Estudio de las vías visuales superiores en el glaucoma

Estudio de las vías visuales superiores en el
glaucoma experimental
Bordone, Melina Paula
2015 03 20
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
www.digital.bl.fcen.uba.ar
Contacto: digital@bl.fcen.uba.ar
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Fuente / source:
Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
Estudio de las vías visuales superiores en el glaucoma
experimental
Tesis presentada para optar al título de Doctora de la Universidad de
Buenos Aires en el área: CIENCIAS BIOLÓGICAS
Melina Paula Bordone
Directora de tesis: Prof. Dra. Ruth Estela Rosenstein
Consejero de Estudios: Prof. Dr. Matías Pandolfi
Lugar de trabajo: Departamento de Bioquímica Humana, Laboratorio de
Neuroquímica Retiniana y Oftalmología Experimental, Facultad de Medicina, UBA.
CEFyBO/CONICET.
Buenos Aires, 2015
Estudio de las vías visuales superiores en el glaucoma experimental
El glaucoma, una de las principales causas de ceguera irreversible, se caracteriza por una pérdida
progresiva de las funciones visuales, que se asocia a la muerte de células ganglionares retinianas
(CGRs) y atrofia de la cabeza del nervio óptico (NO). El principal factor de riesgo es el aumento de
la presión intraocular (PIO). Aunque el glaucoma fue concebido como una enfermedad limitada al
ojo, los axones de las CGRs son extraoculares, con componentes intraorbitales e intracraneales. En
este trabajo de Tesis se examinaron los efectos del glaucoma experimental agudo y crónico sobre el
sistema visual consciente (SV-C) y el sistema visual no formador de imagen (SV-NFI). El SV-C en
la rata, se compone de las CGRs clásicas y sus axones que proyectan al colículo superior (CS) y al
núcleo geniculado lateral (NGL). El SV-NFI se compone por las CGRs intrínsecamente fotosensibles
que expresan melanopsina (CGRsm) y proyectan a los núcleos supraquiasmáticos (NSQ), al núcleo
pretectal olivar (NPO) y al intergeniculado (IG), que participan en la sincronización del reloj
circadiano y el reflejo pupilar, entre otros. El modelo de glaucoma agudo consistió en un aumento de
la PIO a 70 mm de Hg durante 90 min (hipertensión ocular aguda, HOA), en tanto que el glaucoma
crónico se indujo a través de inyecciones intracamerales de condroitín sulfato (CSU), una vez por
semana, durante 15 semanas. A los 7 días post-HOA se observó una alteración significativa de la
función y estructura retinianas, con una pérdida significativa de CGRs, así como cambios astro- y
microgliales en el CS y una disminución en el transporte anterógrado desde la retina al CS y NGL,
pero no a los NSQ y al NPO. El número de CGRsm, los niveles de melanopsina y el reflejo pupilar
consensual permanecieron inalterados aún a las 4 semanas post-HOA. La administración de CSU por
6 semanas indujo alteraciones en la función retiniana y en la vía visual, una disminución en el
transporte anterógrado a todas las áreas de proyección y cambios gliales a nivel del NO, el CS y la
retina. En el CS, estas alteraciones incluyeron una marcada respuesta micro- y oligodendroglial y una
moderada respuesta astrocitaria, que se acompañaron de una disminución del contenido lipídico. A
las 15 semanas de glaucoma crónico, estas alteraciones fueron más marcadas e incluyeron
alteraciones en los axones, sin afectar el número de neuronas coliculares. La minociclina previno
algunas de las alteraciones inducidas por la hipertensión ocular crónica, como el déficit en el
transporte anterógrado desde la retina al CS. En cuanto al SV-NFI, el glaucoma crónico indujo una
caída significativa en el número de CGRsm y los niveles de melanopsina, así como en el transporte
desde la retina a los NSQ y el NPO, con una disminución en el reflejo pupilar consensual. En suma,
los resultados obtenidos en esta Tesis aportan datos de relevancia respecto a la participación de las
áreas visuales post-retinianas en el daño glaucomatoso.
Palabras clave: células ganglionares, glaucoma, glía, hipertensión ocular, minociclina, sistema visual
consciente, sistema visual no formador de imagen, transporte axonal.
Study of superior visual pathways in experimental glaucoma
Glaucoma, one of the main causes of irreversible blindness, is characterized by a progressive loss of
visual functions, which is associated to retinal ganglion cell (RGCs) death and optic nerve (NO)
atrophy. The increase in intraocular pressure (IOP) is one of the main risk factors. Classically,
glaucoma has been conceived as a disease limited to the eye, but axons of RGCs have extraorbital
and intracranial components. In this Thesis work, the effects of acute and chronic experimental
glaucoma on the conscious visual system (C-VS) and the non-image forming visual system (NIF-VS)
were examined. The C-VS in rats includes classical RGCs and their axons that project to the superior
colliculus (SC) and the lateral geniculate nucleus (LGN). The NIF-VS is composed by intrinsically
photosensitive RGCs expressing melanopsin (mRGCs) that project to the suprachiasmatic nuclei
(SCN), pretectal olivary nucleus (OPN) and intergeniculate leaflet (IG), which drive circadian
rhythms and pupillary light reflex (PLR), among others. The acute glaucoma model was induced by
increasing IOP to 70 mm Hg for 90 min (acute ocular hypertension, AOH), whereas chronic
glaucoma was induced by intracameral injections of chondroitin sulfate (CSU), once a week, for 15
weeks. At seven days post-AOH, a significant impairment of retinal function and structure, with a
significant RGCs loss, and astro- and microglial changes were observed in the CS. At the same time,
a marked reduction in anterograde transport to the SC and LGN, but not to the SCN and the OPN,
was observed. At 4 weeks post-AOH, mRGCs cell number, melanopsin levels, and consensual PLR
remained unchanged. CSU administration for 6 weeks induced alterations in retinal and visual
pathway function, a decrease in anterograde transport to all of the RGCs projecting areas, and glial
changes at the level of the retina, ON, and SC. In the SC, these alterations included a marked microand oligodendroglial response and a moderate astrocytic response, which were accompanied by a
decrease in lipid content. At 15 weeks of chronic glaucoma, these changes were more intense and
included axonal changes, without affecting collicular neuron number. Minocycline prevented some
of the alterations induced by chronic ocular hypertension, and the anterograde transport deficit to the
CS. As for the NIF-VS, chronic glaucoma induced a significant reduction of mRGCs number,
melanopsin levels, and anterograde transport to the SCN and OPN, as well as a decrease in
consensual PLR. In summary, the results obtained in this Thesis work provide relevant information
regarding the participation of post-retinal visual areas in glaucomatous damage.
Keywords: retinal ganglion cells, glaucoma, glia, ocular hypertension, minocycline, conscious visual
system, non-image forming visual system, axonal transport.
Agradecimientos
Describir lo que significó la realización de esta Tesis inevitablemente me traslada a lo vivido durante mi
primer Maratón. Entrenar para un maratón no solo requiere preparación física sino también mental.
Motivación, confianza, dedicación, responsabilidad, tolerancia a la frustración y al dolor, paciencia,
perseverancia, compañerismo y entrega, son cualidades que se cultivan en las pistas y se trasladan a la
vida, y en este caso también, al quehacer científico. El científico, y sobre todo el que aspira a serlo,
motivado por la curiosidad y un eventual descubrimiento a veces se ve frustrado por experimentos que no
dan, técnicas que no salen e incluso aparatos que no andan, reactivos que no llegan y otras cuestiones que
superan la realidad para la que uno ha sido entrenado durante sus épocas de estudiante. Luego, la
paciencia, las charlas con compañeros de labo más experimentados o con amigos y familiares que tocan el
tema de oído y mucha perseverancia, permiten volverse a embarcar en la búsqueda de alguna nueva pista.
Aprender a aceptar la incertidumbre y confiar en que en algún momento todo va a llegar a buen puerto
resulta imprescindible para no bajar los brazos y volverlo a intentar. Tal como le ocurre al maratonista,
los primeros kilómetros casi no se sienten, pasada la primera mitad afloran un mar de dudas e incontables
dolores y sin embargo, uno sigue. Sólo cuando ya falta poco se toma conciencia del esfuerzo invertido y
el camino transitado. Es entonces cuando la balanza se inclina y brotan energías desde lo más profundo,
para tirar hasta el 40 y disfrutar del sprint final, esos 2,195 km llenos de emociones indescriptibles junto
con la imagen de todas aquellas personas que hicieron posible tremenda locura. Les agradezco:

A Ruth, por confiar en mí para lanzarme a la aventura, por transmitirme su amor por la retina, por
acompañarme en los primeros pasos y en los últimos, por sacar la brújula en los momentos clave,
por su rigurosidad y sus críticas para hacer de éste un trabajo más sólido y de mí una persona más
fuerte.

A Laura Pasquini, por enseñarme el mundo de los oligodendrocitos, la infinidad de inmunos y
anticuerpos, las horas en el confocal, el IMARIS, las charlas y los papers.

A Dami, por su amistad, sus consejos y su guía, su entusiasmo, su generosidad inmensa y su
tiempo, muchas veces hasta largas horas de la noche.

A Moni, por ser madre y compañera al mismo tiempo. ¡Trabajo difícil ese, si los hay! Por ser mi
ejemplo desde que tengo 6, por guiarme hasta acá y ¿después?, por la búsqueda de papers, la
puesta a punto de técnicas y la bibliografía de la Tesis. A vos Ma, gracias infinitas.

A Ine, por la paciencia y ayuda con las compras de reactivos, trámites burocráticos, las meriendas
todas y los descuentos, Jaja!

A Dani, por las charlas y los mates, las recetas vegetarianas y por localizar algo en el labo cada
vez que necesitaba.

A Pablito, por las inyecciones de CSU, sus chistes malos, su entusiasmo y su carisma, su amistad.
Agradecimientos

A los peques, Flor, Marquitos y Magui, por rejuvenecer al labo, la buena onda, el inmenso
compañerismo, los mates, las horas de compu, los VEPs, las charlas de biología y de la vida.
Chiquis, los quiero!

A Maga, por ofrecerme su hogar durante el doctorado y sus consejos para los formularios de las
becas.

A Diego, Eze, Nuria, Nico, con quienes compartí los últimos años de la Licenciatura y los
primeros del Doctorado, por enseñarme mucho de lo que sé de la “mesada” y dejarme “meter
mano” en sus experimentos.

A Charly, por procesar todos mis “nervios”, las horas y charlas en el MET y por su buena onda.

A Mariana, por ayudarme con el Red Oil, su compañía en las interminables cuantificaciones de
los procesos de la glía, las charlas de la vida y su amistad.

A los “Lemmings”, por los reactivos y la yerba prestada/robada, el microscopio, los almuerzos
compartidos, los festejos conjuntos. En especial a Memi y, también en este último tiempo, a
Silvia, por sus charlas y su amistad.

A mis padres, por darme la vida y por hacer de mí hoy una mujer independiente. A Mamá, por
estar en los momentos más difíciles, darme su garra, su sensibilidad y su valor y por su inmenso
amor. A Papá, por decir sí a todas mis locuras, inculcarme el amor por la naturaleza y la aventura,
y por los no sé cuántos miles de km de ruta para verme cruzar la Cordillera de los Andes a pie!

A mis hermanos, Aye y Ale porque son únicos, por el amor/odio, porque los veo y me veo y los
amo.

A Javi, por entregarme su corazón, hacer mi vida más hermosa y el mundo un lugar más feliz, por
su infinito compañerismo y generosidad, por su ternura y espontaneidad, por su música y por su
gran ayuda en toda esta última etapa.

A mis primos Lore y Victor y sus pimpollos, Celes y Tizi, por su apoyo incondicional, su amor y
sus abrazos.

A Jorge y a Pablito, por las intensas charlas y consejos y por su incondicional apoyo y su cariño.

A mi abuela, por ofrecerme su casa para internarme a estudiar y por bancarse mis nervios antes de
los exámenes.
Agradecimientos

A Laura Colman, por estos 5 años que llevamos juntas, por enseñarme a superar dificultades y
miedos, por animarme a animarme y perseguir mis sueños y por confiar en mí antes que yo
misma.

A “las chichis del Nacional” (Ceci, Flor, Naty, Meli, Lu y Andy) y a mis “compañeritas de la
vida” (Romi, Taty, Nadia, Fer, Lau y Adri), por cultivar todos estos años de amistad repletos de
los más hermosos recuerdos.

A mis amigos de la Facu (Ale, Vero, Belu y Camilo), por las innumerables catarsis doctorales y
científicas. Ya casi estamos, chicos! =)

A Eric Rosenberg, por quererme como un hermano, por las interminables charlas a la salida de los
entrenamientos, por las marchas, su confianza y su apoyo. HLVS!

A Pablito y a Pau, por enseñarme la otra cara del deporte, a correr con una sonrisa y a respirar
para desechar lo negativo, por su tiempo, su entrega, su sensibilidad y su amistad sincera.

A los TROTAS, por su compañerismo y su generosidad desinteresada, por contagiarme su
entusiasmo y energía, por los domingos a las 6 AM, por los fondos y decenas de km, por los
nervios de las largadas y el llanto de llegada, por demostrarme que no existen imposibles, por los
PISTA, PISTA, PISTA que pasaron y que están por venir!

A la Facultad de Medicina de la UBA, en especial al CEFyBO, por el lugar de trabajo brindado
para la realización de esta Tesis.

Al Sistema Nacional de Microscopía por haberme permitido la utilización de los equipos de
microscopía confocal (Dpto. de Fisiología de la Fac. de Medicina de la UBA) y de microscopía
electrónica (Instituto de Biología Celular y Neurociencia “Prof. E. De Robertis”).

Al IQUIFIB del Dpto. de Química Biológica de la Fac. de Farmacia y Bioquímica de la UBA, por
las innumerables horas en el crióstato y en el microscopio de fluorescencia.

Al Estado Nacional que financió mi educación primaria, secundaria y hasta mi formación
universitaria y de post-grado.
A mis padres, Mónica y Sergio.
Al NROE, porque esta Tesis es el
reflejo de un trabajo en equipo.
A Javi, por acompañarme desde
el 28 y hacer los últimos km
más felices y divertidos.
“The difficulty lies, not in the new ideas,
but in escaping from the old ones…”
John Maynard Keynes
(1883-1946)
“…Mi abuelo era ciego. Año tras año se sentó en la misma
habitación ante un brasero de carbón, en el mismo rincón
vuelto hacia el Este. Cada tanto volvía la cabeza hacia el
Sur, pero nunca al Norte. Una vez que me di cuenta de ese
hábito suyo de volver la cara sólo en una dirección, me
sentí tremendamente perturbado (…) Eso me provocaba
malestar. Me parecía misterioso. Al sur había lugares
soleados y me pregunté si, aun siendo ciego, podría
percibir esa dirección como algo un poco más
luminoso…”
Historias en la palma de la mano, Yasunari Kawabata,
1971.
“The pressures on scientists today
oppose truly creative thinking.”
Craig Loehle, 1990.
Los resultados presentados en este trabajo de Tesis forman parte de las siguientes publicaciones
-
Effect of retinal ischemia on the non-image forming visual system.
Ma. Florencia González Fleitas 1, Melina P. Bordone1, Ruth E. Rosenstein, Damián Dorfman.
Chronobiology International 2014; 19:1-12. (versión electrónica previa a publicación)
1
-
: ambos autores prestaron igual contribución al trabajo citado.
Experimental glaucoma in rats induces early glial alterations in the superior colliculus
Melina P. Bordone, Laura A. Pasquini, Pablo H. Sande, Marcos Aranda, Ezequiel Salido, Ruth
Rosenstein. (manuscrito en redacción)
-
Involvement of microglia in the early disruption of the retinal anterograde transport
induced by experimental glaucoma
Melina P. Bordone, Damián Dorfman, Pablo H. Sande, Laura A. Pasquini, Ma. Florencia
González Fleitas, Ruth Rosenstein. (manuscrito en redacción)
Índice
ABREVIATURAS
1
INTRODUCCIÓN
6
1. El ojo
6
1.1. Características generales
6
1.2. Cámara anterior y cámara posterior
9
1.2.1. Producción y circulación del humor acuoso
11
1.2.2. La red trabecular o trabeculado
12
1.3. La retina
15
1.4. Vasculatura del ojo
19
2. El nervio óptico
21
3. Las vías visuales superiores
23
3.1. Características generales
23
3.2. Colículo superior
24
3.3. Núcleo geniculado lateral
26
3.4 Núcleos supraquiasmáticos
27
4. Las células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles
28
5. La glía
30
5.1. Macroglía
30
5.1.1. Astrocitos
30
5.1.2. Células de Müller
31
5.2. Microglía
32
5.3. Oligodendrocitos
37
6. El glaucoma
40
6.1. Características generales
40
6.2. Modelos experimentales de glaucoma
41
Índice
6.3. La vía visual en el glaucoma
44
7. La minociclina
47
OBJETIVOS
49
MATERIALES Y MÉTODOS
50
1. Animales
50
1.1. Inducción de glaucoma agudo
50
1.2. Inducción de glaucoma crónico
51
1.2.1. Tratamiento con minociclina
52
2. Determinación de la presión intraocular
52
3. Función de la retina y la vía visual
53
3.1. Electrorretinografía escotópica
53
3.2 Potenciales oscilatorios
54
3.3 Potenciales visuales evocados (VEPs)
54
4. Evaluación del reflejo pupilar
55
5. Procesamiento histológico
56
5.1. Secciones semifinas
56
5.2. Obtención de cortes en parafina
57
5.3. Cortes por congelación
57
6. Microscopía electrónica
58
6.1. Análisis ultraestructural del nervio óptico
58
6.2. Análisis ultraestructural del colículo superior
58
7. Análisis de células TUNEL(+)
59
8. Análisis de inmunomarcación y detección con isolectina Griffonia simplicifolia I
59
8.1. Inmunofluorescencia
60
8.2. Inmunohistoquímica y detección con isolectina Griffonia simplicifolia I
61
Índice
8.2.1. Inmunomarcación en retinas en montaje plano
61
9. Coloración de lípidos por Red Oil
62
10. Procesamiento de imágenes y cuantificación
62
10.1. Análisis de la retina
62
10.1.1. Evaluación morfométrica de cortes transversales de retina
62
10.1.2. Cuantificación de células ganglionares en retinas en montaje plano
63
10.1.3. Cuantificación de CGRs melanopsina(+) (CGRsm)
63
10.2. Análisis del nervio óptico
64
10.2.1. Determinación del número y área axonal
64
10.2.2. Distribución de frecuencias del número de líneas intraperiódicas
65
10.3. Determinación del área inmunorreactiva en la retina y el nervio óptico
65
10.4. Análisis del colículo superior
66
10.4.1. Cuantificación del área inmunomarcada por GFAP y VgluT-2
66
10.4.2. Cuantificación de la inmunorreactividad para Iba-1 y el número de
66
células Iba-1(+)
10.4.3. Cuantificación de la marca de Red Oil, O1 y pNF-H
67
10.4.4. Análisis por microscopía confocal
67
10.4.4a. Cuantificación del número de células NeuN(+)
68
10.4.4b. Análisis de la complejidad celular por IMARIS
68
11. Transporte de la subunidad de la toxina colérica (CTB)
69
11.1. Inyección intravítrea de CTB
69
11.2. Análisis del transporte de CTB
70
12. Western blot
70
14. Análisis estadístico
71
Índice
RESULTADOS
72
1. Modelo experimental de glaucoma agudo
72
1.1. Sistema visual formador de imagen
72
1.2. Sistema visual no formador de imagen
78
2. Modelo experimental de glaucoma crónico
2.1. Sistema visual formador de imagen
2.1.1. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel del nervio óptico
82
82
94
2.1.2. Efecto del glaucoma crónico experimental sobre la estructura axoglial 103
del colículo superior
2.1.3. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel retiniano
123
2.1.4. Tratamiento con minociclina
126
2.2. Sistema visual no formador de imagen
134
DISCUSION
138
1. Modelo experimental de glaucoma agudo
138
2. Modelo experimental de glaucoma crónico
140
2.1. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel del nervio óptico
147
2.2. Efecto del glaucoma crónico experimental sobre la estructura axoglial del 151
colículo superior
2.3. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel retiniano
164
2.4. Tratamiento con minociclina
166
3. Sistema visual no formador de imagen en el glaucoma agudo y crónico
169
4. Consecuencias conceptuales de los resultados obtenidos y perspectivas futuras
175
BIBLIOGRAFÍA
178
Abreviaturas
ABREVIATURAS
A: amácrina
ACPs: arterias ciliares posteriores
ACR: arteria central retiniana
AH: ácido hialurónico
Al: axolema
Ap: axoplasma
ARNm: ácido ribonucleico mensajero
AS: astrocito
B: bastón
BDNF: factor neurotrófico derivado del cerebro
C: cono
CB: célula bipolar
CCG: capa de células ganglionares
CFN: capa de fibras nerviosas
CG: célula ganglionar
CGRs: células ganglionares retinianas
CGRsm: células ganglionares retinianas melanopsina(+)
CNE: capa nuclear externa
CNI: capa nuclear interna
CNP: actividad CNPasa, β’:γ’-nucleótido cíclico-3-fosfodiesterasa
CPE: capa plexiforme externa
1
Abreviaturas
CPI: capa plexiforme interna
CPO: célula precursora de oligodendrocitos
CS: Colículo Superior
CSS: Colículo Superior Superficial
CSU: condroitín sulfato
CTB: subunidad  de la toxina colérica
CV1: corteza visual primaria
DS: dermatán sulfato
EE: error estándar
EP: epitelio pigmentario
ERG: electrorretinograma
FR: fotorreceptores
GABA: ácido -aminobutírico
GAGs: glicosaminoglicanos
GalC: galactocerebrósido
GFAP: proteína glial fibrilar ácida.
G-HT: tracto genículo-hipotalámico
GSA: aglutinina de Griffonia simplicifolia
H: célula horizontal
HOA: hipertensión ocular aguda
HS: heparán sulfato
Iba-1: molécula adaptadora de unión a calcio ionizado- 1
IG: Intergeniculado
2
Abreviaturas
IL: interleuquina
KS: keratán sulfato
Li: líneas intraperiódicas
LPS: lipopolisacárido bacteriano
M: célula de Müller
MAG: glicoproteína asociada a mielina
MBP: proteína básica de mielina
MEC: matriz extracelular
MET: microscopio electrónico de transmisión
Mi: microglía
MINO:minociclina
MLE: membrana limitante externa
MLI: membrana limitante interna
MOG: glicoproteína de mielina de oligodendrocitos
Nf: neurofilamento
NG2: proteoglicano condroitín sulfato- 4
NGL: Núcleo Geniculado Lateral
NGLd: NGL dorsal
NGLv: NGL ventral
NMDA: N-metil-D-aspartato
NO: nervio óptico
NOS: óxido nítrico sintasa
Np: neuropilo
3
Abreviaturas
NPO: Núcleo Pretectal Olivar
NSQ: Núcleos Supraquiasmáticos
O1: marcador de oligodendrocitos- 1
O4: marcador de oligodendrocitos-4
Ol: oligodendrocito
OM: oligodendrocito mielinizante
OMi: oligodendrocito mielinizante inmaduro
OMm: oligodendrocito mielinizante maduro
OX-42: integrina -M/-2, también conocido como CD11b.
PACAP: polipéptido hipofisario activador de la adenilato ciclasa
PDGFR-: receptor  para el factor de crecimiento derivado de plaquetas
PI3K: fosfatidilinositol-3-quinasa
PIO: presión intraocular
PLP: proteína proteolipídica
pNF-H: cadena pesada del neurofilamento fosforilado
POs: potenciales oscilatorios
preMO: oligodendrocitos pre-mielinizantes
R-HT: tracto retino-hipotalámico
ROS: especies reactivas de oxígeno
SAI: Stratum album intermediale
SAP: Stratum album profundum
SE: segmentos externos
SGI: Stratum griseum intermediale
4
Abreviaturas
SGP: Stratum griseum profundum
SGS: Stratum griseum superficiale
SI: segmentos internos
SNC: Sistema Nervioso Central
SO: Stratum opticum
SZ: Stratum zonale
TO: tracto óptico
TUNEL: terminal transferase dUTP nick end labeling
VCR: vena central retiniana
VEPs: potenciales visuales evocados
VgluT-2: transportador vesicular de glutamato -2
VM: vaina de mielina
5
Introducción
INTRODUCCIÓN
1. El ojo
1.1. Características generales
El ojo es el órgano sensorial especializado en el procesamiento de la información visual.
Los principales componentes estructurales del ojo se representan en la Figura 1. La córnea y el
cristalino concentran la luz y enfocan la imagen sobre la retina, una estructura derivada del
diencéfalo, que constituye la primera estación de relevo del procesamiento de la información
fótica en mamíferos. Los diferentes elementos que componen la imagen (intensidad de luz, color,
forma y movimiento) son descifrados y codificados en la retina, a través de la transformación de
la radiación electromagnética en impulsos nerviosos. Esta información se transmite por fibras
nerviosas que se originan en la retina y constituyen el nervio óptico (NO). Por fuera de la región
intraorbital, el NO avanza hacia la base del cráneo donde atraviesa el canal óptico. En la cavidad
intracraneal, los NOs se entrecruzan parcialmente en humanos, pero casi completamente ( 98%)
en ratas (Lund y col., 1980), formando el quiasma óptico y continúan como tractos ópticos hacia
centros visuales cerebrales, donde se produce el procesamiento de la información sobre los
diferentes elementos que componen la imagen visual consciente. En las cortezas visuales, las
señales son interpretadas y configuran la percepción visual: una sensación subjetiva de la forma,
el color, la profundidad, el movimiento de los objetos y el espacio que nos rodea. En las últimas
décadas se ha demostrado la participación de la retina en procesos visuales no conscientes
(“sistema visual no formador de imagen”) que involucran la transmisión de información fótica a
otros centros del encéfalo, lo que permite la coordinación de tareas reflejas como la adaptación
del tamaño pupilar y la dirección de los ojos hacia blancos de interés, o respuestas más
complejas como la regulación del comportamiento asociado a los ritmos biológicos,
particularmente a los núcleos supraquiasmáticos (NSQ) del hipotálamo, (revisado por Schmidt y
col., 2011).
6
Introducción
La pared del globo ocular está constituida por tres capas, que de afuera hacia adentro son:
1. Túnica externa-fibrosa o esclero-corneal formada por la esclera, el limbo esclerocorneal y la córnea.
2. Túnica media-vascular, úvea o tracto uveal formada por la coroides, tejido conectivo,
los músculos del cuerpo ciliar y los músculos del iris.
3. Túnica interna-nerviosa o retina formada por la retina, el epitelio pigmentario, el
epitelio del cuerpo ciliar y el epitelio del iris.
Figura 1. Representación esquemática de las principales estructuras oculares en el humano (Panel
izquierdo) y esquema simplificado en la rata (Panel derecho).
La túnica externa es una gruesa capa fibrosa que protege las estructuras internas del ojo, y
junto con la presión del humor acuoso, mantienen la forma y turgencia del globo ocular. Esta
túnica es opaca en la mayor parte del globo ocular, y se denomina esclera o esclerótica. Allí se
fijan los músculos extrínsecos del ojo que regulan su movimiento. En la salida del NO, la esclera
se reduce a una membrana fenestrada, la lámina cribosa. En contacto con la túnica media, la
esclera presenta una capa de tejido conectivo laxo, rico en melanocitos demoninada lamina fusca
sclerae. Hacia la porción anterior, la túnica externa se diferencia en la córnea, una estructura
transparente constituida por cinco capas, que en orden externo-interno son: epitelio corneal
7
Introducción
(donde se encuentra la inervación corneal), capa de Bowman, estroma, membrana de Descemet y
endotelio. La córnea, al igual que la esclera, está esencialmente constituida por colágeno,
glicosaminoglicanos (GAGs) y agua, pero se diferencia de ella en que posee un menor porcentaje
de hidratación y en la disposición ordenada de las fibras colágenas del estroma. Esta disposición
disminuye la dispersión de la luz y de este modo, la córnea además de tener un rol protector,
posibilita la entrada de luz al ojo con escasa distorsión. La zona de transición entre la córnea y la
esclera se denomina limbo esclero-corneal.
La túnica media vascular o úvea es responsable de la nutrición y el mantenimiento de la
retina y la esclera, y de la producción de humor acuoso que nutre la córnea y el cristalino, ambos
avasculares (revisado por Kanski, 2005). Posee tres regiones diferentes: la coroides, el cuerpo
ciliar y el iris. La coroides es la porción más vascularizada de la úvea y se encuentra entre la
esclera y la retina. En la coroides se distinguen tres capas: la capa vascular (externa), que limita
con la esclera, la capa coriocapilar (media) y la membrana de Bruch (interna), por la que se
adhiere a la capa pigmentaria de la retina. Esta última, es una capa refringente no homogénea,
constituida por la lámina basal del endotelio de los coriocapilares, una primera capa de fibras de
colágeno, una de fibras elásticas, una segunda capa de fibras de colágeno y la lámina basal del
epitelio pigmentario. El cuerpo ciliar es un engrosamiento que se extiende hacia el interior por
detrás de la unión esclero-corneal. Por último, el iris se ubica por encima de la superficie anterior
del cristalino, varía en su color de acuerdo al contenido de melanina y contiene a los músculos
dilatador (de disposición radial) y constrictor (de disposición circular). En el centro, el iris define
un espacio circular llamado pupila, que regula la entrada de luz al ojo.
La túnica interna-nerviosa o retina es la porción fotosensible del ojo y forma parte del
sistema nervioso central (SNC). Se extiende superficialmente sobre la coroides hasta la ora
serrata, en donde se une firmemente, y luego se extiende como una delgada prolongación
formando las porciones ciliar e irídea de la retina. En el extremo opuesto la retina se une
8
Introducción
firmemente en la papila óptica, donde se continúa con el NO.
A su vez, en el ojo se delimitan 3 compartimientos: 1) la cámara anterior, situada entre la
córnea y el iris; 2) la cámara posterior, ubicada entre el iris y el cristalino; 3) el espacio vítreo,
que se ubica detrás del cristalino, y está rodeado por la retina.
El cristalino es un cuerpo elástico que se encuentra suspendido por un ligamento circular.
En los humanos posee una forma biconvexa, mientras que en la rata tiene forma esférica (Figura
1). El ligamento circular junto con el músculo ciliar, modifican su curvatura y acomodan la
visión a diferentes distancias, lo que le permite funcionar como una lente. Así, tanto la córnea
como el cristalino son los medios refractivos del ojo que permiten que la luz incida en la retina.
El espacio entre la pared posterior del cristalino y la retina está formado por una matriz
extracelular (MEC) transparente y gelatinosa denominada humor vítreo o cuerpo vítreo. Esta
matriz es rica en agua (90%), ácido hialurónico, fibras colágenas tipo II, otras proteínas
glicosiladas o no y escasas células denominadas hialinocitos (revisado por Geneser, 2006)
1.2. Cámara anterior y cámara posterior
Una correcta función visual requiere una forma constante del globo ocular y un trayecto
transparente y sin alteraciones desde la superficie de la córnea hasta la retina. Una vez atravesada
la córnea, la luz pasa por las cámaras anterior y posterior (Figura 1). La cámara anterior es un
área delimitada por la superficie posterior de la córnea, por la superficie anterior del iris y por la
cara anterior y central del cristalino (Figura 2). La cámara anterior contiene el humor acuoso, un
líquido cristalino con una composición que varía desde su formación en los procesos ciliares
hasta su filtrado por el trabeculado, una red de fibras colágenas recubiertas por células
endoteliales y MEC ocupando los espacios entre las fibras (ver más adelante). El humor acuoso
contiene una baja concentración de proteínas (0,1 - 0,2% de la concentración de proteínas del
plasma) pero una mayor concentración de aminoácidos, así como niveles elevados de lactato
(Tokuda y col., 2007), bicarbonato (Gerometta y col., 2005) y ascorbato (Ringvold y col., 2000).
9
Introducción
La pequeña cantidad de proteínas plasmáticas del humor acuoso proviene de la difusión desde el
estroma del cuerpo ciliar a la raíz del iris, se acumula en el estroma del iris y se libera a
continuación en el humor acuoso (revisado por Freddo, 2013). La composición del humor acuoso
difiere del plasma por la presencia de una barrera mecánica epitelial/endotelial (barrera hematohumor acuoso) (Kolker y Hetherington, 1981; Sears, 1985), y por el transporte activo de varias
sustancias orgánicas e inorgánicas desde el epitelio ciliar (Macknight y col., 2000).
A
B
Figura 2. Representación de las cámaras anterior y posterior del ojo. Panel A: Esquema de la circulación
del humor acuoso (flecha roja) desde los procesos ciliares, donde se origina, fluye alrededor del cristalino
e ingresa a la cámara anterior al atravesar la pupila. Panel B: Se muestra una imagen histológica
representativa a nivel del ángulo irido-corneal (recuadro del Panel A) y las mismas estructuras de (A)
señaladas con números. Hematoxilina-eosina.
La cámara posterior es la región comprendida entre el iris y el cristalino, allí se
encuentran las crestas del cuerpo ciliar que producen el humor acuoso. A diferencia del humor
acuoso, el fluido presente en la cámara posterior es esencialmente plasma libre de proteínas,
debido al flujo continuo hacia adelante del humor acuoso, a las uniones estrechas del epitelio
posterior del iris (que impiden la difusión posterior de las proteínas del estroma del iris) y a la
válvula unidireccional que forma la pupila, que descansa sobre la cápsula anterior del cristalino
(revisado por Freddo, 2013).
Como ya se mencionó, no existe una perfusión vascular directa de la córnea y el
cristalino, sino que la circulación normal del humor acuoso, a través de las cámaras anterior y
10
Introducción
posterior, es responsable de la nutrición y metabolismo de estas estructuras.
1.2.1. Producción y circulación del humor acuoso
El balance entre la producción y la reabsorción del humor acuoso mantiene la claridad
óptica y niveles adecuados de presión intraocular (PIO), que otorgan estabilidad mecánica y
ayudan a mantener la turgencia y la forma del ojo. La formación de humor acuoso depende de la
combinación entre una fuerza hidrostática y un gradiente de presión osmótica generado por el
epitelio ciliar. Este último provoca la difusión de agua a través de un gradiente de concentración,
debido a un transporte activo de electrolitos y moléculas pequeñas a través de dos capas de
epitelio (pigmentada y no pigmentada) (revisado por Geneser, 2006). El transporte activo se
produce en las células no pigmentadas y el gradiente generado se mantiene por medio de uniones
estrechas (zónulas ocluyentes) entre las células, que restringen el pasaje de sustancias y forman
la barrera hemato-humor acuoso (revisado por Freddo, 2013). La formación de humor acuoso
ocurre por tres mecanismos: 1) difusión, 2) ultrafiltración y 3) secreción activa. Éste último, es
en mayor medida responsable de la composición química y el volumen del humor acuoso
(Macknight y col., 2000).
Diversos mecanismos colinérgicos y adrenérgicos desempeñan un papel relevante en la
formación y drenaje de humor acuoso, tanto en la fisiología normal como en la terapia del
glaucoma. Alteraciones moderadas de la presión sanguínea sistémica y del flujo sanguíneo del
proceso ciliar no afectan significativamente la formación del humor acuoso.
La circulación del humor acuoso (Figura 2) está determinada por el gradiente de presión
entre las cámara posterior y anterior y por las diferencias de temperatura entre el iris (mayor
temperatura) y la córnea. El humor acuoso entra a la cámara posterior desde el proceso ciliar a
través de un gradiente hidrostático y osmótico. Luego, fluye alrededor del cristalino, y a través
de la pupila se dirige hacia la cámara anterior. Finalmente, abandona el ojo por flujo pasivo en el
ángulo de la cámara anterior por dos vías: 1) la vía trabecular, a través de la cual primero ingresa
11
Introducción
al trabeculado, pasa al lumen del canal de Schlemm (Figuras 2 y 3) y luego a las venas
epiesclerales, desde donde llega a la circulación venosa general, y 2) la vía uveo-escleral, a
través de la cual desde la raíz del iris alcanza la malla escleral, luego pasa por la cara anterior del
músculo ciliar y abandona el ojo a través de los vasos esclerales. En monos, la vía trabecular
drena entre el 40 - 65 % del total del flujo de humor acuoso, y el 35 - 60 % restante lo hace por la
vía uveo-escleral, cuya contribución en gatos y conejos es bastante menor (Bill, 1989), en tanto
que en ratones esta vía drena un porcentaje similar al de humanos (Aihara y col., 2003). El
porcentaje de flujo de humor acuoso por la vía trabecular en humanos oscila entre 75 - 95%,
según resultados obtenidos mediante estudios con isótopos, aunque los cálculos basados en
métodos no invasivos han sugerido un valor del 75% en ojos normales (Bill, 1989).
1.2.2. La red trabecular o trabeculado
Como ya se mencionó, la red trabecular, ubicada en el ángulo de unión del iris y la córnea
(ángulo irido-corneal), es en parte responsable del drenaje del humor acuoso (Figuras 2 y 3). Esta
estructura está constituida por una red entrelazada de finos haces de tejido conectivo con
espacios intermedios de hasta 70 micrómetros. Las trabéculas están formadas por un corazón de
colágeno y fibras elásticas, rodeadas por más fibras elásticas y una zona cortical que consiste en
colágeno parcialmente polimerizado y la membrana basal de las células endoteliales trabeculares
más externas. Los tipos celulares que ocupan este espacio incluyen el endotelio trabecular y
corneal, así como melanocitos y fibroblastos de la capa anterior del iris y del cuerpo ciliar.
El canal de Schlemm se localiza en la parte inferior del trabeculado (Figuras 2 y 3). Las
células endoteliales en esta capa están íntimamente asociadas entre sí y a la membrana basal
mediante complejos de unión (Tian y col., 2000). Estas células secretan el material de la
membrana basal, precursores de colágeno (prolina e hidroxiprolina), fibras elásticas y GAGs.
12
Introducción
A
B
Figura 3. Representación de la estructura y localización del trabeculado. Panel A: Esquema de las capas
de la red trabecular. Panel B: Imágenes de microscopía electrónica de barrido (200x) del trabeculado a
nivel de la úvea en condiciones normales y patológicas (Sihota y col., 2012).
Los GAGs están constituidos por largas cadenas de azúcares no ramificadas, formadas
por la repetición sucesiva de unidades de disacáridos. Los principales tipos de GAGs son: el
ácido hialurónico (AH), el queratán sulfato (KS), el dermatán sulfato (DS), el heparán sulfato
(HS) y el condroitín sulfato (CSU). Todos los GAGs, con excepción del AH, poseen grupos
sulfato en varias posiciones y proporciones (Figura 4). Por ejemplo, las cadenas de CSU son por
lo general sulfatadas en el grupo hidroxilo 4 y/ó 6, las cadenas de DS en la posición 4- y 2-,
mientras que las cadenas de HS pueden estar sulfatadas en posición 2-, 6- y/ó 3-. A su vez, todos
los GAGs con excepción del AH, se unen covalentemente a un núcleo proteico formando un
proteoglicano a medida que pasan por el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi. Las
células endoteliales del trabeculado tienen actividad fagocítica y la capacidad de migrar a través
de los haces trabeculares (Buller, 1990). Por lo tanto, la función del endotelio no es sólo
mantener la integridad estructural de las trabéculas, sino también contribuye a mantener la
función de filtración del área, especialmente cuando concentraciones anormales de alguna
sustancia impiden la salida del humor acuoso.
13
Introducción
Figura 4. Estructura de los principales GAGs del trabeculado.
Como ya se mencionó, la principal vía de salida del humor acuoso es el trabeculado que
está ubicado en el ángulo irido-corneal. La apariencia clínica de esta estructura permite inferir la
facilidad de salida del humor acuoso. Los ángulos cerrados o estrechos y aquellos con depósitos
patológicos tendrán una disminución en el drenaje, con el consiguiente aumento de la PIO.
Evidencias anátomo-fisiológicas indican que el sitio primario de resistencia al flujo
acuoso reside en la red trabecular, la porción profunda de la red esclero-corneal y la membrana
basal yuxtacanalicular cercana al canal de Schlemm, como se muestra en la Figura 3 (Tamm y
col., 2004). Una intensa tinción histoquímica en varias capas del trabeculado humano indica la
presencia de cantidades sustanciales de AH y CSU en las vías de salida del humor acuoso y un
análisis cuantitativo demuestra que del total de GAGs trabeculares, un 20 - 25% corresponde a
AH, 40 - 60% a CSU y DS, 5 - 10% a KS y 15 - 20% a HS (revisado por Acott y Kelley, 2008).
Se ha demostrado que la hipertensión ocular en ratas inducida por la administración de
esclerosantes suaves se correlaciona con una deposición anormal de componentes de la MEC a
nivel de la cabeza del NO en forma análoga a lo observado en ojos glaucomatosos humanos y de
14
Introducción
primates no humanos (Morrison y col., 1990).
1.3. La retina
La retina es una lámina fina de tejido nervioso situada en el fondo del ojo, que constituye
una prolongación del SNC. Está constituida por varios tipos celulares: los fotorreceptores (conos
y bastones), las células horizontales (2 subtipos), las células bipolares (de bastones (ON, único
tipo) y de conos (ON u OFF subdivididas en 6 y 5 subtipos, respectivamente)), las células
amácrinas (entre 23 y 40 subtipos, según el método de clasificación utilizado, genético o
anatómico, respectivamente), las células ganglionares (entre 12 y 22 subtipos, basados en
propiedades anatómicas, moleculares y/o fisiológicas) y células gliales, astrocitos y células de
Müller (revisado por Seung y Sümbüll, 2014). Además, en la retina existen dos poblaciones
discretas de células derivadas del linaje mieloide: los macrófagos perivasculares, y la microglía
(Karlstetter y col., 2014).
En un corte transversal de la retina (Figura 5) se observan diez capas paralelas que desde
la más externa a la más interna son: 1) El epitelio pigmentario (EP), 2) Los segmentos externos
(SE) e internos (SI) de los fotorreceptores (FR), 3) La membrana limitante externa (MLE), 4) La
capa nuclear externa (CNE), que contiene los núcleos de los conos y los bastones, 5) La capa
plexiforme externa (CPE), donde hacen sinapsis los terminales axónicos de los FR con las
dendritas de las células horizontales y bipolares, 6) La capa nuclear interna (CNI), que contiene
los núcleos de las células horizontales, amácrinas y bipolares, 7) La capa plexiforme interna
(CPI), donde hacen sinapsis las células bipolares y amácrinas con las células ganglionares
retinianas (CGRs), 8) La capa de células ganglionares (CCG), que contiene CGRs y amácrinas
desplazadas, 9) La capa de fibras nerviosas (CFN) y, 10) La membrana limitante interna (MLI)
(revisado por Geneser, 2006).
15
Introducción
A
B
Figura 5. Estructura de la retina. Panel A: Esquema representativo de las distintas capas celulares
retinianas. Las flechas indican la dirección de entrada de la luz. C, cono; B, bastón; CB, célula bipolar; H,
célula horizontal; A, amácrina; CG, célula ganglionar; M, célula de Müller; AS, astrocito (Modificado de
Krstić, 1997). Panel B: Sección transversal de la retina adulta del ratón en que se identificó un subtipo de
CB (verde), las CG, A y H (rojas) y los conos (azul-violeta). Modificado de Josh Morgan, portada de
Nature Neuroscience, (9):1, 2006.
Los FR se encuentran en la capa de la retina más cercana al fondo del globo ocular y más
alejada de la córnea y de la entrada de luz, excepto en un área denominada fóvea, donde la luz
incide directamente. En consecuencia, la posición de la retina se encuentra “invertida” respecto a
la entrada de la luz, ya que ésta debe atravesar todas las capas retinianas antes de alcanzar los
fotorreceptores que se encuentran en contacto estrecho con el EP. Las células del EP poseen
gránulos de melanina, un pigmento negro que evita que la luz se refleje en la parte posterior del
ojo y vuelva a la retina, lo que podría provocar distorsión de la imagen visual (Hubel, 1988).
En la retina de mamíferos existen dos tipos de FR: los conos y los bastones. Sus
segmentos externos son la porción sensible a la luz y contienen el pigmento visual (conopsinas o
rodopsina, respectivamente), así como los demás componentes de la cascada de fototransducción
en la que participan diversos mensajeros, enzimas y canales iónicos. Las células del EP
16
Introducción
participan de la remoción y reemplazo de la porción más distal del SE de los FR a través de un
proceso de fagocitosis. Los SE de los conos están constituidos por pliegues apilados de
membrana plasmática invaginada y los de los bastones están formados por discos membranosos,
estructuras saculares donde las paredes de doble membrana quedan separadas por el espacio
intradiscal. En ambos tipos de FR, los SE se unen a los SI a través de un tallo estrecho o cilio. El
cuerpo celular de los FR ubicado en la CNE, contiene al núcleo y demás organelas subcelulares.
Los FR poseen un cinturón de zónulas adherentes que divide a la célula en un dominio
apical y uno basal. El aspecto de este cinturón al microscopio óptico llevó a denominar a esta
región membrana limitante externa (Rodieck, 1973). Participan también los procesos apicales de
las células de Müller, que rodean y dan soporte a los elementos nerviosos. Estas células poseen
un cuerpo celular delgado, que se extiende desde la MLE hasta la zona más interna de la retina,
donde su lámina basal constituye la MLI.
Desde un punto de vista funcional, los conos son responsables de la visión diurna y la
percepción del color. La respuesta de los conos tiene mayor resolución espacial y temporal que la
de los bastones. Los bastones son responsables de la visión nocturna, expresan mayores niveles
de fotopigmento, responden más lentamente a la señal luminosa y sus conexiones con las células
bipolares son más convergentes, lo que amplifica la señal, confiriéndole sensibilidad frente a
luces demasiado tenues como para excitar a los conos. En la mayoría de las especies de
mamíferos, los bastones son aproximadamente 20 veces más numerosos que los conos, aunque la
cantidad relativa de ambos tipos celulares varía marcadamente sobre la superficie de la retina
(LaVail, 1976; Masland, 2001a). Por ejemplo, en la fóvea, ubicada cerca del NO en el centro de
la retina humana y de primates, la agudeza visual es máxima y sólo se observan conos. En la
rata, un animal de hábitos nocturnos, los conos constituyen sólo entre el 1 - 2% del total de FR y
no hay una fóvea similar a la de humanos.
En la CPE, los FR hacen sinapsis con células bipolares y horizontales. Las células
17
Introducción
bipolares reciben input directo de los FR (distintos tipos de células bipolares pueden conectarse
exclusivamente a conos o a bastones) y hacen sinapsis con las CGRs en la CPI y las células
horizontales conectan los FR con las bipolares. La CNI está constituida por los somas de células
horizontales, bipolares y amácrinas. Estas últimas presentan numerosas dendritas pero carecen de
axón. La CPI es una zona de contactos sinápticos, en la que las células amácrinas se conectan
entre sí, con las terminales axónicas de las células bipolares y con dendritas de las CGRs. La
capa de CGRs está constituida por los somas celulares (>17 μm o ganglionares gigantes
ocasionales, > 14 μm o ganglionares grandes y de 5 a 11 μm o ganglionares pequeñas), mientras
que los axones convergen radialmente hacia el disco óptico, por donde las fibras abandonan el
globo ocular (Figura 1) y proyectan al cerebro medio a través del tracto óptico, excepto un
número comparativamente menor de fibras que proyectan a los NSQ, a través del haz retinohipotalámico.
En base a las conexiones anatómicas y funcionales entre los distintos tipos celulares
retinianos, se considera que la información fluye a través de la retina siguiendo dos vías: un
camino directo (desde los FR a las células bipolares y de éstas a las CGRs) y uno indirecto (en el
que entre los FR y las células bipolares se interponen las células horizontales y entre las
bipolares y las CGRs, se interponen las amácrinas). La vía directa de transmisión de información
es altamente específica; la vía indirecta, en cambio, es más difusa. Este plan general de
conexiones retinianas, fundamentalmente a nivel de las vías directas, varía dramáticamente entre
la fóvea y las zonas periféricas. Como se mencionó anteriormente, en la fóvea y zonas
adyacentes un fotorreceptor (cono) se conecta con una única célula bipolar y ésta a su vez con
una única ganglionar. Esta relación entre FR, células bipolares y CGRs, es cada vez más
convergente hacia la periferia. La ventaja de este sistema es la alta densidad de muestreo que
permite una gran resolución espacial (Masland 2001b, revisado por Kandel, 2000).
El principal neurotransmisor excitatorio de la retina es el glutamato, que participa en la
18
Introducción
transmisión de la información visual de la vía directa. El glutamato se libera desde los FR a
células bipolares y horizontales y desde las células bipolares a CGRs y amácrinas. En oscuridad,
el glutamato se libera a la brecha sináptica desde los FR, mientras que la exposición a luz inhibe
su liberación. El glutamato induce despolarización de las células bipolares OFF e
hiperpolarización de las bipolares ON. Estas células a su vez, liberan glutamato en las sinapsis
con las CGRs. Un conjunto variado de señales liberadas por células horizontales y amácrinas,
que incluyen al ácido -aminobutírico (GABA), glicina y dopamina, modulan la transmisión de
la información fótica. En concentraciones suprafisiológicas el glutamato tiene efectos
neurotóxicos sobre las CGRs. Por lo tanto, resulta esencial que las células gliales que rodean las
sinapsis glutamatérgicas, principalmente astrocitos y células de Müller, permitan un clearance
apropiado del neurotransmisor. La excitotoxicidad glutamatérgica ha sido involucrada en
diversas enfermedades oculares como el glaucoma, la retinopatía diabética y el daño isquémico
retiniano (revisado por Kalloniatis y Tomisich, 1999).
1.4. Vasculatura del ojo
La arquitectura vascular del ojo de los mamíferos difiere entre especies, pero tiene una
organización general común, que se esquematiza en la Figura 6 (Funk, 1993; Morrison y col.,
1987). La sangre llega al ojo a través de la arteria oftálmica por encima de la vaina de tejido
conectivo que rodea al NO, hasta penetrar la cabeza del nervio, donde se ramifica en la arteria
central de la retina (ACR) y en las arterias ciliares, a cada lado del NO (Figuras 6 y 7). Estas
últimas, se dividen en dos arterias ciliares posteriores (ACPs) largas y en numerosas ACPs cortas
(Henkind y col., 1979). Las ACPs cortas irrigan la coroides directamente, mientras que las ACPs
largas avanzan por la coroides hacia la parte anterior del ojo, pasan a arteriolas, arteriolas
precapilares cortas y capilares (coriocapilares) que se anastomosan y forman un plexo que se une
a los vasos del cuerpo ciliar en la ora serrata. Junto con el cuerpo ciliar, el iris es irrigado por el
anillo arterial irido-ciliar, que se origina de la arteria ciliar anterior, que es a su vez, una
19
Introducción
ramificación de las ACPs, y surge a la altura del ecuador del globo ocular.
Figura 6. Esquema de la disposición de los principales vasos sanguíneos que irrigan el ojo humano.
Arterias ciliares posteriores (ACPs) largas, ACPs cortas que dan origen a los coriocapilares, Arteria
central de la retina (ACR), vena central de la retina (VCR), venas vorticosas, y arterias y venas del iris.
La circulación sanguínea retiniana constituye el porcentaje remanente (15 - 35%) de la
irrigación del ojo (Henkind y col., 1979) e incluye arterias, arteriolas y capilares, que transportan
sangre rica en nutrientes y oxígeno, y por venas y vénulas, que remueven productos de desecho
que se liberan hacia la MEC.
La ACR se divide en arterias radiales que nutren toda la retina hasta la base del cuerpo
ciliar. La fina red vascular está formada por arteriolas delgadas que nacen de las arterias mayores
y luego siguen como arteriolas precapilares que regulan el flujo sanguíneo. La retina presenta
una doble capa vascular formada por capilares finos entre la CFN y la CCG, y otra capa
localizada entre la CNI y la CPE, que drenan en vénulas postcapilares, que constituyen la red
venular. Los FR y el EP no presentan contacto directo con capilares o vénulas, sino que reciben
nutrientes por difusión desde los coriocapilares. Finalmente, las vénulas de la retina se continúan
en venas largas que desembocan en la vena central de la retina (VCR), cerca del disco óptico.
Las uniones estrechas (zónulas ocluyentes) entre las células endoteliales de los vasos sanguíneos
de la retina, entre las células del EP (barrera hemato-retiniana externa) y las uniones entre las
20
Introducción
células de Müller y los FR de la MLI conforman la barrera hemato-retiniana interna.
En la rata, la sangre venosa del iris y de la mayor parte de la coroides y el cuerpo ciliar
drena en vénulas vorticosas. Las vénulas confluyen cerca del ecuador del ojo en cuatro venas
vorticosas (Figura 6), según cuatro cuadrantes (dorsal, ventral, nasal y temporal), que finalmente
llegan a la esclera, donde confluyen en las venas epiesclerales, ubicadas entre la conjuntiva y la
esclera. Por otro lado, los capilares de la mitad posterior de la coroides drenan en un seno venoso
que se continúa en las venas ciliares, y una pequeña parte de la sangre que irriga la mitad anterior
del cuerpo ciliar, drena a través de la vena ciliar anterior que desemboca en la vena oftálmica
superior.
2. El nervio óptico
El nervio óptico (NO), una evaginación del prosencéfalo (la vesícula óptica), no es un
nervio periférico como los demás nervios craneales, sino un fascículo del SNC. Está formado por
los axones de las CGRs, estructurados en fibras nerviosas por la glía residente. Sobre la
superficie de cada haz, la glía forma una delgada membrana entre los elementos nerviosos y el
tejido conectivo. Las meninges y los espacios inter-meníngeos del encéfalo se continúan sobre el
NO, como se muestra en la Figura 7. La vaina externa del NO está constituida por la duramadre,
que se prolonga hasta el ojo, uniéndose a la esclera. La piamadre forma una capa de tejido
conectivo, íntimamente adherida a la superficie del NO, y se une a la esclera a la altura de la
entrada del NO. Esta vaina pial envía tabiques de tejido conectivo y vasos sanguíneos dentro del
NO.
21
Introducción
Figura 7. Estructura del NO proximal y su irrigación. Panel A: Esquema de los principales vasos
sanguíneos que irrigan el NO a la altura de la cabeza del nervio. Panel B: Corte semifino longitudinal del
NO a la misma altura que en A (azul de metileno y Azur II), con las principales estructuras señaladas con
números (Extraído y modificado de Dai y col., 2012).
En primates, las fibras amielínicas de las CGRs se unen en el disco óptico y abandonan el
globo ocular a través de una apertura en la esclera, denominada lámina cribosa, constituida por
una red de fibras de colágeno. Diversos estudios demuestran la ausencia de una lámina cribosa
clásica en ratones y ratas, especies en las que se describió una estructura denominada lámina
glial, constituida por una red compleja de procesos gliales orientados transversalmente a los
axones, en ausencia de fibras colágenas (Howell y col., 2007; Sun y col., 2009). Los procesos
primarios de los astrocitos organizan los axones en fascículos. En la región próxima a la retina,
estos procesos son mayores y se vuelven más delgados y menos numerosos hacia la zona
mielinizada, más distal de la retina. Existen además procesos secundarios, que subdividen los
fascículos en unidades menores. Los astrocitos, a través de esta red compleja de procesos,
permiten comunicar y regular la función de numerosos axones y, a su vez, la de otros astrocitos
(Sun y col., 2009). En ratas, la lámina glial se extiende aproximadamente entre 80 - 85 μm (en el
eje longitudinal) desde el disco óptico hasta la zona de transición, donde comienza la
mielinización de las fibras (Figura 8). En roedores, se ha descripto que en la porción próxima al
quiasma óptico, se pierde la organización retinotópica de los axones (Baker, 1990) y se ha
sugerido que esto podría deberse al cambio en la organización glial (Guillery y Walsh, 1987).
22
Introducción
A
B
C
Figura 8. Representación de las diferentes regiones del NO proximal. Panel A: Esquema en el que se
indican la CFN, la porción pre-laminar, la lámina glial, la zona de transición y la región mielinizada.
Panel B: Microfotografía del NO proximal de ratón indicando la localización de astrocitos de la lámina
(amarillo), los oligodendrocitos mielinizantes (verde), los axones (amielínicos) de las CGRs (rojo) y los
núcleos de la retina (cyan) (Modificado de Mark Ellisman, NCMIR, San Diego, EE.UU
http://ucsdnews.ucsd.edu/pressrelease/getting_rid_of_old_mitochondria). Panel C: Comparación de la
disposición de los astrocitos (verde) y los axones de las CGRs (rojo) a la altura de la lámina glial y la
región mielinizada del NO de rata (Extraído de Dai y col., 2012).
La mayoría de los axones del NO tienen 0,2 - 0,7 m de diámetro, tanto en primates
como en roedores (a pesar de las diferencias en el largo total del NO entre estas especies),
mientras que los axones más grandes y menos frecuentes tienen entre 1,5 - 2,0 m de diámetro
(Perge y col., 2009). El relativamente pequeño tamaño de la mayoría de los axones de las CGRs
parece estar optimizado en función de la velocidad de transmisión de la información y el
consumo energético (Niven y Laughlin, 2008; Perge y col., 2009, 2012; Wang SS y col., 2008).
3. Las vías visuales superiores
3.1. Características generales
Los axones de todas las CGRs salen del ojo a través del disco óptico y forman el NO. Los
NOs de ambos ojos confluyen en el quiasma óptico. Dependiendo de la especie, una subpoblación de axones de número variable, se cruzan al lado opuesto del encéfalo, mientras otros
23
Introducción
axones continúan su proyección en forma ipsilateral. De esta forma, los axones provenientes de
ambos ojos forman los tractos ópticos izquierdo y derecho que proyectan a los núcleos
subcorticales que participan en el procesamiento visual formador de imagen y no formador de
imagen. En la rata, la proyección es esencialmente cruzada.
El sistema de transporte axonal (o flujo axoplasmático) juega un rol clave en la
comunicación entre las CGRs y los núcleos centrales. El transporte anterógrado, mediado por la
proteína quinesina, participa en el transporte de proteínas sintetizadas en el cuerpo neuronal que
están asociadas a la estructura axonal y la transmisión sináptica. El transporte retrógrado,
mediado por dineína, participa en el transporte de factores que afectan el estado metabólico de
las CGRs. Los microtúbulos son los elementos motores que participan en el transporte, y el ATP
y el calcio son esenciales para este proceso.
Entre los núcleos de proyección retiniana se encuentran el colículo superior (CS), el
núcleo geniculado lateral (NGL) y los núcleos pretectales como el núcleo pretectal olivar (NPO),
los núcleos supraquiasmáticos (NSQ) y los núcleos del sistema ocular accesorio, entre otros.
3.2. Colículo superior
El colículo superior (CS) es un centro integrador del cerebro medio que recibe
información visual directamente desde la retina, y controla el movimiento reflejo de la cabeza y
el movimiento de los ojos. Es una estructura organizada en capas, según la distribución de fibras
y el tamaño y arreglo neuronal. Las capas superficiales están relacionadas con la recepción de
información sensorial, las profundas están relacionadas con la ejecución motora y las intermedias
contienen células multisensoriales integradoras (revisado por May, 2006). La capa superior es
delgada, está compuesta por fibras nerviosas, y se denomina Stratum zonale (SZ). Por debajo de
ella se encuentra una capa de neuronas y neuropilo, el Stratum griseum superficiale (SGS), y
luego sigue el Stratum opticum (SO) que contiene predominantemente fibras. Estas tres capas
constituyen la porción superficial del CS que participa del procesamiento de la información
24
Introducción
visual aferente. Estas neuronas responden principalmente a puntos pequeños dentro de su campo
visual o a puntos en movimiento. Dependiendo de la especie, reciben inputs de la retina
contralateral e ipsilateral, y de áreas visuales de la corteza ipsilateral. El CS profundo contiene
neuronas motoras de proyección. Próximo al SO se encuentra una capa delgada con una variedad
amplia de neuronas multipolares que procesan información multisensorial, denominada Stratum
griseum intermediale (SGI). La capa siguiente se denomina Stratum album intermediale (SAI) y
contiene numerosas fibras. Por debajo del SAI, se encuentra una capa celular denominada
Stratum griseum profundum (SGP). Finalmente, la capa más profunda está formada por fibras
adyacentes a la sustancia gris periacueductal y se denomina Stratum album profundum (SAP)
(Figura 9), que recibe información de las capas superficiales del CS, de los sistemas somatosensoriales y auditivos, de áreas corticales no visuales y del colículo contralateral.
Los axones de las CGRs ingresan al CS por el SO (y en menor medida por el SZ, que
contiene axones de neuronas intrínsecas) y avanzan hasta las capas más superficiales. El
principal sitio de conexión es el SGS superior. En animales con escasa binocularidad (como los
roedores), la gran mayoría de las terminales retinianas proyectan al CS contralateral. Se estima
que en la rata, aproximadamente el 98% de las CGRs proyectan al CS contralateral (Lund y col.,
1980). Las fibras de proyección ipsilateral de las CGRs llegan a la porción rostro-medial del CS
(Isenmann y col., 1999; Lund, 1965; Rao y Lund, 1989; Rodger y col., 2005). Algunas fibras de
la retina temporal proyectan al SO y al SGS inferior. Su principal proyección es hacia el tallo
encefálico, particularmente a los núcleos involucrados en la coordinación de movimientos de los
ojos y cabeza, y proyecciones ascendentes a regiones talámicas. Otro núcleo de conexión con el
CS es el NGL. Neuronas de la capa SGS proyectan a la porción dorsal y ventral del NGL (Figura
9D).
25
Introducción
Figura 9. Representación esquemática de la estructura del CS. Panel A: Esquema en vista sagital del
cerebro de rata. La línea punteada indica la zona medial del CS en corte coronal que se muestra en el
Panel B. Panel B: Corte coronal en la zona medial del CS (en gris). Panel C: Se muestra un detalle de las
capas del CS. Panel D: Patrón de inervación de las capas superiores del CS. Las capas superiores del CS
reciben inervación de las CGRs, fibras del NGL y también terminales de neuronas corticales (neuronas
piramidales de la capa V). SZ, Stratum zonale; SGS, Stratum griseum superficiale; SO, Stratum opticum;
SGI, Stratum griseum intermediale; SAI, Stratum album intermediale; SGP, Stratum griseum profundum;
SAP, Stratum album profundum. Modificado de Paxinos y Watson, 1997 y de May, 2006.
Estudios en ratones han demostrado que las proyecciones retinianas tienen una
representación topográfica ordenada de inervación en las capas superficiales del CS: el eje nasaltemporal y el eje dorsal-ventral de la retina tienen proyección anterior-posterior y medial-lateral
en el CS, respectivamente (Dräger y Hubel, 1975; Siminoff y col., 1966).
3.3. Núcleo geniculado lateral
En primates, el NGL está constituido por seis capas de neuronas; las dos capas ventrales
contienen neuronas grandes (magnocelulares (M)), mientras que las cuatro capas dorsales
contienen neuronas más pequeñas (parvocelulares, (P)). La vía M está involucrada en el
26
Introducción
procesado de la información del movimiento y la forma del estímulo, mientras que la vía P
participa en el análisis de la visión de detalles y de color. La organización funcional del NGL
involucra circuitos retinianos y no retinianos, lo que sugiere que esta estructura participa en
procesos modulatorios que alteran la señal visual proyectada la corteza (Kandel y col., 2000). Se
ha demostrado que las aferencias retinianas a las células tálamo-corticales del gato representa
sólo un 10% del total de sinapsis, en tanto que las sinapsis restantes corresponden a
interneuronas GABAérgicas, proyecciones del núcleo talámico ventricular y el pretectum,
neuronas glutamatérgicas de la corteza visual, señales histaminérgicas del hipotálamo,
noradrenérgicas, colinérgicas y serotoninérigas del mesencéfalo y la protuberancia y fibras e
interneuronas que expresan la enzima óxido nítrico sintasa (NOS) (Carden y col., 2000; Sherman
y Guillery, 1996;). En ratas, el NGL está constituido por un núcleo dorsal (dNGL) y uno ventral
(vNGL) que son rudimentarios en humanos (Bron y col., 1997). A diferencia de los primates, no
existe una laminación aparente en el NGL de roedores (Reese, 1988).
3.4. Núcleos supraquiasmáticos
Los núcleos supraquiasmáticos (NSQ) constituyen el componente principal del reloj
biológico endógeno en mamíferos. Están formados por dos grupos de neuronas que se
encuentran localizadas en la base del tercer ventrículo, sobre el quiasma óptico, en la parte
anterior del hipotálamo (Figura 12). Los NSQ están compuestos por una población heterogénea
de células, incluyendo múltiples clases de neuronas peptidérgicas y astrocitos (Abrahamson y
Moore, 2001). En roedores, estos núcleos están compuestos por alrededor de 20.000 neuronas y
8.000 astrocitos, compactados en un volumen de aproximadamente 1 mm3 (Güldner, 1983; Klein
y col., 1991). Aun en condiciones aisladas, los NSQ mantienen su actividad de marcapasos
(Colwell, 2000; Newman y Hospod, 1986). La lesión o ablación de los NSQ provoca la
desaparición de los ritmos circadianos de secreción hormonal, actividad locomotora y bebida,
entre otros. De hecho, transplantes de tejido hipotalámico conteniendo NSQ a animales con sus
27
Introducción
NSQ lesionados, restauran los ritmos circadianos de estos últimos, induciendo la ritmicidad del
donante en el receptor (Ralph y Lehman, 1991).
Los NSQ se comunican con el resto del organismo a través de proyecciones nerviosas y
secreciones humorales, tanto para las vías de entrada como para las de salida. Las principales
aferencias provienen de la retina. La información desde la retina sigue dos vías, una directa a
través del tracto retino-hipotalámico (R-HT) y una vía colateral que pasa por el intergeniculado
(IG), una estructura laminar pequeña intercalada entre la porción dorsal y ventral del NGL, y
luego inerva la zona ventro-lateral de los NSQ, denominado tracto genículo-hipotalámico (GHT). Además, existen aferencias desde el rafe, tanto del núcleo dorsal como del medial y del
núcleo paraventricular del tálamo (Krout y col., 2002; Moga y Moore, 1997). En realidad,
muchos de los núcleos hipotalámicos inervados por los NSQ establecen circuitos bidireccionales,
inervando ellos mismos a los NSQ en forma recíproca (Krout y col., 2002). De todas las vías
aferentes, la mejor caracterizada es la del R-HT. Esta vía se origina en CGRs que contienen
opsinas y capacidad fotorreceptora intrínseca (Beaulé y col., 2003; Berson y col., 2002; Hattar y
col., 2002; Morin y col., 2003; Provencio y col., 2002), como se detalla a continuación.
4. Las células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles
En las últimas décadas, se describió un subtipo particular de CGRs que expresan el
fotopigmento melanopsina (CGRsm) y son intrísecamente fotosensibles es decir, son capaces de
responder a la luz independientemente del input de los conos y los bastones (Berson y col.,
2002). La melanopsina es una opsina/fotopigmento basado en vitamina A, cuyo máximo de
absorción se encuentra entre los 420 y 440 nm en humanos (Melyan y col., 2005) y los 480 nm
en el ratón (Panda y col, 2005; Qiu y col., 2005), que corresponde a la luz azul en el espectro
visible, y no coincide con el de los FR retinianos clásicos (Brainard y col., 2001; Thapan y col.,
2001; Yoshimura y Ebihara, 1996). Varias líneas de evidencia señalan que las CGRsm son
capaces de transducir funciones visuales no formadoras de imagen, incluyendo la sincronización
28
Introducción
del reloj circadiano, el reflejo pupilar, la regulación del período circadiano en respuesta a luz
constante, la fotoinhibición aguda de la actividad nocturna y la supresión fótica de la liberación
nocturna de melatonina pineal (Berson y col., 2002; Hattar y col., 2002; Lucas y col., 2001;
Provencio y col., 2002). En los últimos años, la descripción de las CGRsm ha dado a la
fototransducción visual no formadora de imagen una base anatómica y permitió explicar por qué
algunas funciones visuales persisten incluso en ratones que carecen de conos y bastones y en
algunas personas ciegas (Hannibal y col., 2004; Wee y Van Gelder, 2004). Los déficits en estas
funciones son sutiles o no evidentes en ratones nulos para melanopsina (Lucas y col., 2003;
Mrosovsky y Hattar, 2003; Panda y col., 2002; Ruby y col., 2002), lo que ha sugerido que los FR
clásicos complementan las funciones de la melanopsina en la regulación de las respuestas no
visuales. Sólo después de que estos ratones se cruzan con otros que carecen de bastones y conos
funcionales se observan fenotipos extremos (Hattar y col., 2003; Panda y col., 2003). Las
CGRsm proyectan principalmente a los NSQ, al NPO y al IG (Gooley y col., 2003; Hattar y col.,
2006). Las CGRsm que proyectan a los NSQ regulan la actividad del reloj circadiano (Berson y
col., 2002; Gooley y col., 2001), mientras que aquellas que proyectan a los NPO son
responsables del reflejo pupilar (revisado por Berson, 2003). El IG recibe aferencias retinianas
casi íntegramente de las CGRsm (Gooley y col., 2003; Hattar y col., 2006) y sus funciones aún
no son del todo claras (revisado por Morin, 2003). Se ha demostrado que las CGRsm también
proyectan, en menor medida, a la zona ventral y subparaventricular del núcleo ventro-lateral
preóptico, regiones del cerebro involucradas en la regulación del sueño y del ritmo circadiano de
actividad locomotora (Gooley y col., 2003; Morin y col., 2003).
Por otra parte, las CGRsm que representan una red heterogénea con amplios campos
receptivos, han sido también involucradas en la regulación del sistema visual formador de
imagen, por ejemplo a través de la regulación de la vía visual de los conos humanos en respuesta
a la exposición a luz por largo plazo (Hankins y Lucas, 2002). Belenky y colaboradores (2003)
29
Introducción
han demostrado que las dendritas de las CGRsm reciben información de células amácrinas y
bipolares, lo que provee a esta última hipótesis una base anatómica, aunque la posibilidad de que
la melanopsina desempeñe un rol en las funciones visuales formadoras de imagen es aún
controversial.
5. La glía
5.1. Macroglía
Las células macrogliales incluyen a los astrocitos presentes en la porción más interna de
la retina, en el NO y en los núcleos visuales mencionados más arriba, y a las células de Müller,
(exclusivas de la retina).
5.1.1. Astrocitos.
Los astrocitos son células grandes, no excitables, con forma estrellada, y se caracterizan
por la presencia de gran cantidad de gránulos de glucógeno en el citoplasma y de haces de
filamentos intermedios, donde se localiza la proteína glial fibrilar ácida (GFAP), específica de
este tipo celular. De acuerdo a diferencias en morfología y localización anatómica, los astrocitos
se clasifican en astrocitos protoplasmáticos (tipo I) y fibrosos (tipo II). Los astrocitos tipo I se
encuentran principalmente en la sustancia gris del SNC y poseen gran número de prolongaciones
ramificadas que suelen extenderse hasta las paredes de los vasos sanguíneos en forma de
pedicelos. De esta forma, participan en la regulación de las uniones estrechas de las células
endoteliales de los capilares y vénulas. Los astrocitos más superficiales emiten prolongaciones
con pedicelos hasta contactar con la piamadre, lo que origina la membrana pial-glial. Los
astrocitos tipo II se encuentran a lo largo de la sustancia blanca y poseen pocas y muy largas
prolongaciones que contactan la membrana axonal en los nodos de Ranvier de axones mielínicos
y suelen encapsular a las sinapsis químicas.
En la retina, los astrocitos se localizan en las regiones de las capas vascularizadas de la
30
Introducción
retina de mamíferos (Schnitzer, 1987, 1988; Stone y Dreher, 1987), y están ausentes en la retina
de aves, que es avascular (Meyer 1977; Reichenbach y col., 1993).
Además de la red compleja de procesos celulares que pone en contacto diversos
astrocitos, existen uniones nexo (gap junctions) entre astrocitos que permiten “concebir” a la red
de astrocitos como una unidad o sincicio funcional (Malone y col., 2007) mediante el cual
pueden comunicarse a través de ondas de aumento en los niveles intracelulares de calcio, y a su
vez, estas ondas pueden disparar la liberación de moléculas neuroactivas (gliotransmisores),
como glutamato y ATP, que modulan la actividad sináptica. De esta manera, una red compleja de
procesos celulares permite a la astroglía un contacto directo con las neuronas y los vasos
sanguíneos, lo que posibilita la modulación del microambiente. Sus funciones son múltiples: el
sostén estructural, la conformación de la barrera hemato-encefálica, la regulación del flujo
sanguíneo, la modulación de la función sináptica, la participación en procesos de plasticidad, la
captación de neurotransmisores, la homeostasis de fluidos, el control de pH y de la concentración
de potasio, el almacenamiento de glucógeno y la participación en procesos de reparación y
cicatrización, entre otros (revisado por Yi y col., 2011). Frente a una alteración en la homeostasis
neuronal, ocurre un amplio espectro de cambios funcionales y estructurales que inducen un
estado macroglial activado. Estos cambios pueden abarcar desde un aumento en la expresión de
GFAP en los procesos celulares, hasta la hipertrofia y proliferación astrocitaria y en casos más
severos, la formación de una cicatriz glial y la reorganización estructural.
5.1.2. Células de Müller
Las células de Müller derivan de la glia radial y constituyen las principales células gliales
de la retina de vertebrados. Poseen un cuerpo celular delgado que se extiende desde la MLE
hasta la MLI, donde se ubican sus pies terminales. Las células de Müller atraviesan todo el
espesor de la retina, rodeando y dando soporte a los somas y procesos de todas las células
retinianas. Entre las numerosas funciones de las células de Müller, se destacan: 1) su
31
Introducción
participación en el metabolismo de la glucosa y en el aporte de nutrientes a las neuronas, así
como en la remoción de sus productos metabólicos; 2) la regulación del flujo sanguíneo y la
participación en la formación y mantenimiento de la barrera hemato-retiniana interna; 3) la
participación en procesos de comunicación neuronal, particularmente a través de la captación
rápida y el reciclaje de neurotransmisores; 4) el control de la homeostasis de iones y agua y la
regulación del pH extracelular; 5) la participación en procesos de reparación y reactividad frente
a una injuria; y 6) la liberación de diversos factores neurotróficos que regulan la función
retiniana (ATP, factor de crecimiento vascular endotelial, factor de crecimiento derivado del
epitelio pigmentario, factor de crecimiento transformante  y factor neurotrófico derivado de
cerebro (BDNF), entre otros) (revisado por Bringmann y col., 2006). El BDNF sintetizado en las
células de Müller es un factor clave para la supervivencia de las CGRs durante el desarrollo y
frente al daño neuronal.
En condiciones fisiológicas, las células de Müller no expresan GFAP pero sí lo hacen
frente a una variada gama de noxas retinianas como la isquemia, el daño por luz y la retinopatía
diabética, entre otras (Dorfman y col., 2013; Grosche y col., 1997; Salido y col., 2013). En este
contexto, el aumento en la expresión de GFAP en las células de Müller constituye un reconocido
indicador de daño o estrés retiniano (Osborne y col., 1991; Wu y col., 2003).
5.2. Microglía
Las células microgliales son las células inmunes residentes del SNC, constituyen el 10%
de la población glial total del cerebro y cumplen diversas funciones, tanto en condiciones
normales como patológicas. Pueden tener efectos tóxicos sobre las neuronas durante el desarrollo
o después de una lesión, como resultado de producción de sustancias citotóxicas y la expresión
de diferentes receptores y sustancias relacionadas con la presentación de antígenos. Por otro
lado, también pueden facilitar la diferenciación neuronal, la supervivencia, y la regeneración a
través de la producción de factores neurotróficos, como BDNF, factor de crecimiento nervioso,
32
Introducción
neurotrofina 3, neurotrofina 4/5, factor básico de crecimiento de fibroblastos, factor de
crecimiento de hepatocitos y factor de crecimiento transformante y sus receptores, así como
diversos factores de diferenciación (Aarum y col., 2003; Hanisch, 2002; Kim y de Vellis, 2005).
Perry y Gordon (1988) propusieron que la microglía atraviesa la barrera hemato-retiniana intacta
en estadíos embrionarios tardíos y postnatales tempranos y se mantiene en el parénquima,
integrada a la retina, principalmente en los estratos fibrosos (CPE, CPI), y en escaso número en
la CFN de la zona central de la retina, adyacente al NO. Más recientemente, la hipótesis de que la
microglía se origina a partir de monocitos circulantes, precursores de monocitos inmaduros, o
células progenitoras mesenquimáticas está adquiriendo mayor aceptación.
En forma relativamente reciente, diversos estudios se han centrado en la participación de
la microglía en diferentes enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer (McGeer y col.,
1987), la enfermedad de Parkinson (Imamura y col., 2003), la esclerosis múltiple (Napoli y
Neumann, 2010) y el glaucoma (Bosco y col., 2011) y en condiciones patológicas como la
hipoxia (Morigiwa y col., 2000), la isquemia cerebral (Hur y col., 2010) o procesos tumorales.
Muchos de estos trabajos se han enfocado particularmente en la marcada transformación de la
microglía a partir de un estado latente o “en reposo” a un fenotipo hipertrofiado o “activado” e
incluso ameboide (Figura 10). En forma previa a su activación, la microglía exhibe una
morfología altamente ramificada, con sitios de ramificación primaria que pueden exceder los 50
m de largo (estado de reposo). En respuesta a una señal de activación, se inicia una etapa de
reestructuración del citoesqueleto, en la que la microglía retrae sus prolongaciones y puede
hipertrofiarse. Durante esta etapa, hay poca o nula extensión de procesos, y sólo se observa
retracción. En algunos casos y en etapas más avanzadas, los procesos microgliales pueden
retraerse hasta aproximadamente el diámetro del cuerpo celular, y nuevas prolongaciones
vuelven a protruir. En la etapa mótil, las prolongaciones nuevas pueden crecer y encogerse, lo
que permite a las células microgliales contactarse con células vecinas (o restos celulares),
33
Introducción
interactuar con ellas y también fagocitarlas (Stence y col., 2001). En la etapa de locomoción, las
células pueden migrar al sitio de la lesión siguiendo un gradiente quimiotáctico de ATP y óxido
nítrico, entre otros factores, liberados directa o indirectamente en el sitio del daño (Duan y col.,
2009).
Figura 10. Modelo de la dinámica de activación microglial. Se muestra un esquema de la microglía
ramificada en reposo (negro), previa a una señal de activación (amarilla) y los cambios fenotípicos que se
suceden tras la activación microglial: estado hipertrófico y de retracción de los procesos (rojo); estado de
transición, en el que la retracción llega a ser máxima; estado mótil, en el que se generan nuevos procesos
(en verde) y estado locomotor, en el que adquiere la capacidad de migrar, estos últimos también estados
fagocíticos. Se indica el nivel de expresión del marcador microglial: molécula adaptadora de unión a
calcio ionizado- 1 (Iba-1), que aumenta o disminuye en relación a la remodelación del citoesqueleto o a
los cambios en la forma celular de un estado a otro. Modificado de Stence y col. (2001).
Además de la notable plasticidad morfológica, la microglía es capaz de realizar diversas
funciones similares a los macrófagos, incluyendo la fagocitosis, la producción de citoquinas proo anti-inflamatorias y la presentación de antígenos (Garden y Moller, 2006), por lo que pueden
tener efectos tanto neurotóxicos como neuroprotectores y regenerativos (Yokoyama y col.,
2004). Actualmente, según una clasificación funcional y molecular la microglía activada se
subdivide en: M1, estadío de activación clásica con propiedades citotóxicas, usualmente refiere a
células estimuladas con interferón y/o factor de necrosis tumoral  que expresan citoquinas
pro-inflamatorias; M2a, estadío de activación alterna, se polariza in vitro por interleuquina 13
34
Introducción
(IL-13) y participa en procesos de reparación y regeneración y M2b, con un fenotipo
inmunorregulador polarizada por IL-10. Existe también un tipo microglial M2c, con un fenotipo
desactivado adquirido (Mosser y Edwards, 2008).
La mayoría de los estudios se han enfocado a los procesos de activación microglial, en
tanto que los procesos de “resolución” o “desactivación” que frenan la respuesta han sido
comparativamente menos estudiados (revisado por Luo y Chen, 2012).
Indudablemente, estas clasificaciones tienden a sobre-simplificar la capacidad de las
distintas poblaciones microgliales para sintonizar finamente una respuesta inmune. En este
sentido, las evidencias indican que es el microambiente más que el modo de activación, lo que
podría regular las características de la microglía. En la enfermedad priónica de roedores, la
microglía retrae sus procesos y sobre-expresa Iba-1 y otros marcadores microgliales (Betmouni y
col., 1996; Broom y col., 2007) pero carece de la capacidad de sintetizar IL-1 a menos que sea
expuesta a lipopolisacárido bacteriano (LPS) administrado a nivel periférico (Walsh y col., 2000,
2001), lo que contribuye a exacerbar la neurodegeneración. El concepto de polarización
microglial es limitado, en tanto no toma en cuenta muchas otras variables, como el nivel de
activación de un dado subtipo, el tiempo de permanencia de las señales de activación, la
interacción con neuronas y astrocitos, la disfunción microglial asociada a la edad, el origen de la
microglía, las poblaciones y proporciones de otros leucocitos y el potencial de una célula
microglial de transformarse entre diferentes estados de activación. Frente a una lesión, se
produce aparentemente una mezcla de células M1 o M2 y muchos otros subtipos (revisado por
Anthony y Pitossi, 2013).
El rol dual de la microglía refiere a la influencia de la microglía sobre las neuronas. Sin
embargo, muchos estudios indican que las neuronas no son meramente “blancos” pasivos de la
microglía, sino que ejercen cierto control sobre las actividades de estas últimas. Existen muchos
tipos de interacción entre las neuronas y la microglía, algunas de las cuales se muestran en la
35
Introducción
Figura 11.
a
Figura 11. Esquema del “diálogo neurona-microglía”. La microglía expresa un grupo de receptores de
superficie que desencadenan señales intracelulares en condiciones de reposo. Muchas de estas señales son
ligandos liberados o expresados en la superficie neuronal como los receptores inhibitorios CX3CR1,
CD200R, y CD172a/Sirp alpha, cuyos ligandos se encuentran en la superficie de neuronas “sanas”. La
disminución de estas señales es indicativa de la pérdida de integridad neuronal. Los receptores como
TREM-2 y purinérgicos median señales que reproducen la injuria neuronal e inducen fagocitosis y
funciones anti-inflamatorias en la microglía. Las neuronas también liberan factores como IL-34 y Csf1
que se unen a su receptor en la superficie microglial e inducen la supervivencia celular o proliferación.
Modificado de Kierdorf y Prinz (2013).
Se ha postulado que la activación microglial, como consecuencia de la injuria neuronal,
estaría involucrada en mecanismos neuroprotectores y que la pérdida posterior de la
comunicación específica entre las neuronas y la microglía, conduciría al comportamiento
neurotóxico de estas últimas (Polazzi y Contestabile, 2002). Múltiples evidencias han
demostrado un intercambio considerable de información entre estos dos tipos celulares y se ha
sugerido que dependiendo el estado neuronal, señales ON u OFF desde las neuronas inducirían
fenotipos microgliales de activación o reposo, respectivamente (Biber y col., 2007). En
consecuencia, la microglía no solo “patrulla” el SNC, sino que también recibe y responde
activamente a señales neurales. Asimismo, la microglía se comunica bidireccionalmente con
astrocitos, determinando el microambiente y la influencia que tendrá sobre procesos de
degeneración o regeneración neuronal. Por un lado, los astrocitos ejercen un rol neuroprotector al
36
Introducción
modular la actividad de la microglía es decir, disminuyendo su citotoxicidad, por ejemplo al
reducir la expresión de IL-12 (Aloisi y col., 1997) e iNOS (Pyo y col., 2003); por el otro, la
microglía libera citoquinas pro-inflamatorias que disminuyen la expresión de conexina 43
(Rouach y col., 2002) y bloquean las uniones estrechas en astrocitos, lo que aumenta su
supervivencia. Además, la activación de astrocitos no sólo facilita la activación de la microglía
distante mediante ondas de calcio, sino también puede inhibir la actividad microglial (Liu y col.,
2011).
5.3. Oligodendrocitos
Los oligodendrocitos maduros (OM) poseen un cuerpo celular pequeño con un
citoplasma muy denso. Presentan un retículo endoplasmático rugoso abundante, frecuentes
polirribosomas libres, un complejo de Golgi desarrollado y numerosas mitocondrias. El núcleo es
esférico y contiene gran cantidad de heterocromatina, pero es más pequeño que el de los
astrocitos. Los OM presentan menor cantidad de prolongaciones y son menos ramificadas que las
de los astrocitos. Son las células gliales especializadas en la formación y mantenimiento de la
vaina de mielina de las fibras del SNC, por lo que se localizan en columnas entre los axones. En
la retina, no existen oligodendrocitos y los axones de las CGRs en la CFN de la retina son
amielínicos. Por otra parte, la porción más cercana a la retina del NO posee fibras amielínicas y
río abajo de una zona de transición, las fibras se mielinizan por oligodendrocitos que se ubican
en esta porción del NO (Figura 8).
Los oligodendrocitos se desarrollan de acuerdo a un linaje bien establecido, definido por
etapas secuenciales en las que se expresan marcadores de superficie y epitopes específicos de
mielina (Figura 12). Los estadios sucesivos se distinguen por el aumento progresivo en la
complejidad morfológica. La célula precursora de oligodendrocitos (CPO) se identifica por la
inmunomarcación para el proteoglicano condroitín sulfato-4 (NG2) o para el receptor  del
factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR-). El oligodendrocito premielinizante
37
Introducción
(preMO), es una célula progenitora tardía, mitóticamente activa y de morfología multipolar
simple y se la identifica por la presencia del marcador O4 y la ausencia del marcador
oligodendrocitos 1 (O1), un galactocerebrósido también denominado GalC. El oligodendrocito
mielinizante inmaduro (OMi) es una célula de morfología multipolar compleja, post-mitótica,
identificada por la presencia de O1 y por la ausencia de moléculas presentes en las vainas de
mielina. Por último, el OM maduro (OMm) se identifica por marcadores asociados a mielina,
como MBP y otros que se indican en la Figura 12 (Back y col., 2007). De este modo, es posible
definir tanto in vivo como in vitro, el momento y las características de la progresión del linaje de
los oligodendrocitos.
Figura 12. Maduración del linaje de oligodendrocitos. En el esquema se muestran cuatro estadíos del
linaje de oligodendrocitos, junto con sus correspondientes características morfológicas y capacidad de
mielinización, migración y proliferación. Cada estadío se define por la combinación de genes,
glicolípidos o proteínas marcadoras que se indican en la Figura. CNP, actividad CNPasa, β’:γ’-nucleótido
cíclico-3-fosfodiesterasa; GalC(O1), galactocerebrósido; MAG, glicoproteína asociada a mielina; MBP,
proteína básica de mielina; MOG, glicoproteína de mielina de oligodendrocitos; NG2, proteoglicano
condroitín sulfato-4; PDGFR, factor de crecimiento derivado de plaquetas-; PLP, proteína
proteolipídica. Olig2 y Sox10 son genes altamente expresados en preMO. Extraído de Back y col., 2007.
38
Introducción
Los axones que forman parte del NO están rodeados por segmentos internodales de
mielina formada por diversos OMm. El espacio entre las vainas de mielina de distintos OMm se
denomina nodo de Ranvier. La mielina actúa como aislante de baja capacitancia y alta
resistencia, de manera que la corriente iónica que se transmite en la zona intermodal lo hace a
alta velocidad (conducción electrotónica o pasiva), mientras que en el nodo de Ranvier la
conducción es mucho más lenta (conducción activa). Esta diferencia de velocidades de
conducción entre la zona intermodal y el nodo de Ranvier hace que la conducción sea
“saltatoria” (de nodo a nodo). Esta adaptación permite un aumento considerable en la velocidad
de conducción y representa un “ahorro” significativo en términos energéticos. La mielina cumple
además una función protectora, ya que asegura la continuidad de la conducción del impulso
nervioso. La estructura de la vaina de mielina consiste en una sucesión de capas alternantes de
lípidos mixtos y proteínas, que se mantienen íntimamente unidas por moléculas de adhesión,
tales como PLP, MBP y MAG, formando una vaina compacta (Baumann y Pham-Dinh, 2001;
Kursula, 2008). Los altos niveles de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno pueden afectar la
estabilidad de la vaina de mielina, al modificar tanto a PLP por peroxidación lipídica, como a las
proteínas que residen entre las superficies repulsivas externas de las láminas de mielina,
causando un debilitamiento o desprendimiento de láminas y el aumento del espesor general la
vaina (Bizzozero y col., 2001; Bongarzone y col., 1995). Se ha sugerido que las subpoblaciones
de
oligodendrocitos
que
mielinizan
axones de
mayor
calibre,
identificados
como
CNP(+)/anhidrasa carbónica II(-), son más susceptibles al daño oxidativo y a la subsecuente
descompactación y pérdida de la integridad axonal, que las subpoblaciones que envuelven mayor
cantidad de axones, de menor calibre y son CNP(+)/anhidrasa carbónica II(+) (Butt y col, 1995;
Payne y col., 2012).
39
Introducción
6. El glaucoma
6.1. Características generales
El glaucoma define a un grupo de desórdenes visuales que constituye una de las
principales causas de ceguera irreversible en el mundo (Weinreb y Khaw, 2004). Es una
disfunción ocular caracterizada por manifestaciones clínicas e histopatológicas que incluyen una
pérdida progresiva de las funciones visuales, que se acompaña de la muerte de CGRs y la atrofia
progresiva de la cabeza del NO. Una complejidad adicional del glaucoma es que su curso es
prácticamente asintomático hasta etapas avanzadas de pérdida visual, debido a que la enfermedad
afecta en primera instancia al campo visual periférico y sólo en las últimas etapas compromete la
visión central.
A pesar del esfuerzo realizado en el área en los últimos 40 años, aún no se conocen
completamente los agentes etiológicos de la enfermedad. El aumento de la PIO es el principal
factor de riesgo para el desarrollo del glaucoma (Gordon y col., 2002; Sommer, 1989). De hecho,
la farmacología disponible para el tratamiento de esta disfunción está orientada esencialmente al
control de la PIO. Sin embargo, un porcentaje considerable de los diagnósticos de glaucoma
(Shields, 2008) corresponden a casos de glaucoma de PIO normal. Por otra parte, es
considerablemente frecuente la detección de una hipertensión ocular crónica sin daño a nivel del
NO (revisado por Heijil y col., 2002).
Existen distintas formas de clasificar a los glaucomas. Según su etiología, se dividen en
primarios (sin causa aparente) o secundarios a otras patologías como diabetes, miopía y uveítis
entre otras (Daubs y Crick, 1981; Klein y col., 1994; Richler y col., 1982). De acuerdo a la
apariencia del ángulo de la cámara anterior, pueden ser glaucomas de ángulo cerrado o abierto
(que es la forma más frecuente (60 -70%) de la enfermedad) (Choong y col., 2003; Weinreb y
Khaw, 2004). Por último, según su evolución pueden cursar en forma aguda o crónica. Se ha
postulado la influencia de un factor hereditario (Shin y col., 1977), así como de un componente
40
Introducción
etario (Quigley y col., 1994) y racial (Tielsch y col; 1994). En el glaucoma primario de ángulo
abierto, la resistencia a la salida del humor acuoso está incrementada, causando una elevación de
la PIO. El mecanismo preciso de la disminución del flujo de humor acuoso es aún elusivo,
aunque muy probablemente esté asociado a alteraciones a nivel del trabeculado y/o el canal de
Schlemm (Cernea, 1993).
El diagnóstico clínico del glaucoma primario de ángulo abierto se fundamenta en tres
alteraciones oculares: el aumento de la PIO, la alteración concéntrica del campo visual y la
excavación de la papila, debida a la pérdida de axones del NO. Si bien la disminución
farmacológica o quirúrgica de la PIO es por ahora la terapia de elección, en muchos casos se ha
observado que la pérdida visual persiste o incluso progresa luego de su restauración a valores
normales. A pesar de la gran variedad de fármacos disponibles (agonistas o antagonistas
adrenérgicos, agonistas colinérgicos o inhibidores de la colinesterasa y análogos de
prostaglandinas, entre otros), aún existe controversia en la terapia médica del glaucoma. En el
inicio de la enfermedad, el tratamiento frecuente es la administración tópica de alguno de los
fármacos; cuando el daño en el NO o en el campo visual progresa a pesar de la terapia
farmacológica (Edmunds y col., 1999) o no se logra un adecuado control de la PIO, se recurre a
una intervención quirúrgica que puede optar entre dos modalidades: una esclerotomía penetrante
o no penetrante. La primera consiste en la creación de una vía accesoria de filtración del humor
acuoso mediante la eliminación de la red trabecular y de una comunicación permanente entre la
cámara anterior y posterior; la segunda técnica consiste también en la creación de una vía
accesoria de filtración del humor acuoso a través de la esclera por eliminación de la red
trabecular pero sin penetrar en la cámara anterior.
6.2. Modelos experimentales de glaucoma
Desde hace varias décadas, la comunidad científica internacional reconoce el uso de
modelos animales como una herramienta útil para el estudio de la patología humana. La similitud
41
Introducción
de un proceso patológico en animales de experimentación, aún con diferencias respecto al
humano, contribuye significativamente a la comprensión de un proceso en su contraparte
humana. A pesar de múltiples intentos, el desarrollo de modelos para el estudio del glaucoma
todavía no ha alcanzado consenso en un modelo que reproduzca completamente la enfermedad
en animales de laboratorio y sea reproducible. Dado el vínculo estrecho entre la hipertensión
ocular y el daño glaucomatoso, los modelos animales de glaucoma generalmente se desarrollan a
través de la inducción de hipertensión ocular o hacen uso de cepas de animales con aumento
espontáneo de la PIO (Pang y Clark 2007; Sappington y col., 2010). En este sentido, las
estrategias más frecuentemente utilizadas son: 1) la cauterización u oclusión de 2 ó 3 de las
venas epiesclerales (Shareef y col., 1995); 2) la inyección de solución salina hipertónica en las
venas acuosas (Morrison y col., 1997); 3) el bloqueo del flujo acuoso por fotocoagulación luego
de la inyección de tinta china en la cámara anterior (Ueda y col., 1998); 4) la inyección de
microesferas de látex en la cámara anterior del ojo que bloquea el drenaje del humor acuoso a
nivel del trabeculado (Weber y Zelenak, 2001) y 5) el uso de cepas de animales en los que la
patología se produce por alteraciones genéticas, de los cuales el más frecuentemente utilizado es
el ratón DBA/2J (Anderson y col., 2002). Estos ratones desarrollan una hipertensión ocular
espontánea, muy variable entre individuos, entre sexos e incluso entre ojos de un mismo animal,
que se hace evidente entre los 6 - 10 meses de vida. Este aumento de la PIO se debe a la
mutación recesiva de dos genes, Gpnmb y Tyrp-1 y tiene como consecuencia una atrofia del
estroma del iris y una dispersión del pigmento que produce la obstrucción de la vía de salida del
humor acuoso, provocando el aumento de la PIO que se asimila al glaucoma pigmentario en
humanos (Anderson y col., 2002). Ninguno de estos modelos es ideal y todos ellos tienen
algunas desventajas, como la necesidad del uso de equipos especializados y de técnicas
quirúrgicas complejas, o presentan una cinética de aumento de la PIO marcadamente diferente a
la de los humanos.
42
Introducción
Como ya se mencionó, los tipos predominantes de GAGs en el trabeculado son el AH y el
CSU. Trabajos pioneros de Barany y Scotchbrook (1954) demostraron que el tratamiento de ojos
de gato con hialuronidasa testicular bovina disminuye la resistencia al filtrado de humor acuoso
en el ángulo, a casi la mitad de su valor inicial. Desde entonces, se ha dedicado considerable
atención a los mucopolisacáridos sensibles a hialuronidasa en el sistema de salida del flujo
acuoso. En este sentido, se ha demostrado que la hialuronidasa testicular incrementa el flujo de
humor acuoso en ojos de perros (Van Buskirk y Brett, 1978) aunque la evidencia sugiere un
efecto menor en ojos humanos (Hayasaka y Sears, 1978). Asimismo, se demostró una
correlación entre la remoción del AH y la disminución en el flujo de humor acuoso en ojos de
conejo (Knepper y col., 1984), perro (Van Buskirk y Brett, 1978) y vaca (Barany y Scotchbrook,
1954), pero no en ojos de primates (Hubbard y col., 1997; Sawaguchi y col., 1992).
En la práctica oftalmológica, se dispone de evidencias considerables a partir del uso de
agentes viscoelásticos que avalan el vínculo entre los GAGs y la PIO. Estos agentes contienen
AH y CSU y se han convertido en una herramienta esencial en la cirugía del segmento anterior
para generar espacio y reducir el trauma y la pérdida de células endoteliales. Estos agentes son
responsables de causar o exacerbar en forma transitoria, pero a veces significativa, una elevación
post-quirúrgica de la PIO (Jurgens y col., 1997). Estos resultados sugieren que el AH y el CSU
podrían participar en la regulación del flujo de humor acuoso y que la acumulación de estos
GAGs en el trabeculado podría cumplir un rol significativo en el glaucoma crónico de ángulo
abierto. En trabajos previos de nuestro laboratorio hemos desarrollado un modelo experimental
de glaucoma a través de la administración semanal de AH en la cámara anterior del ojo. En este
sentido, hemos demostrado que la inyección aguda o crónica de AH aumenta significativamente
la PIO en el ojo de rata (Benozzi y col., 2002) y su administración en forma crónica reproduce
aspectos centrales del glaucoma crónico humano tanto a nivel funcional como histológico
(Moreno y col., 2005a). Sin embargo, el análisis bioquímico del perfil de GAGs de la red
43
Introducción
trabecular de pacientes con glaucoma demuestra una marcada disminución en el contenido de
AH y un aumento en el contenido de CSU (Knepper y col., 1996). Resultados similares se
demostraron en un modelo de glaucoma en conejos (Knepper y col., 1985). Estos resultados
sugieren que el CSU podría participar activamente en la regulación de la salida del humor acuoso
y que una acumulación de CSU en el trabeculado podría desempeñar un rol central en el
glaucoma crónico. De hecho, se demostró que el aumento en el contenido de CSU en el tejido
conectivo yuxtacanalicular de pacientes con glaucoma tiene mayor impacto sobre la resistencia a
la salida de humor acuoso que el aumento en los niveles de AH (Knepper y col., 2005). Estas
evidencias avalan la posibilidad de que un aumento en el contenido de CSU en la cámara anterior
del ojo podría provocar un aumento en la PIO, aspecto que se analizará en este trabajo de Tesis.
6.3. La vía visual en el glaucoma
El glaucoma es usualmente concebido como una enfermedad limitada al ojo; sin
embargo, los axones de las CGRs son extraoculares, con componentes intraorbitales e
intracraneales. En el sistema visual, como en otros sistemas cerebrales, la función y
supervivencia neuronal depende de las conexiones con otras neuronas. Se ha demostrado una
reducción marcada en la densidad de fibras retinianas procedentes de ojos con glaucoma
experimental en el NGLd y el CS (Drouyer y col., 2008). Sin embargo, la información disponible
respecto a cambios trans-sinápticos a nivel del NGL, el CS y la corteza visual primaria (CV1)
han sido hasta ahora sólo escasamente examinados. Estudios en modelos experimentales de
glaucoma en monos han demostrado una disminución significativa en el número, la densidad y el
tamaño de neuronas, así como en el volumen laminar del NGL ipsilateral al ojo glaucomatoso en
las capas retinorreceptivas del NGL que reciben aferencias del ojo glaucomatoso (Weber y col.,
2000; Yücel y col., 2001). En algunos casos, se ha observado un daño preferencial en la vía M
(Weber y col., 2000), en otros de la vía P (Yücel y col., 2001), en tanto que otros estudios
demostraron daños comparables en ambos sistemas (Vickers y col., 1997; Yücel y col., 2003).
44
Introducción
Esta contradicción se extiende también a los resultados obtenidos en un número pequeño de
autopsias humanas (Chaturvedi y col., 1993; Gupta y col., 2006).
Los mecanismos involucrados en el daño neuronal del NGL, el CS y la CV1 en el
glaucoma son aún elusivos. Aunque es un hecho establecido que en el glaucoma las CGRs
mueren por apoptosis, no se han realizado estudios similares a nivel de las proyecciones
cerebrales. Sin embargo, se ha demostrado en situaciones experimentales en las que se produce
desconexión de vías aferentes que las neuronas desaferentadas se “encogen” y posteriormente
mueren por apoptosis (Guillery, 1973). Se ha sugerido que la atrofia neuronal inducida por la
hipertensión ocular podría representar tanto un estado de quiescencia o reducción en el consumo
de energía secundario a la pérdida del input retiniano (Zhang y col., 2009). Algunas evidencias
sugieren que estos cambios podrían ser reversibles, lo que permitiría inducir alguna forma de
intervención terapéutica para prevenir la muerte celular aún en estadíos en los que se observa
reducción del tamaño neuronal (Guillery, 1973; Matthews, 1964). Sin embargo, todos los
estudios dedicados a la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas para el glaucoma, no han
examinado si el beneficio terapéutico se extiende a las vías de procesamiento cortical de la
información visual.
Otro aspecto de interés es la elucidación del curso temporal del daño glaucomatoso en las
vías visuales superiores. Si bien en un modelo de glaucoma en monos se ha descripto una
relación lineal entre el grado de daño del NO y la atrofia de neuronas en el NGL (Yücel y col.,
2001; 2003), también se ha descripto una reducción del tamaño de neuronas del NGL en monos
con hipertensión ocular, sin pérdida evidente de fibras del NO. Esto podría sugerir que la atrofia
del NGL es un evento temprano, eventualmente relacionado en forma directa con la hipertensión
ocular o con cambios funcionales (pero no histológicos) retinianos. La degeneración de neuronas
del NGL y del CS podría ser un mecanismo activo de daño glaucomatoso sobre las CGRs y sus
axones al reducir su metabolismo y disminuir el suministro de factores tróficos a la retina (Gupta
45
Introducción
y Yücel, 2007; Pearson y Stoffler, 1992). Además, cambios en las neuronas del NGL pueden
provocar daños post-sinápticos (degeneración trans-sináptica) en la CV1, localizada en la parte
posterior del cerebro y organizada en columnas de dominancia ocular específica (Crawford y
col., 2001; Lam y col., 2000). Estudios de resonancia magnética demostraron alteraciones
significativas en la CV de pacientes con glaucoma, con una reducción en la densidad de la
sustancia gris en las zonas corticales de proyección visual (Boucard y col., 2009). Estos
resultados sugieren que el glaucoma induce una degeneración retinotópica específica en la CV.
En un modelo de glaucoma experimental en ratas se demostró una alteración del metabolismo de
colina y un aumento marginal en los niveles de glutamato en la CV1 contralateral al ojo
glaucomatoso (Chan y col., 2009). Asimismo, se han demostrado cambios metabólicos en la
CV1 en monos con glaucoma experimental (Lam y col., 2003).
Estos resultados, aunque aún son evidencias fragmentarias obtenidas en un número muy
reducido de muestras humanas y en diferentes modelos experimentales de glaucoma, sugieren
que el daño de las CGRs provoca cambios degenerativos en el NGL, el CS y la CV1. Sin
embargo, las evidencias resultan contradictorias en algunos aspectos, los mecanismos
involucrados en el proceso degenerativo y el curso temporal de este proceso no han sido
exhaustivamente examinados y no se dispone al presente de estrategias terapéuticas capaces de
prevenir, curar, o detener el daño cortical asociado a la pérdida visual glaucomatosa. Desde una
perspectiva clínica, un estudio detallado de la relación entre el déficit retiniano y los cambios
estructurales y funcionales corticales, podrían contribuir a una mayor comprensión de la
progresión en la disfunción visual glaucomatosa, así como al desarrollo de estrategias
terapéuticas diseñadas para la protección del daño cerebral asociado al glaucoma.
46
Introducción
7. La minociclina
La minociclina (MINO) es un análogo semi-sintético de la tetraciclina, de fácil absorción
por el tracto gastro-intestinal, con una vida media aproximada de 18 h (revisado por Chen y col.,
2011). La MINO es una molécula altamente liposoluble, por lo que puede atravesar fácilmente la
barrera hemato-encefálica y hemato-retiniana. En dosis terapéuticas, la MINO tiene buena
tolerancia para su uso en humanos (Chen y col., 2011; Garrido-Mesa y col., 2013). Además de
sus propiedades antimicrobianas, la MINO tiene un potente efecto antiinflamatorio
inmunomodulatorio y neuroprotector (Maier y col., 2007; Chen y col., 2011). El efecto antiinflamatorio de la MINO involucra la inhibición de la activación y la migración microglial,
estimulando su transformación al fenotipo en “reposo” tanto in vivo como in vitro (Garrido-Mesa
y col., 2013), así como la inhibición de la síntesis de óxido nítrico y citoquinas pro-inflamatorias
(Yang y col., 2007; Baptiste y col., 2005; Bosco y col., 2008). Asimismo, se ha demostrado que
la MINO induce cascadas de señales anti-apoptóticos, disminuye la toxicidad glutamatérgica (Du
y col., 2001; Chen y col., 2000; Levkovitch-Verbin y col., 2013; 2014; Sánchez Mejía y col.,
2001; Wang y col., 2004; Zhu y col., 2002), y actúa como scavenger de radicales libres (Kraus y
col., 2005, Wilkins y col., 2004).
Como ya se mencionó, luego de una lesión neuronal, la microglía se activa y libera
sustancias con alto poder deletéreo. De hecho, existe consenso en que la microglía constituye un
blanco potencialmente explotable con fines preventivos y terapéuticos en procesos
neuroinflamatorios y neurodegenerativos. Sobre la base de sus efectos sobre la reactividad
microglial, se han demostrado efectos beneficiosos de la MINO en diversos modelos de injuria
neuronal, como isquemia cerebral (Yrjänheikkii y col., 1998), daño en la médula espinal (Teng y
col., 2004), esclerosis múltiple (Zhang y col., 2008), esclerosis lateral amiotrófica (Kriz y col.,
2002; Zhu y col., 2002), enfermedad de Huntington (Chen y col., 2000; Wang y col., 2006),
enfermedad de Parkinson (Du y col., 2001), y en modelos de daño retiniano inducido por luz
47
Introducción
intensa (Zhang y col., 2004) y transección del NO (Baptiste y col., 2005; Levkovitch-Verbin y
col., 2006; 2011). De hecho, se han realizado estudios clínicos para analizar el efecto de la
MINO en el tratamiento de pacientes con esclerosis múltiple, con resultados alentadores (Zabad
y col, 2007; Zhang y col., 2008). Sin embargo, sólo existen escasos antecedentes sobre el uso de
MINO en el glaucoma (Bosco y col., 2008; Levkovitch-Verbin y col., 2006; 2014). Bosco y
colaboradores (2008) demostraron que el tratamiento de ratones DBA/2J con MINO aumenta la
fracción de células microgliales con fenotipo ramificado, reduce los niveles de Iba-1 y previene
la disminución del transporte axonal retrógrado (desde el CS a la retina). Por otra parte, en un
modelo de glaucoma experimental en ratas inducido por la fotocoagulación translimbal con láser,
se ha demostrado que la MINO aumenta significativamente la expresión del gen anti-apoptótico
Bcl-2, disminuye la expresión de IL-18 y reduce el número de células microgliales fagocíticas en
la retina (Levkovitch-Verbin y col., 2014). El conjunto de antecedentes mencionados, avala la
realización de estudios adicionales para la evaluación del efecto de la MINO con fines
terapéuticos en el glaucoma, aspecto que se analizará en el marco de este trabajo de Tesis.
48
Objetivos
OBJETIVOS
Sobre la base de las consideraciones mencionadas en la Introducción, los objetivos centrales de
este trabajo de Tesis fueron:
1. Analizar los efectos del glaucoma agudo experimental sobre la retina y las vías visuales
superiores.
2. Analizar los efectos del glaucoma agudo experimental sobre el sistema visual no
formador de imágenes.
3. Desarrollar un modelo de glaucoma crónico experimental en ratas.
4. Analizar los efectos del glaucoma crónico experimental sobre las vías visuales superiores.
5. Examinar el efecto de la minociclina sobre las alteraciones inducidas por el glaucoma
crónico a nivel de la retina, el nervio óptico y el colículo superior.
6. Analizar los efectos del glaucoma crónico experimental sobre el sistema visual no
formador de imágenes.
49
Materiales y Métodos
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Animales
Se utilizaron ratas Wistar macho adultas (300 ± 50 g). Los animales se mantuvieron bajo
condiciones controladas de temperatura (21 ± 2°C) y humedad, bajo un fotoperíodo de 12 h de
luz (~ 150 lux en las jaulas) y 12 h de oscuridad (encendido de las luces a las 08.00 h), con agua
y alimento ad libitum. En todos los casos, los animales se anestesiaron con hidrocloruro de
ketamina (150 mg/kg) e hidrocloruro de xilacina (2 mg/kg), administradas intraperitonealmente.
En algunos casos, se aplicó anestesia local (hidrocloruro de proparacaína al 0,5%) en la córnea.
1.1. Inducción de glaucoma agudo. Bajo anestesia general, se canuló la cámara anterior de
cada ojo con una aguja 30G conectada a un reservorio presurizado, conteniendo solución Ringer
lactato. Mediante la regulación de la presión del reservorio, se modificó la presión intraocular
(PIO), que se elevó a 70 mm de Hg durante 90 minutos. De esta manera se indujo una
hipertensión ocular aguda (HOA), caracterizada por el bloqueo total del flujo sanguíneo
(observado mediante examinación del fondo de ojo) y pérdida de la respuesta
electrorretinográfica. Luego de completado el período de hipertensión ocular, se retiró la aguja
de la cámara anterior y se comprobó la inmediata reperfusión y recuperación del flujo sanguíneo.
En el caso del tratamiento simulado, se realizó el mismo procedimiento pero sin el aumento de la
PIO (Figura 13). Durante todo el procedimiento se mantuvo constante la temperatura corporal
mediante el uso de mantas térmicas. Se excluyeron de los experimentos aquellos animales que
sufrieron daño en el cristalino (desarrollo de cataratas) durante el procedimiento. Los animales
se sacrificaron al cabo de 1, 2 ó 4 semanas.
50
Materiales y Métodos
A
B
Figura 13. Fotografías de ojos canulados en la cámara anterior. Panel A: Se muestra un ojo canulado con
una aguja 30G durante el procedimiento simulado. Panel B: Se muestra un ojo con ausencia de rubidez
durante la HOA.
1.2. Inducción de glaucoma crónico. Las ratas se anestesiaron como ya se mencionó.
Mediante el uso de agujas 30G, se inyectaron 10 l de condroitín sulfato (CSU) (400 mg/ml) en
un ojo y el mismo volumen de solución fisiológica en el ojo contralateral. Para ello, los ojos se
enfocaron bajo un microscopio quirúrgico con luz coaxial (Colden, Argentina). Se movió la
aguja a través del limbo esclero-corneal hacia la cámara anterior con el bisel hacia abajo. Cuando
la punta del bisel alcanzó la cámara anterior, el líquido progresivamente incrementó la
profundidad de la cámara, separando la aguja del iris y evitando el contacto con el cristalino. Las
inyecciones se realizaron una vez/semana usando la fuerza necesaria para vaciar el contenido de
la jeringa de tuberculina. El sitio de inyección fue el limbo esclero-corneal, comenzando en la
hora 12 y cambiando semanalmente el sitio de la inyección de hora en hora para evitar la
formación de pannus y rotando el animal para lograr mejor acceso al limbo. Se excluyeron los
animales que desarrollaron cataratas o pthisis bulbi, cuya incidencia no superó el 5% del total de
animales utilizados. Además, casi todos los animales desarrollaron un edema corneal localizado
en el sitio de la inyección que no duró más de 24 h. Durante el período en que los animales
estuvieron anestesiados, se colocó gel sobre los ojos para evitar la sequedad corneal. No se
observaron diferencias en la incidencia de las complicaciones oculares entre los grupos
inyectados con vehículo o CSU. Como control del efecto de las inyecciones per se, se utilizó un
grupo de animales que se manipuló y anestesió en forma análoga, pero no se aplicaron
51
Materiales y Métodos
inyecciones intracamerales. En algunos experimentos, se inyectó vehículo y el ojo contralateral
permaneció intacto. Los animales se sacrificaron a las 3, 6, 10 ó 15 semanas de tratamiento.
1.2.1. Tratamiento con minocilina. Un grupo de animales con glaucoma crónico unilateral al
cabo de cuatro semanas, se dividió al azar en dos subgrupos: uno de ellos recibió
intraperitonealmente una solución de 30 mg/kg de hidrocloruro de minociclina (Sigma, EE.UU.)
en solución salina, una vez por día durante 2 semanas y el otro grupo, fue tratado en forma
análoga con el mismo volumen de vehículo (solución salina). La dosis, vía y esquema de
administración seleccionados se basó en trabajos de otros autores (Guasti y col., 2009). Los
animales se sacrificaron luego de dos semanas de tratamiento.
En todos los procedimientos se respetaron estrictamente las Guías para el Cuidado y Uso
de Animales de Laboratorio de la Association for Research in Vision and Ophthalmology
(ARVO).
2. Determinación de la presión intraocular
La PIO se determinó mediante un TonoPen XL (Figura 14) (Mentor, Norwell, MA,
EE.UU.) en ratas conscientes, según la técnica descripta por Moore y col. (1995). Los animales
se envolvieron suavemente con una toalla, sin provocar estasis venosa ni efectos valsalva, y
mientras un operador lo mantenía firme, otro realizaba la determinación. Se obtuvieron cinco
lecturas de cada ojo, omitiendo las que se registraban cuando el aparato no estaba en contacto
firme con la córnea. La variación entre lecturas resultó menor al 10%. Los promedios de estas
lecturas se registraron como la PIO de un ojo y un día determinados. La PIO de cada animal se
promedió con las del resto de los animales del mismo grupo y el valor promedio resultante se
registró como la PIO media ± error estándar (EE). No se observaron diferencias significativas
entre el ojo derecho y el ojo izquierdo en animales intactos o inyectados con vehículo. Las
mediciones de la PIO se realizaron a la misma hora cada día o semana (entre las 11.00 h y las
12.00 h), para evitar las variaciones diarias en este parámetro.
52
Materiales y Métodos
Figura 14. Determinación de la PIO en ratas.
3. Función de la retina y la vía visual
3.1. Electrorretinografía escotópica. Los animales se adaptaron a oscuridad por 6 h y luego se
anestesiaron, como ya se describió. Se utilizó hidrocloruro de fenilefrina al 2,5% y tropicamida
al 1% (Laboratorios Alcon, Argentina) para dilatar la pupila y se administró solución salina
(Laboratorios Alcon, Argentina) en forma continua sobre la córnea, para mantener un registro
estable y prevenir una queratopatía. Los animales se colocaron a 20 cm de la fuente luminosa.
Todos los registros se realizaron dentro de los 20 min luego de la inducción de la anestesia y se
mantuvo constante la temperatura corporal usando una manta térmica. Se usó un electrodo de
referencia en la oreja (ipsilateral), un electrodo de tierra en la porción media de la cola y un
electrodo de oro en el centro de la córnea. Para la correcta implantación de los electrodos se
utilizó una luz roja de 15 W, que no afectó la adaptación de los animales a la oscuridad. Los
electrorretinogramas (ERGs) de ambos ojos se registraron simultáneamente y en completa
oscuridad. Para ello, se aplicaron 20 pulsos de luz blanca sin atenuación (5 ms, 0,2 Hz)
generados por un estimulador fótico de diodos aplicados con una intensidad máxima de 9 cd
s/m2. Los registros se amplificaron utilizando un equipo Akonic BIO-PC (Akonic, Argentina).
La señal se registró con una ganancia de 100 V, sin atenuación, con filtros de ruido de baja (1,5
Hz) y de alta (1000 Hz) frecuencia para optimizar el registro. Se determinó la amplitud (en V)
de la onda a, como la diferencia en amplitud entre la línea isoeléctrica y el pico negativo, y la
53
Materiales y Métodos
amplitud de la onda b, como la diferencia entre el pico de la onda a y el pico positivo de la onda
b (Figura 15A). Se determinaron las latencias de cada onda. La respuesta electrorretinográfica se
obtuvo como el promedio de los valores de cada corrida. Se realizaron tres estímulos, con un
intervalo de 5 min.
3.2. Potenciales oscilatorios. Los potenciales oscilatorios (POs) se registraron utilizando el
mismo estimulador fótico (5 ms, 0,2 Hz), con filtros de baja (100 Hz) y alta frecuencia (300 Hz).
La amplitud de los POs se calculó como el punto de máxima amplitud de cada pico en relación
a la línea de base (Figura 15B). El resultado obtenido de la suma de los tres picos de los POs se
utilizó para el análisis estadístico.
Figura15. Determinación de la función retiniana. Panel A: Se muestra un registro de ERG escotópico
característico y el método utilizado para evaluar la amplitud y latencia de las ondas a y b. Panel B: Se
muestra un registro de los POs, y se señalan los picos P1, P2 y P3.
3.3. Potenciales visuales evocados (VEPs). Para el registro de los VEPs se colocaron
quirúrgicamente dos electrodos de acero inoxidable 4 mm lateral a la cisura inter-hemisférica y
5,6 mm por detrás de bregma (electrodo activo). Se colocaron electrodos de referencia en
posición 2 mm lateral a la línea media y 2 mm antes de bregma, y un electrodo de tierra en la
cola. Ambos electrodos se aislaron y fijaron con acrílico dental, y la piel se suturó con nylon 5/0.
Los VEPs se registraron 5 días después de la implantación de los electrodos de la siguiente
54
Materiales y Métodos
manera: luego de 6 h de adaptación a la oscuridad, las ratas se anestesiaron, las pupilas se
dilataron y la córnea se irrigó de forma intermitente como ya se describió, bajo luz roja tenue.
Cada ojo se registró individualmente, para lo cual se ocluyó el ojo contralateral, y se registró un
promedio de 70 estímulos. Los ojos se estimularon con luz blanca sin atenuar (1 Hz) con un
estimulador fótico (diodos emisores de luz), fijado a la máxima intensidad de luz y los registros
se amplificaron, filtraron (0,5 Hz filtro de baja frecuencia, 100 Hz filtro de alta frecuencia) y
promediaron. Se evaluaron las amplitudes entre el pico P1 y la deflexión N2 (componente P1N2) y la deflexión N2 y el pico P2 (componente N2-P2), y desde el inicio de los registros se
determinaron las latencias de P1, N2 y P2 (Figura 16).
Figura 16. Determinación de la función de la vía visual. Se muestra un registro de VEPs y el método
utilizado para evaluar la amplitud de cada componente (P1-N2 y N2-P2) y latencias de P1, N2 y P2.
4. Evaluación del reflejo pupilar
Los animales se adaptaron a la oscuridad por 1 h. Se aplicó un pulso de luz blanca de
baja intensidad (120 lux) en un ojo y se registró la contracción de la pupila en el ojo
contralateral. Luego se re-adaptaron los animales a oscuridad por 1 h y se evaluó el reflejo
pupilar consensual frente a un estímulo de luz blanca de alta intensidad (1200 lux). Los registros
se realizaron bajo luz infrarroja con una cámara de video digital (Sony DCR-SR60, Japón). Se
determinó el diámetro de la pupila antes y 30 s después de aplicar el pulso de luz. La velocidad
de muestreo fue de 30 imágenes/s. Se adquirieron las imágenes a partir de la grabación de video
55
Materiales y Métodos
digital utilizando el programa OSS Video Decompiler Software (One Stop Soft, EE.UU.). El
porcentaje de contracción de la pupila se calculó como el porcentaje del área de la pupila a los
30 s del inicio del pulso (estado estacionario) en relación con el tamaño de la pupila dilatada.
Los datos obtenidos de 10 animales por grupo se promediaron y la media se utilizó como el
valor representativo de cada grupo.
5. Procesamiento histológico
Bajo anestesia profunda, los animales se perfundieron con ~ 250 ml de solución
fisiológica, seguida de ~ 300 ml de solución fijadora (paraformaldehído al 4% en buffer fosfato
(PBS) 0,1 M, pH 7,4). Se disecó cuidadosamente el globo ocular con la porción intraorbital del
nervio óptico (NO) proximal y el cerebro. Las muestras se post-fijaron en la misma solución
fijadora durante toda la noche. Los ojos se procesaron como se describirá posteriormente, y se
obtuvieron cortes transversales en parafina de la retina para el análisis morfométrico (espesor
total y de las capas retinianas y número de CGRs) y estudios de inmunomarcación y cortes
transversales del NO para inmunofluorescencia. Los cerebros se cortaron transversalmente (~ 2
mm por encima del quiasma óptico) y se procesaron para la obtención de cortes por congelación
(cortes coronales) de los distintos núcleos de proyección retiniana.
5.1. Secciones semifinas. Bajo anestesia profunda, se expuso el corazón de los animales y se
inyectó intracardiacamente 0,5 ml de heparina (como anticoagulante) y 0,5 ml de nitroprusiato
de sodio al 2,4% (como vasodilatador). Los animales se perfundieron con ~ 200 ml de solución
fisiológica seguida de ~ 300 ml de glutaraldehído al 2% y paraformaldehído al 4% en PBS. Se
disecó cuidadosamente el globo ocular y la porción proximal del NO y el cerebro a la altura del
colículo superior (CS) y se procesaron para la obtención de muestras semifinas. Luego de varios
lavados con PBS, las muestras se post-fijaron durante 1 h en OsO4 al 1% en el mismo buffer.
Posteriormente, se realizaron varios lavados, las muestras se deshidrataron mediante series
crecientes de etanol, se aclararon en acetona y se incluyeron en araldita. Se obtuvieron secciones
56
Materiales y Métodos
transversales semifinas (0,5 m) del NO y parasagitales del CS mediante el uso de navajas de
vidrio y un ultramicrótomo Ultracut E (Reichert-Jung, Austria), que se colorearon con azul de
toluidina-bórax (Bancroft y Stevens, 1990).
5.2. Obtención de cortes en parafina. Luego de varios lavados, las muestras se deshidrataron
(serie creciente de alcohol: 70%, 96%, 100%), se aclararon en acetato de n-butilo y se
embebieron en parafina. Se obtuvieron secciones a lo largo del eje sagital del ojo, manteniendo
la membrana nictitante para facilitar su posterior orientación y secciones transversales del NO
proximal. Los cortes se utilizaron para el análisis histológico y/o morfométrico,
inmunohistoquímica, inmunofluorescencia y análisis de TUNEL (terminal deoxynucleotidyl
transferase dUTP nick end labeling). Todos los cortes se montaron sobre portaobjetos con carga
electrostática (Superfrost Plus Esco, EE.UU.).
5.3. Cortes por congelación. Las muestras se sumergieron en soluciones crecientes de sacarosa
(10%, 20% y 30%), y se armó un taco con solución criopreservante (Cryoblock, O.C.T,
EE.UU.). En un crióstato CM 1850 (Leica, Alemania) se realizaron secciones coronales seriadas
de 30 m a nivel de los NSQ, que se montaron en portaobjetos con carga electrostática. A nivel
del NGL, el NPO y el CS, se realizaron cortes coronales seriados y alternados de 40 m, de los
cuales el primero se descartó, el segundo se montó en portaobjetos cargados y el tercero se criopreservó en PBS y glicerol (1:1) a -20° C, para la realización de estudios de inmunomarcación
en cortes flotantes de cerebro para aquellos antígenos que requirieron una mayor penetración de
los anticuerpos. Para obtener cortes de retinas por congelación se realizaron dos pasos
adicionales: se extrajo la córnea y el cristalino antes del pasaje a sacarosa al 10% y previo al
armado del taco con solución criopreservante, se adsorbió con un papel de filtro el remanente de
sacarosa al 30% junto con el vítreo. Luego, los ojos se seccionaron sagitalmente para obtener
retinas en corte transversal junto con la cabeza del NO y la porción proximal del NO en corte
longitudinal de 15 m de espesor.
57
Materiales y Métodos
6. Microscopía electrónica
6.1. Análisis ultraestructural del nervio óptico. Se evaluó la ultraestructura de secciones
transversales de la región proximal del NO. Se realizaron secciones ultrafinas (70 nm) mediante
el uso de navajas de vidrio y un ultramicrótomo Ultracut E (Reichert-Jung, Austria). Las
secciones se montaron sobre grillas de 200 Mesh y se tiñeron con acetato de uranilo (2% en
etanol al 70%) y con citrato de plomo de Reynolds. Las secciones se analizaron en un
microscopio electrónico de transmisión Zeiss 109T (Zeiss, Alemania), equipado con una cámara
digital Gatan ES1000W, en el Laboratorio Nacional de Investigación y Servicio de Microscopía
Electrónica (LANAIS-MIE, CONICET-UBA, Buenos Aires, Argentina).
6.2. Análisis ultraestructural del colículo superior. Se utilizó un slicer de cerebro para ratas
de 200 - 300 g (# catálogo: NP 62-0047, Harvard Apparatus, EE.UU.) para obtener secciones
coronales de cerebro a la altura del CS de 1 mm de espesor. Se disecaron ambos CS tomando la
capa SGI como borde ventral y se orientaron las muestras mediante una muesca realizada en la
porción medial del CS. Posteriormente, se realizaron secciones ultrafinas parasagitales de la
porción lateral del CS como se muestra en la Figura 17, a fin de obtener cortes transversales de
los axones de las CGRs que ingresan a este nivel desde el tracto óptico (TO). A continuación, el
procedimiento utilizado fue esencialmente similar al que se describió para el NO.
Figura 17. Procesamiento del CS para microscopía electrónica. La figura de la izquierda esquematiza la
entrada de las fibras del tracto óptico (TO) al CS. La imagen central muestra un esquema del CS en corte
coronal y el plano de corte parasagital. La imagen de la derecha representa el plano parasagital con la
porción del CS lateral seccionada, indicada en verde. CSS: CS superficial, SO: Stratum opticum, D:
dorsal, L: lateral, C: caudal, y R: rostral.
58
Materiales y Métodos
7. Análisis de células TUNEL(+)
Para la detección de células apoptóticas, se utilizó el kit de detección in situ ApopTag
(S7110, Chemicon-Millipore, EE.UU.), según las especificaciones del fabricante. En cortes de
retina (a la altura de la cabeza del NO) se cuantificó el número de células TUNEL(+) por
sección. Los resultados obtenidos de 4 secciones separadas se promediaron y el valor promedio
de 5 animales se consideró representativo de cada grupo.
8. Análisis de inmunomarcación y detección con isolectina Griffonia simplicifolia I
Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios:
Anticuerpo
Brn3a
ED1 (CD68)
GFAP
Antígeno
Factor de transcripción neuronal
Glicoproteína de superficie y de vesículas
fagocíticas (microglía activada, macrófagos,
neutrófilos y basófilos).
Proteína glial fibrilar ácida (astrocitos y células
de Müller reactivas).
Especie y tipo
Dilución
Empresa
Cabra, policlonal
1:500
Santa Cruz,
EE.UU.
Ratón, monoclonal
1:200
Abcam, EE.UU.
Ratón, monoclonal
1:1200
Sigma, EE.UU.
(conjugado-Cy3)
Conejo,
monoclonal
1:200
Cell Signaling,
EE.UU.
Iba-1
Proteína adaptadora de unión a calcio ionizado1 (microglía y macrófagos).
Cabra, policlonal
1:500
Abcam, EE.UU.
MBP
Proteína básica de mielina (oligodendrocitos
mielinizantes maduros).
Conejo, policlonal
1:400
*
Fotopigmento de las CGRsm.
Conejo, policlonal
1:750
Affinity
Bioreagent,
EE.UU.
Pollo
1:150
*
Neuromics,
EE.UU.
Proteína nuclear específica de neuronas.
Ratón, monoclonal
IgG
1:200
Millipore,
EE.UU.
Cadena pesada de neurofilamento
extensivamente fosforilado (axones maduros).
Ratón, monoclonal
1:1000
Abcam, EE.UU.
Conejo
1:200
*
Ratón, policlonal
IgM
1:50
*
Cobayo, policlonal
1:4000
Millipore,
EE.UU.
Melanopsina
Nestina
NeuN
pNF-H
(SMI-310)
NG2
O1 (GalC)
VgluT2
Filamento intermedio característico de
progenitores neurales durante el desarrollo. En
el adulto, puede re-expresarse en condiciones de
daño del SNC.
Proteoglicano condroitín sulfato - 4
(polidendrocitos, entre las que se encuentran
células precursoras de oligodendrocitos y
oligodendrocitos premielinizantes).
Marcador de oligodendrocitos – 1 o
Galactocererebrósido (oligodendrocitos
mielinizantes).
Transportador vesicular de glutamato - 2
característico de terminales axónicas de CGRs.
59
Materiales y Métodos
Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios:
Anticuerpo 2rio
Especie
Dilución
Empresa
Conjugado
Anti-cabra
Burro
1:500
Life Technologies, EE.UU.
Alexa Fluor 568
Anti-cobayo
Cabra
1/500
Life Technologies, EE.UU.
Alexa Fluor 568
Anti-conejo
Burro
1:500
Abcam, EE.UU.
Alexa Fluor 488
Anti-conejo
Burro
1:500
Abcam, EE.UU.
Alexa Fluor 568
Anti-conejo
Cabra
1:500
Life Technologies, EE.UU.
Alexa Fluor 568
Anti-conejo
Cabra
1:500
Molecular Probes, EE.UU.
Alexa Fluor 488
Anti-pollo
Cabra
1:100
*
Alexa Fluor 488
Anti-pollo
Cabra
1:200
*
Conjugado-Cy3
Anti-ratón
Burro
1:500
Abcam, EE.UU.
Alexa Fluor 568
Anti-ratón
Burro
1:500
Abcam, EE.UU.
Alexa Fluor 488
Anti-ratón
Cabra
1:500
Molecular Probes, EE.UU.
Alexa Fluor 568
Anti-ratón
Cabra
1:500
Life Technologies, EE.UU.
Alexa Fluor 488
Anti-ratón
Burro
1:100
Jackson, EE.UU.
Alexa Fluor 647-9
* Los anticuerpos anti-MBP, anti-nestina, anti-NG2, anti-O1 y anti-pollo fueron generosamente donados
por la Dra. Laura A. Pasquini del Instituto de Química y Fisicoquímica Biológica (IQUIFIB),
Departamento de Química Biológica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA/CONICET, Argentina.
Las secciones incluidas en parafina se trataron con xilol, serie decreciente de alcohol
(rehidratación) y PBS. Las secciones obtenidas en crióstato se lavaron varias veces con PBS para
quitar el remanente de glicerol. Para secciones montadas en portaobjetos, excepto
especificaciones del anticuerpo, se realizó una recuperación antigénica en 50 ml de buffer citrato
(pH 6,3) a 80ºC durante 40 min. Para los cortes flotantes de cerebro, la recuperación antigénica
se realizó en tubos eppendorf con 1 ml de buffer citrato a 80ºC por 20 min en un bloque seco con
agitación (300 rpm). En ambos casos, la recuperación fue seguida de una permeabilización con
0,1% Tritón X-100 en PBS por 20 minutos. Las secciones se incubaron con suero de caballo
normal al 2% por 60 min para disminuir la unión inespecífica. Para cada tratamiento se
realizaron controles negativos sin el agregado del anticuerpo primario.
8.1. Inmunoflourescencia. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante toda
la noche a 4˚C. Luego de varios lavados, se agregaron los anticuerpos secundarios por β h a
temperatura ambiente. Finalmente, las secciones se marcaron con 4',6-diamidino-2-fenilindol
60
Materiales y Métodos
(DAPI, 0,5 g/ml en solución fisiológica) o Hoechst 33342 (5 g/ml en solución fisiológica) por
10 min y se montaron con medio de montaje para fluorescencia (Vectashield; Vector
Laboratories, EE.UU.). Se utilizó un microscopio de fluorescencia BX50 (Olympus, EE.UU.)
conectado a una cámara para microscopía 3CCD (Sony, EE.UU.). Las imágenes se obtuvieron
con el software ImagePro Plus (Media Cybernetics, EE.UU.).
8.2. Inmunohistoquímica y detección con isolectina Griffonia simplicifolia I (GSA). Se
realizó el bloqueo de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 0,3% en PBS durante
20 min. Luego de varios lavados con PBS, las secciones se incubaron con los anticuerpos
primarios durante toda la noche (excepto con el anticuerpo anti-melanopsina (48 h)) a 4˚C. Para
la detección de células microgliales, las secciones se incubaron por 48 h a 4°C con la isolectina
GSA (Isolectina B4, 1:200; Vector laboratorios, EE.UU.) acoplada a biotina. La
inmunorreactividad se reveló utilizando el complejo biotina-estreptavidina-peroxidasa del kit
LSAB2 System-HRP (Dako, EE.UU.). La reacción de diaminobenzidina se acentuó
posteriormente con un tratamiento con cloruro de cobalto al 0,5% por 15 minutos. Los cortes se
observaron y analizaron con un microscopio Eclipse E400 (Nikon, EE.UU.) conectado a una
cámara Coolpix s10 (Nikon, EE.UU.).
8.2.1. Inmunomarcación en retinas en montaje plano. Los animales se perfundieron como ya
se describió; se disecaron cuidadosamente los ojos y se post-fijaron en la misma solución por 30
min a 4°C. Se aislaron cuidadosamente las retinas y se realizaron marcas en los cuatro
cuadrantes, que permitieron su posterior orientación. Se realizó la inmunomarcación con
anticuerpos primarios como ya se mencionó, en retinas flotantes previa permeabilización con
Tritón X-100 en PBS por 30 min. Finalmente, se montaron en portaobjetos cargados (con la capa
de fibras del NO hacia arriba).
61
Materiales y Métodos
9. Coloración de lípidos por Red Oil
Se utilizaron cortes coronales del CS obtenidos en crióstato (40m de espesor) montados
en portaobjetos cargados. Los cortes se hidrataron con soluciones decrecientes de etanol (96º y
70º, 2 min cada uno) y con agua destilada (30 s). Se preparó una solución de Red Oil al 0,5 %
(m/v, Santa Cruz, EE.UU.) en isopropanol con una semana de anticipación para que decanten los
cristales y se utilizó el sobrenadante. Los cortes se incubaron en solución de Red Oil durante 15
min, y se lavó el exceso de colorante con agua destilada. Los cortes se montaron con medio de
montaje gelvatol.
10. Procesamiento de imágenes y cuantificación
Todas las imágenes obtenidas se ensamblaron y procesaron con Photoshop CS4 (Adobe
Systems, EE.UU.). Sólo se realizaron ajustes de brillo y contraste. Para todas las evaluaciones
morfométricas, las imágenes capturadas en formato TIFF se analizaron con el software ImageJ
(NIH, EE.UU.). Toda la nomenclatura usada corresponde al atlas de Paxinos y Watson (1997).
Para todos los estudios de inmunofluorescencia, se obtuvieron imágenes digitales en formato
TIFF grabadas con igual tiempo de exposición, brillo y contraste.
10.1. Análisis de la retina
10.1.1. Evaluación morfométrica de cortes transversales de retina. Se obtuvieron
microfotografías a una distancia aproximada de 1 mm del NO (región dorsal y ventral) con un
aumento final de 400x. Se determinó el espesor total de la retina y de cada una de sus capas y se
cuantificó el número de células presentes en la CCG (conteo lineal). Los resultados se
expresaron como número de células en 100 m, 200 m o a lo largo de toda la sección, en
secciones coloreadas con hematoxilina-eosina, y cada 100 m para la detección fluorescente de
células Brn3a(+) o TUNEL(+), respectivamente. Para cada ojo se promediaron los resultados
obtenidos de 4 cortes y la media de 5 ojos por grupo se consideró el valor representativo para
cada grupo.
62
Materiales y Métodos
10.1.2. Cuantificación de células ganglionares en retinas en montaje plano. Se calculó el área
total de la retina en montaje plano y se dividió en 4 cuadrantes. Se tomaron microfotografías de
5 sectores por cuadrante con una magnificación final de 200x. Las imágenes (área
correspondiente a 0,1 mm2) de 5 sectores por cuadrante se convirtieron a escala de grises de 8bits y se cuantificó el número de células Brn3a(+) como se muestra en la Figura 18, que se
expresó como número de células por área. Los resultados de 20 sectores por retina se
promediaron y la media de 5 retinas se consideró representativa para cada grupo. El resultado
final se expresó como el número de células en un área de 2 mm2.
Figura 18. Cuantificación del número de CGR con el programa ImageJ. Se calculó el área retiniana total,
se dividió a la retina en 4 cuadrantes y se escogieron 5 sectores por cuadrante (Panel A). Se obtuvieron
microfotografías, se convirtieron a escala de grises (Panel B) y, finalmente a modo binario para
cuantificar el número de células por sector (Panel C).
10.1.3. Cuantificación de CGRs melanopsina(+) (CGRsm). Se obtuvieron microfotografías de
las retinas en montaje plano a bajo aumento (40x) y se reconstruyeron en su totalidad. Se
marcaron manualmente las CGRsm y se construyó una máscara de cuantificación que se procesó
con el software ImageJ para cuantificar el número total de células por retina, como se muestra en
la Figura 19. El resultado obtenido para 5 retinas se promedió y la media se consideró
representativa para cada grupo.
63
Materiales y Métodos
Figura 19. Cuantificación del número de CGRsm con el programa ImageJ. Panel A: Se muestra la
reconstrucción de la retina en montaje plano. Panel B: Se muestra la máscara de cuantificación en la que
se delimitaron los bordes de la retina y se marcaron manualmente las células melanopsina(+). Panel C: Se
muestra la cuantificación del número total de CGRsm con el software ImageJ.
10.2. Análisis del nervio óptico.
10.2.1. Determinación del número y área axonal. En secciones transversales semifinas se
calculó el área total del NO a partir de microfotografías obtenidas con un aumento de 200x. Se
tomaron microfotografías (área de 0,01 mm2) con una magnificación de 1000x. El área total de
cuantificación para cada muestra fue de 0,05 mm2, que representó el 25% del área total del NO.
Las imágenes se convirtieron a escala de grises de 8-bits, se aplicó un valor umbral a todas las
imágenes, determinado inicialmente por examinación visual y finalmente se convirtieron a modo
binario. Las fibras mielínicas se delimitaron digitalmente por el margen interno de la vaina de
mielina. Se cuantificó el número y el área de axones por imagen (Figura 20). Para cada NO se
promediaron los resultados obtenidos de 5 secciones y la media obtenida de 5 nervios se
consideró el valor representativo para cada grupo. Por otra parte, se realizaron histogramas de
distribución de tamaño de fibras, utilizando el complemento de Análisis de Datos del programa
Excel (Microsoft Office 2010, EE.UU.).
64
Materiales y Métodos
Figura 20. Cuantificación del número y área de axones mielínicos con el programa ImageJ. Panel A: Se
muestra una microfotografía representativa de la porción proximal del NO en corte transversal de un
animal control. Panel B: Se muestra la misma imagen que en (A) luego de aplicar un valor umbral de
corte en la escala de grises y de convertirla a modo binario, donde al área axonal quedó delimitada por el
borde interior de la vaina de mielina. Panel C: Se muestra la cuantificación de los axones (número total y
área individual) limitando el rango de tamaño, para excluir procesos gliales y vasos sanguíneos.
10.2.2. Distribución de frecuencias del número de líneas intraperiódicas. Por microscopía
electrónica de transmisión (MET) se tomaron microfotografías con una magnificación de 50.000x
de secciones ultrafinas del NO proximal. Se tomaron un total de 10 imágenes en las que se
cuantificaron las líneas intraperiódicas (Li) de las vainas de mielina de axones de distinto calibre.
Se cuantificaron manualmente las Li de aproximadamente 100 axones por NO. Sólo se tuvieron
en cuenta a aquellos axones en apariencia normal o levemente degenerados. Los axones
degenerados sin axoplasma o con mielina completamente descompactada fueron excluidos.
Mediante el complemento de Análisis de Datos del programa Excel se obtuvo la frecuencia de
axones para cada rango de clase, distribuidos en rangos de cada tres líneas intraperiódicas.
10.3. Determinación del área inmunorreactiva en la retina y el NO. En cortes transversales de
retina inmunomarcados contra los antígenos Iba-1 y ED1 y en cortes transversales de NOs
inmunomarcados contra Iba-1, ED1, GFAP y pNF-H se tomaron microfotografías con un
aumento final de 400x y 200x, respectivamente. Las imágenes se reconstruyeron por Photoshop
y de cada una se obtuvieron 4 secciones de 200 x 200 m2 para las retinas o de 100 x 100 m2
para los NOs. Con el programa ImageJ se determinó manualmente un umbral en colores (RGB),
65
Materiales y Métodos
que se aplicó a todas las imágenes, y se cuantificó el número y área inmunorreactiva para cada
antígeno/sección. Para cada retina se promediaron los resultados obtenidos de 3 cortes (4
secciones/corte) consecutivos y la media obtenida de 4 - 5 retinas o nervios se consideró el valor
representativo para cada grupo.
10.4. Análisis del colículo superior
10.4.1. Cuantificación del área inmunomarcada por GFAP y VgluT-2. Para cada sección, se
delimitó y se calculó el área correspondiente a la región total marcada. Luego se convirtieron las
imágenes digitales a escala de grises de 8-bits y se calculó la densidad óptica para la marca de
GFAP (Cy3) o VgluT-2 (Alexa Fluor 568), que se relativizó al área total (Figura 21). En el caso
de GFAP, debido a la presencia de astrocitos perivasculares, el área relativizada se normalizó al
lado contralateral, que recibió aferencias de un ojo intacto o inyectado con vehículo, según el
caso. Se analizaron 5 animales por grupo.
Figura 21. Determinación del área fluorescente. Panel A: Se muestra una microfotografía representativa
de una sección coronal del CS de un animal control donde se observa la marca inmunofluorescente (CTB
en este ejemplo) en las capas superficiales. Panel B: Se muestra la delimitación del área total retinoreceptiva a la que se relativizó la densidad óptica del panel A.
10.4.2. Cuantificación de la inmunorreactividad para Iba-1 y el número de células Iba-1(+).
Se tomaron dos fotografías (400x) de los sectores mediales, medio-laterales y laterales del CS,
como se muestra en la Figura 22A. Se convirtieron las imágenes digitales a escala de grises de 8bits, se aplicó un valor umbral a todas las imágenes y finalmente se convirtieron a modo binario.
Se limitó el área celular entre 500-1600 px2 y se analizó el número de células Iba-1(+), la
66
Materiales y Métodos
intensidad de marca de Iba-1/célula y el % del área inmunorreactiva en 98574 m2 (Figura 22).
Se analizaron dos secciones por animal y 6 animales por grupo. Para cada uno de los parámetros,
se promediaron los valores obtenidos en cada sector, obteniéndose un valor final para cada grupo
experimental.
Lateral
Medial
Lateral
Figura 22. Análisis de la inmunorreactividad para Iba-1 en el CS. Panel A: Se muestra una
microfotografía representativa de la marca para Iba-1 y la delimitación de los sectores analizados. Panel
B: Se muestra un detalle a 400X de uno de los sectores y las células Iba-1(+). Panel C: Se muestra la
misma imagen del panel B convertida en escala de grises y binarizada, sobre la que se determinó el
número de células Iba1(+), la inmunorreactividad por célula y el % del área inmunorreactiva con el
programa Image J.
10.4.3. Cuantificación de la marca de Red Oil, O1 y pNF-H. Se tomaron fotografías a 100x y
se reconstruyó el CS manualmente con el programa Photoshop. Se seleccionaron sectores de
0,04 mm2 de las capas Stratum Opticum (SO) y Stratum Griseum Intermediale (SGI) en la
porción medial, medio-lateral y lateral del CS y se guardaron las imágenes en formato TIFF.
Con el programa ImageJ se determinó manualmente un umbral en RGB, que se aplicó a todas las
imágenes, que se analizaron como se explicó anteriormente. Se utilizó la fracción de área
marcada, en porcentaje del área total, para expresar el área inmunopositiva para O1, pNF-H o el
contenido de lípidos marcado con Red Oil en 0,04 mm2. El procedimiento descripto se repitió en
dos cortes coronales de CS por animal y se promediaron los datos de 6 u 8 animales por grupo.
10.4.4. Análisis por microscopía confocal. Las muestras se procesaron como se describió en el
punto 8.1. Se utilizó un microscopio confocal Eclipse E800 (Nikon, EE.UU.).
67
Materiales y Métodos
10.4.4a. Cuantificación del número de células NeuN(+). Se obtuvieron imágenes confocales
con un aumento final de 400x de la porción medial y lateral del CS. Se obtuvieron 10 planos
focales de 1 m de espesor y con el programa IMARIS® 6.2.1 (Bitplane) se realizó una
reconstrucción tridimensional en dos planos (z-stacks) de las imágenes. A continuación, con el
programa ImageJ se convirtieron las imágenes a escala de grises de 8-bits, se aplicó un valor
umbral a todas las imágenes y finalmente se convirtieron a modo binario. Se realizó un análisis
preliminar de las células NeuN(+) y se analizó su distribución. En función de estos resultados, se
determinó el límite inferior y superior para el tamaño del soma neuronal, de modo de excluir a
neuritas aisladas o somas yuxtapuestos, respectivamente. Se realizó el recuento de células
NeuN(+) y de observarse somas yuxtapuestos (> a 125 m2), el valor se corrigió manualmente.
El procedimiento descripto se repitió en dos cortes coronales de CS por animal y los datos de 5
animales por grupo se promediaron.
10.4.4b. Análisis de la complejidad celular por IMARIS. Se realizó un análisis detallado de la
morfología microglial, astroglial y de polidendrocitos (células NG2(+)) en el CS medial y
lateral, a partir de cortes inmunomarcados para Iba-1, GFAP o NG2, respectivamente. Para ello,
se realizó una reconstrucción tridimensional a partir de un barrido de imágenes confocales de 0,5
m de espesor con un paso óptico de 95 m, con el fin de incluir las prolongaciones
características de la glía. La adquisición de cada una de estas imágenes llevó aproximadamente
20 min, por lo que se obtuvo únicamente una imagen de cada sector por animal. Con la opción
surpass del programa IMARIS, previo ajuste manual de los puntos iniciales y finales de los
filamentos, se realizó un análisis automático (calidad del 75%) de largo, área y volumen, así
como del número de puntos de ramificación, cantidad de filamentos y puntos terminales de los
procesos gliales. El programa arrojó un archivo en formato Excel con la cuantificación de todos
los parámetros, que se utilizó para el análisis estadístico. Cada imagen se analizó por triplicado
para reducir el error de la cuantificación y verificar la reproducibilidad de las determinaciones.
68
Materiales y Métodos
Por otro lado, se tomaron imágenes de los filamentos reconstruidos a partir de la señal
inmunofluorescente y se superpusieron con éstas para corroborar el análisis, como se observa en
la Figura 23. Se analizaron 6 animales por grupo.
Figura 23. Análisis de la complejidad glial. La microscopía confocal, que suprime luz fuera de foco,
permitió obtener imágenes más nítidas que la microscopía de fluorescencia convencional y reconstruir la
morfología compleja de células microgliales, astrocitos y polidendrocitos (Panel A). El análisis
cuantitativo se realizó con el programa IMARIS que reconstruyó los filamentos (Panel B), a partir de la
fluorescencia de las imágenes. En el Panel C, se muestra la superposición de (A) y (B).
11. Transporte de la subunidad  de la toxina colérica (CTB)
11.1. Inyección intravítrea de CTB. Los animales se anestesiaron y se administró una gota de
proparacaína en cada ojo, como anestésico local. La inyección intravítrea se realizó utilizando
una jeringa Hamilton de 10 l con una aguja 30G, bajo un microscopio binocular de cirugía con
luz coaxial. Con la ayuda de una pinza fina se sujetó el ojo y se introdujo la aguja a ~ 1 mm del
limbo esclerocorneal, a través de la pars plana, en un ángulo tal que evitara lesionar el cristalino.
Se descargó lentamente el contenido de la solución y se dejó la aguja por 30 s a fin de evitar la
pérdida de líquido de la cámara vítrea. Una vez completado el procedimiento, se realizó la
inyección intravítrea en el ojo contralateral. Se inyectaron 4 l de una solución 0,1% (en
solución fisiológica) de CTB conjugada con el flouróforo Alexa 488 ó Alexa 594 (Molecular
Probes, EE.UU.). Luego de la inyección, se evaluó la PIO a distintos intervalos y se observó que
en ningún caso este procedimiento provocó aumento de este parámetro (datos no mostrados). Se
69
Materiales y Métodos
excluyeron los animales que desarrollaron cataratas o sangrado intraocular como resultado de la
inyección intravítrea.
11.2. Análisis del transporte de CTB. Luego de 3 días de la inyección de CTB, los animales se
perfundieron, se disecaron cuidadosamente los cerebros y se post-fijaron durante toda la noche.
Se realizaron cortes coronales seriados por congelación como se especificó en el punto 5.3. Los
cortes se colorearon con DAPI y luego de varios lavados se montaron con medio de montaje
para fluorescencia. Se tomaron imágenes de los NSQ, el NGL, el NPO y el CS y se
compaginaron para obtener una reconstrucción completa en el plano rostro-caudal. De estas
últimas, a excepción del CS, sólo se utilizaron las imágenes en las que las estructuras
presentaron su mayor extensión. Además, se fotografiaron las retinas y NOs de los ojos
inyectados con CTB para corroborar la captación de la toxina por las CGRs y analizar el
transporte en cortes longitudinales del NO proximal, respectivamente. La marca de CTB del NO
se determinó con el programa ImageJ en un rectángulo de 50 m de espesor y 2 mm de longitud
desde la retina. Los valores se relativizaron al máximo de marca de CTB de NOs control.
12. Western blot
Los animales se sacrificaron y se extrajeron las retinas. Cada retina se homogeneizó en
100 l de buffer 10 mM de HEPES, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 10 mM de KCl, 0,5% de
Tritón (v/v) pH 7,9, con el agregado de un cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas
(Sigma, EE.UU.). Luego de 15 min a 4°C, los homogenatos se agitaron por 15 s y se
centrifugaron a 3.000 g por 10 min. Los sobrenadantes se utilizaron para la determinación de la
concentración de proteínas. Las proteínas (100 µg/muestra) se separaron por SDS-PAGE en un
gel de poliacrilamida al 10 - 15 %. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a
membranas de difluoruro de polivinilideno durante 60 min a 15 V en un sistema Bio-Rad TransBlot SD (Bio-Rad Laboratories, EE.UU.). Las membranas se bloquearon con 5% de leche en
polvo descremada en buffer Tris (pH 7,4), conteniendo 0,1% de Tween-20 durante 60 min a
70
Materiales y Métodos
temperatura ambiente. Las membranas se incubaron a 4C con los siguientes anticuerpos
primarios: anticuerpo policlonal de conejo anti-melanopsina (1:1000, Affinity Bioreagent,
EE.UU.) por 48 h, anticuerpo policlonal de cabra anti-Brn3a (1:200, Santa Cruz Biotechnology,
EE.UU.) por 48 h y anticuerpo policlonal de conejo anti-MBP (1:5000) por 24 h. Las
membranas se lavaron con buffer Tris (pH 7,4) conteniendo 0,1% de Tween-20 y se incubaron
durante 2 h con un anticuerpo secundario anti-conejo (1:2000, Bio-Rad) o anti-cabra (1:2000;
Bio-Rad) acoplado a peroxidasa. Las bandas se visualizaron por quimioluminiscencia (Western
Blotting Analysis System; Amersham Biosciences, Argentina) y se determinaron los niveles de
-actina (anticuerpo policlonal de conejo anti- -actina, 1:2000, Sigma, EE.UU.) como control
interno de carga. Las membranas se escanearon y la intensidad de las bandas se determinó
utilizando el programa ImageJ. Los valores se expresaron como unidades arbitrarias respecto a
los niveles de -actina.
La concentración de proteínas se determinó por el método de Lowry y col. (1951),
utilizando albúmina bovina como estándar.
13. Análisis estadístico
Para el análisis estadístico de los resultados se utilizaron el test de Student para la
comparación entre dos grupos experimentales, o el análisis de varianza a dos vías (ANOVA),
seguido de los tests de Tukey o de Dunnett, para comparaciones múltiples.
71
Resultados
RESULTADOS
Sobre el conjunto de antecedentes mencionados en la Introducción, el objetivo central de
este trabajo de Tesis fue analizar las consecuencias del glaucoma sobre el sistema visual
consciente, incluyendo la retina, el nervio óptico (NO) y las áreas de proyección retiniana, así
como sobre el sistema visual no formador de imagen. En este contexto, se realizaron estudios en
un modelo de glaucoma agudo y un modelo de glaucoma crónico. Se describen a continuación
los resultados obtenidos.
1. Modelo experimental de glaucoma agudo
1.1. Sistema visual formador de imagen
En la Figura 24 se muestran los resultados obtenidos en el registro de ERGs escotópicos
en ojos sometidos a un aumento agudo de la presión intraocular (PIO) a 70 mm de Hg por 90
min (glaucoma agudo) y ojos contralaterales sometidos a un procedimiento simulado (sham). En
la misma Figura se muestran registros representativos de los grupos experimentales. Luego de 7
días de la hipertensión ocular aguda (HOA), se observó una caída significativa en la amplitud de
las ondas a y b del ERG, así como de los POs.
Figura 24. Función electrorretinográfica a los 7 días post-HOA o tratamiento simulado (sham). Panel A:
Se muestran las amplitudes de las ondas a y b del ERG, así como de los POs. La HOA provocó una
disminución significativa de todos los parámetros evaluados. Se representan las medias ± EE de 5
72
Resultados
animales/grupo, **p < 0,01 vs. ojos con tratamiento simulado, test de Student. Panel B: Se muestran
registros electrorretinográficos representativos.
La disfunción visual no progresó significativamente en períodos posteriores (datos no
mostrados). El aumento agudo de la PIO indujo cambios evidentes en la estructura retiniana,
como se muestra en la Figura 25. A los 7 días post-HOA, se observó una reducción significativa
en el espesor total de la retina y de las CPI, CPE, CNE y SE de fotorreceptores, así como una
caída significativa en el número de células en la CCG (Tabla 1).
Figura 25. Efecto de la HOA sobre la histología retiniana. En el panel izquierdo se muestran imágenes
representativas de retinas en sección transversal de ojos con tratamiento simulado o sometidos a HOA. A
la derecha se muestra una magnificación del sector recuadrado en el panel izquierdo. La HOA indujo una
marcada alteración de la morfología retiniana, que incluyó una reducción del espesor total de la retina, de
la CNE y de los SE de los fotorreceptores, así como en el número de células en la CCG. Hematoxilinaeosina.
73
Resultados
7 días post-tratamiento
Nº de células en la CCG
Espesor total (µm)
Espesor de la CPI (µm)
Espesor de la CNI (µm)
sham
460,2  9,2
165,6  7,9
37,0  3,4
23,5  0,8
Espesor de la CPE (µm)
9,0  0,6
Espesor de la CNE (µm)
42,1 0,7
Espesor de los SE (µm)
29,6  1,5
HOA
265,4  8,5
**
85,4  17,5
24,5  4,1
18,0  2,9
3,0  1,0
12,3  5,1
7,7  3,0
**
*
**
**
**
Tabla 1. Análisis morfométrico retiniano a los 7 días post-tratamiento. Se representan las medias  EE (5
retinas/grupo), * p < 0,05 y ** p < 0,01 vs. grupo con tratamiento simulado (sham), test de Student. CCG:
Capa de células ganglionares; CPI: capa plexiforme interna; CNI: capa nuclear interna; CPE: capa
plexiforme externa; CNE: capa nuclear externa; SE: segmento externo de los fotorreceptores.
A continuación, se analizó el número de CGRs a través de la inmunorreactividad para
Brn3a (un marcador específico de este tipo celular) en retinas de ojos sometidos a un
procedimiento simulado o a HOA. La HOA indujo una disminución en el número de células
Brn3a(+), como se muestran en la Figura 26. Luego de 2 semanas de la HOA, se observó un
perfil similar y no se observaron diferencias en este parámetro entre ojos intactos y ojos
sometidos a un procedimiento simulado (datos no mostrados).
Figura 26. Efecto de la HOA sobre el número de CGRs. Se muestran imágenes representativas de la
inmunomarcación para Brn3a (rojo) y las capas nucleares de la retina coloreadas con DAPI (azul). Al
cabo de 7 días, la HOA provocó una disminución evidente en el número de células Brn3a(+), respecto al
grupo sometido al tratamiento simulado. Barra de escala: 20 m.
74
Resultados
Estos resultados fueron confirmados mediante el ensayo de TUNEL. Como se muestra en
la Figura 27, en la CCG de ojos sometidos a HOA, se observó un aumento significativo en el
número de células TUNEL(+).
Figura 27. Efecto de la HOA sobre la apoptosis de las CGRs a los 7 días post-tratamiento. En el panel
izquierdo se muestran imágenes representativas. En el panel derecho se muestra la cuantificación del
número de células TUNEL(+) (verde). La HOA indujo un aumento significativo de este parámetro. Se
muestran las medias ± EE (5 retinas/grupo), ** p < 0,01 vs. grupo sham, test de Student.
A continuación, se determinó el estado funcional de los axones de las CGRs a través de la
evaluación del transporte anterógrado de la subunidad de la toxina colérica (CTB) desde la
retina hacia su principal blanco sináptico en la vía visual consciente en la rata, el colículo
superior (CS). A los 7 días, la HOA indujo una marcada reducción en la marca de CTB en el área
retinorreceptiva del CS contralateral, en comparación con el CS contralateral a ojos con
tratamiento simulado (Figura 28). No se observaron diferencias en el transporte de CTB al CS
con aferencias de ojos con tratamiento simulado, respecto de ojos intactos.
75
Resultados
Figura 28. Efecto de la HOA sobre el transporte anterógrado de CTB al CS a los 7 días post-tratamiento.
Se muestra la reconstrucción en sentido rostro-caudal del CS a partir de secciones coronales de cerebro. A
la izquierda se muestra el transporte de CTB de un animal que recibió tratamiento simulado (sham)
unilateral y a la derecha el transporte de CTB de un animal con tratamiento simulado en un ojo e HOA en
el ojo contralateral. La HOA indujo una marcada reducción del transporte anterógrado respecto del
tratamiento simulado. El tratamiento simulado no tuvo efecto per se sobre este parámetro. Barra de
escala: 3 mm.
En la siguiente serie de experimentos, se examinó el estado de la microglía y macroglía
en el CS a los 7 días y 4 semanas post-HOA. Como se muestra en la Figura 29, a los 7 días se
observó una marcada reactividad microglial (evaluada por la inmunorreactividad para Iba-1).
Estas alteraciones se mantuvieron sin cambios luego de 4 semanas post-HOA.
76
Resultados
Figura 29. Estudio de la inmunorreactividad para Iba-1 en el CS a los 7 días y 4 semanas posttratamiento. En ambos períodos se observó una respuesta microglial manifiesta en el CS contrateral al ojo
sometido a HOA.
Asimismo, se observó un aumento en la inmunorreactividad para GFAP en el CS a los 7
días, que fue más marcada luego de 4 semanas post-HOA (Figura 30).
Figura 30. Análisis de la inmunorreactividad para GFAP en el CS. A los 7 días post-HOA, se observó
una moderada respuesta astroglial en las capas superficiales y en la SGI del CS contrateral al ojo
sometido a HOA. Estas alteraciones fueron más marcadas luego de 4 semanas post-HOA.
En conjunto, estos resultados indican que la HOA provocó una alteración funcional
retiniana, junto con cambios estructurales marcados que incluyeron una reducción significativa
en el número de CGRs, así como alteraciones en el transporte anterógrado al CS y en la
77
Resultados
estructura glial del área retinoceptiva y adyacente intermedia del CS. Al menos en la ventana
temporal analizada (7 días post-HOA), este conjunto de alteraciones ocurrieron en forma
simultánea. Por lo tanto, a través de este modelo no fue posible disecar el curso temporal de las
alteraciones visuales a nivel de la retina, el NO y del CS. Sin embargo, se consideró de interés
examinar la vulnerabilidad de las CGRs melanopsina(+) (CGRsm) en particular y del sistema
visual no formador de imagen en general, en este modelo experimental. Los resultados obtenidos
se describen a continuación.
1.2. Sistema visual no formador de imagen
Con el fin de analizar el efecto del glaucoma agudo sobre el sistema visual no formador
de imagen, se seleccionó un período de 4 semanas post-HOA, de manera de maximizar los
cambios en el sistema visual y evaluar las posibles consecuencias sobre este sistema en
particular. Como se muestra en la Figura 31, a las 4 semanas post-HOA se confirmó una
alteración electrorretinográfica altamente significativa en cuanto a la amplitud de la onda a, la
onda b y los POs. En la misma Figura se muestran registros representativos de los grupos
experimentales.
Figura 31. Estudio funcional a las 4 semanas post-HOA o tratamiento simulado. Panel A: Se muestran
las medias ± EE de las amplitudes de las ondas a, b y de los POs del ERG escotópico (5 animales/grupo),
78
Resultados
La HOA indujo una caída significativa en todos los parámetros analizados a las 4 semanas posttratamiento. **p < 0,01 vs. grupo sham, test de Student. Panel B: Se muestran registros representativos
para cada grupo experimental.
En este mismo período, la estructura retiniana se encontró marcadamente alterada, con
cambios en las distintas capas retinianas y en el número de células en la CCG (Figura 32).
Figura 32. Estudio de la histología retiniana a las 4 semanas post-HOA o tratamiento simulado. En el
panel superior se muestran imágenes representativas de retinas de ambos grupos experimentales en
sección transversal (hematoxilina-eosina). Barras de escala: 100 y 50 m (detalles). En el panel inferior
se muestra el espesor total de la retina y el número de células en la CCG. La HOA indujo una marcada
desorganización de la estructura retiniana y una reducción significativa del espesor total y del número de
células en la CCG, con respecto del grupo sham. Se muestran las medias ± EE (5 retinas / grupo), ** p <
0,01 vs. grupo sham, test de Student.
Con el objeto de determinar el número total de CGRsm, el estudio inmunohistoquímico
para Brn3a y melanopsina se realizó en retinas en montaje plano, como se muestra en la Figura
33. Los resultados obtenidos indican que concomitantemente con una caída significativa en el
número de células Brn3a(+), el número de células melanopsina(+) no se modificó
significativamente.
79
Resultados
Figura 33. Estudio de la inmunorreactividad para Brn3a y melanopsina a las 4 semanas post-HOA o
tratamiento simulado. Panel A: Se muestran imágenes representativas de CGRsm en retinas en montaje
plano. Barra de escala: 1000 m. Panel B: a la izquierda se muestra un esquema de la retina y de los
cuadrantes analizados. A la derecha, se muestran imágenes representativas de la inmunorreactividad para
Brn3a (rojo) o melanopsina (verde) para ambos grupos experimentales. Barra de escala: 50m. Panel C:
Se muestra el área retiniana total y el número de células Brn3a(+) y melanopsina(+). Se observó una
disminución significativa del número de células Brn3a(+), en tanto que el número de células
melanopsina(+) permaneció inalterado. Se muestran las medias ± EE (5 retinas/grupo), ** p < 0,01 vs.
grupo sham, test de Student.
Estos resultados se confirmaron por un análisis de Western blot (Figura 34), que indicó
una caída significativa en los niveles retinianos de Brn3a en retinas de ojos que fueron sometidos
a HOA, en tanto que los niveles retinianos de melanopsina no se modificaron significativamente.
80
Resultados
Figura 34. Determinación de los niveles proteicos de Brn3a y melanopsina retinianos a las 4 semanas
post-HOA o tratamiento simulado. Panel A: Se muestran geles representativos. Panel B: Se muestran los
niveles de Brn3a y melanopsina relativos a los niveles de -actina. La HOA indujo una reducción
significativa en los niveles de Brn3a, en tanto que los niveles de melanopsina no se modificaron. Se
muestran las medias ± EE (5 retinas/grupo), ** p < 0,01 vs. grupo con tratamiento simulado (sham), test
de Student.
Con el objeto de evaluar las proyecciones de la retina a áreas centrales del sistema visual
no formador de imagen, se examinó el transporte anterógrado de CTB a los NSQ y el NPO.
Como se muestra en la Figura 35, el transporte de CTB al NPO y los NSQ no se modificó en
forma evidente, en tanto que la marca de CTB disminuyó significativamente en el área
retinorreceptiva del CS y del NGL contralateral a ojos sometidos a HOA.
Figura 35. Efecto de la HOA sobre el transporte anterógrado a las 4 semanas post-tratamiento. En el
panel izquierdo se muestran imágenes representativas del CS, los NGL, NPO y NSQ de un animal que fue
inyectado con CTB-Alexa Fluor 488 (verde) en el ojo con tratamiento simulado y CTB-Alexa Fluor 568
81
Resultados
(roja) en el ojo con HOA. En el panel derecho se muestra un esquema de los núcleos analizados. La HOA
indujo una disminución en la marca de CTB en el CS y los NGL, pero no en los NPO y los NSQ.
Finalmente, se analizó el reflejo pupilar consensual en animales en los que un ojo fue
sometido a HOA o tratamiento simulado y el ojo contralateral permaneció intacto. Como se
muestra en la Figura 36, el reflejo pupilar consensual inducido por 120 lux disminuyó
significativamente en los animales sometidos a HOA, en tanto que cuando el estímulo luminoso
fue de 1200 lux, no se observaron diferencias significativas entre los grupos experimentales.
Figura 36. Efecto de la HOA sobre el reflejo pupilar consensual a las 4 semanas post-tratamiento. Panel
A: Se representa el porcentaje de contracción pupilar en respuesta a un estímulo luminoso de 120 ó 1200
lux. Se observó una reducción significativa en la contracción pupilar frente a un estímulo de 120 (pero no
de 1200) lux. Se muestran las medias ± EE (5 ojos/ grupo), ** p < 0,01 vs. grupo sham, test de Student.
Panel B: Se muestran fotos representativas de la contracción pupilar máxima para ambos grupos
experimentales.
2. Modelo experimental de glaucoma crónico.
2.1. Sistema visual formador de imagen
Como se mencionó en la Introducción, en trabajos previos de nuestro laboratorio
demostramos que la administración semanal de ácido hialurónico (AH) en la cámara anterior del
ojo reproduce aspectos centrales del glaucoma humano. Sin embargo, la utilización de este
modelo debió ser abandonada porque la empresa fabricante (Sigma®) interrumpió en forma
definitiva la producción de este tipo particular de AH (catálogo # H1751). No hemos logrado
82
Resultados
reproducir los resultados originales obtenidos con el tipo de AH con el que se realizaron
experimentos previos, que dieron origen a diversas publicaciones del laboratorio (Belforte y col.,
2007, 2010; Benozzi y col., 2002; Moreno y col., 2004, 2005a, 2005b, 2008;), incluso con
diferentes AH de ésta u otras empresas. Por lo tanto, resultó necesario desarrollar un modelo de
glaucoma experimental alternativo. Para ello, considerando los antecedentes mencionados en la
Introducción sobre la relevancia de los GAGs como barrera al pasaje de humor acuoso, así como
el hecho de que el condroitín sulfato (CSU) junto con el AH son los principales GAGs de la red
trabecular, se examinó el efecto de la administración intracameral de CSU sobre la PIO, la
función y la histología retiniana. Los resultados obtenidos se describen a continuación.
En una primera serie de experimentos, se inyectaron animales con diferentes
concentraciones de CSU en un ojo y vehículo en el ojo contralateral y se determinó la PIO en
ambos ojos de cada animal 24 h después de la inyección. En la Figura 37 se muestran los valores
de PIO de ojos inyectados con vehículo o CSU (10, 20 ó 40%). Se observó un aumento leve pero
no significativo de la PIO en los ojos inyectados con 10 ó 20% de CSU, en tanto que la
inyección con CSU al 40% indujo un aumento significativo de este parámetro.
Figura 37. Efecto de una única inyección intracameral de CSU sobre la PIO. Los ojos se inyectaron con
vehículo o CSU (10, 20 ó 40%), 24 h antes de la determinación de la PIO. Se observó un aumento
significativo de este parámetro en los ojos inyectados con 40 (pero no con 10 ó 20) % de CSU. Se
83
Resultados
representan las medias ± EE (n = 10 ojos / grupo), ** p < 0,01 vs. ojos inyectados con vehículo, test de
Dunnett.
Con el fin de analizar el curso temporal del efecto del CSU sobre la PIO, se realizó una
única inyección de CSU al 40% en un ojo y vehículo en el ojo contralateral y se determinó la
PIO en ambos ojos antes de la inyección (día 0) y diariamente a partir de 24 h post-inyección,
como se muestra en la Figura 38. La inyección de CSU indujo un aumento de casi al doble de la
PIO que duró 7 días, mientras que en el 8vo día post-inyección, la PIO en los ojos inyectados con
CSU alcanzó valores similares al control.
Figura 38. Determinaciones de la PIO en ojos tratados con una única inyección intracameral de vehículo
(círculos blancos) o CSU (círculos negros). El CSU aumentó significativamente la PIO hasta el día 7
post-inyección. Se representan las medias ± EE (n = 10 ojos/grupo), ** p < 0,01 vs. ojos inyectados con
vehículo en los mismos intervalos post-inyección, test de Student.
Con el objeto de inducir una hipertensión ocular persistente, los animales se inyectaron
una vez por semana con CSU (en un ojo) y vehículo (en el ojo contralateral). Se determinó
semanalmente la PIO en ambos ojos, antes de una nueva inyección, como se muestra en la
Figura 39. La PIO de los ojos tratados con CSU fue significativamente mayor que la de los ojos
inyectados con vehículo a lo largo de todo el estudio (15 semanas). No se observaron diferencias
significativas en la PIO de los ojos inyectados con vehículo entre los intervalos analizados, ni
entre ojos intactos o inyectados con vehículo (datos no mostrados).
84
Resultados
Figura 39. Efecto de la administración crónica de CSU sobre la PIO. Se realizaron inyecciones
semanales de vehículo (círculos blancos) o CSU (círculos negros), después de la determinación de la
PIO. El CSU indujo una hipertensión ocular persistente a lo largo de todo el estudio. Se representan las
medias ± EE (n = 15 ojos/grupo), ** p < 0,01 vs. ojos inyectados con vehículo, test de Student.
A continuación, se evaluó el efecto de la hipertensión ocular inducida por CSU sobre la
función de la retina y la vía visual. Para ello, se registraron ERGs escotópicos a las 3, 6, 10 y 15
semanas de tratamiento con vehículo o CSU. En la Figura 40 se muestran las amplitudes de la
onda a, la onda b y los POs en ratas no inyectadas o inyectadas semanalmente con vehículo en un
ojo y CSU en el ojo contralateral. No se observaron diferencias significativas en estos
parámetros entre el grupo de animales con ojos intactos y el grupo tratado con vehículo. A las 3
semanas, la administración de CSU no indujo cambios significativos en ninguno de los
parámetros analizados (datos no mostrados), en tanto que a las 6 semanas de hipertensión ocular
crónica se observó una leve (pero significativa) reducción de la amplitud de la onda a, la onda b
y los POs. La disfunción retiniana fue más evidente luego de 10 semanas de hipertensión ocular
y continuó su progresión a las 15 semanas de tratamiento. Esta disminución fue
significativamente mayor a las 10 y 15 semanas de tratamiento con CSU, respecto del grupo
tratado durante 6 semanas.
85
Resultados
Figura 40. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre el ERG escotópico. Se representa la amplitud
de la onda a, b y POs del ERG de animales con ojos intactos o inyectados semanalmente con CSU en un
ojo y vehículo en el ojo contralateral durante 6, 10 ó 15 semanas. El tratamiento con CSU indujo una
disminución significativa de los tres parámetros analizados en todos los intervalos. A las 10 y 15 semanas
de hipertensión ocular, el efecto del CSU sobre la amplitud de la onda a y los POs fue significativamente
mayor que a las 6. A las 15 semanas, la caída en la amplitud de la onda b fue significativamente mayor
que a las 6 y 10 semanas de tratamiento con CSU. Se representan las medias ± EE (n = 15 ojos/grupo), *
p < 0,05 y ** p < 0,01 vs. ojos inyectados con vehículo, a: p < 0,05 y b: p < 0,01 vs. ojos con 6 semanas
de tratamiento con CSU y # p < 0,05 vs. ojos con 10 semanas de tratamiento con CSU, test de Tukey.
En la Figura 41 se muestran registros electrorretinográficos representativos de ojos
inyectados con CSU o vehículo durante 6, 10 ó 15 semanas. El tratamiento con CSU no afectó
significativamente las latencias de las ondas a y b y de los POs en ninguno de los intervalos
analizados (datos no mostrados).
86
Resultados
Figura 41. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre el ERG escotópico. Se muestran registros
representativos de ojos de animales inyectados con vehículo (línea gris llena) o CSU (línea punteada)
durante 6, 10 ó 15 semanas.
Con el fin de evaluar la actividad de toda la vía visual (desde los fotorreceptores a la
corteza visual) se registraron potenciales visuales evocados (VEPs), a las 3, 6 y 15 semanas de
hipertensión ocular. Se observó una disminución significativa en las amplitudes de los
componentes P1-N2 y N2-P2 en los ojos inyectados con CSU durante 6 ó 15 semanas en
comparación con los ojos inyectados con vehículo (Figura 42). No se observaron cambios en los
VEPs a las 3 semanas de hipertensión ocular (datos no mostrados). Los VEPs en ojos intactos no
difirieron significativamente de los registrados en ojos inyectados con vehículo durante 3 (datos
no mostrados), 6 ó 15 semanas (Figura 42). No se observaron diferencias significativas en las
latencias de los componentes de los VEPs entre los grupos experimentales (datos no mostrados).
87
Resultados
A
B
Figura 42. Efecto de la hipertensión ocular sobre la amplitud de los VEPs. Panel A: A las 6 y 15 semanas
de tratamiento con CSU, las amplitudes promedio de los componentes P1-N2 y N2-P2 de los VEPs
disminuyeron significativamente. Se representan las medias ± EE (n = 8 animales/grupo), * p < 0,05 y **
p < 0,01 vs. ojos inyectados con vehículo, test de Student. Panel B: Se muestran registros representativos
de todos los grupos experimentales: ojos intactos (control, línea negra), ojos inyectados con vehículo
(línea gris llena) o con CSU (línea punteada). En el registro control se señalan los componentes P1, P2 y
N2.
En la Figura 43 se muestran imágenes representativas de retinas en sección transversal de
un ojo tratado con vehículo o con CSU por 10 semanas. Aunque el espesor total de la retina y de
la CPI, la CNI y la CNE no difirió entre los grupos experimentales, se observó una disminución
significativa en el número de células en la CCG en los ojos inyectados con CSU durante 10
semanas (Figura 43, Tabla 2).
88
Resultados
Figura 43. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre la morfología retiniana. Se muestran secciones
transversales de retinas de un ojo inyectado con solución salina (A) y un ojo inyectado con CSU durante 10
semanas (B). Nótese la disminución del número de células en la CCG en el ojo inyectado con CSU, en tanto
que la estructura general de la retina fue similar en ambos grupos. Hematoxilina-eosina.
A las 3 ó 6 semanas de tratamiento con vehículo o CSU no se observaron alteraciones en
la morfología de la retina y a las 15 semanas los resultados fueron esencialmente similares a los
observados a las 10 semanas de tratamiento (datos no mostrados).
10 semanas de tratamiento
Nº de células en la CCG/100 m
Espesor total (µm)
Espesor de la CPI (µm)
Espesor de la CNI (µm)
Espesor de la CNE (µm)
vehículo
CSU
9,2 ± 0,5
132,0 ± 7.0
32,7 ± 4,6
25 ± 2,8
37,1 ± 3.0
5,9 ± 0,7**
129,0 ± 6,8
31,6 ± 4,2
23,3 ± 2,3
35,5 ± 4,7
Tabla 2. Número de células en la CCG y espesor total de la retina y de sus capas. Se representan las
medias ± EE, ** p  0,01 (n = 5 retinas/grupo) vs. grupo inyectado con vehículo, test de Student.
Con el objeto de analizar el efecto de la hipertensión ocular crónica específicamente
sobre las CGRs, se evaluó la inmunorreactividad para Brn3a en cortes transversales de retina.
Como se muestra en la Figura 44, el número de células Brn3a(+) no se modificó
significativamente luego de 6 semanas de hipertensión ocular, en tanto que a las 10 semanas de
glaucoma experimental, se observó una reducción significativa en este parámetro, que fue
similar a la observada luego de 15 semanas de hipertensión ocular.
89
Resultados
Figura 44. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre el número de células Brn3a(+). En el panel
izquierdo se muestran imágenes representativas de retinas de animales con 6, 10 ó 15 semanas de
tratamiento con vehículo o CSU y en el panel derecho, la cuantificación del número de células Brn3a(+).
Este parámetro disminuyó significativamente a las 10 y 15 (pero no a las 6) semanas de tratamiento con
CSU. Se representan las medias ± EE (n = 5 retinas/grupo), ** p < 0,01 vs. ojos inyectados con vehículo,
a: p < 0,01 y b: p < 0,05 vs. CSU durante 6 semanas, test de Tukey.
Por una limitación en la disponibilidad de animales, en los experimentos cuyos resultados
se describirán a continuación se evaluaron dos intervalos de hipertensión ocular crónica: una
etapa temprana, es decir a las 6 semanas de tratamiento (en forma previa a la caída en el número
de CGRs) y una etapa avanzada de glaucoma experimental, es decir a las 15 semanas de
tratamiento con CSU (a posteriori de la caída en este parámetro).
En la siguiente serie de experimentos, se examinó el transporte axonal anterógrado desde
la retina al CS y al NGL, a través de la inyección intravítrea de CTB. En una primera instancia,
se examinaron las retinas de ojos inyectados con CTB para corroborar la incorporación de la
toxina en las CGRs de los grupos experimentales. En ambos intervalos, se observó
cualitativamente que las CGRs mantuvieron la capacidad de captación de la toxina (Figura 45).
90
Resultados
Figura 45. Incorporación de CTB en las CGRs de animales inyectados con vehículo o CSU por 6 ó 15
semanas. En secciones transversales de retina se observó marca para CTB, particularmente en los cuerpos
y los axones de las CGRs (detalle). Barras de escala: 50 m.
Sin embargo, se observó una disminución en el transporte de CTB ya a las 6 semanas de
hipertensión ocular en la porción del NO proximal a la retina (Figura 46).
Figura 46. Transporte de CTB en animales inyectados con vehículo o CSU por 6 semanas. En el panel
izquierdo se muestran cortes longitudinales representativos de 4 NOs/grupo y en el derecho se representa
el % de marca de CTB en función de la distancia a la retina. En el NO de ojos inyectados con vehículo, se
observó acumulación de la toxina en la porción más cercana a la retina (0 - 400 m, región amielínica),
que decayó progresivamente al alcanzar la zona de transición (400 - 600 m) y la región mielinizada del
NO. En el NO de ojos inyectados con CSU por 6 semanas se observó un perfil de decaimiento similar de
CTB en función de la distancia a la retina, aunque la marca fue notablemente menor en toda su extensión.
En cuanto a los núcleos cerebrales, el transporte de CTB disminuyó en el CS contralateral
a ojos hipertensos ya a partir de las 6 semanas de tratamiento con CSU. A las 15 semanas de
tratamiento, se observó ausencia casi completa de marca de CTB en el CS, como se muestra en
91
Resultados
la Figura 47. Resultados similares se obtuvieron en cuanto al transporte de CTB al NGL, como
se muestra en la Figura 48.
intacto
Figura 47. Transporte anterógrado de CTB en animales con ojos intactos o inyectados semanalmente con
vehículo en un ojo y CSU en el ojo contralateral durante 6 ó 15 semanas. Microfotografías representativas
de 5 animales/grupo que muestran el patrón de transporte de CTB hacia las capas superficiales (SZ y
SGS) del CS en cortes coronales. En el CS contralateral al ojo inyectado con vehículo (Veh), no se
observaron signos de alteración con respecto a los controles no inyectados, en tanto que en el CS
contralateral a ojos inyectados con CSU, se observó una marcada reducción de las áreas marcadas con
CTB, tanto a las 6 como a las 15 semanas de tratamiento. Nótese la representación del disco óptico en el
CS, indicada por las flechas blancas.
92
Resultados
Figura 48. Transporte anterógrado de CTB al NGL. Microfotografías representativas de 5
animales/grupo del patrón de transporte de CTB al intergeniculado (IG), NGL dorsal (NGLd) y ventral
(NGLv) en cortes coronales. En el NGL contralateral a ojos inyectados con CSU, se observó una marcada
reducción en la marca de CTB, tanto a las 6 como a las 15 semanas de tratamiento.
A continuación se evaluó el estado de los terminales presinápticos de las CGRs, a través
de la inmunodetección de VgluT-2 en el CS. Este parámetro no se modificó en forma evidente ni
a las 6 ni a las 15 semanas de hipertensión ocular, como se muestran en la Figura 49.
Figura 49. Análisis de la inmunorreactividad para VgluT-2 en el CS de animales inyectados con vehículo
en un ojo y CSU en el ojo contralateral. En el panel izquierdo se muestran imágenes representativas de la
inmunorreactividad para VgluT-2. En el panel derecho se muestra la cuantificación del % de área
inmunopositiva para VgluT-2, que no difirió significativamente entre los grupos experimentales en
ninguno de los intervalos estudiados. Se representan las medias ± EE (n = 5 CS/grupo).
93
Resultados
2.1.1. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel del nervio óptico
En la siguiente serie de experimentos se analizó la morfología y ultraestructura del NO de
ojos inyectados con vehículo o CSU. En cortes semifinos de NO proximal, se cuantificó el área
transversal y el número total de axones y se determinó la distribución del número de axones en
función del área axonal. El glaucoma experimental indujo una disminución moderada pero
significativa del número total de axones a las 6 semanas, que progresó a las 15 semanas de
hipertensión ocular, mientras que el área del NO disminuyó significativamente sólo a las 15
semanas (Figura 50).
Figura 50. Efecto del glaucoma experimental sobre el área transversal del NO y el número de axones a
las 6 ó 15 semanas de tratamiento. En el panel superior se muestran imágenes representativas de cortes
semifinos transversales de la porción proximal del NO (azul de toluidina). En el panel inferior se muestra
la cuantificación del área transversal del NO y del número de axones. El CSU indujo una reducción
significativa del número de axones tanto a las 6 como a las 15 semanas de tratamiento, en tanto que el
área del NO disminuyó significativamente sólo a las 15 semanas. Se representan las medias ± EE (n = 5
nervios/grupo), * p < 0,01 y ** p < 0,01 vs. NOs de ojos inyectados con vehículo, a: p < 0,01 vs. NOs de
ojos inyectados con CSU por 6 semanas, test de Tukey.
94
Resultados
Con el fin de determinar la susceptibilidad diferencial a los efectos deletéreos del
glaucoma en términos del tamaño de los axones, se analizó la distribución de los axones en
función del área axonal (Figura 51). A las 6 semanas, sólo los axones de mayor área (> 1,5 m2)
fueron afectados significativamente por la hipertensión ocular crónica, en tanto que a las 15
semanas se redujo significativamente el número de axones de todos los rangos de área evaluados.
Figura 51. Distribución del número de axones en función del área axonal. A las 6 semanas de
hipertensión ocular, se redujo significativamente el número de axones grandes (entre 1,5 - 2,5 m2 y > 2,5
m2), en tanto que a las 15 semanas disminuyó significativamente el número de axones de todos los
tamaños analizados. Se representan las medias ± EE (n = 5 nervios/grupo), * p < 0,01 y ** p < 0,01 vs.
NOs de ojos inyectados con vehículo, test de Student.
En la Figura 52 se muestran microfotografías representativas de NOs de ojos control o
con 6 ó 15 semanas de hipertensión ocular. Los axones del NO de los ojos inyectados con
vehículo por 6 ó 15 semanas presentaron una forma uniforme (redondeada/oval) y un tamaño
variable, con niveles moderados de glía perivascular y del neuropilo. En el NO de los ojos
tratados con CSU durante 6 semanas, se observaron algunos axones degenerados (áreas densas
de mielina), axones con distensiones y distorsiones que se apartaron de la morfología
característica de axones normales, así como signos de gliosis, evidenciados por un aumento en la
distancia entre los haces de axones del nervio. A las 15 semanas de hipertensión ocular, los
95
Resultados
efectos fueron más marcados y se evidenciaron por una pérdida global de la uniformidad e
integridad axonal (menor número total de axones, mayor número de axones degenerados) y
claros signos de gliosis reactiva (Figura 52).
Figura 52. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre la estructura del NO. Se muestran
microfotografías representativas de cortes transversales del NO proximal, luego de 6 ó 15 semanas de
tratamiento con CSU o vehículo (azul de toluidina). Nótese la distribución homogénea de los axones en
todo el campo, con contenido glial moderado, que se corresponde con un nervio sano. Luego de 6
semanas de hipertensión ocular, se observó una menor densidad de axones, algunas fibras en
degeneración y procesos gliales más numerosos y de mayor tamaño. A las 15 semanas, el efecto del
glaucoma fue más marcado, con evidentes signos de gliosis reactiva. En estos nervios, la mayoría de los
axones presentaron degeneración axonal, siendo escasos los axones con apariencia normal. Imágenes
representativas de 5 NOs/grupo. Barra de escala: 25 m.
A nivel ultraestructural, se observó que los NOs de ojos inyectados con vehículo por 6 ó
15 semanas presentaron una estructura conservada, en la que haces de axones se encontraron
delimitados por finos procesos astrocitarios de citoplasma electrón-lúcido. A mayor aumento, las
96
Resultados
vainas de mielina presentaron una apariencia normal, compacta y muy electrón-densas, rodeando
el axoplasma sin alteraciones evidentes, con fibras del citoesqueleto (microtúbulos y
neurofilamentos) y organelas (principalmente mitocondrias). A las 6 semanas de hipertensión
ocular, la arquitectura global del NO fue similar a la de los NOs de ojos inyectados con vehículo,
con fibras en apariencia normales a bajo aumento. A mayor magnificación, entre fibras normales
se encontraron algunos axones con mielina fragmentada, axones con áreas de mielina
distorsionada y vacuolizada, en las que las lamelas de las vainas se observaron descompactadas.
En baja proporción, se observaron axones completamente degenerados sin axoplasma, en los que
la mielina formó una masa electrón-densa y redondeada. A las 15 semanas de hipertensión
ocular, las alteraciones ultraestructurales fueron más marcadas: el NO presentó una estructura
desorganizada, gruesos procesos astrocitarios intercalados entre los haces de fibras nerviosas con
distinto grado de degeneración y fue frecuente distinguir células microgliales en las
proximidades de axones degenerados. Las células microgliales se reconocieron por poseer
núcleos con forma arriñonada o con una leve escotadura, heterocromatina perinuclear y
citoplasma moderadamente electrón-denso, con vacuolas, lisosomas y áreas de debris, y se
distinguieron de los oligodendrocitos, con núcleos de forma circular u ovoide de gran tamaño
con escaso citoplasma perinuclear levemente electrón-denso, y de los astrocitos, con núcleos
ovoides eucromáticos (Figura 53 y 54). En este estadío, prevalecieron las fibras con mielina
descompactada y axones con degeneración densa de dos tipos: acúmulos de mielina condensada
(como se observó a las 6 semanas) y otros en los que el axoplasma aparentemente fue
reemplazado por un material granular indefinido y electrón-denso. En menor proporción, se
identificaron axones con mielina fragmentada con exposición del axoplasma al medio
extracelular y axones con degeneración laxa (watery degeneration), en el que el contenido
axoplásmico (citoesqueleto y organelas) fue reemplazado por un material amorfo y en apariencia
laxo y claro.
97
Resultados
Figura 53. Análisis ultraestructural del NO proximal. Se muestras imágenes representativas a distintos
aumentos de los NOs de ojos inyectados con vehículo o CSU durante 6 ó 15 semanas. A las 6 semanas de
hipertensión ocular, la estructura general del NO fue similar a la de los NOs correspondientes a ojos
inyectados con vehículo. Sin embargo, intercalados entre axones con apariencia normal, se observaron
axones con áreas de mielina descompactada (flechas negras), axones con ruptura de las vainas (flechas
blancas) y algunos axones completamente degenerados (estrellas blancas). A las 15 semanas, se
observaron procesos astrocitarios (A) más gruesos, así como células microgliales (Mi) y axones con
distinto grado de degeneración. Además, se observaron axones cuyo axoplasma fue reemplazado por una
masa homogénea granular y electrón-densa (asteriscos blancos) y minoritariamente, algunas fibras con
contenido axoplásmico alterado, ausencia del citoesqueleto y organelas (estrellas negras). Ol:
oligodendrocito. Imágenes representativas de 4 NOs/grupo. Barras de escala: 6 m, 1,5 m y 400 nm
para la primera, segunda y tercera fila, respectivamente.
98
Resultados
A
B
C
Figura 54. Detalles al MET de células microgliales en NOs de animales con 15 semanas de hipertensión
ocular. Paneles A y B: Se muestran dos células microgliales en diferentes estados de activación, con
axones degenerados en su interior (estrellas blancas y negras), localizados en las proximidades de axones
con degeneración densa (asteriscos blancos) y laxa (Ad). Nótese la diferencia de contrastes entre el
citoplasma microglial (electrón-denso) y el neuropilo (electrón-lúcido), que facilitó la identificación de
los límites celulares. Panel C: Se muestra un detalle del área señalada en (B) en la que se observan dos
axones degenerados (estrellas negras) en el interior de citoplasma microglial, delimitado por su membrana
plasmática (mp). Nótese en B-C la presencia de múltiples vacuolas (v) y otras organelas electrón-densas
(posiblemente lisosomas), indicativas de un estado microglial fagocítico. f: filamentos intermedios de
astrocitos; Nu: núcleos. Barras de escala: 1 m (A-B) y 0,4 m (C).
Los resultados de la distribución de frecuencias de las líneas intraperiódicas (Li) de los
NOs de animales con 6 ó 15 semanas de tratamiento con vehículo o CSU, se muestran en la
Figura 55. Debido a la presencia de axones degenerados en los animales con hipertensión ocular,
sólo fue posible analizar en estos grupos los axones normales remanentes y los axones con
degeneración leve, que intercalaron focos de mielina descompactada y mielina compacta, en los
que las Li fueron claramente identificadas. El glaucoma experimental a las 15 (pero no a las 6)
semanas indujo un corrimiento de la distribución de frecuencias hacia la izquierda, es decir,
hacia axones con vainas de mielina más delgadas.
99
Resultados
Figura 55. Efecto del glaucoma experimental sobre la distribución de frecuencias del número de líneas
intraperiódicas de los axones del NO proximal. En el panel superior se muestran fotografías
representativas utilizadas para la cuantificación manual del número de líneas intraperiódicas (Li) de las
vainas de mielina (VM) de axones normales a levemente degenerados (con algunos focos de mielina
descompactada en los que aún pueden contarse las Li). En el panel inferior se muestran histogramas
representativos de la distribución de frecuencias del número de Li de los axones de los NOs en animales
con 6 ó 15 semanas de CSU en un ojo y vehículo en el ojo contralateral. La hipertensión ocular por 15
(pero no 6) semanas indujo el corrimiento de la distribución de frecuencias hacia la izquierda. Al:
axolema; Ap: axoplasma; M: mitocondria: Nf: neurofilamentos; Np: neuropilo. Barras de escala: 200 nm.
En la Figura 56 se muestra la inmunorreactividad para Iba-1 y ED1 (un marcador de
células fagocíticas) en cortes transversales de NO proximal y la cuantificación de los resultados
obtenidos. Los animales tratados con vehículo por 6 ó 15 semanas, presentaron niveles
prácticamente indetectables de ED1. El glaucoma crónico indujo un aumento significativo en
ambos parámetros, tanto a las 6 como a las 15 semanas. En cuanto a la inmunomarcación para
ED1, el efecto de la hipertensión ocular fue significativamente mayor a las 15 que a las 6
semanas.
100
Resultados
Figura 56. Efecto del glaucoma crónico sobre la inmunorreactividad para Iba-1 y ED1 en cortes
transversales de NO proximal. En el panel superior se muestran imágenes representativas de la
inmunomarcación para Iba-1, ED1 y núcleos coloreados por DAPI en NOs de ojos con 6 ó 15 semanas
de hipertensión ocular. En el panel inferior se muestra la cuantificación del área Iba-1(+) y ED1(+). Los
NOs de los ojos inyectados con CSU durante 6 ó 15 semanas presentaron niveles de Iba-1 y ED1
significativamente mayores que los observados en los nervios de los ojos inyectados con vehículo. El
efecto de la hipertensión ocular sobre el área ED1(+) a las 15 semanas fue mayor que a las 6, en tanto que
el área Iba-1(+) se redujo leve, pero significativamente a las 15 respecto de las 6 semanas de tratamiento.
Se representan las medias ± EE (n = 5 nervios/grupo), * p < 0,01 y ** p < 0,01 vs. NOs de ojos
inyectados con vehículo, a: p < 0.01 vs. NOs de ojos inyectados con CSU por 6 semanas, test de Tukey.
101
Resultados
En estos mismos nervios se analizó la expresión de GFAP y de la cadena pesada del
neurofilamento fosforilado (pNF-H) (Figura 57). Los nervios control presentaron niveles
moderados de GFAP con un perfil filamentoso y un área positiva para pNF-H en forma de
puncta, con distribución homogénea. En contraste, los nervios de animales con 6 y 15 semanas
de hipertensión ocular, presentaron un área GFAP(+) significativamente mayor y un área pNF-H
(+) significativamente menor que la observada en NOs de ojos inyectados con vehículo.
Figura 57. Efecto del glaucoma crónico sobre la inmunorreactividad para GFAP y pNF-H. En el panel
superior se muestran NOs representativos a las 6 ó 15 semanas de tratamiento con vehículo o CSU. En el
panel inferior se muestra la cuantificación del área GFAP(+) y pNF-H(+). Tanto a las 6 como a las 15
semanas de tratamiento se observó un aumento significativo en la inmunoreactividad para GFAP y una
disminución significativa en el área pNF-H(+). Se representan las medias ± EE (n = 5 nervios/grupo), **
p < 0,01 vs. NOs de ojos inyectados con vehículo, test de Tukey.
102
Resultados
2.1.2. Efecto del glaucoma crónico experimental sobre la estructura axoglial del colículo
superior
La siguiente serie de experimentos tuvo por objeto analizar las consecuencias del
glaucoma experimental crónico sobre distintas poblaciones gliales (microglía, astrocitos,
oligodendrocitos), axones y neuronas del CS. El estado de la microglía se evaluó a través de los
marcadores moleculares: Iba-1 e isolectina GSA (Figura 58 y 59). A las 6 y 15 semanas de
hipertensión ocular se observó un aumento en el número de células Iba-1(+), pero no en la
relación contenido de Iba-1/célula. El aumento en el número de células microgliales a las 15
semanas de hipertensión ocular fue significativamente mayor que a las 6 semanas de tratamiento
con CSU, lo que se reflejó en un aumento en la inmunorreactividad para Iba-1, que sólo resultó
significativo a las 15 semanas de hipertensión ocular (Figura 58).
103
Resultados
A
B
C
D
Figura 58. Estudio de la inmunorreactividad para Iba-1 en el CS. Panel A: Se muestran imágenes
representativas de los sectores medial, medio-lateral y lateral del CS. Nótese la hipertrofia microglial, más
evidente a las 15 semanas de hipertensión ocular. Barra de escala: 50 µm. Paneles B, C y D: Se muestran
los resultados de la cuantificación de la inmunorreactividad para Iba-1 (% del total), del número de
células Iba-1(+) y la inmunorreactividad para Iba-1/célula, respectivamente. A las 6 y 15 semanas de
hipertensión ocular, se observó un aumento en el número de células Iba-1(+) coliculares, que se
correspondió con un aumento en la expresión global de Iba-1, pero no con un aumento en la expresión de
este marcador/célula. En todos los casos se promediaron los resultados obtenidos en los tres sectores. Se
representan las medias ± EE (n = 6 animales /grupo), * p < 0,05 y ** p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos
inyectados con vehículo, a: p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con CSU durante 6 semanas,
test de Tukey.
104
Resultados
En concordancia con estos resultados, se observó un aumento en la tinción para GSA en
el CS contralateral a ojos hipertensos, como se observa en la Figura 59.
Figura 59. Análisis histoquímico para isolectina GSA en el CS. Se muestran imágenes representativas en
los sectores medial, medio-lateral y lateral del CS. A las 6 y 15 semanas de hipertensión ocular se observó
una marcada respuesta microglial en el CS contralateral al ojo con hipertensión ocular crónica. Nótese el
fenotipo “en reposo” de la microglía quiescente en el grupo con vehículo, comparado con la morfología
hipertrofiada típica de células microgliales activadas en el CS que recibió aferencias del ojo
glaucomatoso. Imágenes representativas de 6 animales /grupo. Barra de escala: 50 µm.
Utilizando el programa IMARIS®, se realizó un análisis detallado de la morfología
microglial en dos áreas retinorreceptivas del CS: el CS medial, que recibe aferencias de la retina
superior, y el CS lateral, que recibe aferencias de la retina inferior. Para ello fue necesario
realizar una reconstrucción tridimensional (como se describió en Materiales y Métodos), con el
fin de incluir las prolongaciones características de las células gliales. En la Figura 60 se muestran
las reconstrucciones tridimensionales en dos planos (z-stacks) obtenidas a partir de CS
inmunomarcados para Iba-1. Este procedimiento, que suprime la luz fuera de foco, se traduce en
105
Resultados
imágenes más nítidas que las que se obtienen por microscopía de fluorescencia convencional.
Este análisis indicó que a las 6 semanas de hipertensión, la activación microglial comenzó en la
porción lateral del CS y luego de 15 semanas, progresó y se extendió hacia la región medial. El
análisis cuantitativo de los distintos parámetros se muestra en la Figura 61.
Figura 60. Estudio de la complejidad morfológica de células inmunomarcadas para Iba-1. Se muestran
imágenes representativas del CS medial y lateral a las 6 ó 15 semanas de tratamiento. En los cuatro
cuadrantes de la Figura, la primera columna representa los z-stack de las imágenes confocales, la tercera
(en fondo gris) el análisis de los filamentos microgliales (en azul) con el software IMARIS y la del medio,
la superposición de las dos columnas antes mencionadas. A las 6 semanas de tratamiento con CSU, se
observó una marcada activación microglial en la región lateral del CS que progresó hacia la porción
medial a las 15 semanas de hipertensión. Nótese la hipertrofia celular y la detección de mayor número de
ramificaciones en el CS contralateral a ojos glaucomatosos. Barra de escala: 50 µm.
106
Resultados
Figura 61. Análisis cuantitativo de la complejidad microglial. Se tomaron en cuenta la suma del largo
(A), área (B) y volumen (C) de los procesos microgliales Iba1(+) de las imágenes confocales z-stack, así
como el número total de los puntos de ramificación (D), de los segmentos de los filamentos (E) y puntos
terminales de los mismos (F). A las 6 semanas de hipertensión ocular, se observó un aumento
significativo de todos los parámetros analizados en la porción lateral del CS, que se extendió a la región
medial del CS a las 15 semanas de tratamiento con CSU. Se representan las medias ± EE (n = 6
CS/grupo), * p < 0,05 y ** p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con vehículo, a: p < 0,05 y b: p
< 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con CSU durante 6 semanas, test de Tukey.
En la siguiente serie de experimentos, se evaluó la inmunorreactividad colicular para
ED1. Sólo luego de 15 semanas de hipertensión ocular se observaron células microgliales
ED1(+) en el CS contralateral a ojos hipertensos (Figura 62)
107
Resultados
Figura 62. Inmunodetección de células ED1(+) en el CS. En el panel superior se muestran
microfotografías representativas de la inmunorreactividad para ED1 en el CS de un animal con 6 ó 15
semanas de tratamiento con vehículo o CSU. Las flechas blancas indican la presencia de células ED1(+).
En el panel inferior se muestran detalles de los sectores medial y lateral del CS contralateral a ojos
inyectados con CSU o vehículo durante 15 semanas. Sólo en este período se observó la presencia de
células ED1(+) en el CS contralateral al ojo glaucomatoso. Imágenes representativas de 4 animales
/grupo.
En la Figura 63 se muestran imágenes representativas de la inmunomarcación para GFAP
en el CS de animales con ojos intactos, o de animales que recibieron vehículo en un ojo y CSU
en el ojo contralateral durante 6 ó 15 semanas. Los resultados obtenidos demostraron una
marcada respuesta astroglial a las 15 semanas de hipertensión ocular, que ocupó toda la
extensión del CS en sentido medio-lateral, las capas superficiales (visuales) y la capa SGI del CS
en sentido dorso-ventral. Dada la presencia de astrocitos perivasculares y con el objeto de
minimizar las diferencias entre animales y entre experimentos, todas las comparaciones se
normalizaron al CS contralateral, por lo que se incluyeron dos grupos adicionales: animales con
ambos ojos intactos (control) y animales con un ojo intacto y otro inyectado con vehículo por 6 ó
15 semanas (vehículo). A las 15 semanas de hipertensión ocular se observó un aumento
108
Resultados
significativo en el área GFAP(+), respecto al grupo intacto y al grupo inyectado con vehículo,
que no difirieron estadísticamente entre sí (Figura 63).
C: Control/ Control
V: Vehículo/ Control
G: CSU/ Vehículo
Figura 63. Análisis de la inmunorreactividad para GFAP en el CS. En el panel izquierdo se muestran
imágenes representativas en secciones coronales. A las 15 semanas de hipertensión ocular, se observó una
marcada respuesta astroglial en el CS contralateral al ojo glaucomatoso, localizada principalmente en el
límite entre el CS superficial y profundo. En el panel derecho se muestra la cuantificación de la
inmunomarcación para GFAP respecto del área total del CS, relativa a la marca del CS contralateral. La
hipertensión ocular crónica indujo un aumento significativo en este parámetro a las 15 semanas de
tratamiento con CSU. Se representan las medias ± EE (n = 5 CS/grupo), ** p < 0,01 vs. grupo control (C),
a: p < 0,01 vs. vehículo (V)), test de Tukey.
La complejidad astroglial en imágenes confocales se analizó con el programa IMARIS,
como ya se describió. En la Figura 64 se muestran imágenes representativas y en la Figura 65, el
análisis cuantitativo de los resultados obtenidos. Este estudio permitió detectar una activación
astrocitaria temprana, moderada en la porción lateral y mayor en la región medial del CS. A las
15 semanas de hipertensión ocular, se observó una marcada gliosis reactiva.
109
Resultados
Figura 64. Estudio de la complejidad celular de astrocitos GFAP(+). Se muestran imágenes
representativas del CS medial y lateral a las 6 ó 15 semanas de tratamiento: z-stacks, análisis de los
filamentos (en azul con fondo gris) y la superposición de ambos. A las 6 semanas de hipertensión ocular,
se observó una marcada respuesta astroglial en la porción medial del CS y más moderada en el sector
lateral, mientras que a las 15 semanas se observó una gliosis reactiva astrocitaria manifiesta en ambas
regiones. Barra de escala: 100 µm.
110
Resultados
Figura 65. Análisis cuantitativo de la complejidad celular astrocitaria. Se analizaron los mismos
parámetros que en la Figura 61. A las 6 semanas de hipertensión ocular, se observó una marcada
respuesta astrocitaria en la porción medial del CS (evidenciado por un aumento significativo de todos los
parámetros analizados) y una respuesta astrocitaria más leve en la porción lateral (evidenciada sólo por el
aumento en la suma promedio del largo de los filamentos). A las 15 semanas de hipertensión ocular, se
observó un aumento mayor de todos los parámetros analizados, que se extendió hacia la porción lateral
del CS. Se representan las medias ± EE (n = 6 CS/grupo), * p < 0,05 y ** p < 0,01 vs. CS contralateral a
ojos inyectados con vehículo, a: p < 0,05 vs. CS contralateral a ojos inyectados con CSU durante 6
semanas, test de Tukey.
Con el objeto de analizar el efecto de la hipertensión ocular sobre las sub-poblaciones de
oligodendrocitos coliculares, se realizaron estudios inmunohistoquímicos utilizando marcadores
de estadios diferenciales de este tipo celular. El estudio inmunohistoquímico para NG2 (que
permite identificar CPOs y preMOs (polidendrocitos)), reveló un aumento marcado de este
parámetro con una cinética y un perfil espacial similar al observado para Iba1 (Figura 66). Las
cuantificaciones de los diferentes parámetros analizado por IMARIS se muestran en la Figura 67.
Los niveles de NG2 aumentaron significativamente en la porción lateral del CS a las 6 semanas,
y en la porción medial y lateral a las 15 semanas de glaucoma experimental.
111
Resultados
Figura 66. Estudio de la complejidad celular de los polidendrocitos coliculares. Se muestran imágenes
representativas del análisis por IMARIS de la inmunomarcación para NG2 en el CS contralateral a ojos
inyectados con vehículo o CSU durante 6 ó 15 semanas. La inmunorreactividad para NG2 aumentó en el
CS lateral en un estadío temprano de hipertensión ocular y en el CS medial y lateral, luego de 15 semanas
de glaucoma experimental. Barra de escala: 50 m.
112
Resultados
Figura 67. Análisis cuantitativo de la complejidad celular de los polidendrocitos. Se analizaron los
mismos parámetros que en la Figura 61. A las 6 semanas de hipertensión ocular se observó una marcada
respuesta NG2(+) en la porción lateral del CS, a excepción de la suma del volumen de los filamentos que
no resultó significativa. A las 15 semanas, se observó un aumento significativo en todos los parámetros,
tanto en la porción medial como en la porción lateral del CS, con excepción del área y el volumen de los
filamentos del sector medial del CS que no difirieron significativamente del vehículo. Se representan las
medias ± EE (n = 6 CS/grupo), ** p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con vehículo, a: p <
0,05 y b: p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con CSU durante 6 semanas, test de Tukey.
Los resultados de la inmunorreactividad para O1 en los distintos sectores y capas de
mayor densidad axonal del CS se muestran en las Figuras 68 y 69. A las 6 semanas de
hipertensión ocular, se observó un aumento de este parámetro en la región medial y lateral del
CS que se localizó en el SO superficial y en el SGI que persistió a las 15 semanas de
hipertensión ocular y se extendió desde sus extremos hacia el sector medio-lateral del colículo.
113
Resultados
Figura 68. Análisis inmunohistoquímico para O1. En el panel superior se muestran imágenes
topográficas representativas del CS de animales que recibieron vehículo o CSU en el ojo contralateral por
6 ó 15 semanas. En el panel inferior se muestran detalles de los sectores y capas analizados. Se observó
un claro aumento en la inmunorreactividad para O1 en el sector medial y lateral del CS a las 6 semanas de
hipertensión ocular, que se extendió medio-lateralmente en etapas más tardías de glaucoma experimental.
Barras de escala: 1mm (panel superior) y 50 m (panel inferior).
114
Resultados
Figura 69. Análisis cuantitativo de la inmunomarcación para O1 en el CS. Se determinó el área O1(+) en
las porciones medial, medio-lateral y lateral de las capas SO y SGI. El glaucoma experimental por 6 ó 15
semanas indujo un aumento significativo de este parámetro en casi todas las capas y sectores analizados,
con excepción del sector medio-lateral, en el que la inmunomarca para O1 aumentó significativamente en
e1 SO sólo a las 15 semanas de hipertensión ocular. Se representan las medias ± EE (n = 8 CS/grupo), * p
< 0, 05 y ** p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con vehículo, test de Student.
La superposición de estas microfotografías con las del transporte de CTB, indicó que las
capas intermedias adyacentes a las regiones del CS con pérdida de marca de la toxina
coincidieron con aquellas en las que se observó sobreexpresión de O1 (Figura 70).
115
Resultados
Figura 70. Superposición de la marca de CTB con la marca para O1 en el CS de animales con 6 ó 15
semanas de tratamiento. Las fechas denotan las áreas O1(+), adyacentes a las capas coliculares
retinorreceptivas con ausencia de marca para CTB, tanto en animales con 6 como con 15 semanas de
hipertensión ocular. Barra de escala: 400 µm.
A continuación, se analizaron los niveles coliculares de MBP. Como se muestra en la
Figura 71A, no se observaron diferencias en la inmunorreactividad para MBP entre los grupos
experimentales en ninguno de los intervalos analizados. Estos resultados fueron confirmados por
un estudio de Western blot para dos isoformas (21 y 18,5 kDa) de la proteína (Figura 71B).
116
Resultados
A
B
Figura 71. Análisis de los niveles de MBP en el CS por inmunofluorescencia y Western blot. Panel A: Se
muestran imágenes representativas de las capas coliculares con mayor densidad de axones mielinizados.
No se observaron diferencias en la inmunorreactividad para MBP entre los grupos experimentales en
ninguna de las capas analizadas. Panel B: Determinación de los niveles de las isoformas de MBP de 21 y
18,5 kDa por Western blot. En el panel inferior se muestran geles representativos. En el panel superior se
muestra la cuantificación de la densidad óptica de cada una de las isoformas en relación a los niveles de
-actina. No se observaron diferencias significativas entre los grupos experimentales, en ninguno de los
intervalos analizados para ninguna isoforma. Se representan las medias ± EE (n = 5 CS/grupo).
117
Resultados
En la siguiente serie de experimentos, se analizó el contenido lipídico en las capas de
mayor densidad axonal del CS a través de la marcación con Red Oil. En la Figura 72 se muestran
detalles de los sectores y capas analizados con un procedimiento análogo al de la Figura 68.
A
B
Figura 72. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre el contenido lipídico del CS. Panel A: A la
izquierda, se muestra un corte coronal de cerebro coloreado con Red Oil (Barra: 1 mm) y a la derecha,
una magnificación de la imagen a nivel del CS. Los recuadros indican las áreas de las capas SO y SGI
analizadas (Barra de escala: 400 µm). Panel B: Se muestran detalles de las capas y sectores luego de 6 ó
15 semanas de tratamiento con vehículo o CSU. La hipertensión ocular indujo una reducción del
contenido lipídico del SGI en todos los sectores analizados del CS, tanto a las 6 como a las 15 semanas de
tratamiento. En el SO este efecto fue más moderado y restringido a la porción lateral del CS para ambos
períodos. Barra de escala: 50 µm.
118
Resultados
Los resultados obtenidos indicaron una pérdida del contenido lipídico principalmente en
el SGI, tanto a las 6 como a las 15 semanas de hipertensión ocular crónica. El SO resultó la capa
menos afectada y sólo se observó una disminución significativa del contenido lipídico en la
porción lateral del CS en ambos intervalos (Figura 73).
Figura 73. Cuantificación de la tinción con Red-Oil a nivel del CS. En el SO, el tratamiento con CSU
durante 6 ó 15 semanas indujo una reducción significativa de la marca de Red Oil en la porción lateral.
Esta disminución fue más extendida en el SGI, y a las 6 semanas abarcó las áreas medial, medio-lateral y
lateral, pero sólo las dos últimas a las 15 semanas de glaucoma experimental. Se representan las medias ±
EE (n = 6 CS/grupo), * p < 0, 05 y ** p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con vehículo, test
de Student.
119
Resultados
A continuación, se analizó la ultraestructura de los axones de las CGRs que ingresan por
el tracto óptico a nivel de la porción lateral del CS. A las 15 semanas de hipertensión ocular se
observó una profunda desorganización de la ultraestructura de la región lateral del CS a nivel del
neuropilo y de los axones, que presentaron formas irregulares, frecuentes sectores de mielina
descompactada, con separación de las lamelas de las vainas. En otros casos, se observaron
acúmulos de mielina (Figura 74).
A
B
Figura 74. Estudio ultraestructural de la porción lateral del CS. Panel A: Se muestran imágenes
representativas de CS que recibieron aferencias del ojo tratado con vehículo o CSU por 15 semanas.
Barras de escala (de izquierda a derecha): 4µm; 1 µm; 0,4µm y 0,4µm. Panel B: Se esquematiza el
plano de corte parasagital utilizado para obtener cortes ultrafinos de axones que ingresan a este nivel al
CS desde el tracto óptico. Nótese la cantidad de axones mielinizados y el escaso neuropilo en el CS
contralateral al ojo inyectado con vehículo (A: fila superior). A mayor aumento, se observaron axones
principalmente en corte transversal (redondeados/ovoides) y algunos en corte longitudinal, en los que la
mielina presentó una estructura compacta y el interior del axón se encontró preservado, observándose en
el axoplasma neurofilamentos, microtúbulos y mitocondrias (M). La porción lateral del CS con aferencias
del ojo hipertenso (B: fila inferior), presentó una menor densidad de axones a expensas de una mayor
extensión del neuropilo, que en muchos casos presentó espacios que no resultaron electrón-densos
(asteriscos). En algunos casos, los axones presentaron formas irregulares con mielina descompactada
(puntas de flecha negras) y en otros casos, se observaron acúmulos de mielina en axones degenerados o
en degeneración (puntas de flecha blancas). Imágenes representativas de 4 CS/grupo.
120
Resultados
A continuación, se determinó el estado axonal y neuronal en diversos sectores del CS, a
través de un estudio de inmunofluorescencia para pNF-H y NeuN, respectivamente. En la Figura
75 se muestran microfotografías representativas de la inmunorreactividad para pNF-H en
imágenes topográficas del CS y por sectores, en las dos capas de mayor densidad axonal. La
cuantificación de los resultados se muestra en la Figura 76. La inmunorreactividad para pNF-H,
se redujo significativamente a las 15 (pero no 6) semanas de glaucoma crónico en casi todos los
sectores de las dos capas analizadas, con excepción del sector medial en el SGI, en donde la
reducción del área pNF-H(+) no resultó significativa.
Figura 75. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre la inmunorreactividad para pNF-H en el CS. En
el panel superior se muestran imágenes topográficas representativas de animales que recibieron vehículo
o CSU en el ojo contralateral por 6 ó 15 semanas. En el panel inferior se muestran detalles del SO y SGI
en todos los sectores (medial, medio-lateral y lateral). A las 6 semanas de hipertensión ocular, la
inmunorreactividad para pNF-H no difirió entre los grupos experimentales, en ninguno de los sectores y
121
Resultados
en ninguna de las capas, en tanto que las 15 semanas, este parámetro se redujo en todas las áreas
analizadas. Barra de escala: 50 m.
Figura 76. Cuantificación de la inmunorreactividad para pNF-H en el CS. El área pNF-H(+) se redujo
significativamente a las 15 (pero no 6) semanas de glaucoma crónico en todos los sectores analizados del
SO y en el sector medio-lateral y lateral del SGI. Se representan las medias ± EE (n = 6 CS/grupo). ** p <
0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con vehículo, test de Student.
A las 15 semanas de hipertensión ocular, el número de células NeuN(+) no se modificó
significativamente en ninguna de las áreas evaluadas (Figura 77). Sin embargo, en la porción
lateral del CS se observó cualitativamente el encogimiento de algunas neuronas.
122
Resultados
Figura 77. Estudio de la inmunorreactividad para NeuN en el CS de animales con 15 semanas
hipertensión ocular. En el panel izquierdo se muestran imágenes representativas en la porción medial y
lateral del CS (Barra de escala: 50 m). En el panel derecho se muestra la cuantificación del número de
células NeuN(+). No se observaron diferencias significativas en este parámetro entre los grupos
experimentales, en ninguno de los sectores analizados. Se representan las medias ± EE (n = 5 CS/grupo).
2.1.3. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel retiniano
En la siguiente serie de experimentos, se analizó la expresión de diferentes marcadores
gliales en la retina de ojos hipertensos. Los estudios que se describirán a continuación se
realizaron luego de 3 y 6 semanas de glaucoma experimental. Se determinó la
inmunorreactividad para Iba1, ED1, GFAP y nestina en cortes transversales de retinas.
En la Figuras 78 se muestran imágenes representativas de la inmunorreactividad para Iba1 y ED1 y la cuantificación de los resultados obtenidos. En la retina interna (CCG y CPI) de
animales que recibieron vehículo o CSU en el ojo contralateral por 3 semanas, se observó
inmunorreactividad para Iba-1 en un número moderado de células microgliales con finos
123
Resultados
procesos, en tanto que a las 6 semanas de hipertensión ocular, aumentó el número de células Iba1(+) con citoplasma hipertrofiado. No se observaron niveles apreciables de ED1 en las retinas
que recibieron vehículo o CSU por 3 semanas, en tanto que luego de 6 semanas de hipertensión
ocular, los niveles de ED1 aumentaron en forma ubicua, principalmente en la CCG, CPI, CPE y
EP. A las 6 (pero no 3) semanas, la hipertensión ocular indujo un aumento significativo del área
Iba1(+) y ED1(+), que fue significativamente mayor a las 6 que a las 3 semanas de
administración de CSU (Figura 78).
Iba-1
Figura 78. Efecto de la hipertensión ocular sobre la expresión de Iba-1 y ED1 retinianos a las 3 ó 6
semanas de tratamiento con vehículo o CSU. En el panel superior se muestran imágenes representativas
de cortes transversales de retinas. La hipertensión ocular por 6 (pero no 3) semanas indujo un aumento
marcado en la inmunorreactividad de Iba-1 en la retina interna y de ED1 con distribución ubicua. En el
124
Resultados
panel inferior se muestra la cuantificación del área Iba-1(+) y ED1(+). La hipertensión ocular por 6 (pero
no 3) semanas aumentó significativamente los niveles de Iba-1 y ED1. Se representan las medias ± EE
(n = 5 retinas/grupo). ** p < 0,01 vs. retinas de animales inyectados con vehículo y a: p < 0,01 vs. retinas
de animales inyectados con CSU por 3 semanas, test de Tukey.
A continuación, se analizaron los niveles retinianos de GFAP y nestina. Los resultados se
muestran en las Figuras 79 y 80, respectivamente. En los animales tratados con vehículo, la
inmunorreactividad para GFAP se restringió a los astrocitos de la capa de fibras. En cambio,
tanto a las 3 como a las 6 semanas de hipertensión ocular, se observó un aumento en la
inmunorreactividad para GFAP en los procesos de las células de Müller, que se extendieron
desde la capa de fibras a la CPE (Figura 79).
Figura 79. Efecto del glaucoma experimental sobre la expresión retiniana de GFAP. En las retinas de
ojos inyectados con vehículo, se observó la presencia de GFAP en los astrocitos de la capa de fibras, en
tanto que en las retinas de ojos con 3 y 6 semanas de hipertensión ocular, se observó inmunorreactividad
para GFAP en los procesos de las células de Müller. Imágenes representativas de 4 retinas/grupo.
Se observó expresión de nestina en la capa de fibras en las retinas de todos los grupos
experimentales, en tanto que en animales con 6 semanas de hipertensión ocular, se observó
inmunorreactividad para nestina también en procesos de células de Müller (Figura 80).
125
Resultados
Figura 80. Efecto del glaucoma experimental sobre la expresión de nestina en retinas de ojos con 3 ó 6
semanas de hipertensión ocular. Se muestran imágenes representativas de cortes transversales. En todos
los grupos, la inmunorreactividad para nestina se localizó en la capa de fibras y la CCG, en tanto que en
retinas con 6 semanas de hipertensión ocular también se observaron procesos de células de Müller
nestina(+). Imágenes representativas de 4 retinas/grupo.
2.1.4. Tratamiento con minociclina
Los resultados presentados hasta aquí demuestran una marcada respuesta microglial a
nivel de la retina, el NO proximal y el CS en etapas tempranas de hipertensión ocular. Sobre la
base de estos resultados, en la siguiente serie de experimentos se administró minociclina (MINO)
o vehículo (solución salina, (SS)), en forma intraperitoneal, a partir de la cuarta semana de
hipertensión ocular, diariamente, durante dos semanas. En la Figura 81 se muestra el efecto de la
MINO sobre la PIO. El tratamiento con MINO no afectó este parámetro tanto en ojos
normotensos como hipertensos.
Figura 81. Efecto de la MINO sobre la PIO. La administración de MINO no modificó la PIO de los ojos
tratados con vehículo (veh) o CSU. SS: solución salina. Se representan las medias ± EE (n = 5
126
Resultados
ojos/grupo). ** p < 0,01 vs. ojos de animales inyectados con vehículo, test de Tukey.
A continuación, se analizó el efecto de la MINO sobre la inmunorreactividad para Iba-1 y
ED1 en retinas de ojos hipertensos y se cuantificó el área Iba-1(+) y ED1(+) (Figura 82). La
MINO no previno el aumento en los niveles retinianos de Iba-1, pero evitó completamente el
aumento en los niveles retinianos de ED1 inducido por la hipertensión ocular.
A
B
Figura 82. Efecto de la MINO sobre la inmunorreactividad para Iba-1 y ED1. Panel A: Se muestran
microfotografias representativas de retinas para cada grupo experimental. Panel B: Se muestra la
cuantificación del área Iba-1(+) y ED1(+). La MINO previno el aumento en la inmunorreactividad para
ED1 inducido por la hipertensión ocular, pero no afectó la inmunorreactividad para Iba-1. Se representan
las medias ± EE (n = 4 retinas/grupo), * p < 0,05 vs. ojos de animales inyectados con vehículo, a: p < 0,05
vs. ojos inyectados con CSU en animales que recibieron SS i.p, test de Tukey.
127
Resultados
El efecto de la MINO sobre las alteraciones inducidas por el glaucoma experimental en el
NO proximal se muestran en las Figuras 83 y 84. La MINO previno parcial, pero
significativamente el aumento del área Iba-1(+) y ED1(+) en el NO inducido por la hipertensión
ocular (Figuras 83).
A
B
Figura 83. Efecto de la MINO sobre la inmunorreactividad para Iba-1 y ED1 en el NO proximal. Panel
A: Se muestran microfotografías representativas del NO en corte transversal. Panel B: Se muestra la
cuantificación del área Iba-1(+) y ED1(+). La MINO redujo significativamente el aumento en la
inmunorreactividad para Iba-1 y ED1 inducido por la hipertensión ocular. Se representan las medias ± EE
(n = 4 nervios/grupo), ** p < 0,01 vs. NOs de ojos inyectados con vehículo, a: p < 0,01 vs. NOs de ojos
inyectados con CSU en animales tratados con solución salina (SS) i.p., test de Tukey.
128
Resultados
Asimismo, la MINO previno el aumento en el área GFAP(+) y la disminución de la
inmunorreactividad para pNF-H inducidos por la hipertensión ocular (Figura 84).
A
B
Figura 84. Efecto de la MINO sobre la inmunorreactividad para GFAP y pNF-H en el NO. Panel A: Se
muestran imágenes representativas. Panel B: Se muestra la cuantificación del área GFAP(+) y pNF-H (+).
La minociclina per se redujo significativamente la inmunorreactividad para GFAP en NOs de ojos
inyectados con vehículo y previno completamente el aumento de este parámetro en NOs de ojos
hipertensos. La MINO previno completamente la disminución en la inmunorreactividad para pNF-H
inducida por hipertensión ocular. Se representan las medias ± EE (n = 4 nervios/grupo), ## p < 0,01 vs.
NOs de ojos inyectados con vehículo de animales tratados con SS, ** p < 0,01 vs. NOs de ojos inyectados
con vehículo de animales tratados con SS o MINO, a: p < 0,01 vs. NOs de ojos inyectados con CSU de
animales tratados con SS, test de Tukey.
129
Resultados
A continuación, se determinó el efecto de la MINO sobre las células microgliales y
astrocitos del CS. Como se muestra en la Figura 85, la MINO previno el aumento en la
inmunorreactividad para Iba-1 inducido por la hipertensión ocular en el sector lateral del CS. En
la Figura 86 se muestra la cuantificación por IMARIS. La MINO previno completamente el
aumento en todos los parámetros analizados, a excepción de la suma del volumen de los
filamentos Iba-1(+), en la que el efecto de la MINO fue parcial.
Figura 85. Efecto de la MINO sobre la complejidad de la microglía del CS. Se muestran imágenes
representativas de la porción medial y lateral del CS de animales tratados con vehículo o minociclina. En
los cuatro cuadrantes de la Figura, la primera columna representa los z-stack de las imágenes confocales,
la tercera (en fondo gris) el análisis de los filamentos microgliales (en azul) con el software IMARIS y la
del medio, la superposición de las dos columnas antes mencionadas. La MINO previno la activación
microglial inducida por CSU en la región lateral del CS. Barra de escala: 50 µm.
130
Resultados
Figura 86. Análisis cuantitativo de la complejidad microglial. Se analizaron los mismos parámetros que
los descriptos en las Figura 61. La MINO previno el aumento inducido por la hipertensión ocular de todos
los parámetros. Se representan las medias ± EE (n = 5 CS/grupo), * p < 0,05 y ** p < 0,01 vs. CS
contralateral a ojos inyectados con vehículo, a: p < 0,05 y b: p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos
inyectados con CSU de animales tratados con SS, test de Tukey.
En las Figuras 87 y 88 se muestra el efecto de la MINO sobre la reactividad astrocitaria
inducida por 6 semanas de hipertensión ocular en el CS. La MINO previno el aumento en la
inmunorreactividad para GFAP en la porción medial y lateral del CS y el aumento de todos los
parámetros evaluados en ambos sectores del CS. En el sector lateral del CS, la MINO previno
parcialmente el aumento inducido por la hipertensión ocular de todos los parámetros evaluados.
En el sector medial, la MINO previno completamente el aumento de la suma de la longitud de
los filamentos, el número de puntos de ramificación, el número total de segmentos y de puntos
terminales. La suma del área y el volumen disminuyeron parcialmente con el tratamiento con
MINO en este sector.
131
Resultados
Figura 87. Estudio de la complejidad de la morfología celular en astrocitos inmunomarcados para GFAP.
Se muestran imágenes representativas de la porción medial y lateral del CS de animales tratados con o
vehículo o MINO: z-stacks, análisis de los filamentos (en azul con fondo gris) y la superposición de
ambos. La MINO previno la activación astrocitaria inducida por CSU en la región medial y lateral del CS.
Barra de escala: 50 µm.
132
Resultados
Figura 88. Análisis cuantitativo de la complejidad celular astrocitaria. Se analizaron los mismos
parámetros que en la Figura 61. La MINO previno parcialmente el aumento de todos los parámetros a
nivel de la porción lateral del CS y del aumento de la suma del área y el volumen de los procesos
GFAP(+) de la porción medial del CS y evitó completamente el aumento en el número total de los puntos
de ramificación, de los segmentos de los filamentos y los puntos terminales GFAP(+) de la porción
medial del CS. Se representan las medias ± EE (n = 5 CS/grupo), * p < 0,05 y ** p < 0,01 vs. CS
contralateral a ojos inyectados con vehículo, a: p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con CSU
de animales tratados con SS, test de Tukey.
Finalmente, se determinó el transporte anterógrado de CTB a las 6 semanas de
hipertensión ocular en animales tratados con MINO. La minocilina previno las alteraciones en el
transporte axonal inducidas por la hipertensión ocular (Figura 89).
133
Resultados
Figura 89. Efecto de la MINO sobre el transporte anterógrado al CS. Se muestra la reconstrucción del CS
de animales inyectados bilateralmente con CTB de un animal intacto, un animal con 6 semanas de
hipertensión unilateral y un animal con hipertensión ocular unilateral tratado con MINO. La MINO
previno la caída del transporte inducida por la hipertensión ocular.
2.2. Sistema visual no formador de imagen
Con el objeto de analizar la función del sistema visual no formador de imagen en el
modelo de glaucoma experimental inducido por CSU, en la primera serie de experimentos se
evaluó el número de células melanopsina(+) en retinas de ojos con 15 semanas de hipertensión
ocular. En la Figura 90 se muestran imágenes representativas de retinas en montaje plano
inmunomarcadas para melanopsina. A las 15 semanas, la hipertensión ocular crónica indujo una
disminución significativa del número total de CGRsm (1374 ± 74 y 763 ± 146 células
melanopsina(+) en ojos inyectados con vehículo o CSU, respectivamente; ** p < 0,01, test de
Student, n = 4 ojos/ grupo). Estos resultados fueron confirmados por Western blot, como se
134
Resultados
muestra en la Figura 91. Luego de 15 semanas de hipertensión ocular, se observó una
disminución significativa y comparable en los niveles retinianos de Brn3a y melanopsina.
Figura 90. Estudio de la inmunorreactividad para melanopsina en retinas de ratas inyectadas con vehículo
o CSU durante 15 semanas. En el panel superior se muestra un esquema de la distribución de células
melanopsina(+) en retinas de ojos inyectados con vehículo (A) o CSU (B) y las áreas de las que se
tomaron los detalles (C) y (D) del panel inferior, respectivamente. La melanopsina se localizó en el soma
celular, en axones y dendritas. Luego de 15 semanas de tratamiento con CSU (B, D) se observó un menor
número de CGRs melanopsina(+) respecto a los ojos inyectados con vehículo (A, C). S: superior, I:
inferior, N: nasal, T: temporal.
Figura 91. Análisis de los niveles proteicos de melanopsina y Brn3a en retinas con hipertensión ocular
crónica unilateral por 6 ó 15 semanas. En el panel de la derecha se muestran las medias ± EE de los
135
Resultados
niveles de estas proteínas relativos a los niveles de -actina, y en el de la izquierda se muestran Western
blots representativos (n = 5 retinas/grupo). A las 15 (pero no a las 6) semanas de tratamiento con CSU,
tanto los niveles de melanopsina como los de Brn3a disminuyeron significativamente, respecto del grupo
inyectado con vehículo, ** p < 0,01 vs. ojos inyectados con vehículo, test de Tukey.
Con el objeto de evaluar las proyecciones de las CGRsm, se evaluó el transporte
anterógrado de CTB a los NSQ y el NPO. Los resultados obtenidos indicaron un déficit en el
transporte anterógrado de CTB desde la retina a los NSQ luego de 6 ó 15 semanas de
hipertensión ocular (Figura 92). Un perfil similar se observó a nivel del NPO, como se muestra
en la Figura 93.
Figura 92. Transporte anterógrado de CTB a los NSQ. Se muestran secciones coronales a nivel de
los NSQ enmarcados con línea punteada de un animal representativo de cada grupo (4
animales/grupo). El transporte de CTB fue menor en los NSQ de animales con 6 ó 15 semanas de
hipertensión ocular.
Figura 93. Transporte anterógrado de CTB al NPO luego de 6 ó 15 semanas de glaucoma experimental.
Se muestran imágenes representativas (4 animales/grupo) en cortes coronales para cada grupo
experimental. La hipertensión ocular crónica indujo una reducción del transporte de CTB, tanto a las 6
como a las 15 semanas de tratamiento con CSU.
136
Resultados
Finalmente, se evaluó el reflejo pupilar consensual en animales que fueron inyectados
con CSU o vehículo durante 15 semanas, en tanto que en ambos casos, el ojo contralateral
permaneció intacto. Como se muestra en la Figura 94, un estímulo de 1200 lux, indujo una
disminución en la contracción de la pupila de ojos contralaterales a ojos hipertensos.
Figura 94. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre el reflejo pupilar. El tratamiento con CSU por 6
ó 15 semanas indujo una reducción significativa en el porcentaje de contracción pupilar inducido por un
estímulo de 1200 lux. Se muestran las medias ± EE (n = 5 ojos/grupo), ** p < 0,01 vs. ojos inyectados
con vehículo, test de Tukey.
137
Discusión
DISCUSIÓN
En este trabajo de Tesis se examinaron los efectos del glaucoma experimental agudo y
crónico sobre el sistema visual consciente y las áreas de proyección retinianas, así como sobre el
sistema visual no formador de imagen. Se discutirán a continuación los resultados obtenidos en
función de los objetivos planteados.
1. Modelo experimental de glaucoma agudo
El glaucoma agudo, una forma menos frecuente de la enfermedad que el glaucoma de ángulo
abierto, es consecuencia de una elevación abrupta y pronunciada en la PIO, que causa dolor
ocular intenso, su desarrollo es mucho más rápido, sus consecuencias suelen ser más
devastadoras sobre la visión y por lo tanto, requiere atención médica de urgencia. El aumento de
PIO en la cámara anterior es un modelo frecuentemente utilizado para la investigación de la
isquemia retiniana (Fernandez y col., 2009; Rosenbaum y col., 2001), pero también ha sido
utilizado como modelo experimental de glaucoma agudo, cuya etiología es esencialmente de
naturaleza isquémica. Esta última hipótesis se basa en la observación de que en animales en los
que se induce un aumento pronunciado de la PIO, incluso por intervalos relativamente breves (en
el rango horas), se produce un daño retiniano similar al que se observa en el glaucoma agudo
humano. En este contexto, con el fin de inducir un glaucoma agudo experimental, se aumentó la
PIO a 70 mm de Hg durante 90 min. La elección de estas condiciones experimentales se basó en
trabajos de otros autores (Bui y col., 2005; Fortune y col., 2011; Kong y col., 2009; Yang y col.,
2011). Los resultados obtenidos avalan la hipótesis de que en estas condiciones experimentales,
la HOA reproduce características centrales del glaucoma agudo humano, particularmente una
pérdida irreversible de la visión, como lo demuestran los resultados obtenidos en cuanto a la
estructura y función retiniana, similares a los obtenidos por otros autores (Kim y col., 2013). En
nuestras condiciones experimentales, la HOA provocó una caída significativa en la amplitud de
las ondas a y b del ERG y de los POs junto con marcadas alteraciones histológicas, que
138
Discusión
persistieron sin cambios evidentes incluso luego de 2 semanas de esta maniobra. Según Lafuente
y colaboradores (2002), la muerte de las CGRs luego de 45 min de un aumento agudo en la PIO
es máxima entre los 7 y 14 días post-HOA. Si bien las otras capas retinianas también fueron
susceptibles a la HOA, el estudio inmunohistoquímico contra la proteína Brn3a (un marcador
específico de CGRs) (Nadal-Nicolás y col., 2009), demostró que este tipo celular resultó el más
vulnerable, como se confirmó por la detección de células apoptóticas (TUNEL(+)) únicamente
en la CCG. El daño inducido por la HOA también se manifestó a nivel del transporte axonal,
como lo evidenció una alteración notable en la marca de CTB en el CS contralateral al ojo
expuesto al aumento agudo de la PIO. La HOA impactó significativamente sobre la estructura
del CS, donde se observaron alteraciones micro- y macrogliales evidentes ya a los 7 días posttratamiento, con resultados similares luego de 2 ó 4 semanas post-aumento de la PIO.
Estudios previos han demostrado que la transección del NO, la enucleación o la inyección
intravítrea de NMDA provocan astrogliosis en el CS (McLoon, 1986; Rao y Lund, 1989;
Schmidt-Kastner y col.,1993; Tanaka y col., 2009), junto con la sobre-expresión de antígenos
microgliales, como el complejo mayor de histocompatibilidad II (Rao y Lund, 1989) y la
integrina -M/-2 (OX-42/CD11b) (Hernandes y Britto, 2014). Si bien aún quedan por evaluar
los cambios a nivel de las neuronas coliculares, los resultados obtenidos confirman una de las
hipótesis centrales de este trabajo, que es el impacto del glaucoma sobre las áreas de proyección
retiniana, en particular en las áreas retinorreceptivas del CS. Como ya se mencionó, el glaucoma
agudo desencadena una pérdida brusca e irreversible de la visión y por lo tanto, considerando la
clara afectación de la retina, las alteraciones a nivel cerebral podrían resultar “menos
significativas” en cuanto a convertirse en un blanco terapéutico necesario. Sobre la base de los
resultados obtenidos, es factible que los efectos de la HOA sobre las áreas de proyección
retiniana sean una consecuencia de un déficit en el input sináptico, ya evidenciado a los 7 días de
tratamiento, aunque no se puede descartar formalmente un efecto directo de la HOA sobre los
139
Discusión
centros cerebrales visuales. En este sentido, el conjunto de alteraciones observadas en el modelo
de glaucoma agudo ocurrieron en una forma “demasiado acelerada” y sincrónica (al menos en la
ventana temporal analizada), como para discriminar exhaustivamente la secuencia espaciotemporal de los eventos. De acuerdo a estos resultados, es tentador especular que en la ceguera
producida por este tipo de afección, probablemente contribuyan todas las estructuras
involucradas (la retina, el NO y el CS), aspecto que no había sido previamente examinado.
Considerando la velocidad y magnitud de estos cambios, no resultó pertinente una evaluación
más detallada en estas condiciones experimentales. En cambio, se obtuvieron resultados
inesperados en cuanto a la evaluación del sistema visual no formador de imagen, como se
discutirá más adelante.
2. Modelo experimental de glaucoma crónico
En una primera serie de experimentos, se desarrolló un modelo de glaucoma crónico
experimental a través de la inyección de CSU en la cámara anterior. Los resultados obtenidos
indican que una única inyección de CSU en la cámara anterior del ojo de rata aumentó
significativamente la PIO en comparación con los ojos inyectados con vehículo, en forma
dependiente de la dosis. Una inyección única de una solución de CSU al 40% indujo una
hipertensión ocular que persistió durante 7 días, alcanzando valores similares al control en el 8vo
día post-inyección. Aunque el destino intraocular del CSU es aún desconocido, el lento descenso
de la PIO observado después de una inyección única, sugiere que el CSU podría salir de la
cámara anterior a través del flujo de humor acuoso y/o ser degradado por una actividad de
condroitinasa local.
Con el fin de mantener un aumento sostenido de la PIO, característico del glaucoma
crónico de ángulo abierto humano, se realizaron inyecciones semanales de CSU. La PIO de los
ojos tratados semanalmente con CSU alcanzó un nivel de estado estacionario similar al
provocado por una inyección única de CSU, que fue significativamente mayor que la PIO de los
140
Discusión
ojos inyectados con vehículo y se prolongó a lo largo de toda la duración del estudio. Se ha
demostrado que inyecciones repetidas de CSU (9 mg/ojo) en la cámara anterior de ojos de gato
aumentan la PIO en 4 a 7 mm de Hg por encima de la de los ojos control (Fei y col., 1984), en
tanto que en ojos de ratas se observó un incremento de casi un 100% (~ 10 mm de Hg) en ojos
inyectados con CSU al 40% (8 mg/ojo). Dado que la cámara anterior del ojo de rata es más
estrecha, la mayor hipertensión ocular provocada por CSU en la rata que en el gato podría
atribuirse al hecho de que las concentraciones intracamerales “reales” de CSU en el ojo de rata
podrían ser superiores a las alcanzadas en el ojo de gato. Además, no puede descartarse una
menor capacidad de remoción de CSU en la cámara anterior del ojo de la rata.
La eficacia del CSU para aumentar la PIO en la rata fue similar a la obtenida a través de
inyecciones de AH, como se describió previamente en nuestro laboratorio (Benozzi y col.,
2002). Sin embargo, para alcanzar una hipertensión ocular similar, fue necesaria una mayor
concentración de CSU (40%) que de AH (1%). El dominio de AH es dependiente de la
concentración y forma una red polimérica continua a una concentración de 1 mg/ml. Por el
contrario, el dominio de CSU es limitado y adquiere una configuración de “cepillo para botellas”
sin formar una red polimérica. Además, numerosas moléculas de CSU se unen a una sola
columna vertebral de AH para formar el agregado de un proteoglicano típico (Lau y col., 2013).
Por lo tanto, es esperable que la dosis de CSU necesaria para aumentar la PIO sea mucho mayor
que la de AH. Por otra parte, además de las diferencias estructurales, diferencias en el turnover
de estos dos GAGs podrían explicar esta observación. A pesar de las concentraciones
relativamente altas de CSU necesarias para inducir una hipertensión ocular sostenida, no se
observaron signos de inflamación en la cámara anterior de los ojos inyectados crónicamente con
CSU.
Se ha sugerido que los GAGs pueden reducir el diámetro funcional de los canales de flujo
a través de los espacios esclero-corneales inter-trabeculares profundos y/o regular el flujo a
141
Discusión
través de la membrana basal juxtacanalicular. Por lo tanto, es posible que el CSU inyectado en
forma intracameral actúe de manera similar al CSU endógeno (es decir, impidiendo el flujo
normal de humor acuoso). En concordancia con estos resultados, se ha demostrado que la
inhibición de la enzima que cataliza la biosíntesis de CSU induce un aumento en el flujo de
salida de humor acuoso en ojos humanos y porcinos in vitro (Keller y col., 2011).
La hipertensión ocular desempeña un rol causal, aunque no necesariamente exclusivo, en
la pérdida visual glaucomatosa. De hecho, no todos los modelos experimentales de hipertensión
ocular crónica causan las mismas alteraciones en el sistema visual. Por lo tanto, los siguientes
experimentos se realizaron con el fin de evaluar las consecuencias de la hipertensión ocular
crónica inducida por inyecciones semanales de CSU sobre la función e histología retiniana.
Diversas evidencias indican que algunos componentes del ERG pueden ser afectados en
modelos experimentales de glaucoma. En un modelo de glaucoma crónico inducido por oclusión
de tres venas epiesclerales en ratas, se demostró una disminución significativa de la amplitud de
las ondas a y b del ERG (Bayer y col., 2001a). Cambios similares en el ERG de flash se
demostraron en el ratón DBA/2J (Bayer y col., 2001b) y en ojos inyectados crónicamente con
AH en la cámara anterior (Moreno y col., 2005a). Por otra parte, Viswanathan y colaboradores
(2000) demostraron cambios en el ERG que se correlacionan con las respuestas en el ERG
pattern en un modelo de glaucoma en monos inducido por aplicación de láser en el trabeculado.
Asimismo, se ha descripto una reducción significativa en la amplitud de la onda b del ERG
escotópico en ratas Brown Norway con inyección de solución salina hipertónica en una vena
epiescleral (Chauhan y col., 2002). En concordancia con estos resultados, inyecciones crónicas
de CSU indujeron una disminución significativa en la amplitud de las ondas a y b del ERG
escotópico, que fue evidente ya a las 6 semanas de tratamiento. Además, la reducción adicional
de estos parámetros después de 10 y 15 inyecciones semanales de CSU, sugiere que la
hipertensión ocular crónica provocó una disfunción retiniana progresiva, una característica
142
Discusión
compatible con el glaucoma crónico humano. Un perfil similar se obtuvo en el registro de los
POs en ojos con hipertensión ocular inducida por CSU. Si bien el origen de los POs no ha sido
concluyentemente elucidado, es posible que esta señal se origine en las vías de feedback
neuronal en la retina interna, especialmente en la CPI y principalmente a partir de las células
amácrinas, aunque también podrían contribuir las CGRs y las células bipolares (Wachtmeister,
1998). En conjunto, los resultados obtenidos demuestran una alteración funcional retiniana
significativa y progresiva, que resultó evidente en etapas tempranas de hipertensión ocular (es
decir, a partir de las 6 semanas tratamiento con CSU).
Los VEPs reflejan la actividad de todas las células de la vía óptica desde los
fotorreceptores a la corteza visual, incluyendo a las CGRs y sus axones. En humanos se ha
demostrado que el glaucoma crónico afecta los VEPs, provocando tanto reducciones en la
amplitud (Papst y col., 1984), como aumentos en la latencia (Towle y col., 1983). Sin embargo,
resultados más recientes indican sólo cambios muy sutiles en la latencia de los VEPs asociados
al daño glaucomatoso (Grippo y col., 2006). Los resultados obtenidos en esta Tesis indican
alteraciones significativas en la amplitud (pero no en la latencia) de los componentes P1-N2 y
N2-P2 de los VEPs, que fueron evidentes a las 6 y 15 semanas de hipertensión ocular.
En cuanto a la arquitectura de la retina, se observó un daño significativo limitado a la
CCG en los ojos inyectados con CSU a partir de las 10 semanas de tratamiento. En este sentido,
la diminución en la inmunorreactividad para Brn3a resultó evidente a las 10 y 15 (pero no 6)
semanas de hipertensión ocular, de manera tal que en este modelo experimental y al menos con
las herramientas utilizadas en este trabajo, las alteraciones funcionales (ERG y VEPs)
precedieron a las alteraciones estructurales. En suma, estos resultados indican que inyecciones
semanales de CSU indujeron una elevación moderada y sostenida de la PIO, que provocó
alteraciones significativas sobre la función de la retina (ERG) y de la vía visual (VEPs), así
como sobre la histología retiniana, que reproducen características centrales del glaucoma crónico
143
Discusión
de ángulo abierto en humanos. Asimismo, junto con las evidencias que demuestran mayores
niveles de CSU en la red trabecular de pacientes con glaucoma de ángulo abierto (Knepper y
col., 1996), estos resultados sugieren que el aumento de los niveles de CSU podría desempeñar
un papel clave en la desregulación de la PIO característica de esta forma de glaucoma.
Aunque el glaucoma ha sido concebido como una enfermedad limitada al ojo, los axones
de las CGRs son extraoculares, con componentes intraorbitales e intracraneales. En el sistema
visual, como en otros sistemas cerebrales, la función y supervivencia neuronal depende de las
conexiones con otras neuronas. En este sentido, se ha demostrado una reducción marcada en la
densidad de fibras retinianas procedentes de ojos con glaucoma experimental en el NGLd y el
CS (Drouyer y col., 2008). Si bien la caída en los VEPs a las 15 semanas de hipertensión ocular
podría claramente asociarse a la disminución en el número de CGRs observadas en este período,
la alteración de este parámetro a las 6 semanas de hipertensión ocular, podría atribuirse a una
alteración post-retiniana y/o a una alteración retiniana funcional (pero no histológica).
Asimismo, sobre la base de los resultados obtenidos, es posible que las inyecciones crónicas de
CSU, además de las CGRs, puedan afectar también la estructura y función del NO, como lo
sugiere la alteración en el transporte anterógrado desde la retina al CS y al NGL que fue ya
evidente a las 6 semanas de hipertensión ocular. Resultados similares se describieron en un
trabajo relativamente reciente (Crish y col., 2010), en el que se analizó el transporte anterógrado
de CTB al CS luego de 2 semanas de hipertensión ocular inducida por inyección intracameral de
microesferas de poliestireno en ratas y en el modelo espontáneo de glaucoma (ratón DBA/2J).
En ambos modelos se corroboró la captación activa de CTB en las CGRs. Sin embargo, luego de
sólo dos semanas de hipertensión ocular, el transporte anterógrado en ratas se redujo en un 50 60%, en tanto que en ratones DBA/2J, se observó un déficit del transporte anterógrado al CS a
partir de los 3 - 5 meses de edad en algunos animales y, a los 8 - 10 meses, la mayoría de ellos
tuvieron un déficit significativo de este parámetro, que fue prácticamente completo a los 12
144
Discusión
meses (Crish y col., 2010), con la particularidad de que en este modelo experimental, la pérdida
de CGRs es un evento relativamente tardío que ocurre aproximadamente a los 12 meses de edad
(Libby y col., 2005a, 2005b; Schlamp y col., 2006; Reichstein y col., 2007).
La alteración del transporte axonal en el glaucoma fue descripta por primera vez en los
años 70 (Anderson y Hendrickson, 1974; Minckler y col., 1976, 1977). Desde entonces, se ha
prestado particular atención a la cabeza del NO, que según el “paradigma biomecánico del
glaucoma” podría constituir un “cuello de botella” y ser el sitio más vulnerable a la obstrucción
del flujo axoplásmico, debido a la compresión mecánica de los axones (Burgoyne y col., 2005;
Chidlow y col., 2011; Holländer y col., 1995; Quigley y Addicks, 1980; Quigley y col., 1981).
Sobre la base de esta hipótesis, algunos autores atribuyen la apoptosis de las CGRs a la pérdida
de factores de neurotróficos (principalmente BDNF) derivados retrógradamente desde los
núcleos de proyección central (Pease y col., 2000; Quigley y col., 2000). De hecho, los axones
de las CGRs podrían ser efectivamente más vulnerables a efectos compresivos considerando que
a nivel de la lámina cribosa (o lámina glial en roedores) son amielínicos (revisado por Whitmore
y col., 2005). En algunos modelos experimentales de glaucoma (Bosco y col., 2011; Son y col.,
2010), se han descripto cambios marcados en la reactividad glial a nivel de la cabeza del NO en
etapas tempranas, así como en la ultraestructura de los astrocitos “fortificados” por densas fibras
de filamentos del citoesqueleto, que podrían transducir la hipertensión ocular que opera a este
nivel del NO en el glaucoma (Dai y col., 2011). Se ha postulado que la glía reactiva en la cabeza
del NO altera la composición de la MEC de la lámina (Fuchshofer y col., 2005; Guo y col.,
2005), posiblemente a través de la liberación de citoquinas inflamatorias desde los astrocitos y la
microglía (Bosco y col., 2011; Hernandez, 2000; Tezel y col., 2001; Yuan y Neufeld, 2000), y
por la muerte de oligodendrocitos post-laminares (Nakazawa y col., 2006) que proveerían un
soporte trófico, además de la envoltura aislante en la porción mielinizada del NO (revisado por
Nave, 2010). Aunque no permiten determinar fehacientemente el sitio primario de injuria axonal,
145
Discusión
nuestros resultados demuestran que la disminución del transporte anterógrado es una
manifestación temprana en la porción proximal del NO a la altura de la lámina glial y que
consecuentemente, podría ser responsable de la reducción de la marca de CTB en el CS y el
NGL. Concomitantemente con un déficit en el transporte anterógrado, las proyecciones de los
terminales presinápticos de las CGRs se conservaron, como lo demostró la inmunomarcación
para VgluT-2 en el CS, en forma similar a lo descripto en el modelo de ratones DBA/2J, incluso
en etapas muy tardías de la enfermedad (15 - 22 meses de edad) (Calkins, 2012; Crish y Calkins
2011; Crish y col., 2010, 2013).
Aunque el mecanismo patogénico involucrado en el modelo de glaucoma del ratón
DBA/2J se asocia con la atrofia del iris, la dispersión de pigmento y el desarrollo de sinequias
anteriores periféricas que provocan el cierre progresivo del ángulo irido-corneal (Bouhenni y
col., 2012), lo que difiere marcadamente de los eventos inducidos por las inyecciones de CSU, la
alteración en el transporte axonal desde la retina al CS parece ser una manifestación temprana de
la enfermedad en ambos modelos experimentales. En este sentido, nuestros resultados suman
evidencias a una concepción del glaucoma crónico según la cual, los axones de las CGRs son un
sustrato temprano del daño glaucomatoso, eventualmente anterior a la disminución de los somas.
En este paradigma, la alteración somática podría ser consecuencia (y no causa, como se supuso
originalmente) de la lesión axonal, aunque aún no se dispone de evidencias contundentes
respecto a los mecanismos involucrados en el daño axonal. Si bien como ya se señaló, la
mencionada teoría biomecánica podría explicar la alteración axonal, esta concepción del
glaucoma no provee una interpretación aceptable para la forma de glaucoma de presión normal,
en la que el daño glaucomatoso es similar, pero cursa con una PIO normal, lo que probablemente
sugiera la existencia de mecanismos adicionales y/o alternativos de daño axonal y somático. En
todo caso, por ahora no es posible descartar formalmente que un deterioro subletal de la CGRs
podría afectar la provisión del sustento necesario para sus axones, lo que resultaría en una muerte
146
Discusión
progresiva desde el axón hacia el cuerpo celular; incluso no es posible descartar que las
alteraciones somáticas y axonales inducidas por la hipertensión ocular crónica sean eventos
independientes entre sí. Al presente, no se dispone de herramientas sólidas (específicamente,
marcadores de daño somático) que permitan evaluar estas alternativas. Asimismo, como se
discutirá más adelante, en este trabajo de Tesis hemos demostrado alteraciones gliales en la
retina de ojos hipertensos, también en etapas tempranas de glaucoma experimental inducido por
CSU, que podrían desempeñar un papel activo en la neuropatía glaucomatosa. Sin detrimento de
estas consideraciones, los resultados presentados en este Tesis avalan al NO como un blanco
temprano de daño en el glaucoma crónico experimental, como se discutirá con mayor detalle a
continuación.
2.1. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel del nervio óptico
El análisis histológico del NO demostró un correlato estructural con la disminución del
transporte anterógrado de CTB en la porción proximal del NO. El glaucoma experimental indujo
una disminución moderada pero significativa del número de axones a las 6 semanas, que
progresó a las 15 semanas de hipertensión ocular. De hecho, es posible que la severidad del daño
observado a las 15 semanas explique la reducción del área transversal del NO observada en este
período.
La distribución de los axones en función del área axonal permitió determinar la
susceptibilidad diferencial de los axones más grandes (> 1,5 m2), que ya fueron afectados a las
6 semanas, en tanto que a las 15 semanas de hipertensión ocular se afectó el número de axones
de todos los rangos de área evaluados. Parece poco probable que este resultado pueda atribuirse a
un encogimiento del axoplasma, ya que no se observó un corrimiento hacia axones más
pequeños en la distribución del área axonal. En concordancia con estos resultados, se ha
demostrado una pérdida preferencial de los axones más grandes del NO en otros modelos de
147
Discusión
glaucoma experimental en primates y ratas (Glovinsky y col., 1991; Levkovitch-Verbin y col.,
2002; Moreno y col., 2005a). Resultados preliminares de la cuantificación de axones en la
porción distal del NO que deben confirmarse con experimentos adicionales, indicaron una
preservación de axones en esta porción del NO a las 6 semanas de hipertensión ocular (control:
3103 ± 84; CSU: 2920 ± 62, p = 0,12, test de Student), y una caída significativa de este
parámetro a las 15 semanas de hipertensión ocular (control: 3192 ± 62; CSU: 2506 ± 151, p <
0,01, test de Student), lo que podría sugerir que el daño a nivel distal ocurre más lentamente que
a nivel proximal. Estos resultados difieren de los obtenidos por el grupo de Crish y
colaboradores, que postulan una progresión deletérea desde el axón hacia el cuerpo celular
(mecanismo de dying-back) en el modelo de ratón DBA/2J (Crish y col., 2010; 2013; DenglerCrish y col., 2014) y en el modelo de hipertensión ocular inducido por la inyección de
microesféras en la cámara anterior de ratas (Crish y col., 2010, 2013). Sin embargo, los estudios
de estos autores han sido principalmente funcionales, pero no estructurales, lo que dificulta la
comparación entre los resultados mencionados y los obtenidos en este trabajo de Tesis, sumado a
las diferencias inherentes al modelo experimental utilizado en cada caso.
El análisis ultraestructural permitió analizar el citoesqueleto de los axones, la presencia y
estado de las organelas (principalmente mitocondrias), así como el grado de compactación de la
mielina y los componentes gliales del NO. Las alteraciones ultraestructurales observadas en
función del patrón de degeneración del axoplasma se clasificaron según la presencia de signos de
desintegración focal del citoesqueleto, degeneración laxa (watery degeneration) o degeneración
densa (dark degeneration). La degeneración laxa se caracterizó por una expansión del axolema,
desintegración del citoesqueleto, pérdida de microtúbulos con preservación relativa de los
neurofilamentos, ausencia total o parcial de organelas y reemplazo del axoplasma, en la mayoría
de los casos, por un material amorfo y en apariencia laxo y claro. La degeneración densa se
clasificó en dos subtipos, según se observaran axones en los que el axoplasma aparentemente fue
148
Discusión
reemplazado por un material granular indefinido y electrón-denso, o según se encontraran
completamente degenerados y sin axoplasma, en los que la mielina formó una masa electróndensa y redondeada. Estos tres patrones de degeneración se observaron simultáneamente en los
dos intervalos analizados, aunque a las 15 semanas de hipertensión ocular, las alteraciones
ultraestructurales fueron más marcadas y aparentemente prevaleció la forma de degeneración
densa. Además de estos patrones de degeneración axonal, se observaron axones con alteraciones
en la mielina de varios tipos (axones con mielina fragmentada con/sin exposición del axoplasma
al medio extracelular, axones con áreas de mielina distorsionada y vacuolizada en las que las
lamelas de las vainas se observaron descompactadas o la combinación de ellos). Estas
alteraciones ultraestructurales comparten características con el proceso de degeneración
Walleriana (Carbonell y col., 1991; Liu y Shen, 1985; Narciso y col., 2001; Saggu y col., 2010),
que puede ser desencadenado por noxas de poder deletéreo moderado (lo que podría
homologarse con la situación particular del glaucoma crónico (Salinas-Navarro y col., 2009), así
como con modelos de daño más agresivo, tales como el pinzamiento (crush) (Narciso y col.,
2001) o axotomía (Ma y col., 2013; Waller 1850) del NO. El daño en la mielina podría sugerir la
contribución de componentes extra-axonales en la degeneración axonal inducida por la
hipertensión ocular crónica. Una interpretación posible para la descompactación de la mielina (y
el subsecuente aumento del espesor de la vaina), es la deslaminación leve debida a la ruptura de
los enlaces estructurales entre proteínas de las láminas individuales, que fue evidente al examinar
la mielina a mayor aumento.
El número de Li de las vainas de mielina provee información acerca del grado de
mielinización de los oligodendrocitos (Payne y col., 2012). Como ya se mencionó, en los grupos
con hipertensión ocular sólo fue posible analizar los axones normales remanentes y los axones
con degeneración leve, que intercalaron focos de mielina descompactada y mielina compacta en
los que las Li fueron claramente identificadas. Sin embargo, exceptuando estas salvedades, a las
149
Discusión
15 semanas de glaucoma experimental se observó un corrimiento de la distribución de
frecuencias de las Li hacia axones con vainas de mielina más delgadas. La ausencia de un
corrimiento en la distribución de frecuencias a las 6 semanas de hipertensión ocular
probablemente indique que pocos axones (los más grandes y menos numerosos) fueron sujetos a
fenómenos desmielinizantes en relación al total, como lo demostró la distribución de los axones
en función del área axonal.
En términos gliales, la ultraestructura del NO de ojos hipertensos presentó un arreglo
desorganizado, con gruesos procesos astrocitarios intercalados entre los haces de fibras nerviosas
con distinto grado de degeneración. Fue frecuente distinguir células microgliales en las
proximidades de axones degenerados y en algunos casos se observaron en su interior debris y
axones en degeneración. Estos resultados son compatibles con un aumento en el número de
células fagocíticas en modelos de degeneración Walleriana (Saggu y col., 2010), en los que se
observa la presencia de astrocitos y células microgliales invadiendo la vaina de mielina a nivel
de las Li, así como la fagocitosis de las lamelas debilitadas por la ruptura de los enlaces que las
mantienen compactadas (Liu y Shen, 1985; Narciso y col., 2001).
Las observaciones al microscopio electrónico se corroboraron con estudios de
inmunomarcación para Iba-1, ED1 y GFAP, cuyos niveles aumentaron significativamente en el
NO proximal, tanto a las 6 como a las 15 semanas de hipertensión ocular. En particular, la
inmunorreactividad para ED1 aumentó entre 12 y 20 veces respecto al grupo control, en tanto
que los niveles de Iba-1 resultaron 3 ó 2 veces mayores al control a las 6 y 15 semanas de
tratamiento, respectivamente. Por otra parte, la inmunorreactividad para GFAP aumentó 1,6
veces a las 6 semanas y permaneció elevada hasta las 15 semanas de hipertensión ocular.
La reducción significativa de la inmunorreactividad para pNF-H inducida por la
hipertensión ocular es consistente con las observaciones de la pérdida de transporte anterógrado
a las áreas de proyección y con el daño estructural del citoesqueleto axonal.
150
Discusión
Se ha demostrado un aumento en la reactividad astrocitaria junto con alteraciones en otras
poblaciones gliales tanto en NOs de ratones DBA/2J, como en ratas con hipertensión ocular
crónica (Son y col., 2010). Son y colaboradores (2010) demostraron un aumento en la expresión
del ARNm para vimentina (una proteína característica de astrocitos), ya desde etapas tempranas
de la enfermedad (3 meses) y un aumento en la actividad microglial fagocítica (que coincidió
con una disminución tardía en el número de oligodendrocitos PLP(+), a los 10 meses de edad. En
ratas con hipertensión ocular inducida por fotocoagulación con láser de la red trabecular, se
observó un aumento temprano del ARNm para vimentina en el NO ya a los 10 días del
tratamiento, que se mantuvo elevado hasta los 29 días post-cirugía. En ambos modelos
experimentales se observó una disminución en la inmunorreactividad para pNF-H, que en el
ratón DBA/2J fue aproximadamente de un 80% a los 10 meses de edad y en las ratas, cercano al
100% a los 29 días post-cirugía (Son y col., 2010). Asimismo, en un estudio post-mortem del NO
de un paciente con glaucoma primario de ángulo abierto y pérdida significativa del campo visual
en ambos ojos, se demostró una marcada disminución en la inmunorreactividad para pNF-H en
comparación con NOs de cuatro individuos control (Gupta y col., 2006). En concordancia con
estos resultados, en el modelo de glaucoma utilizado en esta Tesis se demostró una reducción de
~ 50% y ~ 60% en la inmunorreactividad de pNF-H a las 6 y 15 semanas de hipertensión ocular
crónica, respectivamente. En suma, estos resultados avalan el concepto de que la estructura
axoglial del NO constituye un blanco temprano de daño glaucomatoso.
2.2. Efecto del glaucoma crónico experimental sobre la estructura axoglial del colículo superior
Se ha demostrado que una lesión unilateral del NO induce cambios en la población de
células gliales del CS contralateral (Rao y Lund, 1989; Schmidt-Kastner y col., 1993). En
concordancia, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis indican que el glaucoma
experimental
inducido
por
CSU
indujo
alteraciones
microgliales,
macrogliales
y
oligodendrogliales significativas en el CS contralateral a ojos con hipertensión ocular. La
151
Discusión
respuesta de la microglía en el área retinorreceptiva del CS (evaluada por tinción para GSA e
inmunorreactividad para Iba-1), fue un evento temprano que precedió a la pérdida de CGRs. Ya
a las 6 semanas de la hipertensión ocular, se observaron numerosas células microgliales con
somas y procesos hipertrofiados en el CS contralateral a ojos hipertensos. Análogamente, en un
modelo experimental de glaucoma en monos, se ha descripto activación microglial en las capas
del NGL que reciben aferencias de ojos hipertensos (Imamura y col., 2009).
Las células microgliales constituyen la “primera línea de defensa” que responden
rápidamente frente a una lesión cerebral (Hanisch y Kettenmann, 2007; Kreutzberg, 1996; Streit,
2002; Van Rossum y Hanisch, 2004). En base a hallazgos morfológicos, la activación microglial
fue originalmente descripta como un proceso estereotipado y gradual (Kreutzberg, 1996; Streit,
2002). Sin embargo, esta concepción ha sido cuestionada en los últimos años (Hanisch y
Kettenmann, 2007). Varios estudios han demostrado que la microglía ramificada no se encuentra
necesariamente en estado de reposo, como se asumió originalmente, sino que éstas son células
mótiles que mueven constantemente sus procesos y de esta forma, actúan como “centinelas” del
microambiente que las rodea (Davalos y col., 2005; Haynes y col., 2006; Nimmerjahn y col.,
2005; Vinet y col., 2012). Por lo tanto, esta nueva concepción asume que la microglía es activa
aún en condiciones normales, pero puede cambiar su morfología y función en respuesta a un
determinado estímulo (Vinet y col., 2012). En una primera etapa, las células microgliales dirigen
sus procesos hacia la lesión, antes de la retracción de sus procesos y su conversión en células
móviles, capaces de migrar al sitio de la lesión (Davalos y col., 2005; Haynes y col., 2006;
Nimmerjahn y col., 2005). La respuesta microglial a una noxa también puede involucrar
proliferación celular (Hailer y col., 1999; O’Donnell y col., β00β). A las 6 semanas de
hipertensión ocular, los resultados obtenidos podrían sugerir que las células microgliales
proliferaron/migraron en el CS contralateral a ojos hipertensos, como lo demuestra el aumento
en el número de células Iba-1(+), sin cambios en la relación del contenido de Iba-1/célula. Si
152
Discusión
bien el análisis de la complejidad celular por IMARIS reveló un aumento en el número total de
puntos de ramificación, número de segmentos de los filamentos y puntos terminales de los
filamentos, este resultado no necesariamente debe interpretarse en detrimento del concepto
clásico de activación microglial (hipertrofia y retracción de procesos), sino que también podría
reflejar la mayor cantidad de células Iba-1(+). En este sentido, resulta esperable que un mayor
número de células correlacione con una mayor cantidad de procesos/filamentos gliales. Si bien
en el análisis convencional, el porcentaje de área inmunorreactiva para Iba-1 sólo aumentó
significativamente a las 15 semanas de hipertensión ocular, el análisis de IMARIS indicó
alteraciones significativas en la morfología microglial aun en etapas más tempranas de
hipertensión ocular. Es posible que esta discrepancia se deba a que las imágenes obtenidas por
microscopía de fluorescencia convencional procesadas por ImageJ captaran principalmente los
somas y procesos primarios, excluyendo los procesos secundarios de ramificación, más
fácilmente identificables a las 15 semanas de glaucoma experimental, etapa en la cual la
hipertrofia de los cuerpos y los procesos fue más marcada y los niveles de Iba-1 fueron
significativamente mayores que a las 6 semanas de tratamiento.
El análisis de la complejidad celular reveló que la respuesta microglial estuvo definida
espacio-temporalmente; se inició en la porción lateral del CS (a las 6 semanas de hipertensión
ocular) y progresó hacia la porción medial a las 15 semanas de tratamiento. Dado que la
microglía activada puede polarizarse en distintos fenotipos (pro-inflamatoria, M1) o antiinflamatoria, M2), la activación microglial asociada a procesos neurodegenerativos puede
resultar beneficiosa en una respuesta aguda o deletérea en un estado crónicamente activado,
capaz de promover y exacerbar procesos neurodegenerativos (Anthony y Pitossi, 2013; Mosser y
Edwards, 2008). Durante el desarrollo de la presente Tesis, se intentó tipificar a la microglía
mediante el uso de marcadores específicos de cada estado de polarización, utilizando
condiciones que fueron exitosamente utilizadas por la Dra. Laura A. Pasquini (IQUIFIB, Dpto.
153
Discusión
de Química Biológica, FFyB, UBA/CONICET) en otras áreas cerebrales. Sin embargo, en
nuestras condiciones experimentales, no fue posible obtener una inmunomarcación reproducible
para los antígenos iNOS (característico del fenotipo M1) y arginasa o receptor de manosa
(característicos del fenotipo M2) a nivel del CS.
ED1 es una proteína de membrana predominantemente presente en lisosomas y
fagolisomas y correlaciona con la capacidad fagocítica de las células microgliales activadas
(Damoiseaux y col., 1994). Esta proteína también se localiza en la superficie celular, donde
interviene en el reconocimiento célula-célula, debido a que en la síntesis de proteínas
lisosomales de membrana, algunas de las vacuolas del complejo de Golgi se fusionan con la
membrana plasmática y luego son recicladas por endocitosis. La actividad fagocítica de las
células microgliales sólo fue evidente en el período más avanzado de glaucoma crónico, en el
que presumiblemente estas células podrían estar involucradas en la fagocitosis de debris
celulares, evento que precede a la diferenciación celular de oligodendrocitos, que proliferan en
respuesta a procesos inflamatorios (Greenwood y Butt, 2003; Lytle y col., 2009; Miron y col.,
2013; Zai y Wrathall, 2005). Se ha demostrado que la microglía ED1(+) es más numerosa en
cultivos neuronales sometidos a desmielinización inducida por anticuerpos anti-glicoproteína de
la mielina (Defaux y col., 2009). Además, se ha descripto la presencia conjunta de células
ED1(+) e iNOS(+) en focos de lesión inflamatoria inducido por la administración in vivo de LPS
(Felts y col., 2005) o por el tratamiento de células microgliales en cultivo incubadas con mielina
de rata (Pinteaux-Jones y col., 2008). En suma, los resultados de estos trabajos avalan la
asociación de la respuesta fagocítica con una respuesta inflamatoria, es decir, típicamente M1.
Los astrocitos constituyen otra de las poblaciones gliales que se activan frente a distintas
formas de daño del SNC. La activación astroglial se caracteriza principalmente por la
sobreexpresión de GFAP. De hecho, el aumento en los niveles de GFAP es un sello distintivo en
lesiones del SNC tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob
154
Discusión
(Eng y col., 2000), entre otras. Estudios previos han demostrado que la enucleación (Hernandes
y Britto, 2014; McLoon, 1986; Rao y Lund, 1989) o la inyección intravítrea de NMDA (Tanaka
y col., 2009) provocan astrogliosis en el CS. Análogamente a lo descripto en el modelo de
glaucoma agudo ya discutido, una hipertensión ocular aguda de 110 mm de Hg durante 75 min
induce un aumento temprano (3 días) en la expresión de GFAP, tanto en el NGL como en el CS
de ratas (Zhang y col., 2009), y se ha demostrado que en primates, la transección del NO o la
hipertensión ocular moderada durante 14 a 58 días provoca un aumento robusto en la expresión
de GFAP en las láminas del NGL del ojo tratado y una moderada activación astrocitaria en las
columnas de dominancia del ojo tratado en la CV1 (Lam y col., 2009). Sin embargo, los efectos
de la hipertensión ocular crónica sobre los niveles coliculares de GFAP no habían sido
previamente examinados. En este trabajo de Tesis, se demostró una marcada respuesta astroglial
a las 15 semanas de hipertensión ocular, que ocupó toda la extensión del CS en sentido mediolateral, las capas superficiales y la capa SGI del CS en sentido dorso-ventral. Esta distribución
fue similar a la descripta en nuestro y otro modelo de HOA (Zhang y col., 2009), así como en
modelos de enucleación y transección del NO (Hernandes y Britto, 2014; McLoon, 1986; Zhang
y col., 2009). Comparando la respuesta microglial con la respuesta astroglial del CS, nuestros
resultados parecen indicar que la microglía podría ser una de las primeras poblaciones celulares
en detectar un déficit en el input sensorial en esta estructura. En este sentido, además de una gran
plasticidad funcional, las células microgliales se caracterizan por un bajo umbral de activación
(Graeber, 2010) y son capaces de responder incluso a estresores de baja intensidad que afectan al
SNC, ya sea de forma directa o indirecta (Kreutzberg, 1996).
Si bien no se observaron diferencias significativas globales en la inmunorreactividad para
GFAP a las 6 semanas de hipertensión ocular, el estudio sectorial del CS a través del análisis de
imágenes confocales, permitió detectar una activación astrocitaria significativa en la región
medial y más moderada en la porción lateral del CS en este período. Un estudio similar a las 15
155
Discusión
semanas de hipertensión ocular, confirmó los resultados obtenidos previamente por microscopía
de fluorescencia convencional. Además, este análisis aportó información respecto a la
complejidad morfológica de los astrocitos coliculares, que progresó con el tiempo de
hipertensión ocular. Las diferencias en la magnitud de la respuesta a las 6 y a las 15 semanas de
glaucoma crónico podrían interpretarse como diferentes estadíos de un mismo proceso o bien a
dos respuestas astrocitarias diferentes. Trabajos de otros autores (Pekny y col., 2007;
Valamanesh y col., 2013) coinciden en la descripción de dos estadíos de gliosis, con funciones
bien definidas. En las primeras etapas de la lesión, los astrocitos reactivos pueden participar en
procesos de neuroprotección (liberando factores neurotróficos y moléculas antioxidantes) y en
una etapa posterior, la desregulación en la homeostasis de iones y agua, así como la incapacidad
para remover neurotransmisores podría contribuir a la muerte neuronal. Además, la formación de
la cicatriz glial podría delimitar la inflamación al epicentro de la lesión, proteger las redes
neuronales aledañas (Faulkner y col., 2004; Herrmann y col., 2008; Okada y col., 2006; Wanner
y col., 2013) e inhibir fenómenos de plasticidad en el SNC, como el crecimiento de nuevas
neuritas o la reconexión de vías afectadas (Wanner y col., 2013). Cualitativamente, la morfología
de los astrocitos coliculares luego de 15 semanas de hipertensión ocular presentó signos típicos
de una cicatriz glial que comprendió astrocitos hipertrofiados, procesos filamentosos
entrelazados y territorios celulares individuales relativamente más pequeños. Además de
astrocitos, la cicatriz glial se compone de un core de células proinflamatorias CD16/32(+) o
ED1(+) (Horn y col., 2008; Kigerl y col., 2009) y una población grande y heterogénea de células
inmaduras que expresan marcadores comúnmente asociados a progenitores (incluidos nestina,
vimentina, y NG2) (Busch y col., 2010; Lytle y col., 2006; Zai y Wrathall, 2005) y se considera
que la polarización dinámica de diferentes poblaciones celulares en diferentes etapas post-lesión,
“orquesta” la formación de una cicatriz estructuralmente en capas (Hughes y col., 2013). En este
sentido, considerando que la inflamación es una característica central en varios desórdenes
156
Discusión
neurodegenerativos caracterizados por desmielinización y dada la participación de las células
NG2(+) en la formación de la cicatriz glial y también en fenómenos de remielinización, se
analizó el efecto de la hipertensión ocular sobre las sub-poblaciones de oligodendrocitos
coliculares, un aspecto que no había sido previamente explorado en el glaucoma experimental.
Como se mencionó en la Introducción, los oligodendrocitos coliculares se encuentran en
diferentes estadíos de diferenciación: células precursoras de oligodendrocitos (CPO),
oligodendrocitos
premielinizantes,
oligodendrocitos
mielinizantes
inmaduros
(OMi)
y
oligodendrocitos mielinizantes maduros (OMm), que pueden ser caracterizados por la expresión
diferencial de marcadores específicos. Los resultados obtenidos indicaron alteraciones
significativas de los oligodendrocitos coliculares, tanto en etapas tempranas como tardías de
glaucoma crónico experimental. En particular, se observó un aumento en la inmunorreactividad
para NG2 en la porción lateral del CS a las 6 semanas de hipertensión ocular y en la porción
medial y lateral a las 15 semanas de glaucoma experimental, que resultó en un perfil espaciotemporal similar al observado para Iba-1. La glía de tipo NG2(+) (polidendrocitos) forma parte
de la población de CPO, debido a su capacidad de dar origen a oligondendrocitos mielinizantes y
no mielinizantes. Sin embargo no todas las células NG2(+) se diferencian a oligodendrocitos; por
ejemplo, en las primeras etapas post-natales, algunas de estas células se diferencian a astrocitos,
capacidad que pierden gradualmente en etapas post-natales más avanzadas (revisado por
Nishiyama y col., 2014). Los polidendrocitos proliferan y sufren cambios morfológicos en
respuesta a una amplia variedad de estresores del SNC, que además de procesos desmielinizantes
incluyen lesión de la médula espinal (Jones y col., 2002; McTigue y col., 2001), isquemia
(Zhang y col., 2013), lesión por excitotoxicidad (Bu y col., 2001; Wennström y col., 2004) o
infección viral (Levine y col., 1998). El curso temporal de su activación y su morfología reactiva
o el grado de proliferación varía dependiendo de la naturaleza del daño. Si bien aún no se conoce
la relevancia funcional de estos cambios morfológicos y proliferativos, los cambios observados
157
Discusión
en la morfología de las células coliculares NG2(+) en respuesta a la hipertensión ocular
descriptos en la presente Tesis, podrían participar como causa o consecuencia de la progresión
del daño glaucomatoso a nivel central.
Las células NG2(+) exhiben una relación espacial muy cercana a la de los procesos de
astrocitos y el soma microglial, que se vuelve más pronunciada en respuesta a una lesión. En
lesiones agudas, la respuesta de las células NG2(+) ocurre tempranamente (alrededor de las 24 h)
(Horky y col., 2006; Simon y col, 2011; Watanabe y col., 2002), con un curso temporal similar
al de la respuesta microglial y en forma previa a la astrogliosis reactiva (revisado por Nishiyama
y col., 2014). Los resultados obtenidos en cuanto al curso temporal de la respuesta de los
polidendrocitos en relación a la activación micro y astroglial del CS inducida por la hipertensión
ocular, son compatibles con estos antecedentes.
Al presente, se desconoce de qué manera los tres tipos de glía reactiva se comunican entre
sí y conforman eventualmente una respuesta concertada, específicamente adaptada a cada tipo de
lesión. La proliferación de los polidendrocitos depende de diversos factores como la edad, la
localización en el SNC y el nicho germinal del que provienen. Asimismo, se ha sugerido que el
microambiente induce una proliferación diferencial de los polidendrocitos, que es mayor en la
sustancia blanca del cuerpo calloso y el cerebelo comparado con la sustancia gris adyacente (Hill
y col., 2013). Se ha sugerido que un ambiente “más oxidante” de la sustancia blanca proveería de
una mayor concentración de Ca2+ intracelular a las células NG2(+), que están más
despolarizadas. Además, se ha postulado que el comportamiento proliferativo diferencial en
diferentes regiones del SNC podría reflejar diferencias en la funcionalidad de los astrocitos,
diferencias en el estado rédox del microambiente celular ante condiciones fisiológicas, como un
aumento en la respiración celular por aumento en la actividad neuronal, o ante condiciones
patológicas como la hipoxia y la inflamación, que inducen daño oxidativo (revisado por Hill y
Nishiyama, 2014). Evidencia reciente ha demostrado que la actividad neuronal promueve la
158
Discusión
proliferación y diferenciación de las CPO y el remodelamiento de la microestructura de la
mielina, y sugiere que cambios adaptativos en las células formadoras de la mielina representan
un tipo de plasticidad neuronal (Gibson y col., 2014). Paradójicamente, se ha demostrado que la
pérdida de axones y oligodendrocitos en modelos de daño axonal o de desmielinización también
promueven la proliferación de CPO, que en algunos casos generan nuevos oligodendrocitos
(Greenwood y Butt, 2003; Lytle y col., 2009; Zai y Wrathall, 2005) y se ha asociado la
activación microglial en procesos inflamatorios con la proliferación y diferenciación de CPO
(Miron y col., 2013). En este sentido, se analizó el comportamiento de otras poblaciones
oligodendrogliales, a través del estudio de la inmunorreactividad para O1 (característico de OMi
y OMm) y para MBP (característico del último estadío de diferenciación oligodendroglial
(OMm)). El OMi es una célula de morfología multipolar compleja, post-mitótica que carece de
las moléculas presentes en las vainas de mielina. La inmunorreactividad para O1 aumentó en la
porción medial y lateral a las 6 y 15 semanas de hipertensión ocular en las dos capas de mayor
densidad axonal del CS, el SO y el SGI. Las capas SO y SGI adyacentes a las regiones del CS
con pérdida del transporte de CTB coincidieron con aquellas en las que se observó
sobreexpresión de O1, tanto a las 6 como a las 15 semanas de tratamiento. Al presente, la
mayoría de los trabajos que investigaron las consecuencias de un déficit en el input retiniano
sobre núcleos cerebrales visuales (por enucleación o lesiones del NO) se han enfocado en los
astrocitos o en la microglía, y hasta la realización de este trabajo, no se habían examinado las
consecuencias de la hipertensión ocular crónica sobre las poblaciones de oligodendrocitos. Una
interpretación posible de nuestros resultados es que la deprivación del input retiniano afecte en
forma directa componentes de la mielina de las capas del CS de mayor densidad axonal, o de
forma indirecta a través de la activación microglial y que a su vez, constituya una señal para la
proliferación de CPO y diferenciación a oligodendrocitos mielinizantes. En anomalías de la
mielina o en procesos de desmielinización del SNC, es esperable un proceso de remielinización
159
Discusión
que involucra cambios en las poblaciones de oligodendrocitos. La remielinización que ocurre en
respuesta a un proceso desmielinizante se produce a través de la activación de progenitores de
oligodendrocitos en la lesión, que forman nuevos oligodendrocitos y permiten recuperar la
función de aislamiento de la mielina. Sin embargo, el proceso de remielinización se vuelve
progresivamente limitado. Células progenitoras de oligodendrocitos en la lesión, por razones
desconocidas, pierden gradualmente la capacidad de formar oligodendrocitos mielinizantes
(Fernandez y col., 2012). En el CS contralateral a ojos hipertensos, las células precursoras
NG2(+) mostraron una apariencia morfológica alterada, con somas hipertróficos y múltiples
procesos, que se acompañaron por un aumento en la inmunorreactividad para O1, característico
de OM, que podrían quedar arrestados en el estadío OMi. Si bien las consecuencias de la
alteración morfológica de estas células en la progresión de la enfermedad debe ser examinado
más exhaustivamente, es posible que estas células reactivas contribuyen a un estado de
remielinización, pero que la pérdida concomitante de la función y estructura axonal, así como el
aumento en la reactividad microglial podrían provocar una falla para completar la diferenciación
a OMm, lo que resulta en células aberrantes que se acumulan en sitios adyacentes a la lesión, una
situación similar a la observada en modelos crónicos de lesión de la sustancia blanca. En este
contexto, se evaluaron tanto los niveles proteicos como la inmunorreactividad para MBP, como
el contenido lipídico del CS, a fin de determinar el estado de los OMm y de las proteínas y
lípidos de la mielina. Llamativamente, los niveles proteicos y la inmunorreactividad para MBP
no se afectaron significativamente en los períodos estudiados. Aún no disponemos de una
interpretación clara para estos resultados; sin embargo se ha sugerido que durante la
desmielinización, una mayor exposición de epitopes podría aumentar la inmunorreactividad para
antígenos de la mielina, compensando “artificialmente” una caída en los niveles de esta proteína.
Por otra parte, la ausencia de cambios en los niveles proteicos de dos de las isoformas de MPB
probablemente se deba al hecho de haber utilizado homogenatos de toda la estructura del CS,
160
Discusión
con lo que podrían enmascararse fenómenos locales. En contraste, la tinción con Red Oil indicó
una pérdida del contenido lipídico en el sector lateral del SO, tanto a las 6 como a las 15 semanas
de hipertensión ocular crónica, que fue más extendida en el SGI, pues a las 6 semanas y 15
semanas de glaucoma experimental abarcó todos los sectores del CS analizados, exceptuando la
porción medial del SGI a las 15 semanas. La tinción con Red Oil ha sido ampliamente validada
para la determinación de gotas lipídicas en músculo esquelético, corazón e hígado (Mehlem y
col., 2013) y aunque es menos utilizada para el estudio de enfermedades desmielinizantes del
SNC (Prins y col., 2013; Tsiperson y col., 2010), ha permitido detectar un aumento en el
volumen de desmielinización en el estriado de ratas a las que se les administró un adenovirus que
expresa Il-1 (Murta y col., 2012), y se ha demostrado una disminución en el contenido lipídico
tanto en la corteza, el hipocampo y tallo encefálico a los 28 días de un daño axonal traumático
difuso (Wen y col., 2014). En este sentido, a pesar de los resultados obtenidos respecto a los
niveles de MBP, las alteraciones observadas a través de la tinción con Red Oil, podrían
considerarse un indicio (indirecto) de desmielinización o al menos de alteraciones sutiles de la
mielina inducidas por la hipertensión ocular crónica. Las alteraciones en la mielina en la porción
lateral del CS (por donde las fibras retinianas ingresan al CS desde el tracto óptico) fueron
confirmadas por MET. La hipertensión ocular indujo una desorganización evidente de la
ultraestructura del CS lateral a las 15 semanas de hipertensión ocular, que se evidenció a nivel
del neuropilo y de los axones. Estos últimos presentaron formas irregulares, muchas veces con
sectores de mielina laxa y separación de las lamelas de las vainas. En otros casos, se observaron
acúmulos de mielina que correspondieron a axones en degeneración. A nivel del neuropilo, las
alteraciones adquirieron la forma de ampollas (blebs), que no parecerían un artefacto de técnica
porque alrededor de ellas se observaron axones y porque muchas de ellas presentaron un
contenido amorfo electrón-lúcido, que podrían corresponder a áreas del parénquima más
161
Discusión
debilitadas y edematosas. En un futuro próximo, se planea realizar un estudio similar en períodos
más tempranos de hipertensión ocular.
El estado axonal y neuronal en diversos sectores del CS se analizó a través de un estudio
de inmunofluorescencia para pNF-H y NeuN (un marcador específico de neuronas),
respectivamente. La inmunorreactividad para pNF-H se redujo significativamente a las 15 (pero
no 6) semanas de glaucoma crónico en casi todos los sectores analizados, con excepción del
sector medial en el SGI. Sin embargo, el número de neuronas NeuN(+) se preservó aún a las 15
semanas de tratamiento, aunque la evidencia cualitativa de reducción del diámetro neuronal
podría considerarse un índice de atrofia neuronal, que deberá ser confirmada en estudios
cuantitativos complementarios.
Diversos estudios han demostrado que la pérdida de neuronas coliculares frente a noxas
retinianas es un evento relativamente tardío y muy posterior a la caída de los somas de las CGRs.
En un modelo de lesión retiniana inducida por inyección intravítrea de NMDA en ratones, que
provoca una reducción significativa en el número de células en la CCG a partir del día 1 postinyección (Ito y col., 2008), se detectó una pérdida neuronal significativa recién a los 90 días en
el CS (Tanaka y col., 2009). En un modelo de HOA en ratas, 4 semanas post-tratamiento no
fueron suficientes para inducir pérdida neuronal en el dNGL o el CS (Zhang y col., 2009). En
modelos de glaucoma en primates, la disminución de la densidad celular en el NGL es también
un evento muy tardío (Ito y col., 2009; Sasaoka y col., 2008; Yücel y col., 2000, 2001, 2003). En
este contexto, es posible que la pérdida de neuronas coliculares ocurra en períodos aún más
prolongados de hipertensión ocular que los analizados en este trabajo.
Si bien las alteraciones a nivel neuronal fueron claramente menores (al menos con las
técnicas utilizadas), cabe señalar que aproximadamente el 90% de células del SNC son células
gliales, que mantienen una relación íntima con las neuronas y desempeñan un papel crucial en la
regulación del entorno que las rodea. Disfunciones gliales, especialmente de astrocitos y
162
Discusión
microglía han adquirido una relevancia creciente como “actores clave” en la patogenia de
diversos trastornos del SNC (De Keyser y col., 2008), como la epilepsia (Binder y Steinhauser,
2006; Tian y col., 2005), la esquizofrenia (Matute y col., 2005) y la enfermedad de Alzheimer
(Kuchibhotla y col., 2009; Mrak y Griffinbc, 2001), entre otras. En este contexto, las alteraciones
gliales en el CS descriptas en este trabajo de Tesis podrían extender las consecuencias
conceptuales de una disfunción glial central también al glaucoma. Sin embargo, aún no resulta
posible establecer si las alteraciones axogliales del CS, son consecuencia de cambios subletales
en las CGRs o de la glía y los axones del NO (en períodos tempranos), de la pérdida de CGRs y
sus axones (en etapas avanzadas de glaucoma), o son consecuencia directa del aumento de la
PIO, transducido al CS a través de mecanismos aún desconocidos.
El hecho de que la mayoría de los cambios tempranos hayan ocurrido prevalentemente en
la porción lateral del CS, fue un hallazgo sorprendente. Si bien en este trabajo de Tesis no se
realizó un análisis espacial detallado y cuantitativo del déficit del transporte a las áreas
retinorreceptivas del CS, en el modelo de axonopatía distal en el ratón DBA/2J y en ratas adultas
con dos semanas de hipertensión ocular, se demostró que la reducción del transporte activo sigue
un patrón retinotópico que se asemeja a la pérdida de la visión en el glaucoma crónico humano,
es decir, desde la periferia al centro, y hacia la representación del disco óptico en el CS de
roedores (Crish y col., 2010). Aunque en nuestras condiciones experimentales no fue posible
elucidar el perfil de avance de la pérdida del transporte anterógrado, dado que ya a las 6 semanas
de hipertensión ocular la caída fue aproximadamente de un 80 - 95%, resultó llamativa la
preservación de la marca para CTB en la región rostro-medial del CS. De hecho, en los animales
con HOA a los 7 días de tratamiento, el transporte también se preservó en esta pequeña región.
Por distintos métodos y en distintas especies de roedores se ha demostrado que la porción rostromedial recibe proyecciones ipsilaterales (Isenmann y col., 1999; Lund, 1965; Rao y Lund, 1989;
Rodger y col., 2005). En este contexto, la respuesta glial diferencial del sector lateral del CS
163
Discusión
podría tener un sustento anatómico. Es posible especular que la porción medial del CS
contralateral al ojo con glaucoma crónico que recibe escasas aferencias del ojo control, tenga un
ambiente menos nocivo que la porción lateral, y por lo tanto sea menos susceptible al estrés
inducido por la hipertensión ocular en etapas tempranas. En este sentido, Drouyer y
colaboradores (2008) han descripto una pérdida del transporte de CTB en la porción lateral del
CS en ratas con 17 semanas de hipertensión ocular inducida por cauterización de venas
epiesclerales, y sugieren que las proyecciones de la retina inferior están más afectadas que las de
la retina superior (Siminoff y col., 1966). Queda pendiente realizar un análisis de estas
características en el modelo de glaucoma crónico inducido por CSU.
2.3. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel retiniano
Habiendo demostrado cambios gliales tempranos a nivel del NO y el CS, se analizaron
los efectos de la hipertensión ocular crónica sobre las diferentes poblaciones gliales de la retina.
La inmunorreactividad para Iba-1 y ED1 aumentó significativamente a las 6 pero no a las 3
semanas de hipertensión ocular. Este resultado sugiere una marcada activación microglial que se
extendió a todas las capas de la retina y presentó características fagocíticas, en forma previa a la
caída de los somas de las CGRs. Estos resultados concuerdan con los de otros autores, que a
través del estudio de perfiles de expresión génica, asocian las alteraciones retinianas de ratones
DBA/2J a una respuesta inmune innata (Steele et al., 2006), e incluso sugieren su participación
en el inicio de la enfermedad (Fan et al., 2010). En este sentido, Bosco y colaboradores (2011)
demostraron que los niveles proteicos y del ARNm de Iba-1 aumentan significativamente ya a
los tres meses de edad en el ratón DBA/2J, siendo máximos en la retina central y en el NO
proximal, en tanto que en etapas más tardías, estos parámetros se encuentran aumentados en la
retina periférica. Asimismo, Levkovitch-Verbin y colaboradores (2014) demostraron que a los 14
días de hipertensión ocular inducida por cauterización con láser de la red trabecular, aumenta el
número de células Iba-1(+) y ED1(+) en la retina de ratas. Sin embargo, en contraste con lo
164
Discusión
observado en nuestro modelo de glaucoma crónico experimental, el grupo de Bosco (2011)
demostró un rol marginal para ED1 en las retinas de los ratones DBA/2J. Probablemente, estas
diferencias podrían atribuirse a las diferencias entre los modelos experimentales, que incluyen la
magnitud de la hipertensión ocular (que en el modelo DBA/2J es más variable entre animales e
incluso entre los ojos de un mismo animal), a la diferencia entre especies e incluso a la edad de
los animales, entre otros factores.
A las 3 semanas de hipertensión ocular se observó un aumento en la inmunorreactividad
para GFAP en los procesos de las células de Müller, que cualitativamente fue mayor a las 6
semanas de tratamiento. Las células de Müller atraviesan todo el espesor de la retina y contactan
con células bipolares, horizontales, amácrinas, fotorreceptores, células microgliales y astrocitos.
Sobre la base de esta distribución particular, se ha sugerido que las células de Müller se
encuentran topográficamente “bien posicionadas” para monitorear la homeostasis retiniana y
contribuir a la estructura y función de la retina (Goldman, 2014). Es posible que esta disposición
les provea la capacidad de constituir blancos propicios para responder rápidamente ante distintas
noxas, como la hipertensión ocular (Inman y Horner, 2007). En este sentido, no resulta
sorprendente que en nuestro modelo de glaucoma experimental, el aumento en los niveles de
GFAP en las células de Müller (un reconocido indicador de daño retiniano), haya sido uno de los
primeros eventos en respuesta a la hipertensión ocular crónica, incluso anterior a los cambios en
la reactividad microglial. En concordancia con estos resultados, en la retina del ratón DBA/2J se
ha descripto un aumento temprano en la reactividad astrocitaria y de las células de Müller
seguidos por una activación microglial más lenta (Buckingham y col., 2008; Crish y col., 2010;
Howell y col., 2007; Inman y Horner, 2007; Jakobs y col., 2005; Libby y col., 2005; Schlamp y
col., 2006; Son y col., 2010; Stevens y col., 2007). Asimismo, se ha demostrado que la HOA
induce un aumento en la expresión de GFAP en las células de Müller (Woldemussie y col., 2004;
Xue y col., 2006a; Zhang y col., 2009) y nestina (Xue y col., 2006a).
165
Discusión
La nestina es una proteína que forma parte de la familia de filamentos intermedios y fue
originalmente descripta como un marcador de células progenitoras neurales durante el desarrollo
(Lendhal y col., 1990). Evidencias más recientes indican que esta proteína también se expresa en
células progenitoras en el adulto en diversos tejidos en condiciones normales o patológicas
(Fröjdman y col., 1997; Hoffman, 2007; Sejersen y Lendhak, 1993; Yamada y col., 2009). A
diferencia de lo que ocurre en la retina de mamíferos, las células de Müller de los peces poseen
la capacidad de regenerar íntegramente la retina luego de un daño (tóxico, mecánico o por
radiación) y restaurar la visión (Goldman, 2014). Sin embargo, las células de Müller de
mamíferos conservan la capacidad de responder ante diferentes situaciones de daño como el
glaucoma (Xue y col., 2006a), la transección del NO (Xue y col., 2006b), el daño por láser
Kohno y col., 2006), o el desprendimiento de retina (Luna y col., 2010), a través de la expresión
de nestina. En el modelo de hipertensión ocular crónica inducido por CSU, la expresión de
nestina en células de Müller fue evidente a las 6 (pero no 3) semanas de tratamiento
Estos resultados avalan el concepto de que la activación glial retiniana podría ser también
un evento temprano, que antecede a la pérdida de CGRs. En conjunto, los resultados obtenidos
en esta Tesis indican que el glaucoma experimental indujo una activación microglial temprana y
consistente en todas las áreas visuales estudiadas (retina, NO y CS). Sobre la base de estos
resultados, los experimentos que se discutirán a continuación tuvieron por objetivo analizar el
efecto de la inhibición de la reactividad microglial sobre las alteraciones inducidas por el
glaucoma experimental crónico.
2.4. Tratamiento con minociclina
La minociclina (MINO) es una tetraciclina de segunda generación con potentes efectos
antimicrobianos y anti-inflamatorios. Diversas dosis y vías de administración de MINO han sido
utilizadas en modelos experimentales de neurodegeneración. En este trabajo de Tesis, se optó por
166
Discusión
el protocolo utilizado por Guasti y colaboradores (2009) en un modelo de lesión del nervio
espinal en el que la MINO fue eficaz en reducir la respuesta microglial.
La MINO administrada a partir de la cuarta semana de hipertensión ocular crónica, no
modificó la PIO, análogamente a lo descripto en el modelo DBA/2J (Bosco y col., 2008) y en un
modelo de hipertensión ocular inducido por cauterización con láser de la red trabecular en ratas
(Levkovitch-Verbin y col., 2006; 2014). Sin embargo, aunque no afectó los niveles retinianos de
Iba-1, la MINO previno completamente el aumento en los niveles retinianos de ED1 inducido
por el inyecciones crónicas de CSU. En concordancia con nuestros resultados, LevkovitchVerbin y colaboradores (2014) demostraron que la MINO administrada diariamente a partir de 3
días antes de la fotocoagulación con láser, previene el aumento en el número de células
fagocíticas, pero no el aumento en el número total de células microgliales. Resultados
preliminares que deben ser confirmados, parecen indicar que el tratamiento con MINO reduce la
expresión de nestina (pero no de GFAP) en los procesos de las células de Müller. Se ha descripto
un comportamiento similar en las células de Müller de ratones DBA/2J tratados con MINO
durante 25 semanas (a partir de 1,5 meses de edad, en forma previa a la activación microglial,
que ocurre a los 3 meses) (Bosco y col., 2008). En este modelo experimental, la MINO no
modificó la activación astrocitaria y de las células de Müller (evaluada a través de los niveles
proteicos y de ARNm de GFAP), pero redujo significativamente la activación microglial.
A nivel del NO, la MINO previno parcial, pero significativamente el aumento en el área
Iba-1(+) y ED1(+) y evitó completamente el aumento en el área GFAP(+) y la disminución de la
inmunorreactividad para pNF-H inducidos por la hipertensión ocular, un aspecto que no había
sido previamente examinado. Nuestros resultados sugieren que la MINO a nivel del NO previene
el daño glaucomatoso sobre los axones de las CGRs a través de un mecanismo que inhibe tanto
la reactividad microglial y la actividad fagocítica como la astrogliosis reactiva, eventos que
podrían estar causalmente vinculados entre sí. Los efectos de la MINO sobre la preservación de
167
Discusión
la inmunorreactividad para pNF-H avalan el efecto neuroprotector de la MINO sobre los axones
de las CGRs.
A nivel del CS, la MINO evitó la respuesta microglial inducida por la hipertensión ocular
en la porción lateral del CS a las 6 semanas de tratamiento, a excepción de la suma del volumen
de los filamentos Iba-1(+), en la que el efecto de la MINO fue parcial. Asimismo, la MINO
previno el aumento en la inmunorreactividad para GFAP en la porción medial y lateral del CS y
el aumento de todos los parámetros evaluados en ambos sectores del CS. Finalmente, la MINO
previno la reducción del transporte axonal al CS inducida por la hipertensión ocular, efecto que
no había sido previamente demostrado, y que a la luz de los resultados obtenidos podría ser
interpretado sobre la base de los efectos de la MINO a nivel retiniano y del NO. A nivel del CS,
los resultados sugieren que la MINO podría tener un efecto directo, indirecto o la combinación
de ambos. Por un lado, debido a que fue administrada sistémicamente y es capaz de atravesar la
barrera hemato-encefálica, la MINO podría ejercer efectos anti-inflamatorios directos sobre el
CS; por otro, la reducción de las alteraciones en los axones de las CGRs y de la respuesta
microglial en el NO podría prevenir el déficit en el input visual al CS e indirectamente, la
respuesta glial inducida por la hipertensión ocular observada en esta estructura a las 6 semanas
de tratamiento. Dado que la microglía puede regular la mielinización, los oligodendrocitos o
ambos, no es posible descartar que la MINO afecte positivamente a los polidendrocitos y la
mielina, aspectos que se analizarán en un futuro próximo. En suma, estos resultados sugieren que
la MINO administrada en forma intraperitoneal durante 2 semanas, fue efectiva en prevenir
algunas de las alteraciones sobre la vía visual inducidas por la hipertensión ocular crónica. En
este contexto, aunque aún queda pendiente el análisis del número de CGRs en respuesta a la
MINO en ojos glaucomatosos, es posible postular que la respuesta microglial temprana en las
estructuras visuales analizadas, podría participar activamente en la patogénesis del glaucoma. En
168
Discusión
este sentido, estos resultados podrían sugerir el uso de MINO como una nueva estrategia
terapéutica para el tratamiento del glaucoma.
3. Sistema visual no formador de imagen en el glaucoma agudo y crónico
Los resultados obtenidos en el modelo de glaucoma agudo indican que las CGRsm
resultaron funcional y estructuralmente protegidas, incluso en un contexto de un extensivo daño
retiniano, como el observado a las 4 semanas post-HOA. En esta serie de experimentos, se optó
por un período de 4 semanas después de la HOA con el fin de maximizar el daño funcional e
histológico de la retina, y descartar la posibilidad de una protección transitoria (o una muerte
retardada) de las CGRsm. A las 4 semanas post-HOA, se confirmó una disfunción retiniana
altamente significativa y marcadas alteraciones de la estructura de la retina. Aunque la proteína
Brn3a fue considerada un marcador para toda población de CGRs, recientemente se ha
demostrado que la subpoblación de CGRsm no expresan esta proteína (Jain y col., 2012). A las 4
semanas post-HOA, se observó una disminución significativa en el número de células Brn3a(+),
en tanto que no se observaron cambios en el número de células melanopsina(+). Este resultado
fue avalado a través de la determinación de los niveles proteicos de Brn3a y melanopsina
retinianos por Western blot, que demostró una disminución significativa en los niveles de Brn3a,
y la persistencia en los niveles de melanopsina. En concordancia con estos resultados, se ha
demostrado un aumento en la supervivencia de CGRsm en comparación con el resto de las
CGRs luego de la transección del NO (Li y col., 2008; Robinson y Madison, 2004). Por otra
parte, en trabajos recientes de nuestro laboratorio se demostró que, concomitantemente con una
disminución significativa en el número de células Brn3a(+), el número de CGRsm y los niveles
de melanopsina no se alteran en etapas avanzadas de retinopatía diabética experimental
(Fernandez y col., 2013). Otras evidencias de la robustez de las CGRsm proviene de estudios
sobre toxicidad inducida por el tratamiento con ácido kaínico (Sakamoto y col., 2005) o NMDA
(DeParis y col., 2012). Además, se ha demostrado una preservación relativa de las CGRsm en
169
Discusión
dos trastornos mitocondriales hereditarios que causan ceguera: la neuropatía óptica hereditaria de
Leber y la atrofia óptica dominante (La Morgia y col., 2010). En contraposición con estos
resultados, se ha demostrado una degeneración progresiva de las CGRsm en un modelo de
retinitis pigmentosa autosómica dominante (ratas P23H) (Esquiva y col., 2013) y en ratas
distróficas del Royal College of Surgeons (Vugler y col., 2008), y se demostró una reducción
comparable de CGRsm y de las CGRs convencionales con el envejecimiento en retinas humanas
(La Morgia y col., 2010) y modelos animales (Semo y col., 2003). En suma, estos resultados
junto a resultados obtenidos en el modelo de glaucoma crónico inducido por CSU (como se
discutirá más adelante) indican que la robustez de las CGRsm no parecería un fenómeno general,
sino que depende de la naturaleza del daño.
Con algunas excepciones, la mayoría de los trabajos mencionados han evaluado la
preservación de las CGRsm por Western blot y/o inmunohistoquímica, pero relativamente pocos
estudios han investigado la preservación de la capacidad funcional del sistema visual no
formador de imagen en enfermedades retinianas. En este contexto, estudios conductuales
demuestran que la función del reloj circadiano es normal en ratones con degeneración avanzada
de los fotorreceptores clásicos (Freedman y col., 1999), y en algunos seres humanos ciegos
(Klerman y col., 2002). Análogamente a los resultados discutidos más arriba, a las 4 semanas
post-HOA se observó un déficit casi total en el transporte anterógrado de CTB al CS y al NGL
contralaterales, en tanto que no se observaron cambios evidentes en el transporte de CTB desde
la retina de ojos sometidos a HOA a los NSQ o al NPO. Considerando que la mayoría de células
que proyectan a los NSQ y al NPO son melanopsina(+) (Gooley y col., 2003; Hattar y col.,
2006), estos resultados avalan la preservación de los axones de las CGRsm frente al daño
inducido por HOA.
Además de la preservación del soma y los axones de las CGRsm, los resultados obtenidos
demuestran que la funcionalidad de las CGRsm también se preservó en retinas de ojos sometidos
170
Discusión
a HOA. El reflejo pupilar difiere en función de la intensidad de luz y su longitud de onda, de
manera tal que las condiciones de estimulación utilizadas pueden producir respuestas pupilares
que reflejan la fototransducción mediada principalmente por bastones, conos, o melanopsina. En
ese sentido, existe consenso en que las respuestas desencadenadas por melanopsina se producen
en niveles de iluminación elevados, y que a menor intensidad de luz, los conos y los bastones
regulan la contracción pupilar (Grozdanic y col., 2007; Lucas y col., 2003). Cuando los ojos se
estimularon con luz de alta intensidad, el reflejo pupilar consensual a ojos sometidos a HOA, se
conservó en su totalidad, lo que es compatible con la preservación del transporte anterógrado de
CTB desde las retinas de ojos sometidos a HOA al NPO, que proyecta al núcleo de EdingerWestphal y controla la contracción de la pupila (Young y Lund, 1998). En contraste, con una luz
de baja intensidad, la HOA indujo una disminución significativa en el reflejo pupilar consensual,
consistente con la disminución de la onda a del ERG escotópico inducida por la HOA, que
refleja la respuesta de los fotorreceptores. Asimismo, los resultados obtenidos sugieren que los
circuitos neuronales en los que participan las CGRsm resultaron considerablemente “insensibles”
al glaucoma agudo aun en etapas tardías post-HOA. Estos resultados difirieron marcadamente de
las observaciones obtenidas en el modelo de glaucoma crónico inducido por CSU. La
hipertensión ocular crónica indujo una disminución significativa en el número de CGRsm (~
45%) y en los niveles de melanopsina (~ 50%) que fue similar a la observada para el número de
CGRs Brn3a(+) (~ 35%) y los niveles de Brn3a (~ 45%), respectivamente, lo que sugiere que las
CGRsm fueron similarmente vulnerables a los efectos deletéreos de la hipertensión ocular
crónica que el resto de las CGRs. Estos resultados fueron avalados por el estudio del transporte
anterógrado retiniano, que demostró una disminución evidente en la marca de CTB, tanto en las
áreas formadoras de imagen, como en el IG, los NSQ y el NPO. Análogamente, Drouyer y col.
(2008) demostraron una reducción en el transporte de CTB a estas estructuras, y una
disminución comparable en los niveles de ARNm de melanopsina (~25%) y de Thy-1 (~20%)
171
Discusión
(otro marcador específico de CGRs) a las 17 semanas de hipertensión ocular inducida por
fotocoagulación con láser de las venas epiesclerales. Asimismo, en concordancia con estos
resultados, se demostró una pérdida significativa de CGRsm y una reducción significativa en los
niveles de ARNm de melanopsina en ratas Wistar en el mismo modelo de glaucoma (Wang HZ y
col., 2008). En contraste con estos resultados, Li y colaboradores (2006), utilizando un modelo
experimental de glaucoma inducido por la fotocoagulación de las venas epiesclerales y límbicas
en ratas Sprague-Dawley demostraron que las CGRsm son resistentes incluso después de 12
semanas de hipertensión ocular. Por lo tanto, parece posible que el modelo experimental, así
como la cepa de rata o el intervalo de hipertensión analizado, podría explicar esta discrepancia.
Diversas líneas de evidencia demuestran defectos en el reflejo pupilar en pacientes con
glaucoma crónico de ángulo abierto (Kaback y col., 1976; Kohn y col., 1979; Prywes, 1976). Sin
embargo, un número muy reducido de estudios han examinado el reflejo pupilar en modelos
experimentales de glaucoma crónico en ratas. En ese sentido, se demostró un déficit significativo
del reflejo pupilar que se correlaciona con los valores de PIO en ratas Brown Norway con
glaucoma experimental crónico inducido por la cauterización de 3 venas vorticosas y 2 venas
epiesclerales (Grozdanic y col., 2003). En ratas con 6 ó 15 semanas de glaucoma crónico
experimental inducido por inyecciones semanales de CSU se observó una disminución del
reflejo pupilar inducido por luz de alta intensidad, una observación que es compatible con la
disminución de la marca de CTB en el NPO, observada en ambos períodos de hipertensión
ocular. Cabe señalar que si bien no se observaron cambios en los niveles de melanopsina y en el
número de CGRsm en ojos inyectados con CSU durante 6 semanas, la disminución significativa
del reflejo pupilar fue evidente incluso en este período de hipertensión ocular. Estos resultados
sugieren que el reflejo pupilar podría ser un indicador no invasivo y sensible de la disfunción del
sistema visual no formador de imagen, dado que este parámetro reveló una alteración en un
momento en el que los niveles de melanopsina no se modificaron. En suma, estos resultados
172
Discusión
indican una alteración significativa del sustrato neuronal en particular y del sistema visual no
formador de imagen en general, en el glaucoma crónico experimental.
Aún queda por analizar las diferencias entre ambos modelos de glaucoma con respecto al
sistema visual no formador de imagen. Al respecto, cabe señalar que los resultados obtenidos en
el estudio del efecto de la HOA sobre el sistema visual no formador de imagen, fueron
sorprendentes. Considerando la magnitud del daño retiniano observado en estas condiciones
experimentales, el resultado más previsible hubiera sido una afectación significativa de las
CGRsm en particular y del sistema visual no formador de imagen en general. Si bien no puede
descartarse que estos cambios puedan ocurrir en etapas aún más avanzadas post-HOA, los
resultados obtenidos sugieren que las CGRsm resultaron considerablemente “insensibles” a la
HOA, incluso en un intervalo en el que ya tuvieron lugar alteraciones muy notables de la
estructura y función visual. Sobre la base de este estudio experimental, se podría predecir que a
pesar de una baja visión, pacientes con glaucoma agudo, podrían retener el sustrato neuronal y la
funcionalidad del sistema visual no formador de imagen, lo que les permitiría evitar las
consecuencias de la desincronización de su sistema circadiano. En este sentido, los resultados
obtenidos en el modelo de glaucoma agudo apoyan el concepto de que las CGRsm son funcional
y morfológicamente diferentes de la CGRs “tradicionales” y que pueden disponer de una
resistencia intrínseca para sobrevivir después de una HOA y deletérea. Algunos mecanismos han
sido implicados en la robustez de las CGRsm, particularmente, el polipéptido hipofisario
activador de la adenilato ciclasa (PACAP) que se expresa en las CGRsm (Hannibal y col., 2006)
y la enzima fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) (Li y col., 2008), aunque existe evidencia que
desafía la participación de estas señales (DeParis y col., 2012; Perganta y col., 2013). En todo
caso, es evidente que los mecanismos que contribuyen a la robustez de las CGRsm en el
glaucoma agudo no son similarmente eficientes en el modelo de glaucoma crónico, por razones
aún elusivas. Sin embargo, si bien en términos generales, las formas aguda y crónica del
173
Discusión
glaucoma comparten los mismos blancos celulares en el sistema visual, es posible que los
mecanismos patogénicos involucrados en cada caso difieran de manera significativa. Mientras el
glaucoma agudo es una disfunción esencialmente isquémica, el componente isquémico en el
modelo crónico parecería menos relevante o al menos sólo un aspecto patogénico parcial de la
enfermedad. En este sentido, es posible postular que las CGRsm podrían ser resistentes a la
isquemia retiniana, como lo avala su robustez frente a la retinopatía diabética (Fernandez y col.,
2013), pero no a los otros mecanismos de daño (mecánico, neuroquímico, etc.) involucrados en
la forma crónica de la enfermedad. También en este sentido, es necesario considerar el curso
temporal que difiere marcadamente entre ambos modelos, es decir, es posible que las CGRsm
sean capaces de resistir frente a una noxa intensa pero aguda, y sean susceptibles frente a un
daño moderado, pero persistente. La robustez de las CGRsm frente a la HOA también podría ser
también interpretada en términos evolutivos. Los mecanismos del reloj circadiano y la vía de
sincronización desde la retina en vertebrados representan un sistema que ha conferido ventajas
adaptativas a sus portadores, permitiéndoles adaptarse a las fluctuaciones ambientales periódicas
(luz y temperatura, por ejemplo) y coordinar procesos fisiológicos en momentos ambientales
óptimos. Además, el sistema circadiano es capaz de amortiguar cambios sutiles o extremos y
persistir en ausencia de señales ambientales (Bell-Pedersen y col., 2005; Duguay y Cermakian,
2009; Hotta y col., 2007; Peirson y col., 2009). Considerando el rol central de las CGRsm en la
fisiología circadiana, parecería probable que la presión evolutiva haya contribuido a la
preservación de este sistema fotosensible proporcionándole a través de años de selección natural,
la capacidad para resistir a distintas presiones de selección (pero no necesariamente a todas,
como al glaucoma crónico). En todo caso, resulta particularmente atractiva la posibilidad de
identificar los mecanismos involucrados en la resistencia de las CGRsm frente al daño inducido
por glaucoma agudo, considerando que a partir de la manipulación de estos mecanismos podría
174
Discusión
ser posible proveer nuevos enfoques terapéuticos para la protección de estas células, así como de
las CGRs en su conjunto, particularmente en el glaucoma crónico.
Como ya se mencionó, el “escenario” fue notablemente diferente en el glaucoma crónico
experimental con respecto al glaucoma agudo, en el que se observó una afectación significativa
de las CGRsm y sus axones. Como se muestra en este trabajo de Tesis, el glaucoma crónico
podría provocar alteraciones no sólo visuales, sino también en funciones visuales no formadoras
de imagen. Trastornos del sistema circadiano pueden provocar falta de concentración, menor
rendimiento, disminución de habilidades cognitivas, coordinación psicomotora pobre y dolores
de cabeza, entre muchos otros. Existen diversas estrategias terapéuticas para restablecer el
equilibrio circadiano. Por lo tanto, a través de la identificación de los trastornos circadianos en el
glaucoma crónico, estos resultados podrían contribuir a mejorar la calidad de vida de los
pacientes con esta enfermedad ocular.
4. Consecuencias conceptuales de los resultados obtenidos y perspectivas futuras
El objetivo central de este trabajo fue examinar las consecuencias del glaucoma sobre el
sistema visual en general, más allá de los reconocidos efectos a nivel retiniano (específicamente
la pérdida de CGRs) y las comparativamente menos exploradas consecuencias a nivel del NO.
Para ello, en una primera instancia se utilizó un modelo experimental que remeda la situación
clínica del glaucoma agudo humano, que como ya se mencionó, no resultó una herramienta
adecuada para la descripción de la secuencia temporal de eventos deletéreos en la retina, el NO y
el CS por su rápida evolución. En cambio, en el modelo de glaucoma crónico utilizado en este
trabajo, que tiene ventajas comparativas con otros modelos de glaucoma crónico de ángulo
abierto, se obtuvieron indicios de significación respecto al efecto de la hipertensión ocular sobre
estructuras visuales post-retinianas. En este sentido, en el curso de esta Tesis se han demostrado
alteraciones axo-gliales significativas en la retina, el NO y el CS, algunas de las cuales incluso
precedieron a la muerte de las CGRs, que es considerado el signo patognomónico de la
175
Discusión
enfermedad. Es muy probable que una lesión del SNC no consista en cambios independientes en
las diferentes clases de células que lo componen, sino más bien, es plausible que las
interacciones entre las neuronas, los axones y las células gliales también se alteren en detrimento
de las demandas fisiológicas y las funciones del sistema nervioso. En este sentido, aunque aún
no estamos en condiciones de establecer si el daño glaucomatoso ocurre inicialmente en los
somas de las CGRs, sus axones o en los componentes gliales de la retina, el NO o el CS, nuestros
resultados podrían sugerir que la comunicación multidireccional entre todos estos “actores del
sistema visual” puede ser negativamente afectada por la enfermedad. Esta concepción más
holística del glaucoma podría tener consecuencias de transferencia clínica, de manera tal que las
terapias de nueva generación deberían tener en cuenta las alteraciones en las distintas estaciones
de relevo del procesado visual al momento de elegir un tratamiento exitoso. A partir de estos
resultados (a pesar de estar en una etapa experimental), resulta evidente que un tratamiento será
efectivo si y sólo si permite evitar o al menos reducir la progresión del daño glaucomatoso a
nivel de la vía visual en su conjunto. También desde esta nueva perspectiva, es posible predecir
que una terapéutica anti-glaucomatosa eficiente debería involucrar una estrategia compleja, dada
la multiplicidad de los eventos deletéreos y de los componentes celulares afectados. Como ya se
mencionó, al presente, la principal estrategia terapéutica para el glaucoma está dirigida a
disminuir farmacológica o quirúrgicamente la PIO. Los resultados obtenidos en esta Tesis
podrían proveer una interpretación racional a la evidencia de que el éxito del tratamiento (en
términos de protección de la función visual) sea por ahora muy limitado, como lo sustenta el
hecho de que el glaucoma sigue siendo una de las principales causas de ceguera irreversible, a
pesar de los constantes esfuerzos invertidos en mejorar las estrategias para reducir la
hipertensión ocular.
Desde una perspectiva terapéutica y considerando que la activación microglial fue un
aspecto consistente en todas las áreas visuales evaluadas, se analizó el efecto de la minociclina.
176
Discusión
El efecto de la minociclina sobre la activación microglial (un evento central en las enfermedades
neurodegenerativas en general y eventualmente también en el glaucoma), así como su efecto
beneficioso en distintos modelos de enfermedad neurológica y su buena tolerancia para su uso en
humanos, acredita la potencialidad terapéutica de la minociclina para su consideración en el
tratamiento del glaucoma. En este sentido, si bien aún quedan diversos aspectos por analizar, los
resultados obtenidos avalan el uso de minociclina, (eventualmente en conjunto con hipotensores
oculares y compuestos neuroprotectores) para el tratamiento de esta enfermedad, pero además,
estos resultados aportan evidencias sobre la participación microglial en el daño glaucomatoso,
análogamente a lo descripto en otros procesos neurodegenerativos.
Otro de los aspectos analizados en esta Tesis fue el estudio del sistema visual no
formador de imagen en ambas formas de glaucoma experimental. También en este sentido,
quedan aún muchos interrogantes por contestar, como las causas de la resistencia de las CGRsm
al glaucoma agudo y de su susceptibilidad al glaucoma crónico, así como los mecanismos
involucrados en la protección y el daño de estas células, respectivamente. Sin embargo, estos
resultados avalan la importancia de incluir al sistema visual no formador de imagen en el marco
del estudio de enfermedades oftalmológicas en general y del glaucoma en particular. El papel
central de la retina en el sistema generador de ritmos circadianos y las consecuencias
considerables de las alteraciones circadianas sobre la salud humana, acreditan la importancia de
evaluar este sistema y desarrollar estrategias terapéuticas para el tratamiento frente a un mal
funcionamiento o pérdida de las CGRsm. En suma, si bien en el intento de incorporar nuevos
conceptos sobre la neuropatía glaucomatosa, esta Tesis muy probablemente haya generado más
preguntas que respuestas (como corresponde a cualquier trabajo científico), los hallazgos de este
trabajo generan genuinas expectativas de que las nuevas respuestas que surjan de los nuevos
interrogantes contribuyan en forma significativa a mejorar la calidad de vida de los pacientes con
glaucoma.
177
Bibliografía
BIBLIOGRAFÍA
 Aarum J, Sandberg K, Haeberlein SL, Persson MA. Migration and differentiation of neural
precursor cells can be directed by microglia. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100(26):15983-8.
 Abrahamson EE, Moore RY. Suprachiasmatic nucleus in the mouse: retinal innervation,
intrinsic organization and efferent projections. Brain Res. 2001; 916(1-2):172-91.
 Acott TS, Kelley MJ. Extracellular matrix in the trabecular meshwork. Exp Eye Res. 2008;
86(4):543-61.
 Aihara M, Lindsey JD, Weinreb RN. Aqueous humor dynamics in mice. Invest Ophthalmol
Vis Sci. 2003; 44(12):5168-73.
 Aloisi F, Penna G, Cerase J, Menendez Iglesias B, Adorini L. IL-12 production by central
nervous system microglia is inhibited by astrocytes. J Immunol. 1997; 159:1604-1612.
 Anderson DR, Hendrickson A. Effect of intraocular pressure on rapid axoplasmic transport in
monkey optic nerve. Invest Ophthalmol. 1974; 13(10):771-83.
 Anderson MG, Smith RS, Hawes NL, Zabaleta A, Chang B, Wiggs JL, John SW. Mutations
in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat
Genet. 2002; 30:81-5.
 Anthony DC, Pitossi FJ. Special issue commentary: the changing face of inflammation in the
brain. Mol Cell Neurosci. 2013; 53:1-5.
 Back SA, Riddle A, McClure MM. Maturation-dependent vulnerability of perinatal white
matter in premature birth. Stroke. 2007; 38(2 Suppl):724-30.
 Baker GE. Prechiasmatic reordering of fibre diameter classes in the retinofugal pathway of the
ferret. Eur J Neurosci. 1990; 2:24-33.
 Bancroft JD, Stevens A. Theory and practice of histological techniques. 3º edición:
Edinburgh: Churchill-Livingstone; 1990.
 Baptiste DC, Powell KJ, Jollimore CA, Hamilton C, LeVatte TL, Archibald ML, Chauhan
BC, Robertson GS, Kelly ME. Effects of minocycline and tetracycline on retinal ganglion cell
survival after axotomy. Neuroscience 2005; 134(2):575-82.
 Barany EH, Scotchbrook S. Influence of testicular hyaluronidase on the resistance to flow
through the angle of the anterior chamber. Acta Physiol Scand. 1954; 30:240-8.
 Baumann N, Pham-Dinh D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central
nervous system. Physiol Rev. 2001; 81(2):871-927.
 Bayer AU, Danias J, Brodie S, et al. Electroretinographic abnormalities in a rat glaucoma
model with chronic elevated intraocular pressure. Exp Eye Res. 2001a; 72:667-77.
178
Bibliografía
 Bayer AU, Neuhardt T, May AC, et al. Retinal morphology and ERG response in the
DBA/2NNia mouse model of angle-closure glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001b;
42:1258-65.
 Beaulé C, Robinson B, Lamont EW, Amir S. Melanopsin in the circadian timing system. J
Mol Neurosci. 2003; 21(1):73-89.
 Belenky MA, Smeraski CA, Provencio I, Sollars PJ, Pickard GE.Melanopsin retinal ganglion
cells receive bipolar and amacrine cell synapses. J Comp Neurol. 2003; 460(3):380-93.
 Belforte N, Moreno MC, Cymeryng C, Bordone M, Keller Sarmiento MI, Rosenstein RE.
Effect of ocular hypertension on retinal nitridergic pathway activity. Invest Ophthalmol Vis
Sci. 2007; 48(5):2127-33.
 Belforte NA, Moreno MC, de Zavalía N, Sande PH, Chianelli MS, Keller Sarmiento MI,
Rosenstein RE. Melatonin: a novel neuroprotectant for the treatment of glaucoma. J Pineal
Res. 2010; 48(4):353-64.
 Bell-Pedersen D, Cassone VM, Earnest DJ, Golden SS, Hardin PE, Thomas TL, Zoran MJ.
Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet.
2005; 6(7):544-56.
 Benozzi J, Nahum LP, Campanelli JL, Rosenstein RE. Effect of hyaluronic acid on
intraocular pressure in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002; 43(7):2196-200.
 Berson DM, Dunn FA, Takao M. Phototransduction by retinal ganglion cells that set the
circadian clock. Science 2002; 295(5557):1070-3.
 Berson DM. Strange vision: ganglion cells as circadian photoreceptors. Trends Neurosci.
2003;26(6):314-20.
 Betmouni, S, Perry VH, Gordon JL. Evidence for an early inflammatory response in the
central nervous system of mice with scrapie. Neuroscience 1996; 74, 1–5.
 Biber K, Neumann H, Inoue K, Boddeke HW. Neuronal ‘On’ and ‘Off’ signals control
microglia. Trends Neurosci. 2007; 30:596-602.
 Bill A. Uveoscleral drainage of aqueous humor: physiology and pharmacology. Prog Clin
Biol Res. 1989; 312:417-27.
 Binder DK, Steinhäuser C. Functional changes in astroglial cells in epilepsy. Glia 2006;
54(5):358-68.
 Bizzozero OA, Bixler HA, Davis JD, Espinosa A, Messier AM. Chemical deacylation reduces
the adhesive properties of proteolipid protein and leads to decompaction of the myelin sheath.
J Neurochem. 2001;76(4):1129-41.
 Bongarzone ER, Pasquini JM, Soto EF. Oxidative damage to proteins and lipids of CNS
myelin produced by in vitro generated reactive oxygen species. J Neurosci Res 1995;
41(2):213-21.
179
Bibliografía
 Bosco A, Inman DM, Steele MR, Wu G, Soto I, Marsh-Armstrong N, Hubbard WC, Calkins
DJ, Horner PJ, Vetter ML. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve
integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest
Ophthalmol Vis Sci. 2008; 49(4):1437-46.
 Bosco A, Steele MR, Vetter ML. Early microglia activation in a mouse model of chronic
glaucoma. J Comp Neurol. 2011; 519: 599-620.
 Boucard CC, Hernowo AT, Maguire RP, Jansonius NM, Roerdink JB, Hooymans
JM, Cornelissen FW. Changes in cortical grey matter density associated with long-standing
retinal visual field defects. Brain. 2009;132(Pt 7):1898-906.
 Bouhenni RA, Dunmire J, Sewell A, Edward DP. Animal models of glaucoma. J Biomed
Biotechnol. 2012; 2012:692609.
 Brainard GC, Hanifin JP, Greeson JM, Byrne B, Glickman G, Gerner E, Rollag MD. Action
spectrum for melatonin regulation in humans: evidence for a novel circadian photoreceptor. J
Neurosci. 2001; 21: 6405-12.
 Bringmann A, Pannicke T, Grosche J, Francke M, Wiedemann P, Skatchkov SN, Osborne
NN, Reichenbach A. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res.
2006; 25(4):397-424.
 Bron AJ, Tripathi RC, Tripathi BJ. Wolff’s anatomy of the eye and orbit. Chapman & Hall
Medical, London, 1997, p. 736.
 Broom K, Anthony D, Lowe J, Griffin J, Scott H, Blamire A, Styles P, Perry V, Sibson N,
MRI and MRS alterations in the preclinical phase of murine prion disease: association with
neuropathological and behavioural changes. Neurobiol. Dis. 2007;26: 707-717.
 Bu J, Akhtar N, Nishiyama A. Transient expression of the NG2 proteoglycan by a
subpopulation of activated macrophages in an excitotoxic hippocampal lesion. Glia 2001;
34(4):296-310.
 Buckingham BP, Inman DM, Lambert W, Oglesby E, Calkins DJ, Steele MR, Vetter ML,
Marsh-Armstrong N, Horner PJ. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal
loss in a mouse model of glaucoma. J Neurosci. 2008; 28:2735-44.
 Bui BV, Edmunds B, Cioffi GA, Fortune B. The gradient of retinal functional changes during
acute intraocular pressure elevation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005; 46(1):202-13.
 Buller C, Johnson DH, Tschumper RC. Human trabecular meshwork phagocytosis.
Observations in an organ culture system. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1990; 31(10):2156-63.
 Burgoyne CF, Downs JC, Bellezza AJ, Suh JK, Hart RT. The optic nerve head as a
biomechanical structure: a new paradigm for understanding the role of IOP-related stress and
strain in the pathophysiology of glaucomatous optic nerve head damage. Prog Retin Eye Res.
2005; 24(1):39-73.
180
Bibliografía
 Busch SA, Horn KP, Cuascut FX, Hawthorne AL, Bai L, Miller RH, Silver J. Adult NG2+
cells are permissive to neurite outgrowth and stabilize sensory axons during macrophageinduced axonal dieback after spinal cord injury. J. Neurosci. 2010; 30(1):255-65.
 Butt AM, Ibrahim M, Ruge FM, Berry M. Biochemical subtypes of oligodendrocyte in the
anterior medullary velum of the rat as revealed by the monoclonal antibody Rip. Glia. 1995;
14(3):185-97.
 Calkins DJ. Critical pathogenic events underlying progression of neurodegeneration in
glaucoma. Prog Retin Eye Res. 2012; 31(6):702-19.
 Carbonell AL, Boya J, Calvo JL, Marin JF. Ultrastructural study of the neuroglial and
macrophagic reaction in Wallerian degeneration of the adult rat optic nerve. Histol
Histopathol. 1991; 6(4):443-51.
 Carden WB, Datskovskaia A, Guido W, Godwin DW, Bickford ME. Development of the
cholinergic, nitrergic, and GABAergic innervation of the cat dorsal lateral geniculate nucleus.
J Comp Neurol. 2000; 418(1):65-80.
 Cernea P. The resistance to drainage of the aqueous humor. Oftalmología 1993; 37(4):28998.
 Chan KC, So KF, Wu EX. Proton magnetic resonance spectroscopy revealed choline
reduction in the visual cortex in an experimental model of chronic glaucoma. Exp Eye
Res. 2009; 88(1):65-70.
 Chaturvedi N, Hedley-Whyte ET, Dreyer EB. Lateral geniculate nucleus in glaucoma. Am J
Ophthalmol. 1993; 116(2):182-8.
 Chauhan BC, Pan J, Archibald ML, LeVatte TL, Kelly ME, Tremblay F. Effect of intraocular
pressure on optic disc topography, electroretinography, and axonal loss in a chronic pressureinduced rat model of optic nerve damage. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002; 43:2969-76.
 Chen M, Ona VO, Li M, Ferrante RJ, Fink KB, Zhu S, Bian J, Guo L, Farrell LA, Hersch SM,
Hobbs W, Vonsattel JP, Cha JH, Friedlander RM. Minocycline inhibits caspase-1 and
caspase-3 expression and delays mortality in a transgenic mouse model of Huntington disease.
Nat Med. 2000; 6(7):797-801.
 Chen X, Ma X, Jiang Y, Pi R, Liu Y, Ma L. The prospects of minocycline in multiple
sclerosis. J Neuroimmunol. 2011;235(1-2):1-8.
 Chidlow G, Ebneter A, Wood JP, Casson RJ. The optic nerve head is the site of axonal
transport disruption, axonal cytoskeleton damage and putative axonal regeneration failure in a
rat model of glaucoma. Acta Neuropathol. 2011; 121(6):737-51.
 Choong YF, Devarajan N, Pickering A, Pickering S, Austin MW. Initial management of
ocular hypertension and primary open-angle glaucoma: an evaluation of the royal college of
ophthalmologists' guidelines. Eye 2003; 17(6):685-9.
 Colwell CS. Rhythmic coupling among cells in the suprachiasmatic nucleus. J Neurobiol.
2000; 43(4):379-88.
181
Bibliografía
 Crawford ML, Harwerth RS, Smith EL 3rd, Mills S, Ewing B. Experimental glaucoma in
primates: changes in cytochrome oxidase blobs in V1 cortex. Invest Ophthalmol Vis
Sci. 2001; 42(2):358-64.
 Crish SD, Calkins DJ. Neurodegeneration in glaucoma: progression and calcium-dependent
intracellular mechanisms. Neuroscience 2011; 176:1-11.
 Crish SD, Dapper JD, MacNamee SE, Balaram P, Sidorova TN, Lambert WS, Calkins DJ.
Failure of axonal transport induces a spatially coincident increase in astrocyte BDNF prior to
synapse loss in a central target. Neuroscience 2013; 229:55-70.
 Crish SD, Sappington RM, Inman DM, Horner PJ, Calkins DJ. Distal axonopathy with
structural persistence in glaucomatous neurodegeneration. Proc Natl Acad Sci USA.
2010;107(11):5196-201.
 Dai C, Khaw PT, Yin ZQ, Li D, Raisman G, Li Y. Structural basis of glaucoma: the fortified
astrocytes of the optic nerve head are the target of raised intraocular pressure. Glia. 2012;
60(1):13-28.
 Damoiseaux JG, Döpp EA, Calame W, Chao D, MacPherson GG, Dijkstra CD. Rat
macrophage lysosomal membrane antigen recognized by monoclonal antibody ED1.
Immunology 1994; 83(1):140-7.
 Daubs JG, Crick RP. Effect of refractive error on the risk of ocular hypertension and open
angle glaucoma. Trans Ophthalmol Soc UK. 1981; 101(1):121-6.
 Davalos D, Grutzendler J, Yang G, Kim JV, Zuo Y, Jung S, Littman DR, Dustin ML, Gan
WB. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci.
2005; 8:752-758.
 De Keyser J, Mostert JP, Koch MW. Dysfunctional astrocytes as key players in the
pathogenesis of central nervous system disorders. J Neurol Sci. 2008; 267(1-2):3-16.
 Defaux A, Zurich MG, Braissant O, Honegger P, Monnet-Tschudi F. Effects of the PPARbeta agonist GW501516 in an in vitro model of brain inflammation and antibody-induced
demyelination. J. Neuroinflammation 2009; 6:15.
 Dengler-Crish CM, Smith MA, Inman DM, Wilson GN, Young JW, Crish SD. Anterograde
transport blockade precedes deficits in retrograde transport in the visual projection of the
DBA/2J mouse model of glaucoma. Front Neurosci. 2014; 8:290.
 DeParis S, Caprara C, Grimm C. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are
resistant to N-methyl-D-aspartic acid excitotoxicity. Mol Vis. 2012; 18:2814-27.
 Dorfman D, Fernandez DC, Chianelli M, Miranda M, Aranda ML, Rosenstein RE. Postischemic environmental enrichment protects the retina from ischemic damage in adult
rats.Exp Neurol. 2013;240:146-56.
 Dräger UC, Hubel DH. Responses to visual stimulation and relationship between visual,
auditory, and somatosensory inputs in mouse superior colliculus. J Neurophysiol. 1975;
38(3):690-713.
182
Bibliografía
 Drouyer E, Dkhissi-Benyahya O, Chiquet C, WoldeMussie E, Ruiz G, Wheeler LA, Denis P,
Cooper HM. Glaucoma alters the circadian timing system. PLoS One. 2008; 3(12):e3931.
 Du Y, Ma Z, Lin S, Dodel RC, Gao F, Bales KR, Triarhou LC, Chernet E, Perry KW, Nelson
DL, Luecke S, Phebus LA, Bymaster FP, Paul SM. Minocycline prevents nigrostriatal
dopaminergic neurodegeneration in the MPTP model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad
Sci U S A. 2001;98(25):14669-74.
 Duan Y, Sahley CL, Muller KJ. ATP and NO dually control migration of microglia to nerve
lesions. Dev Neurobiol. 2009; 69(1):60-72.
 Duguay D, Cermakian N. The crosstalk between physiology and circadian clock proteins.
Chronobiol. Int. 2009; 26(8):1479-513.
 Edmunds B, Thompson JR, Salmon JF, Wormald RP. The National Survey of
Trabeculectomy. I. Sample and methods. Eye 1999; 13 (Pt 4):524-30.
 Eng LF, Ghirnikar RS, Lee YL. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (19692000). Neurochem. Res. 2000; 25:1439-51.
 Esquiva G, Lax P, Cuenca N. Impairment of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells
associated with late stages of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013; 54:460518.
 Fan W, Li X, Wang W, Mo JS, Kaplan H, Cooper NG. Early Involvement of
Immune/Inflammatory Response Genes in Retinal Degeneration in DBA/2J Mice.
Ophthalmol. Eye Dis. 2010; 1:23-41.
 Faulkner JR, Herrmann JE, Woo MJ, Tansey KE, Doan NB, Sofroniew MV. Reactive
astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. J. Neurosci. 2004;
24(9):2143-55.
 Fei PF, Yue BY, Tso MO. Effects of chronic intracameral injections of chondroitin sulfate on
cat eyes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1984; 222:1-8.
 Felts PA, Woolston AM, Fernando HB, Asquith S, Gregson NA, Mizzi OJ, Smith KJ.
Inflammation and primary demyelination induced by the intraspinal injection of
lipopolysaccharide. Brain 2005; 128(Pt 7):1649-66.
 Fernandez DC, Bordone MP, Chianelli MS, Rosenstein RE. Retinal neuroprotection against
ischemia-reperfusion damage induced by postconditioning. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009;
50(8):3922-30.
 Fernandez DC, Sande PH, de Zavalía N, Belforte N, Dorfman D, Casiraghi LP, Golombek D,
Rosenstein RE. Effect of experimental diabetic retinopathy on the non-image-forming visual
system. Chronobiol Int. 2013; 30(4):583-97.
 Fortune B, Choe TE, Reynaud J, Hardin C, Cull GA, Burgoyne CF, Wang L. Deformation of
the rodent optic nerve head and peripapillary structures during acute intraocular pressure
elevation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011; 52(9):6651-61.
183
Bibliografía
 Fournier AE, Beer J, Arregui CO, Essagian C, Aguayo AJ, McKerracher L. Brain-derived
neurotrophic factor modulates GAP-43 but not T alpha1 expression in injured retinal ganglion
cells of adult rats. J Neurosci Res. 1997; 15; 47(6):561-72.
 Freddo TF. A contemporary concept of the blood-aqueous barrier. Prog Retin Eye Res. 2013;
32:181-95.
 Freedman MS, Lucas RJ, Soni B, von Schantz M, Munoz M, David-Gray Z, Foster R.
Regulation of mammalian circadian behavior by non-rod, non-cone, ocular photoreceptors.
Science 1999; 284: 502-504.
 Fröjdman K, Pelliniemi LJ, Lendahl U, Virtanen I, Eriksson JE. The intermediate filament
protein nestin occurs transiently in differentiating testis of rat and mouse. Differentiation
1997; 61(4):243-9.
 Fuchshofer R, Birke M, Welge-Lussen U, Kook D, Lütjen-Drecoll E. Transforming growth
factor-beta 2 modulated extracellular matrix component expression in cultured human optic
nerve head astrocytes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005; 46(2):568-78.
 Funk RH. The vessel architecture of the pars plana in the cynomolgus monkey, rat and rabbit
eye. A scanning electron microscopic study of plastic corrosion casts. Ophthalmic Res. 1993;
25(6):337-48.
 Garden GA, Möller T. Microglia biology in health and disease. J Neuroimmune Pharmacol.
2006; 1(2):127-37.
 Garrido-Mesa N, Zarzuelo A, Gálvez J. Minocycline: far beyond an antibiotic. Br J
Pharmacol. 2013;169(2):337-52.
 Geneser F. Histología, 3ra Ed. Panamericana, 2006.
 Gerometta RM, Malgor LA, Vilalta E, Leiva J, Candia OA. Cl- concentrations of bovine,
porcine and ovine aqueous humor are higher than in plasma. Exp Eye Res.2005; 80(3):307-12.
 Gibson EM, Purger D, Mount CW, Goldstein AK, Lin GL, Wood LS, Inema I, Miller SE,
Bieri G, Zuchero JB, Barres BA, Woo PJ, Vogel H, Monje M. Neuronal activity promotes
oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science 2014;
344(6183):1252304.
 Glovinsky Y, Quigley HA, Dunkelberger GR. Retinal ganglion cell loss is size dependent in
experimental glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1991; 32:484-91.
 Goldman D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nat. Rev. Neurosci.
2014; 15(7):431-42.
 Gooley JJ, Lu J, Chou TC, Scammell TE, Saper CB. Melanopsin in cells of origin of the
retinohypothalamic tract. Nat Neurosci. 2001;4(12):1165.
 Gooley JJ, Lu J, Fischer D, Saper CB. A broad role for melanopsin in nonvisual
photoreception. J Neurosci. 2003; 23:7093-106.
184
Bibliografía
 Gordon MO, Beiser JA, Brandt JD, Heuer DK, Higginbotham EJ, Johnson CA, Keltner JL,
Miller JP, Parrish RK 2nd, Wilson MR, Kass MA. The Ocular Hypertension Treatment Study:
baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Arch Ophthalmol.
2002; 120(6):714-20; discussion 829-30.
 Graeber MB. Changing face of microglia. Science 2010; 330(6005):783-8.
 Greenwood K, Butt AM. Evidence that perinatal and adult NG2-glia are not conventional
oligodendrocyte progenitors and do not depend on axons for their survival. Mol. Cell
Neurosci. 2003; 23(4):544-58..
 Grippo TM, Hood DC, Kanadani FN, Ezon I, Greenstein VC, Liebmann JM, Ritch R. A
comparison between multifocal and conventional VEP latency changes secondary to
glaucomatous damage. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006; 47:5331-5336.
 Grosche J, Grimm D, Clemens N, Reichenbach A.Retinal light damage vs. normal aging of
rats: altered morphology, intermediate filament expression, and nuclear organization of
Müller (glial) cells. J Hirnforsch. 1997;38(4):459-70.
 Grozdanic SD, Betts DM, Sakaguchi DS, Kwon YH, Kardon RH, Sonea IM. Temporary
elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats
causes functional deficits in the retina and optic nerve. Exp Eye Res. 2003; 77(1):27-33.
 Grozdanic SD, Matic M, Sakaguchi DS, Kardon RH. Evaluation of retinal status using
chromatic pupil light reflex activity in healthy and diseased canine eyes. Invest Ophthalmol
Vis Sci. 2007; 48:5178-83.
 Guasti L, Richardson D, Jhaveri M, Eldeeb K, Barrett D, Elphick MR, Alexander SP, Kendall
D, Michael GJ, Chapman V. Minocycline treatment inhibits microglial activation and alters
spinal levels of endocannabinoids in a rat model of neuropathic pain. Mol. Pain. 2009; 5:35.
 Guillery C. Quantitative studies of transneuronal atrophy in the dorsal lateral geniculate
nucleus of cats and kittens. J Comp Neurol. 1973; 149(4):423-38.
 Guillery RW, Walsh C. Changing glial organization relates to changing fiber order in the
developing optic nerve of ferrets. J Comp Neurol. 1987; 265:203-217.
 Güldner FH. Numbers of neurons and astroglial cells in the suprachiasmatic nucleus of male
and female rats. Exp Brain Res. 1983; 50(2-3):373-6.
 Guo L, Moss SE, Alexander RA, Ali RR, Fitzke FW, Cordeiro MF. Retinal ganglion cell
apoptosis in glaucoma is related to intraocular pressure and IOP-induced effects on
extracellular matrix. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005; 46(1):175-82.
 Gupta N, Yücel YH. What changes can we expect in the brain of glaucoma patients? Surv
Ophthalmol. 2007; 52 Suppl 2:S122-6.
 Gupta N, Ang LC, Noël de Tilly L, Bidaisee L, Yücel YH. Human glaucoma and neural
degeneration in intracranial optic nerve, lateral geniculate nucleus, and visual cortex. Br J
Ophthalmol. 2006; 90(6):674-8.
185
Bibliografía
 Hailer NP, Grampp A, Nitsch R: Proliferation of microglia and astrocytes in the dentate gyrus
following entorhinal cortex lesion: a quantitative bromodeoxyuridine-labelling study. Eur J
Neurosci. 1999; 11:3359-3364.
 Hanisch UK, Kettenmann H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the
normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 2007, 10:1387-1394.
 Hanisch UK. Microglia as a source and target of cytokines. Glia 2002; 40(2):140-55.
 Hankins MW, Lucas RJ. The primary visual pathway in humans is regulated according to
long-term light exposure through the action of a nonclassical photopigment. Curr Biol. 2002;
12: 191-198.
 Hannibal J, Hindersson P, Ostergaard J, Georg B, Heegaard S, Larsen PJ, Fahrenkrug J.
Melanopsin is expressed in PACAP-containing retinal ganglion cells of the human
retinohypothalamic tract. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45(11):4202-9.
 Hannibal J. Roles of PACAP-containing retinal ganglion cells in circadian timing. Int Rev
Cytol. 2006; 251:1-39.
 Harooni M, Freilich JM, Abelson M, Refojo M. Efficacy of hyaluronidase in reducing
increases in intraocular pressure related to the use of viscoelastic substances. Arch
Ophthalmol. 2000; 118:445-6.
 Hattar S, Kumar M, Park A, Tong P, Tung J, Yau KW, Berson DM. Central projections of
melanopsin-expressing retinal ganglion cells in the mouse. J Comp Neurol. 2006; 497:326-49.
 Hattar S, Liao HW, Takao M, Berson DM, Yau KW. Melanopsin-containing retinal ganglion
cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science 2002; 295(5557):106570.
 Hattar S, Lucas RJ, Mrosovsky N, Thompson S, Douglas RH, Hankins MW, Lem J, Biel M,
Hofmann F, Foster RG, Yau KW. Melanopsin and rod-cone photoreceptive systems account
for all major accessory visual functions in mice. Nature 2003; 424(6944):76-81.
 Hayasaka S, Sears ML. Distribution of acid phosphatase, glucuronidase, and lysosomal
hyaluronidase in the anterior chamber of the rabbit eye. Invest Ophthalmol Vis Sci.1978;
17:982-7.
 Haynes SE, Hollopeter G, Yang G, Kurpius D, Dailey ME, Gan WB, Julius D: The P2Y12
receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nat Neurosci. 2006,
9:1512-1519.
 Heijl A, Leske MC, Bengtsson B, Hyman L, Bengtsson B, Hussein M; Early Manifest
Glaucoma Trial Group. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results
from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch Ophthalmol. 2002; 120(10):1268-79.
 Henkind P, Hansen RI, Szalay J. In: Physiology of the Human Eye and Visual System. (RE
Records, ed.), Harper, Hagerstown, Maryland. 1979.
186
Bibliografía
 Hernandes MS, Britto LR. Inflammatory responses in the rat superior colliculus after eye
enucleation. Brain Res Bull. 2014; 101:1-6.
 Hernandez MR. The optic nerve head in glaucoma: role of astrocytes in tissue remodeling.
Prog Retin Eye Res. 2000; 19(3):297-321.
 Herrmann JE, Imura T, Song B, Qi J, Ao Y, Nguyen TK, Korsak RA, Takeda K, Akira S,
Sofroniew MV. STAT3 is a critical regulator of astrogliosis and scar formation after spinal
cord injury. J. Neurosci. 2008; 28(28):7231-43.
 Hill RA, Nishiyama A. NG2 cells (polydendrocytes): listeners to the neural network with
diverse properties. Glia 2014; 62(8):1195-210.
 Hill RA, Patel KD, Medved J, Reiss AM, Nishiyama A. NG2 cells in white matter but not
gray matter proliferate in response to PDGF. J. Neurosci. 2013; 33(36):14558-66.
 Hoffman RM. The potential of nestin-expressing hair follicle stem cells in regenerative
medicine. Expert Opin. Biol. Ther. 2007; 7(3):289-91.
 Holländer H, Makarov F, Stefani FH, Stone J. Evidence of constriction of optic nerve axons at
the lamina cribrosa in the normotensive eye in humans and other mammals. Ophthalmic Res.
1995; 27(5):296-309.
 Horky LL, Galimi F, Gage FH, Horner PJ. Fate of endogenous stem/progenitor cells
following spinal cord injury. J. Comp. Neurol. 2006; 498(4):525-38.
 Horn KP, Busch SA, Hawthorne AL, van Rooijen N, Silver J. Another barrier to regeneration
in the CNS: activated macrophages induce extensive retraction of dystrophic axons through
direct physical interactions. J. Neurosci. 2008; 28(38):9330-41.
 Hotta CT, Gardner MJ, Hubbard KE, Baek SJ, Dalchau N, Suhita D, Dodd AN, Webb AA.
Modulation of environmental responses of plants by circadian clocks. Plant Cell Environ.
2007; 30(3):333-49.
 Howell GR, Libby RT, Jakobs TC, Smith RS, Phalan FC, Barter JW, Barbay JM, Marchant
JK, Mahesh N, Porciatti V, Whitmore AV, Masland RH, John SW. Axons of retinal ganglion
cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 2007; 179:15231537.
 Hubbard WC, Johnson M, Gong H, Gabelt BT, Peterson JA, Sawhney R, Freddo T, Kaufman
PL. Intraocular pressure and outflow facility are unchanged following acute and chronic
intracameral chondroitinase ABC and hyaluronidase in monkeys. Exp Eye Res. 1997; 65:17790
 Hubel DH. Eye, brain and vision. Scientific American Library, WH Freeman (ed.), serie # 22,
New York, 1988.
 Hughes EG, Kang SH, Fukaya M, Bergles DE. Oligodendrocyte progenitors balance growth
with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nat. Neurosci. 2013;16(6):66876.
187
Bibliografía
 Hur J, Lee P, Kim MJ, Kim Y, Cho YW. Ischemia-activated microglia induces neuronal
injury via activation of gp91phox NADPH oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 2010;
391(3):1526-30.
 Imamura K, Hishikawa N, Sawada M, Nagatsu T, Yoshida M, Hashizume Y. Distribution of
major histocompatibility complex class II-positive microglia and cytokine profile of
Parkinson’s disease brains. Acta Neuropathol. 2003; 106:518-26.
 Imamura K, Onoe H, Shimazawa M, Nozaki S, Wada Y, Kato K, Nakajima H, Mizuma H,
Onoe K, Taniguchi T, Sasaoka M, Hara H, Tanaka S, Araie M, Watanabe Y. Molecular
imaging reveals unique degenerative changes in experimental glaucoma. Neuroreport. 2009;
20(2):139-44.
 Inman DM, Horner PJ. Reactive nonproliferative gliosis predominates in a chronic mouse
model of glaucoma. Glia 2007; 55(9):942-53.
 Isenmann S, Cellerino A, Gravel C, Bähr M. Excess target-derived brain-derived neurotrophic
factor preserves the transient uncrossed retinal projection to the superior colliculus. Mol. Cell.
Neurosci. 1999; 14(1):52-65.
 Ito Y, Shimazawa M, Chen YN, Tsuruma K, Yamashima T, Araie M, Hara H. Morphological
changes in the visual pathway induced by experimental glaucoma in Japanese monkeys. Exp.
Eye Res. 2009; 89(2):246-55.
 Ito Y, Shimazawa M, Inokuchi Y, Fukumitsu H, Furukawa S, Araie M, Hara H. Degenerative
alterations in the visual pathway after NMDA-induced retinal damage in mice. Brain Res.
2008; 1212:89-101.
 Jain V, Ravindran E, Dhingra NK. Differential expression of Brn3 transcription factors in
intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mouse. J Comp Neurol. 2012; 520(4):74255.
 Jakobs TC, Libby RT, Ben Y, John SW, Masland RH. Retinal ganglion cell degeneration is
topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 2005;171(2):313-25.
 Jones LL, Yamaguchi Y, Stallcup WB, Tuszynski MH. NG2 is a major chondroitin sulfate
proteoglycan produced after spinal cord injury and is expressed by macrophages and
oligodendrocyte progenitors. J. Neurosci. 2002;22(7):2792-803.
 Jurgens I, Matheu A, Castilla M. Ocular hypertension after cataract surgery: a comparison of
three surgical techniques and two viscoelastics. Ophthalmic Surg Lasers 1997; 28:30-6.
 Kaback MB, Podos SM, Harbin TS, Jr, Mandell A, Becker B. The effects of dipivalyl
epinephrine on the eye. Am J Ophthalmol. 1976; 81(6):768–772.
 Kalloniatis M, Tomisich G. Amino acid neurochemistry of the vertebrate retina. Prog Retin
Eye Res. 1999; 18:811-66.
 Kandel E. y col. Principles of Neural Science. Mc Graw Hill Companies, USA, 4th Ed, 2000,
Part V (27): 523-548.
188
Bibliografía
 Kanski JJ. Clinical Ophthalmology, 4d edition, Elsevier Health Sciences. 2005.
 Karlstetter M, Scholz R, Rutar M, Wong WT, Provis JM, Langmann T. Retinal microglia:
Just bystander or target for therapy? Prog Retin Eye Res. 2014 Dec 2.
 Keller KE, Bradley JM, Vranka JA, Acott TS. Segmental versican expression in the trabecular
meshwork and involvement in outflow facility. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011; 52(8):504957.
 Kierdorf K, Prinz M. Factors regulating microglia activation. Front Cell Neurosci. 2013; 7:44.
 Kigerl KA, Gensel JC, Ankeny DP, Alexander JK, Donnelly DJ, Popovich PG. Identification
of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or
regeneration in the injured mouse spinal cord. J. Neurosci. 2009; 29(43):13435-44.
 Kim SU, de Vellis J. Microglia in health and disease. J Neurosci Res. 2005; 81(3):302-13.
 Klein BE, Klein R, Jensen SC. Open-angle glaucoma and older-onset diabetes. The Beaver
Dam Eye Study. Ophthalmology 1994; 101(7):1173-7.
 Klein D, Moore RY, Reppert SM. (Eds.). Suprachiasmatic Nucleus: The Mind’s Clock.
Oxford University Press, Oxford. 1991.
 Klerman EB, Gershengorn HB, Duffy JF, Kronauer RE. Comparisons of the variability of
three markers of the human circadian pacemaker. J Biol Rhythms. 2002; 17(2):181-93.
 Knepper PA, Collins JA, Frederick R. Effects of dexamethasone, progesterone, and
testosterone on IOP and GAGs in the rabbit eye. Invest Ophthalmol Vis Sci.1985; 26:10931100.
 Knepper PA, Fadel JR, Miller AM, Goossens W, Choi J, Nolan MJ, Whitmer S.
Reconstitution of trabecular meshwork GAGs: influence of hyaluronic acid and chondroitin
sulfate on flow rates. J Glaucoma. 2005; 14:230-238.
 Knepper PA, Farbman AI, Telser AG. Exogenous hyaluronidases and degradation of
hyaluronic acid in the rabbit eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1984; 25(3):286-93.
 Knepper PA, Goossens W, Hvizd M, Palmberg PF. Glycosaminoglycans of the human
trabecular meshwork in primary open-angle glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1996;
37:1360-7.
 Kohn AN, Moss AP, Podos SM. Relative afferent pupillary defects in glaucoma without
characteristic field loss. Arch Ophthalmol. 1979; 97(2):294–296.
 Kohno H, Sakai T, Kitahara K. Induction of nestin, Ki-67, and cyclin D1 expression in Müller
cells after laser injury in adult rat retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 2006;
244(1):90-5.
 Kolker AE, Hetherington J Jr. Becker-Shaffer's diagnosis and therapy of the glaucomas. 5th
ed. St Louis, CV Mosby, 1981.
189
Bibliografía
 Kong YX, Crowston JG, Vingrys AJ, Trounce IA, Bui VB. Functional changes in the retina
during and after acute intraocular pressure elevation in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci.
2009; 50(12):5732-40.
 Kraus RL, Pasieczny R, Lariosa-Willingham K, Turner MS, Jiang A, Trauger JW.
Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct
radical-scavenging activity. J Neurochem. 2005;94(3):819-27.
 Kreutzberg GW. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci.
1996; 19:312-318.
 Kriz J, Nguyen MD, Julien JP. Minocycline slows disease progression in a mouse model of
amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 2002; 10(3):268-78.
 Krout KE, Kawano J, Mettenleiter TC, Loewy AD. CNS inputs to the suprachiasmatic
nucleus of the rat. Neuroscience 2002; 110(1):73-92.
 Krstić, RV. Human microscopic anatomy. Springer-Verlag. 1997.
 Kuchibhotla KV, Lattarulo CR, Hyman BT, Bacskai BJ. Synchronous hyperactivity and
intercellular calcium waves in astrocytes in Alzheimer mice. Science 2009; 323(5918):1211-5.
 Kursula P. Structural properties of proteins specific to the myelin sheath. Amino Acids 2008;
34(2):175-85.
 La Morgia C, Ross-Cisneros FN, Sadun AA, Hannibal J, Munarini A, Mantovani V, Barboni
P, Cantalupo G, Tozer KR, Sancisi E, Salomao SR, Moraes MN, Moraes-Filho MN,
Heegaard S, Milea D, Kjer P, Montagna P, Carelli V. Melanopsin retinal ganglion cells are
resistant to neurodegeneration in mitochondrial optic neuropathies. Brain 2010; 133:2426-38.
 Lafuente MP, Villegas-Pérez MP, Sellés-Navarro I, Mayor-Torroglosa S, Miralles de Imperial
J, Vidal-Sanz M. Retinal ganglion cell death after acute retinal ischemia is an ongoing process
whose severity and duration depends on the duration of the insult. Neuroscience 2002;
109(1):157-68.
 Lam DY, Kaufman PL, Gabelt BT, Matsubara JA. Cortical consequences of elevated
intraocular pressure in primate model of glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000;
41(4)S831. Abstract 4413.
 Lam DY, Kaufman PL, Gabelt BT, To EC, Matsubara JA. Neurochemical correlates of
cortical plasticity after unilateral elevated intraocular pressure in a primate model of
glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44(6):2573-81.
 Lam D, Jim J, To E, Rasmussen C, Kaufman PL, Matsubara J. Astrocyte and microglial
activation in the lateral geniculate nucleus and visual cortex of glaucomatous and optic nerve
transected primates. Mol. Vis. 2009; 15:2217-29.
 LaVail MM. Rod outer segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting.
Science. 1976; 194(4269):1071-4.
190
Bibliografía
 Lendahl U, Zimmerman LB, McKay RD. CNS stem cells express a new class of intermediate
filament protein. Cell 1990; 60(4):585-95.
 Levine JM, Enquist LW, Card JP. Reactions of oligodendrocyte precursor cells to alpha
herpesvirus infection of the central nervous system. Glia 1998; 23(4):316-28.
 Levkovitch-Verbin H, Kalev-Landoy M, Habot-Wilner Z, Melamed S. Minocycline delays
death of retinal ganglion cells in experimental glaucoma and after optic nerve transection.
Arch Ophthalmol. 2006; 124(4):520-6.
 Levkovitch-Verbin H, Makarovsky D, Vander S. Comparison between axonal and retinal
ganglion cell gene expression in various optic nerve injuries including glaucoma. Mol Vis.
2013; 19:2526-41.
 Levkovitch-Verbin H, Martin KR, Quigley HA, Baumrind LA, Pease ME, Valenta D.
Measurement of amino acid levels in the vitreous humor of rats after chronic intraocular
pressure elevation or optic nerve transection. J Glaucoma 2002; 11:396-405.
 Levkovitch-Verbin H, Spierer O, Vander S, Dardik R. Similarities and differences between
primary and secondary degeneration of the optic nerve and the effect of minocycline. Graefes
Arch Clin Exp Ophthalmol. 2011; 249(6):849-57.
 Levkovitch-Verbin H, Waserzoog Y, Vander S, Makarovsky D, Piven I. Minocycline
upregulates pro-survival genes and downregulates pro-apoptotic genes in experimental
glaucoma. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 2014; 252(5):761-72.
 Li RS, Chen BY, Tay DK, Chan HH, Pu ML, So KF. Melanopsin-expressing retinal ganglion
cells are more injury-resistant in a chronic ocular hypertension model. Invest Ophthalmol Vis
Sci. 2006; 47:2951-8.
 Li SY, Yau SY, Chen BY, Tay DK, Lee VW, Pu ML, Chan HH, So KF. Enhanced survival of
melanopsin-expressing retinal ganglion cells after injury is associated with the PI3 K/Akt
pathway. Cell Mol Neurobiol. 2008; 28:1095-107.
 Libby RT, Anderson MG, Pang IH, Robinson ZH, Savinova OV, Cosma IM, Snow A, Wilson
LA, Smith RS, Clark AF, John SW. Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease
features for studying the neurodegeneration. Vis Neurosci. 2005; 22(5):637-48.
 Libby RT, Li Y, Savinova OV, Barter J, Smith RS, Nickells RW, John SW. Susceptibility to
neurodegeneration in a glaucoma is modified by Bax gene dosage. PLoS Genet. 2005;
1(1):17-26.
 Liu KM, Shen CL. Ultrastructural sequence of myelin breakdown during Wallerian
degeneration in the rat optic nerve. Cell Tissue Res. 1985; 242(2):245-56.
 Liu M, Guo L, Salt TE, Cordeiro MF. Dendritic changes in rat visual pathway associated with
experimental ocular hypertension. Curr Eye Res. 2014; 39(9):953-63.
 Liu W, Tang Y, Feng J. Cross talk between activation of microglia and astrocytes in
pathological conditions in the central nervous system. Life Sci. 2011; 89:141-6.
191
Bibliografía
 Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol
reagent. J Biol Chem. 1951; 193:265-75.
 Lucas RJ, Douglas RH, Foster RG. Characterization of an ocular photopigment capable of
driving pupillary constriction in mice. Nat Neurosci. 2001;4(6):621-6.
 Lucas RJ, Hattar S, Takao M, Berson DM, Foster RG, Yau KW. Diminished pupillary light
reflex at high irradiances in melanopsin-knockout mice. Science 2003; 299: 245-247.
 Luna G, Lewis GP, Banna CD, Skalli O, Fisher SK. Expression profiles of nestin and
synemin in reactive astrocytes and Müller cells following retinal injury: a comparison with
glial fibrillar acidic protein and vimentin. Mol. Vis. 2010; 16:2511-23.
 Lund RD, Land PW, Boles J. Normal and abnormal uncrossed retinotectal pathways in rats:
an HRP study in adults. J. Comp. Neurol. 1980; 189(4):711-20.
 Lund RD. Uncrossed visual pathways of hooded and albino rats. Science 1965; 149:15061507.
 Luo XG, Chen SD. The changing phenotype of microglia from homeostasis to disease. Transl
Neurodegener. 2012; 1(1):9.
 Lytle JM, Chittajallu R, Wrathall JR, Gallo V. NG2 cell response in the CNP-EGFP mouse
after contusive spinal cord injury. Glia 2009; 57(3):270-85.
 Lytle JM, Vicini S, Wrathall JR. Phenotypic changes in NG2+ cells after spinal cord injury. J.
Neurotrauma 2006; 23(12):1726-38.
 Ma M, Ferguson TA, Schoch KM, Li J, Qian Y, Shofer FS, Saatman KE, Neumar RW.
Calpains mediate axonal cytoskeleton disintegration during Wallerian degeneration.
Neurobiol Dis. 2013; 56:34-46.
 Macknight AD, McLaughlin CW, Peart D, Purves RD, Carre DA, Civan MM. Formation of
the aqueous humor. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2000; 27(1-2):100-6.
 Maier K, Merkler D, Gerber J, Taheri N, Kuhnert AV, Williams SK, Neusch C, Bähr
M, Diem R. Multiple neuroprotective mechanisms of minocycline in autoimmune CNS
inflammation. Neurobiol Dis. 2007; 25(3):514-25.
 Malone P, Miao H, Parker A, Juarez S, Hernandez MR. Pressure induces loss of gap junction
communication and redistribution of connexin 43 in astrocytes. Glia 2007; 55:1085-98.
 Masland RH. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 2001b; 11(4):431-6.
 Masland RH. The fundamental plan of the retina. Nat Neurosci. 2001a; 4(9):877-86.
 Matthews MR. Further observations on transneuronal degeneration in the lateral geniculate
nucleus of the macaque monkey. J Anat.1964; 98:255-63.
192
Bibliografía
 Matute C, Melone M, Vallejo-Illarramendi A, Conti F. Increased expression of the astrocytic
glutamate transporter GLT-1 in the prefrontal cortex of schizophrenics. Glia 2005; 49(3):4515.
 May PJ. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Prog Brain
Res. 2006; 151:321-78.
 McGeer PL, Itagaki S, Tago H, McGeer EG. Reactive microglia in patients with senile
dementia of the Alzheimer type are positive for the histocompatibility glycoprotein HLA-DR.
Neurosci Lett. 1987; 79:195-200.
 McLoon SC. Response of astrocytes in the visual system to Wallerian degeneration: an
immunohistochemical analysis of laminin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). Exp
Neurol. 1986; 91:613-21.
 McTigue DM, Wei P, Stokes BT. Proliferation of NG2-positive cells and altered
oligodendrocyte numbers in the contused rat spinal cord. J. Neurosci. 2001; 21(10):3392-400.
 Mehlem A, Hagberg CE, Muhl L, Eriksson U, Falkevall A. Imaging of neutral lipids by oil
red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nat. Protoc. 2013;8(6):114954.
 Melyan Z, Tarttelin EE, Bellingham J, Lucas RJ, Hankins MW. Addition of human
melanopsin renders mammalian cells photoresponsive. Nature 2005; 433(7027):741-5.
 Meyer DB. The avian eye and its adaptations. En: The Visual System in Vertebrates.
Crescitelli F, ed. Springer- Verlag, Berlín, 1977; p. 549-611.
 Minckler DS, Bunt AH, Johanson GW. Orthograde and retrograde axoplasmic transport
during acute ocular hypertension in the monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1977; 16(5):42641.
 Minckler DS, Tso MO, Zimmerman LE. A light microscopic, autoradiographic study of
axoplasmic transport in the optic nerve head during ocular hypotony, increased intraocular
pressure, and papilledema. Am J Ophthalmol. 1976; 82(5):741-57.
 Miron VE, Boyd A, Zhao JW, Yuen TJ, Ruckh JM, Shadrach JL, van Wijngaarden P, Wagers
AJ, Williams A, Franklin RJ, ffrench-Constant C. M2 microglia and macrophages drive
oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nat. Neurosci. 2013; 16(9):12118.
 Moga MM, Moore RY. Organization of neural inputs to the suprachiasmatic nucleus in the
rat. J Comp Neurol. 1997; 389(3):508-34.
 Moreno MC, Campanelli J, Sande P, Sánez DA, Keller Sarmiento MI, Rosenstein RE. Retinal
oxidative stress induced by high intraocular pressure. Free Radic Biol Med. 2004; 37(6):80312.
 Moreno MC, de Zavalía N, Sande P, Jaliffa CO, Fernandez DC, Keller Sarmiento
MI, Rosenstein RE. Effect of ocular hypertension on retinal GABAergic activity. Neurochem
Int. 2008; 52(4-5):675-82.
193
Bibliografía
 Moreno MC, Marcos HJ, Oscar Croxatto J, Sande PH, Campanelli J, Jaliffa CO, Benozzi
J, Rosenstein RE. A new experimental model of glaucoma in rats through intracameral
injections of hyaluronic acid. Exp Eye Res. 2005a; 81(1):71-80.
 Moreno MC, Sande P, Marcos HA, de Zavalía N, Keller Sarmiento MI, Rosenstein RE. Effect
of glaucoma on the retinal glutamate/glutamine cycle activity. FASEB J. 2005b; 19(9):1161-2.
 Morigiwa K, Quan M, Murakami M, Yamashita M, Fukuda Y. P2 Purinoceptor expression
and functional changes of hypoxia-activated cultured rat retinal microglia. Neurosci Lett.
2000; 282:153-6.
 Morin LP, Blanchard JH, Provencio I. Retinal ganglion cell projections to the hamster
suprachiasmatic nucleus, intergeniculate leaflet, and visual midbrain: bifurcation and
melanopsin immunoreactivity. J Comp Neurol. 2003; 465(3):401-16.
 Morrison JC, DeFrank MP, Van Buskirk EM. Comparative microvascular anatomy of
mammalian ciliary processes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1987; 28(8):1325-40.
 Morrison JC, Dorman-Pease ME, Dunkelberger GR, Quigley HA. Optic nerve head
extracellular matrix in primary optic atrophy and experimental glaucoma. Arch Ophthalmol.
1990; 108(7):1020-4.
 Morrison JC, Moore CG, Deppmeier LM, Gold BG, Meshul CK, Johnson EC. A rat model of
chronic pressure-induced optic nerve damage. Exp Eye Res. 1997; 64(1):85-96.
 Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev
Immunol. 2008; 8(12):958-69.
 Mrak RE, Griffinbc WS. The role of activated astrocytes and of the neurotrophic cytokine
S100B in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Neurobiol Aging 2001; 22(6):915-22.
 Mrosovsky N, Hattar S. Impaired masking responses to light in melanopsin-knockout mice.
Chronobiol Int. 2003; 20: 989-999.
 Murta V, Pitossi FJ, Ferrari CC. CNS response to a second pro-inflammatory event depends
on whether the primary demyelinating lesion is active or resolved. Brain Behav. Immun.
2012;26(7):1102-15.
 Nadal-Nicolás FM, Jiménez-López M, Sobrado-Calvo P, Nieto-López L, Cánovas-Martínez I,
Salinas-Navarro M, Vidal-Sanz M, Agudo M. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells:
qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest
Ophthalmol Vis Sci. 2009; 50(8):3860-8.
 Nakazawa T, Nakazawa C, Matsubara A, Noda K, Hisatomi T, She H, Michaud N, HafeziMoghadam A, Miller JW, Benowitz LI. Tumor necrosis factor-alpha mediates
oligodendrocyte death and delayed retinal ganglion cell loss in a mouse model of glaucoma. J
Neurosci. 2006; 26(49):12633-41.
 Napoli I, Neumann H. Protective effects of microglia in multiple sclerosis. Exp Neurol. 2010;
225:24-28.
194
Bibliografía
 Narciso MS, Hokoç JN, Martinez AM. Watery and dark axons in Wallerian degeneration of
the opossum's optic nerve: different patterns of cytoskeletal breakdown? An Acad Bras Cienc.
2001; 73(2):231-43.
 Nave KA. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 2010; 468(7321):24452.
 Newman GC, Hospod FE. Rhythm of suprachiasmatic nucleus 2-deoxyglucose uptake in
vitro. Brain Res. 1986; 381(2):345-50.
 Nimmerjahn A, Kirchhoff F, Helmchen F. Resting microglial cells are highly dynamic
surveillants of brain parenchyma in vivo. Science 2005; 308(5726):1314-8.
 Nishiyama A, Suzuki R, Zhu X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair.
Front. Neurosci. 2014;8:133.
 Niven JE, Laughlin SB. Energy limitation as a selective pressure on the evolution of sensory
systems. J Exp Biol. 2008; 211(Pt 11):1792-804.
 O’Donnell SL, Frederick TJ, Krady JK, Vannucci SJ, Wood TL: IGF-I and
microglia/macrophage proliferation in the ischemic mouse brain. Glia 2002, 39:85-97.
 Okada S, Nakamura M, Katoh H, Miyao T, Shimazaki T, Ishii K, Yamane J, Yoshimura A,
Iwamoto Y, Toyama Y, Okano H. Conditional ablation of Stat3 or Socs3 discloses a dual role
for reactive astrocytes after spinal cord injury. Nat. Med. 2006; 12(7):829-34.
 Osborne NN, Block F, Sontag KH. Reduction in ocular blood flow results in glial fibrillary
acidic protein (GFAP) expression in rat Muller cells. Vis. Neurosci.1991; 7(6):637- 9.
 Panda S, Nayak SK, Campo B, Walker JR, Hogenesch JB, Jegla T. Illumination of the
melanopsin signaling pathway. Science 2005; 307(5709):600-4.
 Panda S, Provencio I, Tu DC, Pires SS, Rollag MD, Castrucci AM, Pletcher MT, Sato TK,
Wiltshire T, Andahazy M, Kay SA, Van Gelder RN, Hogenesch JB. Melanopsin is required
for non-image-forming photic responses in blind mice. Science 2003; 301(5632):525-7.
 Panda S, Sato TK, Castrucci AM, Rollag MD, DeGrip WJ, Hogenesch JB, Provencio I, Kay
SA. Melanopsin (Opn4) requirement for normal light-induced circadian phase shifting.
Science 2002; 298: 2213-6.
 Pang IH, Clark AF. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. J.
Glaucoma. 2007; 16(5):483-505.
 Papst N, Bopp M, Schnaudigel OE. Pattern electroretinogram and visually evoked cortical
potentials in glaucoma. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1984; 222:29-33.
 Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Amsterdam: Elsevier, 1997.
 Payne SC, Bartlett CA, Harvey AR, Dunlop SA, Fitzgerald M. Myelin sheath decompaction,
axon swelling, and functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve.
Invest Ophthalmol Vis Sci. 2012; 53(10):6093-101.
195
Bibliografía
 Pearson HE, Stoffler DJ. Retinal ganglion cell degeneration following loss of postsynaptic
target neurons in the dorsal lateral geniculate nucleus of the adult cat. Exp Neurol. 1992;
116(2):163-71.
 Pease ME, McKinnon SJ, Quigley HA, Kerrigan-Baumrind LA, Zack DJ. Obstructed axonal
transport of BDNF and its receptor TrkB in experimental glaucoma. Invest Ophthalmol Vis
Sci. 2000; 41(3):764-74.
 Peirson SN, Halford S, Foster RG. The evolution of irradiance detection: melanopsin and the
non-visual opsins. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2009; 364(1531):2849-65.
 Pekny M, Wilhelmsson U, Bogestål YR, Pekna M. The role of astrocytes and complement
system in neural plasticity. Int. Rev. Neurobiol. 2007; 82:95-111.
 Perganta G, Barnard AR, Katti C, Vachtsevanos A, Douglas RH, MacLaren RE, Votruba M,
Sekaran S. Non-image-forming light driven functions are preserved in a mouse model of
autosomal dominant optic atrophy. PLoS One 2013; 8:e56350.
 Perge JA, Koch K, Miller R, Sterling P, Balasubramanian V. How the optic nerve allocates
space, energy capacity, and information. J Neurosci. 2009; 29(24):7917-28.
 Perge JA, Niven JE, Mugnaini E, Balasubramanian V, Sterling P. Why do axons differ in
caliber? J Neurosci. 2012; 32(2):626-38.
 Perry VH, Gordon S. Macrophages and microglia in the nervous system. Trends Neurosci.
1988; 11(6):273-7.
 Pinteaux-Jones F, Sevastou IG, Fry VA, Heales S, Baker D, Pocock JM. Myelin-induced
microglial neurotoxicity can be controlled by microglial metabotropic glutamate receptors. J.
Neurochem. 2008; 106(1):442-54.
 Polazzi E, Contestabile A. Reciprocal interactions between microglia and neurons: from
survival to neuropathology. Rev Neurosci. 2002; 13:221-42.
 Prins M, Eriksson C1, Wierinckx A, Bol JG, Binnekade R, Tilders FJ, Van Dam AM.
Interleukin-1 and interleukin-1 receptor antagonist appear in grey matter additionally to
white matter lesions during experimental multiple sclerosis. PLoS One 2013;8(12):e83835.
 Provencio I, Rollag MD, Castrucci AM. Photoreceptive net in the mammalian retina. This
mesh of cells may explain how some blind mice can still tell day from night. Nature 2002;
415(6871):493.
 Prywes AS. Unilateral afferent pupillary defects in asymmetric glaucoma. Arch Ophthalmol.
1976; 94(8):1286–1288.
 Pyo H, Yang MS, Jou I, Joe EH. Wortmannin enhances lipopolysaccharide-induced inducible
nitric oxide synthase expression in microglia in the presence of astrocytes in rats. Neurosci
Lett. 2003; 346:141-144.
196
Bibliografía
 Qiu X, Kumbalasiri T, Carlson SM, Wong KY, Krishna V, Provencio I, Berson DM.
Induction of photosensitivity by heterologous expression of melanopsin. Nature 2005;
433(7027):745-9.
 Quigley HA, Addicks EM, Green WR, Maumenee AE.Optic nerve damage in human
glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Arch Ophthalmol. 1981;
99(4):635-49.
 Quigley HA, Addicks EM. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended
intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Invest Ophthalmol Vis
Sci. 1980; 19(2):137-52.
 Quigley HA, Enger C, Katz J, Sommer A, Scott R, Gilbert D. Risk factors for the
development of glaucomatous visual field loss in ocular hypertension. Arch Ophthalmol.
1994; 112(5):644-9.
 Quigley HA, McKinnon SJ, Zack DJ, Pease ME, Kerrigan-Baumrind LA, Kerrigan DF,
Mitchell RS. Retrograde axonal transport of BDNF in retinal ganglion cells is blocked by
acute IOP elevation in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000; 41(11):3460-6.
 Ralph M, Lehman M. Transplantation: a new tool in the analysis of the mammalian
hipothalamic circadian pacemaker. Trends Neurosci. 1991; 14:362-366.
 Rao K, Lund RD. Degeneration of optic axons induces the expression of major
histocompatibility antigens. Brain Res. 1989; 488(1-2):332-5.
 Reese BE. 'Hidden lamination' in the dorsal lateral geniculate nucleus: the functional
organization of this thalamic region in the rat. Brain Res. 1988; 472(2):119-37.
 Reichenbach A, Stolzenburg JU, Eberhardt W, Chao TI, Dettmer D, Hertz L. What do retinal
müller (glial) cells do for their neuronal 'small siblings'? J Chem Neuroanat. 1993; 6(4):20113.
 Reichstein D, Ren L, Filippopoulos T, Mittag T, Danias J. Apoptotic retinal ganglion cell
death in the DBA/2 mouse model of glaucoma. Exp Eye Res. 2007; 84(1):13-21.
 Richler M, Werner EB, Thomas D. Risk factors for progression of visual field defects in
medically treated patients with glaucoma. Can J Ophthalmol. 1982; 17(6):245-8.
 Ringvold A, Anderssen E, Kjønniksen I. Distribution of ascorbate in the anterior bovine eye.
Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000; 41(1):20-3.
 Robinson GA, Madison RD. Axotomized mouse retinal ganglion cells containing melanopsin
show enhanced survival, but not enhanced axon regrowth into a peripheral nerve graft. Vision
Res. 2004; 44:2667-74.
 Rodger J, Symonds AC, Springbett J, Shen WY, Bartlett CA, Rakoczy PE, Beazley LD,
Dunlop SA. Eph/ephrin expression in the adult rat visual system following localized retinal
lesions: localized and transneuronal up-regulation in the retina and superior colliculus. Eur. J.
Neurosci. 2005; 22(8):1840-52.
197
Bibliografía
 Rodieck, RW. Visual pigments: bleaching and regeneration. The vertebrate retina. Principles
of structure and function. WH Freeman and Company, San Francisco. 1973; Cap.VIII.199237.
 Rosenbaum DM, Rosenbaum PS, Singh M, Gupta G, Gupta H, Li B, Roth S. Functional and
morphologic comparison of two methods to produce transient retinal ischemia in the rat. J
Neuroophthalmol. 2001; 21(1):62-8.
 Rouach N, Calvo CF, Glowinski J, Giaume C. Brain macrophages inhibit gap junctional
communication and downregulate connexin 43 expression in cultured astrocytes. Eur J
Neurosci. 2002; 15:403-7.
 Ruby NF, Brennan TJ, Xie X, Cao V, Franken P, Heller HC, O'Hara BF. Role of melanopsin
in circadian responses to light. Science 2002; 298: 2211-3.
 Saggu SK, Chotaliya HP, Blumbergs PC, Casson RJ. Wallerian-like axonal degeneration in
the optic nerve after excitotoxic retinal insult: an ultrastructural study. BMC Neurosci. 2010;
11:97.
 Sakamoto K, Liu C, Kasamatsu M, Pozdeyev NV, Iuvone PM, Tosini G. Dopamine regulates
melanopsin mRNA expression in intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.Eur J
Neurosci. 2005; 22:3129-36.
 Salido EM, Dorfman D, Bordone M, Chianelli MS, Sarmiento MI, Aranda M, Rosenstein RE.
Ischemic conditioning protects the rat retina in an experimental model of early type 2
diabetes. Exp Neurol. 2013;240:1-8.
 Salinas-Navarro M, Jiménez-López M, Valiente-Soriano FJ, Alarcón-Martínez L, AvilésTrigueros M, Mayor S, Holmes T, Lund RD, Villegas-Pérez MP, Vidal-Sanz M. Retinal
ganglion cell population in adult albino and pigmented mice: a computerized analysis of the
entire population and its spatial distribution. Vision Res. 2009; 49(6):637-47.
 Sanchez Mejia RO, Ona VO, Li M, Friedlander RM. Minocycline reduces traumatic brain
injury-mediated caspase-1 activation, tissue damage, and neurological dysfunction.
Neurosurgery 2001; 48(6):1393-9; discussion 1399-401.
 Sappington RM, Carlson BJ, Crish SD, Calkins DJ. The microbead occlusion model: a
paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010;
51(1):207-16.
 Sasaoka M, Nakamura K, Shimazawa M, Ito Y, Araie M, Hara H. Changes in visual fields
and lateral geniculate nucleus in monkey laser-induced high intraocular pressure model. Exp.
Eye Res. 2008; 86(5):770-82.
 Sawaguchi S, Yue BY, Yeh P, Tso MO. Effects of intracameral injection of chondroitinase
ABC in vivo. Arch Ophthalmol. 1992; 110:110-7.
 Schlamp CL, Li Y, Dietz JA, Janssen KT, Nickells RW. Progressive ganglion cell loss and
optic nerve degeneration in DBA/2J mice is variable and asymmetric. BMC Neurosci. 2006;
7:66.
198
Bibliografía
 Schmidt TM, Do MT, Dacey D, Lucas R, Hattar S, Matynia A. Melanopsin-positive
intrinsically photosensitive retinal ganglion cells: from form to function. J Neurosci. 2011;
31(45):16094-101.
 Schmidt-Kastner R, Wietasch K, Weigel H, Eysel UT. Immunohistochemical staining for
glial fibrillary acidic protein (GFAP) after deafferentation or ischemic infarction in rat visual
system: features of reactive and damaged astrocytes. Int J Dev Neurosci. 1993;11(2):157-74.
 Schnitzer J. Retinal astrocytes: their restriction to vascularized parts of the mammalian retina.
Neurosci Lett. 1987; 78(1):29-34.
 Schnitzer J. Astrocytes in the guinea pig, horse, and monkey retina: their occurrence coincides
with the presence of blood vessels. Glia 1988; 1(1):74-89.
 Sears ML. Regulation of aqueous flow by the adenylate cyclase receptor complex in the
ciliary epithelium. Am J Ophthalmol. 1985; 100:194-8.
 Sejersen T, Lendahl U. Transient expression of the intermediate filament nestin during
skeletal muscle development. J. Cell Sci. 1993; 106 (Pt 4):1291-300.
 Semo M, Lupi D, Peirson SN, Butler JN, Foster RG. Light-induced c-fos in melanopsin
retinal ganglion cells of young and aged rodless/coneless (rd/rd cl) mice.Eur J Neurosci.
2003;18:3007-17.
 Seung HS, Sümbül U. Neuronal cell types and connectivity: lessons from the retina. Neuron
2014;83(6):1262-72.
 Shareef SR, Garcia-Valenzuela E, Salierno A, Walsh J, Sharma SC. Chronic ocular
hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Exp Eye Res. 1995. 61(3):379-82.
 Sherman SM, Guillery RW. Functional organization of thalamocortical relays. J
Neurophysiol. 1996; 76(3):1367-95.
 Shields MB. Normal-tension glaucoma: is it different from primary open-angle glaucoma?
Curr Opin Ophthalmol. 2008; 19(2):85-8.
 Shin DH, Beker B, Kolker AE. Family history in primary open angle glaucoma. Arch
Ophtalmol. 1977; 95:598.
 Sihota R, Goyal A, Kaur J, Gupta V, Nag TC. Scanning electron microscopy of the trabecular
meshwork: understanding the pathogenesis of primary angle closure glaucoma. Indian J
Ophthalmol. 2012; 60(3):183-8.
 Siminoff R, Schwassmann HO, Kruger L. An electrophysiological study of the visual
projection to the superior colliculus of the rat. J Comp Neurol. 1966; 127(4):435-44.
 Simon C, Götz M, Dimou L. Progenitors in the adult cerebral cortex: cell cycle properties and
regulation by physiological stimuli and injury. Glia 2011; 59(6):869-81.
 Sommer A. Intraocular pressure and glaucoma. Am J Ophthalmol. 1989; 107(2):186–188.
199
Bibliografía
 Son JL, Soto I, Oglesby E, Lopez-Roca T, Pease ME, Quigley HA, Marsh-Armstrong N.
Glaucomatous optic nerve injury involves early astrocyte reactivity and late oligodendrocyte
loss. Glia 2010; 58(7):780-9.
 Steele MR, Inman DM, Calkins DJ, Horner PJ, Vetter ML. Microarray analysis of retinal
gene expression in the DBA/2J model of glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2006;
47(3):977-85.
 Stence N, Waite M, Dailey ME. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse
analysis in hippocampal slices. Glia. 2001; 33(3):256-66.
 Stone J, Dreher Z. Relationship between astrocytes, ganglion cells and vasculature of the
retina. J Comp Neurol. 1987; 255(1):35-49.
 Streit WJ. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia 2002;
40:133-139.
 Sun D, Lye-Barthel M, Masland RH, Jakobs TC. The morphology and spatial arrangement of
astrocytes in the optic nerve head of the mouse. J Comp Neurol. 2009; 516(1):1-19.
 Tamm ER, Carassa RG, Albert DM, Gabelt BT, Patel S, Rasmussen CA, Kaufman PL.
Viscocanalostomy in rhesus monkeys. Arch Ophthalmol. 2004; 122(12):1826-38.
 Tanaka H, Ito Y, Nakamura S, Shimazawa M, Hara H. Involvement of brain-derived
neurotrophic factor in time-dependent neurodegeneration in the murine superior colliculus
after intravitreal injection of N-methyl-D-aspartate. Mol Vis. 2009; 15:662-9.
 Teng YD, Choi H, Onario RC, Zhu S, Desilets FC, Lan S, Woodard EJ, Snyder EY, Eichler
ME, Friedlander RM. Minocycline inhibits contusion-triggered mitochondrial cytochrome c
release and mitigates functional deficits after spinal cord injury. Proc Natl Acad Sci U S A.
2004;101(9):3071-6.
 Tezel G, Hernandez MR, Wax MB. In vitro evaluation of reactive astrocyte migration, a
component of tissue remodeling in glaucomatous optic nerve head. Glia 2001; 34(3):178-89.
 Thapan K, Arendt J, Skene DJ. An action spectrum for melatonin suppression: evidence for a
novel non-rod, non-cone photoreceptor system in humans. J Physiol. 2001; 535: 261-7.
 Tian B, Geiger B, Epstein DL, Kaufman PL Cytoskeletal involvement in the regulation of
aqueous humor outflow. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000; 41(3):619-23..
 Tian GF, Azmi H, Takano T, Xu Q, Peng W, Lin J, Oberheim N, Lou N, Wang X, Zielke HR,
Kang J, Nedergaard M. An astrocytic basis of epilepsy. Nat Med. 2005; 11(9):973-81.
 Tielsch JM, Sommer A, Katz J, Royall RM, Quigley HA, Javitt J. Racial variations in the
prevalence of primary open-angle glaucoma. The Baltimore Eye Survey. JAMA 1991;
266(3):369-74.
 Tokuda K, Zorumski CF, Izumi Y. Effects of ascorbic acid on UV light-mediated
photoreceptor damage in isolated rat retina. Exp Eye Res. 2007; 84:537–543.
200
Bibliografía
 Towle VL, Moskowitz A, Sokol S, Schwartz B. The visual evoked potential in glaucoma and
ocular hypertension: effects of check size, field size, and stimulation rate. Invest Ophthalmol
Vis Sci. 1983; 24:175-83.
 Tsiperson V, Li X, Schwartz GJ, Raine CS, Shafit-Zagardo B. GAS6 enhances repair
following cuprizone-induced demyelination. PLoS One 2010; 5(12):e15748.
 Ueda J, Sawaguchi S, Hanyu T, et al. Experimental glaucoma model in the rat induced by
laser trabecular photocoagulation after an intracameral injection of India ink. Jpn J
Ophthalmol. 1998; 42: 337-344.
 Valamanesh F, Monnin J, Morand-Villeneuve N, Michel G, Zaher M, Miloudi S, Chemouni
D, Jeanny JC, Versaux-Botteri C. Nestin expression in the retina of rats with inherited retinal
degeneration. Exp. Eye Res. 2013; 110:26-34.
 Van Buskirk EM, Brett J. The canine eye: in vitro dissolution of the barriers to aqueous
outflow. Invest Ophthalmol Vis Sci.1978; 17:258-71.
 Van Rossum D, Hanisch UK. Microglia. Metab Brain Dis. 2004, 19:393-411.
 Vickers JC, Hof PR, Schumer RA, Wang RF, Podos SM, Morrison JH. Magnocellular and
parvocellular visual pathways are both affected in a macaque monkey model of glaucoma.
Aust N Z J Ophthalmol. 1997; 25(3):239-43.
 Vinet J, Weering HR, Heinrich A, Kälin RE, Wegner A, Brouwer N, Heppner FL, Rooijen
Nv, Boddeke HW, Biber K. Neuroprotective function for ramified microglia in hippocampal
excitotoxicity. J Neuroinflammation. 2012; 9:27.
 Viswanathan S, Frishman LJ, Robson JG. The uniform field and pattern ERG in macaques
with experimental glaucoma: removal of spiking activity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000;
41:2797-810.
 Vugler AA, Semo M, Joseph A, Jeffery G. Survival and remodeling of melanopsin cells
during retinal dystrophy.Vis Neurosci. 2008; 25:125-38.
 Wachtmeister L. Oscillatory potentials in the retina: what do they reveal. Prog Retin Eye Res.
1998; 17(4):485-521.
 Waller A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the
frog, and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primituve
fibres. Phil. Transact. Royal Soc. London 1850; 140: 423-9.
 Walsh DT, Perry VH, Minghetti L. Cyclooxygenase-2 is highly expressed in microglial-like
cells in a murine model of prion disease. Glia 2000; 29, 392–396.
 Walsh DT, Betmouni S, Perry VH. Absence of detectable IL-1beta production in murine prion
disease: a model of chronic neurodegeneration. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2001; 60, 173182
 Wang HZ, Lu QJ, Wang NL, Liu H, Zhang L, Zhan GL. Loss of melanopsin containing
retinal ganglion cells in a rat glaucoma model. Chin Med J. (Engl). 2008; 121:1015-9.
201
Bibliografía
 Wang J, Wei Q, Wang CY, Hill WD, Hess DC, Dong Z. Minocycline up-regulates Bcl-2 and
protects against cell death in mitochondria. J Biol Chem. 2004; 279(19):19948-54.
 Wang KK, Larner SF, Robinson G, Hayes RL. Neuroprotection targets after traumatic brain
injury. Curr Opin Neurol. 2006; 19(6):514-9.
 Wang SS, Shultz JR, Burish MJ, Harrison KH, Hof PR, Towns LC, Wagers MW, Wyatt KD.
Functional trade-offs in white matter axonal scaling. J Neurosci. 2008; 28(15):4047-56.
 Wanner IB, Anderson MA, Song B, Levine J, Fernandez A, Gray-Thompson Z, Ao Y,
Sofroniew MV. Glial scar borders are formed by newly proliferated, elongated astrocytes that
interact to corral inflammatory and fibrotic cells via STAT3-dependent mechanisms after
spinal cord injury. J. Neurosci. 2013; 33(31):12870-86.
 Watanabe M, Toyama Y, Nishiyama A. Differentiation of proliferated NG2-positive glial
progenitor cells in a remyelinating lesion. J. Neurosci. Res. 2002; 69(6):826-36.
 Weber AJ, Chen H, Hubbard WC, Kaufman PL. Experimental glaucoma and cell size,
density, and number in the primate lateral geniculate nucleus. Invest Ophthalmol Vis
Sci. 2000; 41(6):1370-9.
 Weber AJ, Zelenak D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres.
J Neurosci Methods 2001; 111:39-48.
 Wee R, Van Gelder RN. Sleep disturbances in young subjects with visual dysfunction.
Ophthalmology. 2004; 111: 297-302; discussion 302-293.
 Weinreb RN, Khaw PT. Primary open-angle glaucoma. Lancet. 2004; 22;363(9422):1711-20.
 Wen L, Xu J, Zhan T, Wang H, Huang X, Liu W, Yang X, Zhan R. The occurrence of diffuse
axonal injury in the brain: associated with the accumulation and clearance of myelin debris.
Neural Regen. Res. 2014; 9(21):1902-6.
 Wennström M, Hellsten J, Tingström A. Electroconvulsive seizures induce proliferation of
NG2-expressing glial cells in adult rat amygdala. Biol. Psychiatry 2004; 55(5):464-71.
 Whitmore AV, Libby RT, John SW. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous
axonal self-destruction and other compartmentalised processes? Prog Retin Eye Res. 2005;
24(6):639-62.
 Wilkins A, Nikodemova M, Compston A, Duncan I. Minocycline attenuates nitric oxidemediated neuronal and axonal destruction in vitro. Neuron Glia Biol. 2004;1(3):297-305.
 Woldemussie E, Wijono M, Ruiz G. Müller cell response to laser-induced increase in
intraocular pressure in rats. Glia. 2004; 47(2):109-19.
 Wu KH, Madigan MC, Billson FA, Penfold PL. Differential expression of GFAP in early vs.
late AMD: a quantitative analysis. Br J Ophthalmol. 2003; 87(9):1159-66.
202
Bibliografía
 Xue LP, Lu J, Cao Q, Hu S, Ding P, Ling EA. Müller glial cells express nestin coupled with
glial fibrillary acidic protein in experimentally induced glaucoma in the rat retina.
Neuroscience 2006a; 139(2):723-32.
 Xue LP, Lu J, Cao Q, Kaur C, Ling EA. Nestin expression in Müller glial cells in postnatal rat
retina and its upregulation following optic nerve transection. Neuroscience 2006b;
143(1):117-27.
 Yamada H, Takano T, Ito Y, Matsuzuka F, Miya A, Kobayashi K, Yoshida H, Watanabe M,
Iwatani Y, Miyauchi A. Expression of nestin mRNA is a differentiation marker in thyroid
tumors. Cancer Lett. 2009; 280(1):61-4.
 Yang LP, Zhu XA, Tso MO. Minocycline and sulforaphane inhibited lipopolysaccharidemediated retinal microglial activation. Mol Vis. 2007; 13:1083-93.
 Yang Q, Shen J, Guo W, Wen J, Wang Z, Yu D. Effect of acute intraocular pressure elevation
on blood flow velocity and resistance in the rabbit ophthalmic artery. Vet Ophthalmol. 2011;
14(6):353-7.
 Yi CX, Habegger KM, Chowen JA, Stern J, Tschöp MH. A role for astrocytes in the central
control of metabolism. Neuroendocrinology. 2011; 93(3):143-9.
 Yokoyama A, Yang L, Itoh S, Mori K, Tanaka J. Microglia, a potential source of neurons,
astrocytes, and oligodendrocytes. Glia. 2004; 45(1):96-104.
 Yoshimura T, Ebihara S. Spectral sensitivity of photoreceptors mediating phase-shifts of
circadian rhythms in retinally degenerate CBA/J (rd/rd) and normal CBA/N (+/+)mice. J
Comp Physiol [A]. 1996; 178: 797-802.
 Young MJ, Lund RD. The retinal ganglion cells that drive the pupilloconstrictor response in
rats. Brain Res. 1998; 787:191-202.
 Yrjänheikki J, Keinänen R, Pellikka M, Hökfelt T, Koistinaho J. Tetracyclines inhibit
microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proc. Natl. Acad. Sci.
U S A. 1998; 95(26):15769-74.
 Yuan L, Neufeld AH. Tumor necrosis factor-alpha: a potentially neurodestructive cytokine
produced by glia in the human glaucomatous optic nerve head. Glia 2000; 32(1):42-50.
 Yücel YH, Zhang Q, Gupta N, Kaufman PL, Weinreb RN. Loss of neurons in magnocellular
and parvocellular layers of the lateral geniculate nucleus in glaucoma. Arch. Ophthalmol.
2000; 118(3):378-84.
 Yücel YH, Zhang Q, Weinreb RN, Kaufman PL, Gupta N. Atrophy of relay neurons in
magno- and parvocellular layers in the lateral geniculate nucleus in experimental glaucoma.
Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001; 42(13):3216-22.
 Yücel YH, Zhang Q, Weinreb RN, Kaufman PL, Gupta N. Effects of retinal ganglion cell loss
on magno-, parvo-, koniocellular pathways in the lateral geniculate nucleus and visual cortex
in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 2003; 22(4):465-81.
203
Bibliografía
 Zabad RK, Metz LM, Todoruk TR, Zhang Y, Mitchell JR, Yeung M, Patry DG, Bell RB,
Yong VW. The clinical response to minocycline in multiple sclerosis is accompanied by
beneficial immune changes: a pilot study. Mult Scler. 2007;13(4):517-26.
 Zai LJ, Wrathall JR. Cell proliferation and replacement following contusive spinal cord
injury. Glia 2005; 50(3):247-57.
 Zhang C, Lei B, Lam TT, Yang F, Sinha D, Tso MO. Neuroprotection of photoreceptors by
minocycline in light-induced retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;
45(8):2753-9.
 Zhang R, Chopp M, Zhang ZG. Oligodendrogenesis after cerebral ischemia. Front. Cell
Neurosci. 2013; 7:201.
 Zhang S, Wang H, Lu Q, Qing G, Wang N, Wang Y, Li S, Yang D, Yan F. Detection of early
neuron degeneration and accompanying glial responses in the visual pathway in a rat model of
acute intraocular hypertension. Brain Res. 2009; 1303:131-43.
 Zhang Y, Metz LM, Yong VW, Bell RB, Yeung M, Patry DG, Mitchell JR. Pilot study of
minocycline in relapsing-remitting multiple sclerosis. Can J Neurol Sci. 2008; 35(2):185-91.
 Zhu S, Stavrovskaya IG, Drozda M, Kim BY, Ona V, Li M, Sarang S, Liu AS, Hartley DM,
Wu DC, Gullans S, Ferrante RJ, Przedborski S, Kristal BS, Friedlander RM. Minocycline
inhibits cytochrome c release and delays progression of amyotrophic lateral sclerosis in mice.
Nature 2002; 417(6884):74-8.
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