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c
094i5i
PROYECTO DE SERVICIO SOCIAL
Ma. Isabel Briones Camelo
A r e s e n t a d o por:
Teléfono:
5-84-91-52
Matricula:
84342323
Clave:
23. 3. 58. 89
Ingeniería Bioquímica Industria
//Carrera:
Trimestre:
89-0
Hrs/Semana:
20
Lugar:
Laboratorio del grupo de Reproducción d e Bovinos (S-326)
y Laboratorio de Biología Molecular {S-254) UAM-Iztapalapa
Fecha d e Inicio:
\'Diciembre
Fecha de Terminación:
3bJulio de 1989
Tutor:
de 1988
M. en C. Elisa Vega Avila
Prof. Asociado iiD1i T.C.
M.V.Z. Ernesto Hernández P.
Profesor Asoc. l i B 1 l T.C.
/Titulo:
Ma. Isabel Briones C.
Análisis d e Algunas Variables
Físicas y Bioquímicas, Presentes en el Moco Cervical
de Bovinos Inducidos al Estro.
Ernesto Hernández P.
Agradezco a :
Elisa su enorme apoyo.
El
Sr.
José
Ram6n
Barbón
animales d e l rancho "Guadalupe".
por
raciiitarnos
V i l l a d e l Márquet, Uro.
los
"ANALISIS DE ALGUNAS
VARIABLES F I S . I C A S
Y BlOCJUlMlCAS PRESENTES EN
EL
MOCO CERVICAL DE BOVINOS
INDUCIDOS A L
ESTRO"
INTHÜDULLIÚN
El signatrcado del cervix y su
secresión,
en
relación
con l a concepción v a r í a s e g U n l a s e q e c i e s . De forma natural,
el
depósito
semen
del
en
cerdos
los
intrauterino. Este también es el
sitio
caballos,
y
inseminación
la
de
es
artrticial en el ganado, a ú n cuando ei semen es depositado en
La vagina durante e l celo natural.
consiguiente e l cervix es
cervical
ser
puede
En
estas
"lugar
un
sólo
usado,
paso"
de
hembra ti).
Por
hormonal
lo anteriormente explicado se
e n algunas especies incluyendo
la
primera barrera para
la
hacia el sitio de la
tertilizacidn
el
y
indirectamente,
indicador del estado del ciclo o del estado
el
vaca,
migración
los
de
(2).
por
especies,
Se
moco
como
un
de
la
considera
cervix
que
la
es
espermatozoides
cree
que
Los
espermatozoides que llegan a l oviducto inmediatamente despues
de
la
cópula
no
son
tértiles,
colonizado y han permanecido
son
y
cierto
aquéllos
tiempo
sitios conocidos con el nombre de reservorios,
posteriormente
al
Útero
de
trompas
y
que
han
en
almacenados
los
falopio
que migran
la
para
tertiiizaclón mediante su propio movimiento progresivo. Es e l
cervix
una
de
las
estructuras
espermático para los rumiantes
#
importancia que este
tiene
Y
sirve
que
se
durante
ha
un
de
comprobado
periodo
reservorio
la
gran
prolongado
después d e l a monta ( 5 , 4 ) .
1
Se ha demostrado que la interaccidn bioffsica
espermatozoide y
el
moco
cervical
es
propiedades del moco juegan un papel
movimiento espermático individual
fuerte
muy
entre
el
que
las
y
importante
cervix,
y químicas
moco
del
la
de
y
cervical
determinan si el espermatozoide penetra o no en el
por i o tanto si alcanza o no e l sitio
tal
(6).
como sucede en el caso de la inseminación artificial
Las propiedades tfsfcao
el
( 5 ) , conservando este papel
aún cuando el espermatozoide pueda eludir a l
,
en
cervix
y
tertiiitacibn,
pudiendq actuar de esta manera como un agente o
barrera
una
para la concepción ( 7 ) .
La
impenetrabilidad
del
moco
1os
a
cervical
espermatotoides en e l humano ha sido reconocido por años como
una
posible causa de infertilidad. Iiebido a esta
inquietud,
se implementó la prueba del moco cervical postcoital
Sims Huhner test, en la
se
cual
espermatozoides activos. A s f
y
baio
el
producción de esperma es normal, si
éste
está
actuando
como
ndmero
de
encontrase
moco,
el
barrera
a
la
que
los
significará
penetración
espermática. Este tipo d e estudio debido a su importancia
continuamente
utilizado
por
clinicos
o
conocimiento de que la
se
espermatozoides no estan presentes en
que
el
cuantifica
(PCT
en
casos
de
es
una
esterilidad inexplicada ( 1 ) .
El moco cervical de muchas
especies,
muestran
cambios
c ~ c l i c o sen sus propiedades tísicas y qufmicas, encontrándose
2
éstos b a j o control hormonal
tt3.í).
Hay un periodo limitado durante el ciclo, cuando el moco
permite a i espermatozoide penetrar táciimente. La penetración
máxima a través del moco cervical en humanos y bovinos ocurre
durante l a tase uvulatoria, con una marcada reducción antes y
después d e esta t a s e ( 1 ) .
este
En
tiempo
los
estrógenos
están dominando y el moco cervical que es secretado es c l a r o ,
con un a l t o contenido de agua, más e l á s t i c o ,
con
cristaJizaciÓn mayor y
proteínas,
domina,
ésto
siendo
presentándose
menos
contenido
contrario
esta
con un patrón de
Cuando
cecresibn
de
la
ceiulas
progesterona
espesa.
opaca
impenetrable a los espermatozoides ( 7 , 8 y 9 , .
Asf
anormalidad en l o s niveles hormonales
repercutir
las
propiedades
impenetrabilidad.
secreción
administración
de
por
del
moco
y
De
esta
manera
cervical
puede
estrógenos
pueden
ser
o
la
y
e
cualquier
en
consiguiente
en
SU
naturaleza
de
la
mediante
la
alterada
progesterona,al
grado
de
signiticar anticoncepción ( i ) .
3
OBJETIVOS
Establecer
la
metodología
apropiada
concentraciones de íosfatasa aicaiina.
totales
para
protelna
determinar
y
atdcares
en moco cervical.
Estudiar
variaciones
en
los
niveles
de
tosratasa
alcalina, protefna y ar6cares totaies presentes en el moco d e
bovinos,
inducidos al estro
mediante
prostaglandina F 2 alfa.
S
la
administración
de
HATER i
AL I' REACT i
VOS
Reactivos:
-
-
S O I . saiinr iootdnica
tti1.9~)
Sol. tartrato de sodio ( 2 % )
Sol.
suirato de c o b r e ti%,
Sol. carbonato de sodio al 2% en NaClH 0 . 1 N
-
Sol.
-
Reactivo d e Folin-Ciocaiteu. Sol. i N
-
Sol.
-
So1.p-nitrofenoi B.cblM
-
Glicina
-
Cloruro d e magnesio-hexahidratado
-
Sol.
-
Sol. hidróxido de sodio @.lN
hidrdxido de sodio 0.2N
Std. Albúmina sérica de bovino ( 0 . 5 m g / m l )
glucosa cl@0arg/l)
R e a c t i v o de antrona
Acido sulfdrico (95%)
Material:
-
Viales de v i d r i o con tapa d e rosca
-
Matraces a t o r a d o s de:
5
-
._
.,
.
. . -_
I
-l@
mi
-25
Ql
-5@
mi
- 1 W mi
-25@ m l
-l@@bl
Matraces Eriencneyer d e 2561~11
Tubo8
d e ensayo
Baño Marfa "Medi Lab"
Balanza analftica "Sartorius"
Potencidmetro
"Beckman" Mod. 35@@
Espectrofotómetro "Zeiss" Mod. Til-6
t
Vortex
Es pat u i
as
Gradi I l a s
\
6
I
:
.
METODOLOGIA
El trabajo de
servicio
social se separb en
etapas. La primera tuvo por objetivo el
dos
determinar
grandes
medirnte
varias pruebas, las condiciones mas apropiadas para llevar
cabo e i estudio d e l moo0
estro.
La segunda etapa,
cervical
del
ganado
inducido
a
al
consistid en determín8r niveies de
tostatasa aicaiina, protefna y azúcares totales
en
animales
inducidos al celo mediante la aplicacidn de prostaglandina F 2
alfa
.
Se tratarán ambas etapas por separado.
'* ESTABLECIMIENTO DE METODOLOGIA **
Para
tratar
esta
etapa
me
tomaré
libertad
la
describir la dinámica que se siguió, asf como l o o
de
resultados
que se obtuvieron a través de ésta. cabe mencionar que dichos
resultados fueron claves para
seguir en cada ensayo aplicado
animales inducidos,
por
lo
determinar
durante
que
se
la
el
metodologfa
estudio
expondrán
segundo etapa de esta sección del trabajo.
de
durante
a
los
la
Úurante esta primera etapa debfan
de
Los
establecerse
siguientes puntos:
i j Condiciones para el manejo del moco;
-
~ i s o i u c i b n del 'moco.
P/V
Relación
moco
de
en
soiuciOn salina ai 6.9%.
ii)
Condiciones de almacenamiento para el moco.
Establecimiento
de
condiciones
de
ensayo
para
determinar espectrofotométricamentet.
-
Fosfatasa ricalina.
Protefna total.
Azúcares totales.
i ) CONDIClONES PARA EL M A N E J O DEL Moco.
que
Debido a la alta viscosidad, elasticidad y cohesión
presentaba el moco en
su
estado
natural,
manejarlo fácilmente y con precisión, por
era
no
io
que
resultaba
no
atectaran
imprescindible disolverlo bajo condiciones que
hasta donde f u e r a posible
y
bioqufmicas
instrumentos
y
que
%U%caracterfsticao
ademas
volua6tricos
automáticas. P r a s a d et.
al.
permitiera
de
ti3J..
presición
posible
fisicoqufmicas
el
manejo
como
recomiendan
4
cual habra
que disolver en 5 m l de
ai(í1.9% a 4.C
pipetas
deshielo
a
10Ca
y
temperatura ambiente,pesar una cantidad de moco entre
Z@@mg,la
con
4
solucion
salina
mediante agitación vigorosa en vortex durante
8
5
I
m 1 nutos.
Siguiendo
llevaron
probarlas,
a
la
cabo
metodologfa
varias
disoluciones
con e l fin de establecer
cada una de las oetodologfas
(8)
se
prosiguid
a
la
apropiadas,
en
se
y
mas
utilizadas durante el
Se observá q u e la relacio’n d e I@@ a
Prasrd e t - a l
citada,
anteriormente
mg
Scbcb
que
estudio.
recomienda
para moco cervical de búfalo, resultaba
muy
azúcares
baja para determinar fosfatasa alcolina, protefna y
I
a
totales en moco cervical d e bovinos,porlo que se prociguio
aumentar la cantidad de moco presente en l o s 5
ail
de solución
salina, teniendo cuidado de siempre observar q u e la
no se sobresaturara y p r e c i p i t a r a , volviendose
a
solucibn
formar
un
nGcieo viscoso.
Las relaciones que se p r o b a r o n fueron tng. de moco/
mi,
de Soi.salina)t
-
-
3(b
mg.
60
ag.
I@@
mg.
/
nil.
ml.
/
Ink.
200 mg. 1 m i .
Fue esta Última r280mg./ml.)
4
la que se decidio u t i l i z a r ,
4
ya que a r r o j o resuitados confiables para la totalidad de
muestras con l a s que hasta
en
ese
momento
inclusive considerabanos permitirfa e l
se
análisis
que arrojaran lecturas ligeramente mayores o
que se habia registrado hasta ese momento.
las
contaba,
de
menores
e
sujetos
los
a
E s t o resultaba
de
9
g r a n importancia para el estudio de las muestras posteriores,
pues
desconocíamos
induccibn
al
los
estro
efectos
el
que
en
ocasionarfa
tratamiento
ganado
el
pudiéndose presentar tanto aumento como
de
bovino,
disminución
los
en
ni ve 1es.
Una v e z obtenida l a relación moco/Sol. saiina
y debido a l a dificultad que representaba
importancia
que
dicha
representaba en La
C,
4.
a
minutos en un espacio
de
alentadores,
el agitar durante 5
prosiguió
a
durante
la
temperatura
obtención
resultados fueron muy
se
una
tase
agitación
para
los
muestra, agitada a temperatura ambiente,
la
l o anterior,
Los
misma
no
resultados
divergfan sensiblemente con respecto a los obtenidos a
Por
io
probar
homogénea.
que
ya
apropiada
U.C.
se decidió omitir el uso del cuarto f r f o
y
agitar a temperatura ambiente.
Paralelo a estas pruebas se realizó una que tendría como
ffn
determinar
descongelamientos
la
de
importancia
la
que
muestra
cont I nuos
1os
tendrían
sobre
los
parámetros a estudiar. Se detectó un decremento significatfvo
en la actividad de rostatasa alcairna en aproximadamente
unidades
de
absorbancia.
Así
mismo
se
observó
inrluencia que el descongelar ejercfa s o b r e la
de azúcares y
alfcuotas
poca
concentracidn
protefna. & e e s t a manera pues, se recomienda el
pronto ensayo de fosratasa aicaiina, así como l a
de
la
cb.1
y
su
congelamiento
preparada l a disolucidn de 20ld mg.
inmediato
separacione
una
de moco en 1 ml.
vez
de
ya
Sol.
10
I -_ ___ -
-- .
salina isotónica.
Con respecto a l almacenamiento. encontramos
literatura
5e
recomienda congelar la
muestra
diario
de
laboratorio.
La
en
la
inmediatamente
después d e haberla tomado del animal, asf como
el trabajo
que
tinairzar
al
importancia
anterior r u e comprobada en muestras que tueron
de
lo
transportadas
en condiciones
sblo
de refrigeración. Algunas de las alteraciones ocurridas
eran
del
lugar de recoleccidn al laboratorio
o b s e r v a b l e s a simple vista; por ejemplo el moco
opaco,
AI
se
mostraba
sin "cuerpo" es decir con poca cohesión y elasticidad.
aplicarle los ensyos en los que estábamos interesados,
encontramos actividad de fosfatasa P i c a ina y se
lecturas
inestables
y
no
reproducib es
registraron
azúcares
de
no
y
protefnas.
€1
tiempo
de
almacenamiento
bajo
condiciones
congelación, no se recomienda que sea mayor de
que l a s propiedades del moco después de
este
30
días,
tiempo
de
ya
varían
considerablemente.
i r ) ESTABLECIMIENTO DE CONDICIONES DE
ENSAYO.
El método de Lowry (143) para cuantificacion de
total es citado e n l a bibliograrfa
(UJ
como
adecuado
moco cervical, p o r lo q u e inmediatamente se
adoptó
ensayo
que
a
utilizar.
Sin
embargo
habla
protefna
como
para
el
determinar
principalmente dos p u n t o s :
l a proporción de moco en
soiucibn
se
mencionó
salina que resultara mas adecuada.
la cual como
anteriormente resultó ser de 2@Ca mg./ml..
que especlticar
la cantidad que de esta d i s o t u c i ó n iba a
utilizada en nuestro ensayo. Con
anterior se
(b.4
mi.,
Por o t r o lado h a b l a
el
ffn
de
ser
lo
determinar
probaron, 4 volumeneo de muestra: @.í,
( b . 2 , (0.3.
siendo que l o s
salina a 6.4 ml.
tres primeros se aforaron
Sol.
con
totales. De acuerdo a nuestras observaciones
el volumen de muestra mas adecuado correspondio a l de a.4 m l ,
ya que Qste, dando lecturas conriables para las muestras
l a s que
hasta
ese
variaciones t a n t o
momento
en
se
límites
contaba,
permitfa
superiores
variaciones posibles en l a s posteriores
como
mayores
interiores.
muestras,
para
cuales no se sabfa como intiuirfa el tratamiento inductor
estro.
Asf
mismo
en
la
literatura
se
(la)
longitudes de onda, 5@b y 7 5 @ nm, para realizar
con
citan
la
Las
al
dos
lectura
espectrofotométrica, siendo que la segunda se cita como la de
mayor sensibilidad cuando las muestras contienen menos de 125
)g.de
protefna
nuestro caso, ya
por
mi,
que
a
circunstancia
partir
de
que
esta
correspondfa
concentración
a
se
visualizaba una desviación que rompfa con l a tendencia lineal
de l o s puntos. Esta observación se comprobaba a l
análisis p o r regresión lfneal, por un lado en
la
aplicar
totalidad
de los puntos y por otro lado en los puntos anteriores a
que se observaba la tendencia a curvearse de l a
grática.
mayor coeficiente de correlación f u é arrojado por l o s
d e concentraciones menores a l o s lZ!@jg./ml.
lo que para establecer
la
curva patr¿n,tan
el
los
El
puntos
d e proteína, por
s ó l o se utilizaron
12
i puntos que contemplaban concentraciones de
ml. ordenados de 28 en 2@
0
12@ / I O . /
a
g./ml.deprotefna.
El ensayo para determinar fosfatasa alcalina result6
más ditfcil d e estabIecer,no sólo
la
por
multiplicidad
el
de
pruebas que hubo que efectuar p a r a determinar cada uno de sus
pasos
condiciones,
y
conriables con las
por
sino
que
se
escasés
la
contaba,
de
a
debido
muestras
la
degradación que sutrfa l a actividad de l a fosfatasa
por
el
patente
alcolina
los continuos descongelamientos de muestra. Es decir
f i n de
a
responder
interrogantes
de
y
establecer
ensayo, debfan de probarse algunas variables
molaridad de
las
resultaba facil
soluciones
lograr todas
pruebas
estas
muestra presente en una única
alfcuota,
los
resultados
que
los
de
a
misma
a
los
que
dfas,
anteriores
cada
congelar.
no
una
d!a
empezar el experimento se descongeiara esa Única
que a l finalizar s e volviera
embargo
varios
de
dfas
obtuvieran,con lo que era necesario que
la
con
debido
ensayos probatorios se realizaban a través
segYn
Sin
se
antes
alfcuofa
de
y
estos
todos
Con
el
como
tales
utilizar.
a
con
cambios de temperatura se ocasionaba un marcado decremento en
l a actividad de
la enzima, por lo
principio denotaba
actividad
que
una
enzirnática
muestra
que
al
representativa
ai
termino de 4 0 5 dias dejaba de reflejarla.
Con
anteriormente citado lo primero que se decid16
l a d i n k i c e de ensayos,
fu8
el
sistema
alfcuotas, una vez hecha l a disoiucidn de
salina
,
con lo cual e r a p o s i b l e
de
moco
descongelar
a
lo
instaurar
en
separocidn
de
base
en
tan
solucidn
sólo
una
cada dta.
Una
I
parte
importante
consumiera
que
y
tiempo durante nuestro estudio,
consistió
técnica más adecuada para determinar
moco
cervical
de
Asf
bovinos.
en
considerable
encontrar
La
alcalina
en
tostatasa
la
mediante
búsqueda
bibliogrdrica, encontramos que la mayor parte de Los
reportados para esta
manejo de
suero.
se
enzima
Sin
encuentran
embargo
Prasad
fndices de fostatasa alcalina e n
mediante el método
indicado
moco
en
basados
ti3,
et-al
el
reportan
de
cervical
bdtaios
til,,
Bergmeyer
Por
ensayos
el
cual
utiliza p-nitrotenilfosfato d sÓd c o como sustrato. Debido
'
é s t o proseguimos a hacer una seleccidn
de
utilizaran el mismo
a
compuesto
debido
califica en s u o b r a ( 1 1 ) como
el
que
metodologfas
que
Bergmeyer
más
sustrato
utilizado sin lugar a dudas. De esta manera se
a
lo
ampliamente
escogieron
y
estudiaron e l método que originalmente Bergnreyer reporta t i l )
asf
como los
confusos
(8).
colaboradores
deficiencias
y
incompletos
e
Así,
adecuar
con
el
el
ensayo
datos
rfn
al
de
de
Prasad
y
complementar
manejo
del
maco,
acoplamos ambas metodologfas básicamente diferenciadas por el
hecho de que la primera es reportada para suero en
la
segunda, como y a io mencionamos,
bÚralos;
asf
mismo
existfan
para
moco
diferencias
en
sangre
cervical
y
de
cantidades,
volúmenes y molaridad que de l a muestra y de cada una de
las
sustancias se utilizaban.
Algunas
de
las
posibilidades
que
se
probaron
14
se
t
-
mencionan a continuación:
a, Posibilidad I A tPrasad et-al,.
1. Tomar una alícuota
de
ml.
0.1
de
muestra
de
moco
previamente disuelto en solución salina.
2. Preparar una mezcla de soiuci6n de g l i c i n a cd.2 i
iy
NaOH (6.25 fl para obtener el buffer
de
pH
l(o.5.
esta m e z c l a que a su vez deberá contener
ml.de
de
Agregar
I
solución
una
5.5 x i @- 3 M d e p-nitrofenil fosfato.
3.
Incubar a Y7 OC durante 30 minutos.
4.
Adicionar i@ ml.
de NacSH @ . @ 2 N .
5. Leer absorbancia a 41.3 nm.
b,
Posibiiidad i B.
(Prasad et-al).
Es semejante al inciso anterior solamente que se p r o b ó
nuevo paso, el cual consistfa
en
preincubar
la
mezcla
sustrato y buffer a 37 oC durante l(d minutos. Terminado
tiempo se a g r e g a @.lml.de
un
de
este
muestra y se siguen los pasos 3 . 4 y
5 descritos e n el inciso anterior.
c ) Posibilidad 11.
1. Mezclar 2 ml.
d e butter de glicina @ . i n con
p-nitrofenilíosrato disbdico 1.11
x
2. Preincubar a 37 oí: durante l@
3. Agregar 1 ml.
de muestra.
4. Mezclar.
5. Tomar 1 m l .
de mezcla.
10 -2fl.
minutos.
Z
ml.
de
6. Incubar a .3I o ¿: durante 36 minutos.
7. Agregar Id m1.
(b
d e NaOH 0.cdSN.
8. Leer a 413 nm.
Se probaron l a s
anteriores
posibilidades
en
variando
cada una de elias:
-
Proporci¿n de moco en solucidn salina
ser
al
disuelto
éste.
-
Diterentes
volbmenes
de
alfcuotas
la
conteniendo
muestra. Estos se encontraban en un rango de Gl.1 a 1 m i .
-
Diferentes
resultados se
ejemplares
bovinos
eviatr
para
debieran principalmente al
estado
los
que
particular
d e un animal.
Observamos que l o s
de
resultados
todos
estos
ensayos
resultaban poco alentadores ya que no s ó l o daban lecturas tan
bajas q u e se encontraban dentro del m a r g e n que el manual
del
espectrofotómetro denomina
que
como
poco
confiable,
además no eran reproducibles. Fué entonces cuando
sino
ensayó
se
la metodologfa que con el mismo sustrato reporta Lynch
Este ensayo desde el principio arroj6 lecturas
reproducibles
aunque no en un rango contiable, porlo que se
s ó l o a encontrar
tan
prosiguió
la d i l u c i ó n que mejores resultados a r r o j a r a .
Esta metodologfa, que f u e con l a que se decidid
relata d e manera
(12).
detallada
en
la
segunda
se
trabajar
etapa
de
este
era
la
que
trabajo.
La
Última
metodologfa
por
establecer
16
I
-
.
determinaba azúcares totales. P a r a ésto decidimos
método de antrona 113) ya que a
ojos
nuestros
probar
el
contaba
con
método
de
algunas ventajas:
-
Es espectrorotométrico
igual
al
que
el
tostatasa alcalina y el de proteína que estabamos utilizando,
por
lo
se
que
contaba
en
laboratorio
el
con
la
toda
intraestructura necesaria.
-
Existía
residentes del
-
cierta
experiencia
de
uso
los
entre
laboratorio.
Todos los reactivos necesarios para su realización
se
encontraban en el laboratorio.
-
Es un método fácil de realizar.
Desde un principio
con
y
el
de
fin
establecer
las
condiciones de ensayo, nos entocamos a realizar
con la relación de 0.2 g .
pruebas
de Sol. salina, ya que
de moco/ ml.
esta relación e r a la que había
arrojado
durante l a s pruebas para determinar el
mejores
método
resultados
tostatasa
de
alcalina y proteína, además de que convenfa manejar la
preparación
para
bibliogratia ( 1 3 ,
todos
los
las
ensayos.
Por
de
muestra
problema para llevarla con agua a un volumen final de 1
por
lo que
en
un
dilución que para el
primer
bloque
se
principio
ensayo
probaron
fue
necesario
resultara
las
la
lado
otro
recomendaba tomar una alfcuota
misma
mi.,
determinar
la
En
un
conveniente.
siguientes
diluciones
cVol.tinal, en muestras d e tres ejemplares distintos: 1 a 10,
1 a 29, y 1 a 2. La
más
conveniente
lecturas
de
absorbancia f u é la de 1 a 2. Acto seguido se llevó a cabo
un
segundo bloque d e diluciones cercanas a la proporcign que
ya
por
sus
habíamos seleccionado. Las relaciones que se probaron
(muestra-Vol. final, d e 1 a
absorbancia a 62(6
contiables
dilución 1 a
tanto
y
4
4
y
1
a
2.5.
Las
nm arrojaban en todos los
reproducibles,
sin
por ser
permitfa
inferiores
la que
como
superlores
embargo
lecturas
casos
se
de
lecturas
#
escogio
la
variaciones
mayores
dentro
tuercsn
de
un
rango
instrumentaimente confiable.
La
metodologia
para
determinar
concentraciones
de
azúcares totales se describe durante l a segunda etapa de este
trabajo.
~
**
METODOLOGIA
1. PREPAHACION DE L A MUESTRA DE MOCO.
Se trabajó con una relacio% d e moco-Sol. salina
g/ml.
(6.2
de
P a r a l o g r a r l a se peso e l vial o recipiente donde
disuelta la muestra.
agragaban 5 m l de
Se vaciaba e n este
solución
salina
al
lg.
moco
y
se
Debido
a
la
de
cb.SJ%.
dificultad que representaba el manejo del moco, no
f á c i l pesar
serfa
resultaba
la cantidad exacta de l g , por l o que se optó
vaciar una cantidad
cercana
a
ésta,
cuidando
soiucioíi salina necesaria para satisracer l a
por
la
agregar
relación.
Acto
seguido se agitaba en vortex durante 5 minutos. a l tkrmino de
los cuaies se separaba el volumen total
aproximádamente i
en
5
alfcuotas
de
ail.
18
APRECIACIONES C U A L I T A I s I V A C OE C U L O R Y COHESION.
I í .
En el momento de manejar el moco para su disolución,
registraron
datos
de
color
y
"aparente
conveniente mencionar que el término d e
nació
para
rererir
muestra, cuando en
espátula.
simples
el
seno
de
ésta
era
l a cual al ser extraída ja!aba
moco, t a n ancho y l a r g o que podfa
Es
cohesi8nn.
"aparente
observaciones
se
cohesi6n"
directas
la
a
introducida
una
consigo un "hilo" d e
incluir
toda
la
muestra
presente en el vial. La apariencia de e s t e nhilo" s e r % a
que se le designe con un número, el c u d ¡ será 2 si este
comprende a toda la muestra y de -2
cuando
la
La
hilo
consistencia
sea semejante a i del agua.
111.
1.
Determinacidn de Protefna. Método de Loury
tí@,.
Preparacibn de Reactivos.
a ) Reactivo A.
Es una mezcla de tres soluciones "stock",
l a s cuales se combinan justo antes de s e r utilizadas,
debido
a que estos reactivos una v e z mezclados son muy inestables
por
lo tanto deben
ser
descartados
el
mismo
día
que
y
se
prepara d i c h a mezcla.
P a r a preparar un volumen d e reactivo A ,
2(6 determinaciones. Distribuir
siguientes
volúmenes
suficiente
l a s soluciones " s t o c k " en
y secuencia:
para
los
(d.
a.5 ml.
Heactivo A - 1
'lartrato de sodio a l 2%
(b.5 m l .
Reactivo
A-2
Culíato de cobre a l 1 % .
58
Reactivo A - 3 carbonato de sodio a i
ml.
2%
en
NaOH
iN.
b,
R e a c t i v o F o l i n Ciocalteu.
Debido a que varios distribuidores,
encuentra
Sigma,
casa
cuya
basta con una dilucidn l:i
presentación
l a normalidad
(
de
se
que
producto
z
concentracio'n
reactivo
presente
1 N > requerida.
c ) E s t a n d a r d d e Albhmina
disuelven 0 . 2 5 0 g.
a r o r a a 543@ m l
p a r a que el
los
entre
utiiiramos, proporcionan ei reactivo en una
id,
.
Sérica
d e BSA en 400 m i .
de
Bovino
~BSAI.
Se
y
se
de agua destilada
.
2 . Método
a,
l o s de
Se prepararon los t u b o s d e l a curva patro'n,
la
muestra problema,
así
como
de ia siguiente manera:
20
protl
mi BCA
Cb
d
@. 4@@
(b
2@
Ca. 840
0.360
0
4v)
(d.
idt3rd
id. 3Lcb
(b
4
6(6
0.120
@. 280
0
5
a@
cb. 16(6
(6.246
@
6. L(b8
0
6
1 (60
ca.
7
12@
Cb. 24Cb
2(00
0.4@0
0
0
'?
A
ml.mtra.
salina
tubo
Tubo
ml.Sol.
continuación se añadieron a todos los tubos 2
reactivo A .
Se agitaron y se dejaron
ambiente durante
i(6
reposar
a
de
temperatura
minutos.
Terminado el reposo, se adicionó a todas los
ml d e ractivos
ml.
de Folin Ciocalteu. se agitaron los
después d e 3@ minutos de reposo a
leyó l a a b s o r b a n c i a a 7 5 @ nm en un
temperatura
(6.2
tubos
tubos
ambiente,
espectrofotometro
y
se
"Zeiss
TM-6".
Finalmente. y con el fin d e encontrar
de protefna
existente
en
la
muestra
la
concentración
( I ( g./g.
moco,,
se
construyó l a curva patrón.
21
1
-
1V.
1.
(12,
Determinacidn de Fosfatasa Alcalina.
Preparación de reactivos.
a ) Soluci6n estandard "stock" de
16-2g.
x
Disolver 1 . 3 9 1 1
de
ccó.blM~.
p-nitrofenoi
p-nitrofenol
grado
reactivo
tFM=159, y atorar con agua destilada a l(0 m l .
b,
Burrer d e glicina-Cloruro de magnesio p H = l @ . S t @ . l N ) .
Disolver 750 mg.
de glicina y 2 U . 3 mg.
hexahidratado. Aforar a I@@ m l .
d e cloruro de magnesio
con agua destilada. Verificar
el v a l o r de pH y de s e r necesario ajustarlo con base o
ácido
ruerte.
x
c ) Sol. d e p-nitroreniltosrato d i s d d i c o ( 1 . 5
Disolver
4@U
mg.
de
p-nitrofeniltosfato
reactivo c P M = ~ b 3 . @ 5 , y a t o r a r a t W m l .
l(b-2M).
disddico
grado
c o m a g u a destilada.
. .
d)
Sol.
de hidrbxido de sodio ( @ . @ 2 N > . Disolver
@.€I
g.
d e hidrbxido de sodio tPM=4@, en agua destilada y atorar a
1
1.
2. Método.
A.
Se
Curva Patrón.
preparó
atorando a 1@(0 mi.
la
solución
con
NaOH
estandard
(@.82N,.@.5
de
p-nitrorenol
ml.
de
la
Sol.
22
"stock"
mismo
del
compuesto.
Esta
se
Sol.
desechó
diariamente.
Se distrrbuyó el p-nitrofenol y NaOH (cd.cb2NJ de
P
acuerdo
l a siguiente t a b l a :
No.
So1.p-nitrofenol
Tubo
A
rnl.
t
NaúHt0.82N)
(
)
nil.
1
l.@
9. cb
2
L. 0
8.0
3
9 . (b
6. cb
4
6.0
4.0
5
t3.
2.
6
10.0
(b
Cb. 0
continuación se mezclaron cada uno de
inversión y
se \ e y d l a
(b
absorbancia
a
410
los
nm
tubos
usando
por
como
reterencia NaOH cb.cd2N.
B.
Problemas.
En un baño María se incubaron a 370 C durante 5
t u b o s que contuvieran 0.5
de
magnesio
y
8.5
Terminado e l tiempo,
ml.
se
ail.
de
minutos
de a m o r t i g u a d o r glicina-cloruro
dioddico.
p-nitrofenilfosfato
adicionó
0.1
nil.
de
la
muestra
23
problema.
Se incubó p o r segunda vez en ban0 Marfa a l a
temperatura durante S U minutos, tiempo despues
adicionaron 6.9 mi.
d e NaüH ih.ioLN.
inversión y se tomó l a
lectura
Se mezclaron
de
absorbancia
u s a n d o como b l a n c o una solucidn preparada de
que el
dei
la
misma
cual
se
l o s tubos
por
4140
a
misma
problema, s ó l o que en lugar d e moco tenía 0.1
nm,
manera
ml.
de
agua.
V.
Determinación de azúcares totales, Método de
1.
Freparacibn de Reactivos.
Antrona
(13).
a ) Solución estandard de glucosa
Le) m g . d e g l u c o s a y a r o r a r
b)
a
mg.11).
Disolver
1@@
m l . con a g u a destilada.
ColuciÓn de antrona ( 2 m g / m l . j .
antrona en 1 0 @ m l . de ácido
(10@
sultÚrico
Disolver ZCa0
concentrado
de
mg.
(95%) y
mantener en i r f o ibaGo con h i e i o ) .
2. M é t o d o .
Con la soluciÓn estandard de glucosa se
siguientes diluciones con
el
fin
de
lograr
realizaron
la
las
curva
calibración:
24
de
No.
Tubo
A
1I J C .
std.
Conc. Azuc.
(mg. / I J
t
ml.)
Aqua
PrOb.
tml)
tml)
(b
1.U
@. U
20.0
a. 2
G9.8
GI.
2
4 @ .@
(d. 4
(d.
6
@.@
3
60.0
a. 6
ca.
4
0.0
4
e@.(b
(d.
6
cb. 2
6 . (b
5
lca0.0
1.a
0.0
0.0
6
'?
0.ca
(D.
(b
d.@
1
@.
d e Col. de antrona d e manera que
las
anadió,
resbaiando
Se les
un ban0 d e hielo por e s p a c i o de Z o 3 minutos.
Y
cb. 25
las
les
capas se estratificaran y no se mezclaran.
los t u b o s en vortex
I
por
todos los tubos se
paredes del tubo, 2 ml.
75
0
se
colocaron
en
un
sometió
Se
bazo
a
mezclaron
de
agua
hirviente durante la minutos. Se enfriaron en hielo y se ley&
la
absorbancia en un espectrofotometro "Zeiss TM-6".
Nota: Si en el momento del mezclado
fluido se t o r n a v e r d e , hay que desecharlo.
l a ' coloración
.
del
HESUL'TAljÜS
P
Resultado
mencionó con
importante
del
anterioridad,
el
trabajo
como
fue,
determinar
las
condiciones
adecuadas para cada uno de los ensayos en que se
área
de
Reproducción
kutónoma Metropolitana
Bovinos
en
plantel
de
Iztapalapa.
descritos en l a segunda parte d e la sección
tienen por objetivo determinar
la
dentro
Universidad
Estos
de
ensayos,
metodologla,
espectrofotométricamente
concentraciones de fosfatasa alcalina,
protefna
totales presentes en el moco cervical. La
de
pasos
sucesos
a
seguir
durante dichos ensayos, fueron descritos en la primera
d e l a sección anterior.
A
continuación se presenta
las
azdcares
y
serie
q u e nos l l e v a r o n a concluir l a secuencia de
mi
basaría
investigaci6n y el de las personas que l o continuaran
riel
se
ya
un
parte
breve
puntuario conteniendo algunos de los puntos. mas relevantes:
t
a, Se disolvio el moco en Sol. salina a l 6.9%. guardando
una concentración de 2~
b , La
m g i ml.
actividad de tosfatasa alcalina se v e
atectada por contl'nuos cambios d e
representados
por
congelamientos
muestra. Con el tfn d e
evitarlos,
temperatura,
y
enormemente
generalmente
descongelamientos
una
vez
de
reaalizada
26
la
se
disolución,
prosiguió
a
aproximádamente 1 ml.
cada una.
Se
en
c)
recomienda
5
separar
cuanto
alícuotas
-2@ C por un tiempo no mayor
muestras, congelarlas a
las
de
almacenaje
el
de
de
30
dfas apartir del momento de su recolección.
d)
Se
consideró
importante
determinar,
.
cualitatfvamente, color y "aparente cohe'sidn"
aunque
Se
tomaron
seguir
durante
tambiin lecturas de pH.
Una vez ya determinada l a metodologfa a
el estudio, se prosiguió a llevarlo
a
muestrearan 12 ejemplares bovinos, 7
cabo.
Para
encontraban b a j o el influjo del tármaco inductor por
servirían como grupo control, mientras que
se
no
se
cuales
los
de
ello
5
tos
que
lo
restantes
habían presentado un estro adelantado con respecto a su ciclo
normal.
respondiendo do esta manera a l
tratamiento
inductor
con Prostaglandina F 2 alfa. Conviene mencionar
que
ocasión que se realizaba
construía
un
experimento,
se
en
cada
lo
curva patrón correspondiente. Un ejemplo de cada una de estas
curvas patro'n
se muestra en l a s tigiiras I , 2 y 3 . Con b a s e en
cada una de estas curvas y mediante el
método
de
regresión
lineal, se obtuvieron los datos d e concentración de cada
de los
pardmetros de
interés.
Estos
datos
uno
posteriormente
fueron manejados en trabajo de escritorio, para reterirlos
a
1 gramo de moco, tal y como se muestran en l a s tablas I y 11.
Por
otro
lado
y
con
el
tin
de
hacer
mas
lo
fácrl
27
lnterpretacidn de los
las
presentes e n
alcalina, F i g .
Y
datos
tigura
resultados
de
7 con base a l o s v a l o r e s de pH
lac tablas 1 y 11, así
4,
para
4
Las
construyeron
gráricas
tostatasa
5 para protesna, F i g . 6 para azúcares
por Altimo F i g .
(Figs.
se
como
las
gráticas
5 y 6 ) nos damos cuenta que
loo
totales
. Observando
correspondientes
valores
de
una tendencia que pueda servir como punto
de partida para hablar
de
posibles
composicidn del moco cervical
cambios
detectar
y
dentro
.con
ello
tratamiento inductor ocasiona desordenes dentro del
que en su papel
io
por
grupo parecen no guardar ninguna relación entre sí y
tanto, mucho menos.
cada
de
Aa
si
el
mismo
y
da barrera espermática no permita el paso
de
éstos, cuando deberfa hacer10,provocandose en efecto e l celo,
p e r o no l a
recundacidn.
manitiesto que
La
AI
observar
desviación
los
estandard
datos
se
de
queda
encuentra
muy
cercana a l a media aritmdtica o incluso. en varios casos, por
encima d e ésta. Al aplicar l a prueba de libre distribución de
Mann-Whitney ( 1 4 ) encontramos en todos
los
ensayos una
p>cb.l
con lo que se asume que no hay diferencia signiticativa entre
los datos d e ambos grupos: control y hormonalmente tratadas.
Las p o s i b l e s causas d e
.io
anteriormente expuesto,
serán
tratadas en la siguiente sección.
Por otro lado, mediante simples apreciaciones
se obtuvieron d a t o s
cohesidn",
de
color,
contaninacidn,
y
visuales,
"aparente
los cuales se muestran en l a tabla I V .
28
1
a
z
i
a
@Qs
a
a
3
o
\
8c)
\
\
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AZUCCSRES TOTALES
MED1.B ( X I
2.800
567. OOCI
605. SOU
876.531
694 829
950.400
.
884. Y 2
P. H.
8.22
7.75
8.73
8.42
8.59
7.50
748.700
8.70
8,878.039
4,445.760
57.910
645.691
s70 o23
1,347. u70
1 , 502. u44
386.000
1,126.170
845.70U
623.900
461 8CiO
ANIMALES
TRf4TCIWS
v-113
V-4132
28-21
28-51
28 32
9
-
1 , SCl2.453
2,723. 114
TABLA 1x1.
.
3, 443.570
8.390
8.770
1 640,
.
89 900'
8.000
35.720
"APRECIACIONES CUALITATIVAS DE COLOR
clave
Co 1or
** Aparente
Y
COHESION"
APARENTE
contaminación
Cohos i
Ón"
moco
Control:
V-l@;Z
Amarillento
28-23
Transparente
ZSr-is
Amarillento
28-25
Transparente
28-3@
Amarillento
No
28-33
Transparente
si
28-34
Amarillento
si
v-it3
Transparente
No
V-4132
Amarillento
si
28-21
Transparente
si
28-31
Amarillento
si
28-32
Blanquecino
si
- 1
si
2
si
- I
2
Si
No
Tratados:
TABLA #
IV
D I SCUS 1ON
los
Tal y como se mencionó en l a sección de resultados,
valores de fosfatasa alcalina, protefna y
azúcares
totales,
parecen no guardar una relación entre s f en cada uno
grupos experimentales (control
lo
parte, y como consecuencia de
apreciar
diferencias
tratados
hormonaJmente
sincronitados).
y
primero,
significativas
los
y
que
no
Por
fue
fungieron
otra
posible
los
entre
loo
de
animales
como
grupo
control.
Las posibles causas
de
lo
anterior
se
enlistaran
8
cont inuaci o'n:
a J
Los ejemplares de los que en
momento,
ese
8e
muestra, presentaban problemas en su reproduccidn, es
no habían quedado prefiadas durante 3 o
4
tratamientos
que
decir,
calores después
Último parto, a pesar de insistentes tratamientos
a base de hormonas,
tomó
con
la
del
inductores
frecuencia
y
dosis eh los que fueron aplicados, parecfan ser inadecuado8 y
no sdlo no otrecian los resultados
esperados,
parecer l a s concentraciones hormonales
podtan h a b e r
aumentado
tan
propia causa de un desorden
dentro del
escandalosamente
aún
mayor,
sino
que
que
que
ai
organismo
eran
la
interferfa
en
29
cualquier intento por provocar el celo Y i a fertilidad en
para
animal. Lo anterior resultaba de invaluable importancia
nosotros, ya que como se ha expuesto, nuestro trabajo,
por objetivo
observar
las
anormalidades
que
en
éstas se vieran
talseandose de
reflejadas
esta
en
menera
las
moco
y
asi,
lógica de lo anterior, no es posible
seguro
propiedades
datos.
los
tenla
el
cervical propiciaba un tratamiento inductor a l estro
si el animal presentaba irregularidades, es casi
Como
que
moco,
del
consecuencia
concluir con e s t e
de animales que contormaban tanto a l g r u p o
grupo blanco del tratamiento inductor con
e1
Aote
como
ai
prostaglandina
F2
control
alta.
bi
La muestra de animales utilizada tanto para el
control ( 7 bovinos>como para el grupo
con prostaglandinas ( 5 bovinos>,
poder establecer tendencias
moco c e r v i c a l ,
de
resulta
dentro
del
animales
muy
grupo
tratados
pequena
para
comportamiento
el cual siendo un sistema bioldgico "in
del
vivo"
es mas diffcil d e estandarizar.
c ) En nueve de las doce muestras de moco
observaron piezas de estiércol, las cuaies
utilizadas
se
representaban
un
ractor contaminante m u y importante, ya que en su tan
composición podfan significa'r fuente, entre otras
nitrógeno
orgánico
el
cuál
podrfa
interferir
variada
cosas,
de
en
las
cuales
se
determinaciones proteicas.
d, El número d e
posibles
razones
por
las
obtuvieron resultados tan desconcertantes, puede s e r
siendo que nosotras principalmente l o atribuimos a
enorme,
problemas
reproductores d e los ejemplares y a l a limpieza en La toma de
las muestras, explicados durante el inciso
a
c
y
de
esta
sección. Sin embargo considero como un factor importante,
el
hecho
de que el moco durante el d e s a r r o l l o del dia e s t r a l
va
Por
lo
presentando diferencias dentro d e su composicidn
tanto y con e l ffn
de
disminufr
las
( Q j .
posibies
resulta interesante tomar en cuenta l a importancia
cobrar.el
variables,
que
pudo
hecho de no haber tomado l a s m u e s t r a s dentro de
un
periodo fijo durante el celo, y que de esta manera se hubiera
contribuido aún más a las diterenclas tan grandes
animales
de
un
mismo
grupo
(control
o
que
entre
sincronizados)
existieron.
31
CONCLUSIONES
A pesar de que
0610 se cumplió
perseguidos, establecer metodologías,
puntos muy importantes para la
d e experimentos que
tuvieran
los
de
uno
se
objetivos
lograron
como
fin
de
ei
ganado
ai
estro
tostatasas
mediante
observaciones
anterior, por
ya
tu6
discutida
alcalina,
después
algunas
durante
de
aplicación
la
prostaglandina F 2 a l f a . La importancia de
Las
determinar
proteína y azúcares totales, ocurren en el moco,
al
serie
planeación de la nueva
variaciones que en concentraciones
inducir
concluir
la
de
estas
de
sección
de
io que m e remitiré a sólo en~istarias.
Es, entonces, d e suma importancia que:
1.
que
Se escoja un hato, del cual se asegure
estado expuesto a
tratamientos
hormonales
no
haya
2
durante
o
más
celos. Otra opción seria incluir a éstos en un grupo
3
de
es tudio.
2. E l mismo h a t o que v a a ser
inductor,
rácilmente
funcione
si
como
durante
grupo
2
o
3
expuesto
control.
ceior
al
tratamiento
Esto
antes
se
de
iograra'
ia
programada para l a inducción, se toman nuestras a las
techa
cuales
32
s e les determinen los parametros q u e se buscan especificar en
el moco "post-induccioh".
estado general del moco
Esto
del
permitirá
animal
conocer
antes
del
bien
tratamiento
hormonal, facilitándose las posteriores comparaciones
lo
tanto l a determinación de diferencias
el
entre
por
y
uno
otro
y
moco. Cumpliéndose de esta manera ei objetivo perseguido.
3. En el momento d e la
toma
de
,muestra
animal, deberán asegurarse las condiciones más
higiene, evitándose la
presencia
deberá congelarse la muestra
recolección
y
asf,
ser
de
de
estrictas
Asf
estiércol.
inmediatamente
transportada
en
del
moco
después
hielo
de
mismo
de
seco
su
al
laboratorio de análisis.
4. Deberá estudiarse a fondo l a posibilidad
recolectar las
muestras
dentro
senalado después d e un primer
observable. Esto traerá como
de
indicio
un
de
periodo
de
de
tiempo
fácilmente
la
necesidad
de
personal d e planta q u e mantenga en observación
constante
al
ganado.
consecuencia
ceio,
procurar
RESUMEN
Se considera que el cervix representa la primera barrera
para la migración d e los espermatozoides hacia el sitio de la
fertilización.
Asf
mismo
se
demostrado
ha
fuerte
la
interacción bioffsica entre é s t o s y el moco cervical, de
ahi'
que ciertos cambios en l a s propiedades Oisicas son esenciales
para l o g r a r el paso de los espermatozoides a l
ovulación. Estos cambios se
estrógenos causan un
moco
hallan
bajo
más
claro,
contenido d e agua y con un patrón
de
control
sucede lo contrario, convirtiéndose en un
Por
todo
lo
en
los
inferir que cualquier anormalidad
con
elástico,
agentes
!a
hormonal:
alto
mayor,
cristalización
mientras que durante el predominio de
para los espermatozoides.
de
tiempo
progestagenos
moco
impenetrable
anterior
facii
es
niveles
hormonales
pueden repercutir en las propiedades del moco y por lo
tanto
e n s u penetrabilidad a los espermatozoides.
E l trabajo tuvo por objetivo, ademas
metodologfa
a
utilizar,
pudieran suscitar
prote!na
en
los
los
determinar
niveles
de
de
establecer
cambios
fosfatasa
que
la
se
alcalina,
y azúcares, así como en el pH, debido a l tratamiento
inductor a l estro mediante prostaglandina F 2 alfa. Los
obtenidos tueron m u y heterogéneos, por lo q u e no
se
datos
apreció
un comportamiento que pareciera propio de
grupos
tcontrol
y
sincronizados),
cada
uno
dificultando
manera, observar diferencias que el tratamiento con
de
de
los
esta
hormonas
hubiera p r o v o c a d o en el g r u p o de los 5 bovinos estudiados con
respecto al control. Mediante los experimentos realizados
hicieron
patentes
formular
algunas
ciertas
deficiencias
propuestas
dirigidas
que
ayudaron
al
grupo
se
a
de
investigación que proseguirá este t r a b a j o .
35
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