Tesis Electrónicas UACh - Universidad Austral de Chile
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Universidad Austral de chile Facultad de Ciencias Escuela de Química y Farmacia PROFESOR PATROCINANTE: Juan Carlos Paredes G. INSTITUTO: Química FACULTAD: Ciencias PROFESOR CO-PATROCINANTE: Sergio Leiva P. INSTITUTO: Microbiología FACULTAD: Ciencias “ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE UNA CEPA BACILLUS MARINO AISLADO DESDE LA COSTA DE VALDIVIA” Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Químico Farmacéutico NICOLE LISSETTE DORNEMANN PINILLA VALDIVIA-CHILE 2012 Dedico éste trabajo a las personas más importantes en mi vida: padres, hermanos, sobrinas, pareja, futuros hijos y familia. Madre mía gracias por tu esfuerzo y apoyo incondicional. Agradecimientos Agradezco a Dios quien me dió la vida y todo lo maravilloso que tengo a mí alrededor. A mi profesor patrocinante Juan Carlos Paredes por su buena disposición para ayudarme y su amabilidad que lo caracteriza. A mi profesor co- patrocinante por su constante apoyo, preocupación, responsabilidad y buena disposición para ayudarme. A mi profesor informante Eduardo Valenzuela. A mi compañera Yamina por su ayuda, disponibilidad y momentos agradables en el laboratorio. A mi madre Cecilia por su preocupación, esfuerzo y apoyo incondicional. A mi padre Guillermo por su comprensión y apoyo. A mis sobrinas Javiera y Sofia por hacer mis días alegres, fortalecerme de amor y ternura con tan sólo una sonrisa. A mis hermanos Guillermo y Constanza por su apoyo, y momentos agradables junto a ellos. A mi pareja Luis por su apoyo y preocupación. A los demás integrantes de mi familia: abuelas, tías, primos por su constante preocupación y cariño entregado en este proceso. Índice de contenidos 1. RESUMEN .................................................................................................................. 1 SUMMARY ..................................................................................................................... 1 2. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 3 3. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 12 3.1 Materiales ............................................................................................................... 12 3.1.1 Biológico ........................................................................................................ 12 3.1.2 Reactivos y medios de cultivo ........................................................................ 12 3.1.3 Equipos ......................................................................................................... 13 3.1.4 Otros.............................................................................................................. 13 3.2 Métodos .................................................................................................................. 14 3.2.1 Análisis filogenético de cepa U38 .................................................................. 14 3.2.2 Caracterización fenotípica de la cepa U38 ..................................................... 15 3.2.3 Determinación de pH, temperatura y salinidad óptima de la cepa U38 ......... 16 3.2.4 Preparación de extractos de la cepa U38 ...................................................... 17 3.2.5 Actividad antimicrobiana de extractos de la cepa U38 ................................... 18 3.2.6 Análisis químico del metabolito de la cepa U38 ............................................. 18 4. RESULTADOS .......................................................................................................... 19 4.1 Taxonomía de la cepa U38 ..................................................................................... 19 4.1.1 Análisis filogenético de la cepa U38 .............................................................. 19 4.1.2 Caracterización morfológica y bioquímica de la cepa U38 ............................. 19 4.2 pH, temperatura y salinidad óptima de la cepa U38 ............................................... 22 4.3 Actividad antimicrobiana contra microorganismos patógenos ................................. 27 4.4 Análisis químico del metabolito de la cepa U38 ...................................................... 31 5. DISCUSIÓN ............................................................................................................. 33 6. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 37 7. REFERENCIAS......................................................................................................... 38 Índice de figuras Página Fig. 1 Se muestra la estructura de algunas moléculas de origen marino que han suscitado interés en la industria. 8 Fig. 2 Dendrograma filogenético de la cepa U38. 20 Fig. 3 Curva de crecimiento de la cepa U38 en medio CMAA. 22 Fig. 4 Crecimiento a diferentes pH de la cepa U38. 24 Fig. 5 Crecimiento a diferentes temperaturas de la cepa U38. 25 Fig. 6 Crecimiento a diferente concentración de NaCl de la cepa U38. 26 Fig. 7 . Actividad antibacteriana de los extractos crudos U38 contra cepas de referencia. 29 Fig. 8 Actividad antibacteriana del extracto U38 contra Staphylococcus aureus ATCC 25923. Fig. 9 30 Actividad antibacteriana del extracto U38 contra Mycobacterium smegmatis ATCC 14468. 30 Fig. 10 Componentes de la cepa U38 observados en cromatografía en capa fina. 31 Fig. 11 Componente de la cepa U38 revelado en cámara con yodo. 31 Fig. 12 Espectroscopía infrarrojo (IR) del extracto de la cepa U38. 32 Índice de tablas Página Tabla 1. Productos naturales marinos y sus derivados en el desarrollo clínico. 7 Tabla 2. Características bioquímicas de la cepa U38. 21 Tabla 3. Inhibición de microorganismos de referencia por extracto de la cepa U38. 27 Tabla 4. Diámetros de inhibición de microorganismos de referencia por extracto de la cepa U38. 28 1 1. RESUMEN En el presente trabajo se estudió la actividad antimicrobiana, taxonomía y condiciones óptimas de crecimiento in vitro de una cepa bacteriana (cepa U38) aislada desde la superficie de ejemplares del alga Ulva lactuca, colectadas desde Playa Rosada en Valdivia. La cepa U38 corresponde a bacilo Gram (+), motil, que forma endosporas y se encuentra como células individuales o forma cortas cadenas. La secuencia del gen 16S rRNA mostró la mayor similitud con las secuencias de especies Bacillus pumilus ATCC 7061 y Bacillus safensis FO-036b. Sus condiciones óptimas de crecimiento fueron un pH 7.5, una temperatura de 37° C y 1.75 % concentración de NaCl. La cepa U38 ejerció actividad inhibitoria frente a bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, incluyendo Staphylococcus aureus. Escherichia coli, Mycobacterium smegmatis y 2 SUMMARY In this work the taxonomy and antimicrobial activity of a Gram positive strain (designated U38) isolated from the surface of the marine algae Ulva lactuca was studied. Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences placed strain U38 within the genus Bacillus, showing the highest 16S rRNA gene sequence similarity to B. pumilus ATCC 7061 (99 %) and B. safensis FO-036b (98,8 %). Strain U38 was found to exert inhibitory activity against Gram-negative and Gram-positive bacteria, including Escherichia coli, Mycobacterium smegmatis and especially clinical strains of Staphylococcus aureus. The results of the present investigation reveal that algaeassociated bacteria are a promising source of antimicrobial metabolites that should be further explored. 3 2. INTRODUCCIÓN La Naturaleza ha constituido por miles de años una fuente de agentes medicinales para el ser humano. Es impresionante el número de drogas que se han aislado desde fuentes naturales, especialmente plantas, las que han formado la base de un sistema de medicina durante milenios (Cragg & Newman 2001). Desde hace varias décadas, los microorganismos también han sido objeto de estudio como productores de sustancias antibacterianas, antifúngicas, antivirales, antiparasitarias, citotóxicas e inhibitorias de otras formas de crecimiento celular (Pellón et al, 2001). El siglo XX fue testigo de la creciente importancia de los microorganismos como productores de antibióticos y otras drogas. Con el descubrimiento casual de la penicilina por Fleming en 1929 a partir de un cultivo de Penicillium notatum (Tortora et al. 2001), se inauguró la “Edad Dorada de los Antibióticos”. Entre los ejemplos notables de compuestos extraídos desde microorganismos tenemos, antibióticos como penicilinas (desde especies de Penicillium), cefalosporinas (desde Cephalosporium acremonium), agentes inmunosupresores como la ciclosporina (a partir de Trichoderma y Tolypocladium), agentes que disminuyen el colesterol, como la mevastatina (desde especies de Penicillium) y lovastatina (de Aspergillus), drogas antihelmínticas y antiparasitarias como las ivermectinas (desde Streptomyces), aminoglicósidos, tetraciclinas, antitumorales como las familias de compuestos del ácido aureolico, mitomicina y actinomicina, e incluso agentes antidiabéticos (Cragg & Newman 2001). El 70% de la superficie de nuestro planeta está cubierta por océanos. Se estima que en ciertos ecosistemas marinos, tales como los arrecifes de coral o el fondo del mar 4 profundo la diversidad biológica es más alta que en el ambiente terrestre. Aunque los océanos contienen una biodiversidad superior a la de la tierra, su exploración desde el punto de vista de búsqueda de nuevos compuestos químicos apenas se ha iniciado, y se conocen en la actualidad únicamente unos quince mil productos naturales de origen marino, una décima parte de los terrestres. A pesar de su reciente exploración, ya hay productos naturales marinos que han mostrado actividad hacia la mayoría de las dianas celulares y moleculares (De la Calle, 2007). Muchos organismos marinos son de cuerpo blando y tienen un estilo de vida sedentario, y requieren medios de defensa química contra potenciales depredadores y/o patógenos. Estos organismos marinos proporcionan un hábitat rico en nutrientes, donde las bacterias crecen en comunidades complejas. Estas bacterias adheridas a las superficies de organismos marinos (bacterias epibiontes) son una rica fuente de moléculas antimicrobianas de gran utilidad, las cuales inhiben la adhesión, crecimiento o supervivencia de especies microbianas competidoras, con el objetivo de obtener una ventaja en entornos competitivos. También está claro que diferentes especies de bacterias producen diferentes tipos de compuestos antimicrobianos (Wilson, 2010). Yooseph et al. (2007) demostraron que la inmensa mayoría de las moléculas liberadas por bacterias marinas no se han caracterizado. Por su parte, Taylor et al. (2005) demostraron que la asociación invertebrado-microorganismo varía entre sitios geográficos. Por ejemplo, la esponja marina Cymbstela concentrica posee comunidades bacterianas distintas en las regiones tropicales respecto a ejemplares que habitan aguas templadas en la costa este de Australia. Sin embargo el mecanismo exacto de esta especificidad geográfica se desconoce. A su vez, Long y Azam (2001) y Mearns- 5 Spragg et al., (1998) han demostrado que un número significativamente mayor de bacterias adheridas a superficie de organismos marinos produce una mayor cantidad de compuestos inhibidores en comparación con las bacterias que se encuentran en forma libre en el agua. Un claro ejemplo de bacterias epibiontes bioactivas son las que se encuentran en las esponjas marinas. Estas bacterias son una rica fuente de metabolitos bioactivos con actividad antimicrobiana, citotóxica, antitumoral, que son de interés farmacéutico y biotecnológico. Más de 10.000 metabolitos han sido recuperados de fuentes marinas, la gran mayoría de los cuales se originan en las esponjas. Los metabolitos microbianos marinos poseen estructuras moleculares y actividades biológicas peculiares, se cree debido a que los organismos productores viven en un medio ambiente muy diferente al terrestre. Los organismos marinos habrían desarrollado como adaptación vías metabólicas singulares, lo que llevó a la producción de metabolitos con nuevas estructuras y actividades. Por ejemplo, representantes de Bacillus marinos exhiben actividades antibacterianas, antivirales y anticancerígenas y producen antimicrobianos noveles denominados macrolactinas (Mondol, et al. 2011). Si bien la mayoría de las moléculas marinas más prometedoras todavía están en desarrollo clínico o preclínico (Tabla 1), algunas ya están en el mercado como citarabina y ET743 (Yondelis ) (Haefner, 2003). Actualmente, hay varios compuestos de origen marino con un futuro promisorio en terapia. (Figura 1) La esponja Aldis hymeniacidon contiene un alcaloide llamado himenialdisina, el cual es un potente inhibidor de la proteína serina/treonina kinasa que inhibe la fosforilación in vitro de microtúbulos humanos asociados a proteínas tau que están implicados en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. Además, la 6 himenialdisina reduce la producción de interleucina 8 y la prostaglandina E2 en células humanas, lo que indica que puede tener actividad anti-inflamatoria. Otro ejemplo es la briostatina, compuesto que inhibe la síntesis de la proteína kinasa y actualmente está en ensayos clínicos para tratar el cáncer (Chabot-Fletcher, 1997). Muchas de las moléculas aisladas desde bacterias marinas poseen cualidades extraordinarias, como su halogenación, siendo notable la presencia de átomos de cloro o bromo (Figura 1). Esta halogenación rara vez se encuentra en metabolitos de origen terrestre. Este universo de moléculas marinas biológicamente activas, de extremada sutileza estructural, forman un armamento tan fascinante que no es de extrañar que sean calificadas como las medicinas del futuro. La comunidad científica sólo ha explorado la punta del iceberg del potencial existente en la biodiversidad marina. 7 Nombre del compuesto Compuestos que actúan sobre canales iónicos Ziconotida AM336 GTS21 Compuestos inhibidores de las enzimas metionina aminopeptidasa Origen Caracoles cono Caracoles cono Gusano nemertino LAF 389 Esponja Inhibidor Proteina Kinasa Briostatina-1 Briozoario Agentes interfieren microtúbulos Babosa de Dolastatina-10 mar Babosa de IXL651 mar Babosa de Cernadotina mar Discodermolina Esponja HTI286 Esponja Agentes que interactúan con ADN Tunicado Yondelis ™ marino Inductor stress oxidativo Tunicado Aplidina ™ marino Agentes inmunoestimulantes KRN 7000 Antagonistas enlace Proteinas-Calcio Squalamina lactato Clase química Compañía Aplicación Estado Péptido Neurex Péptido Anabaseinaderivado AMRAD Taiho Pánico Crónico Pánico Crónico Alzheimer y Esquizofrenia Amino y derivado Novartis Cáncer Fase I Policétido GPC Biotech Cáncer Fase II Péptido Cáncer Fase II Péptido NCI/Knoll Llex Oncology Cáncer Fase I Péptido Policétido Tripéptido Knoll Novartis Wyeth Cáncer Cáncer Cáncer Fase II Fase I Fase I Isoquinolona PharmaMar Cáncer Fase II/III Depsipéptido cíclico PharmaMar Cáncer Fase II Fase III Fase I/II FaseI/II Esponja αgalactosilceramida Kirin Cáncer Fase I Tiburón Aminoesteroide Cáncer Fase II Genaera Tabla 1. Productos naturales marinos y sus derivados en el desarrollo clínico (Fuente: Haefner, 2003). 8 Figura 1. Estructura de algunas moléculas de origen marino que han suscitado interés en la industria farmacéutica (Fuente: Haefner, 2003). 9 La aparición de resistencia bacteriana a los antimicrobianos se ha agravado y es causado por el uso indiscriminado e inadecuado de los antimicrobianos, donde estos fármacos son fácilmente disponibles y accesibles, incluso sin receta médica. Las terapias antimicrobianas tradicionales solían ser una forma efectiva de tratar las infecciones bacterianas, pero la aparición de cepas multirresistentes ha provocado un aumento en el número de casos de enfermedad y mortalidad (Harakeh et al., 2006). La aparición de la resistencia de las bacterias patógenas a los antibióticos convencionales exige una mayor atención a la purificación y caracterización de agentes antimicrobianos con nuevos mecanismos de acción. El desarrollo de resistencia a los antibióticos entre bacterias patógenas como Staphylococcus aureus resistente a meticilina y Enterococcus resistentes a vancomicina puede ser contrarrestada con moléculas de origen marino que presenten estructuras inusuales y nuevos mecanismos de acción (Sperstad et al., 2011). El ejemplo más notable lo constituyen algunas bacterias Gram negativas como Klebsiella, Enterobacter y Pseudomonas que inactivan algunos antibióticos a través de β lactamasas. Si bien la prevalencia de la resistencia en hongos es inferior a la de las bacterias, hay una creciente preocupación por el aumento de la micosis resistente a los tratamientos tradicionales con antifúngicos. Ejemplo de ello, lo constituye la resistencia de C. albicans a los azoles. Se ha demostrado que algunas cepas de Candida aisladas de pacientes sometidos a terapias con fluconazol de larga duración, tienen niveles elevados de proteínas transportadoras (MFS) (ABC) que provocan la salida del fármaco, reduciendo así su acumulación intracelular (Hernández et al., 1997). Asimismo, las enfermedades causadas por micobacterias son uno de los grandes 10 problemas de salud pública que enfrenta la humanidad. Se hace necesario desarrollar nuevas drogas antituberculosis frente a la aparición de nuevas cepas multiresistentes a antibióticos. En este sentido, la microbiota de nuestras costas prácticamente no ha sido explorada como una fuente de nuevas drogas anti-micobacterianas. Especies de Bacillus son muy abundantes en la naturaleza, siendo aisladas de ambientes tan diversos como agua dulce, ambientes marinos, suelo, plantas y animales. Es un género bacteriano caracterizado por células Gram positivas, que crecen en condiciones aeróbicas y que forman endosporas latentes. La diversidad metabólica de Bacillus ha sido aprovechada en biotecnología, como por ejemplo para la producción de moléculas tales como la riboflavina, estreptavidina y -lactamasas (Maughan & Van der Auwera 2011). Nagao et al. (2001) identificaron 2 nuevas macrolactinas desde una cepa marina de Bacillus aisladas desde el alga Schizymenia dubyi. Estas macrolactinas mostraron actividad contra Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus, pero no contra Escherichia coli. En este trabajo se estudiará la taxonomía, actividad antimicrobiana y condiciones in vitro óptimas de crecimiento de una cepa Bacillus, la que se denominó U38, aislada desde la superficie del alga marina Ulva lactuca desde la costa de Valdivia, la cual previamente demostró actividad antimicrobiana contra S. aureus (Alvarez, 2010). Además, se realizará una caracterización química preliminar del principio activo. Se plantea la hipótesis que “La cepa marina U38 (Bacillus sp) exhibe actividad anti-micobacteriana, inhibiendo el crecimiento de Mycobacterium smegmatis” 11 El objetivo general de este estudio es investigar la acción antimicrobiana de extractos crudos de un Bacillus sp marino aislado de la superficie del alga Ulva lactuca. Para comprobar esta hipótesis se plantean los siguientes objetivos específicos: A) Identificar la cepa U38 mediante un análisis fenotípico y filogenético. B) Estudiar el crecimiento de la cepa U38 a diferentes temperaturas, pH y salinidades. C) Evaluar el efecto antimicrobiano y anti-micobacteriano de extractos crudos obtenidos con cloroformo de la cepa marina U38 de Bacillus sp. D) Realizar una caracterización química preliminar del o los metabolitos responsables de la actividad anti-micobacteriano de la cepa U38. 12 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Materiales 3.1.1 Biológico Se utilizó la cepa bacteriana marina U38, aislada desde la superficie de ejemplares del alga Ulva lactuca (Alvarez, 2010), colectadas desde Playa Rosada en Valdivia, Región de los Ríos. Las cepas de referencia usadas fueron: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus no multidroga resistente (no-MDR), Staphylococcus aureus multidroga resistente (MDR), Klebsiella pneumoniae MDR, Acinetobacter MDR, Escherichia coli ATCC 8733, Mycobacterium smegmatis ATCC 14468, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila y Candida albicans. 3.1.2 Reactivos y medios de cultivo Los reactivos empleados para esta investigación fueron: acetato de etilo RIEDER-DE HAEN (p.a), ácido L-glutámico, agar-agar nacional, agar base urea (Difco), agar citrato (Difco), agar Müeller-Hilton (M-H), agar noble (Difco), agua destilada, almidón, asparragina, caldo Luria Bertani (LB), caldo marino 2216 (Difco), caldo marinoagua de mar artificial (CMAA), cloroformo RIEDER-DE HAEN (p.a), cloruro de calcio, cloruro de potasio, cloruro de sodio, dimetil sulfóxido RIEDER-DE HAEN (p.a), DNasa (Difco), D(-) fructosa, D(-) glucosa, D(-) manitol, D(-) trehalosa, extracto de carne, extracto levadura (Oxoid), peptona (Difco), fosfato de amonio, fosfato monopotásico, gelatina, glicerol, glicina, inulina, L(-) cisteína, L(-) metionina, L(-) ramnosa, L(-) tirosina, L(+) arabinosa, lactosa, maltosa, medio MIO (Difco), medio MRVP, medio nitrato (Difco), metanol RIEDER-DE HAEN (p.a), metiletilcetona MERCK (p.a), nitrato de 13 potasio, rafinosa, reactivo nitrato A y nitrato B, rojo fenol, silicagel 60 MERCK (70-230 mesh ASTM), sucrosa, suero fisiológico, sulfato de amonio, sulfato de magnesio, tolueno MERCK (p.a),Tris, yodo metálico extra puro SCHARLAU CHEMIE S.A. 3.1.3 Equipos Los equipos empleados para esta investigación fueron: agitador termorregulado (IKA), agitador orbital termorregulado (MRC), autoclave Huxley HL 341, balanza analítica AMD GR-200, bomba de vacío, cámara UV CC-10, centrífuga ROTINA 420R, espectrofotómetro Helios Gamma (Thermo Scientific), espectrofotómetro IR Fourier Transform Infrared Spectrometer FT/IR – 4200, estufa de cultivo FOC 225E 28±1°C y 37±1°C, lámpara UV UVGL-58 Handheld UV lamp, medidor de pH Orion 3 star (Thermo Scientific), refrigerador LG a 4°C, rotavapor Eyela Rotary Evaporator N-1001, vortex VELP Scientific. 3.1.4 Otros Aros sujetadores, asa de siembra, botellas (Schott) de 100, 250, 500 y 1000 mL, cámara cromatográfica de vidrio con fondo plano, cámara fotográfica digital, cubeta, embudo de decantación 250 y 1000 mL, espátulas metálicas, filtros de membrana CA diámetro 30 mm y porosidad 0.2 µm (Orange Scientific), filtro milipore 0,45 µm, guantes de látex (Health Touch), jeringas (NIPRO) 5 mL estériles, lápiz marcador, matraces balón de 250 y 500 mL, matraces (BOECO) de 250, 500 y 1000 mL, mechero, micropipetas de 10, 100 y 1000 µL (Biopette), papel aluminio, papel filtro, papel parafilm, pinza, pinza para sostén, puntas estériles para micropipetas, placa 14 cromatográfica de silicagel, placas Petri de vidrio y plástico de 90 mm de diámetro, probetas (Isolab) de 50 y 100 mL, rastrillo de siembra, regla, tórulas estériles, tubos eppendorf 1.5 mL, tubos Falcon (ORANGE) de 10 y 50 mL, tubos Venoject, estándar de turbidez McFarland 0.5, vasos precipitados de 500 y 1000 mL. 3.2 Métodos 3.2.1 Análisis filogenético de cepa U38 El ADN del genoma de la cepa bacteriana U38 se extrajo empleando los protocolos de Chachaty y Saulnier (2000). Para amplificar el 16S rRNA se utilizaron los primers universales 1492 r (5´-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3´) y 27f (5´- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´). Para la amplificación se utilizó la KOD XL DNA polimerasa (Novagen) y un termociclador Personal Cycler (Eppendorf), con un ciclo que consiste en: denaturación inicial a 94 C por 3 min y 30 ciclos a 94 C por 30 seg, seguidos por 55 C por 30 seg y una extensión de 72 C por 2 min, y finalmente una extensión de 74 C por 10 min. El fragmento amplificado se purificó por medio del kit MinElute Gel Extraction (QIAGEN). El fragmento purificado se clonó en el vector pGEMTeasy (Promega) y el plásmido resultante se envió a secuenciar al Departamento de Ecología de la Pontificia Universidad Católica de Chile en Santiago. Las secuencias resultantes fueron comparadas mediante un análisis BLAST con las secuencias de 16S rRNA contenidas en la librería de nucleótidos del GenBank. Los alineamientos múltiples con las secuencias de 16S rRNA de las especies y cepas más cercanas se realizaron con el programa ClustalW. Los árboles filogenéticos fueron construidos mediante el 15 método Neighbor-Joining y el programa MEGA5. La topología del árbol filogenético se evaluó mediante 600 repeticiones de “bootstrap”. 3.2.2 Caracterización fenotípica de la cepa U38 Para caracterizar fenotípicamente esta cepa bacteriana marina se realizaron las siguientes pruebas: tinción de Gram y tinción de Wirtz, utilización de citrato de Simmons, ureasa, hidrólisis de gelatina, producción H 2S, DNasa, Rojo metilo, VogesProskauer, hidrólisis de almidón, reducción de nitrato. Para la determinación de la utilización de compuestos orgánicos como única fuente de carbono se utilizó la metodología descrita por Ventosa et al. (1982). Para aminoácidos, se agregó 100 mL de una solución de diferentes aminoácidos al 10% (glicina, asparragina, ácido L- glutámico, L-metionina, L-tirosina, L-cisteína) esterilizada por filtración (0.2 µm tamaño del poro), a un medio base(caldo) compuesto de: 900 mL de agua destilada, 1 g KCl, 17.5 g NaCl, 0.2 g MgSO4 x 7H20, 1 g (NH4)2HPO4 y 0.5 g KH2PO4, ajustado a un pH de 7.5. Para azúcares, se agregó 100 mL de una solución de diferentes azúcares al 10% (sucrosa, glucosa, manitol, fructosa, lactosa, almidón, inulina, L (-) ramnosa, rafinosa, L (+) arabinosa) esterilizada por filtración (0.2 µm tamaño del poro) a un medio base (caldo) compuesto de: 900 mL de agua destilada, 1 g KCl, 17.5 g NaCl, 1 g KNO3, 0.2 g MgSO4x7H20, 1 g (NH4)2HPO4 y 0.5 g KH2PO4, ajustado a un pH de 7.5. Los cultivos que presentaron crecimiento (turbidez) después de una incubación por 7 días a 37°C se consideraron como positivos. 16 Para determinar la producción de ácido a partir de carbohidratos se utilizó un medio consistente de 100 mL de una solución de diferentes azúcares al 10% (glucosa, lactosa, fructosa, manitol, sucrosa) esterilizada por filtración (0.2 µm tamaño del poro) el cual se mezcló con un medio base (Leifson, 1963) autoclavado, compuesto de: 900 mL de agua de mar artificial, 0.1 g extracto de levadura, 1 g peptona, 0.5 g (NH4)2 SO4 y 10 mL de una solución de rojo fenol al 0.1%(10 mL agua destilada y 0.01 g rojo fenol), ajustado a pH 7.5. Posteriormente este medio preparado se dispensó en tubos venoject en volúmenes de 5 mL. Los cultivos que presentaron cambio de coloración de rojo a amarillo y turbidez después de una incubación por 7 días a 37°C se estimaron como positivos. 3.2.3 Determinación de pH, temperatura y salinidad óptima de la cepa U38 Para determinar las condiciones óptimas de crecimiento de la cepa bacteriana se utilizó caldo marino-agua de mar artificial (CMAA), el cual contiene 5 g de peptona, 1 g de extracto de levadura y 1 L de agua de mar artificial (14 g NaCl 0.3 M, 4.8 g MgSO4 0.05 M, 1.18 g CaCl2 0.01 M, 0.60 g KCl 0.01 M, 20 mL Tris 0.025 M). Para determinar el pH óptimo, matraces de 250 mL conteniendo 100 mL de CMAA ajustado a diferentes pH (5, 6, 7, 7.5 y 8) se inocularon con 10 µl de un cultivo nocturno de la cepa U38. Los cultivos se incubaron a 37°C bajo agitación constante (150 rpm), y a diferentes horas de crecimiento (0, 6, 9, 24, 27, 30 y 33) para cada pH se tomaron alícuotas de 1 mL de cada matraz y se midió la absorbancia a 600 nm. Para determinar la temperatura óptima, matraces de 250 mL conteniendo 100 mL de CMAA ajustado al pH determinado como óptimo (7.5), se inocularon con 10 µl de un 17 cultivo nocturno de la cepa U38. Los cultivos se incubaron a distintas temperaturas (10, 20, 28, 37 y 45°C) bajo agitación constante (150 rpm), y a diferentes horas de crecimiento (0, 6, 9, 24, 27, 30 y 33) para cada temperatura se tomaron alícuotas de 1 mL de cada matraz y se midió la absorbancia a 600 nm. Finalmente, para determinar la concentración de NaCl óptima, matraces de 250 mL conteniendo 100 mL de CMAA ajustado al pH determinado como óptimo (7.5), se inocularon con 10 µl de un cultivo nocturno de la cepa U38. Los cultivos se incubaron a distintas concentraciones de NaCl (0, 1.75, 3, 5 y 10 %) a la temperatura determinada como óptima (37°C) bajo agitación constante (150 rpm), y a diferentes horas de crecimiento (0, 6, 9, 24, 27, 30 y 33) para cada concentración de NaCl se tomaron alícuotas de 1 mL de cada matraz y se midió la absorbancia a 600 nm. 3.2.4 Preparación de extractos de la cepa U38 5 matraces de 1 L, cada uno conteniendo 500 mL de medio 2216 fueron inoculados con un cultivo nocturno de la cepa U38 e incubados a 28°C por 5 días. Posteriormente los cultivos fueron centrifugados a 15°C y 4,500 xg por 25 min y el sobrenadante se filtró a través de discos de nitrato de celulosa (milipore 0.45 µm). El sobrenadante filtrado se concentró en un matraz balón, eliminando el solvente (cloroformo) mediante rotavapor. Finalmente el extracto se resuspendió en 200 µl dimetilsulfóxido (DMSO). 18 3.2.5 Actividad antimicrobiana de extractos de la cepa U38 Discos de papel filtro (5 mm de diámetro) fueron impregnados con 20 µl del extracto (o diluciones de éste) y se depositaron sobre tapices en agar Mueller-hinton de S. aureus ATCC 25923, S. aureus no multidroga resistente (no-MDR), S. aureus multidroga resistente (MDR), K. pneumoniae MDR, A. MDR, E. coli ATCC 8733, M. smegmatis ATCC 14468, P. aeruginosa PAO1 y A. hydrophila o tapices de C. albicans en agar sabouraud. Para sembrar los tapices, los cultivos se ajustaron al estándar 0.5 McFarland. Las placas se incubaron a 37°C por 18-24 h para después registrar el diámetro de los halos de inhibición. 3.2.6 Análisis químico del metabolito de la cepa U38 Se hizo análisis cualitativo en cromatografía en capa fina (C.C.F) para verificar presencia de metabolitos secundarios utilizando como fase estacionaria una placa de silicagel (6 cm de largo y 2 cm de ancho) y como eluente una mezcla de tolueno, metiletil-cetona, metanol (8:1:1), finalmente las placas fueron reveladas bajo observación en lámpara UV, y en cámara de yodo. Para identificar presencia de grupos funcionales en los metabolitos presentes en el extracto se hizo análisis en espectrofotómetro FTIR. 19 4. RESULTADOS 4.1 Taxonomía de la cepa U38 4.1.1 Análisis filogenético de la cepa U38 Utilizando la secuencia del gen 16S rRNA de U38, secuencias de otras especies de Bacillus obtenidas desde la base de datos GenBank y utilizando el método de Neighbour-joining (Saitou y Nei, 1987) en el programa MEGA se construyó un árbol filogenético. El análisis filogenético demostró que la cepa bacteriana U38 corresponde al género Bacillus siendo las especies más cercanas (Figura 2) Bacillus pumilus ATCC 7061 (99 % similitud) y Bacillus safensis FO-036b (98,8 % similitud). 4.1.2 Caracterización morfológica y bioquímica de la cepa U38 La cepa bacteriana U38 corresponde a bacilo Gram (+), motil, que forma endosporas y se encuentra como células individuales o forma cortas cadenas. Sobre agar marino 2216 forma colonias de color crema, brillantes, de aproximadamente 3 mm de diámetro después de 5 días de incubación a 37 °C. El análisis fenotípico de la cepa U38, demostró que ésta produce ácidos a partir de la fermentación de glucosa (fermentación mixta), degrada urea produciendo amoniaco, utiliza como única fuente de carbono compuestos orgánicos, tales como azúcares: glucosa, sucrosa, lactosa, rafinosa, L(+) arabinosa y los aminoácidos, asparragina, L(+) cisteína. Además, la cepa U38 produce ácidos a partir de los carbohidratos, glucosa, sucrosa, fructosa y lactosa. Finalmente, la cepa U38 no posee la enzima triptofanasa (indol negativo) y posee actividad de ornitina descarboxilasa (Tabla 2). 20 Bacillus stratosphericus 41KF2a 99 Bacillus altitudinis 41KF2b Bacillus aerophilus 28K 100 Bacillus safensis FO-036b 97 98 Bacillus pumilus ATCC 7061 88 U38 Bacillus aerius 24K 80 99 Bacillus mojavensis IFO15718 Bacillus subtilis subsp. subtilis strain DSM 10 73 71 51 74 Bacillus atrophaeus JCM9070 Bacillus vallismortis DSM11031 Bacillus amyloliquefaciens NBRC 15535 Bacillus idriensis SMC 4352-2 12 Bacillus cibi JG-30 99 100 100 Bacillus indicus Sd/3 Bacillus marisflavi TF-11 Bacillus aquimaris TF-12 9 Bacillus shackletonii LMG 18435 50 Bacillus acidicola 105-2 90 92 Bacillus oleronius ATCC 700005 Bacillus litoralis SW-211 Bacillus foraminis CV53 33 Bacillus lentus NCIMB8773 Bacillus flexus IFO15715 31 Bacillus simplex DSM 1321 36 94 Bacillus asahii MA001 Brevibacillus brevis JCM2503 0.01 Figura 2. Dendrograma filogenético de la cepa U38 con las de cepas de Bacillus más estrechamente relacionadas, basado en el análisis de la secuencia del gen 16S rRNA y construido con el método Neighbour-Joinin. 21 Tabla 2. Características bioquímicas de la cepa U38. PRUEBAS Producción de ácido: Manitol Glucosa Sucrosa Fructosa Lactosa Utilización citrato Reduccion nitrato Producción de H2S Voges-Proskauer Rojo metilo Ureasa Utilización de: Manitol Glucosa Sucrosa Fructosa Lactosa Inulina Almidón Rafinosa L (-) Ramnosa L (+) Arabinosa Glicina Asparragina Ácido L-Glutámico L-Metionina L-Cisteína L-Tirosina Hidrólisis de: Almidón Gelatina Dnasa MIO: Motilidad Indol Ornitina CEPA U38 + + + + + + + + + + + + + + + 22 4.2 pH, temperatura y salinidad óptima de la cepa U38 Se determinaron las condiciones in vitro óptimas de crecimiento de la cepa bacteriana U38, para lo cual ésta se cultivó en CMAA a 150 rpm, variando el pH, temperatura y salinidad. Se determinó que las condiciones óptimas de crecimiento de la cepa U38 son un Absorbancia (600 nm) pH 7.5, una temperatura de 37° C y 1.75% concentración de NaCl (Figura 3). 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 0 6 9 24 27 30 33 Horas Figura 3. Curva de crecimiento de la cepa U38 en medio CMAA bajo las condiciones óptimas de cultivo: pH 7.5, temperatura de 37°C y 1.75% NaCl. Estas condiciones óptimas de crecimiento de la cepa obtenidas en la figura 3 se determinaron de la siguiente manera: Para determinar el pH óptimo de crecimiento, la cepa se cultivó en medio CMAA a diferentes pH (5, 6, 7, 7.5 y 8), manteniendo constante la temperatura (37°C) y salinidad (1.75 %), los resultados indican que el pH de crecimiento in vitro de la cepa U38 es 7.5 (Figura 4). En efecto, a pH 5 la fase exponencial y estacionaria comenzó más tardíamente que a pH 6, 7,7.5 y 8. Se obtuvieron los mayores valores de 23 crecimiento a pH 7 y 7.5. A 6 y 9 horas de crecimiento, la OD600 fue de (0.535, 0.880 a pH 7 y 0.601, 0.875 a pH 7.5), confirmando que el pH óptimo de crecimiento de la cepa U38 es 7.5. Para determinar la temperatura óptima de crecimiento, la cepa U38 se cultivó en medio CMAA a diferentes temperaturas (10, 20, 28, 37 y 45°C), manteniendo constante la salinidad (1.75 %) y el pH óptimo determinado (7.5). Los resultados indican que la temperatura de crecimiento in vitro de la cepa U38 es 37°C (Figura 5). A 10° C no hubo crecimiento y a 20 °C la fase exponencial y estacionaria comenzó más tardíamente que a 28, 37 Y 45° C. Se obtuvieron los mayores valores crecimientos a 37 y 45° C , aunque al evaluar los valores de absorbancia a las 6 y 9 horas de crecimiento ( 0.601, 0.875 a 37° C y 0.460, 0.550 a 45° C ) se confirmó que la temperatura óptima de crecimiento de la cepa U38 es 37 ° C. Para determinar la salinidad óptima de crecimiento, la cepa U38 se cultivó en medio CMAA a diferentes concentraciones de NaCl (0, 1.75, 3, 5 y 10 %), manteniendo constante la temperatura y el pH óptimo determinados anteriormente (37 °C, pH 7.5). A una salinidad de 1.75 % la absorbancia registrada a las 6 horas de crecimiento es mayor a la registrada a 3, 5 y 10 %. Es interesante notar que la cepa U38 creció bastante bien a 0 % de NaCl con valores comparables y en algunos puntos incluso mayores a los registrados a 1.75 % de NaCl (Figura 6). Por ejemplo, a las 6 h la OD600 a 0 % NaCl fue de 0.747 mientras que a 1.75 % fue de 0.601, pero a las 24 h, la absorbancia a 0 % NaCl fue de 1.240, mientras que a 1.75 % NaCl fue de 1.319. Sin embargo, considerando que la cepa U38 se aisló desde el ambiente marino se seleccionó 1.75 % NaCl como la concentración a utilizar en el resto del estudio. 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 0 Absorbancia (600 nm) Absorbancia (600 nm) pH 5.0 6 9 1,00 0,10 0,01 0,00 0 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 9 24 27 Horas Absorbancia 600 (nm) 6 10,00 24 27 30 33 Horas pH 7.0 0 pH 6.0 Absorbancia (600 nm) Absorbancia (600 nm) 24 30 6 9 24 27 Horas 30 33 pH 7.5 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 0 33 6 9 24 27 30 33 Horas pH 8.0 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 0 6 9 24 27 30 33 Horas Figura 4. Crecimiento a diferentes pH de la cepa U38. Los valores son el promedio ± desviación estándar de 3 experimentos independientes. 10 C Absorbancia (600 nm) Absorbancia (600 nm) 25 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 0 6 9 24 27 30 20 C 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 33 0 6 9 28 C 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 0 6 9 24 27 30 33 Horas Absorbancia (600 nm) Absorbancia (600 nm) Horas 24 27 30 37 C 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 33 0 6 30 33 Horas 9 24 27 Horas 30 33 Absorbancia (600 nm) 45 C 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 0 6 9 24 27 Horas Figura 5. Crecimiento a diferentes temperaturas de la cepa U38. Los valores son el promedio ± desviación estándar de 3 experimentos independientes. 0 % NaCl Absorbancia (600 nm) Absorbancia (600 nm) 26 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 0 6 9 24 27 30 1,75 % NaCl 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 0 33 6 9 Absorbacia (600 nm) Absorbancia (600 nm) 3 % NaCl 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 9 24 27 Horas Absorbancia (600 nm) 6 27 30 33 Horas Horas 0 24 30 5 % NaCl 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 33 0 6 9 24 27 30 33 Horas 10 % NaCl 10,00 1,00 0,10 0,01 0,00 0 6 9 24 27 30 33 Horas Figura 6. Crecimiento a diferente concentración de NaCl de la cepa U38. Los valores son el promedio ± desviación estándar de 3 experimentos independientes. 27 4.3 Actividad antimicrobiana contra microorganismos patógenos Extractos crudos de la cepa U38 presentaron actividad contra S. aureus ATCC 25923, S. aureus no multidroga resistente (no-MDR), S. aureus multidroga resistente (MDR), E. coli ATCC 8733, M. smegmatis ATCC 14468. Sin embargo los extractos de U38 no exhibieron actividad contra K. pneumoniae MDR, A. MDR, P. aeruginosa PAO1, A. hydrophila y C. albicans (Tabla 3 y Figura 7) Tabla 3. Inhibición de microorganismos de referencia por extracto de la cepa U38. (0: Sin actividad) Microorganismo Diámetro halo de inhibición (cm) Staphylococcus aureus ATCC 25923 Staphylococcus aureus non-MDR Staphylococcus aureus MDR Escherichia Coli ATCC 8733 Mycobacterium smegmatis ATCC 14468 Klebsiela pneumoniae MDR Acinetobacter MDR Pseudomonas aeruginosa PAO1 Aeromonas hydrophila Candida albicans 2,6 2,3 1,5 1,3 1,2 0 0 0 0 0 Asimismo, se probaron distintas concentraciones del extracto de la cepa U38 y se ensayaron contra las cepas de prueba S. aureus ATCC 25923 y M. smegmatis ATCC 14468 (Tabla 4). Los resultados muestran que si bien el extracto de la cepa U38 mostró actividad contra ambas bacterias Gram positivas, es contra S. aureus ATCC 25923 donde el extracto muestra su mayor potencia, observándose halos de inhibición a muy bajas concentraciones (Figura 8,9 y Tabla 4). 28 Tabla 4. Diámetros de halos inhibición de microorganismos de referencia por extracto de la cepa U38. Microorganismo Concentración de extracto (mg/mL) Diámetro de inhibición (cm) 26 13 6,5 3,2 1,6 0,8 2,6 2,2 1,9 1,5 1,1 0,8 26 13 6,5 3,2 1,6 0,8 1,0 0 0 0 0 0 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Mycobacterium smegmatis ATCC 14468 29 Figura 7. Actividad antibacteriana de los extractos crudos de la cepa U38 contra cepas de referencia. A) Escherichia coli ATCC 8733. B) Staphylococcus aureus noMDR. C) Y D) Staphylococcus aureus MDR. E) Mycobacterium smegmatis ATCC 14468. F) Staphylococcus aureus ATCC 25923. 30 Figura 8. Actividad antibacteriana de diferentes concentraciones del extracto de la cepa U38 contra Staphylococcus aureus ATCC 25923. A) 5 µl de extractos crudos (26 mg de peso seco / mL). B) 5 µl de extractos crudos (13 mg de peso seco / mL). C) 5 µl de extractos crudos (6.5 mg de peso seco / mL). D) 5 µl de extractos crudos (3.2 mg de peso seco / mL). E) 5 µl de extractos crudos (1.6 mg de peso seco / mL). F) 5 µl de extractos crudos (0.8 mg de peso seco / mL). Figura 9. Actividad antibacteriana del extracto de la cepa U38 contra Mycobacterium smegmatis ATCC 14468. A) 5 µl de extractos crudos (26 mg de peso seco / mL). 31 4.4 Análisis químico del metabolito de la cepa U38 Se analizó químicamente el extracto de la cepa U38 y mediante cromatografía en capa fina se observó la presencia de tres metabolitos (Figura 10 y 11). Figura 10. Componentes de la cepa U38 observados en cromatografía en capa fina bajo lámpara UV. Eluente tolueno, metil-etil-cetona, metanol (8:1:1). Figura 11. Componente de la cepa U38 revelado en cámara con yodo. 32 A través de espectroscopía infrarrojo (IR) se determinó la presencia de moléculas de una banda característica de compuestos nitrogenados a 3650 cm (Figura 12). 3650 cm-1 Figura 12. Espectroscopía infrarrojo (IR) del extracto de la cepa U38. -1 33 5. DISCUSIÓN El aumento de la resistencia de bacterias patógenas a los antibióticos existentes se ha convertido en un problema para la salud pública. En este contexto, nuevas fuentes de antimicrobianos, tales como microorganismos acuáticos y de ambientes extremos, están comenzado a captar la atención de los científicos (Lo Giudice et al.2007). Una gran diversidad de compuestos que presentan bioactividad han sido aislada de organismos marinos. Sin embargo, aún existe poca información sobre los productos naturales marinos en comparación con los productos naturales de los organismos terrestres los que han sido investigados por muchos años (Xue et al., 2004). El medio ambiente marino es una rica fuente de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI), polisacáridos, minerales, vitaminas, antioxidantes, enzimas y péptidos bioactivos. Algunos de estos péptidos bioactivos pueden tener potencial para la promoción de la salud humana y la reducción de riesgo de enfermedades (Kim & Wijesekara 2010). Las algas pueden ser clasificadas en dos grupos principalmente, en microalgas que incluye algas verdes azuladas, dinoflagelados, diatomeas, etc. y en macroalgas (algas marinas) que incluye las algas verdes, pardas y rojas. Las algas rojas son consideradas como la fuente más importante de muchos metabolitos biológicamente activos en comparación con otras clases de algas (Ali A. El Gamal, 2010). Asimismo, bacterias marinas epibiontes aisladas de la superficie de las algas marinas están 34 atrayendo la atención como una nueva fuente potencial de nuevos productos bioactivos (Yan et al., 2012) En el presente estudio, se ensayó la actividad antimicrobiana de una cepa bacteriana aislada del alga Ulva lactuca, la cual se identificó perteneciente al género Bacillus. Especies de Bacillus son muy abundantes en la naturaleza, siendo aisladas de ambientes tan diversos como el agua dulce, agua salada, suelo, plantas y animales. (Maughan & Van der Auwera 2011). La secuencia del gen 16S rRNA de la cepa U38 marina mostró la mayor similitud con las secuencias de especies B. pumilus ATCC 7061 y B. safensis FO-036b. Las condiciones óptimas de crecimiento in vitro de la cepa marina U38 es un pH de 7.5, una temperatura de 37°C y una salinidad de 1.75%. Estas condiciones están en el rango reportado para otras especies de Bacillus. Por ejemplo, estudios fenotípicos con Bacillus marismortui (Arahal et al., 1999), indican un crecimiento entre pH 6.0 y 8.5 y ausencia de crecimiento sobre los 50°C. Por su parte un estudio de Bal et al. (2009) con 16 especies de Bacillus marinos, reporta un crecimiento en el rango de pH 6 – 8, una temperatura máxima de 40°C y porcentajes de NaCl inferiores al 10%. Referente a la salinidad la curva de crecimiento para 0 % y 1.75 % de NaCl es similar (Figura 6), sin embargo se consideró 1.75 % salinidad óptima debido a que el ensayo se realizó con una cepa bacteriana marina no terrestre. Según León et al. (2007) las bacterias epibiontes de origen marino no presentan crecimiento en ausencia de NaCl. En otro estudio Jain et al., (2010) mostró que la cepa Bacillus SM2014 tolera una concentración de sal de 0% a 15%. 35 Extractos apolares obtenidos de la cepa marina U38 presentaron actividad antimicrobiana tanto contra bacterias Gram negativas como positivas (S. aureus ATCC 25923, S. aureus no-MDR, S. aureus MDR, E. coli ATCC 8733 y M. smegmatis ATCC 14468). Investigadores de otras latitudes también han reportado bacterias epibiontes de Ulva lactuca con actividad antiestafilocócica. Vijayalakshmi et al. (2008) aislaron 182 cepas de bacterias desde la superficie de las algas marinas Chaetomorpha linoids, U. lactuca, Enteromorpha compressa y Gracilaria edulis, de las cuales 32 se obtuvieron desde U. lactuca, de las cuales sólo 3 inhibieron el crecimiento de la S. aureus multirresistente y sólo una cepa inhibió el crecimiento de K. pneumoniae multirresistente. Por su parte Nagao et al. (2001) identificaron 2 nuevas macrolactinas desde una cepa marina de Bacillus aisladas desde el alga Schizymenia dubyi. Estas macrolactinas mostraron actividad contra B. subtilis y S. aureus, pero no contra E. coli. Álvarez (2010) señala que de 47 cepas marinas aisladas de la U. lactuca, sólo 5 cepas tenían actividad antimicrobiana sobre la bacteria patógena S. aureus ATCC 25984. Yilmaz et al., (2006) señala que el genero Bacillus tienen efectos antimicrobianos en particular contra las bacterias Gram-positivas de prueba. Bacillus marinos con actividad antimicrobiana se han aislado en distintas latitudes. Por ejemplo, Mondol et al., (2011) determinaron la presencia de los ácidos grasos antimicrobianos (leodomycins A y B) desde cultivos de una cepa de Bacillus sp, aislada desde sedimentos de arrecifes de coral en Corea. Por su parte, Berrue et al. (2009) aislaron una cepa de Bacillus pumilus (SP21) desde muestras de sedimento de las Bahamas, identificando una serie de lipopéptidos bioactivos con actividad 36 antibacteriana. Asimismo, Das et al. (2008) identificaron biosurfactantes lipopéptidos con actividad contra bacterias Gram positivas y negativas a partir de cultivos de una cepa de Bacillus circulans marino. Muchas de las moléculas aisladas desde bacterias marinas poseen cualidades extraordinarias, como su halogenación, siendo notable la presencia de átomos de cloro o bromo. Esta halogenación rara vez se encuentra en metabolitos de origen terrestre (Mancilla, 2003). En este sentido, futuros estudios con estas cepas deben incluir una etapa de optimización de la obtención del metabolito bioactivo, el cual considere no sólo el cultivo a diferentes temperaturas, pH y salinidad, sino que también el uso de diferentes medios de cultivo (López, 2012). Finalmente, se acepta la hipótesis que la cepa marina U38 (Bacillus sp) exhibe actividad anti-micobacteriana, inhibiendo el crecimiento de M. smegmatis. 37 6. CONCLUSIONES El análisis de la secuencia del gen 16S rRNA de la cepa U38 mostró un 99% de similitud con las especies Bacillus pumilus ATCC 7061 y un 98,8% Bacillus safensis FO-036b. La cepa U38 ejerce actividad inhibitoria frente a bacterias Gram-negativas y gram-positivas, incluyendo Escherichia coli, Mycobacterium smegmatis y Staphylococcus aureus. La cepa U38 presenta un pH óptimo de 7.5, una temperatura óptima de crecimiento de 37°C y 1.75% de NaCl. El extracto de la cepa U38 presentó tres metabolitos determinándose la presencia de compuestos nitrogenados. Los resultados de la presente investigación revelan que la asociación alga- bacteria son una fuente prometedora de metabolitos antimicrobianos que se han de profundizar. Se acepta la hipótesis de trabajo, que la cepa marina U38 (Bacillus sp) exhibe actividad anti-micobacteriana, inhibiendo el crecimiento de Mycobacterium smegmatis. 38 7. REFERENCIAS Ali A. El Gamal. (2010) Biological importance of marine algae. Saudi Pharmaceutical Journal 18: 1–25. Alvarez, C. (2010) Actividad antimicrobiana de bacterias asociadas al alga Ulva lactuca. Tesis Licenciatura en Ciencias, Universidad Austral de Chile. 64 p. Arahal, D., Márquez, C., Volcani, B., Schleifer, K. and Ventosa, A. (1999) Bacillus marismortui sp. nov., a new moderately halophilic species from Dead Sea. International Journal of Systematic Bacteriology 49: 521-530. Bal, S., Mishra, R., Rath, B., Sahu, H. and Thatoi, H. (2009) Characterization and extracellular enzyme activity of predominant marine Bacillus spp. isolated from sea water of Orissa Coast, India. Malaysian Journal of Microbiology 5: 87-93. Berrue, F., Ibrahim. A., Boland, P. and Kerr, R. 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