Reseña de los Métodos Diagnósticos para Mycobacterium

Reseña de los Métodos
Diagnósticos
para Mycobacterium tuberculosis.
M.C. Jesús Angel Araujo Glez.
U.A.C.J.
Abril-2006
I. TUBERCULOSIS
La tuberculosis es una enfermedad
infecto-contagiosa que representa un
problema importante de salud pública y
actualmente, se considera como una
emergencia a nivel mundial.
La tuberculosis No es aún una enfermedad erradicada.
Es una infección que a nivel comunitario es controlable,
prevenible y curable. Sin embargo, es un grave problema
epidemiológico, terapéutico y de Dx clínico y microbiológico.
DESCRIPCIÓN
¾ El reservorio principal es el hombre enfermo.
Se transmite por vía aérea; al toser o expectorar
mediante aerosoles que al llegar al pulmón pueden
producir la infección.
2,400 años a.C.
¾ La tuberculosis es una infección crónica cuyo
agente etiológico es el Mycobacterium tuberculosis
(1882) y, en raras ocasiones por otros agentes
microbianos como:
Mycobacterium bovis
Mycobacterium africanum
Mycobacterium microti
Bacilo de Calmette y Guérin
¾ La prevención y control de la tuberculosis intenta evitar la infección.
Si ésta se produce, se debe evitar su transmisión.
Bacilo de Koch.
9
9
Actinomicetales, Mycobacteriaceae, Mycobacterium tuberculosis.
Bacilo aerobio, de 0.2-0.6 x 2-10 µm
No movil, sin capsula
No forma esporas
Parasito intracelular (monocitos/macrófagos)
9
BAAR (Ziehl-Neelsen), lento crecimiento.
9
9
9
Lipo-Arabino-galactano
Micolato y peptidoglicano.
6,6-dimicolato de trehalosa.
Diagnóstico.
¾ Clínico.
¾ Microbiológico.
¾ Radiológico.
¾ Biología Molecular.
¾ Inmunológico.
¾
Dx Clínico.
¾
Dx Radiológico.
9
Perdida de peso.
Tos productiva.
Fiebre.
9
Método auxiliar,
Radio-opacidad apical.
9
9
Inmunológicos.
(AcLAM)
Ac-AgLAM)
¾
PPD (Mantoux)
9
Diferenciar infectados/no infectados.
9 Reacción hipersensibilidad
retardada. (previo, natural, adquirido)
9 Especificidad 95-99%
¾
9
9
9
9
9
‰
48-72 hr.
QuantiFERON TB
Detecta IFN-γ, mezcla de
péptidos sintéticos (ESAT-6) y
(CFP-10).
Infección latente-Tb. evaluación?
“Puede usarse en lugar de PPD”.
Resultado en 24 hr.
Antígenos más específicos.
“Confirmar-excluir Tb./infección
latente, requiere la combinación
de hallasgos epidemiológicos,Rx,
clínicos y Dx entre otros.”
Microbiológico.
¾ Baciloscopía.
9 Técnica basica.
9 Bajo costo, rápida.
9 Sensibilidad
(104, 103 bacilos /ml)
Microbiológico.
¾ Cultivo. (10-100 /ml)
9 Sensibilidad 80 – 85%
9 Especificidad 98%
9
Carac. Fenotípicas:
Colonia rugosa,
no pigmentada, Niacina+,
reduce NO2, Catalasa+, etc.
Cromatografía.
Microbiológico.
¾
BACTEC 460, 9000
¾
9
9
Método radiométrico
2-3 semanas.
Sondas de DNA
(AccuProbe® test).
MIGIT
Sistema para cultivo
de micobacterias de
detección rápida.
(sensor de fluorescencia detecta
)
oxígeno
Biología Molecular.
DNA
Replicación
(DNA Polimerasa)
9 Detección de ácidos nucléicos específicos.
DNA/RNA
™ Dogma central.
Retrotranscripción
(Transcriptasa Reversa)
Transcripción
(RNA Polimerasa)
RNA
Traducción
Diagnóstico Molecular.
¾
Detección secuencias de DNA/RNA
9
Sondas DNA (oligonucleótido marcado)
Diagnóstico.
(Especificidad)
‰
Ensayos:
1.- Id. en cultivo
2.- Id. directa en especímen
3.- Amplificación (sensibilidad)
sensibilidad).
Acido Nucléico
Blanco
DNA-Sonda
Hibridación
Detección
Diagnóstico Molecular.
¾ Amplificación:
DNA Blanco
1. Preparación de muestra (DNA/RNA).
2. Amplificación.
PCR, LCR, TMA.
3. Detección.
Sistema Roche PCR biotina-avidina/peroxidasa.
Sistema Abbott LCR reacción Ag-Ac.
Sistema GEN-PROBE-TMA usa protección por
hibridación (HPA).
Electroforésis.
Denaturalización
R
E
P
E
T
I
C
I
O
N
Hibridización de Primers
D
E
L
C
I
C
L
O
.
Extensión por DNA Polimerasa
Métodos de tipificación molecular de M. tuberculosis
complex
Junio de 1998 por Cole y cols.
Métodos de tipificación molecular de M. tuberculosis complex
¾ MÉTODO
DE RFLP-IS6110
¾ 1º Cultivo de M tb.(~3-6 semanas)
¾ 2º Extracción y purificación del DNA
¾ 3º Digestión con pvuII y electroforesis
¾ 4º Transferencia del DNA
(Southern Blot)
¾ 5º Hibridación con sonda complementaria
a IS6110 y autoradiografia(~1 semana)
Discrepancias.
Microscopía Cultivo
BM
-
+
TB
+
-
Mycobacteria atipica
-
+
TB Tx, paucibacilar,
Falso +
+
-
TB, contaminación
™Evaluar utilidad real del Método en un contexto Clínico adecuado.
Métodos de B.M. vs tradicionales.
Ventajas
‰ Sensibilidad
que
microscopía.
‰ Rapidez que cultivo.
‰ Confirmación M.tuberculosis
‰ Agilizar la Id. en cultivo.
‰ Permite reconocer cepas
MDR.
Desventajas
‰ Rapidez
? (Lab.)
‰ Costo - Beneficio
‰ Reproducibilidad
‰ Interpretación.
Detección TB
¾
5% Triton X-100 (Sigma, St. Louis, Mo.) Tris-EDTA buffer (pH 8.0)
Buffer lisis (2%SDS,
(2%
¾ Mezcla para PCR (Buffer, dNTPs, Taq, Mg 5-GAGTCTCCGGACTCACCGG-3)
¾ Amplicón 1200 pb
+2,
.
(Laminillas)
U.A.C.J.