Extraccion-Cromatografia

TÉCNICAS DE MUESTREO,
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
Ingeniería Ambiental
Problema
Elección del
método analítico
Toma de
muestra
Tratamiento
de la muestra
Proceso de
medida
Tratamiento de
los datos
Valoración de
los resultados
Informe y
conclusiones
UNIDAD Nº6
EXTRACCIÓN - CROMATOGRAFÍA
CONCEPTO DE CROMATOGRAFÍA.
La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o mas
compuestos por distribución entre dos fases inmiscibles, una fase móvil
(llamada también activa) que transporta las sustancias que se separan y que
progresa (se desplaza en una dirección definida) en relación con la otra,
denominada fase estacionaria.
Fase estacionaria: sólido o líquido retenido por fijación a un sólido.
Fase móvil: fluido (líquido o gas) que arrastra la muestra a través
de la fase estacionaria.
Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de manera
diferente con las dos fases estableciéndose un reparto entre ambas
Se establece un equilibrio de adsorción o partición del analito
entre las dos fases (móvil y estacionaria)
FASE MÓVIL
FASE
ESTACIONARIA
CROMATOGRAFÍA (CLASIFICACIONES)
1. Según la finalidad del análisis
Separación y purificación
Preparativa
Separación, cuantificación y
caracterización
Analítica
2. Según los tipos de fase estacionaria y fase móvil
Fase estacionaria
Fase móvil
Sólida
Líquida o gaseosa
Cromatografía
de Adsorción
Líquido
Líquida o gaseosa
Cromatografía
de Partición
CROMATOGRAFÍA (CLASIFICACIONES)
3. Según donde se contenga a la fase estacionaria
a. Cromatografía en Columna
b. Cromatografía en Batch
c. Cromatografía en Papel
d. Cromatografía en Capa Fina
(o Cromatografía en Capa Delgada)
CROMATOGRAFÍA (CLASIFICACIONES)
4. Según la fuerza impulsora
a. Gravedad
b. Capilaridad (papel, capa fina)
c. Diferencia de Presión (GC y HPLC)
CROMATOGRAFÍA (CLASIFICACIONES)
4. Según la interacción entre la fase móvil y el soluto
a. Cromatografía de intercambio iónico
b. Cromatografía de interacción hidrofóbica
c. Cromatografía de afinidad
Interacción Electrostática
efecto hidrofóbico
variada pero específica
d. Cromatografía de afinidad por metales
inmovilizados (IMAC)
enlaces covalentes
e. Cromatografía de fase normal y reversa
dipolos
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
El soluto se distribuye entre dos fases; una sólida (adsorbente), la fase
estacionaria, y otra móvil.
El sólido se presenta en forma de gránulos para incrementar la superficie, es
decir el número de procesos de adsorción-desorción. Por ello, la efectividad de
interacción depende de los grados de interacción del soluto con ambas fases.
A mayor interacción sólido-soluto
A mayor interacción soluto-solvente
Mayor retención,
mobilidad más lenta
Mayor avance con la fase móvil
Mobilidad más rápida
PASOS DEL PROCESO CROMATOGRÁFICO
1.
2.
3.
4.
5.
Armado de la Placa o Columna
Siembra
Desarrollo
Revelado
Elución
CONCEPTO DE R.F. (RELACIÓN DE FRENTES)
RF: es la relación entre la distancia que recorre la muestra desde el punto de
su aplicación (lugar de siembra) y la distancia que recorre el disolvente hasta
el frente del eluyente (solvente de corrida).
A mayor RF,
mayor movilidad
del analito
VARIABLES DE CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
ADSORBENTE:
 Alúmina: 50 y 200 micrones (comercialmente). Básica (pH=10),
neutra (pH=7) y ácida (pH=4).
Presenta grados de Actividad de acuerdo a su deshidratación (cantidad
de sitios activos)
• Grado (I): calentamiento entre 300°C-400°C varias horas
• Grado (II a V): (II) 3%-4%, (III) 5%-7%, (IV) 9%-11% y (V) 15-19%
 Sílica: Presenta grados de Actividad de acuerdo a su deshidratación
(cantidad de sitios activos)
• Grado (I): calentamiento cercano a 300°C varias horas.
• Grados (II a V): (II) 5%, (III) 15%, (IV) 25% y (V) 38%.
VARIABLES DE CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
ADSORBENTE:
Tamaño de Grano del Adsorbente: A menor tamaño de grano, mayor superficie
de interacción del analito con la fase estacionaria.
• Incremento de la Resolución
• A menor tamaño de grano (en columnas se hace
lenta la elución, requiriéndose aplicación de
presión). (5 micrones: HPLC; 5-40 micrones: CCD y
CCP; 60-200 micrones: columna)
Empaquetamiento en Columnas: Se debe lograr homogeneidad en la fase
estacionaria
En TLC empaquetamientos menos
densos implican un RF mayor y
empaquetamientos mas densos
un RF menor, ocasionando
indefinición o irreproducibilidad.
En Columna la homogeneidad
esta
dada
por
el
asentamiento parejo del
relleno.
Inercia Química: Deben tenerse en cuenta posibles reacciones parásitas, por
ejemplo la sílica tiene propiedades ácidas y la alúmina básicas. El agregado
de sustancias ácidas o básicas debe ser contemplado por posible formación
de sales. También debe tenerse en cuenta que los adsorbentes grado (I)
pueden producir deshidratación de productos lábiles.
Controlar que el Adsorbente no
reacciones con los analitos
VARIABLES DE CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
ESTRUCTURA DEL ANALITO:
La capacidad de adsorción del analito viene dada por su capacidad de
interacción y ello obedece a los grupos funcionales que presenta y su
distribución en su estructura.
En Alúmina se observa el siguiente comportamiento (se ordenan de mayor a
menor interacción)
•
•
•
•
•
•
Ácidos y Bases
Alcoholes y Tioles
Aldehidos y Cetonas
Halogenuros de Alquilo y Ésteres
Hidrocarburos Insaturados
Hidrocarburos Saturados
VARIABLES DE CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
SOLVENTE DE ELUCIÓN:
Es fundamental que los solventes usados sean anhidros (para no afectar la
reactividad conferida a la fase estacionaria) y que sean miscibles entre sí si se
corresponde a una mezcla. Se debe controlar una velocidad de elución lenta en
la columna para permitir la presencia del mayor número de equilibrios de
reparto
POLARidad
POLARidad
VARIABLES DE CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
TEMPERATURA:
El reparto del analito entre las dos fases es un proceso de equilibrio, por ende se
establecen diferentes valores de la constante de distribución a distintas
temperaturas. El control de la temperatura es fundamental para lograr un
proceso reproducible.
SATURACION DE LA CUBA:
En procesos de adsorción en placa (CCD y CCP) y de partición (cromatografía en
papel) el desarrollo se da en cubas que deben estar saturadas con solvente para
que cuando se lleve a cabo el proceso de corrida o elución, o en caso contrario el
solvente se evaporará a la vez que corre presentandose una corrida
inhomogénea. Proceso que se agrava ante mezclas de solventes, donde uno
usualmente es más volátil que otro, alterándose la composición del solvente de
corrida.
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
REVELADO:

Se pueden usar placas que vienen preparadas para observación en UV a
254nm y 366nm.

Sales de Cs y Mo como revelador general:
• 1g de Cs2SO4
• 2g de Acido Fosfomolíbdico (H3[P(Mo3O10)4] · xH2O)
• 10 mL de H2SO4
• 90 mL de H2O

Revelados específicos.
APLICACIONES
1. Detección Cualitativa Rápida de Analito: por ejemplo, se puede determinar
si la muestra de un compuesto es impuro (solo si da positivo, es caso
negativo es no concluyente). Para la determinación de componentes de una
muestra, la cantidad de manchas obtenidas solo brinda un mínimo número
de sustancias presentes (¿por qué?). Permite el seguimiento de una
reacción química por analisis de la presencia de reactivos y productos
mediante contraste frente a patrones.
2. Determinación Semicuantitativa de Analitos: De la placa se puede recuperar
porción del sílice donde el revelado muestre presencia de analito y proceder
a una resuspensión en solvente, posterior filtración y determinación de la
concentración del analito (mediante métodos ópticos, eléctricos, etc.).
3. Aislamiento y Purificación parcial de Analitos de una Muestra: la
cromatografía en capa delgada puede usarse para separar componentes de
una mezcla y lograr así el aislamiento de analitos o familia de ellos
(sustancias con similar RF), el procedimiento se realiza por remoción de la
porción de placa con muestra (y fase estacionaria) y resuspensión.
Posteriormente se puede proceder a nuevas corridas a fin de separaciones
más efectivas.
4. De Uso Preliminar para la selección de un solvente de corrida: se selecciona
el solvente de corrida para CCP (300 mg de muestra mínimo y 30g de sílica o
50g de alúmina en placa 20x20 de 2 a 3 mm de espesor).
CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
Fase estacionaria
Fase móvil
Agua de hidratación
del papel
Líquido (Agua u otro
solvente)
Solvente Hidrofóbico
(aceite de oliva,
silicona, parafina, etc.)
Cromatografía en Papel de
fase invertida o
Cromatografía en Papel de
fase inversa
•El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra.
•Se utizan solventes orgánicos saturados en agua, y los criterios de
identificación son similares a los de la Cromatografía de Adsorción (La fase
más polar se retiene).
Celulosa
CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN
CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN
REVELADO:

En el caso de la corrida de iones metálicos, la exposición a H2S puede
permitir la generación de sulfuros coloreados.

En caso de dobles enlaces presentes, exposición a vapores de I2.

Revelado por bañado

Por pulverización