Práctica 12: Espiroquetas.

PRACTICA #12
ESPIROQUETAS
OBJETIVO DE LA PRACTICA.
Conocer las diferencias morfológicas de las espiroquetas, las dificultades para su
cultivo y las técnicas de identificación.
INTRODUCCION
Las espiroquetas son bacterias finas, helicoidales, gramnegativas y de paredes
flexibles. Los géneros con especies patógenas son Treponema, Borrelia y
Leptospira. Entre la pared y la membrana plasmática corren filamentos como un
eje en el centro de la espiral, llamados ejes axiales (2-6). Algunas pueden
cultivarse y otras no.
El Treponema pallidum causa sífilis humana y no se puede cultivar. Sin embargo,
el conejo es susceptible, inoculado en el testículo. Todos los treponemas son
morfológicamente iguales. El diagnóstico se efectúa por observación del material
clínico en microscopio de campo oscuro y por reacciones serológicas.
MATERIALES Y METODOS.
I.
Tinción por la técnica de impregnación argéntica.
Los reactivos son:
Sol. A (mordente)
25 ml de una sol. saturada de Sulfato de Aluminio y Potasio (14 gr / 100 ml
de agua)
50 ml de sol. de ác. Tánico al 10 % en agua
5 ml de una sol de cloruro férrico al 5 % en agua.
Conservar la solución en una botella.
Solución B (colorante)
100 ml de una sol. de AgNO3 al 5 % en agua.
A 90 ml de la sol. de AgNO3 adicionar gota a gota una sol. de hidróxido de
amonio concentrado (aprox. 2-5 ml), hasta que se redisuelva el precipitado
pardo formado.
Agregar gota a gota un poco de la solución de AgNO3 restante, hasta que
persista una leve turbidez.. Conservar en una botella.
Tinción:
1. Marque en un portaobjetos, un círculo del área donde quedará el frotis,
con un lápiz graso.
2. Haga un frotis con un poco de sarro dental en una gota de agua. Las
espiroquetas saprófitas del sarro sirven para ilustrar la forma de este
grupo de bacterias espiraladas.
3. Seque al aire, no fije con calor.
4. Cubra la preparación con solución A durante 4 min.
5. Lave con agua destilada.
6. Cubra el frotis con solución B y caliente hasta desprendimiento de
vapores por 4 min sin dejar ebullir.
7. Lave con agua destilada y escurra. Deje secar. Observe a 100 X
II. Tinción Negativa:
1. En un portaobjetos coloque una gota de sol. sal. fisiológica y deposite en
ella un poco de sarro dental tomado con un palillo. Haga una suspensión
del material.
2. Adicione una gota de tinta china y mezcle con los microorganismos.
3. Extienda la mezcla con otro portaobjetos, en forma semejante al frote
sanguíneo.
4. Deje secar al aire libre y observe al microscopio de luz.
5. Las espirilas se observan sin color, brillantes.
III. Prueba serológica de VDRL (aglutinación en placa) para la identificación de
Treponema pallidum mediante la detección de reaginas antisífilis en suero, plasma
o L.C.R, contra el antígeno cardiolopina.
Reactivos: 1) suspensión antigénica estabilizada (VDRL)
2) Control positivo
1. Prueba cualitativa:
1.1. Obtenga 3 ml de sangre y deje coagular. Centrifugue y separe el suero.
1.2. para inactivar el complemento, caliente el suero a
60-62 C por 3 min, o a 56 C por 30 min.
1.3. Coloque una gota de suero inactivado (0.05 ml) sobre un portaobjetos.
1.4. Corra simultáneamente un control positivo y uno negativo.
1.5. Añada una gota de emulsión del antígeno al suero.
1.6. Rotar la placa en forma circular por cuatro minutos.
1.7. Leer la reacción al microscopio con 10 X.
1.8. Interpretacion de los resultados:
Resultado positivo: observación de agregados
Resultado negativo: No se observan agregados.
2. Prueba semicuantitativa:
2.1. En un portaobjetos coloque el control negativo con 50 microlitros de s.s.f., más
20 microlitros de suspensión antigénica.
2.2. La muestra que resulte positiva en la prueba cualitativa, se diluye con s.s.f., en
la forma siguiente, utilizando portaobjetos:
2.1. Coloque 50 microlitros de s.s.f en cada uno de seis portaobjetos
2.2.2. En el #1 porta adicione 50 microlitros de la muestra y mezcle con un
palillo.
2.2.3. Transfiera 50 microlitros de la muestra anterior al porta #2. Mezcle con un
palillo. De ahí pase 50 microlitros al porta #3, y continúe sucesivamente
hasta el #6. Del último porta se descartan 50 microlitros.
2.2.4. En cada dilución agregar 20 microlitros de la suspensión antigénica.
2.2.5. Agite en forma rotatoria cuatro minutos y lea enseguida
2.2.6. Interpretación del resultado: El título de las muestras corresponderá a la
última dilución en que se haya observado floculación (+).
- Anote detalladamente los resultados y dibujos de las bacterias observadas con
los diferentes métodos de tinción.
- Interprete los resultados obtenidos en la técnica serológica, explicando lo ocurrido
en la reacción inmunológica en ese caso especial. Discuta la sensibilidad de la
prueba VDRL. Compare los resultados con datos de la literatura.
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.
CUESTIONARIO.
3. Qué es la cardiolipina de la reacción VDRL?
4. Qué desventajas muestra la VDRL en un diagnóstico de T. pallidum?
5. Mencione dos Pruebas Específicas para el diagnóstico de sífilis.
6. Qué son los treponemas de Reiter y qué uso tienen?