su maduración y
dispersión (Hay y Robert, 1995). Durante ese
período las semillas varían enormemente en su
tamaño, forma, estructura, morfología interna
y presencia de tejidos de almacenamiento
Frutos, semillas y embriones de Cinchona officinalis
Romero-Saritama
28
(Hartmann et al., 1997). El estudio de rasgos
funcionales y cambios morfológicos en especies
individuales es importante porque nos permiten
determinar la respuesta de las plantas a factores
ambientales (Lavorel et al., 2007), en cambio los
rasgos morfológicos en cápsulas podrían ayudar
a establecer su calidad (Romero-Saritama y
Pérez, en prensa), reconocer las especies en el
campo (Amorim, 1996), y proveer de información
importante para la germinación y conservación
de las semillas. Por ejemplo estudios realizados
en Trema micrantha concluyeron que los rasgos
morfológicos son una importante herramienta
para comprender los procesos germinativos de
esa especie (Amorim et al., 1997). El conocimiento
de rasgos morfológicos también contribuye a la
comprensión de la dinámica a nivel de poblaciones
vegetales (Donadio y Demattê, 2000), predecir el
ritmo de los procesos de las especies dentro de
los ecosistemas (Garnier et al., 2004; Laughli et al.,
2012) y en estudios taxonómicos de las especies.
En este sentido algunos autores como Gunn
(1981, 1984), Lima (1985, 1989), Oliveira (1999),
Kirkbride et al. (2003) y Tozzi y Meireles (2008) en
sus trabajos muestran la importancia de los rasgos
morfológicos en la taxonomía de leguminosas. En
cambio Martin (1946) utilizó rasgos morfológicos
para clasificar a las semillas, de acuerdo con el
tamaño y disposición del embrión dentro de la
semilla, clasificación que hasta la actualidad se
sigue utilizando como una referencia en estudios
de evolución, morfología y dormancia de semillas
(Forbis et al., 2002; Baskin y Baskin, 2004; FinchSavage and Leubner-Metzger, 2006).
Dentro de los rasgos morfológicos, el tamaño de
las semillas ha sido uno de los más estudiados y
su importancia radica en que ocupa una posición
pivotante en la ecología de las plantas al estar
asociado tanto con la capacidad de las especies
de dispersarse como al de establecerse en un
determinado sitio (Leishman et al., 1995; Alexander
et al., 2001). El tamaño de las semillas en algunas
especies ha significado que semillas grandes
produzcan plántulas más vigorosas en el sotobosque,
mientras que especies con semillas pequeñas
con rápida germinación, estarían adaptadas a la
colonización de nuevos espacios (Thompson, 2000).
La variación del tamaño de las semillas ha sido bien
estudiada en otras latitudes; sin embargo, en las
zonas tropicales son escasos estos estudios, más aún
para especies nativas o endémicas.
En países tropicales como Ecuador que posee una
alta biodiversidad, todavía una gran proporción
de especies vegetales aún no se describen
taxonómicamente, lo cual implica un esfuerzo
en generar información referente a los diferentes
REMCB 36 (2), 2015
componentes y rasgos de las especies. Con respecto
a investigaciones sobre rasgos morfológicos de
cápsulas de Cinchona officinalis L. no se conocen
estudios a detalle o al menos no se evidencian
reportes de ello. En Ecuador el género Cinchona
conocido como cascarilla y considerado “árbol y
la flor nacional del Ecuador” (Buitrón, 1999), está
compuesto por 12 especies, cuatro endémicas y
8 nativas (Jørgensen y León-Yánez, 1999) de las
cuales C. capulí está casi amenazada, C. rugosa y C.
lucumifolia vulnerable, C. mutisii en peligro crítico
(Cornejo y Jaramillo, 2011), y aunque C. officinalis
todavía no consta dentro del libro rojo de plantas
endémicas del Ecuador, su distribución es bastante
baja y restringida lo cual ha puesto a la especie al
límite de su desaparición (Madsen, 2002).
Las especies de Cinchona identificadas como
plantas medicinales distribuidas en la región andina
sudamericana (Valverde, 1998) han sido utilizadas
mundialmente como remedio contra la malaria y
desórdenes infecciosos por más de 300 años (Stell,
1982), lo que ha llevado a considerarlas como
plantas “salvadoras de la humanidad” (Buitrón,
1999). El uso de estas especies ha implicado que
sus poblaciones naturales bajen drásticamente
y en algunos de los casos estén amenazadas; por
ello es fundamental realizar trabajos que apoyen
su conservación in situ y ex situ. C. officinalis fue
la primera especie de cascarilla descrita por la
ciencia (Acosta-Solis, 1989), es un árbol o arbusto
que puede alcanzar unos 16 metros de altura
(Anderson y Taylor, 1994) perteneciente a la familia
Rubiaceae, descubierto y revelado por un indígena
de Loja a los virreyes españoles de Lima (Buitrón,
1999), considerándola endémica de la región sur
del Ecuador específicamente del valle de Loja
(Madsen, 2002; Garmendia, 2005), de donde se
reconoce proviene el producto de mejor calidad
(Buitrón, 1999). Sin embargo, también se la puede
encontrar distribuida en las provincias de Bolívar,
Chimborazo, Cañar, Azuay, Morona Santiago y
Zamora Chinchipe (Jørgensen y León-Yáñez, 1999).
Lamentablemente y a pesar de la gran importancia
comercial y medicinal que ha tenido el género
Cinchona, la sobreexplotación (Madsen, 2002) y
los graves problemas de deforestación, sin duda
han hecho que poblaciones de C. officinalis en
la provincia de Loja estén en riesgo y pongan en
peligro su sobrevivencia natural en el tiempo, por
esta razón el presente estudio tuvo como objetivo
generar información sobre rasgos morfológicos
cuantitativos y cualitativos del fruto, semillas y
embrión de C. officinalis que nos permitan identificar
parámetros y herramientas para mejorar el manejo,
germinación y conservación ex situ de la especie.
29
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección del material.- Se recolectaron 200
frutos maduros de cinco individuos de C. officinalis
en un remanente de bosque montano (Sierra, 1999)
ubicado a una altitud de 2 250 msnm en el sector
Zamora Huayco (4°01´51.8”S 79°10´30.8”W) de la
provincia de Loja al sur del Ecuador que corresponde
a la zona de amortiguamiento del parque Nacional
Podocarpus. La temperatura media anual es de
15.3º C; y un promedio de lluvia anual de 900
mm (Cañadas, 1983). El bosque montano del sur,
es un ecosistema en peligro de desaparecer, los
pocos remanentes se encuentran en lugares poco
accesibles por la pendiente fuerte y con un suelo
menos útil para la agricultura (MAE, 2012).
Análisis morfológicos.- Se seleccionó y midió una
muestra de 50 frutos en buen estado fitosanitario
y se determinó el número de semillas por fruto.
Los diferentes rasgos morfológicos cuantitativos
y cualitativos evaluados para frutos, semillas
y embriones se muestran en la tabla 1. Las
dimensiones del fruto y el grosor de las semillas se
midió mediante un calibrador electrónico Stainless
hardened de tres dígitos. Utilizamos el “software”
de acceso libre Imagen J (http://imagej.nih.gov/
ij/) para determinar el largo y ancho de 50 semillas.
Se realizaron cortes longitudinales y transversales
después de colocar las semillas en agua, durante
15 minutos, para identificar la presencia o ausencia
de endospermo, forma y tipo de embrión. La
longitud del embrión se determinó mediante el uso
de una rejilla milimetrada en un estereoscopio. La
nomenclatura usada para los diferentes caracteres
cualitativos se basó en Moreno (1984), Mauseth (1986)
y Vozzo (2005). El tipo de embrión fue de acuerdo
con la clasificación de Martin (1946) (Tabla 1).
Tabla 1. Rasgos cuantitativos y cualitativos medidos para
Cinchona officinalis
Rasgo Cuantitativos
Rasgo Cualitativos
Largo de frutos (mm)
Color de frutos
Ancho de frutos (mm)
Color de semillas
Ancho de semillas (mm)
Forma de semillas
Largo de semillas (mm)
Color de embrión
Peso de semillas (g)
Tipo de embrión
Largo de embrión (mm)
Presencia de endospermo
Ancho del cotiledón
Análisis de datos.- Se obtuvieron valores
estadísticos descriptivos para cada uno de los
rasgos cuantitativos y los resultados se graficaron
mediante “box plot”. Se establecieron asociaciones
entre rasgos cuantitativos con la prueba de
correlación Spearman (p < 005), adecuado para
variables que no se ajustan a una distribución
normal (Kent y Coker, 1992). Utilizamos el “Test de
Wilcoxon” para comparar el tamaño de las semillas
de C. Officinalis con otras especies del mismo
género distribuidas en Ecuador según información
bibliográfica generada por Andersson y Taylor
(1994), realizamos cluster utilizando distancia
euclidiana para identificar grupos de especies
con características similares según el tamaño de
las semillas. Todos los análisis estadísticos fueron
realizados en el entorno R (R Core Team, 2013).
RESULTADOS
Morfología de frutos.- El fruto de C. officinalis es
una cápsula septicida seca dehiscente polispérmica,
ovoide alargada que puede contener de 12 a 90
semillas, se separa longitudinalmente a través de
las ranuras carpelares desde la base al ápice del
fruto, originando dos valvas o lóculos (Figura 1). El
pericarpio es delgado pero leñoso de consistencia
dura, la superficie de forma fisurada color café a
marrón oscuro con presencia de diminutos tricomas
color blanco.
Como podemos observar en la figura 2, el largo de
los frutos puede variar entre 16 a 29 x 4.5 a 9.4 mm de
ancho. Encontramos que el 50 % de las mediciones
del largo se encuentran por debajo de la media (22.07
± Desviación estándar (DE) 3.04), mientras que solo
el 25 % de las mediciones del ancho estuvieron por
debajo de la media (7.37 ± DE 1.19 mm), presentando
así una asimetría negativa.
Caracterización de semillas y embrión.- Las
semillas presentan una forma fusiforme de testa
blanda con superficie membranosa con presencia
de alas muy frágiles que se rompen fácilmente
(Figura 3A) y terminan en pequeños tricomas
simples de color café amarillento. Semillas con
endospermo y embrión pequeño espatulado con
desarrollo rudimentario, tipo espatulado de color
blanco (Figura 3B).
El tamaño de las semillas de C. officinalis se
diferencia significativamente de las otras especies
de Cinchona distribuidas en Ecuador, sin embargo
posee afinidad con dos especies (Figura 4).
C. officinalis es una de las especies con semillas de
menor tamaño, que presenta un largo promedio
de 5.01 (± DE 0.60) x 2.46 (± DE 0.33) mm de ancho
(Figura 5) y grosor máximo de 1 mm. Las semillas
son livianas con un peso promedio de 3.30e-04 g
(DE: 0.0001). El embrión es bastante pequeño con
un promedio de 1.51 mm (± DE: 0.24) y puede
llegar hasta 1.85 mm de largo (Tabla 2).
Frutos, semillas y embriones de Cinchona officinalis
Romero-Saritama
30
A
Figura 2. Variación del tamaño de los frutos de C. officinalis. F= fruto
B
A
C
B
Figura 1. Frutos de C. officinalis en diferentes estados de
desarrollo. A.- Sección longitudinal del fruto inmaduro donde
se puede evidenciar las ranuras carpelares y los dos lóculos
(Lc) donde se forman las semillas. B.- Fruto seco en proceso de
dehiscencia separándose por las ranuras carpelares desde la
base al ápice del fruto. C.- Vista de un lóculo en un fruto abierto.
REMCB 36 (2), 2015
Figura 3. Características de las semillas de Cinchona officinalis. A
Parte exterior de las semillas. B Parte interna de las semillas. tes=
testa, end= endospermo, emb= embrión, sam= samara.
31
Figura 4. Dendograma y agrupación jerárquica de acuerdo con
el tamaño de las semillas del género Cinchona. El asterisco(*)
significa semillas de C. officinalis mediada en este estudio
Figura 5. Boxplot del tamaño promedio y distribución de
medidas de semillas de C. officinalis (n=50). Emb= embrión.
Tabla 2. Resultados comparativos (p< 0.05) del tamaño de las semillas de C. officinalis con el promedio de otros géneros
distribuidos en el Ecuador.
Especie
Largo (mm)
p valor
Ancho (mm)
p valor
C.officinalis
5.2
0.025
2.6
0.002
C.lancifolia
9.0
0.001
3.2
0.001
C.lucumifolia
5.3
0.025
2.4
ns
C.macrocalys
9.0
0.001
2.9
0.001
C.mutisii
6.7
0.001
3.3
0.001
C.parabolica
6.9
0.001
2.0
0.001
C.pubescens
7.7
0.001
2.5
ns
C.pitayensis
6.0
0.001
3.6
0.001
C.rugosa
8.5
0.001
3.3
0.001
C.villosa
5.2
0.025
1.9
0.001
ns = no significativo.
ancho de los cotiledones (S = 137, p-valor = 0.003).
No se encontraron asociaciones significativas entre
los demás rasgos estudiados.
Ancho cotiledones (mm)
Los resultados de las correlaciones entre rasgos
cuantitativos (Figura 6) mostraron que existe una
asociación entre el largo del embrión (S = 145,
p-valor = 0.033) con el ancho de las semillas y con
Figura 6. Correlación spearman (p= <0.05) entre rasgos en las semillas de Cinchona officinalis.
Frutos, semillas y embriones de Cinchona officinalis
Romero-Saritama
32
DISCUSIÓN
En la naturaleza podemos observar una diversidad
de adaptaciones de las plantas que les permiten
asegurar su dispersión y adaptación a diversos
lugares. En el caso de C. officinalis, la forma, el
tamaño y el peso de las semillas son rasgos que
están íntimamente relacionados con el tipo de
dispersión, permitiéndoles ser llevadas por el
viento. Las ventajas asociadas a este tipo de
dispersión y al tamaño pequeño de las semillas, han
sido relacionadas con la habilidad de alcanzar más y
mejores sitios de germinación (Peco et al., 2003). Sin
embargo, al ser las semillas pequeñas, estas aportan
poco al crecimiento de la nueva planta y dependen
muy pronto de los recursos disponibles en su
medio, por lo cual su riesgo de morir es muy alto
(Vásquez et al., 1997). Ante esta situación una de las
estrategias que poseen las plantas para sobrevivir
es producir muchas semillas (Parker, 1989). La
variación encontrada en el número de semillas por
fruto de C. officinalis también podría ser una ventaja
al momento de establecerse en un determinado
sitio, ya que los frutos que tienen varias semillas
muestran mayor probabilidad de contener por
lo menos una semilla madura, viable y que logre
sobrevivir (Dalling, 2002). Además, la variación
de semillas por fruto aparte de ser estrategia de
los sistemas de reproducción y establecimiento de
las diferentes especies (Parker, 1989), en algunos
taxones se presenta como una respuesta a la
asignación de recursos de la planta a las semillas,
las fluctuaciones en la disponibilidad de recursos,
hace que las plantas opten por modificar el número
de semillas antes que su peso (Haig y Westoby, 1988;
Garrido et al., 2005), y en C. officinalis la variación en
el número de semillas es alta.
Contrario a las ventajas de dispersión que
puede tener una semilla pequeña, el tamaño
que presentan las semillas de C. officinalis podría
significar una desventaja ecológica con respecto
a semillas grandes que dan a las plántulas más
recursos de cara a la germinación, establecimiento
y supervivencia de las plántulas (Jakobsson y
Eriksson, 2000; Susko y Lovett-Doust, 2000; Paz
y Martínez-Ramos, 2003; Alcántara y Rey, 2003),
esta podría ser una de las razones por las cuales
no se observa con frecuencia la germinación y
regeneración natural de C. Officinalis. Sin embargo,
una posible ventaja que presentan las semillas para
ayudar a su germinación es su tipo de testa, que
al ser blanda y membranosa puede absorber mejor
y mayor cantidad de agua para iniciar su proceso
germinativo, a diferencia de las especies con
semillas de testa dura que generan latencia física
impidiendo el paso del agua desde afuera hacia el
interior de las semillas (Baskin y Baskin, 2015).
REMCB 36 (2), 2015
Por otro lado, el tipo y tamaño pequeño del embrión
en las semillas de C. officinalis podría influir en el
tiempo y tasa de germinación. En estudios con
plantas del Mediterráneo y en algunas Apiaceas
mostraron una relación positiva entre la velocidad
y tasa de germinación con el tamaño del embrión
(Vivrette, 1995; Vandelook et al., 2012). Semillas con
embriones pequeños requiere un extenso período
de crecimiento del embrión antes de la germinación
(Baskin y Baskin, 1988; Vandelook, 2012). Por lo
tanto, una de las consecuencias que tendrían los
embriones pequeños que presentan las semillas
de C. officinalis sería el retraso en la germinación,
no solo porque el embrión deberá primeramente
crecer, sino que al estar rodeado por endospermo,
este también puede convertirse en una barrera para
el desarrollo de la radícula. En estudios con otras
especies se ha demostrado que el endospermos
genera cierta resistencia mecánica al crecimiento
del embrión (Baskin y Baskin, 2014; Yan et al., 2014),
por lo cual las semillas necesitan mayor tiempo
para germinar. La presencia de endospermo en las
semillas se considera un caracter primitivo en las
especies (Lee et al., 2012) con respecto a las semillas
sin endospermo.
CONCLUSIONES
•Los rasgos morfológicos determinados en
las cápsulas de C. officinalis podrían actuar
en forma complementaria generando en las
semillas ventajas y desventajas al momento de
dispersarse y germinar.
•Los rasgos como tamaño, peso y forma de
las semillas, podrían favorecer a C. officinalis
a encontrar nuevos y mejores sitios para
germinar y establecerse durante su dispersión,
sin embargo, rasgos internos en las semillas
podrían influir negativamente en el proceso
normal germinativo y podrían también requerir
tratamientos pregerminativos.
•Los rasgos morfológicos evaluados son
factores a tomar en cuenta al momento de
generar y ejecutar programas de conservación,
propagación y recuperación de esta especie por
medio de semillas.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo contó con el apoyo financiero por parte
del programa de becas SENESCYT 2008-2 y por
proyectos internos de la UTPL. A Javier Loayza
por el apoyo en la colección de semillas; a Janneth
Simaluiza por la revisión del manuscrito.
33
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Romero-Saritama
36
REMCB 36 (2), 2015
37
Celulasas presentes en el tracto digestivo del
camarón Litopenaeus vannamei
Claudia Segovia-Salcedo1, Alexandra Narváez-Trujillo 2, Fernando Espinoza-Fuentes3
Departamento de Ciencias de la Vida. Escuela Politécnica del Ejército.
Sangolquí, Ecuador. mcsegovia@espe.edu.ec
1
Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Escuela de Ciencias Biológicas,
Pontificia Universidad Católica del Ecuador. Quito, Ecuador. anarvaez@puce.edu.ec
2
3
Universidad Espíritu Santo. Guayaquil, Ecuador.
Recibido: 2015-08-07; aceptado: 2015-10-12
RESUMEN.- Las celulasas han sido clasificadas como endoglucanasas responsables de degradar celulosa,
lo que le proporciona gran importancia en los procesos de la cadena alimentaria. Las celulasas y enzimas
relacionadas son utilizadas ampliamente en varios procesos industriales. La celulosa es utilizada como
una fuente nutricional por varios organismos, inicialmente se pensaba que únicamente microorganismos
podrían degradarla, pero en la actualidad se ha encontrado celulasas en varios grupos de animales. En este
trabajo, presentamos la detección de celulasas en extractos obtenidos del camarón Litopenaeus vannamei.
En los ensayos se utilizaron individuos adultos y de los diferentes subestadios de L. vannamei colectados
en los estanques de cría de las camaroneras de la Península de Santa Elena y Muisne, en las provincias
de Santa Elena y Esmeraldas, respectivamente. Los hepatopáncreas, los estadios larvarios y los intestinos
fueron homogeneizados en un homogeneizador Braun-Melsungen. Para la identificación de la celulasa,
se utilizó como sustrato carboximetil celulosa (CMC) de mediana viscosidad. Para medir su actividad se
añadió ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS). La actividad de la celulasa se determinó en base en la cantidad
de los grupos reductores liberados. Para intentar determinar el origen sea endógeno o microbiano de las
celulasas identificadas, se sometieron las muestras de adultos a antibióticos.
En el subestadio zoea 3, se identificó una celulasa con un rango de pH óptimo entre pH 6.5 y pH 9.5. En las
muestras de hepatopáncreas del camarón adulto se determinaron dos pH óptimos: uno en el rango ácido (pH
4-6) y otro en el rango básico (pH 10-11) lo cual sugiere la presencia de dos celulasas diferentes. En el intestino
se observó actividad únicamente en el pH ácido (pH 4-6). La actividad celulolítica detectada en el desarrollo
ontogénetico del camarón fue baja e inestable, una condición reportada también en el análisis comparativo
de enzimas digestivas en otras cuatro especies de crustáceos. La actividad relativa de las dos enzimas del
hepatopáncreas es similar y cada una de estas tienen una actividad cuatro veces mayor a la encontrada en el
intestino. Estos resultados indican la presencia de dos celulasas presentes en el hepatopáncreas y se sugiere
que una de ellas (con pH óptimo ácido) podría ser transportada desde el hepatopáncreas al intestino, aunque
los datos no son concluyentes. En el caso de la celulasa con actividad a pH básico (10.5) puede tratarse de
una celulasa producida de manera endógena por el camarón. Los datos reportados en este estudio sobre las
capacidades de producción enzimática del camarón puede ser la base para futuros proyectos de investigación
cuyo objetivo sea optimizar los procedimientos de cultivo del camarón.
PALABRAS CLAVES: Celulasas, crustáceos, digestión, Ecuador, Litopenaeus vannamei.
ABSTRACT.- Cellulases have been classified as endoglucanases. This is the only enzyme capable of
degrading cellulose, which gives an immense importance in the processes of the food chain, being cellulose
the most abundant source of carbon on earth. Cellulases and related enzymes are widely used in various
industrial processes. Cellulose is used as a nutritional source for several organisms, initially it was thought
that only microorganisms may degrade this polymer however cellulases have been reported in many animal
groups. In this paper, we present the preliminary identification and characterization of cellulases in the shrimp
Litopenaeus vannameiduring its larval and adult stages. In adults and f different sub-stages of L. vannamei
were collected in culture tanks in comercial shrimp farms in the Santa Elena Peninsula and Muisne, in the
provinces of Esmeraldas and Santa Elena, respectively. The hepatopancreas, larval stages and intestines were
Celulasas en el camarón Litopenaeus vannamei
Segovia et al.
38
homogenized in a Braun-Melsungen homogenizer. Carboxymethyl cellulose (CMC) of medium viscosity was
used as a substrate. To measure enzymatic activity 3,5 dinitrosalicylic acid (DNS) was added. The cellulase
activity was determined based on the amount of reducing groups released. To try to determine the presence of
endogenous cellulases, that is produced by shrimp, samples were submitted to antibiotics and later assayed.
In sub-stage zoeal 3, a cellulase with an optimal pH range between pH 6.5 and pH 9.5 was determined.
In samples of adult shrimp hepatopancreas two optimum pH were determined: one in the acid range (pH
4-6) and one in the basic range (pH 10-11), while in the intestine only one in an acidic pH range (pH 4-6)
was determined. The cellulase activity detected in the ontogenetic development of the shrimp was low and
unstable, a condition also reported in the comparative analysis of digestive enzymes in four other species
of crustaceans. The relative activity of the two enzymes is similar in the hepatopancreas and each of these
have an activity four times greater than that found in the intestine. These results suggest the presence of two
possible cellulases, one could be transported from the hepatopancreas into the intestine but more tests are
needed to get more conclusive results. The cellulase activity at basic pH (10.5) may be a cellulase produced
endogenously by the shrimp. The data reported in this study of enzyme production capabilities shrimp can
be the basis for future research projects aimed at optimizing procedures shrimp farming.
KEYWORDS: Celullases, crustacean digestión, Ecuador, Litopenaeus vannamei
INTRODUCCIÓN
En los últimos 20 años el progreso en la ingeniería
genética de las enzimas y la tecnología de
fermentación, han permitido el desarrollo de
aplicaciones enzimáticas en las áreas industriales
que van desde la fabricación de detergentes más
eficientes y amigables con el ambiente, hasta
aplicaciones en la industria textil, del cuero, de
alimentos, cosméticos, productos médicos y
también como herramientas para proyectos de
investigación (Galante y Formantici, 2003). Esto ha
llevado a que el gasto en la utilización de enzimas
se cotice en varios millones de dólares a nivel
mundial y que los proyectos de investigación en
busca de nuevas enzimas aptas para ser utilizadas
en la industria se multipliquen (Beilen y Li, 2002).
Las celulasas han sido clasificadas en:
endoglucanasas, que se encargan de la destrucción
de los enlaces 1,4-β –glucosídicos actuando en la
hidrólisis en el interior de la cadena; luego están las
exo-celobiosas que son exoglucanasas, encargadas
de hidrolizar los enlaces 1,4- β- glucosidicos,
liberando celobiosa desde los extremos no
reducidos de la cadena de la celulosa; y celobiosas
conocidas también como β-glucosidasas, que
catalizan la hidrólisis del disacárido celobiosa
liberando a las glucosas (Henrissat, 1991; Lo Leggio
y Larsen, 2001; Byrne et al.,1999).
La hidrólisis de la celulosa se lleva a cabo de
diferente manera según la especie. En el caso de
algunos microorganismos aeróbicos se produce
una combinación de endo y exo- glucanasas,
que si bien atacan al sustrato individualmente
poseen una acción de sinergia entre ellas. Al
mismo tiempo se ha visto que algunos organismos
REMCB 36 (2), 2015
anaeróbicos, producen complejos multienzimáticos
extracelulares que se encargan de la hidrólisis de la
celulosa (Ohara et al., 2000; Calderón-Cortés et al.,
2012; Tanimura et al., 2012; Tuyub-Tzuc et al., 2014).
Para intentar consensuar esta difícil actividad
la Internacional Union of Biochemistry and
Molecular Biology (1992) sugiere que la hidrólisis
de los complejos celulósicos empiezan a degradarse
por acción de las endoglucanasas que rompen
los enlaces 1,4-β-glucosídicos lo cual reduce
significativamente el grado de polimerización de
la celulosa permitiendo que nuevos extremos de
cadenas queden expuestos y faciliten el acceso para
las exo-celobiasas que dan origen a unidades del
disacárido celobiosa, el cual será hidrolizado por la
enzima celobiasa originando moléculas unitarias
de glucosa (Hui et al., 2002).
La celulosa es utilizada como una fuente
nutricional por varios organismos, inicialmente
se pensaba que únicamente microorganismos
podrían degradarla pero en la actualidad se
ha encontrado celulasas en varios grupos de
animales. La tasa de absorción de nutrientes se
basa en la tasa del contacto de los nutrientes con
el epitelio intestinal. La inclusión de fibra en la
dieta, como en el caso de celulosa, está asociada
con mayor tiempo de permanencia del alimento
en el estómago lo que contribuye a la utilización
eficiente de proteína (Velurtas et al., 2011). De ahí,
que la formulación de cualquier dieta requiere de
una información detallada de los requerimientos
nutricionales y capacidades digestivas de las
especies. Los perfiles de actividad de las enzimas
digestivas han sido utilizados para determinar las
necesidades nutricionales de los crustáceos.
39
Las enzimas celulasas se encuentran en una amplia
gama de invertebrados como anélidos, moluscos,
equinodermos y artrópodos (Crawford et al., 2004).
Se ha demostrado que algunos invertebrados
son capaces de degradar celulosa, celulasas
microbianas pueden estar contribuyendo a los
niveles de actividad enzimática observados en el
sistema digestivo (Nakashima et al., 2002). En la
última década se ha generado información sobre
la presencia de celulasas en invertebrados, aunque
en su mayoría atribuida a microorganismos
simbiontes presentes en los tractos digestivos.
Fueron Watanabe et al. (1998) quienes reportaron
por primera vez la producción de una celulasa
endógeno en Reticulitermes speratus Kolbe
(Isoptera: Rhinotermitidae) y posteriormente
ha habido otras investigaciones que han
reportado celulasas endógenas en los órdenes
Blattaria, Coleoptera, Hymenoptera, Hemiptera,
Phthiraptera, and Orthoptera (Watanabe y
Tokuda, 2010). Una distinción importante es que
las celulasas endógenas de insectos se clasifican
como endoglucanasas, la mayoría de la familia de
la glicosil hidrolasas 9 (GHF9), mientras que las
celulasas de origen microbiano reportadas son endo
y exo- glucanasas y corresponden a otras familias
de GHF (Watanabe y Tokuda, 2010). Actividad de
celulosas ha sido detectada en langostas, cangrejos
y cangrejos de río (Pavasovic et al., 2004). Directa
evidencia de una secreción endógena de celulasa
en un crustáceo ha sido demostrada gracias a
estudios moleculares en el cangrejo rojo (Cherax
quadricarinatus) y la presencia de una secuencia
de cDNA de endo-1-4-β-glucanasa que se reporta
en el hepatopáncreas de este artrópodo (Byrne et
al.,1999; Tanimura et al., 2012).
En este trabajo, presentamos la identificación y
caracterización preliminar de las celulasas del
camarón Litopenaeus vannameien sus estadios
larvario y adulto.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de la muestra.- En los ensayos se
utilizaron camarones adultos y de los diferentes
subestadios de L. vannamei colectados en los
estanques de cría de las camaroneras de la Península
de Santa Elena y Muisne, en las provincias de Santa
Elena y Esmeraldas respectivamente.
En el caso de los adultos, se seleccionaron
especímenes con un promedio de 8.0 a 10.0 gramos
de peso corporal, con una curva de crecimiento
de 1.0 g/semana, que fueron alimentados con un
balanceado compuesto de 36 % de proteína.
En el lugar de recolección se extrajeron los
intestinos y hepatopáncreas mediante una incisión
en la parte dorsal del animal. Dichas muestras
fueron transportadas a 4° C hasta el Laboratorio
de Biotecnología de la PUCE-Quito para los
análisis respectivos.
En el caso de los subestadios larvarios, estos fueron
recolectados en laboratorios de cría de camarón
en la provincia de Santa Elena. Los subestadios
colectados fueron: Zoea 1, 2 y 3; Mysis 1, 2 y 3; y poslarva 1, 2 y 6. Los subestadios se clasifican según los
días desde la eclosión del nauplio (Fao, 2006), y con
esta base fueron clasificados por los laboratorios de
cría de camarón que proveyeron las muestras.
Preparación de los homogeneizados de
hepatopáncreas e intestinos.- El hepatopáncreas
fue homogeneizado con agua destilada a 4
grados centígrados en el laboratorio, se utilizó un
homogeneizador Braun-Melsungen de 5 mL de
capacidad con punta de teflón. Para extraer la grasa
del hepatopáncreas se procedió a dos procesos
sucesivos de centrifugación (el primero a 12 000 rpm
por 20 min, seguido por 3 000 rpm durante 20 min)
mediante una centrífuga refrigerada Sorvall RC-5b
(Lee et al., 1990). La grasa fue desechada y se extrajo
el sobrenadante, llevándola a una concentración de
4 animales/mL. De igual manera, los intestinos
fueron homogeneizados (Ultra-Turvax T25) y
filtrados por una malla de nylon con un poro de 250
micras. La solución fue diluida hasta llegar a una
concentración final de 6 animales/mL.
Preparación de los homogeneizados de los
subestadios.- Las muestras de los diferentes
subestadios
de
Litopenaeus
vannamei
se
homogeneizaron sobre hielo, en 16 mL de agua
destilada enfriada a 4° C, en un homogeneizador
Braun-Melsungen. Debido al reducido tamaño
de los animales en los diferentes subestadios
se homogenizó el animal completo (aprox. 4003 500 μm) (Rodgers et al., 2013). Los diferentes
homogeneizados se filtraron a través de una malla
de nailon con un poro de 250 micras. De esta
manera se obtuvo un preparado inicial, para cada
estadio, con una concentración de 40 a 50 animales/
mL, que se congeló a -20° C en alícuotas de 6 mL. El
homogeneizado inicial se diluyó hasta 5 veces según
la actividad enzimática en los diferentes estadios.
Cuantificación de proteína total.- La cuantificación
de proteína total en las muestras analizadas se la
realizó siguiendo el método de Bradford (1976), que
utiliza albúmina de huevo como muestra estándar
y métodos colorimétricos. Para preparar la proteína
patrón se disolvieron 6 mg de ovoalbúmina en 3
mL de agua destilada; esta solución de proteína
se diluyó diez veces. El colorante se preparó
Celulasas en el camarón Litopenaeus vannamei
Segovia et al.
40
disolviendo completamente 10 mg de azul de
Coomassie G en 5 mL de metanol, se añadieron 10
mL de ácido ortofosfórico (H3PO4) 85 % y se aforó a
100 mL con agua destilada. A cada tubo se le añadió
1 mL de colorante y después de 5 minutos se midió
la absorbancia contra un blanco de agua (100 μL)
sometido al mismo procedimiento anterior con
la utilización de un espectofotómetro Milton-Roy
Spectronic 301 (Absorbancia 595 nm).
Determinación del ph óptimo de celulasas y
cuantificación de la actividad enzimática.- En
el caso de los adultos y los subestadios previo
a la determinación de la actividad enzimática
se determinó el pH óptimo al cual la actividad
hidrolítica de la celulasa fue más evidente. Cada
ensayo se realizó en triplicado en un rango de pH
de 4.0 a 10.0, tomando intervalos de 0.5 unidades en
el caso de los subestadios y adultos, en este último
se amplió el rango básico hasta 11.0. Los valores de
pH en el rango de pH se lograron usando diferentes
tampones comunmente utilizados: citrato-fosfato
(pH 4.0-6.5), fosfato (pH 7.0-8.5) y glicina-NaOH
(pH 10.5-11). La concentración final de los tampones
fue de 0.05 M (Espinoza-Fuentes et al., 1984).
Se utilizó como sustrato carboximetil-celulosa
(CMC) de mediana viscosidad con una concentración
final de 0.5 %. Los tubos de reacción constaban, en
el caso de los adultos, de 0.2 mL de sustrato, 0.2
mL de tampón (0.2 M) a diferente pH (4.0-11.0) y
0.4 mL de extracto enzimático (hepatopáncreas
e intestino). En el caso de los subestadios, las
mezclas de reacción fueron de 0.5 ml de sustrato,
0.5 mL de tampón 0.2 M a diferente pH y 0.2 mL de
extracto enzimático (homogeneizado de camarón).
Los tubos fueron incubados en un baño maría a 30
grados centígrados por 30, 60, 90 y 120 minutos.
Para detener la reacción enzimática se adicionaron
0.4 ml de ácido 3.5 dinitrosalicílico (DNS), se agitó la
solución y se lo llevó inmediatamente a ebullición.
Los tubos fueron enfriados hasta temperatura
ambiente, se añadieron 0.4 mL de agua destilada en
el caso de los subestadios larvarios y 0.4 mL en el
caso de los adultos y se procedió a la cuantificación
por espectrofotometría. Para los ensayos se
establecieron muestras blancos en las cuales el
volumen correspondiente al extracto enzimático se
remplazó por el mismo volumen de agua destilada.
La absorbancia de las muestras se midió mediante
espectrofotometría a 540 nm contra una muestra
blanco de agua destilada sometida al mismo
tratamiento (Espinoza - Fuentes et al., 1984).
En la preparación del ácido 3-5 dinitro-salicílico
se disolvió 1 g de ácido 3-5 dinitro-salicílico en
20 mL de hidróxido de sodio (NaOH) 2 N; se
añadieron 50 mL de agua destilada para lograr una
buena disolución. Inmediatamente se añadieron
REMCB 36 (2), 2015
30 g de tartarato de sodio y se aforó a 100 mL. La
actividad de la celulasa se determina en función de
la cantidad de los grupos reductores liberados, la
coloración será más intensa mientras mayor sea la
actividad hidrolítica, y por lo tanto la absorbancia
detectada por espectrofotometría será mayor
(Espinoza - Fuentes et al., 1984).
Una vez determinados los valores de pH en los
cuales la absorbancia era mayor y por lo tanto el pH
óptimo para la actividad hidrolítica de la enzima,
se procedió a cuantificar la actividad enzimática
relativa expresada en términos de mUnidades
(mU/animal). Una unidad de enzima es la
cantidad de enzima que hidroliza una nanomol de
sustrato por minuto.
La concentración de enzima presente en las
muestras ensayadas se obtuvo relacionando la
pendiente de cada ensayo con el factor de absorción
del sustrato, la cantidad de enzima utilizada en mL
y el factor de dilución de la muestra para obtener
la actividad enzimática relativa en mU/mL. Una
vez cuantificada la cantidad de proteína para cada
muestra de extracto, la actividad específica (mU/
mg) se obtiene del cociente entre la actividad
relativa (mU/animal) y la concentración de proteína
total (mg/animal). Los ensayos de actividad
enzimática se realizaron en el pH determinando
para cada muestra y se utilizó CMC como sustrato,
tampón al pH óptimo y el extracto enzimático de
hepatopáncreas, intestino o del subestadio larvario.
Se utilizaron blancos de sustratos (sin extracto
enzimático) y de enzima (sin sustrato) a los cuales
se sometió al mismo tratamiento. Cada ensayo se
realizó por triplicado.
Actividad enzimática en camarones vivos adultos
en presencia de antibióticos.- Únicamente para
los camarones vivos adultos se realizaron ensayos
con (67) camarones vivos con un peso entre 8 y 10
g para eliminar la presencia de microorganismos
productores de celulasa. Los especímenes fueron
colectados y posteriormente transportados en
agua de mar para su cultivo en el Laboratorio de
Biotecnología de la Pontificia Universidad Católica
del Ecuador. Los camarones se mantuvieron en
peceras de 40 litros de agua con salinidad del 3 %,
a una temperatura de 22° C y aireación constante.
La alimentación usada fue balanceado comercial
con 36 % de proteína. En el tiempo cero del ensayo
se sacrificaron dos especímenes y se cuantificó
la presencia de celulasa en el hepatopáncreas.
Para descartar o evidenciar la presencia de
crecimiento microbiano se sembraron muestras de
hepatopáncreas en agar nutriente, medio selectivo
para Pseudomonas, TCBS (medio selectivo para
Vibrio), Cetrimide (selectivo para Pseudomonas),
Caseina Peptina y Sauboraud 2 % de glucosa
41
(hongos) y se los evaluó. A todos los medios se les
adicionó 3 % de sal (NaCl).
Determinación de dosis de antimicrobianos.Para eliminar en lo posible a los microorganismos
presentes en el cultivo del camarón y que podrían
estar contribuyendo a la actividad de celulasa
identificada, se realizaron pruebas de sensibilidad
con las bacterias aisladas del hepatopáncreas. Los
antimicrobianos ensayados fueron: eritromicina (30
mg), ácido oxalínico (10 mg) nitrofurantoína (50
mg), cloranfenicol (50 mg), tetraciclina (30 mg) y
sulfatrimetroprim (25 mg). El nivel de sensibilidad
se basó en la medición de halos de inhibición de
crecimiento bacteriano alrededor del disco de
antibiograma bajo el método de Bauer-Kirby (1966).
A partir de los resultados de las pruebas de
sensibilidad, se realizó un control de supervivencia
con un individuo, al cual se le colocó en una pecera
con 50 ppm del antimicrobiano de mayor sensibilidad
y 1 mL/L de albendanzol (antiprotozoo). Se repitió
la dosis cada seis horas en el caso de los antibióticos
y una vez al día con el albendazol. Se sacrificó
al individuo y se extrajo el hepatopáncreas para
comprobar el efecto de los antimicrobianos.
Posteriormente se realizó el mismo proceso con 20
camarones en un período de cinco días con la misma
frecuencia la frecuencia de administración de
antimicrobianos y albendazol para el control. Los
especímenes fueron sacrificados, su hepatopáncreas
fue extraído y se llevó a una concentración final
de 1.2 hepatopáncreas/mL (sin antibiótico) y 2.5
hepatopáncreas /mL (con antibiótico).
Este experimento se lo realizó nuevamente en
el laboratorio comercial AQUALAB S.A en la
península de Santa Elena con camarones adultos con
un promedio de 5 g con la finalidad de ensayar con
especímenes tratados previamente con probióticos
en las piscinas de crecimiento. Se utilizaron las
mismas concentraciones de antibióticos aplicadas
a los camarones en el Laboratorio de la PUCE. La
única diferencia fue el uso del quimioterapeútico
líquido Trifluralin con dosis de 10 ppm, dos veces
al día en lugar de albendazol. Los hepatopáncreas
fueron extraídos y homogeneizados según los
procedimientos anteriores con una concentración
final de 2.6 hepatopáncreas/mL (sin antibiótico) y
3.1 hepatopáncreas/mL (con antibiótico).
RESULTADOS
pH óptimo de celulasas en homogenizado de
subestadios larvarios.- Se tuvo dificultad en
determinar el pH óptimo de la actividad de
celulasa en los homogeneizados debido a un
comportamiento irregular de la enzima en los
ensayos en todos los estadios larvarios ensayados.
Para establecer la actividad en función del pH, se
eligió el estadio en el cual su actividad fue estable
y regular para la realización de los ensayos, en este
caso el subestadio zoea 3. En este subestadio se
determinó que el tiempo total de incubación óptimo
para cuantificar la actividad fue de 240 minutos en
cuatro intervalos de 60 minutos y se determinó un
rango amplio de pH - entre pH 6.5 y pH 9.5 - en
el cual se evidenció actividad celulásica (Figura 1).
Figura 1. Curva de pH óptimo de la enzima celulasa en el
subestadio Zoea 3 del camarón Litopenaeus vannamei. La
actividad de la celulasa se presenta en un rango de pH de 6 a 9.5
pH óptimo de celulasas en hepatopáncreas e intestino.En las muestras de hepatopáncreas de camarón
adulto se determinaron dos pH óptimos: uno en
el rango ácido (pH 4-6) y otro en el rango básico
(pH 10-11), mientras que en el intestino se observó
únicamente el pH ácido (pH 4-6). (Figura 2).
Figura 2. Curva de pH óptimo de la enzima celulasa en el
hepatopáncreas e intestino del camarón adulto Litopenaeus
vannamei
Cuantificación de la actividad enzimática.- El
registro de absorbancia después de los intervalos
de incubación con las mezclas de reacción fue
irregular por lo cual, a pesar de tener evidencia de
Celulasas en el camarón Litopenaeus vannamei
Segovia et al.
42
actividad de celulasa no se cuantificó la actividad
relativa de la celulasa en los estadios larvarios. El
subestadio en el cual se evidenció mayor estabilidad
de la actividad fue el subestadio zoea 3. En todos
los ensayos la actividad de la enzima fue baja.
Los datos de cuantificación de actividad enzimática
de las muestras en sus pH óptimos se reportan
en la tabla 1. La actividad relativa (mU/animal)
nos indica que la actividad de las dos especies
enzimáticas (pH 5 y pH 10)) en el hepatopáncreas
es similar, indicando que las dos podrían ser
producidas en este órgano; la actividad de la
especie enzimática del intestino es tres veces menor
a las del hepatopáncreas. Al determinar la actividad
en función de la cantidad de proteína presente
en la muestra (actividad específica) se observa
una mayor actividad de la enzima en el intestino
que las dos presentes en el hepatopáncreas. Esto
sugiere que en el intestino la actividad detectada
podría ser la suma de la actividad de la enzima del
hepatopáncreas (pH 5) que viaja al intestino y la
actividad celulásica del aporte de microorganismos
asociados al intestino. Esta observación se respalda
por los ensayos realizados con el camarón cultivado
en el Laboratorio de Biotecnología de la PUCE
como en el laboratorio comercial en la Península
de Santa Elena, en los cuales la actividad específica
de la celulasa es mayor en las muestras tratadas
con antimicrobianos con relación a las muestras
no tratadas, lo cual indica que sí hay un aporte de
parte de microorganismos asociados en cuanto a la
actividad de celulasa en el camarón.
Análisis microbianos.- Después de 24 horas
de cultivo se observó crecimiento bacteriano en
Agar nutriente, cetrimide, TCBS agar, y en el agar
selectivo para Pseudomonas. En los antibiogramas,
los antibióticos de mayor sensibilidad fueron
nitrofurantoína y ácido oxalínico.
DISCUSIÓN
La nutrición de los organismos marinos es esencial
para una acuacultura rentable, por lo cual los
tipos y las propiedades de las enzimas digestivas
del camarón definen las capacidades digestivas
y por tanto sugieren los ingredientes que deben
ser incluidos en las dietas para reproducir las
condiciones de la alimentación de los crustáceos en
condiciones naturales. Sin embargo, el proceso de
elaboración de dietas, en la mayoría de los casos,
no ha incluido información sobre las condiciones
fisiológicas y bioquímicas del camarón (NarváezTrujillo, 1990). Las especies de camarones son
omnívoros con amplias capacidades bioquímicas
para poder degradar las fuentes de energía de su
ambiente natural. El principal recurso energético
de este crustáceo es la proteína seguido por
los carbohidratos como energía metabólica.
Adicionalmente necesita lípidos como elementos
fundamentales en la función y estructura celular
(Gaxiola et al., 2006).
Los metazoos son capaces de digerir la celulosa
gracias a la presencia de microorganismos
simbiontes (bacterias, hongos y protozoos) que
proporcionan a sus hospederos habilidades
digestivas adicionales (Hood, 1971; Cutter y
Rosenberg, 1971; Mangrove, 1988; Byrne et al.,
1999). El modelo enzimático más conocido se
basa en el sistema de hongos donde se demuestra
su complejidad basada en acciones poligénicas,
conjuntos multienzimáticos y estructuras mixtas
formadas entre celulasas y proteínas, glicoproteínas
o polisacáridos (Eveleigh, 1987).
En el caso de crustáceos, el proceso digestivo se lleva
a cabo en el hepatopáncreas y en el intestino medio
con funciones y actividades diferentes en dichos
órganos. La celulasa actúa en la digestión primaria
Tabla 1. Actividad relativa (mU/animal) y específica (mU/mg) de celulasas en las muestras de adulto analizadas*
MUESTRAS
mU/Animal
mU/mg
Hepatopáncreas (pH 5)
30.5±2.8
5.9
Hepatopáncreas (pH 10.5)
33.3±5.0
6.4
Intestino (pH 5)
8.3±0.6
8.9
Hepatopáncreas con tratamiento antimicrobiano
88.8±13.4
12.5
Hepatopáncreas sin tratamiento antimicrobiano
140.9±6.0
34.9
Hepatopáncreas con tratamiento antimicrobiano
11.0±2.0
1.9
Hepatopáncreas sin tratamiento antimicrobiano
25.2±0.5
2.8
Muestras sin tratamiento
Muestras tratadas en el Laboratorio de Biotecnología
Muestras tratadas en las Camaroneras de Sta. Elena
*Se reporta la media de tres determinaciones.
REMCB 36 (2), 2015
43
iniciando su actividad en el hepatopáncreas para
posteriormente volver a activarse en el intestino
medio. En insectos se ha propuesto una recirculación
de enzimas que puede ser aplicado también a los
crustáceos (Espinoza-Fuentes et al., 1984)
La actividad celulolítica detectada en el desarrollo
ontogénetico del camarón fue baja e inestable,
una condición reportada también en el análisis
comparativo de enzimas digestivas en cuatro
especies de crustáceos incluyendo dos especies de
Penaeus realizada por Luqing (1997). A pesar de
evidenciar actividad celulolítica, la inestabilidad en
la actividad a lo largo del tiempo de desarrollo de los
ensayos y la baja actividad observada no permitió
cuantificar la actividad relativa. El pH óptimo
determinado en el rango de 6.5 a 9.5 sugiere que
puede haber una mezcla heterogénea de enzimas
por un origen múltiple de los extractos obtenidos
considerando que en los tanques de cultivo hay
larvas provenientes de nauplios desovados a partir
de diferentes hembras ovadas; por otro lado, este
amplio rango de pH observado puede indicar la
presencia de enzimas producidas por la larva y/o
por microorganismos asociados, a pesar del uso
y aplicación de antibióticos en los tanques de cría
(Narváez-Trujillo, 1990).
En el caso del adulto, se encontró actividad
enzimática para celulasas a dos pHs: 5.0 y 10.5 en el
hepatopáncreas y de pH 5.0 en el intestino (SegoviaSalcedo, 1996). La actividad relativa (mU/animal)
de las dos enzimas del hepatopáncreas es similar
y cada una de estas tienen una actividad tres
veces mayor a la encontrada en el intestino. Estos
resultados sugieren la presencia de dos posibles
celulasas, una de ellas podría ser transportada
desde el hepatopáncreas al intestino. Los datos
de actividad de celulasa con un rango ácido
concuerdan con lo observado en estadio larvario
(Narváez-Trujillo, 1990). Una alternativa a esta
interpretación es que hay la producción de una
celulasa en el hepatopáncreas que tiene dos rangos
de pH para su actividad, en este caso aún se sostiene
la posibilidad que la enzima del hepatopáncreas se
movilice al intestino y actúe a un pH más ácido que
la del hepatopáncreas. En ninguno de los dos casos
se invalida la participación de actividad celulásica
por parte de microorganismos asociados como
sucede en otros crustáceos (Zimmer et al., 2002).
Celulasas de origen fúngico y microbiano presentan
actividad enzimática dentro de los rangos
encontrados en el intestino (pH 5) (Wang et al., 1994;
Guillén et al., 1987; Kaya et al., 1994; Copa-Patiño et
al., 1987; Espinoza-Fuentes et al., 1984; Tuyub-Tzuc
et al., 2014). Adicionalmente, la actividad enzimática
de los extractos provenientes de los organismos
tratados con antimicrobianos, antifúngicos y
antiprotozoarios disminuyó en relación a las
muestras no tratadas (Tabla 1) apoyando la
hipótesis que la celulasa activa a pH ácidos (pH 4-6)
puede tener un origen fúngico o microbiano. Estos
resultados concuerdan con los datos de bacterias
aisladas del tracto digestivo de Penaeus aztecus que
describen a una o más celulasas junto con lipasas,
amilasas y quitinasas (Dempsey y Kitting, 1987).
Esta capacidad multienzimática sugiere un alto
potencial de degradación por parte de estas colonias
microbianas. Pero su funcionalidad va a estar
restringida a las condiciones ambientales del tracto
digestivo (pH, niveles de oxígeno, disponibilidad
de nutrientes (Tuyub-Tzuc et al., 2014).
En el caso de la celulasa con actividad a pH básico
(10.5) puede tratarse de una celulasa producida de
manera endógena por el camarón. Estos datos son
apoyados por lo encontrado por Byrne et al. (1999)
que identificó el cDNA de una endo-1,4-betaglucanasa de 469 aminoácidos, denominada CqEG,
generada en el hepatopáncreas del crustáceo Cherax
quadricarinatus. Este gen es similar en estructura a
los encontrados en los genes de endoglucanasas
funcionales de cucarachas y termitas (Watanabe y
Tokuda, 2001). Estudios de comparación genética
han identificado a estos genes pertenecientes a la
familia de glicosil hidrolasas (GFH) 9 celulasas
(Byrne et al., 1999) similares a los encontrados en
termitas lo cual sugiere un origen común entre las
células de insecto con la de crustáceos. Es posible
que las enzimas de celulasas hayan evolucionado
en diferentes linajes de los crustáceos en relación
con sus preferencias alimenticias principalmente
en los herbívoros (Crawford et al., 2004).
Las evidencias observadas en este estudio favorecen
la combinación de enzimas celulósicas endógenas
y simbióticas para la digestión de la pared celular
vegetal en L. vannamei. La participación cooperativa
de celulasas de diferentes fuentes (simbiontes
y hospederos) con diferentes características
enzimáticas proveen de un mecanismo exitoso de
digestión de dietas ricas en celulosa (Tanimura et al.,
2012). De igual manera debemos tomar en cuenta
que la composición de la flora bacteriana varía con
la dieta ya que un porcentaje de microorganismos
ingresan al tracto digestivo con la comida. De ahí,
la importancia de estudios más profundos sobre la
comunidad microbiana permanente y la itinerante
asociada al camarón y las capacidades enzimáticas
de cada una de ellas. Este estudio no descarta la
posibilidad que las fuentes de celulasas no sean
efectivamente de microorganismos resistentes a los
antimicrobianos utilizados.
Celulasas en el camarón Litopenaeus vannamei
Segovia et al.
44
Los datos reportados en este estudio sobre
las capacidades de producción enzimática del
camarón pueden ser la base para futuros proyectos
de investigación cuyo objetivo sea optimizar
los procedimientos de cultivo de camarón. La
identificación de altos niveles de actividades
de carbohidrasas como las celulasas sugiere la
presencia de materiales vegetales en la dieta
de L. vannamei, lo cual está relacionado con la
presencia de algas como fuente alimenticia en estos
invertebrados filtradores.
Estudios específicos
son necesarios para definir formulación de dietas
específicas para el camarón considerando tanto
la microbiota como las enzimas endógenas del
sistema digestivo. Futuras investigaciones en estas
áreas pueden reducir los costos de producción y
mejorar los niveles de digestión de las dietas.
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Celulasas en el camarón Litopenaeus vannamei
Segovia et al.
46
REMCB 36 (2), 2015
47
Tratamiento de un efluente derivado de una planta
procesadora de pieles para extracción de gelatina
mediante la tecnología de ficorremediación
Diana Ontaneda Andrade1, Mabel Cadena Zumárraga2, Ana González 2,
Ever Morales Avendaño3*
Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Central del Ecuador.
1
Departamento de Ciencias de la Vida y Agricultura, Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE.
2
3
Proyecto Becas Prometeo-SENESCYT. evermster@gmail.com
Recibido: 2015-08-02; aceptado: 2015-09-03
RESUMEN.- Entre las alternativas de tratamiento biológico de aguas residuales de curtiembres, se
propone la ficorremediación para la reducción de la carga contaminante del efluente y producción de
biomasa microalgal. Se evaluó la eficiencia de remoción de N, P, DQO, DBO5, SO4-2 y sólidos en un efluente
de curtiembre derivado del procesamiento de pieles para extracción de gelatina, mediante un consorcio
con las microalgas Desmodesmus sp. y Chlorella sp. Para dicho estudio se aplicó un diseño experimental de
bloques al azar. Dicho experimento se realizó en contenedores con 15.0 L del efluente (50 %) inoculado con
dicho consorcio a una densidad celular de 0.70 x106 cel.ml-1. Mientras que, en el control solo contuvo el
efluente. Ambos tratamientos, con 5 repeticiones fueron mantenidos en condiciones externas de laboratorio
en cuanto a iluminación solar y temperatura durante 25 días. El efluente inicial presentó una concentración
de sulfatos, DBO5, DQO, P y N de 570 mg.l-1, 6 200 mg.l-1, 11 825 mg.l-1, 4.9 y 612 mg.l-1; respectivamente.
En el tratamiento con el consorcio se alcanzó el crecimiento más elevado de 14.0 x106 cel.mL-1 a los 18 días.
No hubo diferencia significativa entre el control y el efluente con el consorcio en cuanto a la remoción
de sulfatos, DQO, P y N, cuyos máximos se produjeron entre 78 % y 89 % a los 15 días de realizado el
experimento. La biomasa microalgal obtenida al final del experimento, reportó un 8.45 %; 21.0 %; 6.68 %;
32.23 %; 7.75 % y 23.89 % de humedad, proteína, grasa, cenizas, fibra y carbohidratos, respectivamente.
Ambos tratamientos fueron efectivos para la remoción de contaminantes del efluente. No obstante, con la
aplicación de la tecnología de la ficorremediación se genera adicionalmente biomasa microalgal con una
excelente calidad nutricional para ser utilizada como complemento alimenticio animal.
PALABRAS CLAVES: biomasa, consorcio microalgal, curtiembre, DBO5, ficorremediación.
ABSTRACT.- Among the alternatives for biological treatment of tannery wastewater, the
phycoremediation for reducing the pollution load of the effluent and microalgal biomass production it is
proposed. The removal efficiency of N, P, COD, BOD 5, SO4-2 and solids in tannery effluent derived from
fur processing to extract jelly, through a consortium with Desmodesmus sp. and Chlorella sp. microalgae
was evaluated. The study was applied to an experimental randomized block design. This experiment was
carried out in containers with effluent 15.0 L (50 %) inoculated with the consortium to a cell density of 0.70
x106 cel.ml-1. While in control only contained the effluent. Both treatments, with 5 replicates were kept in
conditions outside laboratory for solar lighting and temperature for 25 days. The initial effluent presented
a concentration of sulfates, BOD 5, COD, P and N of 570 mg l-1, 6 200 mg.l-1, 11 825 mg l-1, 4.9 and 612 mg l-1;
respectively. In the treatment with the highest growth consortium of 14.0 x106 cel.mL-1 was reached after
18 days. There was no significant difference between the control and the effluent with the consortium
regarding the removal of sulphates, COD, P and N, whose maximum occurred between 78 % and 89 % at
15 days carried out the experiment. The microalgal biomass obtained at the end of the experiment, reported
a 8.45 %; 21.0 %; 6.68 %; 32.23 %; 7.75 % and 23.89 % moisture, protein, fat, ash, fiber and carbohydrates,
respectively. Both treatments were effective in removing contaminants from the effluent. However, the
application of technology phycoremediation microalgal biomass is also generated with excellent nutritional
quality to be used as an animal feed supplement.
KEYWORDS: biomass, BOD5, microalgal consortium, phycoremediation, tannery.
Ficorremediación de un efluente de curtiembre
Ontaneda et al.
48
INTRODUCCIÓN
Entre las tecnologías aplicadas en los procesos de
depuración de efluentes se utilizan los tratamientos
físicos, químicos y biológicos, según de la carga
orgánica, compuestos recalcitrantes
y de la
capacidad de remoción del tratamiento al cual se
somete al agua (Lofrano, 2013). La ficorremediación
constituye un tipo de tratamiento biológico en el
cual se utilizan microalgas y/o cianobacterias para
la remoción, biotransformación y reutilización de
contaminantes dentro del agua (Rawat et al., 2011;
Kotteswari et al., 2012; Bhatnagar y Kumari, 2013).
Asimismo, se caracteriza por presentar ventajas
sobre métodos físico-químicos convencionales; tales
como intercambio iónico, ósmosis inversa, diálisis y
electro-diálisis, adsorción con carbón activado, y la
reducción química o la oxidación, debido a su eficacia
de eliminación, aprovechamiento de nutrientes
y el bajo costo de su aplicación y mantenimiento
(Hanumntha et al., 2011; Olguín et al., 2013).
Las microalgas Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcum,
Desmodesmus, Oocystis, Oedogonium y Scenedesmus,
conjuntamente con la flora bacteriana asociada
han sido utilizadas en estudios de biorremediación
de aguas residuales por su capacidad de asimilar
una elevada concentración de nitrógeno, fósforo y
reducir la DQO y DBO5, a partir de efluentes urbanos,
porcinos, de plantas procesadoras de alimentos,
textileras, extractoras de aceite de palma, curtiembres
(Sivasubramanian et al., 2014; Chacón et al., 2004).
En Ecuador la mayor parte de las empresas
procesadoras de pieles para extracción de gelatina
y de curtiembres para calzados y accesorios,
generan sus efluentes a cuerpos de agua, sin
ningún tratamiento previo, lo cual ha provocado
una gran cadena de contaminación (Muñoz,
2011), caracterizada por la presencia de sustancias
químicas orgánicas e inorgánicas provocando así,
una acelerada eutrofización debido al exceso de
fosfatos y nitratos, incrementando la demanda
de oxígeno (DO) y la demanda biológica de
oxígeno (DBO), causando consecuencias graves
en los sistemas acuáticos y en la salud humana
(Tayupanda, 2010; Cerón, 2011). En tal sentido, se
proponen alternativas como la ficorremediación
a fin de recuperar la calidad de aguas residuales
afectadas por el tratamiento con pieles de bovinos.
En el presente trabajo, se utiliza un consorcio de
las microalgas Desmodesmus sp. y Chlorella sp.,
para el tratamiento de aguas residuales de una
planta procesadora de pieles para extracción de
gelatina, con la finalidad de remover el exceso
de N, P, DQO, DBO y sulfatos, y a la vez obtener
biomasa microalgal con factibilidad de ser
utilizada como complemento alimenticio animal o
como fertilizante.
MATERIALES Y MÉTODOS
Área de estudio.- Los muestreos de efluentes se
realizaron en una curtidora ubicada en el barrio
Totoras, parroquia de Cevallos, provincia de
Tungurahua, Ecuador y comprendida entre las
coordenadas 1°21´16,52” S y 78° 36´56,84” E y a una
altura de 2 984 msnm. Las muestras del efluente
fueron colectadas de forma manual en 10 envases
plásticos con volumen de seis litros procedentes
del tambor donde se descarga el agua de las caretas
del ganado vacuno, con alto contenido de sulfatos
y del sedimentador que son las aguas residuales
resultado de toda la producción de la planta
Figura 1. Esquema del diseño experimental aleatorizado de la fase de tratabilidad del efluente al 50 % (v/v) con un consorcio de las
microalgas Desmodesmus sp. y Chlorella sp. y con el control, cada uno con cinco réplicas.
REMCB 36 (2), 2015
49
procesadora de cuero para la extracción de gelatina.
Las muestras de 50 litros del efluente fueron
mantenidas en envases de plástico medianamente
tapadas hasta su uso para el ensayo de tratabilidad.
realizado con una mezcla de acetona: metanol (2:1)
y cuantificados mediante las ecuaciones propuestas
por Jeffrey y Humphrey (1980) y Strikland y Parsons
(1972) respectivamente.
Producción del consorcio microalgal.- El consorcio
conformado por las microalgas Desmodesmus sp. y
Chlorella sp., fue previamente evaluado en la fase
de factibilidad, destinada a evaluar la capacidad
de crecimiento a las concentraciones del efluente
al 10, 25 y 50 % (v/v). Este experimento con un
volumen de tres litros fue realizado mediante un
diseño completamente al azar (DBCA) con tres
tratamientos y tres repeticiones por tratamiento.
Estos cultivos discontinuos fueron enriquecidos
con el fertilizante comercial Nitrofoska (1.0 mL-l), y
mantenidos con agitación manual periódicamente
y sin aireación. De acuerdo con los resultados
obtenidos, el consorcio logró el mayor crecimiento
con el efluente al 50 % (v/v), por lo tanto se seleccionó
dicha concentración para el estudio de tratabilidad.
En cuanto al consorcio, este fue escalado hasta un
volumen de cinco litros a fin de ser utilizado como
inóculo en la prueba de tratabilidad.
Análisis físico-químico de efluente.- A partir del
efluente tratado se tomaron muestras al día 0, 5,
10, 15, 20 y 25 de iniciada la fase de tratabilidad.
Para ello se tomaron submuestras de 250 ml
a partir de cada uno de los cinco tratamientos
correspondientes al efluente+consorcio y al control.
Estas fueron mezcladas para obtener 2.0 L de cada
tratamiento y luego centrifugadas para obtener el
sobrenadante como producto real para análisis de
sulfatos, DBO5, DQO, Fósforo total y Nitrógeno total
y según los métodos: Hach 8025-PEE/ANNCY 28,
APHA 4500 SO4 E-PEE/ANNCY 20, APHA 5210
D- PEE/ANNCY23, APHA 5220 D- PEE/ANNCY
03, APHA4500-P B-E- PEE/ANNCY/55, HACH
8075-PEE/ANNCY/56.
Fase de tratabilidad.- Para la fase de tratabilidad
se utilizaron cinco tinas de plástico de 40x30x20
cm con 15 L del efluente al 50 % (v/v), tanto para el
tratamiento con el consorcio como para el control,
no inoculado (Figura 1).
Este bioensayo fue iniciado con la adición del
consorcio con una densidad celular equivalente
a 0.7x6 cel.mL-1. Ambos tratamientos fueron
mantenidos durante 23 días en época de verano en
la terraza del edificio de cuatro niveles de la Unidad
de Biología de la Universidad Central del Ecuador,
a temperatura ambiente (entre 20±5° C durante
el día y de unos 12±2° C durante la noche. Las
unidades de experimentales fueron aleatorizadas
de acuerdo con el programa Microsoft Excel (Lara,
2001) y agitadas manualmente unas 12 veces al
día. El volumen perdido por evaporación era
restituido con agua potable y para lo cual, también
se colocó una tina de 15.0 L con agua potable, a fin
de determinar el volumen de evaporación de los
tratamientos durante el día.
El crecimiento del consorcio en el efluente fue
monitoreado cada tres días, mediante recuento celular
con una cámara de Neubauer (Guillard y Sieracki,
2005). Para la comparación de crecimiento del
consorcio Chlorella sp., y Desmodesmus sp., se aplicó
como diseño experimental un análisis de varianza
Anova (Di Rienzo et al., 2012). Mientras que, para
la determinación de clorofila y carotenoides fueron
colectados de cada tina con el efluente inoculado unos
2 ml por dos repeticiones. El método de extracción fue
El porcentaje de remoción fue determinado a partir
del valor inicial obtenido de cada variable con
respecto al detectado cada cinco días hasta finalizar
con el día 25 (Romero et al., 2009).
Análisis proximal de la biomasa microalgal.- La
biomasa obtenida al final de la fase de tratabilidad
fue sometida a sedimentación mediante la
aplicación de un floculante comercial a base de
quitosano, luego esta fue concentrada, lavada
varias veces para retirar el efluente remanente y
secada en una estufa a 70° C (Andrade et al., 2009).
El análisis proximal fue realizado a la biomasa
seca y se determinó el contenido porcentual
(%, p/p) de humedad, proteína, grasa, ceniza y
fibra de acuerdo con el método INEN (Instituto
Ecuatoriano de Normalización) 518, 519, 523, 520,
522. Mientras que, el contenido de carbohidratos o
extracto libre de nitrógeno, se determinó al restar
100 % menos los resultados de proteína, extracto
etéreo, fibra y ceniza. El contenido de calorías
(Kcal/100g) se obtuvo a partir de multiplicar el
porcentaje de carbohidratos y proteínas por 4 Kcal
y el porcentaje de grasa por 9 Kcal (Livesey, 1995;
Benítez et al., 2008).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Crecimiento del consorcio.- El crecimiento de las
microalgas Desmodesmus sp. y Chlorella sp., fue
evidente desde el primer día del ensayo, por lo
cual se observó en ambas un incremento constante
de la densidad celular. Chlorella sp. alcanzó el
mayor crecimiento al final de la fase exponencial
con 7.8x106 cel.ml-1, mientras que, Desmodesmus sp.
presentó una fase exponencial más prolongada,
Ficorremediación de un efluente de curtiembre
Ontaneda et al.
50
hasta el día 21 con 9.48x106 cel.mL-1, y hasta decaer
conjuntamente con Chlorella sp. a los 23 días con
valores similares de densidad celular, de 3.76 y
3.5x106 cel.mL-1 respectivamente (Figura. 2).
Figura 2. Crecimiento (x106 cel.ml-1) del consorcio conformado
por las microalgas Desmodesmus sp. y Chlorella sp. en el
efluente al 50 % (v/v), en relación al tiempo de desarrollo del
experimento de tratabilidad.
Siendo estos valores no
significativamente
diferentes (p>0.005). Estos resultados también
reflejan que en la fase de tratabilidad del
efluente, el mayor aporte en cuanto al proceso
de biorremediación lo expresa Chlorella sp. entre
los días 6 y 12. En cambio, Desmodesmus sp.
sustituye a Chlorella sp. entre los días 15 y 21 de
iniciado el bioensayo. Además, cuando se analiza
el crecimiento conjunto del consorcio ChlorellaDesmodesmus, durante los 23 días de la fase de
tratabilidad (Figura 3).
Figura 3. Crecimiento (x106 cel.ml-1) conjunto del consorcio
microalgal: Desmodesmus sp. – Chlorella sp. en el efluente al 50 % (v/v)
en relación al tiempo de desarrollo del experimento de tratabilidad.
Se evidencia una fase exponencial entre los días 3
y 12 y una tendencia estacionaria a partir del día
12 hasta el día 21, en la cual se exhibió la mayor
densidad celular de 14.0x106 cel.mL-1.
En relación con el control, se observó a los 9 días de
iniciado el ensayo de tratabilidad un crecimiento
reducido del consorcio microalgal, con el valor
más elevado para Desmodesmus sp. de 2.56x106 cel.
mL-1 en el día 9 y estabilizándose a partir del día
21, con 1.14 x106 cel.ml-1. En cambio, el crecimiento
Chlorella sp. apenas obtuvo una densidad celular de
0.58x106 cel.mL-1 en el día 9 y de 0.75x106 cel.mL-1,
también a partir del día 21. Esto significa que el
consorcio logra crecer en el efluente no inoculado,
en virtud que a concentraciones del efluente
REMCB 36 (2), 2015
inferiores a un 70 %, se presentan condiciones
aptas para ser utilizadas como medio de cultivo. En
cambio, a elevadas cargas orgánicas del efluente se
induce un efecto inhibitorio e incluso tóxico para
el crecimiento de microorganismos, incluyendo
a los fotosintéticos. Además, al ser mantenidos
estos efluentes diluidos en condiciones externas
de laboratorio, son susceptibles de ser colonizadas
por estos microorganismos. Se ha descrito que,
en estanques pocos profundos entre 30 y 60 cm
con efluentes y a cielo abierto en presencia de la
luz natural, se favorece el crecimiento microalgal,
generándose una interacción exitosa entre las
microalgas y las bacterias presentes, de tal forma
que se inicia el consumo de nutrientes de estos
reservorios (Malgas, 2013).
Tanto las microalgas Chlorella como Desmodesmus
ó Scenedesmus han sido utilizadas en diversos
estudios dada su facilidad de crecimiento y
adaptación a diferentes tipos de efluente. (De Godos
et al., 2010) evaluaron diferentes consorcios con
Scenedesmus, Chlamydomonas, Microspora, Oocystis,
Chlorella y Nitzschia; otro con Chlorella sorokiniana
y Scenedesmus obliquus y por último un consorcio
solo con varias cepas de Chlorella. Otros trabajos
han descrito con la aplicación de un consorcio
conformado por Chlorella vulgaris, Scenedesmus
quadricauda, Scenedesmus dimorphus y Arthrospira
platensis con la finalidad de evaluar el efecto de
la iluminación, temperatura, filtrado del efluente
porcino, profundidad del biorreactor, aireación,
CO2 y duración del período de estudio.
De acuerdo con estos resultados, se observó que el
consorcio siempre se mantuvo tanto en el efluente
inoculado como en los controles, y sin la presencia
de otro tipo de microalgas. Adicionalmente, se
destaca que la flora bacteriana inherente al efluente
permaneció también en ambos tratamientos. En un
estudio de tratabilidad de efluentes de pescadería
con Scenesdemus sp., en condiciones externas de
laboratorio, también se ha descrito su capacidad de
competencia ante otro tipo de microalgas; aun cuando
también se reportó presencia de flora bacteriana propia
del efluente (Andrade et al., 2009). Está demostrado
que el aporte de las bacterias son eficaces para la
biodegradación de la materia orgánica presente en
los efluentes; de tal forma que contribuye al aporte de
nutrientes a las microalgas en condiciones aeróbicas
(Sriram y Senivasan, 2012).
Entre otros bioindicadores del crecimiento microalgal en
un proceso de ficorremediación se incluyeron también
a los pigmentos clorofila y carotenoides producidos
por las microalgas; ya que reflejan las condiciones
adecuadas de iluminación, pH y disponibilidad de
nutrientes en el efluente para su crecimiento.
51
Estos ensayos realizados en condiciones externas
de laboratorio, presentan una ventaja para la
remediación de aguas residuales, debido a la
disponibilidad de aprovechamiento de la luz
solar; lo cual permite la actividad fotosintética y
metabolismo de contaminantes en efluentes y con
participación de bacterias (Salazar, 2005). En este
sentido, cuando se analizó la biomasa cosechada del
efluente los días 10, 15, 20 y 25, se obtuvo la mayor
producción de clorofila total y de carotenoides a
los 20 días, con un contenido de 32.67 (p>0.05) y
6.47µg/ml-1, respectivamente (Figura 4).
Tabla 1. Valores iniciales (t0días) y finales (t25días) de
parámetros físico-químicos del efluente de una planta
procesadora de pieles para extracción de gelatina, inoculado con
el consorcio microalgal.
Parámetro
Unidades
Valor inicial
Valor final
Color
Aparente
Unid. Pt-Co
5040
895
Sulfatos
mg.l-1
570
169
DBO5
mg.l
6200
167
DQO
mg.l-1
11825
840
Fósforo total
mg.l
4,9
0,5
Nitrógeno
total (NKT)
mg.l
612
54
-1
-1
-1
En cuanto a la remoción de sulfatos, se obtuvieron
valores similares en ambos tratamientos. A los
5 días se logró una reducción del 72.19 % y
de 71.93 % en el control y efluente inoculado
respectivamente. Mientras que, a los 20 días fue
de 78.29 % para el control y de 79.25 % para el
efluente inoculado (Figura 5).
Figura 4. Contenido de clorofila y de carotenoides (µg.ml-1) en
el consorcio microalgal en la fase de tratabilidad del efluente.
Estos máximos valores coinciden con la densidad
celular más elevada obtenida por el consorcio en
el día 21. Además se, observó una tendencia al
incremento de carotenoides desde el día 10 hasta el
25, con diferencia significativa (p>0.05).
Así mismo, la relación manifiesta entre el contenido
de clorofila y de densidad celular o peso seco,
también ha sido descrita en cultivos discontinuos
en diferentes microalgas. Tal es el caso de cultivos
de Scenedesmus obliquus en efluente de una planta
productora de caramelos y en el cual se logró un
rango de la tasa de crecimiento en cuanto a peso
seco y de clorofila, entre 0.32-0.42 y 0.33-0.41
respectivamente (Toyub et al., 2008). Es decir, la
aplicación de una correlación entre el contenido de
clorofila y crecimiento mediante densidad celular
o peso seco es proporcional en fase exponencial
(Morales et al., 2002).
Los resultados obtenidos del estudio de tratabilidad
del efluente con la finalidad de evaluar la eficiencia
de remoción de sulfatos, DBO5, DQO, Fósforo y
Nitrógeno total, ante la aplicación del consorcio
Desmodesmus-Chlorella se presentan de acuerdo
con los análisis realizados al inicio, y a los 5, 10, 15
y 20 días de experimento. Al inicio, se determinó
una concentración de sulfatos, DBO5, DQO, fósforo
y nitrógeno de 570, 6 200, 11 825, 4.9 y 612 mg.l-1
(Tabla 1), al momento de desarrollar el experimento
de tratabilidad del efluente.
Figura 5. Porcentaje de remoción de Sulfato (%) en el control y
en presencia del consorcio microalgal.
En virtud de haberse observado presencia del
consorcio microalgal en todos los controles, podría
sugerirse que además de la presencia de la flora
bacteriana contribuyeron a la reducción de sulfatos
y de los otros contaminantes del efluente. El uso de
sulfatos en presencia de compuestos orgánicos por
parte de las bacterias sulfato reductoras está descrito
en diversos estudios en tratamiento anaeróbico de
efluentes y lodos (Percheron et al., 1997; Sarti et al.,
2010; Zhao et al., 2010). Es posible que, el hecho
de no haber obtenido remociones más elevadas,
podría ser debido a la carencia de este grupo de
microorganismos capaces de utilizar el sulfato en
condiciones aeróbicas. Sin embargo, se ha descrito
la aplicación de un consorcio conformado por
bacterias reductoras de sulfatos y Spirulina platensis
para el tratamiento de un efluente de curtiembre y
en el cual obtuvieron una remoción del 80 % (Rose
et al., 1998); este valor fue similar al determinado
en este estudio de tratabilidad con el efluente
procedente de una planta procesadora de piel de
vacuno, para luego ser utilizada en la extracción de
gelatina y sin la adición de cromo.
Ficorremediación de un efluente de curtiembre
Ontaneda et al.
52
El efecto del pH sobre la eficiencia de eliminación
de sulfatos de las aguas residuales también ha sido
descrito. Así, se ha reportado un óptimo de pH
4.5 en un estudio realizado a pH entre 2.5 y 10.5,
tomando en consideración factores como la DQO y
las condiciones bioelectroquímicas del tratamiento
aplicado (Liang et al., 2013). Al respecto, se observó
durante el estudio de tratabilidad un pH de 8
al inicio y de 9 al final del monitoreo realizado.
De tal manera que, el pH elevado podría ser
otro factor limitante para el caso de la remoción
biológica del sulfato en presencia de las bacterias
sulfatorreductoras (Al Zuhair et al., 2008).
cianobacterias (Spirulina platensis y Oscillatoria
princeps) y la microalga, Chlorella vulgaris en un
efluente de una planta extractora de gelatina a partir
de piel de vacuno en la India. Entre los resultados
logrados se obtuvo una remoción de DQO y DBO
de 90.08±0.176 % y 89.24±0.544 % respectivamente
(Ghatnekar et al., 2011), estos fueron similares a
los obtenidos en la presente investigación. Con
la bacteria fotosintética Rhodocyclus gelatinosus,
cultivada en un efluente de un matadero avícola
en condiciones de laboratorio, también se han
reportado valores similares para la remoción de la
DQO con un 90 % (Giglio et al., 2003).
La remoción de DBO5 al quinto día, tanto en el control
como en el efluente con microalgas inoculadas fue
de 76.29 % y de 78.06 %; respectivamente. Para
luego, alcanzar un incremento hasta 92.81 % en el
control y de 93.69 % con el consorcio inoculado en
el día 25 (Figura 6).
La microalga Chlorella vulgaris, también ha sido
utilizada para el tratamiento de efluentes y lodos
procedentes de una planta procesadora de pieles de
vacunos en la India, pero con remociones inferiores
a las obtenidas en el presente estudio. En dicha
investigación se obtuvo una remoción de solo un
22.0 % y de 38 % de DBO y DQO respectivamente
(Hanumantha et al., 2011). La cianobacteria Nostoc
sp., también ha sido utilizada en el tratamiento de
efluentes de curtiembres y los resultados reportan
una remoción del DBO y DQO del 37.0 % y 48.6
% respectivamente, al término de cuatro semanas
(Nanda et al., 2010). Sin embargo, tales resultados
no superan la eficiencia de remoción de estos dos
parámetros en relación con los obtenidos en la
presente investigación.
Figura 6. Porcentaje de remoción de la DBO5 (%) en el control y
en presencia del consorcio microalgal.
Mientras que, para la DQO también se logró
una remoción al quinto día de 76.5 % y de 84.20
% en el control y con el consorcio microalgal;
respectivamente. Luego, a los 25 días se obtuvo
la misma eficiencia de remoción en ambos
tratamientos, con 88.54 % y 88.44 % en el control y
con el consorcio respectivamente (Figura 7).
Figura 7. Porcentaje de remoción de la DQO (%) en el control y
en presencia del consorcio microalgal.
Estos resultados pueden compararse con los
obtenidos en un estudio sobre aplicación de
un consorcio microbiano integrado por hongos
(Aspergillus flavus y Aspergillus niger), bacterias
(Bacillus subtilis y Nitrobacter winogradskyi),
REMCB 36 (2), 2015
Al analizar la remoción del nitrógeno, entre 5 y 25
días se encontró que tanto el control como en los
tratamientos con el consorcio, se obtuvo la misma
eficiencia en la reducción del nitrógeno total. Al
final del experimento, se alcanzó un valor de
87.99% en el control y de 88.73 % con la tecnología
de ficorremediación (Figura. 8).
Figura 8. Porcentaje de remoción del Nitrógeno (%) en el control
y en presencia del consorcio microalgal
Para el caso del fosfato, también se detectaron
valores similares con una máxima a los 20 días,
tanto en el control como con el consorcio inoculado,
con un 89.80 % y 91.84 %; respectivamente. En
muestras de efluentes procedente de un planta
53
de tratamiento de aguas residuales de la ciudad
de Pune Bopodi, India, se realizó un estudio para
evaluar el efecto del consorcio con Chlorella vulgaris
y Scenedesmus quadricauda sobre la reducción de
fosfato y nitrato, cada 5 días hasta los 30 días y
entre los resultados se destacó que C. vulgaris
mostró mejor capacidad de eliminación de nitrato
con 78 % y S. quadricauda la de fosfato con 81 %
(Kshirsagar, 2011). Otras cepas de Chlorella vulgaris,
Scenedesmus obliquus y de Ourococcus multisporus
han sido objeto de un estudio para la producción
de biomasa microalgal como fuente de biodiesel,
previamente cultivadas en aguas residuales
municipales en Corea del Sur y entre los resultados
obtenidos evidenciaron una
eliminación casi
completa de nitrógeno y fósforo (> 99%) al término
de 4 días (Min-Kyu, 2013). Estos resultados
obtenidos en otros países corresponden a estudios
sobre el uso de consorcios de microalgas, que en
nuestro caso con las microalgas Desmodesmus sp.Chlorella sp., también se aplica la ficorremediación
para la remoción de estos parámetros y producción
de biomasa microalgal, como una tecnología dual
y más efectiva para el tratamiento de efluentes. La elevada eficiencia de remoción de DQO, DBO5, N y
P reportada en el control, es probablemente debida a la
actividad de la flora bacteriana asociada al efluente no
inoculado y a la colonización de las microalgas Chlorella
sp. y Desmodesmus sp. durante el período del estudio.
De tal manera que, el bioproceso de remoción tanto
en el control como en el tratamiento con el consorcio
microalgal ha sido debida a la actividad microbiana
heterotrófica y fotosintética. Esta evidencia también
ha sido descrita con un consorcio de Chlorella vulgaris
y bacterias asociadas a un efluente de una fábrica de
cerveza, a partir del cual se determinó que las bacterias
asociadas participan de una manera significativa en la
biorremoción de la DQO y DBO5 (Raposo et al., 2010).
La aplicación de consorcios con microalgas también
ha sido aplicada para el tratamiento de efluentes de
curtiembres mediante el uso de Chlorella vulgaris LS120
y Scenedesmus obliquus LS121, pero tomando en cuenta
proporciones diferentes de volúmenes de cultivo de
dicho consorcio y del efluente, tales como 100:400,
200:300, 250:250, 300:200 y 400:100. De esta manera,
Elumalai et al. (2014), reportaron las mayores eficiencias
de remoción de TDS, DBO y DQO a la relación
de 250:250 (consorcio:efluente) y en comparación a
cultivos monoalgales de estas microalgas.
Los resultados del análisis proximal realizados a la
biomasa microalgal de 155 g obtenida al final del
estudio de tratabilidad, a fin de verificar su calidad
nutricional (Vasco, 2008), indicaron un 8.45 % de
humedad, 32.23 % de cenizas, 21 % de proteína, 6.68
% de grasa, 23.89 % de carbohidratos, 7.75 % de fibra y
un valor calórico de 239.68 Kcal/100g (Tabla 2).
Tabla 2. Contenido de humedad, proteína, grasa, cenizas, fibras,
carbohidratos y energía de la biomasa microalgal, determinado
mediante análisis proximal.
Ensayo
Método
Unidades
Resultado
Humedad
INEN 518
%(p/p)
8.45
Proteína
INEN 519
%(p/p)
21.00
Grasa
INEN 523
%(p/p)
6.68
Ceniza
INEN 520
%(p/p)
32.23
Fibra
INEN 522
%(p/p)
7.75
Carbohidratos
Cálculo
%(p/p)
23.89
Energía
Cálculo
K cal/100g
239.68
Es decir, esta biomasa consistió mayormente de
materia orgánica con un 51.57 % y con un contenido
de cenizas de un 32.23 %, menor al control. Es
posible que, este elevado porcentaje sea debido
a sulfatos, carbonatos y cloruros adicionados al
sistema de procesamiento de pieles. Se destaca
igualmente, que el contenido de cenizas es superior
a lo reportado por Ghatnekar et al. (2011); lo cual
significa que las microalgas Desmodesmus sp.
y Chlorella sp., estuvieron expuestas a un gran
contenido de minerales presentes en el efluente.
En relación con el contenido de proteínas en un
21%, se estima que este fue similar al registrado con
la microalga Scenedesmus sp. a partir de un efluente
de pesquería con 24.41 % (Andrade et al., 2009).
Sin embargo, Ghatnekar et al. (2011) determinaron
valores superiores de un 56.84 % a partir de un
efluente de una planta extractora de gelatina. Es
posible, que el consorcio integrado por microalgas,
bacterias y hongos, contribuyeron a incrementar la
producción de proteínas.
El contenido de fibra cruda y considerado como
el componente de carbohidratos no digeribles de
7.75 %, estuvo en el rango estimado para las algas
marinas, entre 3.9 % y 13.5 % (Quevedo, 2008). No
obstante, fue menor al reportado por ingredientes
empleados frecuentemente en la alimentación
animal y considerados altamente fibrosos, como
el heno de alfalfa y de avena, con un contenido
entre 25 % y 35 % (Bondi, 1987). Por su parte, el
extracto etéreo con un contenido del 6.68 % fue
superior al reportado por Andrade et al. (2009)
Ficorremediación de un efluente de curtiembre
Ontaneda et al.
54
y Ghatnekar et al. (2011). Así como, el reportado
para cereales (arroz y centeno) y leguminosas el
cual se encuentra por debajo del 2.0 % (Chávez
et al., 1996). Este elevado contenido de lípidos
puede ser debido a la concentración de grasas y
aceites presentes en las pieles procesadas para la
posterior extracción de gelatina. Además, esta
biomasa microalgal cosechada a partir de este
tipo de efluente podría ser evaluada en cuanto
al contenido de triacilglicéridos como fuente de
ácidos grasos para la producción de biodiesel.
Estos resultados confirman estudios realizados
donde se comprueba que mediante la tecnología
de ficorremediación de aguas residuales (Renuka
et al., 2015) se genera, además de una depuración
de contaminantes, una producción de biomasa
microalgal para ser utilizada como complemento
alimenticio o para biocombustible.
CONCLUSIONES
•Se demuestra la efectividad del uso de un
consorcio microalgal como catalizador del
proceso de remoción de cada uno de los
parámetros evaluados.
•Con el ensayo de tratabilidad realizado a un
volumen de 15 L del efluente al 50 %, se confirmó
una elevada eficiencia de remoción de sulfatos,
DBO5, N, DQO y P, a partir del quinto día.
•El uso de sedimentadores con agitación, permite
remociones superiores entre el 78 y 89 % de
los parámetros analizados; pero con un valor
agregado cuando se aplica la ficorremediación
debido a la producción de biomasa microalgal
con una calidad nutricional adecuada, por el
contenido de proteínas y minerales.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por el Programa
Becas Prometeo de la Secretaría Nacional de
Educación Superior y Ciencia, Tecnología e
Innovación de la República del Ecuador. Al Centro
de Biología de la Universidad Central del Ecuador,
por su apoyo permanente en la realización del
estudio experimental.
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57
Caracterización molecular de péptidos antimicrobianos a partir
de muestras de piel de Agalychnis spurrelli (Anura: Hylidae)
Andrea P. Vargas1, Óscar Pérez2, David Ortega - Paredes2, Myrian Rivera1
Laboratorio de Investigaciones de Citogenética y Biomoléculas de Anfibios (LICBA) ,
Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito, Ecuador.
1
Laboratorio de Biología del Desarrollo, Escuela de Ciencias Biológicas,
Pontificia Universidad Católica del Ecuador,, Quito, Ecuador. ap.vargash@gmail.com
2
Recibido: 2015-08-03; aceptado: 2015-08-27
RESUMEN.- Las secreciones de la piel de Agalychnis spurrelli han probado tener una marcada actividad
antimicrobiana sobre diferentes microrganismos patógenos por la presencia de biomoléculas en ellas. Se
realizaron análisis moleculares del ARN mensajero de la piel de A. spurrelli para determinar el tipo de
péptido antimicrobiano presente en las secreciones cutáneas de esta especie. Para amplificar las secuencias
precursoras de los péptidos maduros, se utilizaron iniciadores específicos que contienen secuencias
altamente conservadas. Como resultado se obtuvo una secuencia de ADN complementario de 357 pb,
la cual fue comparada con sus ortólogos de otras especies de la misma subfamilia Phyllomedusinae, se
lograron índices de identidad muy altos para precursores de dermaseptinas. Finalmente, para el análisis de
la secuencia de ADN complementario, se tradujo la secuencia nucleotídica por codones, con lo que se obtuvo
una secuencia aminoacídica. Dicha secuencia posee las características particulares de péptidos de la familia
de las dermaseptinas: una secuencia altamente conservada, una propieza acídica con los aminoácidos
Lisina y Arginina y el extremo C-terminal variable. En conclusión, la secreción total de Agalychnis spurrelli
contiene un péptido de la familia de las dermaseptinas o un péptido relacionado con ellas.
PALABRAS CLAVES: ADN complementario, Dermaseptinas, Phyllomedusinae, secuencias precursoras
ABSTRACT.- The skin secretions of Agalychnis spurrelli have proven to have a strong antimicrobial
activity on different pathogens because they contain certain biomolecules that have antimicrobial action.
In the Phyllomedusinae family antimicrobial peptides are commonly present. Molecular analysis where
performed in mRNA from the skin of A. spurrelli to determine the type of antimicrobial peptide present in
the skin secretions of this species. The precursor that amplifies the sequences of mature peptides, where
amplified by using specific primers that contained the highly conserved sequence, characteristic in this
family. The result was a sequence of DNA complementary of 357 pb. This sequence was compared with their
orthologs from other species of the same subfamily Phyllomedusinae, obtaining very high levels of identity
for dermaseptin precursors. Finally, for the analysis of complementary DNA sequence, this was translated
into an amino acid sequence. This sequence has the characteristics of peptides of the dermaseptin family: a
highly conserved sequence, an acidic propiece with Lysine and Arginine and the variable the C-terminus.
In conclusion, the total secretions of Agalychnis spurrelli contain a peptide of the family of dermaseptin or a
dermaseptin like peptide.
KEYWORDS: complementary DNA, Dermaseptins, Phyllomedusinae, precursor sequences,.
INTRODUCCIÓN
Por la cantidad de especies descritas a nivel
mundial, Ecuador está catalogado como el tercer
país en diversidad de anfibios, y el primero en
el mundo por el número de especies por área
(Coloma et al., 2011). En el pasado, las comunidades
locales han utilizado muchas de estas especies con
fines medicinales y terapéuticos. Las biomoléculas
secretadas en la piel de los anfibios constituyen
una fuente biológica de compuestos con varias
funciones fisiológicas, especialmente de defensa
(Barra y Simmaco, 1995), dirigida hacia patógenos
externos. Estas moléculas forman parte de la
inmunidad innata de estos organismos y pueden
ser aminas biogénicas, alcaloides complejos y
Caracterización de péptidos antimicrobianos en anuros
Vargas et al.
58
péptidos antimicrobianos (Simmaco et al., 1998).
Para que la inmunidad innata, pueda actuar sobre
patógenos que evolucionan rápidamente, los genes
del sistema inmune de los anfibios poseen niveles
muy altos de polimorfismos, dados por la presión
selectiva. Este polimorfismo está asociado con
la actividad antimicrobiana dada por los genes
implicados. Ranas que pertenecen al mismo género
pero de diferentes especies o subfamilias, pueden
tener diferentes tipos de péptidos con diferente
tamaño, carga, hidrofobicidad, conformación y
espectro de acción (Duda et al., 2002).
En los anfibios ecuatorianos la familia Hylidae es
una de las más extensas por contener alrededor de
51 géneros incluidos en tres subfamilias: Hylinae,
Pelodryadinae y Phyllomedusinae. De la subfamilia
Phyllomedusinae han podido ser aislados
aproximadamente 80 péptidos antimicrobianos
que, agrupados por alineamiento múltiple de sus
secuencias, forman 7 familias de péptidos: las
phylloseptinas (PLS), las dermatoxinas (DRT),
las plasticinas (PTC), las phyllotoxinas (PLX), las
hyposinas (HPS), los péptidos huérfanos y las
dermaseptinas (DRS) (Amiche et al., 2008).
Las Dermaseptinas están representadas por 50
péptidos provenientes de los géneros Pachymedusa,
Phyllomedusa y Agalychnis (Amiche et al., 2008). Son
lineares, catiónicos y generalmente no hemolíticos
(De Lucca et al., 1998). La naturaleza anfipática de
las dermaseptinas les permite una interacción con la
membrana del patógeno causando un colapso total de
la integridad de la misma, dando como resultado la
pérdida de la permeabilidad (Charpentier et al., 1998).
Para la mayoría de las dermaseptinas los
precursores codifican una sola copia del péptido
antimicrobiano maduro al extremo C-terminal de
la secuencia. Una comparación de las secuencias
precursoras de los péptidos revela que poseen
una preproregión N-terminal común, altamente
conservada inter e intraespecíficamente y una
región C-terminal diferente que corresponde
a los péptidos antimicrobianos maduros. La
preprorregión conservada comprende una señal
peptídica hidrofóbica de 22 residuos seguidos
por una propieza acídica que termina en una
prohormona que procesa la señal Lisina Arginina
(Lys-Arg) (Duda et al., 2002).
Por lo antes expuesto, en la presente investigación se
realizaron análisis moleculares del ARN mensajero
de la piel de Agalychnis spurrelli para determinar
la presencia de un péptido antimicrobiano en las
secreciones cutáneas de esta especie, las mismas
que han probado tener una amplia actividad
antimicrobiana (Cilveti et al., 2013), antifúngica
(Vargas, 2012) y anticancerígena (Chuang, 2012).
REMCB 36 (2), 2015
MATERIALES Y MÉTODOS
Para la caracterización con métodos moleculares
de péptidos antimicrobianos se siguió el protocolo
determinado por Vanhoye y colaboradores (2003).
Tres especímenes (SC26539, SC26542 y SC26543)
fueron sacrificados colocándoles Lidocaina en el
área bucal para evitar dañar la piel. Posteriormente
se procedió a removerla para obtener varias
muestras de aproximadamente 180 mg que fueron
conservadas y almacenadas en RNAlater (QIAGEN
Cat.No. 76106) a -20º C según lo especifica el
protocolo de clonación de Vanhoye et al. (2003).
Consecutivamente se extrajo el ARN total. Se utilizó
el reactivo Tri Reagent (MOLECULAR RESEARCH
CENTER INC. Cat. No. TR-118), el protocolo se
siguió según las especificaciones del fabricante
mediante la centrífuga Refrigerated Centrifuge
SIGMA 1-15K. El ARN resultante se disolvió en 25
μl de agua DEPC. Para comprobar la presencia de
ácidos nucleicos se corrió el ARN extraído en geles
de agarosa al 1 % y TBE 0.5X.
Después, el ADN complementario (ADNc) fue
sintetizado a partir del ARN total extraído de las
muestras de piel. Para esto se utilizó la transcriptasa
reversa M-MulV (ROCHE Cat .No.11062603001) así
como el protocolo especificado por el fabricante con
los siguientes reactivos: 5 μl de buffer de incubación
5X, 1.25 μl de M-MulV transcriptasa reversa, 2.5 μl
de PolyA oligodT (ROCHE Cat. No. 10108677001),
1 μl de Inhibidor de RNAsas (ROCHE Cat. No.
03335399001), 1.25 μl de deoxinucleotidos trifosfato
(dNTPs) (INVITROGEN Cat. No. 1842701), 5 μl de
templado de ARN total (2-5 μg) y 9 μl de agua libre
de nucleasas (DEPC).
Al producto de la reacción se lo colocó en un tubo
de microcentrífuga de 1.5 ml con un volumen final
de 25 μl y posteriormente fue incubado en un baño
María Reciprocal Shaking “Bath PRECISION”,
por una hora a una temperatura de 37º C. A partir
del ADNc sintetizado se realizó un protocolo de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con el
objetivo de amplificar una porción de la secuencia
del precursor del péptido de A. spurrelli del ADN
complementario total obtenido.
Para realizar la amplificación se diseñaron
iniciadores específicos basándose en secuencias
conocidas de precursores de dermaseptinas
encontrados en especies cercanas a A. spurrelli
como Agalychnis callidryas y Agalychnis annae.
Para esto, dos secuencias de precursores de A.
callidryas y una de A. annae fueron alineadas entre
sí. Dichas secuencias fueron alineadas mediante el
programa ClustalW de European Bioinformatics
Institute EMBL. Una vez encontradas las porciones
59
más alineadas se utilizó el programa BCM
Searchlauncher de Baylor Collage of Medicine
HGSC para diseñar los iniciadores corriente abajo
A.spuR1 y A.spuR2, los cuales fueron iniciadores
degenerados. (Tabla 1)
El iniciador corriente arriba A.spuF1 pertenece
a la secuencia nucleotídica que codifica para
el extremo N-terminal de la preprorregión de
los precursores de dermaseptina diseñado por
Vanhoye et al. (2003). La síntesis de los iniciadores
fue realizada bajo pedido por INVITROGEN.
Una vez obtenidos los iniciadores A.spuF1,
A.spuR1 y A.spuR2 se realizó un PCR anidado.
Este procedimiento utilizó una ADN polimerasa
GoTaq (PROMEGA Cat. No. M3005) siguiendo el
protocolo recomendado por el fabricante.
Para la elaboración de estas amplificaciones
se utilizó una termocicladora PTC-100 MJ
RESEARCH. La reacción se colocó en la
termocicladora, la cual se programó con los
siguientes ciclos: desnaturalización inicial a 94° C
por 2 minutos, acoplamiento a 56° C (temperatura
dependiente de la secuencia de los iniciadores
empleados) por un minuto, extensión a 72° C por 3
minutos con 30 segundos y extensión final a 72° C
por 5 minutos. Los ciclos 2, 3 y 4 se repitieron por
33 veces según las recomendaciones del fabricante
de la polimerasa. La temperatura de acoplamiento
se obtuvo mediante la ecuación de Wallace. Al
término del PCR todas las muestras resultantes
fueron corridas en geles de agarosa y visualizadas.
Las bandas del tamaño adecuado fueron extraídas
del gel de agarosa para realizar la Amplificación
Rápida De Extremos 3’ De ADN Complementario
(3’RACE). Se realizó el 3’RACE usando la cola
de poliA presente en el ARN como sitio de inicio
para PCR. Para este procedimiento se utilizó el
ARN total extraído de la piel de la rana empleando
como iniciadores específicos al iniciador corriente
arriba A.spuF1 basado en el dominio altamente
conservado del extremo N-terminal de los péptidos
antimicrobianos de la familia Hylidae. Los
iniciadores específicos corriente abajo AP y AUAP
fueron obtenidos del Kit de reacción del 3’RACE
(System for Rapid Amplification of cDNA Ends
INIVTROGEN Cat. No. 18373-019).
Para la síntesis de ADN complementario se procedió
según las especificaciones del fabricante utilizando
de 1 a 5 μl del ARN total extraído de la piel de A.
spurrelli y un ARN control incluido, en el Kit.
Para la amplificación del ADNc de interés se
siguieron las especificaciones del Kit (3’RACE
System for Rapid Amplification of cDNA Ends
INVITROGEN Cat. No. 18373-019).
La termocicladora fue programada con los siguientes
ciclos: Desnaturalización inicial a 94º C por 3
minutos, desnaturalización a 94º C por un minuto,
acoplamiento a 56º C por un minuto, extensión a
72º C por 3 minutos con 30 segundos y extensión
final a 72º C por 5 minutos. Los ciclos 2, 3 y 4 se
repitieron por 35 veces según las recomendaciones
del fabricante de la GoTaq polimerasa y el protocolo
de 3’RACE. Luego de la amplificación se extrajo la
muestra con 50 μl de cloroformo y se transfirió la
fase acuosa en un tubo nuevo.
Al término del PCR, todas las muestras resultantes
fueron corridas en geles de agarosa y visualizadas, las
bandas del tamaño adecuado fueron extraídas del gel.
Tabla 1. Iniciadores utilizados en la caracterización de péptidos antimicrobianos de la piel de A. spurrelli. De arriba hacia abajo: Tres iniciadores
degenerados diseñados a partir de secuencias conocidas de precursores de péptidos antimicrobianos; tres iniciadores en el Kit de 3’ RACE AP,
AUP, AUAP; y tres iniciadores incluidos en el Kit de clonación pCR 2.1 TOPO M13 Reverse, M13 Forward y T7 Promoter.
Primers
Secuencia
Referencia
Primer degenerado A.spuF1
5’-GGC TTT CCT KAA GAA ATC TC-3’
Primer degenerado A.spuR1
5’-CCT CYT CAT CTT CAT TTT CTC-3’
Primer degenerado A.spuR2
5’-CAC TTT GCT CRT CRT CTT CTT G-3’
3’ RACE Adapter Primer
5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACT TTT
TTT TTT TTT TTT T-3’
AP primer INVITROGEN
3’RACE Universal Amplification Primer
5’-CAU CAU CAU CAU GAC CGT TCA
GCT GGA TAT TAC-3’
UAP primer INVITROGEN
3’ RACE Abridged Universal
Amplification Primer
5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3’
AUAP primer INVITROGEN
M13 Reverse Primer
5’-CAG GAA ACA GCT ATC AC GTC CTT
TGT CGA TAC TG-3’
pCR 2.1 TOPO
T7 Promoter
5’-AGT GAG TGC TAT TA TCA CTC AGC
ATA AT-3’
pCR 2.1 TOPO
M13 Forward(-20)Primer
3’-CTG GCC GTC GTT TTA C GAC CGG
CAG CAA AAT G-5’
pCR 2.1 TOPO
Caracterización de péptidos antimicrobianos en anuros
Vargas et al.
60
Los fragmentos de A.spuF1-A.spuR1, A.spuF1-A.
spuR2 y A.spuF1-AUAP (3’RACE) se ligaron al
vector pGEM®-T Vector System (PROMEGA Cat.
No. A3610), por poseer una región de resistencia
a la ampicilina y alfa complementación. El
protocolo fue realizado según las especificaciones
del fabricante. Las bacterias competentes se
transformaron con los vectores que contenían los
fragmentos A.spuF1-A.spuR1, A.spuF1-A.spuR2
y 3’RACE. Para esta transformación se utilizaron
las bacterias químicamente competentes One
ShotR TOP10 Competent Cells INVITROGEN
(Cat. No. C40401). El protocolo se realizó según las
especificaciones del fabricante. Simultáneamente
a este protocolo se preparó el medio de cultivo
bacteriano. Para esto se usó el medio Luria-Bertoni
(LB) y Agar en 2 cajas Petri plásticas para cada
fragmento. Una vez polimerizado el medio, se
sembraron 30 μl de X-Gal INVITROGEN (Cat. No.
15520018) a un concentración de 40 mg/ml, y 15
μl de ampicilina ROCHE (Cat. No. 10835242001) a
una concentración de 50 mg/ml para cada placa.
Posteriormente a su transformación, las bacterias
fueron sembradas en el medio de cultivo
previamente preparado. Pasadas las 24 horas se
observó el crecimiento de colonias, y se marcó
con un círculo a las colonias recombinadas con
cada amplicón. Con el objetivo de conocer si las
colonias crecidas en las cajas Petri contenían el
inserto, se realizó un PCR de cada cultivo de
colonias, mediante iniciadores específicos del
vector A.spuF1-A.spuR1,
A.spuF1-A.spuR2
y A. spuF1-AUAP (3’RACE), con su respectiva
temperatura de acoplamiento. Se escogieron tres
colonias de A.spuF1-A.spuR1, A.spuF1-A.spuR2
y 3’RACE. A continuación se purificó el plásmido
con el inserto de las colonias escogidas. Para este
procedimiento se utilizó el kit High Pure Plasmid
Isolation para preparaciones mini (ROCHE Cat.
No. 11754777001). El Kit fue utilizado según las
especificaciones del fabricante. Las muestras
se enviaron a secuenciar con los iniciadores T7
corriente arriba y SP6 corriente abajo, específicos
del vector. Las muestras fueron secuenciadas por el
servicio de secuenciación MACROGEN Inc.
Para un análisis más profundo se realizó la traducción
de las secuencias nucleotídicas empleando el
programa BCM Search launcher de Baylor Collage of
Medicine HGSC. Se obtuvieron 6 marcos de lectura,
tres en sentido 5’3’ y tres en sentido 3’5’. Cada
secuencia obtenida fue alineada con las secuencias
aminoácidicas de péptidos antimicrobianos y de las
especies más cercanas, seleccionando la secuencia
mejor alineada usando el programa ClustalW del
European Bioinformatics Institute EMBL, que indicó
el índice de identidad entre ellas.
REMCB 36 (2), 2015
RESULTADOS
Como resultado de la amplificación del ADN
complementario de A. spurrelli con los iniciadores
específicos diseñados a partir de secuencias
conocidas de precursores peptídicos, se obtuvo
un gel de agarosa con varias bandas. Se pudieron
observar dos bandas de aproximadamente
100 y 120 pb amplificada con los iniciadores
A.spuF1-A.spuR1 y A.spuF1-A.spuR2. También se
observó una banda de 357 pb aproximadamente,
correspondiente a la amplificación de la secuencia
total de interés, obtenida del 3’RACE con los
iniciadores A. spuF1-AUAP (3’RACE). (Figura 1).
Figura 1. Amplicones A.spuF1 con A.spuR1, A.spuR2 y AUAP
(3’RACE). De izquierda a derecha se puede observar: M, la
escalera de peso molecular (Ladder); 1 y 2, secuencias de 357pb
precursoras de dermaseptinas producto de 3’RACE; 3, amplicón
de 120pb obtenido del PCR anidado con A.spuF1 y A.spuR1; 4,
amplicón de 100pb obtenido del PCR anidado con A.spuF1 y
A.spuR2; 5, control negativo; 6, control positivo (3’RACE).
De la clonación de las secuencias A.spuF1-A.spuR1,
A.spuF1-A.spuR2 y A.spuF1-UAP (3’RACE)
en bacterias competentes, se obtuvieron varias
colonias transformadas con el inserto en la placa de
cultivo. A continuación se seleccionó una colonia
para realizar una amplificación con los iniciadores
A. spuF1 y AUAP. Como resultado, en el gel de
agarosa al 1 %, pudieron observarse bandas de 357
pb aproximadamente, que corresponden al tamaño
esperado de la secuencia total del precursor
de los péptidos antimicrobianos. Se realizó el
mismo procedimiento con A.spuF1-A.spuR1 y
A.spuF1-A.spuR2. Finalmente se seleccionaron
tres colonias de cada inserto para ser purificadas y
posteriormente secuenciadas. Como resultado de la
purificación del plásmido y su posterior secuenciación
se obtuvo la secuencia precursora del péptido de
Agalychnis spurrelli que cuenta con 357 pb (Figura 2)
y dos amplicones más pequeños que pertenecían a la
amplificación de segmentos de la secuencia precursora
de 100 y 120 pb.
61
de las especies Agalychnis annae, Agalychnis
callydrias, Phyllomedusa sauvagei y Phyllomedusa
hypochondrialis. (Tabla 2).
DISCUSIÓN
El ADN contiene empacada toda la información
genética que un organismo necesita para
desarrollarse y funcionar, y en base a esa información
este puede construir proteínas (Watson et al., 2007).
El ARN mensajero contiene la información genética
procedente del ADN para la síntesis de proteínas.
Estas a su vez son los productos finales de la mayoría
de rutas de información y tienen que ser sintetizadas
y transportadas en respuesta a las necesidades
celulares del momento (Lehninger et al., 2008).
Figura 2. Amplicón de A.spuF1-AUAP a partir de colonias
transformadas. Los amplicones de ADN fueron obtenidos
a partir de la amplificación de colonias recombinadas,
amplificadas con iniciadores A.spuF1-AUAP. De izquierda a
derecha se observan la escalera de peso molecular seguida de
las bandas uno y dos de 357pb.
A continuación se procedió a comparar la secuencia
precursora total de péptidos antimicrobianos de A.
spurrelli con secuencias del banco genético National
Center of Biotechnology Information (NCBI). Los
índices de identidad obtenidos muestran que la
secuencia precursora del péptido de Agalychnis
spurrelli se encuentra estrechamente relacionada
con secuencias precursoras de dermaseptinas y
péptidos relacionados con dermaseptinas, aisladas
La información de los precursores de péptidos
antimicrobianos presentes en la piel de los anfibios,
está codificada en el ADN de cada una de las células
del organismo. Sin embargo, estas secuencias son
traducidas exclusivamente en las células de la
piel para la producción de sustancias de defensa
secretadas por las glándulas granulares (Tennessen
y Blouin, 2008). Las secuencias de estos péptidos son
muy similares entre especies relacionadas. (Figura 3).
Los anfibios de la familia Hylidae poseen
precursores
llamados
preprodermaseptinas
(Vanhoye et al., 2003) a partir de las cuales fueron
diseñados los iniciadores A.spuF1 corriente arriba,
A.spuR1 y A.spuR2 corriente abajo. Es posible
encontrar ciertos segmentos de la secuencia de una
proteína en organismos de un grupo taxonómico
y no en otros grupos y estos segmentos pueden
usarse como “secuencia firma” del grupo en el cual
se encuentren (Lehninger et al., 2008).
Tabla 2. Índices de identidad de la secuencia A.spuF1-AUAP (3’RACE) de Agalychnis spurrelli comparados con las secuencias de sus
ortólogos en otras especies.
ESPECIE
TIPO DE SECUENCIA
IDENTIDAD MÁXIMA
Agalychnis annae
mRNA for dermaseptine related peptide, clone AA 3-1
96%
Agalychnis callidryas
mRNA for DRP-AC1 precursor (drp.AC1 gene)
89%
Phyllomedusa hypocondralis
mRNA for dermaseptine H2 protein precursor (dsn-2 gene)
87%
Phyllomedusa hypocondralis
mRNA for dermaseptine H1 protein precursor (dsn-1 gene)
87%
Agalychnis callidryas
Dermaseptien like precursor DRP-AC-3 mRNA
90%
Phyllomedusa sauvagei
mRNA for preprodermaseptine S13 (drsS13 gene)
83%
Phyllomedusa sauvagei
Partial mRNA for preprodermaseptine S12 (drs12 gene)
83%
Phyllomedusa sauvagei
mRNA for dermaseptin sVII
86%
Agalychnis annae
mRNA for dermaseptin-related peptide, clone AA-3-6
81%
Phyllomedusa hypocondralis
mRNA for preprodermaseptine H3 (dpp-H3 gene)
89%
Agalychnis callidryas
mRNA for ARP-AC1 precursor
80%
Phyllomedusa hypocondralis
mRNA for preprodermaseptine H4
91%
Phyllomedusa sauvagei
mRNA preprodermaseptine S11 (drsS11 gene)
79%
Caracterización de péptidos antimicrobianos en anuros
Vargas et al.
62
presente en el mensajero de A. spurrelli. El alto
grado de conservación de estas preprorregiones se
debe a que se originó de una familia de multigenes
perteneciente a un ancestro común (Duda et al., 2002).
Sin embargo, a pesar de tener una preprorregión
altamente conservada evolutivamente, los péptidos
antimicrobianos poseen un extremo C-terminal
muy variable. Esta variabilidad da como resultado
una gran cantidad de péptidos de diferentes
tamaños, secuencias y espectro antimicrobiológico
(Vanhoye et al., 2003); no obstante, muchas de
estas sustituciones de aminoácidos observadas
en una familia de proteínas pueden ser de tipo
conservador, es decir, sustituciones en las cuales
un residuo de un aminoácido está remplazado por
otro que posee propiedades químicas similares
(Lehninger et al., 2008).
Para conocer el tamaño y la secuencia total del
precursor del péptido antimicrobiano de A. spurrelli
se realizó la técnica molecular llamada 3’RACE
(Rapid Amplification of cDNA Ends).
Figura 3. Alineamiento de secuencias precursoras de péptidos
antimicrobianos de especies de la subfamilia Phyllomedusinae.
Identidades nucleotídicas coloreadas, alineadas con el editor de
alineamientos Bioedit.
La amplificación de una porción pequeña del
precursor a partir de estos iniciadores indica que
el dominio altamente conservado de péptidos
antimicrobianos de la familia Hylidae, está
Esta técnica amplifica secuencias nucleotídicas a
partir de un ARN mensajero usado como templado.
El 3’RACE necesita dos secuencias iniciadoras
específicas que encierren a la secuencia de interés
y toma ventaja de la cola de poliA contenida en
al ARNm como iniciador genérico para sintetizar
ADN complementario (Sambrook y Russell, 2001).
En el caso de A. spurrelli se tomó como iniciadores
a la preprorregión altamente conservada con el
iniciador A.spuF1 específico y el iniciador AUAP
genérico que se une a la región conocida en el
extremo 5’ (Figura 4). Como resultado se obtuvo
una secuencia de 357 pb, consistente con la longitud
de los precursores de péptidos antimicrobianos de
la familia Hylidae (Vanhoye et al., 2003).
Figura 4. Esquema de la región amplificada y clonada usando métodos moleculares. En azul se observan la prepro-región altamente conservada
de precursores de péptidos antimicrobianos usada como iniciador corriente arriba (A.spF1) y el iniciador de amplificación universal AUAP
corriente abajo. En verde se observa la secuencia amplificada del precursor de péptidos antimicrobianos de A. spurrelli con 357 pares de base.
Este fragmento y sus iniciadores se encuentran en el dominio lacZ- (3.9 kb) del vector de clonación pCR 2.0-TOPO.
REMCB 36 (2), 2015
63
El alto índice de identidad que se obtuvo mediante
la comparación y alineamiento de la secuencia
resultante, con las secuencias precursoras de
péptidos antimicrobianos presentes en el Banco
Génico, NCBI, demostró que el extracto crudo de
A. spurrelli contiene una dermaseptina o un péptido
relacionado con las dermaseptinas. Se puede
asegurar que se trata de una dermaseptina, por el
alto grado de similitud de secuencias ortólogas con
otras especies de la familia Hylidae como Agalychnis
annae (mRNA for dermaseptin-related peptide,
clone AA-3-1) con 96 %, Agalychnis callidryas (mRNA
for DRP-AC1 precursor (drp-AC1 gene) con 89 %,
Phyllomedusa hypochondrialis (mRNA for dermaseptin
H1 y H2 protein precursor) con 87 % y Phyllomedusa
sauvagei (mRNA for preprodermaseptin S 12 y S13)
con un 83 % de similitud (Tabla 3).
Posterior al análisis de las secuencias de ADN
complementario se procedió a traducir las
secuencias aminoacídicas, se obtuvo como
resultado seis marcos de lectura, los cuales fueron
alineados con secuencias ortólogas presentes
en el Banco Génico NCBI. Todos los marcos de
lectura tuvieron índices de identidad altos. Esto
podría indicar una estrecha relación en el origen
de los péptidos antimicrobianos o incluso un
origen común de los mismos. El marco de lectura
3’5’ Frame 1, obtuvo la similaridad más alta con
Agalychnis annae con un 90 %. Mientras que con las
otras especies antes mencionada fluctúa entre 86 %
y 46 %, lo cual podría suponer una estrecha relación
en el origen de los péptidos antimicrobianos de
ambas especies (Figura 5).
Adicionalmente, la secuencia aminoacídica de A.
spurrrelli presenta la región altamente conservada
Figura 5. Secuencia aminoacídica obtenida a partir de la
secuencia precursora de péptidos de Agalychnis spurrelli.
Secuencia de 75 aminoácidos amplificada a partir de A.spuF1AUAP. La secuencia nucleotídica se encuentra subrayada.
de péptidos de la familia Hylidae, una propieza
acídica que mantiene el extremo ArgininaLisina, y la región N-terminal de precursores de
dermaseptinas (Vanhoye et al., 2003).
Mediante la comparación de las secuencias
nucleotídicas y aminoacídicas de A. spurrelli con los
secuencias presentes en el banco génico NCBI, se
obtuvieron índices de identidad que nos indican que
estos amplicones, y las secuencias aminoacídicas,
poseen un alto grado de similaridad con secuencias
ortólogas de A. annae.
La diversificación de los loci pudo haber sido parte
de una estrategia evolutiva desarrollada por estas
especies como resultado de cambios del nicho
ecológico, tomando en cuenta el dramático cambio
evolutivo de predadores microbianos (Duda et al.,
2002). El uso de una familia de proteínas para realizar
estudios evolutivos y de relaciones filogenéticas
requiere de la identificación de miembros de esta
familia con funciones similares en la gama más
amplia posible de organismos. La información
Tabla 3. Índices de identidad de la secuencia aminoaminoacídica traducida a partir de A.spuF1-AUAP (3’RACE) de Agalychnis
spurrelli comparados con las secuencias de sus ortólogos en otras especies
Especie
Tipo De Secuencia
Identidad Máxima
Agalychnis annae
mRNA for dermaseptine-related peptide, clone AA-3-1
58%
Phyllomedusa hypocondrialis
mRNA for dermaseptine H1 protein precursor (dsn-1 gene)
45%
Agalychnis callydrias
Dermaseptine-like precursor DRP-AC-3
41%
Phyllomedusa hypocondrialis
mRNA for dermaseptin H2 protein precursor (dsn-2 gene)
45%
Agalychnis callydrias
mRNA for DRP-AC-1 precursor
41%
Phyllomedusa sauvagei
mRNA for preprodermaseptin S12 (drsS1 gene)
44%
Phyllomedusa sauvagei
Partial mRNA for preprodermaseptin S13 (drsS1 gene)
46%
Agalychnis callydrias
mRNA for ARP-AC-1 precursor
43%
Agalychnis annae
mRNA for dermaseptine-related peptide, clone AA-3-3
38%
Agalychnis annae
mRNA for dermaseptine-related peptide, clone AA-3-4
30%
Agalychnis callidryas
mRNA for ARP-AC1 precursor
90%
Phyllomedusa hypocondrialis
mRNA for phyllosepti-8 protein precursor
86%
Phyllomedusa sauvagei
mRNA preprodermaseptin S9 (drsS9 gene)
86%
Caracterización de péptidos antimicrobianos en anuros
Vargas et al.
64
extraída de la familia de proteínas puede usarse
para el análisis de divergencia y relación evolutiva.
Sin embargo, esta información debe ser comparada
con investigaciones sobre fisiología y bioquímica
de los organismos (Lehninger et al., 2008).
No obstante, la información obtenida a partir de la
secuencia precursora de péptidos antimicrobianos
de A. spurrelli ha servido, en este estudio, para la
preliminar identificación de uno de los péptidos
antimicrobianos presente en las secreciones de la
piel de dicho organismo.
CONCLUSIONES
•La secuencia nucleotídica precursora de péptidos
antimicrobianos presente en Agalychnis spurrelli,
pertenece a los precursores de antimicrobianos
de la subfamilia Phyllomedusinae, ya que
fue amplificada con las regiones altamente
conservadas características de este grupo
taxonómico.
Citogenética y Biomoléculas de Anfibios (LICBA),
de la Escuela de Ciencias Biológicas de la PUCE
por su constante colaboración. A la Pontificia
Universidad Católica del Ecuador por el apoyo
financiero otorgado al proyecto: Caracterización
química y citogenética de anfibios ecuatorianos.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Amiche M, Ladram A, Nicolas P. 2008. A consistent
nomenclature of antimicrobial peptides isolated
from frogs of the subfamily Phyllomedusinae.
Peptides, 247: 870-875.
Barra D, Simmaco M. 1995. Amphibian skin: A
promising resource for antimicrobial peptides.
Trends in Biotechnology, 13(6): 205-209.
Charpentier S, Amiche M, Mester J, Vouille
V, Le Caer JP, Nicolas P, Delfour A. 1998.
Structure, Synthesis, and Molecular Cloning
of Dermaseptins B, a Family of Skin Peptide
Antibiotics. The Journal of Biological Chemistry,
273(24): 14690-14697.
•Gracias al alto grado de conservación de
las secuencias nucleotídicas precursoras de
péptidos antimicrobianos de la subfamilia
Phyllomedusinae,
estas
pudieron
ser
adecuadamente usadas como iniciadores
para la caracterización molecular de péptidos
antimicrobianos relacionados.
Chuang PH. 2012. Evaluación de la actividad
anticancerígena del extracto peptídico crudo
de Agalychis spurrelli. Tesis de Lienciatura en
Ciencias Biológicas, Pontificia Universidad
Católica del Ecuador, Quito, Ecuador.
•La secuencia precursora de Agalychnis spurrelli
posee un alto grado de identidad con su
ortólogo en la especie Agalychnis annae, por
lo cual puede inferirse una historia evolutiva
muy cercana de estas especies por presiones de
evolución adaptativa.
Cilveti C, Rivera M, Rodríguez-Riglos M, Alcocer I.
2013. Inhibición de Enterobacterias Portadoras
de Carbapenemasas con Secreciones Peptídicas
de Anfibios Nativos Ecuatorianos. Revista
Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas,
Volumen XXXIV(1,2): 85-98.
•La secuencia aminoacídica del péptido
antimicrobiano obtenida de Agalychnis spurrelli y
las de sus ortólogos Agalychnis annae, Agalychnis
callidryas,
Phyllomedusa
hypochondrialis
y
Phyllomedusa sauvagei, posee una región altamente
conservada, una propieza acídica que exhibe el
extremo Arginina-Lisina, y una región C-terminal
multivariable, regiones que son características de
los precursores de dermaseptinas.
Coloma LA, Hoomoed MS, Quiguango-Ubillús A.
2011. Anfibios de Ecuador. Fundación Otonga.
En línea <http//www.puce.edu.ec/Zoología/
anfecua.htm> Consμltado: Marzo, 2012.
AGRADECIMIENTOS
Los
autores
expresan
su
imperecedero
agradecimiento a la Dra. Iliana Alcocer Negrete del
Laboratorio de Microbiología de la PUCE y a la Dra.
Jeannete Zurita, de Zurita&Zurita Laboratorios,
por su incondicional apoyo. Al personal de los
laboratorios de Microbiología, de Biología del
Desarrollo y del Laboratorio de Investigaciones de
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REMCB 36 (2), 2015
67
Sensibilidad antimicrobiana y detección de genes
de virulencia en aislados clínicos de Shigella spp.
Irina Villacrés1, Iliana Alcocer1, Jeannete Zurita2 y Mercedes Rodríguez-Riglos1
Laboratorio de Microbiología, Escuela de Ciencias Biológicas,
Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito, Ecuador, iralcocer@puce.edu.ec
1
2
Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito, Ecuador.
Recibido: 2015-08-07; aceptado: 2015-10-05
RESUMEN.- El género Shigella comprende las especies S. flexneri, S. sonnei, S. boydii y S. dysenteriae,
bacterias responsables de la shigelosis. Éste género se caracteriza por la presencia de multirresistencia a
antibióticos y una variedad de factores de virulencia que permiten la infección al hospedero. El objetivo de
este estudio fue establecer la sensibilidad antimicrobiana y detectar genes de virulencia “Invasion plasmid
antigen H“, ipaH; “Invasion-associated locus”, ial; “Shigella toxin” Stx; “Shigella enterotoxin 1A”, set1A; y
“Shigella enterotoxin 1B”, set1B en aislados clínicos de Shigella spp. Se analizaron 79 aislados obtenidos de
Zurita & Zurita Laboratorios y del hospital Vozandes. Mediante serotipificación, se registraron tres especies:
S. flexneri (64.6 %), S. sonnei (29.1 %), y S. boydii (6.3 %). La sensibilidad antimicrobiana siguió el método
de difusión con disco según las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standars Institute (CLSI). La
resistencia obtenida fue a tetraciclina (96.20 %), ampicilina (94.9 %), trimetoprima/sulfametoxazol (86.1 %)
y cloranfenicol (84.8 %). No se registraron aislados de Shigella con resistencia a ciprofloxacino, azitromicina
ni a ceftriaxona. Se determinó la presencia de genes de virulencia por la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Se determinó una alta prevalencia de los genes ipaH (91.1 %) e ial (82.3 %), los genes codificantes
de enterotoxina 1 (set1A y set1B) se encontraron en un 35.4 %. Los resultados obtenidos demuestran la
existencia de multirresistencia a antibióticos y cepas virulentas.
PALABRAS CLAVES: enterotoxinas, genes de virulencia, resistencia antimicrobiana, serogrupos, Shigella spp.
ABSTRACT.- The genus Shigella includes S. flexneri, S. sonnei, S. boydii and S. dysenteriae, which are
producers of shigelosis. The genus are characterized due to multidrug resistance to antibiotics and a
variety of virulence factors that allow the infection to host. The objective of this study was to establish the
antibiotic susceptibility and detection of virulence genes in clinical isolates of Shigella spp.: invasion plasmid
antigen H (ipaH), invasion-associated locus (ial), Shigella toxin (Stx), Shigella enterotoxin 1A (set1A), and
Shigella enterotoxin 1B (set1B). We analyzed 79 strains from “Zurita & Zurita Laboratorios” and “Hospital
Vozandes”. Three species were identified: S. flexneri (64.6 %), S. sonnei (29.1 %), and S. boydii (6.3 %) by
antiserum agglutination. The antimicrobial susceptibility was performed by following the disk diffusion
method and recommendations of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). High resistance
was observed to tetracycline (96.2 %), ampicillin (94.9 %), trimethoprim/sulfamethoxazole (86.1 %), and
chloramphenicol (84.8 %). No resistance was identified to ciprofloxacin, ceftriaxone and azitromicin. The
analysis of the presence of virulence genes was performed using the Polymerase Chain Reaction (PCR). A
high prevalence of genes ipaH (91.1 %) and ial (82.3 %) was determined, the encoding genes of enterotoxin
1 (set1 and set1B) were found in 35.4 % of the isolates. The results demonstrate the existence of multidrug
resistances to antibiotics and virulent strains of the genus Shigella.
KEYWORDS: antimicrobial resistance, enterotoxins, serogroups, Shigella spp., virulence genes.
INTRODUCCIÓN
El género Shigella (Shiga, 1989) comprende bacilos
Gram negativos de 0.3 a 1.0 μm diámetro y de 1
a 6 μm de longitud, no móviles, no formadores de
esporas, anaerobios facultativos, pertenecientes
a la familia Enterobacteriaceae (Terragno et al.,
2007). Las cuatro especies del género Shigella que
provocan todas las manifestaciones clínicas de
la shigelosis, que pueden causar desde diarrea
acuosa hasta diarrea exudativa fulminante, son
Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii y
Resistencia y virulencia en Shigella spp
Villacrés et al.
68
Shigella sonnei. La enfermedad más grave resulta de
la infección causada por las especies S. dysenteriae
tipo 1. Se considera que la cepas de S. flexneri son
menos virulentas, mientras que, las de S. boydii
y S sonnei, generalmente, originan episodios
autolimitados de diarrea acuosa con fiebre. No se
ha establecido hasta el momento la razón por la
cual en los países industrializados predominan
las infecciones por cepas se S. sonnei y S. boydii,
mientras que, los aislamientos de S. dysenteriae y S.
flexneri son característicos de los países en vías de
desarrollo (Zurita, 2012).
Su identificación se fundamenta en características
bioquímicas y antigénicas, en base a ellas se
describen cuatro especies: Shigella dysenteriae
(Shiga, 1898), perteneciente al serogrupo A; Shigella
flexneri (Flexner, 1900), concerniente al serogrupo
B; Shigella boydii (Boyd, 1938), perteneciente al
serogrupo C; y, Shigella sonnei (Sonne, 1915),
perteneciente al serogrupo D. Los grupos A, B y
C se subdividen en serotipos (número arábigo)
y subtipo (letra minúscula) que son 12, 14 y 18,
respectivamente. El grupo D tiene un solo serotipo.
Todas ellas pueden causar disentería bacilar,
aunque con diferente gravedad (Zurita, 2012).
La Organización Mundial de la Salud (2010) estima
la ocurrencia de 165 millones de casos y 1.1 millones
de muertes por año, de las cuales alrededor de
576000 son de niños menores de 5 años de edad.
La transmisión de estas bacterias se produce
principalmente por ruta fecal-oral directa o
indirecta en lugares que se caracterizan por una
higiene deficiente (Kotloff et al., 1999). La infección
surge posteriormente a la ingestión de 10 a 100
microorganismos y los síntomas se presentan de 12
a 96 horas relativas al período de incubación de la
bacteria (Mandell et al., 2009).
La shigelosis es una enfermedad diarreica aguda
autolimitada, sin embargo, hay condiciones en las
cuales se encuentra establecido el tratamiento cuyo
objetivo principal es bajar la carga microbiana y la
intensidad de los síntomas. Se recomienda el uso
de ceftriaxona en lactantes menores de 6 meses que
requieran hospitalización así como ciprofloxacino
en adultos mayores con deshidratación severa.
Debido a que el inóculo es muy bajo, también
se recomienda tratamiento en los casos de
hacinamiento (Zurita, 2012).
El género Shigella presenta una variedad de
factores de virulencia que le permiten el ingreso
a la mucosa gástrica, evadiendo las defensas del
hospedero. Varios de estos factores han sido
REMCB 36 (2), 2015
asociados al género Shigella, los más relevantes en
este estudio son los que intervienen en la invasión y
colonización del epitelio intestinal como los genes
ipaH (invasión plasmid antigen H), que permite
la diseminación facilitada de Shigella a través de la
mucosa y la inhibición de la coagulación inducida
por trombina que provoca la eliminación de sangre
en las heces (Hale, 1991) e ial (invasión-associated
locus) que promueve la internalización e invasión
del tejido “blanco” gracias a la producción de
adhesinas e invasinas y permite la diseminación
intercelular de la bacteria y el traslado y secreción
de diversos factores de virulencia (Noriega et
al., 1999). El gen ipaH conocido como “invasión
plasmid antigen H” ha sido observado en el 99
% de aislados de Shigella, determinándose como
el gen más estable de detectar debido a que se
encuentra en el cromosoma y en el ADN plasmidial
en múltiples copias (Lin Thong et al., 2005).
La enterotoxina 1 (ShET-1), es una proteína
codificada en el cromosoma bacteriano por los
genes set1A (subunidad A de la proteína) de
309 pb y set1B (subunidad B de la proteína) de
147 pb. La importancia de la enterotoxina 1
en la virulencia de Shigella se ha descrito más
recientemente. Esta toxina parece relacionarse
con la fase temprana de la diarrea acuosa en la
shigelosis, expresándose con mayor frecuencia en
S. flexneri 2a. Sin embargo, el mecanismo por el
cual inicia la diarrea durante la shigelosis aún no
está claramente definido (Vargas et al., 1999).
Otro factor de virulencia es la exotoxina Shiga, que
es liberada únicamente durante la lisis celular. Su
efecto es bloquear la síntesis proteica en la célula
eucariota (Henhly et al., 1996). La exotoxina Shiga
es una enterotoxina que se asocia con el serotipo A1
de S. dysenteriae. Esta exotoxina es codificada por
el gen Stx de 895 pb. La principal complicación de
la liberación de la toxina Shiga es el desarrollo del
Síndrome Urémico Hemolítico.
Por lo expuesto, el objetivo fue establecer la
sensibilidad antimicrobiana y detectar genes de
virulencia ipaH, ial, Stx, set1A y set1B en aislados
clínicos de Shigella spp., por medio de pruebas
fenotípicas y genotípicas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Población de estudio.- El presente estudio incluyó un
total de 79 aislados clínicos de Shigella spp., obtenidos
en Zurita & Zurita Laboratorios (Quito, Ecuador) y
del hospital Vozandes en Quito. Fueron colectados
durante el año 2005 al año 2010. Las muestras
provienen de procesos infecciosos documentados.
69
Los aislados se mantienen en la Colección
Bacteriana Quito Católica, CB-QCA del
Laboratorio de Microbiología en la Escuela de
Ciencias Biológicas con registro de los códigos
hospitalarios, fechas de aislamiento, origen de los
aislados, sexo y edad de los pacientes.
Identificación bioquímica del género Shigella.El género Shigella de acuerdo con sus reacciones
bioquímicas se identifica como un bacilo no
mótil, no fermentador de lactosa, productor o no
de ornitina descarboxilasa según la especie, no
productor de triptofanasas y que presenta una
fermentación butilén-glicólica. Para evidenciar
este perfil se realizaron las pruebas bioquímicas
estándares: agar con triple azúcar y hierro (TSI),
motilidad, indol, ornitina (MIO) y rojo de metilo
(RM)/Vogues-Proskauer (VP), a partir de colonias
aisladas en agar entérico Hecktoen (Difco, 2003).
Identificación serológica de las especies del
género Shigella.- La serotipificación se realizó
mediante la técnica de aglutinación en lámina
propuesta por Edwars y Edwing (1972) y conforme
a las recomendaciones del Manual Difco Shigella O
Antisera (2011). Mediante esta técnica se puso en
evidencia la presencia de antígenos somáticos O
enfrentando el antisuero polivalente (anticuerpo)
con la bacteria (antígeno). Las cepas fueron
enfrentadas con los cuatro antisueros policlonales
comerciales Difco Shigella Antisera Poly de
serogrupos: Grupo A, S. dysenteriae, serotipos 1-7;
Grupo B, S. flexneri, serotipos 1-6; Grupo C, S. boydii,
serotipos 1-7; y, Grupo D, S. sonnei, serotipos I y II.
Para la utilización de los antisueros policlonales
y la validación de los resultados, se realizaron
controles positivos y negativos. Para el control
positivo se utilizaron las cepas American Type
Culture Collection, ATCC: S. sonnei 25931; S. boydii
(1) 9207; y S. flexneri (2b) 12022. Para los controles
negativos se utilizó una gota de cloruro de sodio al
0.85 % y la cepa Escherichia coli ATCC 25922.
Sensibilidad a los antimicrobianos.- Para este
procedimiento fue utilizado el método de difusión
con disco (Bauer et al., 1966) en agar Müller-Hinton
(Difco TM) con sujeción a las recomendaciones
propuestas por el Clinical and Laboratory Standars
Institute (CLSI, 2015).
Detección molecular de genes de virulencia en
Shigella spp.- La extracción del ADN total se realizó
con el empleo del método sugerido por Carvalho
et al. (2001). La confirmación de la integridad del
ADN para la realización de la reacción en cadena
de la polimerasa PCR fue realizada mediante la
amplificación del gen codificante de la subunidad
16S del ribosoma bacteriano. Los iniciadores
utilizados para la amplificación del gen 16S
descritos por Malhotra-Kumar et al. (2005) se
encuentran detallados en la Tabla 1. Para medir el
peso molecular de las bandas obtenidas se utilizaron
100 bp DNA Ladder TrackltTM (Invitrogen). Como
control negativo se utilizó agua de grado molecular
y como control positivo para el gen 16S ARNr se
empleó la cepa S. flexneri ATCC (2b) 12022.
El ciclo de amplificación del gen 16S fue llevado
a cabo en un termociclador Labnet Multigene
Model TC9600-G programando un ciclo de
desnaturalización inicial a 93° C por 3 minutos,
seguido de 27 ciclos, los cuales consistieron en
un paso de desnaturalización a 93° C por 30
segundos, seguido de un paso de anillamiento
a 59.3° C 45 segundos, y un último paso de
extensión a 65° C por 45 segundos; finalmente un
Tabla 1. Iniciadores utilizados para la identificación de varios genes asociados a mecanismos de virulencia en Shigella spp y el 16S.
Iniciador
Gen de
virulencia
Secuencia de nucleótido (5’ a 3’)
Tamaño
Amplicón (pb)
Referencia
16S rRNA F
rrs
GAGTACGACCGCAAGGTTGA
100
Malhotra-Kumar et al. (2005)
16S rRNA R
rrs
CTGGTAAGGTTCTTCGCGTTG
100
Malhotra-Kumar et al. (2005)
ShET1AF
set1A
TCACGCTACCATCAAAGA
309
Fusano et al. (1995)
147
Fusano et al. (1995)
320
Frankel et al. (1989)
423
Lüscher y Altewegg (1994)
895
Frankel et al. (1989)
ShET1AR
ShET1BF
TATCCCCCTTTGGTGGTA
set1B
ShET1BR
ialR
ATTTGTGGATAAAAATGACG
ial
ialR
Shig1
StxFR
CTGGATGGTATGGTGAGG
GGAGGCCAACAATTATTTCC
ipaH
Shig2
StxF
GTGAACCTGCTGCCGATATC
TGGAAAAACTCAGTGCCTCT
CCAGTCCGTAAATTCATTCT
Stx
CAGTTAATGTGGTTGCGAAG
CTGCTAATAGTTCTGCGCATC
Resistencia y virulencia en Shigella spp
Villacrés et al.
70
ciclo de extensión a 72° C durante 5 minutos. Los
productos resultantes de la reacción en cadena de
la polimerasa fueron almacenados a -20° C hasta su
análisis electroforético.
Para la identificación de genes de virulencia
en Shigella spp., se emplearon los iniciadores
previamente descritos por Fusano et al. (1995) y
Lüscher y Altewegg (1994) los cuales se encuentran
detallados en la Tabla 1.
Para la reacción en cadena de la polimerasa se usó
el ADN total. Las condiciones de amplificación
utilizadas son descritas por Lin Thong et al. (2005)
y Vargas et al. (1999). Como control negativo se
utilizó agua de grado molecular en lugar de ADN
y como control positivo para todos los genes en
estudio se empleó la cepa CB-QCA 3349 Shigella
flexneri pues este aislado posee cuatro de los cinco
genes en estudio: ipaH, ial, set1A y set1B.
La PCR fue estandarizada en un volumen de 25
μl, que contiene: 12.5 μl de Green 0.4 mM de cada
iniciador (Invitrogen) y 1 μl de ADN.
El programa de amplificación de los genes se realizó
en un termociclador Labnet Multigene Model
TC9600-G. Se inició el programa de PCR con una
desnaturalización inicial de 95° C por 5 minutos,
seguido de 30 ciclos con una desnaturalización a 95° C
durante 50 segundos, anillamiento, para los genes
ipaH, ial, y set1B a 52°C por 1.5 minutos; para el gen
set1A a 48° C por 1.5 minutos; para el gen Stx a 55° C
por 1.5 minutos; y, extensión a 72º C durante 2
minutos, seguido de un ciclo de extensión final a
72° C por 7 minutos.
El peso molecular de las bandas obtenidas para
cada gen fue estimado visualmente mediante el
uso de 100 bp DNA Ladder TrackltTM (Invitrogen).
Análisis de los productos de amplificación.- Los
productos de PCR fueron analizados mediante
electroforesis horizontal en geles de agarosa al 1.0
% en tampón TBE 1 X (89 mM de Tris, 89 mM de
ácido bórico y 2.50 mM de EDTA). El programa de
electroforesis consistió en la aplicación de 8V/cm
durante 45 minutos en tampón TBE 0.5 X. La tinción
del gel se realizó con el empleo de SYBRGold
(Invitrogen). Los resultados fueron documentados
en el sistema de captura de imágenes MiniBis Pro
(DNR Bio- Imaging Systems) con la ayuda del
programa informático GelCapture 4.5.3.
Validación de los genes de virulencia.- Para
validar el protocolo de amplificación y confirmar la
identidad de la cepa se utilizó como control el aislado
REMCB 36 (2), 2015
CB-QCA 3349 Shigella flexneri que posee cuatro de
los cinco genes en estudio: ipaH, ial, set1A y set1B.
Los productos de PCR fueron enviados a Macrogen
Korea para su secuenciamiento. Las muestras
fueron purificadas a partir de gel de agarosa con la
utilización del Kit Wizard ® SV Gel and PCR CleanUp System. Las secuencias fueron editadas con el
programa Genius versión 7.0 y alineadas con las
secuencias depositadas en el GENBANK mediante
la utilización de la herramienta BLAST.
Análisis estadístico.- El análisis porcentual de los
resultados se realizó mediante el empleo de Microsoft
Office Excel 2010 (©2010 Microsoft Corporation).
Para el estudio de los resultados obtenidos tanto en
la serotipificación como en la presencia de genes de
virulencia, y resistencia a antimicrobianos, se utilizó
el método estadístico de análisis de correspondencias
múltiples (MCA), con el cual se determinó la
contribución de varios factores en un simple
evento o resultado, mediante la comparación de los
diferentes serotipos utilizados, con la presencia de
genes y la resistencia a antibióticos individualmente.
Para este análisis se empleó el programa estadístico
informático “Statistical Package for the Social
Sciences” (SPSS) versión 12.0.
RESULTADOS
Población de estudio.- De los 79 aislados, 61
muestras (77.20 %) fueron obtenidas a partir de heces,
18 muestras (22.8 %) a partir de secreciones vaginales.
Identificación serológica de las especies del género
Shigella.- Por medio del método de aglutinación en
lámina se obtuvo la identificación de las especies
del género Shigella, obteniéndose 51 aislados (64.6
%) positivos para Shigella flexneri, 23 aislados (29.1
%) para Shigella sonnei, 5 aislados (6.3 %) positivos
para Shigella boydii, y 0 % de aislados positivos para
Shigella dysenteriae (Figura 1).
Figura 1. Porcentaje de identificación de las diferentes especies
en la población total de aislados de Shigella spp. N=79
71
De los 51 aislados de Shigella flexneri, 33 (64.7 %) fueron
aislados de heces y 18 (35.3 %) de secreción vaginal.
De los 23 aislados de Shigella sonnei, 23 (100 %) fueron
aislados de heces. De los 5 aislados de Shigella boydii,
también el 100 % fueron aislados de heces.
Sensibilidad a los antimicrobianos.- La
sensibilidad a antimicrobianos obtenida para
los diferentes antibióticos enfrentados con los
aislados de Shigella spp., se observa en la Figura
2. Analizando globalmente el género, se observó
que 76 aislados (96.2 %) presentan una resistencia a
tetraciclina, 75 aislados (94.9 %) fueron resistentes a
ampicilina, 68 aislados (86.1 %) fueron resistentes a
trimetoprima/sulfametoxazol, 67 aislados (84.8 %)
presentaron resistencia a cloranfenicol, 7 aislados
(8.9 %) fueron resistentes a ácido nalidíxico,
4 aislados (5.1 %) presentaron resistencia a
nitrofurantoina y no se encontró aislamientos
con resistencia a ciprofloxacino, azitromicina ni a
ceftriaxona, (Figura 2). Como control positivo fue
incluido el análisis de las cepas ATCC: S. sonnei
25931, S. boydii (1) 9207 y S. flexneri (2b) 12022,
las cuales mostraron sensibilidad a todos los
antibióticos utilizados.
Figura 2. Porcentaje de resistencia a antibióticos dentro de la
población de Shigella spp. N=79
Detección molecular de los genes de virulencia en
Shigella spp.- Para el gen 16S ARNr se obtuvo un
98 % de identidad, para el gen ipaH se obtuvo un
100 % de identidad, para el gen ial se obtuvo el 99
% de identidad en un total de 10 secuencias donde
se producen alineamientos significativos, para el
gen set1A se obtuvo 100 % de identidad y para el
gen set1B se obtuvo un 99 % de identidad.
Figura 3. Representación fotográfica en gel de agarosa de la
amplificación de los genes ipaH, ial, set1A y set1B en Shigella
spp. M, marcador de peso molecular (100pb); Pocillo 1, control
positivo gen ipaH cepa CB-QCA 3349 Shigella flexneri; Pocillo
2, muestra positiva de Shigella spp. para el gen ipaH; Pocillo
3, control positivo gen ial cepa CB-QCA 3349 Shigella flexneri;
Pocillo 4, muestra positiva de Shigella spp. para el gen ial; Pocillo
5, control positivo gen set1A cepa CB-QCA 3349 Shigella flexneri;
Pocillo 6, muestra positiva de Shigella spp. para el gen set1A;
Pocillo 7, control positivo gen set1B cepa CB-QCA 3349 Shigella
flexneri; pocillo 8, muestra positiva de Shigella spp. para el gen
set1B; Pocillo 9, control negativo, agua de grado molecular.
el gen ial se presentó en 65 aislados (82.3 %), 47
aislados (59.5 %) presentaron el gen set1B y 32
aislados (40.5 %) el gen set1A. Ningún aislado
evidenció presencia del gen Stx (Figura 4). Seis
aislados (7.6 %) no presentaron ningún gen de los
analizados en este estudio.
Figura 4. Porcentaje de presencia de los genes set1A, set1B, ial,
ipaH y Stx en la población total de aislados de Shigella spp. N=79
Según el análisis estadístico existe alta
heterogeneidad en los patrones de resistencia al
relacionarlos con las especies con una concentración
superior de casos de S. flexneri multirresistentes en
relación con las otras especies.
Análisis de presencia o ausencia de genes de
virulencia.- El análisis de la presencia de los genes
fue evidenciado mediante la amplificación en gel
de agarosa obteniéndose las bandas con el peso
específico para cada gen estudiado (Figura 3).
La presencia de los cuatro genes ipaH, ial, set1A y
set1B en conjunto se encuentra exclusivamente en
S. flexneri. Para S. sonnei se observó una mayor
concentración de casos con presencia de genes
set1A y set1B. En el caso de S. boydii se observó una
mayor presencia del gen ial.
Los resultados obtenidos para el total de 79 indican
que 72 aislados (91.1 %) presentaron el gen ipaH,
En la Tabla 2 se encuentran en detalle los patrones
de virulencia en Shigella. Shigella flexneri tiene
Resistencia y virulencia en Shigella spp
Villacrés et al.
72
principalmente el patrón de virulencia 1 con la
presencia de los genes ipaH, ial, set1A y set1B
con 28 aislados que indican la producción de la
enterotoxina 1 (set1A y set1B), la producción de
los genes de la invasión y colonización del epitelio
intestinal (ipaH) y de la producción de adhesinas
e invasinas que permiten la diseminación
intercelular de la bacteria (ial). En esta especie
todos los aislados presentaron el gen ipaH excepto 4
aislados que no tuvieron ningún gen. En la especie
S. sonnei el patrón de virulencia prevalente fue
el 4 con la presencia de los genes ipaH, ial y set1B
en 11 aislados. En esta especie todos los aislados
presentaron el gen ipaH excepto 2 aislados que no
tuvieron ningún gen. Finalmente en la especie S.
boydii se vio principalmente el patrón de virulencia
ipaH, set1B, ial y el patrón ipaH, ial. Todos los
aislados en esta especie tuvieron el gen ial.
Entre los marcadores fenotípicos la serotipificación
es el método de mayor agudeza para la especiación
del género Shigella. Este método permite realizar
estudios de vigilancia que determinen la prevalencia
de serogrupos y serovariedades en diferentes
zonas geográficas, ya sea en estudios de brotes o
de casos esporádicos (Guerrant et al., 1999). En este
estudio se utilizó con el 100 % de éxito el método de
serotipificación en los aislados de Shigella se obtuvo
la presencia de las especies S. flexneri, S. sonnei y S.
boydii. No se han registrado en revistas indexadas,
hasta la fecha, cepas de S. dysenteriae en el Ecuador
ni en 10 años de vigilancia de la resistencia (Zurita,
2012). En este estudio, mediante serología, no se
identificó S. dysenteriae.
Estudios relativos a la identificación de especies
dentro del género Shigella han determinado que
Tabla 2. Patrones de virulencia mostrados por los aislados de Shigella spp.
Especies
Genotipos de virulencia
Patrón
S. flexneri
1
ipaH,set1A,set1B, ial
28
2
ipaH, ial
7
3
ipaH, set1A, ial
1
4
ipaH, set1B, ial
5
S. sonnei
S. boydii
Total de cepas
%
28
35.4
20.3
7
2
16
1
1.3
6
11
2
19
24.1
ipaH, set1A
2
1
3
3.8
6
ipaH
3
2
5
6.3
7
ial
1
1.3
8
ninguno
6
7.6
79
100.0
Total
1
4
2
51
23
5
ipaH, invasión plasmid antigen H; ial, invasión-associated locus; set1A, enterotoxina 1-subunidad A; set1B, enterotoxina 1-subunidad B.
DISCUSIÓN
Las enfermedades diarreicas a nivel mundial han
sido atribuidas a diferentes agentes infecciosos y
uno de los más comunes es Shigella. Mundialmente
se producen unos dos mil millones de casos de
diarrea cada año y se consideran como la segunda
mayor causa de muerte de niños menores de
cinco años (OPS, 2009). A nivel de Latinoamérica
y el Ecuador las enfermedades diarreicas agudas
(EDA) son la segunda causa de morbilidad en la
población en general y de mortalidad en niños
menores de 5 años y adultos mayores (INEC,
2009). Al ser las enfermedades transmitidas por
alimentos un problema de salud a nivel mundial se
considera imprescindible realizar la capacitación en
identificación y determinación de la sensibilidad de
los antibióticos en enfermedades entéricas debido a
razones epidemiológicas (OPS, 2009).
REMCB 36 (2), 2015
en países en vías de desarrollo la circulación
prevalente es de S. flexneri y S. dysenteriae; mientras
que, S. sonnei y S. boydii son característicos en
países industrializados.
En el presente estudio se observó que la especie
más común es S. flexneri con un 64.6 %, seguida por
S. sonnei con un 29.1 %, S. boydii con un 6.3 % y
no se reportó S. dysenteriae. Estos datos concuerdan
con los datos publicados para Latinoamérica,
especialmente estudios realizados en Brasil,
Uruguay, Cuba y Argentina donde la información
para la prevalencia de estas especies de Shigella
es similar (Mota et al., 2005; Merino et al., 2004;
Ramírez et al., 2004; Silva et al., 2008).
Durante años las enfermedades diarreicas como
la shigelosis han sido tratadas mundialmente
con el uso de antibióticos como trimetoprima/
sulfametoxazol, ampicilina, ciprofloxacino y
azitromicina (Silva et al., 2008). Sin embargo, la
73
aparición de aislados multirresistentes ha limitado
el tratamiento y ha incrementado la prevalencia
de la enfermedad (Silva et al., 2008). La diversidad
de fenotipos de resistencia mostrados por los
aislados pudiera deberse a que la resistencia de
este es mediada por plásmidos, con la excepción
para quinolonas y azitromicina y además por
integrones o transposones que estén incorporados
al cromosoma bacteriano (Ramírez et al., 2004).
Estudios competentes relacionados con la
resistencia a antimicrobianos en Shigella spp. en
países de Latinoamérica como Brasil, Chile, Cuba,
Argentina, y Uruguay reportan una alta resistencia
a los antibióticos trimetoprima/sulfametoxazol,
cloranfenicol y ampicilina (Silva et al., 2008; Boehme
et al., 2002; Ramírez et al., 2004; Vila et al., 1994;
Mota et al, 2005). Mientras que para países como
Canadá, Senegal e India se reporta una resistencia a
la ampicilina y tetraciclina (Bassa et al, 2010).
Para Ecuador según Zurita (2012) el porcentaje
de resistencia en Shigella flexnerii a ampicilina,
tetraciclina,
trimetoprima/sulfametoxazol
y
cloranfenicol sobrepasa el 60 %. Durante la
vigilancia del año 2000 al 2010 no se han detectado
aislamientos de Shigella resistentes a cefalosporinas
de tercera generación y quinolonas. Las otras
especies de Shigella como S. boydii y S. sonnei se
aíslan en bajo número por lo que, no permiten sacar
conclusiones de porcentaje resistencia. No se han
detectado aislamientos de S. dysenteriae durante
estos diez años de vigilancia.
En este estudio se observó una alta resistencia
a tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina y
trimetoprima/sulfametoxazol lo que concuerda
con los datos reportados a nivel mundial y
especialmente en Latinoamérica (Bassa et al.,
2010; Zurita, 2012).
Debido a que en los niños no está indicado el uso
de ciprofloxacino, se recomienda alternativamente
utilizar el ácido nalidíxico (Replogle et al., 2000), pero
el inconveniente es que su uso genera rápidamente
resistencia. La cefalosporina de tercera generación
como ceftriaxona está indicada para lactantes que
requieren hospitalización debido a la gravedad del
cuadro clínico. En adultos y niños menores de 5
años está indicado ciprofloxacino como droga de
primera elección y la azitromicina está indicada
para los niños que pueden ser manejados en forma
ambulatoria (Saurina et al., 2000).
En este estudio 18 aislamientos provinieron de
muestras de secreción vaginal aisladas en niñas
menores de 9 años. La vulvovaginitis causada
por Shigella, se debe a colonización de la zona
perianal por un cuadro anterior de diarrea y
que por la proximidad anatómica llega a la zona
genital, causa un proceso inflamatorio de la vulva
y vagina acompañado de sangrado. Esto se debe
a que la fisiopatología de Shigella se manifiesta
de igual manera que en el epitelio intestinal, en
el epitelio vaginal que está exento de estrógenos
(Ocampo et al., 2014).
El género Shigella produce principalmente
enfermedades diarreicas que pueden llevar a
serias complicaciones debido a que las diferentes
especies integrantes del género presentan factores
de virulencia como genes de invasión celular,
enterotoxinas y exotoxinas que afectan severamente
al paciente, lo cual posteriormente en casos severos
puede llevar a la muerte (Jiménez y Achí, 2009).
El gen ipaH es considerado uno de los genes más
estables y presentes en todas las especies de Shigella
en razón que se encuentra tanto en el cromosoma
bacteriano como en múltiples copias en ADN
plasmidial (Lin Thong et al., 2005) además este
gen se encuentra identificado en otras bacterias
patógenas como en E. coli enteropatógena, por lo
que se lo considera un gen con altas características
virulentas (Aranda et al, 2004). En los análisis
realizados el gen ipaH fue encontrado en el 91.1 %
de los aislados, postulándose como el de mayor
presencia dentro de los genes analizados en este
estudio. La variación de este porcentaje con lo
descrito por otros autores se puede deber a que
las cepas negativas sufrieron mutación o deleción
del gen (Silva et al., 2008). Aunque esto es muy
poco probable ya que el gen se encuentra en el
cromosoma bacteriano y en copias en el plásmido
de invasión, estos casos se observan en cepas poco
virulentas o algunas que se han mantenido en
congelación por mucho tiempo como es el caso de
los aislados utilizados en este estudio (Silva et al.,
2008). Siete aislados (8.9 %) no presentaron el gen
ipaH de estos 6 (7.6 %) tampoco presentaron los
otros genes de estudio.
Aunque el gen ial está encargado de permitir la
invasión celular, en algunos casos no se observó
la presencia de éste. Tal comportamiento se debe
a que el gen ial reside en una región del plásmido
que es un “hot spot” para deleción espontánea
(Lin Thong et al., 2005). En este estudio se
comprobó esta afirmación obteniéndose una
presencia del gen en los aislados estudiados del
82.3 % y es el segundo gen presente dentro de los
analizados en este trabajo.
En estudios anteriores autores describen que
la presencia de los genes set1A y set1B juntos,
únicamente se observan en la especie S. flexneri
Resistencia y virulencia en Shigella spp
Villacrés et al.
74
concluyéndose que estos genes se encuentran
altamente conservados en esta especie (Noriega et al.,
1995; Vargas et al., 1999). Según los datos recopilados
en este análisis, se ratifica lo antes mencionado
porque se obtuvo un 35.4 % de presencia de estos
genes juntos y dentro de este porcentaje el 100 %
de los aislados positivos pertenecen a la especie
S. flexneri, es decir que al presentarse en conjunto
estos dos genes únicamente en la especie S. flexneri
se podría afirmar que esta es la única especie
productora de la enterotoxina ShET-1.
La presencia de uno de los genes no indica que
la cepa sea virulenta por lo que es importante
evaluar los resultados globalmente (Lin Thong et
al., 2005). En este estudio se formaron patrones
de virulencia según los genotipos encontrados en
los aislados estudiados. El patrón de virulencia
con mayor presencia es el número 1 (ipaH, set1A,
set1B, ial) lo que significa que la mayoría de los
aislados presentan 4 de los 5 genes estudiados.
Estos resultados sugieren que la mayoría de cepas
aisladas son de carácter altamente virulento.
Los análisis estadísticos demostraron que existe
una relación entre las especies y su patogenicidad
y virulencia, así se determinó a la especie S. flexneri
con la mayor presencia de los genes de virulencia
estudiados y con la mayor multirresistencia
a antimicrobianos. Las especies S. sonnei y S.
boydii presentan a su vez genes de virulencia y
multirresistencia pero en menor proporción que la
especie S. flexneri.
Los resultados conseguidos en este estudio
representan los primeros relacionados con genes
de virulencia y resistencia a antibióticos en el país.
En esta bacteria se observó claramente la presencia
de cepas multirresistentes a antibióticos utilizados
comúnmente como tratamiento primario de
shigelosis, esto, combinado con la alta virulencia de
las cepas, representa un problema para el control y
tratamiento de esta bacteria.
CONCLUSIONES
•La mayor prevalencia se determinó en la especie
S. flexneri (64.6 %), seguida de la especie S. sonnei
(29.1 %) y finalmente la especie S. boydii (6.3 %).
No se identificaron aislados pertenecientes a la
especie S. dysenteriae.
•Los aislados de Shigella flexneri, S. sonnei
y S. boydii presentaron mayor resistencia
a tetraciclina, seguido de ampicilina,
trimetoprima/sulfametoxazol y finalmente,
cloranfenicol. Mientras que presentaron una
REMCB 36 (2), 2015
muy baja resistencia a nitroflurantoina. No se
registraron aislados de Shigella con resistencia
a ciprofloxacino, azitromicina ni a ceftriaxona.
•Los genes de virulencia se encuentran en alta
proporción en los aislamientos de Shigella
principalmente los genes ipaH e ial. Los genes
ipaH permiten la invasión y colonización del
epitelio intestinal y los genes ial la formación
de adhesinas e invasinas y la diseminación
intercelular de la bacteria.
•Los genes set1A y set1B productores de
la enterotoxina 1 ShET-1 se encontraron
exclusivamente en la especie S. flexneri que es
la especie prevalente lo que contribuye a una
mayor toxicidad.
•No se encontró Shigella toxin, esto se debe que esta
toxina es producida en su mayoría para la especie
S. dysenteriae y en el análisis no se identificó esta
especie dentro de las muestras aisladas.
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean agradecer al grupo de trabajo
del Laboratorio de Microbiología de la Escuela
de Ciencias Biológicas, PUCE, Quito, a todo
el personal de Zurita & Zurita Laboratorios y
del hospital Vozandes, Quito. Este estudio fue
realizado con fondos del Proyecto “Diversidad
Genómica y perfil de resistencia a antimicrobianos
en bacterias entéricas” (Código de Proyecto
G13019) y del proyecto “Genotipaje de la resistencia
a antimicrobianos en bacterias entéricas” (Código
G13034) financiados por la Pontificia Universidad
Católica del Ecuador.
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77
NOTA CIENTÍFICA
Redescubrimiento de Sigmodon inopinatus
(Rodentia: Cricetidae) en los Andes occidentales
de la provincia de Tungurahua, Ecuador
Diego G. Tirira1, 2 y Andrea Vallejo-Vargas1
Museo de Zoología, Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito, Ecuador.
Fundación Mamíferos y Conservación, Quito, Ecuador. diego_tirira@yahoo.com
1
2
Recibido: 2015-07-30; aceptado: 2015-10-05
RESUMEN.- Sigmodon inopinatus es una especie endémica de los Andes occidentales del Ecuador y es
unos de los roedores más raros y menos conocidos del país. Su presencia ha sido documentada previamente
en tres localidades de dos zonas de las provincias de Chimborazo y Azuay. La presente nota científica
reporta una cuarta localidad para la especie luego de 30 años del último hallazgo (y a 92 años del primero)
y extiende su rango de distribución conocida en 33 kilómetros al norte. Este también es el primer reporte
para la especie fuera de un área protegida y en una zona medianamente intervenida. Se comenta sobre la
abundancia y conservación de la especie.
PALABRAS CLAVES: abundancia, conservación, Cordillera Occidental, extensión de distribución, páramo.
ABSTRACT.- Sigmodon inopinatus is endemic to the Western Andes of Ecuador and one of the rarest and
least known species of rodents in this country. Its presence has been previously documented in two areas
and three locations in the provinces of Chimborazo and Azuay. This scientific note reports a fourth locality
for the species, after 30 years of the latest finding (and 92 years of the first) and extends its range known
in 33 kilometers to the north. This is also the first report for the species outside a protected area and in a
moderately impacted site. We comment on the abundance and conservation of the species.
KEYWORDS: abundance, conservation, Cordillera Occidental, distribution extension, paramo.
INTRODUCCIÓN
El género Sigmodon tiene amplia distribución
en el continente. Se lo encuentra desde
aproximadamente los 41º N, en los Estados Unidos,
a través de México y Centroamérica, hasta el norte
y noroccidente de Sudamérica (Voss, 2015). El
género incluye 13 especies (UICN, 2015), cuatro
de ellas en Sudamérica y dos presentes en la fauna
ecuatoriana: S. inopinatus (endémica para los Andes
occidentales del país) y S. peruanus (de los bosques
secos del suroccidente de Ecuador y noroccidente
de Perú; Voss, 2015; Tirira, 2007).
Sigmodon inopinatus Anthony, 1924 (o rata
algodonera ecuatoriana), es una de las especies
de roedores menos conocidas en el Ecuador, pues
se ha reportado únicamente de tres localidades
en dos áreas separadas del país (Tirira, 2011). Su
distribución se restringe a las partes altoandinas de
la Sierra centro y sur, dentro de los páramos de la
Cordillera Occidental de los Andes, en las provincias
de Chimborazo y Azuay (Tirira, 2007; Voss, 1992).
La especie fue descrita sobre la base de 11 ejemplares
colectados por George H. H. Tate y Harold E.
Anthony, entre el 24 y 26 de octubre de 1923, en
el páramo de Urbina (01º30’S, 78º44’W; Voss, 1992),
laderas nororientales del volcán Chimborazo, a una
altitud de 11 400 pies (3 474 metros sobre el nivel
del mar; Voss, 1992). Anthony (1924) indica que la
colección de esta serie fue uno de los hallazgos más
inesperados y sorpresivos de su extenso estudio
de campo en el Ecuador, en alusión a que era la
primera vez que el género Sigmodon era registrado
a tan elevada altitud; de hecho, hasta el presente, S.
inopinatus es la especie que mayor altitud alcanza
dentro del género (Voss, 2015, 1992).
Redescubrimiento de Sigmodon inopinatus
Tirira y Vallejo-Vargas
78
Un segundo hallazgo para la especie ocurrió en
1981, 59 años más tarde, en Chaupiurcu (02º53’S,
79º19’W; 3 750 metros), páramo del Cajas, provincia
de Azuay, a unos 170 kilómetros sur de la localidad
tipo (Barnett, 1999); en los años siguientes (1983 y
1984), otros tres ejemplares fueron capturados en
los alrededores de la laguna La Toreadora (02º46’S,
79º13’W; 4 000 metros), en la misma zona del
Cajas (Barnett, 1999; Voss, 1992). Desde entonces,
la especie no había sido vuelta a colectar, hasta el
hallazgo que se documenta en esta nota científica.
Todas las localidades de colección mencionadas
se encuentran dentro de la formación ecológica de
páramo, una forma andina caracterizada por tener
un clima frío, mayormente húmedo y cubierto de
vegetación herbácea (principalmente gramíneas),
habitualmente de pronunciada pendiente y con valles
planos y húmedos cubiertos por áreas pantanosas o
vegetación de tipo almohadilla (Voss, 1992).
Los sitios de colección en la provincia de Azuay
estuvieron en zonas húmedas, ligeramente pantanosas
y próximas a cuerpos de agua (Barnett, 1999); mientras
que en la provincia de Chimborazo fueron en zonas
con buen drenaje y ligera pendiente (Voss, 1992;
Anthony, 1924). Se desconocen sus refugios.
Aspectos reproductivos sobre la especie son
desconocidos. La única información documentada
es que dos hembras presentaron cuatro embriones
cada una (una en julio y otra en octubre; Barnett,
1999; Anthony, 1924), número que estaría dentro
del rango inferior que se ha indicado para el género
(Barnett, 1999).
La especie ha sido categorizada como En Peligro, de
acuerdo con el Libro Rojo de los mamíferos del Ecuador
(Tirira, 2011), y como Vulnerable, según la Lista
Roja de la UICN (UICN, 2015). Los localidades de
colección indicadas corresponden a sendas áreas
protegidas: Reserva de Producción Faunística
Chimborazo y Parque Nacional Cajas (Tirira, 2007).
MATERIALES Y MÉTODOS
Área de estudio.- El hallazgo que se documenta
a continuación se realizó en las estribaciones
occidentales de la provincia de Tungurahua, en la
localidad conocida como Chiquiurco (01º15’16”S,
78º44’36”W; ca. 3 460 metros de altitud), a 20
kilómetros al oeste de Ambato, cantón Ambato.
La zona corresponde al ecosistema Herbazal del
páramo (Salgado et al., 2013). Se caracteriza por
la dominancia de gramíneas amacolladas con
una altura superior a 50 cm. La flora gramínea
representativa de este ecosistema corresponde a los
REMCB 36 (2), 2015
géneros Agrostis, Calamagrostis, Cortaderia, Festuca y
Stipa, junto con parches de arbustos de los géneros
Diplostephium, Hypericum y Pentacalia; además,
posee una abundante diversidad de hierbas de
roseta, rastreras y diversas formas de vida (Salgado
et al., 2013; Ramsay y Oxley, 1997).
La estructura de este ecosistema y composición de
la vegetación está influenciada fuertemente por
las quemas asociadas con la ganadería extensiva
(Salgado et al., 2013); aunque no se confirmó la
quema del páramo durante la visita de campo,
fue evidente la presencia de ganado vacuno en los
alrededores del punto donde se registró este roedor.
El clima en la zona es frío y posee alta humedad
(entre 80 y 90 %; Salgado et al., 2013).
Identificación.- El espécimen fue identificado con
la ayuda de la clave dicotómica de Voss (2015), la
descripción original de la especie de Anthony (1924)
e información complementaria disponible en Tirira
(2007). Para la identificación y como referencias se
tomaron ciertas medidas corporales y craneales,
según propone Voss (1992, 1988).
El ejemplar fue depositado en el Museo de Zoología
de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador
(QCAZ), de la ciudad de Quito.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El 21 de octubre de 2014 se encontró un macho
adulto de Sigmodon inopinatus (QCAZ 15672;
número de campo QKM 53000) en la localidad de
Chiquiurco, a menos de 200 metros del reservorio
de agua homónimo, que extiende en 33 kilómetros
al norte la distribución previamente conocida para
la especie. El sitio del hallazgo tenía una moderada
pendiente y la vegetación circundante era típica
de páramo, según se describió anteriormente.
El individuo fue encontrado muerto sobre una
almohadilla, en un estado inicial de descomposición
que facilitó una adecuada preservación.
Las medidas tomadas al espécimen QCAZ
15672 fueron las siguientes (en milímetros; entre
paréntesis se indican las medidas del holotipo,
según Anthony, 1924, y entre corchetes el mínimo
y máximo reportado para la especie en Tirira,
2007): longitud de la cabeza y el cuerpo 118 (160)
[136–167]; largo de la cola 79.5 (99) [78–79]; largo
de la pata posterior 27.8 (31) [28–30]; largo de la
oreja 18.6 [14–22]; largo de las vibrisas mayores
32.6; largo del cráneo 33.0 (35.6); ancho del cráneo
14.8; longitud del hueso nasal 12.9 (12.8); largo de
la hilera dental superior 18.2; largo de la hilera
dental inferior 14.8; largo del maxilar inferior 23.4;
79
ancho del cóndilo occipital 12.5; ancho del foramen
incisivo 2.4; alto de los incisivos 6.9. Otras medidas
tomadas se indican en la tabla 1, junto con valores
reportados por Voss (1992); todas las medidas
tomadas siguieron los criterios de Voss (1988).
Las características del espécimen QCAZ 15672
coindicen que las indicadas en la descripción de
la especie por Anthony (1924) y las reportadas por
Tirira (2007), que son: pelaje denso y suave; dorso
de color marrón oscuro amarillento con numerosos
pelos negruzcos entremezclados y unos pocos
pelos sobresalientes con las puntas blancas que
le dan un ligero aspecto canoso; región ventral
de color marrón grisáceo con la base de los pelos
de color gris oscuro. Hocico redondeado y romo;
ojos relativamente grandes; orejas redondeadas,
negruzcas y bien peludas; vibrisas cortas y escasas.
Cola más corta que la longitud de la cabeza y el
cuerpo (alcanzó un 67 %), bicolor (con pelos
oscuros por arriba, ligeramente más pálidos por
debajo). Patas posteriores largas y angostas, con
la piel de la parte superior negra y recubierta de
pelos de color marrón grisáceo; las plantas también
fueron negras. Anthony (1924) indica que en la
serie capturada en Urbina existió poca variación en
el color de los individuos.
En cuanto a las medidas corporales y craneales
registradas, la mayoría de ellas se encuentran dentro
de los rangos, o con mínimas variaciones, a las
reportadas para la especie por Tirira (2007) y Voss
(1992), con excepción de la longitud de la cabeza y
el cuerpo, lo cual demostraría que se trataba de un
individuo joven y que todavía no había alcanzado el
tamaño corporal de un adulto, algo que también es
corroborado con el largo de la cola, que se encontraría
dentro del rango inferior para la especie.
Abundancia.- La evidencia indica que Sigmodon
inopinatus es una de las especies de roedores más
difíciles de encontrar en el Ecuador, según sugirió
Tirira (2007) al tratarla como una especie rara.
Durante el estudio de campo de 1923, G. H. H. Tate
y H. E. Anthony colectaron 51 micromamíferos
no voladores en la zona de Urbina durante
tres días consecutivos, con la captura de cuatro
especies correspondientes a los géneros Akodon,
Microryzomys, Thomasomys y Cryptotis; además
de los 11 ejemplares de Sigmodon inopinatus, que
representaron un 18 % del total de capturas (según
catálogo del American Museum of Natural History,
AMNH, en Tirira, 1995–2015).
En el estudio efectuado en el páramo del Cajas
que permitió la captura de una nueva serie de S.
inopinatus, entre 1981 y 1987, con un esfuerzo de 5 942
noches de trampeo, se capturaron 483 pequeños
mamíferos no voladores correspondientes a 19
especies; de los cuales, apenas cinco ejemplares
(1 %) fueron Sigmodon inopinatus; esto es un éxito
de captura de 0.0001 por trampa utilizada.
Entre los esfuerzos fallidos por registrar esta
especie, en un rango de 30 kilómetros a la redonda
de las localidades de colección indicadas por
Barnett (1999) y Anthony (1924), se tienen los
siguientes resultados:
En las mismas estribaciones del volcán
Chimborazo (en altitudes superiores a los 3 400
metros) se pueden mencionar las siguientes
colecciones: entre 1930 y 1931, Franz Spillman
colectó cuatro ejemplares correspondientes a los
géneros Akodon y Thomasomys (Tirira, 2013). En
mayo de 1939, A. Mena y A. Proaño capturaron 21
Tabla 1. Medidas craneales tomadas a Sigmodon inopinatus en tres localidades.
Medida
Chiquiurco
Urbina
Cajas
(QCAZ 15672. m)
(AMNH 2 m. 6 h)
(BMNH 82.814. m)
Longitud cóndilo basalincisivos
32.8
32.6 (29.4–34.8)
34.2
Largo del diastema
9.7
9.5 (8.0–10.6)
10.5
Largo oclusal de los morales
7
6.7 (6.6–6.8)
6.8
Ancho del primer molar
2.35
2.2 (2.1–2.4)
2.2
Largo del foramen incisivo
7.2
7.3 (6.4–8.1)
7.8
Ancho del puente del palatino
3.5
2.7 (2.3–3.4)
3
Ancho de la placa cigomática
3.9
4.0 (3.4–4.6)
3.9
Menor ancho interorbital
4.6
4.3 (4.0–4.4)
4.8
Profundidad de los incisivos
2.2
1.9 (1.6–2.0)
2
Ancho de los incisivos
3.1
2.8 (2.3–3.1)
3.3
Ancho cigomático
20
20.2 (18.7–21.4)
21.6
Datos de Urbina y Cajas provienen de Voss (1992). Todas las medidas se indican en milímetros; m = macho; h = hembra. Acrónimos
de colección en anexo 1. Las medidas tomadas siguen a Voss (1992, 1988).
Redescubrimiento de Sigmodon inopinatus
Tirira y Vallejo-Vargas
80
ratones correspondientes a los géneros Phyllotis y
Thomasomys (catálogo del Field Museum of Natural
History, en Tirira, 1995–2015). En la misma zona de
Urbina, Alfred L. Gardner realizó el 16 de agosto
de 1976 un muestreo con la captura de siete ratones
correspondientes a dos especies de los géneros
Akodon y Phyllotis (catálogo del United States
National Museum, en Tirira, 1995–2015).
(con las cuencas de los ríos Chanchán y Cañar
de por medio). En tal escenario, es importante
realizar nuevos muestreos en localidades donde su
presencia sea esperada, con la finalidad de conocer
mejor sobre el estado de conservación de esta
especie; hasta tanto, se considera que la categoría
de conservación asignada por el Libro Rojo de los
mamíferos del Ecuador (Tirira, 2011) está justificada.
En un muestreo efectuado en julio de 1913,
antes del descubrimiento de esta especie, en las
mismas laderas del volcán Chimborazo, William
B. Richardson, reportó la captura de siete ratones
del género Thomasomys (catálogo del AMNH, en
Tirira, 1995–2015).
AGRADECIMIENTOS
En la provincia de Azuay, en la zona del páramo
del Cajas, durante distintos muestreos efectuados
entre 1922 y 2004, se colectaron entre 3 200 y
4 100 metros de altitud, un total de 373 cricétidos
correspondientes a siete géneros y 11 especies
(Tirira, 1995–2015).
En una evaluación ecológica rápida efectuada
entre octubre y noviembre de 2014 por los autores
de esta nota, en dos localidades del suroccidente
de la provincia de Tungurahua y al norte del
volcán Chimborazo, se capturaron 12 ratones
correspondientes a tres especies de los géneros
Akodon, Microryzomys y Thomasomys, con un
esfuerzo de seis días de muestreo y 50 trampas/día
(Tirira, 1995–2015).
Conservación.- La vegetación nativa en el área del
registro reveló un moderado estado de conservación,
sin ser evidentes impactos relevantes, como quemas,
reemplazo de la vegetación nativa por cultivos o
pastos introducidos o siembra de pinos. La única
amenaza a considerar es la presencia de ganado
vacuno disperso, con los consiguientes impactos de
pastoreo y pisoteo de los animales. La localidad no
se encuentra dentro de ninguna área protegida.
De acuerdo con Tirira (2011), la principal amenaza
para la especie es la pérdida de su hábitat natural,
algo que ya fue documentado por H. Anthony en
sus apuntes de campo durante la colección de la
serie tipo: “the atmosphere was too smoky for successful
photography because the local people were burning
the grass” [“la atmosfera era demasiado densa y
estaba cubierta de humo, lo cual no ayudaba para
la fotografía debido a que los campesinos locales
quemaban el pajonal]” (Voss, 1992).
Otro factor a considerar es lo restringida y
discontinua que es la distribución de S. inopinatus,
pues se conoce solamente de dos áreas separadas
y con pocas probabilidades de conexión entre ellas
REMCB 36 (2), 2015
El hallazgo ocurrió durante la evaluación del
“Estado actual del ecosistema páramo en la provincia
de Tungurahua”, un proyecto de Geoinformática
y Sistemas Cia. Ltda. y el Gobierno Provincial de
Tungurahua, bajo financiamiento de la Corporación
Alemana para el Desarrollo (Deutsche Gesellschaft
für Internationale Zusammenarbeit, GIZ). A Efrén
Alvarado y Milton Tirado, quienes participaron de
la salida de campo donde se colectó el espécimen
y aportaron con información sobre el área de
estudio. A Ma. Alejandra Camacho y Santiago
Burneo, del Museo de Zoología de la Pontificia
Universidad Católica del Ecuador (QCAZ), por el
apoyo brindado para la preparación y preservación
del espécimen colectado. A la Dirección Provincial
de Tungurahua del Ministerio del Ambiente por
el permiso de investigación (No 07-2015 IC-FLOFAU-DPAT/MA).
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Ecuadorian mammals. No. 4. American Museum
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History, 42(4): 161–217.
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geographic reference: 894−1531. 3a edición. The John
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Ramsay PM y Oxley ER. 1997. The growth form
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Ecuadorian paramos. Plant Ecology, 131: 173–192.
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Ecuador continental: 139–141. Subsecretaría de
Patrimonio Natural, Ministerio del Ambiente
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81
Tirira DG. 1995–2015. Red Noctilio. Base
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Tirira DG. 2013. Mamíferos ecuatorianos en museos
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Tirira DG. 2011. Rata algodonera ecuatoriana
(Sigmodon inopinatus). En: Tirira DG (ed), Libro
Rojo sobre los mamíferos del Ecuador: 121. 2a
edición. Fundación Mamíferos y Conservación,
Pontificia Universidad Católica del Ecuador y
Ministerio del Ambiente. Publicación especial
8. Quito, Ecuador.
Tirira DG. 2007. Guía de campo de los mamíferos
del Ecuador. Ediciones Murciélago Blanco.
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UICN. 2015. IUCN Red List of threatened species.
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and Natural Resources. Versión 2015.3. Página
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3050: 1–56.
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Ichthyomyine rodents (Muroidea): patterns of
morphological evolution in a small adaptive
radiation. Bulletin of the American Museum of
Natural History, 188(2): 259–439.
Anexo 1: Registros conocidos de Sigmodon inopinatus
Ejemplares [18]: Azuay, Chapiurcu: BMNH 82.814 (macho). La Toreadora: BMNH 84.348 (hembra; donado
a MEPN), 85.884 y 85.885 (sexo no indicado); además un ejemplar no colectado (sexo no indicado).
Chimborazo, Urbina: AMNH 66303 y 66311 (machos), 66304 a 66310 (holotipo), 66312, 66314 y 66512
(hembras). Tungurahua, Chiquiurco: QCAZ 15672 (macho).
Acrónimos de colecciones:
-AMNH: American Museum of Natural History, Nueva York
-BMNH: British Museum of Natural History, Londres
-MEPN: Museo de la Escuela Politécnica Nacional, Quito
-QCAZ: Museo de Zoología de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito
Fuentes: Tirira (1995–2015), Barnett (1999), Voss (1992), Anthony (1924).
Redescubrimiento de Sigmodon inopinatus
Tirira y Vallejo-Vargas
82
REMCB 36 (2), 2015
83
COLECCIONES DE MUSEO
Las colecciones biológicas: Los tesoros escondidos
de un país mega-diverso.
Claudia Segovia-Salcedo1, 2, Luis Carrasco3 y Néstor Acosta Buenaño3
Universidad de las Fuerzas Armadas, Departamento de Ciencias de la Vida, Sangolquí, Ecuador.
mcsegovia@espe.edu.ec
1
2
Proyecto iDigBio. University of Florida, Florida Museum of Natural History, Gainesville, Fl. USA.
Ministerio del Ambiente. Subsecretaría de Patrimonio Natural del Ecuador. Quito, Ecuador
luis.carrasco@ambiente.gob.ec, nestor.acosta@ambiente.gob.ec
3
Recibido: 2015-07-31; aceptado: 2015-10-05
Ecuador, a pesar de su reducido tamaño, alberga
una de las más altas concentraciones de diversidad
en el planeta y mucho de ella no está reflejada en
nuestras colecciones biológicas (Suárez, 2014). Su
ubicación en la intersección de la línea ecuatorial,
junto con los Andes y la Amazonía, contribuye a
su gran riqueza biológica. Grandes naturalistas
como el Baron Alexander von Humboldt (18021803), Jacques-Alexandre Goujoud Bonpland
(1799-1805), Charles Darwin (1835) entre otros, han
explorado y colectado en el Ecuador, y muchos de
esos especímenes ecuatorianos se encuentran en
los museos de Historia Natural más importantes
del mundo sin que científicos locales puedan
acceder. En la actualidad, la mayoría de los
especímenes ecuatorianos de colecciones recientes
se encuentran en instituciones locales públicas y
privadas, sin embargo, no sabemos con exactitud el
número de colecciones y de especímenes debido a
la falta de integración y apertura a la socialización
de quienes poseen estos datos. Esto ocasiona que
esta importante información no esté de forma
organizada y al alcance de investigadores locales e
internacionales, tomadores de decisiones y público
en general. A pesar que a nivel mundial se están
creando bases de datos y portales de biodiversidad
con acceso libre como Global Biodiversity
Information Facility (GBIF), Atlas of Living
Australia (www.ala.org.au), Integrated Digitized
Biocollection
(www.idigbio.org),
CONABIO
(Comisión Nacional para el Conocimiento y uso de
la Biodiversidad) (Janken, 2013), en nuestro país no
hemos iniciado un proceso nacional de inventario
de las colecciones biológicas para una posterior
digitalización. Los procesos de democratización de
la información de biodiversidad están creando una
mayor interacción entre el público y las colecciones,
fortaleciendo su existencia y además explorando
nuevas aplicaciones para el uso de las mismas en
diferentes sectores de la sociedad (Drew, 2011). El
objetivo de este artículo es presentar los resultados
de un breve inventario de las colecciones biológicas
del Ecuador con miras a la creación de la Base
Nacional de Datos de Biodiversidad (BNDB) y su
portal web dentro de la Subsecretaría de Patrimonio
Natural del Ecuador del Ministerio del Ambiente.
En los meses de enero a mayo del presente año
se inició este proceso como un primer intento de
integración de los herbarios, museos y colecciones
biológicas del Ecuador. A través de encuestas y
visitas a diferentes instituciones se obtuvo el número
de especímenes, tipos y fecha de fundación. Si
bien hemos logrado recopilar valiosa información,
algunas colecciones todavía deber ser encontradas
e incluidas. Como resultado de este proceso
descubrimos verdaderos tesoros para la comunidad
científica que se encuentran depositados en nuestro
país. El Instituto de Ciencias Biológicas de la Escuela
Politécnica Nacional (EPN) tiene la única colección
paleontológica con más de 10 000 especímenes:
alberga las colecciones mastozoológica e ictiológica
más grandes del Ecuador con ejemplares que datan
de inicios del siglo anterior como un mono araña
de la costa, Ateles fusciceps (1969, figura 1a), un
mono capuchino, Cebus albifrons, (1925, figura 1b)
que según Tirira (2015) actualmente corresponde
a Cebus aequatorialis, y musaraña andina, Cryptotis
equatoris (1951, figura 1c). Más de 30 000 ejemplares
de mamíferos se encuentran depositados en las
colecciones de la Pontificia Universidad Católica del
Ecuador (QCAZ), el Instituto de Ciencias Biológicas
de la EPN y el Museo Ecuatoriano de Ciencias
Naturales (MECN), con una representatividad
taxonómica del 70 % de nuestra mastofauna.
Colecciones Biológicas en el Ecuador
Segovia et al.
84
En el caso de los peces, las colecciones ictiológicas
de la EPN y el MECN albergan más de 10 000
especímenes catalogados y muchos más por
ser identificados. La mayoría de las muestras
pertenecen a la región de la Amazonía y representan
especialmente a las familias Characidae y
Loricaridae, convirtiéndole en un centro de
referencia para la zona norte de esta región.
Las colecciones entomológicas son las más grandes
del país con más de 1’300 000 ejemplares distribuidos
en cinco museos: QCAZ, MECN, EPN, Biblioteca
Aurelio Espinoza Pólit y USFQ. El museo QCAZ es
el que alberga la mayor cantidad de especímenes
con cerca de un millón de invertebrados, los grupos
con mayor representatividad son los Carábidos y
Lepidópteros. Otras colecciones importantes de
insectos se encuentran en la Fundación Biblioteca
Ecuatoriana Aurelio Espinoza Pólit (200 000
mariposas) y en la Universidad San Francisco de
Quito con un enfoque en invertebrados acuáticos
(aprox. 10 órdenes, número de especies no
determinado). El Museo Ecuatoriano de Ciencias
Naturales (MECN) es el mayor repositorio de
pieles de aves en el Ecuador con más de 8 000
especímenes con una representatividad del 80 % de
las especies de aves del país, que albergan varios
tipos y especímenes únicos.
En la última década las colecciones herpetológicas han
crecido exponencialmente con énfasis en los Andes y
la Amazonía, alcanzando más de 40 000 especímenes.
Los esfuerzos de varias instituciones (QCAZ,
JAMBATU, MECN) han llevado a un incremento
en el número de descripciones de nuevas especies
y por ende de publicaciones científicas (más de 30
artículos en una búsqueda utilizando las palabras
claves Ecuador y Herpetología en los últimos 10 años
a tráves de la base de datos Science Direct).
Finalmente, entre los 13 herbarios que brindaron
información mantienen más de 650 000
especímenes con énfasis en la Flora Amazónica y
Andina con información desde mediados del siglo
anterior. Las colecciones botánicas han permitido
clarificar el número, rango de distribución,
y estado de conservación de muchas de las
poblaciones vegetales en nuestro territorio, así
como la generación de varias obras de recopilación
de la Flora del Ecuador. Sin duda los herbarios
han sido las colecciones mejor organizadas y
preservadas en nuestro país. Es interesante conocer
Figura 1. Los especímenes más antiguos encontrados en las colecciones biológicas ecuatorianas ubicados en el Instituto de Ciencias
Biológicas de la Escuela Politécnica Nacional. A) Mono Araña de la Costa (Ateles fusciceps, 1969). B) Mono capuchino, Cebus albifrons,
(1925). C) Musaraña Andina (Cryptotis equatoris, 1951).
REMCB 36 (2), 2015
85
que en el Ecuador existe un herbario de Botánica
Económica en la USFQ, una Xiloteca (Herbario de
la Universidad Técnica del Norte) y una colección
botánica histórica perteneciente al Padre Sodiro
en la Fundación Biblioteca Ecuatoriana Aurelio
Espinoza Pólit (Tabla 1, Figura 2).
Tabla 1. Datos recolectados de las colecciones biológicas ecuatorianas en esta investigación.
HERBARIOS
Institución
Acrónimo
Año
Registros
Universidad Central del Ecuador
Q
1860
12 535
Tipos
Unidad Educativa Bolívar
UEB
1921
3 000
Universidad Nacional de Loja
LOJA
1949
45 000
Escuela Superior Politécnica del Chimborazo
CHEP
1966
16 724
Pontificia Universidad Católica del Ecuador
QCA
1971
200 000
1 000
Museo Ecuatoriano de Ciencias Naturales
QCNE
1977
238 598
1 888
Universidad Técnica del Norte
HUTN
1985
15 000
Universidad Central del Ecuador
QAP
1989
90 000
Universidad San Francisco de Quito
QUSF
1994
29 484
Universidad Técnica Particular de Loja
HUTPL
2002
15 000
66
7
Universidad Técnica del Norte
HUNT
2005
1 800
Universidad Tecnológica Indoamérica
HUTI
2012
900
2
Fundacion B.E. Aurelio Espinoza Polit
QPLS
2013
13 500
219
Universidad Tecnica de Cotopaxi
UTC
2015
TOTAL
3 000
684 541
3 182
Tipos
MUSEOS - VERTEBRADOS
Institución
Acrónimo
Año
Registros
Universidad Central del Ecuador
Q
1860
1 654
Unidad Educativa Bolívar
UEB
1921
3 000
Colegio Teodoro Gómez de la Torre
CTGT
1944
160
Escuela Politécnica Nacional
EPN
1946
55 259
Universidad Técnica de Ambato
MCCUTA
1969
555
Pontificia Universidad Católica del Ecuador
QCAZ
1973
15 500
Escuela Superior Politécnica del Chimborazo
ESPOCH
1975
20 000
Instituto Nacional de Biodiversidad - MECN
MECN
1977
42 023
FundaciónHerpetológica Gustavo Orcés
FHGO
1989
12 000
Universidad Técnica Particular de Loja
MUTPL
2005
500
Centro - Jambatu
CJ
2011
760
Pontificia Universidad Católica- Ambato
PUCA
2011
339
Universidad Tecnológica Indoamerica
MUZUTI
2011
8 186
Universidad San francisco de Quito
MUSI
2014
Fundacion B.E. Aurelio Espinoza Polit
FDPR
159
52
1
7 600
200 000
TOTAL
367 536
212
Registros
Tipos
MUSEOS - INVERTEBRADOS
Institución
Acrónimo
Año
Escuela Politécnica Nacional
EPN
1946
79 357
42
Pontificia Universidad Católica del Ecuador
QCAZ
1973
1’000 000
2 683
Instituto Nacional de Biodiversidad - MECN
MECN
1977
59 227
71
Universidad Técnica del Norte
UTN-in
2005
TOTAL
1 800
1’140 384
2 796
Colecciones Biológicas en el Ecuador
Segovia et al.
86
endémicas o amenazadas (Fisher & Davidson, 1998;
Graham et al., 2004; O’Connell et al., 2004; Shaffer
et al., 2009), además los datos de los herbarios nos
ayudan a entender los procesos de introducción y
distribución de especies invasoras. A través de la
información depositada en las colecciones podemos
determinar detalles de la historia natural de los
organismos (Krishtalka y Humphrey 2000; Miller
y Rogers, 2014). Los especímenes de museos nos
permiten definir indicadores de impacto ambiental
en los diferentes ecosistemas al ser fuente de
material genético, bioquímico e isotópico, así como
determinar vectores y controladores biológicos
de enfermedades (Graham et al., 2004; Lister &
Climate Change Research Group, 2011).
Figura 2. Número de registros y tipos reportados en las
colecciones biológicas ecuatorianas
Las colecciones biológicas son verdaderos legados
de información que necesitan ser apoyados,
mantenidos y protegidos por el Estado e
instituciones privadas (Hill et al., 2012; Stucky et
al., 2014). No solamente son el sitio de referencia
científica para el descubrimiento de nuevas
especies, sino que son sitios de generación de
conocimiento en diferentes ámbitos (Winker,
2004; Matsunanga et al., 2013). Una colección bien
curada puede ser fundamental para la creación de
modelos de cambio climático que incluyan rangos
de expansión y reducción de distribución, variación
fenológica o cambios evolutivos. Además, las
colecciones biológicas permiten documentar
cambios en la estructura de la comunidad en
épocas recientes o pasadas (Drew, 2011; Graham et
al., 2004; Lister & Climate Change Research Group,
2011), de ahí la importancia de los repositorios
históricos como las muestras del padre Sodiro
que se encuentran albergadas en la Fundación
Biblioteca Ecuatoriana Aurelio Espinoza Pólit, o
las muestras paleontológicas del EPN. Mediante
información de estas muestras como los rangos
de distribución, podemos conocer los procesos
de disminución poblacional y así determinar
áreas prioritarias de conservación para especies
REMCB 36 (2), 2015
En los últimos años, las colecciones han influenciado
en la aplicación y el desarrollo de nuevas
herramientas bioinformáticas para la digitalización
e integración de bases de datos (Edwards et al.,
2000; Berents et al., 2010; Drew, 2011). Finalmente,
no podemos olvidar que las colecciones biológicas
juegan un papel fundamental en la educación
en todos los niveles, donde se puede incentivar
procesos de asociación, observación y análisis de
los objetos desde los niños hasta los adolescentes
(Cook et al., 2014; Powers et al., 2014; Knight-Davis
et al., 2015). Los especímenes de las colecciones
son una herramienta clave en el entrenamiento de
los estudiantes de pregrado, carreras biológicas
y afines. Los museos de historia natural y las
colecciones biológicas son uno de los pocos sitios
donde convergen el público en general y los
científicos creando el ambiente adecuado para
entablar una comunicación directa sobre temas de
conservación y manejo (Drew, 2011).
A pesar de la falta de apoyo por parte de las
entidades estatales tanto a nivel locales como
central (bajo presupuesto, falta de capacitación
e infraestructuras adecuadas), las colecciones
biológicas en nuestro país son numerosas y han
permanecido activas por más de un siglo, pero la
información todavía está incompleta, dispersa, y
muchas veces inaccesible. Necesitamos entonces,
crear una plataforma que nos permita compartir
información para unir esfuerzos en áreas geográficas
y taxonómicas de interés, evitar la duplicación de
trabajo, y fortalecer a las colecciones pequeñas, de
ahí la iniciativa de la creación de la Base Nacional
de Datos de Biodiversidad (BNDB) con los objetivos
de investigación, educación, manejo y conservación
de nuestro recurso más preciado: la Biodiversidad.
El conocimiento sobre nuestra biodiversidad está
cambiando rápidamente y necesitamos generar
mecanismos que nos permitan utilizar y contribuir
a esa información con un manejo responsable y
multidisciplinario de los datos.
87
El valorar nuestras colecciones biológicas es
un deber de todos los ciudadanos. Conocerlas,
apoyarlas, difundirlas, y protegerlas es una misión
no solo de la comunidad científica y quienes las
posean, sino del Estado y de la sociedad. Esto se
fundamenta en que las colecciones biológicas
guardan nuestra herencia de conocimiento para
las futuras generaciones. Una razón más por lo
cual la colaboración entre los curadores y los
investigadores es esencial para la inclusión de
las colecciones en los proyectos de investigación.
Es tiempo de crear una alianza nacional en favor
de las colecciones biológicas para promover su
continuidad en el tiempo y su apertura a los
desafíos del siglo XXI a través de una colaboración
entre academia y estado.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a todas las instituciones que
abrieron sus puertas y compartieron su información.
A la Pontificia Universidad Católica del Ecuador
(QCAZ-mastozoología, QCA, Ambato), Instituto
de Ciencias Biológicas de la Escuela Politécnica
Nacional, Universidad Central del Ecuador (Q y
QAP), Instituto Nacional de Biodiversidad (MECNQCNE), al Herbario de la Universidad Nacional
de Loja, Fundación Herpetológica Gustavo Orcés,
Centro Jambatu de Investigación y Conservación
de Anfibios; Universidad San Francisco de Quito
(QUSF y MUSF), Universidad Técnica del Norte
(HUTN), Universidad Tecnológica Indoamérica
(HUTI), Universidad Técnica de Cotopaxi, Escuela
Superior Politécnica del Chimborazo (Herbario y
Museo), Unidad Educativa Bolívar, Universidad
Técnica Particular de Loja (HUTPL), Fundación
Biblioteca Ecuatoriana Aurelio Espinoza Polit,
Colegio Teodoro Gómez de la Torre, Universidad
Técnica de Ambato, y a Silva Carbón por su
auspicio. Parte de la información presentada
pertenece al proyecto del Ministerio del Ambiente
“Inventario de Centros de Rescate”.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Actualizada de Especies del Ecuador.
89
INSTRUCTIVO PARA AUTORES
Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas
CRITERIOS DE PUBLICACIÓN
La Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas (REMCB) publica las investigaciones científicas
originales que no hayan sido sometidas a publicación en ningún medio impreso o electrónico. Los campos
de investigación que se incluyen son las Ciencias Biológicas, Químicas, Bioquímicas, Ciencias Médicas,
Biotecnología, Conservación y Manejo de Recursos.
Los manuscritos podrán ser sometidos bajo las siguientes modalidades:
Trabajos científicos reportan resultados originales producto de un proceso de investigación científica,
en áreas de interés para la REMCB. Los autores son responsables del uso de datos de terceros. Los
trabajos científicos constarán de las siguientes partes: Título, Autor(es), Afiliación institucional, correo
electrónico del autor de correspondencia, RESUMEN, PALABRAS CLAVES:, ABSTRACT,
KEYWORDS: (escritos en inglés), INTRODUCCIÓN, MATERIALES Y MÉTODOS,
RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIONES (opcionales), AGRADECIMIENTOS
Y REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
Notas científicas reportan resultados preliminares de procesos investigativos experimentales. Las notas
científicas constarán de las siguientes partes: Título, Autor(es), Afiliación institucional, correo electrónico
del autor de correspondencia, RESUMEN, PALABRAS CLAVES:, ABSTRACT, KEYWORDS:
(escritos en inglés), INTRODUCCIÓN, MATERIALES Y MÉTODOS, RESULTADOS Y
DISCUSIÓN (unidos), AGRADECIMIENTOS Y REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
Artículos de revisión (Review): de un tema específico relacionado con los campos que incluye la revista.
Tendrán un formato personalizado por sus autores, pero es obligatorio el uso de las siguientes secciones:
Título, Autor(es), Afiliación institucional, correo electrónico del autor de correspondencia, el texto (con las
subdivisiones que sean apropiadas) y REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
AUTOR DE CORRESPONDENCIA
El autor de correspondencia asume la responsabilidad de incluir a todos los autores de la investigación en el
orden apropiado, obtener el consentimiento de dichos autores antes de someter el manuscrito a la revista e
informar a los autores sobre todos los cambios de edición realizados al manuscrito antes de la publicación.
De igual manera el autor de correspondencia se responsabiliza de la comunicación con el comité editorial
y del cumplimiento del formato requerido por la revista y la aprobación de la versión final del manuscrito.
FORMATO DEL MANUSCRITO
Título en minúsculas, con una extensión máxima de 18 palabras, negrita, centrado, 14 puntos. Ejemplo:
Preferencia de estratos boscosos en la alimentación de
Turdus fuscater del Pasochoa
Autor o Autores: Nombre(s), Apellido(s), en negrita, 12 puntos. Ejemplo:
Juan Eduardo Pueblo P1 y Estelita Estrella2
Afiliación institucional: institución, ciudad, país, correo electrónico del autor encargado de la
correspondencia; si los autores representan a diferentes instituciones indicar con un superíndice numérico,
el texto en 10 puntos. Ejemplo:
90
1
2
Centro de Investigaciones Científicas del IASA, Facultad de Ciencias Agropecuarias, ESPE, Sangolquí, Ecuador. j_salazar@espe.edu.ec
Departamento de Zoología, Escuela de Biología, Universidad Amazónica del Uruguay.
RESUMEN: con una extensión máxima de 200 palabras
PALABRAS CLAVES: cinco palabras separadas por coma y en orden alfabético
ABSTRACT: resumen en inglés
KEYWORDS: cinco palabras en inglés, separadas por coma y en orden alfabético
INTRODUCCIÓN
En el contenido de esta sección se asume que el lector es un conocedor del tema por lo tanto debe ser concisa.
MATERIALES Y MÉTODOS
Esta sección debe proveer la información necesaria para entender y replicar los experimentos. En caso
de reportar nuevos procedimientos es necesario que se incluya información detallada de los mismos. De
forma opcional se pueden incluir anexos que complementen esta información. Es necesario mencionar las
marcas de los equipos y reactivos.
En los trabajos que así lo requieran es necesario presentar el listado del material examinado, con las
coordenadas de las localidades muestreadas y citar las instituciones depositarias de los especímenes.
RESULTADOS
Deben ser presentados en el mismo orden como fueron descritos en la sección de materiales y métodos. Los
datos cuantitativos deben ser presentados en tablas o figuras.
DISCUSIÓN
No repetir los resultados sino discutir sobre el significado de ellos al compararlos con datos existentes,
argumentar y resaltar la novedad de los mismos.
CONCLUSIONES
Es una parte opcional del texto, deben ser sintéticas y consistentes con los resultados y la discusión, se
deben separar con viñetas de círculo, por ejemplo:
•Las especies ecuatorianas D. chorlavi y D. rucux comparten el número cromosómico 2n=10 con las
especies que conforman el grupo de especies D. mesophragmatica.
•D. chorlavi y D. rucux difieren entre ellas en el tamaño y morfología del cromosoma 5.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Serán citadas en orden alfabético según el apellido del primer autor y seguido de la letra del nombre; si
el mismo autor tiene dos o más artículos del mismo año, estos serán diferenciados alfabéticamente con
una letra. Si el mismo autor tiene dos o más artículos de diferentes años, estos serán citados en orden
cronológico del más antiguo al más reciente.
Cuando el artículo tiene más de seis autores, serán nombrados los seis primeros seguidos de et al.
REMCB 36 (2), 2015
91
Las referencias bibliográficas llevarán sangría especial francesa. Ejemplos:
a. Artículo de revista científica: Los nombres de las revistas deberán ser escritos en su forma completa y con cursiva:
Rodríguez-Guerra A, Barnes CW, Ordóñez MC, Salazar A y Soria CA. 2012. Identificación y evaluación de
algunos hongos con actividad celulásica aislados en Ecuador. Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias
Biológicas 33(1 y 2): 65–81.
Duchicela EJ. 2004. Diversidad funcional de las micorrizas arbusculares asociadas a Brosimun utile en
condiciones naturales. Ciencia 7(8):65–77.
Staikou A y Lazaridou-Dimitriadou M. 1991. The life cycle, population dynamics, growth and secondary
production of the snail Xeropicta arenosa Ziegler (Gasteropoda: Pulmonata) in northern Greece. Zoological
Journal of Linnean Society 101:179–188.
b. Capítulo de libro
Eisenberg JF. 1979. Habitat, economy and society: some correlations, and hypotheses for the Neotropical
primates. En: Bernsteind IS y OE Smiths (eds) Primates ecology and human origins: ecologycal
influences on social organization: 215–262. Granland STPM Press. New York and London.
c. Tesis de grado
Astudillo Y. 2009. Identificación, caracterización y diferenciación de carbohidratos y proteínas en la secreción
de dorso y pie de la babosa terrestre Limas flavus (Mollusca: Gastropoda). Tesis de Licenciatura en
Ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Católica del Ecuador. Quito, Ecuador.
d. Libros enteros
Gumport RI, Deis FH, Gerber N y Koeppe RE. 2006. Biochemistry, Sexta edición. Freeman and company.
USA. 627 pp.
e. Información proveniente de internet: Ciertas páginas que tengan información científica relevante
pueden citarse así:
Di Fiore A. 2001. Proyecto Primates Ecuador. Página de Internet: www.nyu.edu/projects/difiore.
Consultada 13-enero-2006.
CITAS EN EL TEXTO: use el siguiente formato para la citación de literatura en el texto, la cual debe
tener un orden cronológico del más antiguo al más reciente: (Barba et al. 2009, Barba 2010, Montenegro y
del Pino 2010, Salceda 2011a, b).
FIGURAS
Las figuras (esquemas, diagramas, dibujos, gráficos, fotografías y mapas), deben ser preparadas en formato
JPG o TIFF, de alta calidad, resolución mínima de 300 dpi, pueden ser a colores y cada una deberá ser
enviada en un archivo individual rotulado con el número correspondiente. Se sugiere utilizar programas
de edición de gráficos para la elaboración de las figuras. Las figuras de barras pueden presentarse en 2D
o 3D pero siempre deberán mostrarse en plano frontal. Las figuras compuestas por secciones deberán
identificar cada sección con una letra mayúscula que sea visible y de tamaño apropiado con la imagen. La
posible ubicación de las figuras debe señalarse en el texto del manuscrito con una cita entre paréntesis y
resaltado amarillo. Ejemplo (Figura 1, aquí). El comité editorial se reserva el derecho de ubicar las figuras
en función del espacio disponible.
Las figuras deberán ser numeradas en orden de aparición en el texto, deberán llevar una rotulación que
debe iniciar con la palabra Figura y el número arábigo correspondiente y un título conciso, en 10 puntos y
negrita, y a continuación una leyenda descriptiva (opcional) de la figura, ésta no debe ser una repetición del
texto. Incluir las definiciones de las abreviaciones usadas en la figura, si fuera el caso. Las leyendas deberán
enviarse en un archivo Word.
92
TABLAS
Las tablas deben presentarse con una rotulación en la parte superior la cual debe iniciar con la palabra
Tabla y el número arábigo correspondiente, luego un título conciso y explicativo en 10 puntos y negrita, y a
continuación una leyenda (opcional). Los símbolos o abreviaciones pueden explicarse al pie de la tabla. Las
tablas serán numeradas de acuerdo al orden de aparición en el texto y estarán construidas solo con líneas
horizontales que separen los encabezados. Deben ser preparadas en formato XLS (EXCEL), y cada tabla
presentarse en una hoja aparte, según el criterio de rigurosa economía de espacio. La posible ubicación
de las tablas debe señalarse en el texto del manuscrito con una cita entre paréntesis y resaltado amarillo.
Ejemplo (Tabla 1, aquí). El Comité Editorial se reserva el derecho de ubicarlas en función del espacio
disponible, o solicitar a los autores efectuar los cambios correspondientes.
NOMENCLATURA
Nombres científicos.- Los nombres científicos deben ser escritos en itálicas, y al ser citados por primera vez
en el texto se debe incluir el nombre del/los autor(es) de la descripción original de la especie.
Abreviaturas.- Utilizar la menor cantidad de abreviaturas. Definir la abreviatura la primera vez que
aparezca en el texto.
Numeración.- Las cifras decimales serán separadas con punto, ejemplo: 0.007 o 1.005 y un máximo de hasta
tres decimales. Los miles se escriben sin puntos ni comas, ejemplo: 18460, 593000. Los rangos de números
arábigos deben ser separados con el tipo de símbolo Word “en dash” (–).
Simbología.- Tomar como referencia el Sistema Internacional de Unidades (SI). Las coordenadas deberán
ser representadas así: 78°31´17.2” W 0°11´22”S. Escribir los símbolos o abreviaturas a continuación de la
cifra numérica, sin espacio entre ellos, ejemplo: 32%, 12ml, 88g, 46°C, 115°F. Se permite el uso de la letra
L en mayúscula o l en minúscula como símbolos del litro, a fin de evitar la confusión entre la cifra 1 (uno)
y la letra l (ele). El submúltiplo micro se representa con la letra griega μ seguido de la unidad de medida,
por ejemplo: μL, μg. Los símbolos de las unidades de medida no van seguidos de un punto, excepto al
final de una frase.
La escritura de palabras compuestas se sujetará a las reglas ortográficas correspondientes, pues se deben
emplear con guión o sin él según los casos, como en los siguientes ejemplos: físico-químico, teórico-práctico,
cirujano-anestesista, seudotumor, neurorradiología, intracraneal.
PRESENTACIÓN DEL MANUSCRITO
Los manuscritos deben ser presentados en formato Word, en idioma español o inglés, en formato de columna
normal, con los cuatro márgenes de 2.5cm, tipo de letra “Times New Roman” 12 puntos (excepto donde se
indica un tamaño diferente), doble espacio, justificado, sin sangría, numeración en líneas y páginas.
Los títulos de las secciones (INTRODUCCIÓN, MATERIALES Y MÉTODOS, RESULTADOS,
DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, AGRADECIMIENTOS Y REFERENCIAS
BIBLIOGRÁFICAS) van en mayúsculas, negrita. Excepto en la introducción, en el resto de secciones
se pueden utilizar subtítulos. Los subtítulos van en el mismo párrafo con minúsculas, negrita, separados
del texto por punto y raya.
El autor de correspondencia deberá enviar el manuscrito original en versión electrónica vía e-mail a la
dirección, revecuatorianamedycb@gmail.com. El manuscrito deberá ir acompañado de los archivos de
figuras y tablas y un archivo con las leyendas de las mismas (no incluir las figuras y tablas dentro del
archivo de texto). Junto a este material se deberá enviar una carta dirigida al editor de la Revista en la
cual se debe indicar la originalidad del trabajo y describir el aporte de cada uno de los coautores a la
investigación. En los casos que se considere necesario, el editor solicitará la presentación de los permisos
de investigación y/ó los informes favorables de los comités de ética respectivos.
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93
Los manuscritos serán revisados por árbitros anónimos asignados por el editor, su aprobación estará sujeta al
contenido científico, respaldado por el parecer de los árbitros y la resolución del editor, el mismo que solicitará
de los autores realizar los cambios y sugerencias pertinentes, acompañando las sugerencias respectivas.
El editor se reserva el derecho de rechazar los manuscritos cuando estos no cumplan con el formato o los
requerimientos establecidos por la revista.
INFORMACIÓN SOBRE LA REVISTA: información adicional y el instructivo para publicación
se encuentra disponible en el portal de la Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas (REMCB)
http://www.puce.edu.ec/revistaciencia.
Última actualización: noviembre 2015
94
REMCB 36 (2), 2015
95
FE DE ERRATAS
El siguiente artículo fue publicado en el Número 35 (1 y 2), 2014 de la REMCB, en ésta
edición se lo incluye como una fe de erratas con una corrección en el orden de los autores
96
REMCB 36 (2), 2015