IL-4, IL-5, IL-1β, IL-8, TNF-α EN PACIENTES CON

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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA
UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS
DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS
MAESTRÍA EN BIOLOGÍA – MENCIÓN INMUNOLOGÍA BÁSICA
IL-4, IL-5, IL-1β, IL-8, TNF-α EN PACIENTES CON
INFECCION AGUDA POR VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO
TRABAJO DE GRADO PRESENTADO PARA OPTAR AL GRADO DE MAGISTER
SCIENTARUM EN BIOLOGÍA-MENCIÓN INMUNOLOGÍA BÁSICA
AUTOR: ALIBETH ROSSANNA MAVAREZ MONTES
C. I. 14.090.681
TUTORA: Dra. NEREIDA VALERO
C. I. 8.491.958
MARACAIBO, SEPTIEMBRE DE 2008
REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA
UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS
DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS
MAESTRÍA EN BIOLOGÍA – MENCIÓN INMUNOLOGÍA BÁSICA
IL-4, IL-5, IL-1β, IL-8, TNF-α EN PACIENTES CON
INFECCIÓN AGUDA POR VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO
…………………………………………………………………………………………………
Trabajo de Grado presentado para Optar al Grado de Magíster
Scientarum en Biología - Mención Inmunología Básica
AUTOR: Alibeth Rossanna Mavárez Montes
C. I. 14.090.681
TUTORA: Dra. Nereida Valero
C. I. 8.491.958
Maracaibo, Septiembre de 2008
ii
IL-4, IL-5, IL-1β, IL-8, TNF-α EN PACIENTES CON INFECCIÓN AGUDA POR
VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO
____________________________________
Lcda. Mavárez Montes, Alibeth Rossanna
C. I. 14.090.681
Dirección: Residencias Las Islas, casa Nº 17, Av. 18C con calle 106A, Parroquia
Cristo de Aranza, Municipio Maracaibo, Estado Zulia.
Teléfono: 0261-7697794
Móvil: 0424-6143013
Correo electrónico: alibethrmavarezm@hotmail.com
___________________________________
Tutora: MgSc. Nereida Valero
C. I. 8.491.958
iii
VEREDICTO
Este Jurado, nombrado por el Consejo Técnico de la División de Estudios para
Graduados de la Facultad Experimental de Ciencias de la Universidad del Zulia,
aprueba el Trabajo de Grado titulado “IL-4, IL-5, IL-1β, IL-8, TNF-α EN PACIENTES
CON INFECCIÓN AGUDA POR VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO”, que la Lcda.
Alibeth Rossanna Mavárez Montes C. I. 14.090.681 presenta ante este Consejo para
optar al grado de MAGISTER SCIENTIARIUM EN BIOLOGÍA – MENCIÓN
INMUNOLOGÍA BÁSICA.
Jurado:
_________________________
MgSc. Nola Montiel
Jurado
_________________________
Dr. Héctor Pons
Jurado
_________________________
MgSc. Jorge Guiñes
Jurado
Maracaibo, Septiembre 2008
iv
DEDICATORIA
A ti Dios por dar la oportunidad de vivir, a
mis padres Omaira y Aly por estar conmigo
en todo momento y uds mi rey y mi reina por
ser los mas hermoso que ha
llegado a mí vida los amos.
v
AGRADECIMIENTOS
-
Principalmente a Dios por ser quien guía mis pasos, aportándome la fuerza,
que necesito para poder trazar todas las metas que me he propuesto.
-
A la Dra. Nereida Valero por brindarme sus conocimientos, orientación e
incentivar en mi el espíritu de investigador, así como también por ofrecerme
su apoyo en los buenos y malos momento, entregándome su amistad
incondicional.
-
A la Universidad del Zulia, Facultad Experimental de Ciencia, División de
Estudios para Graduados por permitirme ingresar a sus aulas, y así poder
adquirir nuevos conocimientos.
-
Al M.C José Hernández por ser un hombre con gran espíritu de superación,
mi consejero en los momentos que más lo necesito, y por ser el mejor esposo
que puede haber en el mundo. Te amo Rey.
-
A la Dra. Yraima Larreal por contar con sus consejos en todo momento.
-
A la MgSc. MeryBell Maldonado por toda su amistad, contribución, y
orientación otorgada para la elaboración de este trabajo.
-
Al personal de la Sección de Virología del Instituto de Investigaciones Clínica
por toda su ayuda y colaboración especialmente a la MgSc Luz Marina
Espina.
-
A mi compañera Lcda. Jennifer Gotera por brindarme su amistad y por
compartir conmigo todos esos momentos duros, dándome el apoyo que
necesario para no desfallecer.
vi
-
A udes papi y mami por darme la vida, amor, confianza y apoyarme en todo
momento, los amo.
-
A mi reina pequeña Emily Sofía por regalar el don de ser madre y haber
llegado en el mejor momento de mi vida, para brindarme la sonrisa que día a
día alegre mi vida, eres lo más gran que puedo tener.
- A Mairaly y Aly Javier por ser los mejores hermanos que se puedan tener.
- A mis niños Gilberto y Gilary por llenarme de alegría, ternura y amor, su tía
linda los ama.
- A mi suegra por se otra madre para mi, apoyándome en esta meta trazada.
-
A mis amigos los MgSc. Yenddy, Alegría, Ricardo y al futuro MgSc. Jhon por
su amistad incondicional y por su ayuda en lo momentos necesarios.
- A todos mis compañeros de clases por su cariño y amistad.
-
A los Dres. Betulio Chacín, Dagoberto Bermúdez y Francisco Arocha, por la
colaboración prestada para la toma de los muestras.
- Al personal del Hospital General del Sur, Policlínica Maracaibo, Falcón y a los
pacientes por permitir la toma de las muestras para la realización de este
proyecto.
-
A FONACIT por depositar su confianza en mi, por otórgame la beca para la
realización de mis estudios.
-
Al CONDES por el financiamiento de este proyecto.
vii
INDICE DE CONTENIDO
pág.
PRESENTACION………………………………………………………………….... i
FRONTISPICIO……………………………………………………………………... ii
VEREDICTO…………………………………………………………………………
iii
DEDICATORIA………………………………………………………………………
iv
AGRADECIMIENTOS………………………………………………………………
v
INDICE DE CONTENIDO…………………………………………………………..
vii
INDICE DE FIGURAS………………………..……………………………………..
ix
INDICE DE TABLAS………………………………………………………………..
xi
RESUMEN…………………………………………………………………………… xii
ABSTRAC……………………………………………………………………………. xiii
ABREVIATURAS……………………………………………………………………. xiv
I. INTRODUCCION……………………………………………………………… 1
II. OBJETIVOS…………………………………………………………………... 6
III. MATERIALES Y METODOS……………………………………………….. 7
Población estudiada ………………………………………………………………
7
Toma de Muestra……………………………………………………………………
7
Recolección de las muestras………………………………………………………
7
Aislamiento e Identificación del virus por Inmunofluorescencia………………..
9
Cultivo e Infección de Monocitos………………………………………………….. 10
Determinación de proteínas………………………………………………………..
11
Cuantificación de IL-4, IL-5, IL-1β, IL-8, TNF-α en muestra de suero,
sobrenandantes de cultivo de monocitos infectados y en células Hep-2……..
11
viii
Cuantificación de IgE sérica……………………………………………………….. 12
Cuantificación de IgG anti-VSR por el método de Inmunofluorescencia
Indirecta………………………………………………………………………………
12
Análisis Estadístico………………………………………………………………….
13
IV. RESULTADOS………………………………………………………………. 14
Estudios séricos.………………………………………………………….
14
Estudios en cultivos …..………………………………………………….
23
V. DISCUSIÓN…………………………………………………………………... 27
VI. CONCLUSIONES……………………………………………………………
32
BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………...
33
ANEXOS……………………………………………………………………………... 40
ix
INDICE DE FIGURAS
pág.
Fig. 1.- Distribución de la población estudiada con infección respiratoria
aguda (IRA) por Virus Sincicial Respiratorio.
14
Fig. 2.- Concentraciones séricas de IL-4 en pacientes con infección
respiratoria aguda por VSR.
14
Fig. 3.- Concentraciones séricas de IL-4 en pacientes con Infección
Respiratoria Aguda por Virus Sincicial Respiratorio clasificados de acuerdo a
la severidad de la enfermedad.
15
Fig. 4.- Concentraciones séricas de IL-5 en pacientes con infección
respiratoria aguda por VSR.
16
Fig. 5.- Concentraciones séricas de IL-5 en pacientes con Infección
Respiratoria Aguda por Virus Sincicial Respiratorio clasificados de acuerdo a
la severidad de la enfermedad
16
Fig. 6.- Concentraciones séricas de IL-1 β en pacientes con infección
respiratoria aguda por VSR.
17
Fig. 7.- Concentraciones séricas de IL-1β en pacientes con Infección
Respiratoria Aguda por Virus Sincicial Respiratorio clasificados de acuerdo a
la severidad de la enfermedad"
18
Fig. 8.- Concentraciones séricas de IL-8 en pacientes con infección
respiratoria aguda por VSR.
18
Fig. 9.- Concentraciones séricas de IL-8 en pacientes con Infección
Respiratoria Aguda por Virus Sincicial Respiratorio clasificados de acuerdo a
la severidad de la enfermedad.
19
x
19
Fig.10.- Concentraciones séricas de TNF-α en pacientes con infección
respiratoria aguda por VSR.
Fig.11.- Concentraciones séricas de TNF-α en pacientes con Infección
Respiratoria Aguda por Virus Sincicial Respiratorio clasificados de acuerdo a
la severidad de la enfermedad.
20
Fig.12.- Concentraciones séricas IgE en pacientes con infección respiratoria
aguda por VSR.
21
Fig.13.- Concentraciones séricas de IgE en pacientes con Infección
Respiratoria Aguda por Virus Sincicial Respiratorio clasificados de acuerdo a
la severidad de la enfermedad.
21
Fig.14.- Relación de IL-5 y eosinofilia en sérica de pacientes con infección
respiratoria aguda por VSR.
23
Fig.15.- Concentraciones de IL-4 en sobrenadantes de cultivo de monocitos
humanos y HEp-2 infectados con VSR.
24
Fig.16.- Concentraciones de IL-5 en sobrenadantes de cultivo de monocitos
humanos y HEp-2 infectados con VSR.
24
Fig.17.- Concentraciones de IL-1β en sobrenadantes de cultivo de
monocitos humanos y HEp-2 infectados con VSR.
25
Fig.18.- Concentraciones de IL-8 en sobrenadantes de cultivo de monocitos
humanos y HEp-2 infectados con VSR.
26
Fig.19.- Concentraciones de TNF-α en sobrenadantes de cultivo de
monocitos humanos y HEp-2 infectados con VSR.
26
xi
INDICE DE TABLA
Tabla I.- Niveles séricos de citocinas y los grupos de estudio con infección 22
respiratoria aguda.
xii
Mavárez Montes, Alibeth Rossanna. “IL-4, IL-5, IL-1β, IL-8, TNF-α EN PACIENTES
CON INFECCION AGUDA POR VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO” Trabajo
presentado para optar al grado de Magister Scientarum en Biología, Mención
Inmunología Básica. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias.
División de Estudios para Graduados. Maestría en Biología, Mención Inmunología
Básica. Maracaibo. Estado Zulia, Venezuela. 2008. 40p.
RESUMEN
El virus sincicial respiratorio (VSR) es el principal patógeno en niños y la primera
causa de enfermedad en lactantes. Dada la importancia de la participación de la
inmunidad celular en la limitación de la enfermedad por VSR, se sugiere que es
probable que la reducción de células TH1 y TH2 juega un papel importante en la
susceptibilidad a bronquiolitis por VSR. Se planteó como objetivo determinar las
concentraciones de IL-4, IL-5, IL-1β, IL-8 y TNF-α en pacientes con infección aguda
por VSR, y el papel que pueden desempeñar estos factores solubles, así como la
IgE total, IgG anti-VSR y la eosinofilia en la severidad de la enfermedad. Se
seleccionaron 35 pacientes sin distingo de edad y sexo con diagnóstico clínico de
infección respiratoria aguda (IRA) alta o baja. Se recolectaron muestras del tracto
respiratorio, sangre con o sin anticoagulante de los pacientes y de 10 individuos
sanos como grupo control. Se utilizó cultivo de células Hep-2 para el aislamiento e
identificación del VSR por la técnica de Inmunofluorescencia Directa. La
determinación de citocinas se realizó por la técnica de ELISA, tanto en suero, cultivo
de monocitos y en células HEp-2 a las 24 horas pi. En los niveles séricos se
evidenció un aumento marcado (p<0,05) de todos estos factores solubles en los
pacientes con infección por VSR al compararlo con el grupo control, pero solo
resulto diferente (p<0,05) a los pacientes negativos al virus en la determinación de
IL-1β, IL-8 e IgE. Según el grado de severidad de la enfermedad se observó un
aumento (p<0,01) en los pacientes infectados por VSR grado moderado y severo
con respecto al control y a los no infectados por VSR, sugiriendo una respuesta
inmunitaria mas grave debido al proceso inflamatorio generado, mientras que en los
cultivos HEp-2 solo se incremento la IL-4. En los cultivos de monocitos no se
observaron diferencias en cuanto a las citocinas ensayadas y la presencia del virus.
Estos resultados sugieren una acción relevante de IL-8 e IgE implicada en la
patogénesis por VSR y así como un aumento importante la citocinas IL-4, IL-5
relacionada a la infección grave causada por este virus.
Palabras Claves: VSR, IRA, TH2, citocinas proinflamatorias
Correo Electrónico: alibethrmavarezm@hotmail.com
xiii
Mavárez Montes, Alibeth Rossanna. “IL-4, IL5, IL-1β, IL-8, TNF-α IN PATIENTS
WITH ACUTE INFECTION BY RESPIRATORY SINCYTIAL VIRUS” Trabajo
presentado para optar al grado de Magister Scientarum en Biología, Mención
Inmunología Básica. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias.
División de Estudios para Graduados. Maestría en Biología, Mención Inmunología
Básica. Maracaibo. Estado Zulia, Venezuela. 2008. 40p.
ABSTRACT
The respiratory sincytial virus (RSV) is the main pathogen in children and the
first cause of inferior respiratory tract disease in infants since, cellular immunity
plays an important role in the resolution of RSV disease, probability decrease
of TH1 and TH2 cells. Could be important in the susceptibility to VSR
broncholitis. Therefore, the aim of this study was to determine the serum
content of IL-4, IL-5, IL-1β, IL-8, and TNF-α IgE, anti-RSV IgG and eosinophlia
in patients with acute infection and to stablish the relation of those parameters
with the severity of the disease. Thirty five patients with high or low acute
respiratory infection of any age and sex were selected. Ten normal individuals
were used as control. Samples from respiratory tract and blood (with and
without anticoagulants) were obtained. HEp-2 cell cultures were used to
isolated and identified RSV. Identification was performed by direct
imnunofluorescence. Cytokines were determined in 24 hours post infection
monocyte and HEp-2 and serum ELISA. Increased content of serum factors
were increased (p<0.05) in RSV infected patients when compared to control,
however, only IL-1β and IL-8. And IgG were significantly increased (p<0,05)
when compared to acute infection patients without RSV infection. Mild and
severe forms of RSV infection show higher value (p<0.01) when compared to
control and acute infection was observed in patients whithour RSV infection,
suggesting higher immune response related with the severity of the disease.
Only increased content of IL-4 was observed in HEp-2 cultures. There were
not significant differences in monocyte cultures related to cytokine and virus
content. These results suggest an important role of IL-4, IL.5, IL-8 and IgG in
the respiratory infection by RSV.
Key Words: RSV, IRA, TH2, proinflammatory cytokines
E-MAIL: alibethrmavarezm@hotmail.com
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS
CMN: Células mononucleares
ELISA: Ensayo de Inmunoabsorción Enzimática
IRA: Infección Respiratória
IL-: Interleucina
IFD: Inmunofluorescencia Directa
IFI: Inmunofluorescencia Indirecta
IFN: Interferón
GM-CSF: Factor estimulador de colonia granulocítico-macrofágico
LBA: Lavado Bronqueoalveolar
PI: Post infección
TNF: Factor de Necrosis Tumoral
TMB: Tetrametilbencidina
VSR: Vírus Sincicial Respiratório
INTRODUCIÓN
Las infecciones respiratorias agudas (IRA) son enfermedades con evolución
menor a 15 días, siendo la más grave de ellas, la neumonía. Las IRA constituyen un
importante problema de salud pública y entre los agentes etiológicos involucrados
principalmente se encuentran los virus, causando morbilidad a cualquier edad; no
obstante, los casos más severos se presentan en lactantes y en la población mayor
de 60 años y los virus implicados son el Virus Sincicial Respiratorio (VSR),
Parainfluenza y Adenovirus (Rosete y col., 2002; Aristizábal, 2008).
En Venezuela, las IRA representan un problema de salud pública relevante y son
consideradas la principal causa de morbimortalidad en niños menores de 5 años.
Según el Ministerio del Poder Popular para la Salud, ocupa la primera causa entre
las enfermedades de denuncia obligatoria y es uno de los principales motivos de
consulta en atención primaria en salud (Boletín Epidemiológico, 2006)
El VSR, pertenece a la familia Paramixoviridae y al género pneumovirus (Fenner,
1976). Éste presenta un tamaño de 80nm-120nm siendo más pequeño que el resto
de los paramixovirus. Su nucleocápside
mide de 11-15 nm. Su ARN es
monocatenario, no segmentado y codifica para 10 proteínas (Cane y col., 1995).
Presenta dos subtipos serológicos (A y B) y 2 glicoproteínas de superficie, la G
(mediadora de la adherencia del virus a la superficie respiratoria) que estimula una
respuesta inmunitaria tipo TH2 y la F (funde las membranas del virus a la célula
huésped) y estimula una respuesta tipo TH1 (Tristam y col., 1999, Melnick., 1999;
Sullender, 2000; Picazo, 2002; Lemanske, 2003).
La población en riesgo de padecer la infección por VSR son los niños que se
encuentran en guarderías, hacinamiento y en mayor frecuencia cuando son
prematuros, o presentan cardiopatía congénita, hipertensión pulmonar, displasia
broncopulmonar,
neuropatía
crónica,
fibrosis
quística,
inmunodeficiencia
y
enfermedad metabólica o neurológica (Doménech, 2004).
La transmisión del VSR se da fácilmente a través del contacto de persona a
persona, por medio de la dispersión de partículas o gotitas al toser, estornudar o
hablar, por contacto con el material infeccioso depositado en ropa de cama, cunas y
manos contaminadas, ocasionando autoinfecciones vía nasal u ocular. El período de
incubación es aproximadamente de 3 a 6 días, la excreción del virus puede durar 2
semanas o más en niños y menos tiempo en adultos (Boletín Epidemiológico del
Ministerio de Salud de Nicaragua; Mandell y col., 1999).
Al inicio de la enfermedad el virus se replica en nasofaringe, alcanzando títulos
VSR altos como 1x106 DI/ml en cultivo de tejidos de secreción nasal. La adherencia
del virus a las células del tracto respiratorio superior se produce por la unión de la
glicoproteína G con el receptor de la célula huésped, probablemente un
glucosaminoglicano tipo heparina, seguido de la fusión de la envoltura viral con la
membrana celular (mediada por la glicoproteína F) y de la penetración de la
nucleocapside en el citoplasma (Falsey y Walsh., 2000).
En condiciones normales, las dos ramas de la inmunidad mantienen un perfecto
equilibrio. Existe un balance entre la inmunidad innata, que se caracteriza por su
respuesta inmediata en reconocer y eliminar al agente extraño mediante una serie
de mediadores no específicos, y la adaptativa caracterizada porque además del
reconocimiento inmunitario y eliminación efectiva del patógeno, induce la formación
de células específicas de memoria. La respuesta inflamatoria a la infección por VSR
se inicia probablemente en las células del epitelio respiratorio. Estas células
producen una serie de citocinas y quimiocinas en respuesta a las infecciones virales
(Welliver, 2000).
La inmunidad adquirida producida por VSR es parcialmente eficaz, por lo que las
reinfecciones son comunes, sin embargo después de la primera exposición es poco
frecuente la enfermedad grave. La protección y recuperación de la enfermedad son
mediadas principalmente por el sistema inmunitario del huésped. Los anticuerpos
secretorios, los séricos, los linfocitos T citotóxicos dependientes del complejo mayor
de histocompatibilidad clase I, y en los lactantes menores, los anticuerpos maternos,
sirven como efectores específicos (Mandell y col., 2002; Domachowske y
Rosenberg., 1999).
Cuando existe infección por VSR se produce un desequilibrio entre ambas ramas
de la inmunidad: la inmunidad innata a través de la producción de mediadores
proinflamatorios y el reclutamiento de neutrófilos, eosinófilos y monocitos en la vía
respiratoria, y la adaptativa gracias a una respuesta celular excesiva de linfocitos T
CD8+ y producción por parte de los linfocitos T CD4+ de citocinas TH1 y TH2 que
llevan a la producción de inflamación pulmonar, bronquiolitis y sibilancias recurrentes
(Lemanske, 2003; Mejías y col., 2004). Krishnam y col., 2003), realizaron un estudio
donde determinaron que la inmunorespuesta que puede darse en niños, cuando son
infectados por primera vez por VSR, probablemente el virus este contribuye a la
severidad de la enfermedad en tres fases posibles: una inmunorespuesta natural,
una respuesta adaptativa escasa, o una respuesta adaptativa polarizada en la
dirección TH2.
Una vez iniciada la respuesta inmunitaria, los linfocitos T cooperadores son
activados generando una respuesta adaptativa de tipo TH1 o TH2. La producción
temprana de interferón gamma (IFN-γ) es la clave para que se presente una
respuesta predominante TH1, mientras que una baja producción de IFN-γ se asocia
con una respuesta TH2 predominante con eosinofilia pulmonar persistente
(Openshaw, 2002). Algunos estudios muestran que en pacientes con infección por
VSR se produce una activación predominante de linfocitos de tipo TH2 (Roman y
col., 1997).
En esta respuesta participan una serie de citocinas, las cuales son proteínas que
regulan la función de las células que las producen u otros tipos celulares. Son los
agentes responsables de la comunicación intercelular, inducen la activación de
receptores específicos de membrana, funciones de proliferación y diferenciación
celular, quimiotaxis, crecimiento y modulación de la secreción de inmunoglobulinas.
Las personas con bronquiolitis por VSR producen citocinas como la interleucina
(IL-1), factor de necrosis tumoral alpha (TNF-α), IL-6 e IL-8. En respuesta a las
citocinas, se produce una infiltración de células inflamatorias, predominantemente
neutrófilos (Openshaw, 2002), también la IL-4 e IL-5 son secretadas en respuesta a
la infección del virus. La síntesis de IgE por los linfocitos B depende de la IL-4, y
esta se incrementa por la acción de IL-5, IL-6 e IL-13 (Kiniwa y col., 1992; Del Prete
y col., 1998; Punnonen y col., 1993).
La IL-4 e IL-5 juegan un papel relevante en la eosinofilia que acompaña a la
inflamación de las vías aéreas (Clutterbuck y col., 1989 y 1990). Las citocinas
proinflamatorias como la IL-1β, IL-6, IL-11, TNF-α y factor estimulador de colonia
granulocítico-macrofágico (GM-CSF) son liberados por una gran variedad de
células entre las que se encuentran incluidos los macrófagos y células epiteliales y
están implicadas en la amplificación de la respuesta inflamatoria, el TNF-α se haya
implicado especialmente en las reacciones asmáticas (Lorente, 2001).
Por otro lado la infección por VSR activa una serie de quimiocinas como la IL-8
que promueve el reclutamiento de neutrófilos y eosinófilos, responsables en parte
del proceso inflamatorio. Estudios con expectoración de pacientes sugieren un papel
importante de esta quimiocina en las exacerbaciones de asma (Laham y col., 2004;
Gern y col., 2002; Oh y col., 2002), y es producida por células epiteliales de la
mucosa nasal en cultivo, donde promueven la supervivencia de los eosinófilos
(Mullol y col., 1995 y Noah y col., 2000).
En investigaciones sobre la patogénesis de la enfermedad producida por VSR, se
ha demostrado una relación entre polimorfismo de nucleótidos en la secuencia del
gen de la IL-8. Este polimorfismo se asocia a la producción creciente de IL-8, que es
un potente quimioatrayente de neutrófilos, además se ha demostrado que ocurre
con mayor frecuencia en niños con bronquiolitis por VSR, en los cuales se han
encontrado niveles plasmáticos de IL-8 incrementados asociados a enfermedad
severa, y con predominio de neutrófilos (Roche y col., 2003). También
se ha
demostrado que concentraciones de IL-8 y de RANTES en secreciones respiratorias
de infantes con bronquiolitis se correlacionan con el número de leucocitos presentes
en las mismas, indicando que estas quimiocinas pueden ser responsables de la
infiltración del leucocito en la vía aérea durante la infección por VSR (McNamara y
col., 2005; Brandenburg y col., 2001; Hull y col., 2000).
La inmunidad natural producida por este virus ha sido demostrada por el
incremento de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 en lavados nasales de infantes durante la
infección activa (Noah y col., 1995); quizás lo más importante para la clasificación de
éste, sea esclarecer la asociación entre la naturaleza temporal y el grado de
variabilidad de la inmunidad mediada por células (Van Schaik y col., 1999, De Weerd
y col., 1998 así mismo como la desviación o deficiencia de la misma (Brandenburg y
col., 2000, Bendelja y col., 2000), que en la vida temprana es transitoria, todos estas
alternativas se han ofrecido como sugerencias para explicar la variabilidad en la
severidad de la enfermedad (Aberle y col, 1999).
Dada la importancia de la participación de la inmunidad celular en la limitación de
la enfermedad por VSR en la infección temprana (0penshaw y col., 1992), algunos
autores sugieren que es ampliamente probable que la reducción de la células de tipo
TH, tanto TH1 como TH2 durante la infancia, juega un papel importante en la
susceptibilidad a bronquiolitis después de la infección por VSR. Se ha señalado que
el balance en la producción de citocinas/quimiocinas TH1 frente a TH2 podría
relacionarse con la gravedad de la infección (Mejías y col., 2004).
Las células HEp-2 se obtuvo en 1952 a partir (carcinoma laríngeo humano) son
virus-permisivas, corresponde al primer tipo de cultivo, con las que se puede
identificar la presencia del VSR al observar un efecto citopático (ECP) que se origina
en las células infectadas, este ECP es característico del virus y consiste en la
formación de sincicios reconocidos como células gigantes multinucleadas,
(Archundia, 2000).
Algunas investigaciones realizadas en el modelo múrido como en humanos han
evidenciado que la proteína G del VSR estimula la respuesta TH2 (Aberle y col.,
1999), mientras que la proteína F estimula la respuesta TH1 (Van Schaik y col.,
1999) lo que aparentemente explica la variación de los síntomas producidos por
VSR en el trato respiratorio inferior. Sin embargo, ciertos resultados han creado
dudas sobre el patrón de citocinas que el virus estimula; así algunos autores
sugieren que el patrón de citocinas predominante durante la infección por VSR es
TH1, otros que es TH2, o bien que estimula a ambas (Roman y col., 1997; Van
Schaik y col., 1999).
La razón que ha motivado la realización de la presente investigación responde al
hecho de que hasta ahora existen contradicciones relacionadas a la respuesta
inmunitaria inducida por el virus, la caracterización de la respuesta inmunitaria frente
a VSR en los pacientes con IRA, pudiera ser utilizada como marcador diagnóstico en
la severidad de la enfermedad, así como también para el diseño de estrategias de
tratamiento para este tipo de afecciones y aportar evidencias en el mecanismo
inmunopatogénico del VSR cuando se presente las IRA y así fomentar los esfuerzos
para disminuir estas infecciones en nuestro país.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar IL-4, IL-5, IL-1β, IL-8 y TNF-α en pacientes con infección aguda por
Virus Sincicial Respiratorio (VSR).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Aislar e identificar el VSR en cultivos de células HEp-2 a partir muestras del
tracto respiratorio (lavado nasofaríngeo, exudado faríngeo, hisopado nasal, o
lavado bronqueoalveolar) de pacientes con infección respiratoria aguda (IRA).
Determinar la concentración sérica de IgE total e IgG anti VSR en muestras
de pacientes con infección respiratoria y en individuos controles.
Cuantificar citocinas TH2 (IL-4 e IL-5) y proinflamatorias (IL-1β, IL-8 y TNF-α)
en sobrenandantes de cultivo (monocitos normales y en células HEp-2), en
suero de pacientes con IRA y en controles.
Relacionar estos factores con la severidad de las manifestaciones clínicas en
los pacientes, según la clasificación del manual del programa IRA.
Relacionar la IgE con la eosinofília e IL-5 durante la infección por VSR.
MATERIAL Y MÉTODOS
Población estudiada
De un total de 150 pacientes estudiados se seleccionaron 35 pacientes con IRA,
en edades comprendidas de 1 a 77 años (X±DE: 34,41 ± 20,70), sin distingo de
sexo, procedentes de diferentes centros asistenciales de la cuidad de Maracaibo
(Hospital General del Sur, Policlínica Maracaibo, Clínica Falcón e Instituto de
Investigaciones Clínicas “Dr. Américo Negrette”) durante el período comprendido
entre enero 2005 a diciembre 2007.
A cada paciente se le tomó muestra de lavado nasofaríngeo, exudado faríngeo,
hisopado nasal, o lavado bronqueoalveolar, antes de iniciar terapia con fármacos. Al
momento de la toma de la muestra los pacientes seleccionados presentaban
síntomas de infección respiratoria aguda (fiebre, tos, obstrucción nasal, rinorrea y
estornudos) dentro de los primeros siete días de evolución (5,48±2,51días). Como
población control se incluyeron 10 individuos aparentemente sanos en edades
similares a los pacientes (31,20±21,18 años) sin antecedentes de infección
respiratoria,
sin
asma
o
enfermedad
pulmonar
obstructiva,
enfermedad
cardiovascular, ni tabaquismo para el momento de la toma de la muestra, con
resultados negativos a las pruebas virológicas y bacteriológicas.
Se excluyeron del estudio todos aquellos pacientes que estaban recibiendo
tratamiento con antibiótico, esteroide, antileucotrieno o antialérgico, los que
presentaron infecciones respiratorias crónicas y pacientes asmáticas.
Recolección de muestras (Anexo 2)
Las muestras de sangre fueron recolectadas a través de venopunción con previa
asepsia (con alcohol isopropílico al 70%) del pliegue del codo, colocadas en tubos
de ensayos con anticoagulante EDTA para la realización de los frotis sanguíneos
que fueron coloreados con Wrigth-Giemsa (hemograma) contaje diferencial de
células leucocitaria y sin anticoagulante para la obtención del suero, los cuales
fueron almacenados a -70º C, hasta su procesamiento.
Además, se tomaron muestras del trato respiratorio (lavado nasofaríngeo,
exudado faríngeo, hisopado nasal, o lavado bronqueoalveolar), fueron recolectadas
por duplicado, una se colocó un tubo estéril que contenía medio de transporte para
aislamiento viral (solución de Hank´s suplementada con suero fetal bovino, tratada
previamente con antibiótico y antimicótico: 1.000u/ml de penicilina, 500ug/ml de
estreptomicina y 4ug/ml de anfotericina B). Las muestras fueron lisadas en un
sonicador (Modelo Fisher Scientif. Sonic 300) a 30 decibeles. Posteriormente fueron
centrifugadas 300 x g durante 10 min a 4 ºC para obtener sobrenadantes libres de
células y moco. El sobrenadante que se obtuvo se utilizó para el cultivo celular
(Lahiri y col., 1999 y Noda y col., 1999).
La segunda muestra se colocó en un tubo de transporte de Cary & Blair para el
estudio bacteriológico, y para lo cual fueron inoculadas en placas de agar
McConkey, agar sangre de carnero, sangre de carnero con kanamicina y agar GC.
Se incubó por 24-48h a 37ºC en condiciones aerobias, microaerofílicas y anaerobias.
Las especies bacterianas fueron identificadas según técnicas bacteriológicas
convencionales (Finegold y col., 1998).
A cada paciente se le llenó una ficha de recolección de datos diseñada para la
investigación de virus respiratorios (Anexo 1), previo consentimiento por escrito,
tomando en cuenta las Normas del Código de Bioética y Bioseguridad del FONACIT
capítulos 2 y 3 (Briceño y col., 2002) y del Comité de Bioética del Instituto de
Investigaciones Clínicas “Dr. Américo Negrette” de la Facultad de Medicina,
Universidad del Zulia.
Los pacientes con IRA fueron clasificados según grado de severidad de acuerdo a
los criterios del manual del programa IRA (1996).
„ Caso Leve: La presencia de uno o más de los siguientes síntomas o signos:
Secreción nasal, obstrucción nasal, garganta roja, tos y ronquera.
„ Caso Moderado: La presencia de uno o más de los siguientes síntomas o
signos: Dolor y/o secreción de oídos. garganta con puntos o placas de pus,
ganglios palpables y dolorosos en el cuello y frecuencia respiratoria de 50 a
70 por minuto.
„ Caso Grave: La presencia de uno o más de los siguientes síntomas o signos:
Aleteo nasal, retracción (tiraje) intercostal y/o subesternal, quejido respiratorio.
estridor, cianosis, y frecuencia respiratoria mayor de 70 por minuto.
Aislamiento viral e identificación por inmunofluorescencia directa en cultivo de
células HEp-2.
Se seleccionaron las células HEp-2 en este estudio para el aislamiento,
replicación e identificación del virus. Se
inocularon por duplicado 200μL de
sobrenadante de las muestras, obtenidos después de la sonicación, en cultivos de
células HEp-2 (Línea celular de carcinoma laríngeo humano) provenientes del
Instituto Nacional de Higiene (INH) protocolo -520-I. Luego se colocaron a 37°C en
atmósfera de 5% de CO2 en platos cultivo de 24 pozos. Se incubaron por 1 hora a
37ºC y 5% de CO2 para la adherencia viral. Posteriormente se adicionaron 300μL de
medio de cultivo MEM (minimum esscential medium) suplementado con 10% de
suero fetal bovino y con antibiótico-antimicótico a concentraciones descritas. Se
colocaron a 37°C en atmósfera de 5% de CO2. Cuando la formación de células
gigantes multinucleadas o sincicios fue evidente (96-120 horas), se retiró el
sobrenadante del cultivo y se tomaron las células para la identificación viral y el
duplicado se guardó a –70 ºC para pases sucesivos. Se utilizaron controles en cada
placa, uno positivo (cepa de VSR conocida) y el negativo que sólo contenía medio
de cultivo, para la comparación de los cambios morfológicos.
La
detección
e
identificación
del
VSR
se
hizo
por
la
técnica
de
inmunofluorescencia directa (IFD). Simultáneamente se investigó la presencia de
otros virus respiratorios como Adenovirus, Parainfluenza tipo 1, 2 y 3, e Influenza A y
B, utilizando un anticuerpo monoclonal especifico marcado (Light DiagnosticsTM
SimulFluor® Respiratory Screen Kit, Chemicon Internacional Temecula. CA, USA).
Este kit contiene dos componentes los cuales se unieron al antígeno vírico
apropiado en la muestra. El componente primario conjugado con fluoresceína se
unió a las células infectadas por Adenovirus, Influenza A, Influenza B y
Parainfluenza 1, 2 y 3 mostrando una fluorescencia color verde manzana brillante y
el secundario conjugado con rodamina, se unió al VSR, coloreando las células
amarillo oro, permitiendo la discriminación del VSR de otros virus respiratorios. Las
células no infectadas se observaron de color rojo pálido debido a la presencia del
colorante azul de Evans como contraste. El VSR mostró un patrón de positividad
amarillo oro en el citoplasma de la célula, y se observaron los sincicios,
característico de este virus. Para el resto de los virus se observó fluorescencia color
verde manzana citoplasmática, nuclear o ambas localizaciones. Se determinó una
reacción de tinción positiva para cualquiera de los siete virus por la presencia de al
menos 2 células intactas que presentaron fluorescencia específica. Un resultado
negativo estuvo indicado por la ausencia de fluorescencia en un muestreo mínimo
de 20 células epiteliales. Se utilizó para la visualización de las células fluorescentes
un microscopio invertido con fluorescencia (Zeiss modelo 872E, Alemania).
Cultivo e infección de monocitos.
Se realizaron cultivos de células mononucleares (CMN) para evaluar la respuesta
inmunitaria frente a una infección producida por VSR, debido a que los monocitos
humanos cuando son infectados por virus se activan, producen y liberan una serie
de citocinas como IL-1β y TNF-α en lavados nasales (Corne, 1997).
Las células mononuclares (CMN) se aislaron de sangre heparinizada de 5
voluntarios sanos, por centrifugación en gradiente de densidad sobre histopaque
1077 (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO) (Boyum., 1968). Se verificó la viabilidad
celular con la coloración supravital de azul tripán y se ajustó la concentración a
2x106 cel/ml. Las CMN se resuspendieron en medio RPMI 1640, suplementado con
10% de suero fetal bovino y con antibiótico-antimicótico a las concentraciones
anteriormente descritas. Las muestras de suspensión celular se sembraron en platos
de cultivo de veinticuatro pozos de fondo plano con un diámetro de 16 mm y se
incubaron por 3 horas a 37°C en atmósfera de 5% de CO2, para permitir la
adherencia de los monocitos al fondo de la placa.
Las células no adherentes fueron removidas por lavados con medio de cultivo. Se
estimó una población de monocitos de aproximadamente 3x105 cel/pozo, las cuales
fueron infectados con 4x104 UFP/ml de VSR aislados en células HEp-2 (Arnold.,
2005). Esta fue calculada para producir una multiplicidad de infección de 1 (MOI: 1),
asumiendo que todas las células del cultivo podrían ser blanco para el VSR. Los
monocitos control se cultivaron con sobrenadantes de células HEp-2 de los
individuos controles. Utilizando la técnica de IFD descrita anteriormente se confirmó
la infección viral de los monocitos. En los sobrenadantes de estos cultivos se
determinaron las concentraciones de IL-4, IL-5, IL-1β, IL-8 y TNF-α a las 24 horas
post infección (pi). Los estudios en cultivos celulares fueron realizados por triplicado.
Determinación de Proteínas.
La determinación de las proteínas se realizó basada en el método de Bradford
(Bio-Rad Protein Assay). Las proteínas fueron medidas en los monocitos y en las
células HEp-2 que quedaron adheridos en el fondo de la placa, los cuales fueron
sometidos a un proceso de sonicación. El cálculo de la concentración se determinó a
través de una curva de regresión lineal de densidad óptica vs. concentración que se
obtuvo con estándares de concentraciones conocidas y que se incluyeron
simultáneamente al procesamiento de las muestras. Los resultados se leyeron a 595
nm fueron expresados en mg.
Cuantificación de IL-4, IL-5, IL-1β, IL-8 y TNF-α en muestra de suero y en
sobrenandantes de cultivo de monocitos y en células HEp-2.
Los niveles de IL-4, IL-5, IL-1β, IL-8, TNF-α se determinaron en forma cuantitativa
a través de la técnica de ELISA de fase sólida de alta sensibilidad y especificidad,
proporcionada por diferentes casas comerciales: IL-4, IL-5 y TNF-α (DIACLONE,
Francia, Fleming), IL-1β (ALPCO Diagnostics, New York, USA) e IL-8 (R & D
Systems, Miniapolis, MN, USA).
La técnica consistió en un ensayo cuantitativo de ELISA tipo sandwich, en la cual
se hizo reaccionar la muestra con un anticuerpo monoclonal de captura específico
para la citocina fijado a una fase sólida, sobre la cual se adicionó un anticuerpo
monoclonal secundario biotinilado contra al antígeno. Luego de un periodo de
incubación y posterior a una fase de lavado, se le agregó un complejo streptavidinaperoxidasa que se unió al anticuerpo biotinilado. Posterior al periodo de incubación y
lavado, se agregó el sustrato de tetrametilbencidina (TMB). La reacción enzimasustrato se evidenció por el desarrollo de un color cuya intensidad fue directamente
proporcional a la concentración de la citocina presente en la muestra. El cálculo de
la concentración se determinó a través de una curva de regresión lineal de densidad
óptica vs. concentración que se obtuvo con estándares de concentraciones
conocidas y que se incluyeron simultaneo al procesamiento de las muestras. Los
resultados se leyeron a 450 nm y fueron expresados en pg/ml para suero y pg de
citocina/mg de proteína en los cultivos de monocitos y células HEp-2.
Cuantificación de IgE sérica.
El método empleado es un ELISA tipo sandwich (CALBIOTECH INC. CBI. Spring
Valley, C.A), donde las muestras de suero fueron colocadas en pozos recubiertos
con un anticuerpo de captura (anti-IgE). La IgE presente en el suero de los pacientes
queda adherida a este anticuerpo. Luego de la incubación a 37ºC, se lavaron, y se
añadió el conjugado Anti-IgE HRP. Luego se adicionó el substrato, desarrollándose
un color cuya intensidad es proporcional a la concentración de IgE en las muestras.
Éstas fueron leídas a 450nm. Por medio de una curva estándar se obtuvo la
concentración de IgE en UI/ml.
Determinación de IgG anti-VSR por el método de inmunofluorescencia
indirecta.
Está basada en la reacción de los anticuerpos IgG anti-VSR presentes en la
muestra que se unen al antígeno que se encuentra en la superficie del portaobjetos,
las inmunoglobulinas no unidas son eliminadas en el proceso de lavado. Luego el
complejo antígeno-anticuerpo es revelado mediante una anti-IgG humana marcada
con isotiocianato de fluoresceína. La reacción positiva se evidenció mediante un
color verde manzana nuclear y citoplasmático de un 20-25% de las células, mientras
que en una reacción negativa las células se observaron de color rojo (Pneumoslide
IgG, VIRCELL, SL, Granada, España).
Análisis Estadístico.
Los datos obtenidos fueron ordenados y analizados mediante el programa Graph
Pad Prism 5.0 (San Diego, CA. USA). Todas las determinaciones estadísticas fueron
realizadas por análisis de varianza (ANOVA) y utilizando como post-test la prueba de
Bonferroni. El límite de significancia fue p<0,05. Para establecer la asociación de
variables se utilizó el test de correlación de Pearson y el Ji cuadrado. Los resultados
son presentados como media ± desviación estándar.
RESULTADOS
De los 35 pacientes con infección respiratoria aguda, 15 (42,85%) presentaron
positividad
para VSR: 5 (33,33%) presentaron infección leve, 3 (20%) infección
moderada y 7 (46,66%) infección grave; 20 pacientes (57,14%) resultaron negativos
para la infección por VSR pero positivos para otros agentes infecciosos: 6 (30%) con
infección leve, 4 (20%) moderada y 10 (50%) grave (Fig 1).
Leve
Moderado
Grave
VSR-
VSR+
0
5
10
15
20
25
nº de casos
Figura 1. Distribución de la población estudiada con
infección respiratoria aguda (IRA) por Virus Sincicial
Respiratorio (n=15) y sin infección por VSR (n=20)
clasificados según el grado de severidad de IRA.
Estudios séricos.
Al analizar las concentraciones séricas de IL-4 se encontró que éstas fueron
similares entre los pacientes con infección por VSR (13,82±2,732 pg/ml) o ausencia
del virus (12,32 ±1,478pg/ml), pero incrementadas (p<0,01) con respecto a la
población control (9,463±1,392pg/ml) (Fig 2).
IL
-4(p
g
/m
l)
20
*
15
*
10
5
0
Control
VSR+
VSR-
Figura 2. Concentraciones séricas de IL-4 en pacientes con
infección respiratoria aguda por VSR (n=15), y negativos al
virus
(n=20). Las concentraciones fueron determinadas
por ELISA. Los datos representan el X±DE y analizados con
ANOVA + post test de Bonferroni. *p<0,01 con respecto al
control (n=10).
Las concentraciones de IL-4 según el grado de severidad, arrojaron diferencias
significativas (p<0,01) entre los grupos de pacientes VSR- con infección leve
(12,58±0,2467pg/ml) y grave (12,98±1,448 pg/ml) con respecto al grupo control
(9,463±1,392 pg/ml); mientras que en los pacientes VSR+ con infección grave
(16,07±2,409 pg/ml) este incremento fue muy marcado (p<0,001) con respecto a los
grupos VSR+ con infección leve (11,81±0,7809pg/ml) e infección moderada (11,93±
0,6123pg/ml), VSR- y el control (Fig 3).
*
**
IL-4(pg/m
l)
20
15
*
10
*
Control
Leve
Moderada
Grave
5
0
VSR+
VSR-
Figura 3. Concentraciones séricas de IL-4 en pacientes
con Infección Respiratoria Aguda por Virus Sincicial
Respiratorio clasificados de acuerdo a la severidad de la
enfermedad: VSR+ con infección leve (n=5), moderada
(n=3) y grave (n=7) y VSR- leve (n=6), moderada (n=4),
grave
(n=10)
y
un
grupo
control
(n=10).
Las
concentraciones fueron determinadas por ELISA. Los
datos representan el X±DE y analizados con ANOVA +
post test de Bonferroni. *p<0,01 con respecto al grupo
control, **p<0,001 con respecto a los grupos VSR+ con
infección leve y moderada y VSR- con infección grave.
En relación a las concentraciones séricas de IL-5 se observó una elevación
significativa (p<0,001) entre los pacientes que se en encontraban o no infectados por
VSR (74,41±31,23 pg/ml y 61,59±7,273 pg/ml) con respecto al control (31,88±10,46
pg/ml) (Fig 4). No se observaron cambios importantes con respecto al tipo de
infección (VSR+ vs VSR-).
IL-5(pg/ml)
150
*
100
*
50
0
Control
VSR+
VSR-
Figura 4. Concentraciones séricas de IL-5 en pacientes con
infección respiratoria aguda por VSR (n=15), negativos al virus
(n=20) y controles (n=10). Las concentraciones fueron
determinadas por ELISA. Los datos representan el X±DE y
analizados con ANOVA + post test de Bonferroni. *p<0,01 con
respecto al control .
Al hacer la clasificación de las concentraciones séricas de IL-5 según el grado de
severidad se encontraron elevadas (p<0,05) en aquellos pacientes con infección por
VSR en los distintos grados de severidad de la enfermedad: leve (76,25± 38,25
pg/ml); moderado: (74,99±34,73 pg/ml) y grave (72,85± 29,880
pg/ml) y los no
infectados por VSR de manera grave (66,94±3,817 pg/ml) con respecto al grupo
control, es decir los niveles de IL-5 fueron similares en todos los grados de severidad
(Fig 5).
IL-5 (pg/m l)
150
100
* *
*
*
50
0
VSRVSR+
Figura 5. Concentraciones séricas de IL-5 en pacientes con
infección respiratoria aguda por Virus Sincicial
Respiratorio clasificados de acuerdo a la severidad de la
enfermedad: VSR+ con infección leve (n=5), moderada
(n=3) y grave (n=7) y VSR- leve (n=6), moderada (n=4),
grave (n=10) y un grupo control (n=10). Las
concentraciones fueron determinadas por ELISA. Los
datos representan el X±DS y analizados con ANOVA + post
test de Bonferroni. *p<0,05 con respecto al grupo control.
Control
Leve
Moderada
Grave
En cuanto a las concentraciones séricas de IL-1β, estas estuvieron incrementadas
(p<0,001) en los pacientes con infección por VSR (19,89±3,545 pg/ml) y los VSR(15,95±3,450pg/ml) con respecto al grupo control (9,514±7141 pg/ml), a su vez en
los VSR+ resultaron mayores a los que no estaban infectados por este virus (Fig 6).
IL-1β(pg/m
l)
25
*
**
20
*
15
10
5
0
Control
VSR+
VSR-
Figura 6. Concentraciones séricas IL-1 β en pacientes con
infección respiratoria aguda por VSR (n=15), y negativos al
virus
(n=20) y controles (n=10). Las concentraciones
fueron determinadas por ELISA. Los datos representan el
X±DE y analizados con ANOVA + post test de Bonferroni.
*p<0,001 con respecto al control. **p<0,01 con respecto a
los pacientes sin infección por VSR.
Al relacionar la IL-1β con el grado de severidad se encontró elevación de las
concentraciones (p<0,05) en el grupo VSR- grave (21,25±3,219 pg/ml) con respecto
a VSR- leve (12,94±1,387), mientras que en los pacientes con infección por VSR no
se evidenciaron cambios en los niveles de IL-1β relacionados a la severidad de la
infección (Fig 7).
IL -1 β (p g /m l)
30
20
*
*
*
*
**
*
*
Control
Leve
Moderado
Grave
10
0
VSR+
VSR-
Figura 7. Concentraciones séricas de IL-1β en pacientes con Infección
Respiratoria Aguda por Virus Sincicial Respiratorio clasificados de acuerdo
a la severidad de la enfermedad: VSR+ con infección leve (n=5), moderada
(n=3) y severa (n=7) y VSR- leve (n=6), moderada (n=4) severa (n=10) y un
grupo contrl (n=10). Las concentraciones fueron determinadas por ELISA.
Los datos representan el X±DS y analizados con ANOVA + post test de
Bonferroni. *p<0,05 con respecto al grupo control. **p<0,05 con respecto
al grupo VSR- con infección leve.
Con respecto a las concentraciones de IL-8 en el suero de pacientes con IRA se
observó un aumento marcado (p<0,01) entre el grupo con infección por VSR
(114,1±90,93 pg/ml) al compararlo con el control (29,55±5,808 pg/ml) y el negativo
al virus (33,40±20,26 pg/ml) (Fig 8).
250
*
IL-8(pg/m
l)
200
150
100
50
0
Control
VSR+
VSR-
Figura 8. Concentraciones séricas IL-8 en pacientes con
infección respiratoria aguda por VSR (n=15), y negativos al
virus
(n=20)
y
un
grupo
control
(n=10).
Las
concentraciones fueron determinadas por ELISA. Los datos
representan el X±DE y analizados con ANOVA + post test
de Bonferroni. *p<0,01 con respecto al control y a VSR-.
Así mismo, al observar las concentraciones de IL-8 en suero de pacientes con IRA
producidas por VSR según el grado de severidad, se evidenció elevación (p<0,001)
en el
grupo de infección grave (195,1±62,84 pg/ml) con respecto al control
(29,55±5,808 pg/ml), VSR+leve (61,65±5,183 pg/ml); VSR+moderado (112,5±1,614
pg/ml) y VSR- grave (49,321±16,09 pg/ml). Mientras que el grupo con infección por
VSR moderada arrojó valores incrementados (p<0,01) con respecto al grupo control
y VSR-moderada (24,98 ±1,769 pg/ml), es decir que los niveles de IL-8 se asocian
directamente al grado de severidad de las IRA producidas por VSR (Fig 9).
300
Control
Leve
Moderada
Grave
IL-8 (pg/ml)
*
200
**
100
0
VSR+
VSR-
Figura 9. Concentraciones séricas de IL-8 en pacientes con infección
respiratoria aguda por Virus Sincicial Respiratorio clasificados de acuerdo a
la severidad de la enfermedad: VSR con infección leve (n=5), moderada
(n=3) y grave (n=7) y VSR-leve (n=6), moderada (n=4) y grave (n=10). Las
concentraciones fueron determinadas por ELISA. Los datos representan el
X±DE y analizados con ANOVA + Bonferroni. *p<0,001 con respecto al grupo
control, infección por VSR leve, moderada y sin VSR grave. **p<0,01
con
respecto al grupo control y sin infección por VSR moderada.
Al analizar las concentraciones de TNF-α en suero de pacientes con IRA de
acuerdo al tipo de infección se evidenciaron niveles elevados (p<0,001) en los
grupos VSR+ (80,80±27,54 pg/ml) y VSR- (94,31±20,92 pg/ml) con respecto al grupo
control (26,26±3,009 pg/ml), no así entre ellos (Fig 10).
TNF-α (pg/ml)
150
100
*
*
VSR+
VSR-
50
0
Control
Figura 10. Concentraciones séricas de TNF-α en pacientes con
infección respiratoria aguda por VSR (n=15), y negativos al virus
(n=20) y un grupo control (n=10). Las concentraciones fueron
determinadas por ELISA. Los datos representan el X±DE y
analizados con ANOVA + post test de Bonferroni. *p<0,01 con
respecto al control.
En cuanto a las concentraciones de TNF-α obtenidas en el suero de pacientes con
infección por VSR (leve: 54,21±17,66 pg/ml; moderado: 67,04±2,47 pg/ml y grave:
105,7±12,36 pg/ml) y entre los pacientes que resultaron negativos a la infección viral
en todos los grados
de severidad (leve: 85,55±26,93 pg/ml, moderado:
98,50±19,47pg/ml y grave: 99,12±20,52 pg/ml) se observó una elevación (p<0,001)
al ser comparados con el grupo control (26,26±3,00 pg/ml). Los pacientes infectados
por VSR grave presentaron un aumento (p<0,001) de sus niveles con respecto a los
grados inferiores de la enfermedad, es decir existe relación entre los niveles de
TNF-α con el grado de severidad en la infección por VSR (Fig 11).
T N F - α ( p g /m l)
150
*
**
100
*
*
*
*
*
Control
Leve
Moderada
Grave
50
0
VSR+
VSR-
Figura 11. Concentraciones séricas de TNF-α en pacientes con infección
respiratoria aguda por Virus Sincicial Respiratorio clasificados de acuerdo a
la severidad de la enfermedad: VSR+ con infección leve (n=5), moderada
(n=3) y grave (n=7) y VSR- leve (n=6), moderada (n=4) y grave (n=10). Las
concentraciones fueron determinadas por ELISA. Los datos representan el
X±DS y analizados con ANOVA + Bonferroni. *p<0,05 con respecto al grupo
control y una **p<0,05 con respecto al grupo con infección por VSR leve y
moderada.
En cuanto a las concentraciones de IgE sérica se evidenció un incremento
significativo (p<0,05) en los pacientes con infección respiratoria por VSR
(61,05±31,27Ul/ml) con respecto al resto de los grupos: control (18,49± 5,513 Ul/ml)
y VSR- (26,24±15,42 Ul/ml) (Fig 12).
100
*
Ig
EU
L
/m
l
80
60
40
20
0
Control
VSR+
VSR-
Figura 12. Concentraciones séricas IgE en pacientes con
infección respiratoria aguda por VSR (n=15), y negativos al
virus
(n=20)
y
un
grupo
control
(n=10).
Las
concentraciones fueron determinadas por
ELISA. Los
datos representan el X±DE y analizados con ANOVA +post
test de Bonferroni. *p<0,01 con respecto al control y sin
infección por VSR.
Al comparar equivalentes en individuos con infección fue evidente el incremento
(p<0,01) de las concentraciones séricas de IgE en las infecciones moderadas
(76,92±3,536 Ul/ml) y graves (79,89±17,47 Ul/ml) con respecto al control (18,49±
5,513 Ul/ml) y a las obtenidas en los pacientes VSR- moderada (25,39±9,898 Ul/ml)
y VSR- grave (21,41±8,555 Ul /ml). La producción sérica de IgE se asoció a una
mayor severidad de la infección por VSR (Fig 13).
150
*
100
I g E ( U l / m l)
Control
Leve
Moderada
Grave
**
50
0
VSR+
VSR-
Figura 13. Concentraciones séricas de IgE en pacientes con infección
respiratoria aguda por Virus Sincicial Respiratorio clasificados de acuerdo a la
severidad de la enfermedad, VSR con infección Leve (n=5), moderada (n=3) y
grave (n=7) y VSR- leve (n=6), moderada (n=4), grave (n=10) y grupo control
(n=10). Las concentraciones fueron determinadas por ELISA. Los datos
representan el X±DS y analizados con ANOVA + post test de Bonferroni.
*p<0,001 con respecto al grupo control, con infección por VSR leve y sin
infección por VSR grave. **p<0,01 con respecto a control, VSR+leve y VSRmoderado .
Al determinar las concentraciones séricas de las citocinas ensayadas (IL-4, IL-5,
IL-1β, TNF-α e IL-8), se evidenció un aumento marcado (p<0,01) de todos estos
factores solubles en los pacientes con infección por VSR al compararlo con el grupo
control, pero sólo resultó diferente a los pacientes negativos al virus en la
determinación de IL-1β, IL-8 e IgE (Tabla I).
TABLA I.- NIVELES SERICOS DE CITOCINAS E IgE EN PACIENTES CON INFECCIÓN
RESPIRATORIA AGUDA Y CONTROLES.
Control
VSR+
VSR-
n=10
n=15
n=20
IL-4(pg/ml)
9,463±1,3
13,82±2,7a
12,32±1,4a
IL-5(pg/ml)
31,88±10,4
74,41±31,2a
61,59±7,2a
IL-1β(pg/ml)
9,514±2,7
19,89±3,5a,b
15,95±3,4a
TNF-α(pg/ml)
26,26±3,0
80,80±27,5a
94,31±20,9a
IL-8(pg/ml)
29,55±5,808
114,1±90,43a,b
33,40±20,26
IgE (UI/ml)
18,49± 5,513
61,05±31,27 a,b
26,24±15,42
a
b
p<0,05 con respecto al control. p<0,05 con respecto a VSR-
Se encontró una correlación positiva (r=0,8796, p<0,01) entre la IL-5 sérica con el
número de eosinófilos presente en los pacientes con infección respiratoria producida
por VSR (Fig14). Mientras que en los pacientes sin infección por VSR no se obtuvo
tal asociación (Datos no mostrados).
Eosinofilo %
15
10
5
0
0
50
100
150
200
IL-5 (pg/ml)
Figura 14. Correlación de IL-5 (pg/ml) sérica y
eosinofilia en pacientes con infección respiratoria
aguda por VSR (n=8). Las concentraciones fueron
determinadas por ELISA. Analizados con Test de
correlación de Pearson (r=0,8796, p<0,01).
En cuanto a la determinación sérica de IgG anti-VSR, el 100% de los pacientes
seleccionados y de la población control arrojaron inmunidad al virus. A pesar de que
el paciente está enfermo en el momento de la toma de la muestra, no se realizó
títulación de anticuerpos IgG anti-VSR.
Estudios en cultivos
Aun cuando se evidenció un incremento (p<0,01) de las concentraciones de IL-4
en sobrenadantes de cultivo de monocitos a la 24 horas pi, en infectado por VSR
(85,13±7,584 pg/mg de proteína) y sin infección (VSR-:78,44±11,08 pg/mg de
proteína) con respecto al control (35,17±10,55 pg/mg de proteína), la diferencia
existente (p<0,01) entre las concentraciones de IL-4 en los cultivos de HEp-2
infectados con VSR y en monocitos, parece indicar que no hubo producción de esta
citocina en los monocitos. Mientras que en las concentraciones de IL-4 en
sobrenadantes de HEp-2 se evidenció un aumento significativo (p<0,001) en los
cultivos infectados por VSR+ (129,7±30,88 pg/mg de proteína) con respecto al
control (59,35±15,89 pg/mg de proteína) y negativos al virus (81,32±19,61 pg/mg de
proteína) (Fig 15).
IL-4(pg/mgdeproteína)
200
**
150
100
*
Control Monocitos
VSR+
VSR-
*
50
0
Monocitos
HEp-2
Figura 15. Concentraciones de IL-4 en sobrenadantes de cultivo
de monocitos humanos y HEp-2 infectados con VSR (n=9) y sin
infección
por
VSR
(n=9).
Las
concentraciones
fueron
determinadas por ELISA. Los datos representan el X±DE y
analizados con ANOVA + Bonferroni. *p<0,01 con respecto al
control (n=4) y **p<0,001 con respecto al resto de los cultivos.
Al analizar las concentraciones de IL-5 obtenidas de sobrenadantes de monocitos,
se observa que los cultivos no infectados por VSR (1095±559,0 pg/mg de proteína)
presentaron niveles elevados (p<0,05) con respecto a los controles (426,4±122,8
pg/mg de proteína) y a los infectados por VSR (645,4 ±142,6 pg/mg de proteína);
mientras que en los sobrenadantes de células HEp-2 no se observaron diferencias
(VSR+:364,0±79,75 pg/mg de proteína; VSR-: 418,7± 245,7 pg/mg de proteína y Co:
363,2±30,22 pg/mg de proteína), por lo que la producción de IL-5 no estuvo
IL-5 (pg/mg de proteína)
relacionada a la presencia de VSR (Fig 16).
2000
Controles
VSR+
VSR-
*
1500
1000
500
0
Monocitos
HEp-2
Figura 16. Concentraciones de IL- 5 en sobrenadantes de cultivo de
monocitos humanos y HEp-2
infectados con VSR (n=9) y sin
infección por VSR (n=9). Las concentraciones fueron determinadas
por ELISA. Los datos representan el X±DE y analizados con ANOVA
+ post test de Bonferroni. *p<0,01 con respecto al control y a
VSR+.
En las concentraciones de IL-1β obtenida de los sobrenadantes de monocitos
cultivados que no tenían infección por VSR (2368±494,4 pg/mg de proteína) se
evidenció un incremento (p<0,001) con respecto a los grupos control (344,9±102,58
pg/mg de proteína) y VSR+ (876,0±189,8 pg/mg de proteína) en cultivo. Mientras
que en las células HEp-2 los cultivos sin infección por VSR (992,1± 298,0 pg/mg de
proteína) arrojaron concentraciones mayores (p<0,05) que las observadas en los
IL-1β (pg/mg de proteína)
controles (346,6±36,76 pg/mg de proteína) (Fig 17).
4000
3000
Control
VSR+
VSR-
*
2000
**
1000
0
Monocitos
HEp-2
Figura 17. Concentraciones de IL 1 β en sobrenadantes de
cultivo de monocitos humanos y HEp-2 infectados con VSR
(n=9) sin infección por VSR (n=9). Las concentraciones fueron
determinadas por ELISA. Los datos representan el X±DE y
analizados con ANOVA + post test de Bonferroni. *p<0,01 con
respecto al control y VSR+. **p<0,01 con respecto al control.
Similar respuesta se obtuvo en las concentraciones de IL-8 en monocitos, donde
se evidenció que los cultivos no infectados por VSR (1130±335,6 pg/mg de proteína)
arrojaron las mayores concentraciones (p<0,05) con respecto al control (648,1±164,4
pg/mg de proteína) y a los infectados por VSR (876,4±117,6 pg/mg de proteína). En
los sobrenadantes de células HEp-2 no se observaron diferencias (VSR+: 429,7±
87,64 pg/mg de proteína; VSR-: 410,3± 155,6 pg/mg de proteína y Co: 452,0± 103,0
pg/mg de proteína) (Fig 18).
IL-8 (pg/mg de proteína)
2000
Controles
VSR+
VSR-
*
1500
1000
500
0
Monocitos
HEp-2
Figura 18. Concentraciones de IL-8 en sobrenadantes de cultivo de
monocitos humanos y HEp-2
infectados con VSR, (n=9) sin
infección por VSR (n=9). Las concentraciones fueron determinadas
por ELISA. Los datos representan el X±DE y analizados con ANOVA
+ post test de Bonferroni. *p<0,05 con respecto al grupo control y
los infectados por VSR.
Las concentraciones de TNF-α en los sobrenadantes de cultivo de monocitos no
infectados por VSR (2570± 908,7 pg/mg de proteína) se elevaron significativamente
(p<0,05) con respecto al control (711,9 ± 56,16 pg/mg de proteína) y VSR+ (1523±
908,9 pg/mg. Con respecto a los sobrenadantes de células HEp-2 no se observaron
diferencias (VSR+: 745,7± 256,2 pg/mg de proteína; VSR-: 903,1± 658,9 pg/mg de
TNF-α(pg/mg de proteína)
proteína y Co: 639,3± 57,66 pg/mg de proteína) (Fig 19).
4000
Control
VSR+
VSR-
*
3000
2000
1000
0
Monocitos
HEp-2
Figura 19. Concentraciones de TNF-α en sobrenadantes de
cultivo de monocitos humanos y HEp-2 infectados con VSR
(n=9) y sin infección por VSR(n=9). Las concentraciones fueron
determinadas por ELISA. Los datos representan el X±DE y
analizados con ANOVA + post test de Bonferroni. *p<0,01 con
respecto al control e infectado por VSR.
DISCUSIÓN
En este estudio se analizaron las concentraciones séricas de IL-4, IL-5, IL-1β, IL8 y TNF-α, dado que estas citocinas juegan un papel relevante en la inflamación de
las vías aéreas (Rodríguez y col., 1999). A pesar de que se observó una elevación
de IL-4 tanto en el suero de los pacientes infectados como en los no infectados por
VSR, al clasificarlos por grados de severidad es evidente un marcado aumento
relacionado a la infección grave causada por VSR. Este hallazgo es indicativo de
activación de linfocitos TH2, que junto a los efectos de esta citocina sobre la síntesis
incrementada de IL-5 e IgE (elevada en los casos severos), sugieren regulación de
la expresión de los receptores de IgE en los macrófagos y eosinófilos, haciendo que
estas células interaccionen con cualquier tipo de alergeno, lo que conllevaría a un
aumento de la gravedad de la enfermedad, tal como lo reportan Rodríguez y col.,
(1999) y Liu y col., (2007). Además, Legg y col., en el 2003, en un estudio realizado
en lavados nasales de niños que padecían infección respiratoria, observaron que la
IL-4 se encontró elevada en los niños con bronquiolitis por VSR, así como la IL-10 e
IL-12 los días 1-2 y 5-7 de la enfermedad, datos que sugieren que en estos
pacientes se produce un exceso de respuesta Tipo TH2 o una respuesta inmunitaria
deficiente de tipo TH1.
En células de epitelio respiratorio como las HEp-2 las concentraciones de IL-4
fueron marcadamente incrementadas en los cultivos infectados por VSR, mientras
que en monocitos no se determinaron cambios importantes asociados a la presencia
de este agente, lo que sugiere que probablemente las concentraciones de IL-4
favorezcan un micro ambiente bronquial o broncoalveolar caracterizado por altos
niveles de esta citocina, la cual representa el factor determinante mas importante en
la expansión de los linfocitos TH2, o en la diferenciación de linfocitos B hacia células
productoras de IgE (Pala y col., 2002). Además, la IL-4 favorece la producción de
mucosidad a través de la activación de los neutrófilos y de la estimulación de los
receptores del factor de crecimiento epidermal (EGF) (Lorente y col., 2001)
También se encontraron elevados los niveles séricos de IL-5 en pacientes con
IRA por VSR causando infección leve, moderada o grave, y sólo en aquellos
pacientes con IRA grave causada por otros agentes. Sanmugalingham y col., (2000)
en su estudio demuestran el papel selectivo de la IL-5 en la mediación de la
adherencia dependiente de integrina del eosinófilo al epitelio de la vía aérea y
reafirma una vez mas la importancia de esta citocina en el control de la activación
del eosinófilo en enfermedades tales como asma. La correlación positiva encontrada
entre la IL-5
y la cantidad de eosinófilos en los pacientes infectados por VSR,
sugieren que haya mayor posibilidad de que a nivel de la vía aérea esto ocurra, una
vez conocido que los eosinófilos se producen en la médula a partir de células
pluripotenciales del progenitor CD34+, que son comunes a los eosinófilos y
basófilos, que bajo la influencia de factores de crecimiento, incluyendo IL-3, el factor
estimulador de colonia granulocítico-macrofágico (GM-CSF) e IL-5regulando la
activación de los eosinófilos.
La IL-3 y GM-CSF son activos como precursores
tempranos, mientras que la IL-5 actúa mas tardíamente para la diferenciación de los
eosinófilos y su liberación a la circulación sanguínea (Denburg, 1998). A pesar de
que la logística en la recolección de las muestras sanguíneas no fue del todo
eficiente, dado que permitió determinar eosinófilos en sólo 8 de los 15 pacientes con
IRA por VSR, en el presente estudio la eosinofilia fue evidente en estos pacientes y
no en los no infectados por VSR sugiriendo que los eosinófilos activados por virus se
reclutan probablemente en las vías respiratorias causando daño y provocando una
reacción de hiperreactividad tardía (Balfour, 1996, Phipps y col, 2007), asociado a un
cuadro clínico más severo.
Chang y col., (2003), realizaron un estudio en LBA, donde determinaron los
niveles de IL-5 e IFNγ, los cuales fueron aumentados significativamente en el grupo
de pacientes asmáticos sin infección identificada por VSR y con bronquiolitis
inducida por VSR, comparado con valores del grupo control. Cuando dividieron a los
niños del grupo con bronquiolitis, en subgrupos eosinófilo-positivos y eosinófilonegativos, el subgrupo eosinófilo-positivo había aumentado perceptiblemente los
niveles
IL-5.
El
porcentaje
de
los
eosinófilos
en
el
LBA,
correlacionó
significativamente con los niveles de IL-5 en ambos grupos. Estos autores sugieren
una predisposición a una respuesta inmunitaria tipo TH2, tal como se sugiere en
este y en otros estudios realizados en ratones que han demostrado que la infección
por VSR puede inducir una alteración en el equilibrio TH1/TH2 a favor de una
respuesta TH2 con producción creciente de IL-5 (Welliver y col., 1981).
En cuanto a la concentración sérica de IL-1β, ésta fue marcadamente alta en los
pacientes con y sin infección por VSR con cuadro clínico desde leve a grave, lo que
nos sugiere liberación de esta citocina en la IRA no relacionada a VSR. Mientras
que los niveles de TNF-α también estuvieron incrementados en los pacientes con y
sin infección por VSR y en los diferentes grados de severidad. Resultados que
concuerdan con lo descrito por Noah (1995) en un estudio realizado en niños en un
hogar de cuidado diario, donde determinaron en lavados nasales la expresión de IL1β, IL-8, IL-6 y TNF-α, los cuales estuvieron muy elevados al ser comparados con el
control, y todos menos el TNF-α disminuyeron sus concentraciones de 2-4 semanas
sin evidenciar diferencias significativas con respecto a los no infectados por VSR.
Beutler (2000) y Tian (2001) en otros estudios encontraron niveles elevados de TNFα en los primeros días, al ser estos relacionados con la carga del virus, lo cual
confirma claramente que es una citocina que se encuentra involucrada en la
mediación de los procesos inflamatorios producidos por la infección con VSR.
La IL-1 promueve la liberación de mediadores procedentes de los mastocitos del
pulmón humano, de modo dependiente de la IgE (Salaxi y col., 1989 y Bischoff y
col., 1992); estas citocinas producen la liberación de histamina de los mastocitos de
adenoides y epidermis, respectivamente (Subramanian., 1987 y Van Overdeld y col.,
1991).
Las células TH2 producen IL-5, citocina que promueve la síntesis y secreción de
IgE por células B, siendo ésta crucial en el desarrollo y superviviencia de eosinófilos
en los sitios de inflamación. Esto puede explicar la eosinofilia frecuentemente
asociada con reacciones alérgicas mediadas por IgE (Herrero, 2006). Los niveles
séricos de IgE en pacientes con infección por VSR estuvieron muy elevados y este
aumento fue más evidente en las infecciones moderadas y graves. Welliver (2000)
en varios estudios en niños con IRA, encontró que los niveles de IgE específicas
para este virus, estaban incrementados en células epiteliales y secreciones
nasofaringeas, asociando este hecho con las sibilancias y obstrucción de vías
respiratorias, y postularon que se produce una sensibilización de las células
cebadas, que al ocurrir una subsecuente infección, el VSR interactúa con las IgE
específicas y activa la liberación de mediadores que consecuentemente agravan el
cuadro clínico.
Llama la atención que en modelos in vitro, las concentraciones de IL-1β y TNF-α
no mostraron diferencias importantes en los sobrenadantes de cultivos infectados
por VSR al ser comparados con los controles. Algunos autores sugieren que el TNFα tiene un papel crítico en la inflamación, pero la función de esta citocina en
enfermedades causadas por VSR no esta totalmente clara, dado que
algunos
mencionan que tiene un papel protector en las infecciones por VSR (Henderson,
1995),
mientras que Mejías y col., (2004) realizaron un estudio en ratones, los
cuales recibieron un anticuerpo monoclonal neutralizante antiVSR e infectados
intranasalmente con VSR A2, a las 24 horas tenían las concentraciones más altas
de TNF-α en muestras del LBA pero sin presentar sintomatología durante el curso de
la infección. Estos autores concluyeron que la replicación reducida de VSR está
asociada significativamente a la producción de TNF-α aumentada que podría
explicar, por lo menos en parte, la regulación de marcadores clínicos e inflamatorios
en la severidad de la enfermedad aguda y la mejoría de las anormalidades
pulmonares.
La IL-8 es una quimiocina potente que promueve el reclutamiento de neutrófilos y
eosinófilos, responsables en gran parte del proceso inflamatorio. Estudios previos
sugieren un papel importante de esta citocina en las exacerbaciones de asma
(Baggiolini y col., 1994). En un trabajo realizado por O´Sullivan en 2005 observó
aumento de las concentraciones de IL-8 en muestras de secreción respiratoria de
niños con broquiolitis y al correlacionarlas con el número de leucocitos en las
mismas secreciones, indicaron que probablemente esta quimiocina puede ser
responsable de la infiltración del leucocito de la vía aérea durante la infección de
VSR.
En
otro
estudio
realizado
por
Hasan
(2002),
determinó
que
las
concentraciones séricas de IL-8 el día 1 de evolución se encontraban aumentadas,
para luego disminuir durante el período de cinco días de estudio. Una declinación
similar en concentraciones del quimiocinas fue observada en secreciones
nasofaríngeas. Sin embargo, cuando la concentración de IL-8 en secreciones
respiratorias fue comparada con las de suero, diversas tendencias eran observadas.
En el presente estudio los niveles séricos de IL-8 estuvieron incrementados en los
pacientes infectados por VSR, y particularmente con infección grave, hallazgos que
concuerdan con estudios previos. Sin embargo, al observar las concentraciones en
sobrenadantes de HEp-2 y monocitos humanos no se evidencio relación alguna de
esta citocina y la infección por VSR, contrario a lo reportado por Kurt-Jones y col.,
(2000) quienes describen en monocitos humanos estimulados in vitro con la proteína
F del VSR A2 purificada, la activación de receptores tipo Toll 4 (TLR 4) involucrados
en la liberación de IL- 8, IL-6 e IL-1.
Con respecto a la detección de lnmunoglobulinas G específicas al virus (IgG
antiVSR), en el presente estudio se demuestra que todos los pacientes y sanos
(controles) presentaron inmunidad al virus; estos datos indican una alta
seroprevalencia de VSR y refuerzan el concepto de que la mayoría de la población
tiene contacto con el virus probablemente desde la infancia. Hallazgo que concuerda
con lo descrito por Lérida y col., (2000) en un estudio epidemiológico en pacientes
con y sin criterio serológico de infección aguda por VSR, en los cuales encontraron
97% de inmunidad al virus con sólo un 6,8% de seroconversión. No se observaron
variaciones significativas al relacionar la inmunidad con la severidad de la IRA en los
pacientes, sin embargo los mayores porcentajes de IgG anti VSR se encontraron en
la población que presentó IRA grave, a pesar que algunos autores describen que
después de la primera exposición al virus es poco frecuente la enfermedad grave y
que la inmunidad producida por VSR es parcialmente eficaz y hasta el momento no
existe una medida de profilaxis efectiva solo la administración mensual de un
anticuerpo monoclonal humanizado anti VSR (Palivizumab) representa una
alternativa de protección a la infección (Skaricic y col., 2008).
Tomando en cuenta todos los parámetros evaluados es importante recalcar la
posible y relevante acción de la IL-8 como principal citocina implicada en la
patogénesis de la infección causada por el VSR, sin dejar de mencionar el
incremento de citocinas proinflamatorias como la IL-1 β y el TNF-α, que aun cuando
no estuvieron relacionadas directamente a la infección por VSR,
se sugiere su
participación in vivo, en el agravamiento del cuadro clínico. La determinación de IL-4
e IL-5 pudieran indicar la generación de una respuesta inmunitaria tipo TH2 en los
pacientes con IRA infectados por VSR, mientras que se evidenció un alto porcentaje
de inmunidad en la población no relacionada a la severidad de la IRA en los
pacientes analizados.
CONCLUSIONES
En base a los resultados obtenidos en el presente estudio, se concluye:
9 Durante la infección respiratoria aguda se incrementan los niveles séricos de
citocinas proinflamatorias IL-1 β
y
TNF-α, no solo relacionados a la
presencia del VSR.
9 Se sugiere una relevante acción de la IL-8 como principal citocina implicada
en la patogénesis de la infección causada por el VSR, asociada posiblemente
al reclutamiento de neutrófilos y eosinófilos, responsables en gran parte del
proceso inflamatorio en la vía aérea de estos pacientes.
9 El incremento en las concentraciones de IL-4 e IL-5 en los pacientes
infectados por VSR sugieren una respuesta inmunitaria tipo TH2 relacionada
a la infección grave causada por VSR.
9 La producción incrementada de IL-4 en células HEp-2 infectadas por VSR
sugieren la participación de esta citocina en la regulación de la síntesis de
otros factores como la IL-5 e IgE.
9 El alto porcentaje de IgG anti VSR encontrado en los pacientes y controles
indican una seroprevalencia a VSR.
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