CLART® HPV4 GENOTIPADO DE PAPILLOMAVIRUS HUMANO MEDIANTE IDENTIFICACIÓN GENÓMICA PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO 1 CLART® HPV4 CLART® PAPILLOMAVIRUS HUMANO 4 o CLART® HPV4 está bajo la protección de 2 familias de patentes correspondientes a las solicitudes de Patente Internacional PCT WO2007017699 y WO2011116797. Dichas familias comprenden miembros que han entrado en fase nacional y regional en distintos territorios, entre los cuales se incluyen patentes concedidas en España, Alemania, Dinamarca, Francia, Italia, Suecia, Rusia, Méjico, China e Israel, y solicitudes de patente en tramitación en Brasil y Canadá. CLART®, CLART-Strip®, CAR®, SAICLART® y AUTOCLART® son Marcas Registradas por GENOMICA. GENOMICA, S.A.U. Parque Empresarial Alvento, Edificio B Calle Vía de los Poblados, 1 – 1ª planta 28033 Madrid, España www.genomica.com Versión 3 Junio 2015 2 ÍNDICE: 1. GLOSARIO DE TÉRMINOS 2. DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO 3. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT 3.1. Reactivos de amplificación 3.2. Reactivos de visualización 3.3. Otros componentes 4. MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO 4.1. Reactivos y material 4.2. Equipos 5. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN 5.1. Recomendaciones generales 5.2. Precauciones para la visualización 6. TOMA DE MUESTRAS 6.1. Frotis 6.2. Suspensiones celulares 7. PROTOCOLO DE TRABAJO 7.1. Procesamiento de la muestra sin necesidad de extracción del ADN. 7.2. Reacción de amplificación 7.3. Visualización del producto amplificado en CLART-Strip® (CS) 7.3.1. Visualización manual. 7.3.2. Visualización en autoclart® 8. LECTURA DE RESULTADOS 9. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 10. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO 11. BIBLIOGRAFÍA 12. TABLAS 3 1. GLOSARIO DE TÉRMINOS Atención, ver instrucciones de uso Fecha de caducidad Producto sanitario para Diagnóstico In Vitro Lote 25ºC Conservar a temperatura ambiente 20ºC 8ºC Conservar entre 4 ºC y 8 ºC 4ºC -18ºC Conservar entre –30 ºC y –18 ºC -30ºC 4 2. DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO El kit está basado en la amplificación de fragmentos específicos del genoma vírico y su posterior hibridación con sondas específicas para cada tipo de PVH. CLART® Papillomavirus humano 4 es capaz de detectar infecciones y coinfecciones de hasta 35 genotipos en un único tubo, lo que conlleva un amplio número de ventajas: Su alta sensibilidad permite la detección de cantidades mínimas de ADN vírico sin necesidad de una extracción compleja. La elevada especificidad, al utilizar una secuencia correspondiente a una región altamente conservada dentro del genoma vírico y sondas de captura específicas para cada tipo de PVH. Fácil de estandarizar en un laboratorio hospitalario. Rapidez, se obtienen los resultados de los análisis en 4 h. CLART® Papillomavirus humano 4 detecta la presencia de los 35 virus de PVH (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 68a y b, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, 85 y 89) con mayor importancia clínica, en distintos tipos de muestras humanas (frotis, suspensiones celulares y muestras en medio de captura de híbridos). La detección se lleva a cabo mediante la amplificación de un fragmento de unos 450 pb dentro de la región L1 del virus por tratarse de una secuencia que está altamente conservada entre los distintos tipos de PVH. Sin embargo, esta región presenta suficientes variaciones como para poder diferenciar cada tipo de virus con sondas específicas. De esta manera, se asegura la especificidad de la detección. La detección del producto amplificado por PCR se lleva a cabo mediante una nueva plataforma tecnológica basada en microarrays de baja densidad: CLART® (Clinical Arrays Technology). La plataforma se fundamenta en un principio muy sencillo pero a la vez muy cómodo y eficaz que consiste en incluir un microarray en el fondo de un pocillo de placa microtiter, lo que simplifica todo el proceso de hibridación y visualización frente a los sistemas de arrays clásicos. La Figura 1 muestra un CLART-Strip® o CS de 8 pocillos. Figura 1. Plataforma CLART-Strip® en forma de tira de 8 pocillos. 5 El sistema de detección con CLART® Papillomavirus humano 4 se basa en la precipitación de un producto insoluble en aquellas zonas del microarray en las que se produce la hibridación de los productos amplificados con las sondas específicas. Durante la PCR, los productos amplificados se marcan con biotina. Después de la amplificación, estos productos se hibridan con sus respectivas sondas específicas que están inmovilizadas en zonas concretas y conocidas del microarray, tras lo que se incuba con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa. El conjugado se une a través de la estreptavidina con la biotina presente en los productos amplificados (que a su vez se encuentran unidos a sus sondas específicas) y la actividad peroxidasa provoca la aparición de un producto insoluble en presencia del sustrato o-dianisidina, que precipita sobre las zonas del microarray en las que ocurre la hibridación (Figura 2). 6 Productos marcados Sondas en el array Biotina Hibridación Incubación con conjugado Conjugado Precipitación específica Reacción de revelado Figura 2: Esquema del método de visualización. Las sondas, inmovilizadas sobre la superficie, capturan sus productos amplificados complementarios marcados con biotina. A través de la biotina, se une el conjugado, en este caso estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano, HorseRadish Peroxidase). El sustrato o-dianisidina por la acción de la HRP, produce un precipitado sobre la zona en la que se produce la hibridación. 7 3. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT El kit CLART® Papillomavirus humano 4 contiene suficientes reactivos para el análisis de 16, 48 ó 96 muestras clínicas. Los reactivos incluidos en el kit se han agrupado en varias cajas, dependiendo de la temperatura a la que se han de conservar. Todos los reactivos son estables en las condiciones indicadas de conservación hasta la fecha de caducidad indicada. 3.1. Reactivos de amplificación Los reactivos de amplificación se envían a -20 ºC. Son los siguientes: Tubos de Amplificación contienen 45 µl de mezcla de reacción. Están listos para su uso y deben mantenerse a -20ºC. Sólo se deben descongelar sobre hielo el número preciso de tubos de amplificación que se vayan a procesar, conservando el resto de los tubos a la temperatura indicada. Nota: En la caja del kit se incluye un indicador adhesivo e irreversible de temperatura; la aparición de un color rojizo en la ventana de visualización indica que en algún momento los productos han sobrepasado la temperatura de conservación de –20oC y no deben utilizarse. 3.2. Reactivos de visualización El kit de visualización se envía a 4 ºC. ¡ADVERTENCIA!: Una vez recibido el kit, las tiras CLART-Strip® (CS) deben conservarse a temperatura ambiente. Tiras CS (incluyendo las sondas específicas). Se suministran en un sobre termosellado. Conservar siempre cerrado (máx. 25ºC), a temperatura ambiente y protegido de la luz. SH (Solución de Hibridación). Conservar a 4ºC DC (Diluyente de Conjugado). Conservar a 4 ºC. CJ (Conjugado). Conservar a 4 ºC. RE (Solución de Revelado). Conservar a 4 ºC y protegido de la luz. TL (Tampón de Lavado). Conservar a 4 ºC. Soporte y tapa para tiras de 8 pocillos. 3.3. Otros componentes Para la captura y posterior procesamiento de la imagen se necesitan los siguientes componentes: Lector CAR® (CLINICAL ARRAY READER): permite la lectura e interpretación automática de hasta 12 tiras de arrays CS, es decir, de hasta un máximo de 96 muestras. 8 SAICLART®: software desarrollado por GENOMICA para el procesamiento de imágenes. Software específico del kit CLART® HPV4 diseñado y validado por GENOMICA. Figura 3. CAR® (CLINICAL ARRAY READER) 4. MATERIAL REQUERIDO, NO SUMINISTRADO 4.1. Reactivos y material Agua destilada. Etanol 96% Guantes desechables. Puntas de pipeta con filtro o desplazamiento positivo. Recipiente con hielo picado. Tubos tipo Eppendorf de 1,5 ml autoclavados. Gradillas para tubos de 1,5 ml. Soporte para tubos de 0,5 ml/0,2 ml. Suero salino (0.9% NaCl). 4.2. Equipos autoclart® (figura 4) Este equipo se necesita para la visualización automática El autoclart® permite el procesado automático de la fase de visualización de hasta 12 tiras de arrays CS, es decir, de hasta un máximo de 96 muestras. 9 Figura 4. autoclart® Microcentrífuga. Termociclador. Cabina de flujo laminar para el laboratorio de extracción- adición de muestra Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl para el laboratorio de extracción (Pre-PCR) Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl para el laboratorio de visualización ( Post-PCR) Termobloque con agitación ajustable a 25°C, 30°C y 65 ºC. Compatible con placas de 96 pocillos. Vortex. Sistema de vacío (opcional). 5. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN ¡Muy importante para evitar contaminaciones! Leer detenidamente antes de comenzar la técnica. 5.1. Recomendaciones generales: 1. La técnica se debe realizar en dos áreas separadas físicamente, para evitar la contaminación de las muestras con el producto amplificado anteriormente. Cada una de las áreas debe tener su propio material de trabajo identificado (pipetas, puntas, tubos, gradillas, guantes, etc.) y nunca debe salir de cada una de ellas. 1. Área pre-PCR: En este área se hace la preparación de las muestras y la adición del material a los tubos de amplificación. Dicha preparación de las muestras debe realizarse dentro de una cabina adecuada y con las medidas de esterilización más amplias posibles para evitar contaminaciones. 2. Área post-PCR: En esta área se lleva a cabo la amplificación y la visualización del producto amplificado. El material de esta área nunca ha de entrar en contacto con el del área de extracción. Evitar ir al área de pre-PCR después de haber estado trabajando en el área de visualización. 10 2. Utilizar guantes en todo momento. Es recomendable cambiarse de guantes con cierta frecuencia y obligatoriamente cada vez que se empieza a trabajar en las áreas antes descritas. Siempre hay que utilizar guantes nuevos cuando se añada el ADN a los tubos de amplificación. 3. Limpiar las zonas de trabajo (poyatas, campanas, gradillas, pipetas) en profundidad con lejía diluida al 10% cada vez que se procese una tanda de muestras, y obligatoriamente después de una contaminación. En el caso de termocicladores y termomixers, se recomienda limpiarlos antes y después de su uso, en estas mismas condiciones. 4. Emplear siempre puntas con filtro y pipetas de desplazamiento positivo para evitar contaminaciones debidas a la micropipeta. Se debe trabajar con un juego de pipetas para cada área. 5. Emplear material de laboratorio desechable y autoclavado. 6. Nunca mezclar reactivos de dos tubos diferentes, aunque sean del mismo lote. 7. Cerrar los tubos de reactivos inmediatamente después de su uso para evitar contaminaciones. 8. Desechar la punta de la micropipeta tras cada pipeteo. 9. GENOMICA no se hace responsable de los resultados obtenidos con el kit si se emplean otras muestras distintas a las indicadas. 5.2. Precauciones para la adición del material al tubo de amplificación. 1. Utilizar guantes en todo momento. 2. Limpiar las superficies de trabajo de la cabina con lejía diluida al 10%. 3. Encender el flujo laminar y la luz UV al menos 20 minutos antes de comenzar la extracción. Apagar la luz UV cuando se esté trabajando dentro de la cabina. 4. La preparación de las muestras debe hacerse dentro de la cabina. 5.3 Precauciones para la visualización 1. Evite que la punta de la pipeta o del sistema de vacío toque el fondo del pocillo, ya que podría dañarse el microarray situado en el fondo/pocillo. 2. Se recomienda añadir cada solución sobre la pared del pocillo CS, nunca directamente sobre el fondo. 3. Es conveniente no añadir la solución SH hasta que se vayan a añadir los productos desnaturalizados de PCR. 4. El array no debe quedar seco. 11 5. Tras la incubación con la solución CJ, es muy importante lavar bien el microarray para evitar que queden restos de éste y que reaccionen con la solución RE, produciendo un precipitado inespecífico que pueda dar lugar a interpretaciones erróneas del resultado. 6. Evite burbujas sobre la superficie del microarray al añadir cualquiera de las distintas soluciones. 7. Al visualizar la imagen en el lector, comprobar que aparezcan los marcadores de posición y que no haya burbujas o manchas que interfieran en la lectura. En caso contrario, limpiar el fondo del pocillo con un papel de celulosa impregnado de alcohol. 6. TOMA DE MUESTRAS 6.1. Frotis Tomar la muestra con una torunda seca y estéril, de algodón o alginato, lo suficientemente grande como para obtener una buena cantidad de muestra. No utilizar dispositivos que produzcan el sangrado de la lesión. Volver a introducir la torunda en su tubo sin ningún tipo de medio. Conservar la muestra a 4ºC si se va a procesar antes de 7 días o a –20ºC si se va procesar después. 6.2. Suspensiones celulares Estas suspensiones celulares son del tipo de las utilizadas para realizar citologías cervicovaginales de capa fina por filtración a través de membranas (ThinPrep®). Tomar la muestra con un cepillo o espátula. Resuspender la muestra agitando el dispositivo utilizado en un vial con medio de transporte. Desechar el dispositivo utilizado y conservar la muestra a 4ºC hasta su procesamiento. 7. PROTOCOLO DE TRABAJO Las muestras pueden ser procesadas directamente. A continuación se muestran los distintos protocolos. 7.1. Procesamiento de la muestra sin necesidad de extracción de ADN 7.1.1. Torunda seca Añadir 1.5 ml de Suero Salino. Vortexear bien. Está listo para la reacción de amplificación. En el caso de que la torunda haya sido extraída de manera previa, no añadir nuevamente 1.5ml de suero salino, sino tomar 5 µl de suero remanente para la PCR. 7.1.2. Medio de Captura de Híbridos 12 Tomar 200 µl de muestra en un tubo de 1.5 ml. Centrifugar 1 min a 4.000rpm. Tirar el sobrenadante. Añadir 1 ml de suero salino, vortexear bien y mezclar, centrifugar 1 min a 4.000rpm. Tirar el sobrenadante. Añadir 1 ml de suero salino, vortexear bien y mezclar, centrifugar 1 min a 4.000rpm. Tirar el sobrenadante. Resuspender en 50 µl de agua DNAsa free. 7.1.3. Suspension celular_ ThinPrep Tomar 400 µl de suspensión celular en un tubo de 1.5ml. Centrifugar 1 min a 13.000rpm. Tirar el sobrenadante. Resuspender en 400 µl de Suero Salino. Centrifugar 1 min a 13.000rpm. Tirar el sobrenadante. Resuspender en 25 µl de agua DNAsa free. 7.2. Reacción de amplificación Recomendaciones específicas para la amplificación: Trabajar en el área pre-PCR, siempre en campana y siguiendo las recomendaciones del punto 5.1. Añadir la muestra directa procesada según el punto 7.1, siempre en campana y siguiendo las recomendaciones del punto 5.1. Durante el proceso mantener los tubos separados y en hielo. 1. Descongelar un Tubo de Reacción por cada muestra que se va a estudiar y mantenerlos en hielo. No usar temperaturas superiores a 37ºC para la descongelación. 2. Centrifugar unos segundos los Tubos de Reacción en la microcentrífuga para que quede todo el líquido en el fondo del tubo (si no se dispone de adaptadores de microcentrífuga para los Tubos de Reacción, se pueden utilizar en su lugar tubos de un tamaño mayor a los que se les haya cortado la tapa). 3. Añadir 5 µl de las muestras a los Tubos de Reacción y resuspender varias veces con la micropipeta. Dejar los tubos en el hielo. 4. Programar en el termociclador los siguientes ciclos de temperaturas: 1 ciclo 98ºC 5 min 98ºC 15 seg 55ºC 15 seg 45 ciclos 72ºC 30 seg 13 1 ciclo 72ºC 1 min 4ºC continuo hasta la recogida de tubos 6. Arrancar el programa y colocar los Tubos de Reacción en el termociclador. La duración de la amplificación es de unas 2 horas, aunque puede variar ligeramente dependiendo del termociclador. Esta técnica únicamente ha sido validada en termocicladores con rampas estándar, no rápidas. 7.4. Visualización del producto amplificado en CLART-Strip® (CS) Recomendaciones específicas antes de comenzar la visualización: EL PROTOCOLO DESCRITO A CONTINUACIÓN SE DEBE REALIZAR SIEMPRE EN EL ÁREA POST-PCR. NUNCA LLEVAR EL PRODUCTO AMPLIFICADO AL ÁREA DE PREPCR. 1. Encender el CAR® (CLINICAL ARRAY READER) al comienzo del proceso. La autocalibración del equipo tarda unos minutos y es necesario además introducir el nombre de las muestras de cada pocillo en el programa antes de la lectura. 2. Asegurarse, de que antes de comenzar la hibridación el termomixer de placas ha estado a 65ºC al menos 30 minutos. 3. Atemperar la SH (solución de hibridación) a temperatura ambiente hasta la desaparición de los cristales. En el caso de que siga habiendo cristales, introducirlo en el termomixer mientras se calienta para la hibridación. 4. Preparar el tampón de lavado antes de cada ensayo, no reutilizar soluciones o restos preparadas con anterioridad. 5. Usar una punta con filtro diferente para cada pocillo y cambiarla cada vez que se añada un reactivo. 6. En el caso de utilizar bombas de vacío equipadas con peines de 8 puntas para aspirar las soluciones, desechar los peines después de cada uso o descontaminarlos con una solución de lejía diluida al 10% tras cada ensayo. Asegurarse de que la bomba aspira adecuadamente y no deja restos en el fondo del pocillo. 7. Aspirar completamente las diferentes soluciones dentro de los pocillos sin tocar el array. 7.4.1. Visualización manual. 1. Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los productos de PCR. Para este paso, colocar los tubos amplificados en el termociclador e incubar 14 a 95ºC durante 10 minutos. Programar en el termociclador 15 minutos para que una vez transcurridos los 10 minutos los amplificados sigan a 95ºC. Sacar los tubos de la incubación a 95ºC y colocarlos inmediatamente en un recipiente con hielo. 2. Preparación de la Solución TL diluida: Por cada tira CS (8 pocillos en total), preparar 10 ml de solución de lavado diluida, añadiendo 1 ml de Solución TL a 9 ml de agua destilada. 3. Prelavado de los CS: antes de empezar el ensayo es necesario lavar los tubos AT añadiendo 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS, resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta multicanal, teniendo en cuenta que no se debe tocar la superficie del array. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vacío. El array debe quedar sin restos de solución, aunque nunca debe permanecer seco durante mucho tiempo. Añadir la siguiente solución inmediatamente. 4. Hibridación: Antes de usar la Solución SH, ésta debe estar a Tª ambiente. Una vez desnaturalizados los productos de PCR, añadir 100 µl de solución SH (evitar que se forme espuma) a cada pocillo de los CS. Añadir 10µl de producto de PCR desnaturalizado a cada pocillo de los CS, resuspender varias veces para que se mezcle con la solución de hibridación, con cuidado de no tocar el cristal. Incubar la tira cubierta con la tapa de plástico transparente en el termomixer de placa tapado durante 30 minutos a 65º C, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la Solución SH con pipeta o bomba de vacío. (Dejamos programado el termomixer de placa a 30º C y en movimiento para su utilización posterior en el paso 6. Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura). 5. Doble Lavado: usar puntas diferentes para cada pocillo en ambos lavados. Añadir 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS, resuspender de 10 a15 veces con la pipeta multicanal. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vacío multicanal. Repetir la operación. Si llegado a este paso, el termomixer no hubiera llegado a los 30º C, se dejan los pocillos con esta solución hasta que el termomixer alcance la temperatura. 6. Bloqueo y conjugado: 15 minutos antes de concluir la hibridación, se debe preparar la solución CJ diluida y mantener en hielo. Se recomienda centrifugar la solución CJ durante 10 segundos antes de usarla. A continuación, preparar la solución CJ diluida. Por cada CS, se añade 1 ml de solución DC y 9µl de Solución CJ. Se debe dar un vórtex a la solución una vez diluida para homogenizar. Desechar la Solución TL diluida sin dejar seco el array y añadir a cada pocillo del CS 100 µl de Solución CJ diluida. Incubar durante 15 minutos exactos en el termomixer de placa a 30º C, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la solución rápidamente con pipeta o bomba de vacío 15 multicanal. (Dejar programado el termomixer de placa a 25º C y en movimiento para su utilización posterior en el paso 8. Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura). 7. Triple Lavado: añadir inmediatamente 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS, resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta multicanal y desechar la solución con la pipeta o vacío sin dejar seco el array. Repetir la operación dos veces más. Es muy importante que no queden restos de Solución CJ ya que ésta reaccionaría con la Solución RE dando lugar a una señal inespecífica. 8. Revelado con Solución RE: quitar la solución TL diluida sin dejar seco el array, añadir 100 µl de solución RE a cada pocillo del CS e incubar 10 minutos a 25 º C en el termomixer de placa sin agitación. ¡Advertencia! Es muy importante utilizar el termomixer sin agitación 9. Desechar la Solución RE completamente con pipeta o vacío. El array debe quedar seco 10. CAR® (CLINICAL ARRAY READER): Coloque la placa en el CAR® para tomar las imágenes de todos los pocillos. Posteriormente serán analizadas automáticamente. 7.4.2. Visualización en autoclart® 1. Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los productos de PCR. Para este paso, colocar los tubos amplificados en el termociclador e incubar a 95ºC durante 10 minutos. Programar en el termociclador 15 minutos para que una vez transcurridos los 10 minutos los amplificados sigan a 95ºC. Sacar los tubos de la incubación a 95ºC y colocarlos inmediatamente en un recipiente con hielo. 2. Encender el equipo autoclart® y seguir las instrucciones que aparecen en la pantalla: 3. Cerrar la puerta y pulsar el mando. 4. Seleccionar Run en el menú de inicio. 5. Seleccionar el tipo de ensayo a realizar: HPV 4. 6. Seleccionar el pocillo de la tira en el que se desea comenzar: A1 o E1, en el caso de que se reutilice un CS donde se han procesado previamente los 4 primeros arrays. 16 7. Seleccionar el número de muestras. Con autoclart® se pueden procesar desde 4 a 96 muestras. El número de muestras debe ser un múltiplo de 4. 8. Confirmar que el número de muestras y el pocillo de inicio (A1 o E1) es correcto. 9. Colocar el rack completo de puntas en su posición correspondiente. 10. Chequear que el contenedor de puntas y el contenedor de desecho de reactivos están vacíos. 11. Llenar la botella de agua destilada con 250 ml de agua destilada. 12. Añadir los volúmenes de reactivos que autoclart® solicita en función del número de muestras que se quieran procesar: TL (Tampón de lavado). El volumen que aparece en la pantalla, indica la cantidad de TL diluido necesaria. Para preparar el TL diluido realizar una dilución 1:10 del TL en agua destilada. SH (Solución de Hibridación). Añadir el volumen de solución de hibridación atemperada que aparece en la pantalla. CJ (Conjugado). Se recomienda centrifugar el CJ durante 10 segundos antes de usarse. Cada 1 ml de solución CJ diluida que indique la pantalla se prepara añadiendo 1 ml de DC (Diluyente de conjugado) y 9µl de Solución CJ. Se debe dar un vórtex a la solución una vez diluida para homogenizar. RE (Revelado). Añadir el volumen de revelado indicado en la pantalla. 13. Cerrar la puerta y pulsar el mando para comenzar. El equipo realizará el pre-lavado de los CS y la adicción de la solución de hibridación, a continuación emitirá un pitido para indicar que es el momento de la adicción de las muestras, el pitido cesará cuándo el usuario abra la puerta del equipo. 14. Para añadir las muestras sacar los CS del autoclart® y adicionar 10µl de producto de PCR desnaturalizado a cada pocillo de los CS, resuspender varias veces para que se mezcle con la solución de hibridación, con cuidado de no tocar el fondo del pocillo. A continuación introducir de nuevo la placa en el autoclart® y pulsar el mando para que continúe el proceso de visualización. 15. Cuando ha terminado el proceso de visualización, el autoclart® emite un pitido hasta que el usuario abre la puerta del equipo para sacar los CS y proceder a la lectura en el CAR®. 16. CAR® (CLINICAL ARRAY READER): Coloque la placa en el CAR® para tomar las imágenes de todos los pocillos. Posteriormente serán analizadas automáticamente. 17 8. LECTURA DE RESULTADOS El procesamiento de los datos obtenidos a partir de cada uno de los análisis, se realiza de forma automática. El equipo de lectura y análisis presentará un informe en el que se indican los resultados. 9. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Uno de los inconvenientes de la detección por amplificación genómica son los falsos negativos debidos, bien a una calidad inadecuada del ADN de la muestra (por toma de cantidad insuficiente de muestra, por degradación del ADN debida a una incorrecta conservación o por pérdida del ADN de la muestra durante su extracción), o bien a la presencia de inhibidores de la ADN polimerasa en las muestras en las que se quiere analizar la presencia del virus (hemoglobina, restos de parafina, sales, etc). Con el kit CLART® Papillomavirus humano 4 se han eliminado estos falsos negativos gracias a la introducción de dos controles internos en el mismo tubo de reacción donde se analiza la muestra. Cada tubo de amplificación contiene los siguientes oligos: Un par de oligonucleótidos que amplifican un fragmento del gen CFTR humano. Éste es el control de extracción de ADN genómico o control del ADN del paciente. Un par de oligonucleótidos que amplifican un plásmido modificado incluido en el tubo de amplificación y que se usa como control de amplificación de la reacción de PCR. Oligonucleótidos específicos de PVH. El tubo de PCR se ha diseñado para favorecer la amplificación de PVH frente a la de los dos controles. En relación a estos últimos, la amplificación del control de ADN genómico prima sobre la del control de la reacción de amplificación. La razón de este diseño es: El control interno de ADN genómico es necesario para la confirmación de un verdadero resultado negativo, ya que nos informa de la presencia de ADN del paciente en la muestra, aunque no haya habido amplificación de ningún tipo de VPH. El control interno de amplificación nos permitirá distinguir entre los casos de inhibición de la reacción de PCR y aquéllos en los que no se encontró ADN en la muestra. En ciertas condiciones (ej. cuando hay un elevado número copias de un virus de PVH o cuando la muestra presenta varios tipos de PVH a la vez) puede suceder que no se amplifiquen los dos controles o alguno de ellos y aparezca una lectura de: SIN SEÑAL. Teniendo en cuenta estas observaciones, podemos considerar las siguientes interpretaciones de los resultados de lectura: 18 √. POSITIVO CONTROL GENÓMICO √ CONTROL DE AMPLIFICACIÓN √ x.NEGATIVO √ √ RESULTADO para algún genotipo INTERPRETACIÓN POSITIVO NEGATIVO Otros resultados validos: RESULTADO para algún gentipo √ POSITIVO √.POSITIVO x. NEGATIVO CONTROL GENÓMICO CONTROL DE AMPLIFICACIÓN RESULTADO VALIDO INTERPRETACIÓN √ SIN SEÑAL POSITIVO SIN SEÑAL SIN SEÑAL POSITIVO √ SIN SEÑAL NEGATIVO Aunque el control de amplificación se muestre SIN SEÑAL. Esto se debe al efecto de la competencia entre los tres tipos de ADN. Aunque ambos controles se muestren SIN SEÑAL. Esto se debe, bien a que hay una gran cantidad de copias de virus, o a un elevado número de genotipos de VPH presentes en la muestra. Éste se considera un RESULTADO VÁLIDO. En este caso podemos decir que se trata de un verdadero resultado negativo. Resultados considerados como un RESULTADO NO VÁLIDO: RESULTADO para algún gentipo x.NEGATIVO x. NEGATIVO CONTROL GENÓMICO SIN SEÑAL SIN SEÑAL CONTROL DE AMPLIFICACIÓN √ SIN SEÑAL INTERPRETACIÓN NO HAY ADN PCR INHIBIDA RESULTADO NO VALIDO SOLUCIÓN Se debe a que no hay ADN en la muestra. Repita la técnica desde la extracción o bien pedir al facultativo una nueva toma de muestra al paciente. Verifique que en las muestras o en el material genético extraído no hay presencia de ninguna de estas sustancias. En la mayoría de los casos se recomienda repetir la extracción o, si esto no es posible, pedir al facultativo una nueva toma de muestra al paciente. Esto se debe a que algunas sustancias pueden inhibir la reacción de PCR al perjudicar la actividad de la enzima ADN polimerasa. 19 Existen dos posibilidades que dan lugar a un resultado de VIRUS NO CONCLUYENTE: En aquellos casos en que las tres réplicas de una sonda sean muy distintas entre sí. En coinfecciones para aquellos virus que se encuentren en el límite de detección de la técnica. 10. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO CONTROL DE INTERFERENCIAS CONOCIDAS: Existen sustancias que pueden interferir en funcionamiento del kit CLART® Papillomavirus humano 4. Principalmente, son sustancias que inhiben la ADN polimerasa y, por tanto, la reacción de amplificación. Las interferencias más conocidas son: 1 Presencia de hemoglobina y exceso de detritos celulares. Al no realizarse una purificación de la muestra como tal, pueden producirse inhibiciones por exceso de hemoglobina o detritus que añadidos al tubo de amplificación provoquen una inhibición. 2 Presencia de ácido acético o iodina en la muestra a analizar. Si la toma de muestra para el análisis con el kit CLART® Papillomavirus humano 4 se realiza después de una colposcopia, esta muestra puede contener ácido acético o iodina, que inhiben la PCR. Para evitar esto, realizar la toma de muestra para el análisis con CLART® Papillomavirus humano 4 previamente a la colposcopia. 3 Utilización de muestras no adecuadas. El análisis de cualquier otro tipo de muestra clínica distinta a las indicadas en el manual del kit CLART® Papillomavirus humano 4, así como una toma incorrecta de las muestras, puede conllevar que el resultado del análisis no sea concluyente. Por ejemplo, si la torunda ha sido incluida en algún tipo de medio, la PCR puede resultar inhibida. 4 La conservación inadecuada de las muestras puede influir en el resultado del análisis. Si las muestras se someten a condiciones que puedan provocar una degradación del ADN que contienen, el resultado del análisis será de muestra inhibida por falta de amplificación del control del ADN de la muestra. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS: 1. Parámetros Analíticos: Sensibilidad analítica. La sensibilidad analítica se determinó mediante la amplificación de los fragmentos específica de la región L1 para los diferentes genotipos de VPH clonados en plásmidos recombinantes (columnas 102 copias y 10 copias). La sensibilidad para los tipos indicados en la tabla en la columna (50 copias) también fue determinada a partir de la detección de muestras del programa de evaluación de 20 herramientas de laboratorio para el tipado del PVH, de la organización mundial de la salud OMS (2013 WHO HPV LabNet Proficiency Study of HPV DNA Typing). GENOTIPO VPH 6 11 16 18 26 31 33 35 39 45 51 52 53 56 58 59 66 68a 68b 82 2 10 copias 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 50 copias (2013 WHO HPV) 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 10 copias 100% 80% 80% 80% 100% 100% 80% 60% 80% 80% 80% 100% 100% 80% 60% 80% 100% 80% 100% N=110 Tabla 1. Sensibilidad analítica del kit CLART® HPV4 kit Dado el significado clínico de los genotipos de VPH 16 y 18, se han incluido los datos de sensibilidad para esos tipos obtenidos a partir de la detección de muestras del programa de evaluación de herramientas de laboratorio para el tipado del VPH de la organización mundial de la salud OMS, además en la tabla 1 se muestra la sensibilidad de otros tipos incluidos en dicho panel. Este programa compara y evalúa las diferentes metodologías de detección de VPH comerciales disponibles para una efectiva implementación y monitorización de los programas de vacunación para VPH. Basado en este programa, se considera una herramienta como apta para el diagnóstico si detecta al menos 50 unidades internacionales (equivalentes genómicos o copias) de los tipos de VPH 16 y 18, hecho demostrado con CLART® Papillomavirus humano 4. 2. Parámetros de utilidad diagnóstica. Para determinar los parámetros de utilidad diagnóstica del nuevo kit CLART® Papillomavirus humano 4, se han realizado estudios comparativos frente a la versión HPV2. Dichos estudios se realizaron en colaboración con cuatro hospitales españoles. 21 Servicio de Microbiología del Hospital Universitari Germans Trias i Pujol de Badalona. Unidad de Virología del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Clínico San Carlos. Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Se analizaron 419 muestras de las cuales 88 fueron torundas secas, 101 muestras en medio de captura híbrida y 232 citologías líquidas tipo ThinPrep. En la siguiente tabla se ilustran los datos de sensibilidad y especificidad diagnósticas para los tipos de VPH detectados por el kit CLART® Papillomavirus humano 4 desde muestra directa sin necesidad de extracción de ADN: Tipo Tipo 6 Tipo 11 Tipo 16 Tipo 18 Tipo 31 Tipo 33 Tipo 35 Tipo 39 Tipo 40 Tipo 42 Tipo 43 Tipo 44 Tipo 45 Tipo 51 Tipo 52 Tipo 53 Tipo 54 Sensibilidad 100,0 83,3 100,0 100,0 93,8 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 92,6 97,1 100,0 Especificidad 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,5 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 Tipo Tipo 56 Tipo 58 Tipo 59 Tipo 61 Tipo 62 Tipo 66 Tipo 68 Tipo 70 Tipo 71 Tipo 72 Tipo 73 Tipo 81 Tipo 82 Tipo 83 Tipo 84 Tipo 89 Sensibilidad 100,0 93,3 95,0 100,0 87,0 100,0 100,0 81,8 100,0 100,0 100,0 100,0 90,0 100,0 100,0 100,0 Especificidad 99,7 100,0 99,7 100,0 100,0 99,8 99,8 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,5 Tabla 2. Parámetros diagnósticos de la técnica CLART® HPV4. 11. BIBLIOGRAFÍA Bosch, F.X., Lorincz, A., Muñoz, N., Maijer, C.J.L.M. and Shah K.V.: “The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer”. J. Clin. Pathl. 55, 244-265 (2002). Calleja-Macías, I.E., Villa, L.L., Prado, J.C. et al. "Wordwide genomic diversity of the highrisk human papillomavirus types 31, 35, 52, 58, for close relatives of human papilloma virus type 16”. Journal of Virology. 79, 13630-13640 (2005). Chranioti A., Spathis A., Aga E., Merustoudis C. Pappas A., Panayiotides I. and Karakitsos P. “Comparison of two commercially available methods for HPV Genotyping: CLART HPV2 22 and Linear Arrays HPV Genotyping Test”. Analytical and Quantitative Cytopathology and Histopathology. Volumen 34, number 5, October 2012. De Villiers, E.M.: “Heterogeneity of the human papillomavirus group”. J. Virol. 63, 48984903 (1989). 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TABLAS En la siguiente tabla se indica el riesgo oncogénico de los PVH que se detectan en este kit. TIPO RIESGO ONCOGÉNICO * TIPO RIESGO ONCOGÉNICO * PVH 6 Bajo Riesgo PVH 56 Alto Riesgo PVH 11 Bajo Riesgo PVH 58 Alto Riesgo PVH 16 Alto Riesgo PVH 59 Alto Riesgo PVH 18 Alto Riesgo PVH 61 Bajo Riesgo PVH 26 Alto Riesgo Probable PVH 31 Alto Riesgo PVH 62 Bajo Riesgo PVH 66 Alto Riesgo PVH 33 Alto Riesgo PVH 35 Alto Riesgo PVH 68 Alto Riesgo PVH 39 Alto Riesgo PVH 71 Bajo Riesgo PVH 40 Bajo Riesgo PVH 72 Bajo Riesgo PVH 42 Bajo Riesgo PVH 43 Bajo Riesgo PVH 73 Alto Riesgo Probable PVH 81 Bajo Riesgo PVH 44 Bajo Riesgo PVH 82 Alto Riesgo Probable PVH 45 Alto Riesgo PVH 83 Bajo Riesgo PVH 51 Alto Riesgo PVH 84 Bajo Riesgo PVH 52 Alto Riesgo PVH 85 Bajo Riesgo PVH 53 Alto Riesgo Probable PVH 89 Bajo Riesgo PVH 70 Bajo Riesgo PVH 54 Bajo Riesgo * Clasificación del riesgo oncogénico según: Bouvar d V, Baan R, Straif K, Grosse Y, Secretan B, El Ghissassi F et al. 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