UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOLOGÍA APLICACIÓN DE UNA PRUEBA DIAGNÓSTICA QUE DETERMINA EL NÚMERO DE REPETICIONES CGG Y EL ESTADO DE METILACIÓN DEL GEN FMR1 PARA DETECCIÓN DE SÍNDROME X FRÁGIL EN PACIENTES VERACRUZANOS CON DISCAPACIDAD INTELECTUAL IDIOPÁTICA TESIS TRABAJO DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL QUE PRESENTA: MARTHA EDITH SÁNCHEZ SANTOYO DIRECTOR y CODITECTOR DR. ROBERTO LAGUNES TORRES – HECTOR VIVANCO CID XALAPA, VER. AÑO 2014 Agradecimientos A Dios Por la vida, por hacerme sentir que no estoy sola especialmente en los momentos difíciles, por hacer realidad las imposibilidades y abrir puertas para que este trabajo y este momento sean un sueño más cumplido, porque con tus enseñanzas estoy aprendiendo a ser un mejor ser humano, una mejor hija, una mejor amiga y una mejor profesionista. A mis padres Por cada día de esfuerzo y sacrificio que pasaron para apoyarme, por mantenerme en la carrera, por esos días de preocupación, por sus cuidados y por la confianza que han tenido en mí, no sé qué habría hecho sin su apoyo. A mis hermanos A Abi por ser una de mis mejores amigas y mi mejor hermana, por tu amor, tu alegría, tu confianza y por la madurez con la que me aconsejabas. A Rafiki por convertirme en la tía de un niño hermoso “manuelito” A mi tía Silvia Mi gran amiga y mi segunda madre, gracias por tu amor, tu confianza, por preocuparte por mí, por esas platicas de antes en las que me escuchabas y me aconsejabas como si fueras mi mamá, por tus oraciones y por nuestra muy hermosa amistad que me acompaña aunque estemos lejos. Al Dr. Patricio Barros Nuñez, Dr. Pavel Romero Espinoza y Dra. Berenice Ochoa Hernández del Centro de Investigación Biomédica de Occidente (CIBO) en Guadalajara; Jalisco Estaré eternamente agradecida con ustedes, ya que sin su apoyo en Guadalajara no habría sido posible realizar mis experimentos y tal vez este momento no habría sido una realidad, además de su amistad, su confianza en mí y todas sus atenciones para que mi estancia fuera agradable. A mis amigos Al personal de enfermería del CREEVER por su disponibilidad para realizar las tomas de muestra, por su amistad, su apoyo y sus palabras de ánimo, así como al demás personal que contribuyo a apoyarme. Saúl por haberme apoyado en gran parte de mi carrera. Marry Jane por tu amistad, por el gran ser humano que eres. Artur por el apoyo que me has brindado y por tu amistad. Quím. Viky Uchino porque siempre creyó en mí, por su amistad y por apoyarme para que mi estancia en Guadalajara fuera posible. Quím. Margarita por tu amistad, tu confianza, tu aprecio y por tus oraciones. Quím. Paty por la atención que tuviste siempre conmigo en el laboratorio. A la Quím. Yadira por haber tenido siempre palabras de ánimo para mí. Ara por tu hospitalidad y tu confianza durante mi estancia en Guadalajara. A mis sinodales Por el tiempo, amistad, apoyo y sus aportaciones en la revisión de este trabajo. 2 A mis asesores Dr. Roberto Lagunes y Dr. Héctor Vivanco Cid Por haberme aceptado en el Instituto Investigaciones Médico Biológicas (IIMB) como su tesista, ya que con esta experiencia me llevo un gran aprendizaje. A mis maestros A todos los maestros que dedicaron tiempo a enseñarme y a quienes despertaron en mí la pasión por la Biología, especialmente a la Mtra. Eda Ixora Escalante, la Dra. Beatriz Palmeros Sánchez, el Mtro. Lucio Gil y la Dra. Rocío Coutiño que además de su valiosa amistad han dejado en mí persona, enseñanzas de vida y me han apoyado de diferentes maneras para llegar a este momento. Y a todas las personas que de una u otra manera contribuyeron a que concluyera esta etapa que dará inicio a otra y a muchas más. ¡Gracias! 3 Dedicatoria A mi bello ángel José de Jesús, siempre estarás vivo en mi corazón y en el de nuestra familia, te amaremos por siempre. A mi familia y seres queridos A todos los angelitos que faltan por ayudar son uno de mis más grandes motivos e inspiraciones para levantarme cada día y encontrarle sentido a la vida. A los ángeles que formaron parte de mi vida especialmente Beba gracias por tu amor sincero, noble y por tu lealtad, y a Bibi jamás los olvidaré. Y a quienes forman parte de ella ahora mi Gordita, Muñeca, Camila, Bolo, Estrella, Óreo y mi princesa Luna. A todas las personas que tienen sueños, solo sigan adelante, pónganse en manos del Rey de reyes y esperen que el obrará conforme a lo que hay en sus corazones. 4 RESUMEN En una muestra de 41 individuos (33 varones y 8 mujeres) que presentaban discapacidad intelectual idiopática y otras características como trastornos de lenguaje, trastornos de aprendizaje y conductas autistas, se buscaba encontrar la mutación completa (≥ 200 repeticiones del trinucleótido CGG) que causa el síndrome X frágil. Para realizar la identificación de esta mutación, se utilizó la metodología de PCR que amplifica DNA que ha sido tratado previamente con bisulfito de sodio, técnica que en un primer ensayo es capaz de detectar el número de repeticiones CGG en el gen FMR1 al amplificar alelos normales (5-50 repeticiones CGG) y alelos con premutación (50-200 repeticiones CGG). En el estudio realizado se detectaron alelos de 26,29 y 32 repeticiones CGG en varones y en una mujer se amplificaron dos alelos correspondientes a 26 y 39 repeticiones, lo cual ubica a estos pacientes en el rango normal de repeticiones CGG, en las 7 mujeres restantes solo se amplificó una banda para cada una. El estado de metilación del UTR 5´ de cualquier gen determina la expresión del mismo, en el caso particular del gen FMR1 cuando el número de repeticiones CGG es ≥ 200 hay metilación de las citosinas de las islas CpG y de las repeticiones CGG que inactivan el promotor, inhibiendo la expresión del gen. La ausencia de la proteína FMRP es típica de individuos afectados por SXF. En consecuencia al realizar un segundo ensayo de PCR en DNA para evaluar el estado de metilación del gen FMR1, se espera un amplificado de 80 pb para individuos afectados. En los resultados obtenidos no hay producto amplificado de tal tamaño, solo se observó en los controles positivos y en mujeres en las que un cromosoma X está inactivado de manera normal. En conclusión los resultados sugieren que se requiere de un tamaño de muestra mayor y como criterio principal para un estudio de población sin fenotipo definido, los pacientes deben presentar, al menos discapacidad intelectual idiopática; la PCR que determinó el número de repeticiones permitió detectar alelos en el rango normal en todos los varones confirmado en la PCR que detectó el estado de metilación en las islas CpG en la cual no hubo amplificado del alelo con mutación completa en ningún varón, solo amplificó el cromosoma X inactivo en mujeres, la metodología tiene una limitante ya que no permite diagnosticar SXF en mujeres que amplifican una sola banda. 5 INDICE Abreviaturas 1. INTRODUCCIÓN 2.ANTECEDENTES 2.1 Síndrome X frágil 2.1.1 Cuadro clínico 2.1.1.1 Discapacidad intelectual (retraso mental) 2.1.2 Gen FMR1 2.1.3 Mutación en el gen FMR1 2.1.4 Proteína FMRP 2.1.5 Métodos de diagnóstico del síndrome X frágil 2.1.6 Southern blot 2.1.7 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 2.1.8 Modificación del DNA por bisulfito de sodio 2.1.9 Análisis inmunohistoquímico 2.1.10 Criterios para realizar el diagnostico de SXF 3.PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 4. HIPÓTESIS 5. OBJETIVO GENERAL 5.1 OBJETIVOS PARTICULARES 6. MATERIAL Y MÉTODO 6.1 Diagrama de trabajo 6.2 Muestra 6.3 Metodología 6.3.1 Toma y transporte de muestras sanguíneas ……………………………7 ……………………………8 …………………………..10 …………………………..10 …………………………..10 …………………………..12 …………………………..13 …………………………..14 …………………………..16 …………………………..17 …………………………..17 …………………………..17 …………………………..18 …………………………..20 …………………………..21 …………………………..22 …………………………..23 …………………………..23 …………………………..23 …………………………..24 …………………………..24 …………………………..25 …………………………..26 …………………………..26 6.3.2 Obtención del paquete de leucocitos 6.3.3 Extracción del DNA genómico 6.3.4 Determinación de la calidad del DNA 6.3.5 Modificación del DNA por tratamiento con bisulfito de sodio 6.3.6 Amplificación de la región del gen FMR1 que contiene las repeticiones CGG mediante PCR 6.3.7 Amplificación de la región del gen FMR1 que contiene las islas CpG mediante PCR 6.3.8 Electroforesis en gel de poliacrilamida (29:1) 6.3.9 Tinción de geles de poliacrilamida con nitrato de plata 6.3.10 Determinación del tamaño de la secuencia repetitiva CGG y del estado de metilación de las islas CpG 7. RESULTADOS 8. DISCUSIÓN 9. CONCLUSIONES 10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 11. ANEXOS …………………………..26 …………………………..26 …………………………..27 …………………………..28 …………………………..30 …………………………..31 …………………………..32 …………………………..32 …………………………..33 …………………………..35 …………………………..37 …………………………..41 …………………………..42 …………………………..45 6 ABREVIATURAS DNA: Ácido desoxirribonucleico AgNO3: Nitrato de plata RNA: Ácido ribonucleico SXF: Síndrome X Frágil RM: Retraso Mental PCR: Reaccion en Cadena de la Polimerasa ARNm: Ácido ribonucleico mensajero EDTA: Ácido etilendiaminotetracético FMR1: Fragile X Mental Retardation 1. FMRP: Fragile Mental Retardation Protein HPLC: Cromatografía líquida de alta rendimiento Pb: Pares de bases µL: microlitros. M: Solución molar. g: Gramos. MgCl2: Cloruro de magnesio. MgSO4: Sulfato de magnesio. mL: Mililitro mM: Milimolar mmol: Milimol Na2EDTA: Buffer sodio EDTA NaCl: Cloruro de sodio NaOH: Hidróxido de sodio ng: Nanogramo NH4Cl: Cloruro de amonio NH4HCO3: Bicarbonato de amonio nm: Nanómetros ºC: Grado centígrado pH: Potencial de hidrógeno PM: Peso molecular pmol: Picomol rpm: Revoluciones por minuto SDS: Dodecil sulfato de sodio TBE: Buffer Tris Base-Ácido Bórico-EDTA TAE: Buffer Tris- Acido Acético- Na2EDTA 2. H2O TEMED: N,N,N’,N’-Tetrametiletilendiamina UV: Luz ultravioleta g: Microgramo 7 1. INTRODUCCIÓN En el genoma humano se conocen un grupo de enfermedades causadas por la expansión de tripletes, conocidas como VNTR´s (Variable Number Tandem Repeat) (Bowen, 2012), los tripletes expandidos son muy inestables en meiosis y mitosis. Esta expansión trinucleótida puede producir ganancia o pérdida de la función génica y parece asociarse a una variedad de factores, algunos directamente relacionados con el proceso expansivo (cis-actuantes) y otros cuya interacción con los tripletes contribuye a su inestabilidad (trans-actuantes). Cuatro tipos de tripletes tienen capacidad de expansión patogénica en seres humanos (CGG/GCC, CAG/GTC, CTG/GAC y GAA/CTT) y pueden localizarse tanto en secuencias génicas codificadoras (atrofia muscular bulboespinal, enfermedad de Huntington y algunas ataxias espinocerebelosas) como no codificadoras, tal es el caso de ataxia de Friedreich, distrofia miotónica y síndrome X frágil (Rosales-Reynoso et al., 2009). La importancia del síndrome X frágil se debe a que es la causa más frecuente de retraso mental hereditario después de la trisomía 21 (Jorde, 2005; Rousseau et al., 1995) y es una enfermedad hereditaria ligada al cromosoma X, en el cual se caracteriza un sitio frágil ubicado en la región Xq27.3 (Vázquez, 2001). La mutación que causa el síndrome es una expansión anormal del trinucleótido CGG de 200 o más repeticiones, llamada mutación completa, en la región 5´ UTR del exón 1 del gen FMR1 (Fragile X Mental Retardation 1) (Hedge et al., 2001; Rosales-Reynoso et al., 2007; Sadic et al., 2010). Esto causa un proceso de hipermetilación, que inactiva el promotor del gen FMR1 por lo que no hay expresión génica y no hay un producto, la proteína FMRP, que es responsable del fenotipo X frágil (Espinoza, 2008). El síndrome muestra gran variabilidad y el diagnóstico clínico suele ser difícil (Panagopoulos et al., 1999), además de que no es determinante. Debido a lo anterior, se requiere de métodos de diagnóstico molecular que detecten la expansión de la región repetitiva CGG y determinen el estado de metilación de las islas CpG del gen FMR1 para establecer el diagnóstico definitivo de la enfermedad (Christofolini et al., 2006). Clínicamente, los individuos afectados, presentan deterioro cognitivo, (Christofolini et al., 2006), el SXF es causante de discapacidades que van desde grados variables de problemas de aprendizaje hasta retraso mental aunque se asocian con frecuencia retrasos severos en lenguaje, problemas de conducta, comportamiento semejante al autista, testículos agrandados, orejas grandes o prominentes, hiperactividad, retraso en el desarrollo motor y deficiente integración sensorial (Volio y Berguer et al., 2005). 8 A pesar de que el SXF es la causa más común de retraso mental hereditario (Hegde et al., 2001; Jorde, 2005; Nonell et al., 2006; Rousseau et al., 1995), existe desconocimiento de esta enfermedad en nuestro país entre profesionales de la salud y la educación, además de que se han realizado pocos trabajos de investigación sobre síndrome X frágil. En el Estado de Veracruz no se han reportado estudios al respecto, razones que justifican la realización de esta investigación, que se enfoca en aplicar una prueba diagnóstica para síndrome X frágil en pacientes afectados con discapacidad intelectual idiopática del Estado de Veracruz. El abordaje experimental se fundamenta en la detección del número de repeticiones CGG en una muestra de 41 individuos, considerando como criterio de mutación completa una variación igual o superior a 200 repeticiones, puesto que las mutación completa se correlaciona con el grado de metilación de islas CpG en el UTR del gen FMR1 y en las citosinas de las repeticiones CGG, el DNA de cada paciente se modificará por bisulfito de sodio previo a la amplificación por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) técnica que ha sido implementada en nuestro país por Rosales-Reynoso, ( 2000). 9 2. ANTECEDENTES 2.1 Síndrome X frágil Es la causa más común de retraso mental hereditario (Rousseau et al., 2011; Castro- Volio y Cuenca-Berger, 2005; Florencia et al., 2006; Young-Yim et al., 2008). El Síndrome X frágil (SXF), es conocido como Síndrome de Martín-Bell, en honor a J.P. Martin y a J. Bell, quienes delinearon el síndrome por primera vez en 1943 (Cuenca-Berguer et al., 2002), y también como retraso mental sitio frágil 1 o FRAXA (López, 2006), tiene una frecuencia estimada de 1:4500 en varones y 1:9000 en mujeres (Barros-Nuñez et al., 2008). El SXF es una enfermedad hereditaria que está ligada al cromosoma X, en la cual se caracteriza un sitio frágil ubicado en la región Xq27.3 (Vázquez, 2001). Es causada por una mutación dinámica (Young -Yim et al., 2008) que involucra la amplificación del triplete CGG, en la región 5’UTR del exón 1 en el gen FMR1 (Fragile X Mental Retardation 1) (Hedge et al., 2001; Rosales-Reynoso et al., 2007; Sadic et al., 2010). Cuando el trinucleótido se amplifica ≥ 200 repeticiones, origina una mutación completa, por lo cual se desencadena un proceso de hipermetilación que inhibe la transcripción del gen, esto conduce a la deficiencia de la proteína FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) en individuos afectados (Romero-Espinoza, 2008; Rosales-Reynoso et al., 2005; Barros- Nuñez et al., 2008; Yuhas et al., 2009; Robinson, 2007; Young -Yim et al., 2008), la enfermedad es causante de discapacidades que van desde grados variables de problemas de aprendizaje hasta retraso mental (Castro- Volio y Cuenca-Berger., 2002, 2005). 2.1.1 Cuadro clínico Los pacientes afectados con SXF, tienen un amplio espectro de características físicas, así como déficits cognitivos y de comportamiento (Rubeis y Bagni., 2011) por lo que el cuadro clínico difiere a menudo según el sexo del paciente (Castro- Volio y Cuenca-Berger., 2005). El fenotipo clínico de los pacientes incluye anormalidades físicas, retardo mental y transtornos de la conducta (Romero- Espinoza, 2008). Antes de la pubertad, los varones pueden mostrar orejas protuberantes, paladar ojival, puente nasal aplastado, macrocefalia, pliegues epicánticos, un único pliegue palmar, mala coordinación de sus movimientos, articulaciones muy flexibles e hipotonía. Después de la pubertad se pueden incluir otros rasgos, como cara alargada y angosta con mentón prominente, orejas grandes, 10 macroorquidismo y prolapso de la válvula mitral, además pueden mostrar laxitud del tejido conectivo, problemas visuales, escoliosis, tics motores, mayor talla durante la niñez y menor durante la madurez, piel aterciopelada, pie equino varo, pliegue en la planta del pie, frente ancha o abultada, manos grandes, hernias, pulgares con doble articulación, pie plano y pecho excavado. Entre las características físicas en las mujeres, destaca la cara angosta y las orejas grandes (Castro- Volio y Cuenca-Berger, 2005; Rubeis y Bagni, 2011) Véase Figura 1,2 y 3. El fenotipo neurocognitivo también es diferente entre los sexos, debido a la inactivación al azar de un cromosoma X en las mujeres, solamente el 30-50% de ellas va a manifestar síntomas cognitivos, a pesar de tener la mutación, las que son sintomáticas y la mayoría de los varones tienen predisposición a presentar desde la infancia problemas cognitivos, de conducta y emocionales que incluyen retraso cognitivo con coeficientes intelectuales (CI) que disminuyen con la edad, trastornos en el lenguaje y la comunicación y desarrollo anormal (Castro- Volio y Cuenca-Berger, 2005) , en varones el retraso mental puede ser moderado con una media de CI=42 y con un retraso mental severo en aproximadamente 25% de los casos (mientras que las mujeres presentan un retraso mental ligero, normalmente con un CI= 70-90 (Nussbaum, 2008; Rubeis y Bagni., 2011). Entre las alteraciones del comportamiento se encuentra que son hiperactivos, palmean o se muerden las manos, tienen rabietas, establecen poco contacto visual, tienen frecuentes apariciones de comportamiento semejante al autista, déficit de atención, retraso de lenguaje, comportamiento estereotipado, deterioro social, ansiedad. (Cuenca-Berguer et al., 2002; Hagerman et al., 2010; Nussbaum, 2008). Figura 1: A, B, C. Tres varones afectados con características faciales del síndrome X frágil. Nótese la cara alargada y estrecha, las orejas grandes, la frente prominente, y el pobre contacto ocular. 11 A B C Figura 2: A, B, C. Se muestran algunas características del cuadro clínico. A. Paladar arqueado. B. Pie plano C. Hiperextensibilidad de las articulaciones. Figura 3: A, B, C. Individuos con síndrome X frágil poseen características físicas poco evidentes. Imagen tomada de Vries et al., 1998. 2.1.1.1 Discapacidad intelectual (retraso mental) El retraso mental es, en nuestra sociedad, la discapacidad más frecuente, y se pone en evidencia desde la infancia. Se habla de RM cuando el coeficiente de inteligencia (CI) es inferior a 70, tras medirse éste de forma segura y válida, según la American Association of Mental Retardation (AAMR), algo que no es posible en niños menores de 3 o incluso de 5 años (Tejada, 2006). EL CI de aproximadamente 70-75 o inferior es obtenido mediante evaluaciones realizadas con uno o más test de inteligencia, aplicados individualmente y desarrollados para evaluar el funcionamiento intelectual (Alonso, 1994). La definición de retraso mental propuesta por la AAMR plantea que el retraso mental es una discapacidad caracterizada por limitaciones significativas en el funcionamiento intelectual y la 12 conducta adaptativa tal como se ha manifestado en habilidades prácticas, sociales y conceptuales. Esta discapacidad comienza antes de los 18 años. Este término está siendo cambiando actualmente por el de Discapacidad Intelectual, este cambio en la terminología se ilustra en el nombre de las organizaciones como AAIDD (Asociación Americana de Discapacidad Intelectual y Discapacidades del Desarrollo). Los principales cambios respecto a la anterior definición incluyen: una nueva concepción de la conducta adaptativa; una nueva dimensión de participación, interacciones y roles sociales; este término engloba a la misma población de individuos que anteriormente fueron diagnosticados con retraso mental en número, clase, nivel, tipo y duración de la discapacidad y la necesidad de servicios y apoyos individualizados que tienen las personas con esta discapacidad. Cada individuo que es o era susceptible de un diagnóstico de retraso mental es susceptible de un diagnóstico de discapacidad intelectual (Schalock et al., 2007). En la literatura, el SXF se define como la causa más común de discapacidad intelectual en todo el mundo (Essop y Krause, 2013), enfermedad causada por la mutación completa que inactiva la expresión del gen FMR1, la transcripción y por ende la traducción a la proteína FMRP; el retraso mental es el resultado de anormalidades en la traducción de proteínas que dependen de la FMRP para el transporte de sus ARN y para su traducción (Botell et al., 2006). 2.1.2 Gen FMR1 El gen FMR1 mide 38Kb y consta de 17 exones y 16 intrones y está altamente conservado entre las especies (Figura 4). El hallazgo más importante en este gen ha sido la identificación de un segmento de repeticiones CGG las islas CpG, mismas que se encuentran diseminadas en todo el genoma. Por otro lado se ha descubierto que una característica que contribuye a la estabilización de esta región es la presencia de secuencias AGG las cuales se encuentran intercaladas cada 9 o 10 repeticiones CGG (Rosales- Reynoso et al., 2005).Los alelos normales poseen dos tripletes AGG intercalados, un tercio de los alelos con premutaciones poseen solo un triplete AGG, y alelos con mutación completa no tienen ninguno, los alelos con repeticiones CGG que tienen tripletes AGG intercalados han mostrado más estabilidad en la transmisión que aquellos que solamente contienen la secuencia repetitiva CGG (Castro- Volio y Cuenca-Berguer et al., 2005). 13 2 3 4 5678 9 1011121314 15 16 17 Figura 4: Representación esquemática de la estructura del gen FMR1. Imagen tomada y modificada de Florencia et al., 2006. 2.1.3 Mutación en el gen FMR1 El SXF es causado por una mutación que involucra la amplificación del triplete CGG, en la región 5’UTR del exón 1 en el gen FMR1 (Hedge et al., 2001; Rosales-Reynoso et al., 2007; Filipovic-Sadic et al., 2010), En la población general el número de tripletes CGG varía entre 5-50 (Panagopoulos et al.,1999; Florencia et al., 2006), sin embargo hay otra cifra que va de 6-50 tripletes CGG (Rosales-Reynoso et al., 2005, 2007; Barros-Nuñez et al., 2008; Hak Kwon et al., 2001)), esto se debe a que el número de repeticiones es altamente polimórfico. Repeticiones CGG entre 50-200 generan premutaciones (Rosales-Reynoso et al., 2007; Panagopoulos et al., 1999; Florencia et al., 2006) que manifiestan inestabilidad del estado de premutación a mutación completa cuando se trata de la transmisión de una madre portadora a su hijo afectado (Volio y Berguer, 2005), además pueden desarrollar Síndrome de temblor/ataxia asociado a X frágil (FXTAS) en varones, o Insuficiencia Ovárica Primaria en mujeres (FXPOI), (Hagerman, 2010). Cuando aumenta, el DNA se inestabiliza, esto implica que el número de repeticiones se expanda con la transmisión hereditaria, de manera que se produce un aumento en el trinucleótido de 200 a más repeticiones. Si el número de tripletes aumenta por encima de 200, se produce una mutación completa, esto en los individuos afectados causa que presenten el Síndrome X frágil. (FilipovicSadic et al., 2010; Castro- Volio y Cuenca-Berger, 2005). El incremento en el número de trinucleótidos mayor a 200, desencadena una hipermetilación de las citosinas de las secuencias CGG (Romero-Espinoza, 2008; Rubeis y Bagni, 2011) y de las islas CpG, por lo que la metilación inactiva la región del promotor del gen y se inhibe la transcripción, por ende la expresión génica y finalmente la síntesis de la proteína FMRP (Figura 5). (Saluto et al., 2005; Castro-Volio et al., 2005; Florencia et al., 2006). Ha sido el primer ejemplo de un nuevo tipo de alteración genética referido como una “mutación dinámica” o “DNA inestable” que podría 14 originarse por recombinación meiótica o durante la replicación y reparación del DNA (Florencia et al., 2006). Cabe mencionar que en el gen FMR1 se han descrito otros tipos de alteraciones en el gen FMR1 como deleciones y mutaciones puntuales, que igualmente impiden su función. Estas mutaciones se han encontrado tanto en el promotor como en la secuencia codificante de la proteína (Romero-Espinoza et al., 2008) Figura 5: Representación esquemática del gen FMR1 y el mecanismo molecular del síndrome X frágil: Expansión de (CGG)n en diferentes grados y su efecto en la funcionalidad del gen. Tres diferentes rangos de repetición del trinucleótido CGG se han descrito: (A) Normal (la longitud varía de 5-50 trinucleótidos), (B) premutación (predisposición a la enfermedad, varia de 50-200 trinucleótidos, hay un incremento en los niveles de RNAm), mutación completa (el número de trinucleótidos puede ser de 200 hasta miles). Los hombres portadores de la premutación la heredan a sus hijas relativamente sin un cambio en el tamaño, estas hijas no están afectadas pero tienen el riesgo de tener descendencia afectada. Una premutación es susceptible a amplificarse después de pasar por meiosis en mujeres. Imagen tomada de Florencia et al., 2006. 15 2.1.4 Proteína FMRP Es una proteína compuesta de 632 aminoácidos, y tiene 5 dominios, en la región N-terminal existe una secuencia nuclear funcional (NLS); enseguida se localizan 2 dominios de unión al ARN (dominios de homología a ribonucleoproteína K, llamados KH1 y KH2). Una secuencia de exportación nuclear (NES), codificada por el exón 14; y por último, una secuencia de reconocimiento de RNA, que es un conjunto de residuos de glicina y arginina llamado caja RGG, ubicada en el extremo carboxilo (Gabus et al., 2004; Romero-Espinoza 2008). Veáse figura 6. Funcionalmente pertenece a la familia de RBPs (RNA binding protein), interactúa con proteínas y RNAs formando grandes ribonucleopartículas mensajeras (mRNPs) (Rubeis y Bagni, 2011). La proteína FMRP se expresa ampliamente en varios tejidos, los más altos niveles se encuentran en el cerebro y en los testículos (Rousseau et al., 2011), los cuales son órganos fuertemente afectados por el síndrome (Gabus et al., 2004). Figura 6: Esquema de la estructura de la proteína FMRP. Imagen tomada de Rousseau et al., 2011. La función celular no ha sido entendida completamente, actualmente se sabe que los dominios KH y la caja RGG son secuencias que se encuentran en proteínas de unión al ARN, lo que concuerda con la observación de que la FMRP característicamente se encuentra asociada con polisomas traduciendo activamente, y apoya la idea de que la proteína puede estar modulando la traducción o influenciando la estabilidad del ARNm in vivo. (Romero-Espinoza, 2008). La visión actualmente es que regula el transporte de RNAm y la traducción de una manera crítica para el desarrollo de las neuronas (Florencia et al., 2006; Gabus et al., 2004). Además Westmark y James Malter mostraron que es clave para regular la traducción de una proteína involucrada en la enfermedad de Alzheimer llamada APP (amyloid precursor protein) (Robinson, 2007). Además, ensayos de traducción in vivo demuestran que la FMRP inhibe la traducción de ARN mensajeros mediante el bloqueo de la subunidad ribosómica 60S, por lo que se ha propuesto que la FMRP funciona como regulador negativo de la expresión génica a nivel traduccional (Romero-Espinoza, 2008). 16 Se conoce que también regula la traducción de algunos mensajes que son importantes para la plasticidad sináptica, la migración neuronal y la neurogénesis adulta (Hagerman et al., 2011). Por lo que su ausencia altera la plasticidad sináptica, la cual está implicada en el aprendizaje y la memoria (Botell et al., 2006). 2.1.5 Métodos para el diagnóstico del síndrome X frágil La identificación de la causa del SXF y sus características ha revolucionado su diagnóstico, el cual antes de 1991, se realizaba con análisis citogenético identificando el sitio frágil en Xq27.3 (Rousseau et al., 2011). Actualmente se han diseñado una serie de técnicas moleculares e inmunohistoquímicas que permiten efectuar el diagnóstico del síndrome X frágil; estos incluyen el Southern blot, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el análisis inmunohistoquímico (Romero-Espinoza, 2008). 2.1.6 Southern blot Es el método de diagnóstico más común de detección del síndrome X frágil. Es una técnica en la cual el DNA genómico es digerido con enzimas de restricción específicas y se hibridan a una sonda específica del gen, es utilizada para determinar el tamaño y el estado de metilación de las mutaciones en el gen FMR1, sin embargo es un método laborioso, intensivo y puede tomar varios días para obtener resultados. No siempre es posible determinar claramente premutaciones en el rango bajo (55-65 tripletes) ni de un grado intermedio (45-54 repeticiones). Este tipo de análisis tiene un alto grado de complejidad, requiere considerable experiencia en el laboratorio para detectar mutaciones de tipo irregular como mosaicismo que tienen alelos normales y alelos con mutación completa. El Southern blotting es todavía considerada por la gran mayoría de los laboratorios de referencia como la técnica gold estándar para el diagnóstico molecular del gen FMR1 (Rousseau et al., 2011). 2.1.7 Reacción en Cadena de la Polimerasa Es el método preferido para diagnósticos moleculares en general. Sin embargo, la premutación y la mutación completa en el gen FMR1 son ricas en GC, esto limita la amplificación por PCR simple (Rousseau et al., 2011) por lo cual se requiere subsecuentemente el análisis por Southern 17 blot, ya que por apareamiento entre bases se forman estructuras secundarias, esto lleva al uso de aditivos químicos como dimetilsulfóxido, formamida o el análogo de base 7-deaza-dGTP, que presentan varios problemas en su utilización: 1.- El ADN que contiene el análogo de base migra más lento que el ADN intacto, por lo que requiere de geles de poliacrilamida desnaturalizantes y marcadores de tamaño especiales. 2.- Cuando las secuencias amplificadas se corren en geles de agarosa o poliacrilamida, no pueden ser teñidos con Bromuro de Etidio o Nitrato de Plata, debido a que los análogos de base anteriormente mencionados, altera su estructura electrónica impidiendo su fluorescencia y su visualización (Rosales-Reynoso et al., 2007). Para eludir estos inconvenientes, el tratamiento de modificación del DNA por bisulfito de sodio previo a la amplificación por PCR fue propuesto por Panagopoulos (Panagopoulos et al., 1999), El uso de PCR basado en DNA modificado con bisulfito de sodio permite la amplificación de las secuencias repetitivas por PCR simple; convierte las citosinas no metiladas en uracilo, evitando la formación de estructuras secundarias que impiden el funcionamiento de la DNA polimerasa (Romero-Espinoza, 2008). 2.1.8 Modificación del DNA por bisulfito de sodio El uso de DNA modificado por bisulfito de sodio fue descrito por Shapiro y col. Hayatsu y col. en 1970, con el objetivo de evitar los residuos 5-metilcitosina, que participan en la metilación del DNA y que dan lugar a la inactivación en algunos genes durante el desarrollo. Debido a que la región en dónde ocurre la mutación en el gen FMR1, es rica en secuencias C+G, se forman estructuras secundarias por apareamiento entre bases, que impiden o dificultan la amplificación de secuencias con premutación o mutación completa mediante PCR simple. Como alternativa a este problema se diseñó una técnica que puede resolverlo, tratando el DNA genómico con bisulfito de sodio (Rosales-Reynoso, 2000). Este tratamiento consta de tres pasos para llevar a cabo la modificación (Figura 7): 1.- La adición del bisulfito de sodio a la doble unión de los carbonos 5-6 de la citosina. 2.-Desaminación hidrolítica del complejo citosina-bisulfito, que da lugar a un complejo uracilo-bisulfito, ocurre a un pH 5-6. 18 3. Tratamiento alcalino para la remoción del grupo sulfonado para que la modificación de citosina a uracilo sea completada. Figura 7: Representación de la modificación del DNA con bisulfito de sodio, como tratamiento previo para amplificación por PCR, técnica utilizada como alternativa para el diagnóstico del síndrome X frágil. Imagen tomada de Romero-Espinoza, 2008. El efecto del bisulfito en el DNA varía en función del estado de metilación del gen, esto significa que en la cadena 5’-3’ de individuos sanos y portadores de la premutación, las citosinas de las secuencias con amplificación de trinucleótidos CGG y de las islas CpG adyacentes (no metiladas), son convertidas en uracilo (UGG y UpG), mientras que en la cadena 3’-5’, las dos citosinas de la secuencia CCG son convertidas en uracilos (UUG). Por otro lado, en aquellos individuos con la mutación completa, la secuencia con amplificación del trinucleótido CGG y las islas CpG en la cadena 5’-3’ se encuentran metiladas, por lo que no hay una conversión de las citosinas a uracilo. Recientemente se ha propuesto la aplicación de esta técnica para determinar el estado de metilación del gen FMR1 y para la detección de secuencias con amplificación de trinucleótidos CGG, técnica que permite realizar un diagnóstico molecular en pacientes con síndrome X frágil (Rosales-Reynoso; 2000). 19 Esta técnica ha sido utilizada en diferentes estudios en población mexicana y ha generado los resultados esperados, los cuales han permitido detectar premutaciones y se ha logrado determinar el estado de metilación del gen FMR1 para detección de las mutaciones completas. (RosalesReynoso, 2000, 2005; Vielma, 2004; Barros-Nuñez et al., 2008). Entre los principales estudios que utilizan esta técnica, está el reportado por Rosales-Reynoso et al (2007) en el cual se analizó la utilidad de la PCR utilizando DNA modificado por bisulfito de sodio, como un método rápido de detección para diagnosticar a pacientes con síndrome X frágil y con enfermedad de Huntington (HD), además se realizó secuenciación de un número de muestras amplificadas para validar el procedimiento y los resultados fueron idénticos a los obtenidos por PCR. El análisis comparativo con 38 pacientes X frágil, mostró una sensibilidad y especificidad de 100%, en comparación con la técnica gold estándar de Southern blot. Por tanto, se concluyó que la amplificación por PCR simple y su uso con DNA modificado es un método confiable, útil y específico para el diagnóstico molecular del SXF (Rosales- Reynoso et al., 2007). 2.1.9 Análisis inmunohistoquímico Existen anticuerpos dirigidos contra la FMRP que han permitido desarrollar técnicas inmunohistoquímicas que permiten el estudio de la expresión de la proteína. Hay diversos estudios que emplean este análisis y han realizado importantes aportaciones para el estudio y el diagnóstico de la enfermedad, entre los principales se encuentran el realizado por Willemsen y colaboradores en 1995 quienes publicaron el primer trabajo en el que describieron una nueva técnica inmunohistoquímica no invasiva para estudiar la expresión de la FMRP en células sanguíneas, se empleó anticuerpo monoclonal de ratón (1A1) contra la FMRP; la muestra biológica consistía sólo en una o dos gotas de sangre que se extendían en un portaobjetos; las células que se analizaban eran linfocitos. El estudio demostró que todos los individuos del grupo control expresaban la FRMP (>96%); y el grupo de pacientes expresaban la FMRP en <10%, posteriormente, los mismos autores revalidaron los resultados mediante el estudio de un número mayor de individuos afectados, confirmando que la prueba inmunohistoquímica para FMRP en sangre es ideal para el diagnóstico y tamizaje de varones en poblaciones de riesgo porque discrimina sin ningún solapamiento entre varones normales y afectados con la mutación completa. Establecieron de forma práctica porcentajes de corte en el nivel de expresión de la proteína: menos del 42% de expresión determina afectación, y más de 42% establece normalidad. 20 Dicho valor posee una sensibilidad y especificidad del 100%. Para obtener este valor deben examinarse un mínimo de 80 linfocitos. La prueba inmunohistoquímica tiene ciertas ventajas sobre otras, resulta económica, fácil y rápida de realizar, sin embargo no permite la detección de portadores de la premutación, ni de individuos mosaicos. La principal aplicación de la prueba inmunohistoquímica de FMRP es el tamizaje del síndrome X-frágil en varones en poblaciones de riesgo (Romero-Espinoza, 2008). 2.1.10 Criterios para realizar el diagnóstico de SXF Es muy importante mencionar, que se han establecido criterios para considerar necesario realizar o no un diagnóstico molecular, la NSGC (National Society of Genetic Counselors) recomiendan solo se realice la prueba de síndrome X frágil para individuos que presenten las siguientes características: 1)Individuos de ambos sexos con retraso mental, retraso en el desarrollo, o autismo especialmente cuando es asociado con características físicas y de comportamiento del síndrome X frágil, una historia familiar de síndrome X frágil o un retraso mental no diagnosticado. 2) Individuos con una historia familiar de síndrome X frágil o una historia familiar con retraso mental no diagnosticado y están buscando consejo reproductivo. Cuando no hay un diagnóstico establecido de síndrome X frágil. 3) Evaluación prenatal a individuos que son portadores conocidos para la mutación en el gen FMR1. 4) Individuos evaluados previamente por citogenética y mostraron resultados inconsistentes con su fenotipo. 5) Mujeres con problemas reproductivos o de fertilidad asociados con niveles elevados de FSH (Hormona Folículo Estimulante) especialmente si hay una historia familiar de falla ovárica prematura, síndrome X frágil o retraso mental no diagnosticado. 6) Individuos con temblor o ataxia cerebelar de origen desconocido, particularmente cuando hay una historia familiar de trastornos del movimiento, síndrome X frágil o retraso mental sin diagnóstico. (McConkie-Rosell et al., 2005) 21 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Se conoce que existen un grupo de patologías humanas causadas por una expansión anormal de trinucleótidos, ubicados en regiones génicas codificadoras o no codificadoras, que pueden desencadenar procesos de metilación causando el silenciamiento de un gen, provocando la pérdida de su función, tal es el caso del síndrome X frágil que es causado por una mutación en el gen FMR1, denominada mutación completa, la cual se caracteriza por el incremento de 200 o más trinucleótidos CGG, como consecuencia se inactiva el promotor del gen FMR1 por lo cual los procesos de transcripción, y traducción a la proteína FMRP no pueden llevarse a cabo. La importancia del SXF se debe a que constituye una de las principales causas genéticas que originan retraso mental. En México el SXF es poco conocido en la población general. En la literatura se conocen pocos estudios realizados en población mexicana, sin embargo la frecuencia de los individuos afectados en nuestro país y en particular en el estado de Veracruz aún es desconocida. El SXF es una enfermedad compleja en cuanto a su diagnóstico, debido a que la causa se debe a una mutación completa el cuadro clínico no es determinante, por lo que se requiere de una metodología a nivel molecular que sea capaz de detectar la mutación completa así como la premutación e individuos con alelos normales tanto en varones como en mujeres. Actualmente se conocen diferentes técnicas que han permitido su diagnóstico, entre las principales se encuentra el Southern blot asociado o no a PCR e Inmunohistoquímica, aunque por el otro lado también presentan alguna limitación, sin embargo, los estudios reportados en algunos Estados de nuestro país utilizan PCR con un tratamiento previo de modificación del DNA con bisulfito de sodio, la cual ha resultado ser una metodología alternativa, confiable y comprobada para el diagnóstico de la enfermedad. (Rosales-Reynoso, 2000; Rosales-Reynoso et al., 2005, 2007; Vielma, 2008). En el Estado de Veracruz se tiene la necesidad de contar con un diagnóstico molecular, por lo que a pacientes con retraso mental idiopático o que presentan un cuadro clínico de SXF, no se les diagnostica completamente o son mal diagnosticados, por lo cual se requiere de una metodología capaz de detectar individuos afectados, que sea confiable, sencilla , reproducible al permitir hacer una detección molecular amplia de individuos afectados y esté al alcance de quienes puedan estar en riesgo o necesiten recibir asesoramiento genético adecuado que contribuya a su tratamiento y prevención. Esto lleva al planteamiento de la siguiente pregunta de investigación: 22 Mediante una prueba diagnóstica basada en PCR con DNA modificado por bisulfito de sodio ¿será posible detectar la mutación completa en el gen FMR1 para identificar individuos veracruzanos que se encuentren afectados por síndrome X frágil? 4. HIPÓTESIS En una muestra seleccionada de individuos veracruzanos con discapacidad intelectual idiopática se detectará la mutación completa para identificar a los pacientes afectados por síndrome X frágil. 5. OBJETIVO GENERAL Contribuir al diagnóstico del síndrome X frágil en algunos individuos con discapacidad intelectual. 5.1 OBJETIVOS PARTICULARES a) Seleccionar individuos veracruzanos con discapacidad intelectual idiopática b) Determinar en su DNA modificado por bisulfito de sodio: 1. El número de repeticiones CGG en el gen FMR1 2. Detectar la mutación completa mediante el estado de metilación de las islas CpG de dicho gen. 23 6. MATERIAL Y MÉTODO 6.1 Diagrama de trabajo Selección de la muestra a estudiar 1.- Criterios de inclusión. 2.- Reunión con padres y/o tutores 2.- Firmas de consentimiento informado. Toma de muestras y transporte al laboratorio IIMB Veracruz Separación de células mononucleares Extracción de DNA de leucocitos Determinación de la concentración por espectrofotometría Determinación de la calidad de DNA por electroforesis en Agarosa Modificación del DNA con bisulfito de sodio Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Amplificación de secuencia para el número de tripletes CGG Amplificación de las islas CpG Electroforesis en geles de poliacrilamida y tinción con Nitrato de Plata Electroforesis en geles de poliacrilamida y tinción con Nitrato de Plata Análisis de resultados Escritura de la tesis 24 6.2 Muestra Grupo de estudio Se estudió un grupo de 41 individuos del Estado de Veracruz, la muestra incluye a 33 varones y 8 mujeres. Estos pacientes acuden a consulta de Genética en 3 diferentes lugares: 1) CREEVER (Centro de Rehabilitación y Educación Especial de Veracruz) en Xalapa-Enríquez; Veracruz. 2) CRIVER (Centro de Rehabilitación Infantil de Veracruz) y 3) Instituto de Investigaciones Médico Biológicas en Veracruz; Veracruz. Consideraciones éticas A los padres y/o tutores de los pacientes, se les solicitó de forma voluntaria la firma de una carta de consentimiento informado, de acuerdo a las normas internacionales establecidas (Anexo 2). Criterios de inclusión: Pacientes de sexo femenino y masculino Edad 2-16 años Discapacidad intelectual idiopática Conductas autistas Trastornos de lenguaje y aprendizaje Criterios de exclusión: 1. No aceptación a participar en el estudio. 2. Pacientes con discapacidad intelectual, trastornos de lenguaje y aprendizaje causados por una patología diagnosticada como síndrome de Down, parálisis cerebral etc. 3. Pacientes en los que la cantidad de muestra de DNA no sea suficiente en cantidad y /o calidad para realizar el diagnóstico molecular. Grupo control Este grupo está formado por 3 pacientes, como grupos controles, a los que previamente se les ha realizado el diagnóstico molecular para determinar número de repeticiones CGG y estado de metilación en el gen FMR1 para síndrome X frágil, que incluyeron: Un varón negativo para X frágil Una mujer heterocigota negativa para X frágil Un varón positivo (afectado) para síndrome X frágil Las muestras de DNA de este grupo control, fueron proporcionadas por la División de Genética del Centro de Investigación Biomédica de Occidente, en Guadalajara; Jalisco. 25 6.3 METODOLOGÍA 6.3.1 Toma y transporte de muestras sanguíneas Para la toma de muestra, la definición del sitio de punción en el paciente dependió de la edad y tamaño del niño, así como de la accesibilidad de la vena. La punción venosa se realizó con mariposa pediátrica y sistema Vacutainer, en cada individuo se obtuvo un volumen de sangre periférica de 3-5 mL, fue colectada en un tubo estéril con sistema de vacío (BD Vacutainer®) que contiene EDTA como anticoagulante. Los tubos con la muestra fueron rotulados con los siguientes datos: Nombre, número de expediente, tipo de análisis y fecha. Las muestras sanguíneas fueron transportadas de inmediato al laboratorio en una red fría, posteriormente fueron almacenadas en refrigeración a una temperatura de 4°C. 6.3.2 Obtención del paquete de leucocitos Las muestras de sangre periférica se centrifugaron a 2500 rpm, 5 minutos a 18°C, y posteriormente en cada una se realizó el siguiente procedimiento: Se desechó el sobrenadante, se recuperó el anillo de leucocitos y se transfirió a un tubo limpio. Se adicionaron 3 mL de solución ACK lisis (NH4Cl, KHCO3, EDTA-2Na), se mezcló por inversión y se dejó en reposo 20 minutos a temperatura ambiente, posteriormente se centrifugó a 2500 rpm, 5 minutos a 18°C. Se decantó y se resuspendió el pellet de células, inmediatamente se lavó con 3 mL de solución salina, se mezcló por inversión y se centrifugó a las mismas condiciones anteriores. 9. Los pasos de lavado se repitieron como fueron necesarios, hasta que el pellet que contiene los leucocitos quedó limpio. 6.3.3 Extracción del DNA genómico Para la extracción de DNA se utilizó el protocolo de DNAzol ® Reagent (Invitrogen, Inc) El proceso se llevó a cabo en 4 fases; 1) Lisis de células y núcleos: Se transfirieron aproximadamente 100 µL de las células en suspensión a un tubo eppendorf de 1.5 mL y se adicionaron 500 µL DNAzol se mezcló por pipeteo suavemente 6-7 veces. 2) Precipitación 26 Se adicionaron 250 µL de etanol absoluto, se mezcló por inversión 6-7 veces. Se dejaron los tubos a temperatura ambiente 3-6minutos. Se centrifugó a 4000 RFC, 2 minutos, 4°C. 3) Lavado del DNA Se desechó el sobrenadante, se agregaron 800 µL de etanol al 75% y se mezcló por inversión suave aproximadamente 6 veces posteriormente se dejaron a temperatura ambiente aproximadamente 1 minuto. El lavado se realizó 2 veces 4) Secado del DNA Se desechó el etanol y el tubo se dejó abierto aproximadamente 5-15 segundos hasta que el pellet quede seco. Una vez seco, se añadieron 300 µL de NaOH 8 Mm, se mezcló por pipeteo cuidadosamente hasta que el DNA se disolvió por completo en la solución. 6.3.4 Determinación de la calidad del DNA a) Concentración EL DNA se cuantificó por espectrofotometría de dos formas: 1. Muestras cuantificadas en Nanodrop: Se colocó 1 µL de cada muestra de DNA en el equipo y se procedió a ser analizada mediante el software integrado. 2. Muestras cuantificadas en espectrofotómetro convencional, para esto se siguió el siguiente procedimiento: 1. Se realizó una dilución 1:100, para lo cual se colocaron 990 L de agua inyectable en un tubo eppendorf y se añadieron 10 L de muestra de ADN, se mezcló con vórtex y se dio un pulso en la centrífuga. 2. La dilución se transfirió a una celdilla nueva. 3. Se determinó la absorbancia (densidad óptica, DO) a 260 y 280 nm. 4. Se estimó la concentración de ADN a partir de dicha lectura por la siguiente fórmula: A260 * FACTOR DE CONVERSION* FACTOR DE DILUCIÓN= (µg/mL) En donde: Factor de dilución= Volumen total/Volumen de la muestra; en este estudio es igual a 1000/10L 27 Factor de conversión = 50, es una constante, es el coeficiente de extinción molar de 50 ng de DNA que es la máxima absorbancia de 1.0 unidad de DO a 260 nm. 5. Posteriormente se realizó el cálculo para convertir µg/mL a ng/µL. b) Pureza Para determinar la pureza de DNA, el valor de la relación DO 260 nm/DO 280 nm, debe estar entre 1.7 y 2.0 para considerarse como pura, una relación menor indica contaminación con proteínas o fenoles y valores por arriba de 2 significa que hay RNA disperso (Huescas- Espejel, 2004). c) Integridad Para determinar la integridad del ADN y su estado de degradación, se siguió el siguiente procedimiento: 1. Se preparó un gel de agarosa al 1% y se procedió inmediatamente a realizar la tinción con Bromuro de Etidio antes de que gelifique. 2. Se adicionó TAE 1X como buffer de corrimiento a la cámara de electroforesis 3. Se mezclaron 5 µL de cada muestra de DNA con 2 µL de buffer de carga 4. Se procedió a cargar cada muestra en los pozos del gel 5. Se efectuó el corrimiento a 120 volts, aproximadamente 40 minutos. 6. Se visualizó el DNA con el transiluminador y se fotografió en el fotodocumentador. 6.3.5 Modificación del DNA por tratamiento con bisulfito de sodio A) Método manual Las muestras de DNA cuya calidad y concentración fueron aceptables se sometieron al tratamiento con bisulfito de sodio Primera parte: Preparación del bisulfito de sodio e incubación del DNA 1.- Se pesaron 4g de bisulfito de sodio, se disolvió en 8 mL de agua grado HPLC (Cromatografía líquida de alto rendimiento) por sus siglas en inglés (Murray et al., 2013) y se mezcló. 2.- Se ajustó a un pH final de 5. 3.- Se pesaron 0.068 g de Hidroquinona, se incorporó a la solución y se mezcló. 28 4.- Se colocaron 22 µL de DNA de cada muestra y se desnaturalizaron en el termoblock a 95°C durante 5 minutos. 5.- Las muestras se colocaron en hielo y se les agregaron 22 µL de NaOH 1M. 6.- Se mezclaron e incubaron en baño María a 37°C por 30 minutos. 7.- Se agregaron 400 µL de bisulfito de sodio-hidroquinona y 56 µL de agua HPLC a cada muestra. 8- Se agregaron 3 gotas de aceite mineral a cada muestra. 9.-Las muestras se incubaron a 55°C durante 16 horas. Segunda parte de la modificación del DNA 1.- Se tomaron 480 µL de la muestra y se colocaron en otro tubo limpio. 2.- Se adicionó 1 mL de resina a cada muestra y se mezcló. 3.- Se adicionó la muestra DNA-resina (Wizard DNA Clean Up System de Promega). 4.- Se adicionaron 2 mL de alcohol isopropílico al 80% a cada muestra para el lavado. 5.- Se quitó la columna de la jeringa. 6.- Se centrifugó la columna a 10 000 rpm por 2 minutos. 7.- Se incubó en el termoblock a 70°C con 50 µL de agua grado HPLC. 8.- Se centrifugó la columna en cada tubo a 10 000 rpm por 1 minuto. 9.- Se eliminó la columna de la muestra. 10.- Se agregaron 24 µL de NaOH 1M y 6µL de agua grado HPLC, se incubó a 37°C de 15 a 30 minutos. 11.- Se adicionaron120 µL de acetato de amonio a cada tubo. 13.- Se adicionaron 600 µL de Etanol absoluto frío y se mezcló. 14.- Se centrifugó a 10 000 rpm por 8 minutos 15.- Se decantó y se dejó secar el pellet a temperatura ambiente. 16.- Se resuspendió el DNA en 50 µL de agua grado HPLC y posteriormente se incubó por 30 minutos. B) Método del Kit EZ DNA Methylation-Gold Las muestras que fueron modificadas por el método manual y que no amplificaron en la PCR de repeticiones CGG y de las islas CpG, fueron modificadas utilizando el kit EZ DNA Methylation Gold de Zymo Research. El procedimiento se llevó a cabo, siguiendo las instrucciones del manual. 29 6.3.6Amplificación de la región del gen FMR1 que contiene las repeticiones CGG mediante PCR Para la amplificación de los fragmentos que contienen las repeticiones, los iniciadores que se utilizaron fueron los siguientes: FR754F: 5´ (CAA CCT CAA TCA AAC ACT CAA CTC CA) 3´ N = 26 FR526R: 5´ (GGG AGT TTG TTT TTG AGA GGT GGG) 3´ N = 24 Los primers fueron diseñados para la cadena antisentido después del tratamiento con bisulfito de sodio (Panagopoulos et al., 1999). Condiciones de amplificación para la PCR de repeticiones CGG del gen FMR1: Cada reacción de PCR se realizó con un volumen de reacción de 25 µL en microtubos eppendorf de 0.2 mL. Veáse tabla 1. Tabla 1. Mezcla de reactivos para cada tubo de reacción de PCR para repeticiones CGG. Reactivo Concentración inicial Concentración final Volumen 1 rxn H2O HPLC ______ ______ 12.2 µL Buffer amplificación 10X ______ 2.5 µL PCR Enhancer 10X ______ 2.5 µL MgSO4 50 Mm 25 Mm 1.5 µL dNTP´S 2 µL Primer FR754F 20 pmol/ µL 0.5 µL Primer FR526R 20 pmol/ µL 0.5 µL Taq Platinum _____ ______ 0.3 µL DNA modificado manual _____ ____ 3 µL 30 Nota: En algunas reacciones se utilizaron hasta 6 µL de DNA modificado ajustando el volumen del H2O HPLC para que el volumen final fuera de 25 µL. El programa que se utilizó para la amplificación fue el siguiente: 1. Desnaturalización inicial 94°C 5 minutos 2. Desnaturalización 93°C 1 minuto 3. Alineación de cebadores 58°C 1 minuto 4. Extensión 74°C 2 minutos 5. Programar 31 ciclos de los pasos 2 al 4 6. Extensión final 74°C 10 minutos 7. Mantener a 4°C (opcional ) 6.3.7 Amplificación de la región del gen FMR1 que contiene las islas CpG mediante PCR Los iniciadores fueron diseñados para la cadena antisentido y son específicos para la amplificación de citosinas metiladas que están presentes tanto en individuos afectados así como en el gen FMR1 normal del cromosoma X inactivo (Panagopoulos et al., 1999). Los primers para la amplificación de las islas CpG localizadas rio arriba de las repeticiones, fueron los siguientes: FR690F: 5´ (AAC GAC GAA CCG ACG ACG) 3´ N = 18 FR611R: 5´ (CGT CGT CGC GTT GTC GTAC) 3´ N = 19 Condiciones de amplificación para la PCR de las islas CpG del gen FMR1: Cada reacción de PCR se realizó con un volumen de reacción de 25 µL en microtubos eppendorf de 0.2 mL. Veáse tabla 2. Tabla 2. Mezcla de reactivos para cada tubo de reacción de PCR de metilación islas CpG Reactivo Concentración inicial Concentración final Volumen 1 rxn H2O HPLC ______ ______ 14.2 µL Buffer (-MgCl2) 10X ______ 2.5 µL MgCl2 50 mM 25 mM 3µL 31 dNTP´S _______ 2.5 Mm 2 µL Primer FR690F ______ 20 pmol/ µL 0.5 µL Primer FR611R ______ 20 pmol/ µL 0.5 µL Taq Platinum _____ ______ 0.3 µL DNA modificado con Kit _____ ______ 2µL El programa que se utilizó para la amplificación fue el siguiente: 1. Desnaturalización inicial 94°C 5 minutos 2. Desnaturalización 93°C 30 segundos 3. Alineación de cebadores 65°C 30 segundos 4. Extensión 74°C 30 segundos 5. Programar 32 ciclos de los pasos 2 al 4 6. Extensión final 74°C 10 minutos 7. Mantener a 4°C (opcional ) 6.3.8 Electroforesis en gel de poliacrilamida (29:1) 1.- Se prepararon geles de poliacrilamida al 6% para correr las muestras de repeticiones CGG y geles al 12% para muestras de metilación islas CpG. 2.- Se utilizó TBE 1X como buffer de corrimento y se adicionó a la cámara de electroforesis. 3.- A cada muestra del producto de PCR se le agregaron 5 µL buffer de carga 6X, se mezcló y se tomaron 20 µL de cada muestra para cargar en el gel. 4.- La fuente de poder se programó a 67 Volts, 200 mA (mili Amperes) durante 16 horas. 6.3.9 Tinción de geles de poliacrilamida con nitrato de plata 1.- Los geles se sacaron de los cristales y se sumergieron en solución fijadora (compuesta por etanol absoluto al 10% y ácido acético 0.5%) durante 10 minutos. 32 2.- Se desechó la solución fijadora y se cubrieron con nitrato de plata de 5-10 minutos aproximadamente. 3.- El nitrato de plata se decantó y se almacenó en un frasco para reutilizarse, los geles se lavaron con agua destilada por 20 segundos - 1 minuto para quitar el exceso de solución. 4.- El agua destilada se eliminó y se sumergieron los geles en solución reveladora hasta la visualización de las bandas. 5.- La solución reveladora se eliminó, y se agregó solución fijadora por 20 segundos y se desechó. 6.- Se enjuagaron con agua destilada brevemente y se eliminó el agua (opcional). 7.- Los geles se montaron sobre un acetato y se almacenaron en una bolsa de plástico transparente. 8.- Se rotularon, se procedió a ser observados en el transiluminador y se tomó fotografía de cada uno. 6.3.10 Determinación del tamaño de la secuencia repetitiva CGG y del estado de metilación de las islas CpG a) Determinación del número de repeticiones CGG. Por la ubicación de los iniciadores empleados, la secuencia a amplificar CGG tendrá 183 pb más el tamaño de la secuencia repetitiva CGG que es particular para cada caso (Rosales-Reynoso et al., 2007). Para determinar el número de repeticiones CGG se utiliza la siguiente fórmula. Tamaño del amplificado (en pares de bases) – 183 pb N de repeticiones CGG = 3 b) Determinación del estado de metilación de las islas CpG. Se espera la amplificación de un fragmento de 80 pb en varones afectados y en mujeres (por el cromosoma X inactivo), mientras que en varones normales no habrá fragmentos amplificados. 33 Después del tratamiento con bisulfito, los residuos de Cm de los dinucleótidos CpG son reconocidos por los iniciadores que están diseñados para amplificar únicamente las secuencias que tienen citosinas y que no fueron modificadas por estar metiladas (Panagopoulos et al., 1999). 34 7. RESULTADOS De un total de 41 muestras de sangre periférica de pacientes veracruzanos se logró la extracción de DNA con la cantidad y calidad necesaria para el diagnóstico molecular del gen FMR1, la cual se realizó en dos etapas: 1) la identificación del de la secuencia repetitiva CGG, y 2) la determinación del estado de metilación de las islas CpG adyacentes al promotor del gen FMR1. En el ensayo de PCR para identificar la secuencia repetitiva CGG del gen FMR1 se detectó que, en 9 varones hubo un producto amplificado de 280 pb que corresponde a 32 repeticiones CGG, en 8 varones el producto fue de 270 pb correspondiente a 29 repeticiones y en 16 el amplificado fue de 260 pb lo que equivale a 26 repeticiones CGG; de las 7 mujeres solo una amplificó dos bandas, una de 260 pb y la otra de 300 pb, esto corresponde a 26 y 39 repeticiones CGG, estos números de repeticiones ubica a estos pacientes en el rango normal de repeticiones que va de 550 (Figura 8 y 9). De las 7 mujeres restantes solo se observó un amplificado de 270 pb en 3 de ellas, y en 4 mujeres el amplificado fue de 260 pb, para estas pacientes mujeres no fue posible obtener un diagnóstico para SXF. MP 280 pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 MP 280 pb Figura 8. Productos analizados en un gel de poliacrilamida al 6% ( representativo) y teñido con nitrato de plata. MP: Marcador de 20 pb; líneas 1-15 varones alelo normal, línea 16: control varón normal; línea 17: control varón afectado para X frágil. 35 1 2 3 4 5 6 7 280 pb Figura 9.Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% los productos amplificados. Línea 1.: Marcador 20 bp DNA Ladder; líneas 2, 3,4: mujeres que amplificaron una sola banda de 280 pb, línea 6,7: un amplificado de 260 pb, línea 5: mujer heterocigota que amplifica dos alelos uno de 260 pb y el otro de 300 pb. En el ensayo de PCR para determinar el estado de metilación del gen FMR1 se espera un amplificado de 80 pb para detectar la mutación completa, en los resultados obtenidos no hay producto de tal tamaño en todos los varones, solo se observan amplificados correspondientes a las muestras que funcionan como controles positivos, de lo anterior se concluye que el gen FMR1 no está metilado por lo tanto no hay individuos afectados con SXF. En todas las mujeres hubo un producto amplificado de 80 pb, caso en que el cromosoma X está inactivo de forma normal (Figura 10). MP 80 pb 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 MP 80 pb Figura 10. Productos analizados en un gel de poliacrilamida al 12%.MP: Marcador de 20 pb, líneas 2-13: varones normales no hay producto amplificado 80 pb, línea 14 y 18: varón X frágil control positivo, línea 15- 17: amplificado que corresponde al cromosoma X inactivo en mujeres, línea 19: carril sin muestra. 36 8. DISCUSIÓN Es conocido que la mutación que causa el síndrome X frágil se debe a un incremento de la secuencia repetitiva CGG a más de 200 tripletes, llamada mutación completa, lo que desencadena un proceso de hipermetilación que da lugar a la inactivación del promotor del gen FMR1 e impide el proceso de transcripción y la síntesis de la FMRP, pero como se mostró anteriormente, los resultados obtenidos fueron negativos, por lo que no se encontraron individuos afectados por síndrome X frágil. Los estudios realizados en otras partes del mundo que han detectado individuos afectados han utilizado un tamaño de muestra mayor al de nuestro estudio y criterios específicos, principalmente retraso mental presente en todos los pacientes, lo cual incrementa la probabilidad de encontrar individuos afectados con SXF. Dado que la frecuencia oscila entre el 0.6 y el 4%, se requieren más de 100 individuos de estudio, como es el caso de lo realizado en 176 muestras que fueron colectadas en Central Java, Indonesia, detectaron 7 pacientes con mutación completa los cuales tenían una historia familiar de SXF (Winarni et al., 2012), de 105 muestras en Guatemala se encontraron 5 individuos afectados y fueron seleccionados por tener un diagnóstico clínico para SXF (Yuhas et al., 2009),1127 niños en China fueron evaluados, se encontró que la mutación completa fue del 2.8% y presentaban retraso mental (Zhong et al., 1999), 1206 individuos en Delhi, India de los cuales 360 presentaban además de retraso mental un diagnóstico clínico para SXF y fueron 19 los individuos afectados. (Jain et al., 1998), 511 individuos en Francia, de los cuales 162 resultaron afectados por la mutación completa, todos tenían una historia familiar de SXF además de retraso mental (Rousseau et al., 1991). En México se realizó diagnóstico molecular a 62 niños con retraso mental idiopático, aquí la frecuencia de los individuos afectados fue del 3.2%, lo cual no es significativamente diferente de las reportadas en otras poblaciones. (González del Angel et al., 2000). Respecto a la prevalencia de la enfermedad, en la literatura existen reportes en poblaciones de diferentes partes del mundo, por lo que con la búsqueda y el desarrollo de un diagnóstico molecular para el síndrome X frágil desde los años 90, varios estudios se han llevado a cabo. Anteriormente se consideraba una prevalencia de 1:1000 varones esto en una población étnica, por lo que con las técnicas de diagnóstico molecular se hizo una reexaminación y se demostró que 1:4,000 varones se encuentran afectados por el síndrome X frágil (Turner et al., 1996), posteriormente estudios realizados en una población de Caucásicos principalmente del norte de 37 Europa establecieron una prevalencia de 1:4000 varones y 1:6000 mujeres afectados en la población general, pero un estudio realizado en dos poblaciones, una en Áfrico-Americanos reveló que 1/2545 varones y en Caucásicos 1/3717 están afectados por el síndrome X frágil. (Crawford et al., 2002). Similarmente los índices de SXF en individuos con retraso mental son comparables en Australia y Gran Bretaña 4.3%, Brasil 2%, Chile 5%, China 2.8%, Grecia 0.9%, Finlandia 5.4%, Holanda 4.2%, Indonesia 2.4%, Japón 2.1%, Puerto Rico 3%, Estados Unidos 1.1% y 0.6% y México 4.1%. La baja frecuencia de la mutación completa ha sido reportada para población de Negros en comparación con los Caucásicos, hay reportes del 6.1% de 148 varones negros de Sudáfrica que tienen la mutación completa, se reporta que el primer estudio de prevalencia en niños negros y caucásicos encontraron frecuencias comparables para ambas poblaciones Considerando las tasas de prevalencia, indican que la mayoría de varones y aproximadamente 50% de las mujeres con mutación completa están afectados por retraso mental (Mazzoco, 2000). Los varones con SXF se ven más gravemente afectados por discapacidad intelectual debido a que solo poseen un cromosoma X, en comparación con las mujeres que tienen dos cromosomas X, por lo que si el gen esta silenciado en uno, en el otro cromosoma se compensa la función del gen FMR1. Peprah (2012) resume la mayoría de los estudios que se han realizado en diferentes poblaciones. La prevalencia de SXF más baja ha sido reportada en Canadá, Estonia, Japón y Taiwán. Estas cifras fueron significativamente inferiores comparadas con países del occidente. Desde el 2008 reportes de países como Egipto e Irán han sido publicados, esto sugiere que el diagnóstico para SXF es ampliamente aceptado, la caracterización de las repeticiones CGG en el gen FMR1 es reconocido como un método para determinar la etiología de las discapacidad intelectual en diversas poblaciones. A medida que haya más reportes sobre la distribución de las repeticiones CGG (normal, premutación y mutación completa) pueden ser comparados con otras poblaciones bien caracterizadas (ej. poblaciones del oeste de Europa). Esta información es importante para: entender la inestabilidad genética y los elementos asociados además de comprender los riesgos en la población que podrían ser de interés para los expertos en asesoramiento genético así como para familias con una historia o están afectados por SXF y para quienes son portadores de una premutación y desean tener hijos (Peprah, 2012). 38 En cuanto al método utilizado, la determinación del número de repeticiones CGG y el estado de metilación de las islas CpG para el diagnóstico del síndrome X frágil, generalmente es realizado por Southern blot, desafortunadamente es muy caro, requiere más tiempo, el procedimiento no puede determinar repeticiones CGG cortas para alelos normales y con premutación, por el otro lado la PCR simple falla para amplificar estas repeticiones por el alto contenido de GC que resulta en la formación de estructuras secundarias, reactivos como 7-deaza-dGTP y otros aditivos han sido utilizados para resolver este problema pero tienen el inconveniente de reducir la visualización de los productos amplificados teñidos con Bromuro de Etidio o Nitrato de Plata (Rosales-Reynoso et al., 2005), por estas razones, el diagnóstico molecular por PCR en DNA modificado por bisulfito de sodio ha sido propuesto como un método alternativo, rápido, confiable y de costo razonable, para estimar el número de repeticiones CGG en síndrome X frágil y en otras enfermedades causadas por repetición anormal de trinucleótidos como la enfermedad de Huntington. Es un método de detección rápido, y viable para el diagnóstico, su confiabilidad ha sido comprobada y reportada en diversos estudios (Rosales-Reynoso et al., 2007, 2005; Vielma, 2008). El método se utiliza ampliamente en varones, también puede utilizarse para mujeres, en nuestro estudio fue posible discriminar mujeres heterocigotas con alelos normales, por lo cual resultan ser negativas para SXF. Aunque existe una complicación, debido a la metilación que causa que un cromosoma X se inactive, hay una restricción para la aplicación de este método, existe un 20% de posibilidad de que un alelo sea homocigoto en las mujeres, por esto, cuando en el análisis se amplificó una sola banda hay dos alternativas posibles, un alelo se observa dentro del rango normal de repeticiones pero al ser homocigota la mujer, un alelo no se puede observar y por tanto no es posible determinar si equivale a una premutación que no es posible visualizar o a una mutación completa que no es posible amplificar con esta metodología. Sin embargo, hay experimentos preliminares en los cuales por este método se ha logrado detectar premutaciones (6 mujeres de 9=67%) (Panagopoulos et al., 1999). Hay reportes en la literatura, en los cuales han modificado la PCR como una técnica capaz de amplificar premutaciones y mutaciones completas en varones y en mujeres, método reportado previamente por Lyon et al., 2010, llamada TRP PCR (triplet repeat primed PCR), es un test no tan caro, con una alta sensibilidad y especificidad, amplifica las repeticiones CGG, utiliza un 39 primer fluorescente y permite la rápida detección, los productos amplificados son analizados por electroforesis capilar (Basehore et al., 2012). 40 9. CONCLUSIONES Los resultados sugieren que se requiere de un tamaño de muestra mayor y como criterio principal para un estudio de población sin fenotipo definido, los pacientes a los que se les realice diagnóstico molecular para SXF, deben presentar, al menos discapacidad intelectual idiopática. La PCR que determina el número de repeticiones del trinucleótido CGG es la primera prueba que se realizó para conocer el número de repeticiones CGG, la cual permitió detectar alelos en el rango normal en todos los varones. La PCR que detecta el estado de metilación de las islas CpG del gen FMR1 es la segunda prueba que se puede realizar para confirmar los resultados obtenidos en la PCR de repeticiones CGG, la cual logra detectar la mutación completa en varones (en nuestro caso se observó en el control positivo) y permitió amplificar el cromosoma X inactivo en las mujeres. Este método en las mujeres solo permite descartar el SXF al amplificar dos alelos en el rango normal (5-50 CGG). La metodología tiene una limitante, ya que no permite diagnosticar SXF en mujeres que amplifican una sola banda. 41 10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Alonso, MAV. El cambio de paradigma en la concepción de retraso mental: la nueva definición de la AAMR. 1994. Siglo Cero. Basehore, J.M. Marlowe, N.M. 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Preparación de reactivos para extracción de DNA BUFFER ACK LISIS Componentes Cloruro de amonio NH4Cl Bicarbonato de potasio KHCO3 EDTA disódico Na2EDTA 250 mL 2.01g 0.25g 9.3mg 1.-Se disolvió y aforó a 250 mL de agua mili-Q hasta su completa disolución, en parrilla de agitación. 2.- Se ajustó el pH entre 7.2-7-4. 3.- Se rotuló el frasco y se almacenó a temperatura ambiente. ETANOL AL 75% 75 ml etanol al 100% 37.5 ml etanol al 100% 100 ml agua 50 ml agua El etanol absoluto se disolvió en agua inyectable estéril para prepararlo a una concentración del 75%, se almacenó a temperatura ambiente en un tubo Corning de 50 mL y fue rotulado. SOLUCIÓN NaOH 8 Mm 1M NaOH= 40g 40 g ---------1000 mM 0.32 g --------8 mM 0.32 g---------1000 mL 0.064 g---------200 mL Se disolvió y se aforó a 200 mL en agua inyectable estéril. Se rotuló el frasco y se almacenó a temperatura ambiente. Preparación de reactivos para electroforesis TAE 10X Y TAE 1X TAE 10X Tris 40 mM Ácido acético Na2 EDTA 2H2O H20 mili-Q 1L 48.4 g 11.42 ml 7.44 g 1L TAE 1X 1 L 900 mL H20 mili-Q 100 mL TAE 10 X 45 GELES DE AGAROSA AL 1% y al 4% Previamente: Se preparó la charola donde va el gel colocándole masking-tape a los lados, y se le colocó finalmente el peine. 1.-Se pesaron 0.3 g de para un gel al1% y 1.2 g para un gel al 4%, y se vació a un matraz especial para preparar geles. 2.- Se añadieron 30 mL de TAE 1X. 3.- Se disolvió con calor en el microondas (haciendo pausas), hasta que la mezcla quedó homogénea y transparente. 4.- Se agregaron inmediatamente 5 µL de Bromuro de Etidio, se mezcló cuidadosamente y se vació el gel a la charola. 5.- Se dejaron transcurrir aproximadamente 20 minutos hasta que el gel este sólido, se le retira el peine. 5.- Se llenó la cámara con buffer TAE 1X hasta la marca y se coloca el gel para proceder a cargar las muestras de DNA. Preparación de reactivos para la modificación del DNA SOLUCIÓN DE BISULFITO DE SODIO-HIDROQUINONA Reactivo Peso molecular Cantidad / 10 mL Bisulfito de sodio 104.06 g/mol 4.0 g Hidroquinona 110.11 g/mol 0.068 g Concentración final 3.1 M 0.5 M 1.- Una vez pesado el bisulfito de sodio, se mezcló en parrilla de agitación, se ajustó a un pH=4.9 -5.1con gotas de NaOH 10 M. 2.- Una vez ajustado el pH, se incorporaron 0.068 g de Hidroquinona y se mantuvo en parrilla de agitación para su disolución. 3.- La probeta se almacenó en una probeta cubierta con papel para proteger la solución de la luz y evitar su oxidación, se mantuvo a 4°C brevemente para su uso posterior. ACETATO DE AMONIO Reactivo Acetato de Amonio Peso molecular 77.08 g/mol Cantidad / 50 mL 38.54 g 1.- El acetato de amonio se disuelve en H20 grado HPLC. 2.- Se ajustó el pH=7.0 HIDROXIDO DE SODIO 10 M Reactivo Peso molecular Cantidad / 50 mL NaOH 40.0 g/mol 20 g Concentración 10 M Concentración 10M Preparación de reactivos para la PCR MEZCLA DE dNTP’s 46 Concentración Inicial (100 mM) dATP dCTP dGTP dTTP 1 L H2O L Total Concentración Final 5 5 5 5 45 45 45 45 50 L 50 L 50 L 50 L 10 mM 10 mM 10 mM 10 mM Preparación de reactivos para electroforesis en gel de poliacrilamida SOLUCIÓN FIJADORA 1.- Mezclar 100 mL de etanol absoluto con 5 mL de ácido acético. 2.- Aforar a 1 L con agua destilada. SOLUCIÓN CON NITRATO DE PLATA Pesar 2 g de AgNO3 y aforar a 1L con solución fijadora. SOLUCIÓN REVELADORA Pesar 30 g de NaOH, agregar 5 mL de formaldehído y aforar a 1 L con agua destilada. GEL DE POLIACRILAMIDA AL 12% (29:1) 22.5 mL de agua destilada 18.4 mL de poliacrilamida 29:1 (29 g de acrilamida, 1 g de bis acrilamida en 100 mL). 4.6 mL de buffer TBE 10X (EDTA 0.02 M, Tris 0.89 M, ácido bórico 0.89 M) pH 8.0. 460 L de persulfato de amonio (APS) al 10%. 46 L de TEMED Se mezclan todos los componentes, se transfiere el contenido a los cristales previamente montados, se coloca el peine y se deja polimerizar. Una vez polimerizado el gel, se retiró el peine, el empaque y los separadores y se lavó cuidadosamente con agua destilada. Se colocó buffer de corrimiento en la cámara de electroforesis y se colocaron los cristales cuidadosamente para evitar formación de burbujas para el montaje de las muestras. Se dejó correr por 16 horas, 67 Volts/ 200 mA. GEL DE POLIACRILAMIDA 6% 31.6 mL de agua destilada 9.2 mL de poliacrilamida 29:1 (29 g de acrilamida, 1 g de bis acrilamida en 100 mL). 47 4.6 mL de buffer TBE 10X (EDTA 0.02 M, Tris 0.89 M, ácido bórico 0.89 M) pH 8.0. 460 L de persulfato de amonio (APS) al 10%. 46 L de TEMED Se mezclan todos los componentes, se transfiere el contenido a los cristales previamente montados, se coloca el peine y se deja polimerizar. Una vez polimerizado el gel, se retiró el peine, el empaque y los separadores y se lavó cuidadosamente con agua destilada. Se colocó buffer de corrimiento en la cámara de electroforesis y se colocaron los cristales cuidadosamente para evitar formación de burbujas para el montaje de las muestras. Se dejó correr por 16 horas, 67 Volts/ 200 mA. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS AMPLIFICADAS A cada producto amplificado se le adicionan 5 L de buffer de carga 6X, posteriormente se aplicaron las muestras en un gel de poliacrilamida al 6 y 12%. 48 Anexo 2 CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO . Instituto de Investigaciones Médico Biológicas Veracruz; Ver a ___ de ____________de 2012 A quien corresponda: Por medio de la presente hago de su conocimiento que ha sido mi consentimiento en forma libre, voluntaria y sin presiones para participar en el proyecto de investigación “FRECUENCIA DE MUTACIONES EN EL LOCUS PARA EL SINDROME X FRAGIL EN DOS POBLACIONES DE NIÑOS INSTITUCIONALIZADOS” a cargo del Dr. Roberto Lagunes Torres que se realizará en dos lugares: la toma de muestra sanguínea será en el CRIVER y el análisis molecular en el laboratorio del Instituto de Investigaciones Medico Biológicas en Veracruz; Veracruz. He sido informado que el estudio consiste en calcular la frecuencia con la que se presenta la mutación que causa el Síndrome X Frágil en niños que acuden al CRIVER por presentar retraso mental, trastornos de aprendizaje y conductas autistas. Esto se realizara tomando una muestra de sangre de la vena del brazo del niño, existiendo la mínima posibilidad de que se forme un moretón, posteriormente en el laboratorio se realizara la extracción del material genético (DNA) de cada una de las muestras obtenidas y será analizado con una prueba molecular conocida como PCR, los resultados obtenidos de esta prueba permitirán identificar a los niños y niñas que sean portadores o estén afectados por el Síndrome X Frágil. Tengo el conocimiento de que este estudio se obtendrá como beneficio a un mejor y correcto diagnóstico de esta enfermedad y que permitirá ser más conocida entre los profesionales de la salud y en la población en general y ser distinguida de otras enfermedades genéticas que presenten signos y conductas similares al Síndrome X Frágil, así como para establecer de manera más adecuada el riesgo que existe de transmisión a la descendencia. Es de mi conocimiento que este estudio no tiene ningún costo para mí. También se me explicó que la información obtenida es confidencial, así mismo se me ha explicado que puedo solicitar información adicional acerca de los riesgos y beneficios de mi participación y que estoy en libertad de negarme a participar en el estudio, sin que esto modifique la calidad de atención médica que reciba en el CRIVER. Finalmente doy mi consentimiento para que se informe el resultado del análisis molecular en forma directa bajo confidencialidad. NOMBRE DEL PACIENTE: ______________________________________________ NOMBRE Y FIRMA DEL PADRE O TUTOR: ______________________________ RESPONSABLE DEL PROYECTO: DR. ROBERTO LAGUNES TORRES FIRMA_________ 49