Determinación semicuantitativa de la expresión de ARNm de las

Original
VOL. 20 / N ÚM. 4 / O CTUBRE-DICIEMBRE 2001
INMUNOLOGÍA, 2001; PP 184-195
Determinación semicuantitativa de la expresión
de ARNm de las isoformas de MIP-1α y MIP-1β
mediante un competidor recombinante y RT-AFLP
1
1
1
P. ADREANI , I. G ÓMEZ , R. COLOBRAN , P. CARO, F. PELUSA, R. P UJOL-BORRELL, M. J UAN
Laboratori d’Immunobiologia per a la Recerca i les Aplicacions Diagnòstiques. Centre de Transfusió i
Banc de Teixits. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol. Universitat Autónoma de Barcelona.
Badalona
SEMIQUANTITATIVE ASSESSMENT OF MIP-1α AND MIP1β mRNA ISOFORM EXPRESSION BY USING A RECOMBINANT COMPETITOR FRAGMENT AND RT-AFLP.
RESUMEN
Dentro de la amplia familia de las citocinas quimiotácticas, MIP-1α y MIP-1β son β-quimiocinas de especial interés por sus efectos sobre linfocitos y monocitos, las principales células de la inmunidad adquirida. En estudios previos
hallamos una correlación clara entre los niveles tisulares de
MIP-1α y MIP-1β y el diagnóstico clínico en los diversos
cuadros de enfermedad autoinmune del tiroides. La existencia de isotipos para estas quimiocinas impone cierta dificultad en su análisis y evaluación funcional. En este trabajo
presentamos un protocolo que, aprovechando pequeñas
diferencias a nivel de secuencia nucleotídica, combina RTPCR y restricción con MspI para estimar semicuantitativamente los niveles de ARNm de los loci codificantes para cada
una de estas dos quimiocinas. El aspecto más relevante de
esta técnica es el uso de un fragmento de ADN recombinante que actúa de estándar interno tanto para MIP-1α como
para MIP-1β, a la vez que contiene un lugar de restricción
para MspI. De esta forma actúa como control no sólo de
amplificación (en una RT-PCR competitiva) sino también
de eficiencia de la digestión. La validez técnica de la aproximación, se corroboró por la similar cinética de amplificación del estándar interno y de las dos citocinas mediante
PCR en tiempo real. Un estudio de la inducción de la expresión de MIP-1β (mediante experimentos de tiempo-respuesta) en células U-937 demostró diferencias claras entre
los ARNms de los dos loci indicando que este protocolo puede contribuir al estudio de la expresión diferencial de productos génicos similares mediante técnicas disponibles en
la mayoría de los laboratorios.
ABSTRACT
Among the broad family of chemotactic cytokines, MIP-1α
and MIP-1β, β-chemokines are of special interest, because of
their central role as chemoattractants for lymphocytes and
macrophages, the main cells of the adaptive immune response.
In previous studies, we have found a relationship between tissue
levels of MIP-1α and MIP-1β and clinical diagnosis in autoimmune thyroid glands. The measurement of these chemokines is
difficult because of the existence of different isotypic forms. Here,
we present a protocol that, taking advantage of small differences in nucleotide sequence, combines RT-PCR and restriction
with MspI to allow the semiquantitative assessment of mRNAs
from the two chemokines. The key feature of our approach is the
introduction of an internal standard common to MIP-1α and
MIP-1β which is co-amplified and contains a MspI restriction
site. This allows the easy control of both the amplification (competitive RT-PCR) and the efficiency of the restriction. Real time
PCR experiments demonstrated that the kinetics of the amplifications of the internal standard of both chemokines were similar, thus validating the approach. A time course of MIP-1β induction in U-937 cells showed substantial differences among the
mRNAs derived from the two loci, an indication that this technique may contribute to study the differential expression of gene
products of similar sequence using techniques available at most
laboratories.
PALABRAS CLAVE: MIP-1β/ MIP-1α/ Quimiocinas/
RT-PCR semicuantitativa/ Estándar interno.
KEY WORDS: Chemokines/ MIP-1 . MIP-1 / Chemokines/
Semiquan-titative RT-PCR/ Internal standard.
1
Estos tres autores han contribuido de manera equivalente a la obtención de los resultados presentados, por lo que deberían ser considerados
primeros autores independientemente de la posición que ocupan.
184
INMUNOLOGÍA
INTRODUCCIÓN
U
no de los elementos definitorios de los procesos inflamatorios implicados en la mayor
parte de las patologías en las que interviene el sistema inmunitario, es el grado y
composición del infiltrado leucocitario. La
migración selectiva de los leucocitos, controla tanto
los procesos de recirculación fisiológica continua de
las células del sistema inmunitario, como la llegada
masiva localizada a las zonas lesionadas (inflamación). En ambos procesos, recirculación e inflamación, intervienen principalmente mecanismos de
adhesión intercelular y del leucocito con la matriz
extracelular (1). En todos estos procesos adhesivos
se utilizan como mediadores moleculares las quimiocinas, citocinas de pequeño peso molecular que
por su afinidad a la matriz extracelular forman gradientes de concentración alrededor de las células
productoras. Sus similitudes estructurales y funcionales han llevado a la agrupación de todas estas
pequeñas proteínas bajo el término estructural de
superfamilia de las quimiocinas.
Entre las características más relevantes de las
quimiocinas, podríamos decir que son proteínas
de pequeño tamaño (60-70 aminoácidos, aproximadamente) y que se encuentran altamente relacionadas en estructura (presentan una homología
de al menos un 25%); así son fundamentales sus 2
primeros residuos cisteínicos del extremo N-terminal (2) puesto que son los aminoácidos que permiten subclasificar esta superfamilia en 4 grupos
principales: a) las CXC o α-Quimiocinas que presentan un aminoácido separando estas 2 primeras
Cisteinas; b) las CC o β- quimiocinas que no presentan aminoácidos adicionales entre ambas cisteinas [dentro de este grupo, ha sido identificada
la llamada 6Ckine/SLC, la cual presenta un patrón
inusual de 6 cisteinas en lugar de 4 (3)]; c) las XC
quimiocinas o γ-quimiocinas, que pierden el primer y tercer residuo de cisteína (4,5) (sólo se ha
descrito la linfotactina en este grupo); y d) las
CX3C quimiocinas caracterizadas por sus 3 aminoácidos intercalados entre las 2 cisteínas “clasificadoras” (6,7) con la fractalcina como representante único.
En cuanto a sus propiedades biológicas, las quimiocinas se distinguen por su capacidad de regular la movilidad celular por medio de la unión a
receptores de membrana que presentan una cierta
especificidad en el reconocimiento y en su distribución celular. Su papel en la adhesión es único,
ya que modulan de manera muy precisa las funciones adhesivas de las células diana, promoviendo la polarización celular (8), la activación funcional de ciertas moléculas de adhesión (9) e
incluso la inducción de diversos genes efectores
fundamentales en los mecanismos de adhesión
(10,11). No hay que olvidar que las quimiocinas
desarrollan también efectos más amplios como la
P. A DREANI ET AL.
co-estimulación para la proliferación y diferenciación celular o la definición de patrones de síntesis de otras citocinas (1,12).
Las quimiocinas actúan, de forma específica y
selectiva sobre las células dianas, a través de sus
receptores de membrana quienes inducen señales
intracelulares mediante su acoplamiento a proteínas G (13,14). Hasta la fecha se han identificado
una veintena de estos receptores (15-16), aunque,
de acuerdo con evidencias funcionales, contamos
con la existencia de otros receptores no definidos
molecularmente aún (17).
Estudios recientes de nuestro grupo (7), Ashhab
y cols. in preparation), indican el posible papel de
las β-quimiocinas en los fenómenos autoinmunes,
cosa que coincide con el hecho de que en esta subfamilia se encuentran las quimiocinas con un mayor
efecto localizador de monocitos y linfocitos (18).
Mediante la aplicación y optimización de la metodología MOPAC (Mixed Oligonucleotides Primed
Amplification of cDNA) (19), hemos podido demostrar que en glándulas tiroideas de enfermos de
Graves-Basedow existe una expresión aumentada
de MIP-1α, MIP-1β, MCP-1 y RANTES, mientras
que no se detecta MCP-3. La especial sobreexpresión de MIP-1α y MIP-1β en las muestras estudiadas reafirman datos de otros autores que indican la
existencia de factores de regulación conjunta de la
expresión de ambas quimiocinas y en concreto en
las enfermedades autoinmunes del tiroides.
Nuestro grupo se ha interesado por diversos elementos de la estructura génica del MIP-1β puesto
que el genoma humano presenta la secuencia no-alélica de un segundo locus. La existencia de dos loci
para MIP-1β ya había sido postulada por trabajos
previos (20, 21) donde se les dió el nombre de locus
744,1 (al que llamaremos en este artículo locus A
con la idea de simplificar la terminología) y locus
744,2 (locus B). Aquellos datos basados en estudios
genómicos llevaron a sus autores a sugerir que este
segundo locus podía ser un pseudogén (20), aunque
los trabajos de nuestro grupo (7) indican que el locus
B puede ser codificante. De hecho, esta duplicidad
de loci codificantes para MIP-1β ha sido constada
también para MIP-1α (SCYA3 y SCYA3L) en la que
el “segundo locus” (SCYA3L, al que también denominaremos a partir de ahora locus B) codifica para
una segunda forma de MIP-1α (MIP-1αP o LD78β)
(22). En este trabajo, se expone la aproximación
metodológica que nos permite valorar la expresión
de MIP-1α y MIP-1β (tanto del locus A como del
locus B). Esta técnica se ha puesto a punto como
medio para comparar la regulación de la expresión
de los dos loci de ambas quimiocinas, y para determinar si contribuyen de forma distinta a los fenómenos de localización y de modulación de la respuesta
inmunitaria. Nuestros resultados demuestran la factibilidad de la aproximación, que se fundamenta en
el uso de un estándar interno como control en una
RT-PCR competitiva y de la discriminación de cada
185
DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LA EXPRESIÓN DE ARNm DE LAS ISOFORMAS DE MIP-1α Y MIP-1β
uno de los loci de interés gracias al uso de una endonucleasa de restricción. Esta aproximación metodológica, debe considerarse como una herramienta
simple pero muy útil para la valoración cuantitativa
de la expresión de los ARNm de los loci A y B de las
quimiocinas MIP-1α y MIP-1β.
MATERIAL Y MÉTODOS
Cultivo celular
Nuestros estudios se han realizado con ARN de
la línea monocítica U-937 obtenida de la ATCC
(American Tissue Culture Collection). El medio
de cultivo utilizado fue RPMI 1640 suplementado
con 10% FCS y 2 mM L-glutamina (los tres productos de Life Technologies, Merelbeke, Bélgica), además de gentamicina 40 mM (Sigma, St. Louis, MO,
EE.UU.) y Penicilina 100 UI/ml (Laboratorios Ern,
Barcelona, España). Todas las incubaciones y cultivos se hicieron a 37º C con 5% CO2 / 95% aire.
2
Los cultivos se realizaron en frascos de 75 cm
(Costar, Nalge Nunc International, Dinamarca) en
suspensión. Las estimulaciones celulares con
Ionomicina (1µg/ml), LPS (0,1µg/ml) y PMA
(0,1µg/ml) (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) se llevaron a término a tiempos de 0, 3, 6 y 24 h, respectivamente. Debido a la inestabilidad intrínseca de
los extremos UA 3’ del ARNm de las quimiocinas,
agregamos a los cultivos 10 mg/ml de cicloheximida (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) 3 h antes de
la recolección para aumentar la estabilidad.
Extracción de ARN
El método empleado fue el descrito previamente
por Chomczynsky (23) adaptado ligeramente en
nuestro laboratorio. Brevemente, el pellet seco pro6
veniente de 5.10 células cultivadas (y estimuladas),
guardado a –70º C hasta el momento de su utilización, se homogeneiza agregando 500 µl de solución
de desnaturalización (tiocianato de guanidina 4M;
citrato de sodio 25 mM; 2-β mercaptoetanol 0,1M;
N-lauroilsarcosina 0,5%; antifoam 0,5%) 50 µl acetato de sodio 2M pH 4 y 500 µl de fenol saturado
con agua, mezclando con vórtex después de la adición de cada uno de los reactivos. Se incuba en hielo durante 10 min y se agregan 150 µl de una mezcla de cloroformo-isoamilalcohol que también se
incuba en hielo por 10 min más. Se centrifuga 20
min a 10.000 rpm (4º C), para separar la fase acuosa de la orgánica, precipitándola seguidamente con
1 vol de isopropanol (incubación de 1 h a -70º C) y
centrifugando 30 min a 14.000 rpm (4º C). Tras descartar el sobrenadante, el pellet se resuspende en
300 µl de solución de desnaturalización y 150 µl de
fenol saturado en agua. Se mezcla con un vórtex,
agregando seguidamente 150 ml de una mezcla de
186
VOL.
20 NÚM. 4 / 2001
cloroformo-isoamilalcohol. Tras incubar 10 min a
4ºC, se centrifuga a 10.000 rpm durante 20 min
(4ºC), transfiriendo el sobrenadante a otro tubo
donde se reprecipita con 1 vol de acetato potásico y
2 vols de etanol absoluto (post-centrifugación a
14.000 rpm durante 30 min a 4ºC). El pellet obtenido se lava 3 veces con etanol al 70%, se seca bien
y se resuspende en 20 µl de agua de DEPC (H2O
destilada tratada 20 h con dietilpirocarbonato,
[Genaxis Botechnology, Saint-Cloud Cedex,
Francia] y posteriormente autoclavada).
La concentración de ARN se determina por
espectrofotometría a una longitud de onda de 260
nm, evaluando también su pureza (relación entre
las lecturas a 260 y 280 nm; este valor debe encontrarse entre 1,8 y 2,0 para que podamos considerar
acceptable la extracción). La integridad del ARN se
valora por comparación interna (y con una muestra de ARN de E. Coli) por medio de un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. Se considera que
el ARN está íntegro, cuando las bandas correspondientes a los ribosómicos presentan aproximadamente una intensidad 2/1 en el ratio 28S/18S.
Tratamiento con DNAsa-I de las preparaciones
de ARN
Para eliminar los residuos de ADN genómico, que
pudieron haber sido extraídos junto con el ARN, las
muestras son tratadas de la siguiente manera: 2µl de
tampón (40mM Tris-HCl pH 7,5; 6mM MgCl2), 2µl
DNAasaI (Amersham Pharmacia Biotech.
Barcelona. España), Xml de muestra de ARN y 16-X
µl de H2O destilada. La mezcla se incuba a 37º C
durante 30 min. Luego se cuantifica nuevamente el
ARN y se recomprueba su integridad. Finalmente,
el ARN se precipita con acetato potásico 3M, glucógeno 20 mg/ml y 1 volumen de isopropanol, lavándolo con etanol al 75%. El pellet obtenido se diluye
en agua de DEPC y se conserva a -20ºC.
Retrotranscripción
Se desnaturaliza previamente el ARN (1µg diluido en agua hasta 11,8 ml) incubándolo a 68ºC
durante 5 min. Inmediatamente después se coloca
a 4º C durante 5 min. La reacción de retrotranscripción se realiza según las condiciones indicadas por
el proveedor de la Superscript II (Life Technologies,
Merelbeke, Bélgica): 4µl de Tampón de primera
cadena (5X), 1µl de dNTPS (2mM), 2µl DTT
(0,1M), 2µl Oligo-dT24 (500µM), los 11,8µl del
ARN desnaturalizado, 0,5µl RNAsin (40U/µl), y
0,5µl Superscript-II (200U/µl). La reacción se incuba 60 min a 42º C. Para inactivar el proceso las muestras se calientan hasta 99º C durante 5 min, reenfriándolas a 4º C (5 min más). Los 20 µl de reacción
se diluyen 4 veces en EE, usando 1µl de este ADNc
INMUNOLOGÍA
diluido para cada 10 µl de reacción de la PCR. Todos
los reactivos utilizados fueron suministrados por
Promega (Madison, WI, USA) a excepción de la
Superscript-II y su tampón.
RT-PCR. Condiciones generales
Las diversas RT-PCR se han desarrollado bajo las
siguientes condiciones generales de amplificación:
1ml de tampón de PCR (10X, con MgCl2 15 mM);
1µl de mix dNTPs (2mM); 0,5 µl de cebador antisense (10mµM); 0,5µl cebador antisense (10µM); 2µl
de ADNc; 3µl de H2O. Las muestras se someten a los
cambios de temperatura controlados por el termociclador (MJ. Research, modelo Mini Cycler), iniciando el proceso con un inicio en caliente (Hot
Start) a 80º C, tras lo cual se agregan 500 mU de la
ADN-Polimerasa DynaZyme II (Finnzymes OYFinlandia) diluidas en 2µl de agua. Posteriormente
se aplica el siguiente programa de ciclación: 30 s a
95º C, 30 s a 59º C y 30 s a 72º C, que se repite por
35 ciclos con una extensión final de 5 min a 72º C.
Las secuencias de los cebadores utilizados para la
amplificación de MIP-1α son: Cebador α-Sense ⇒
5’ TTCCGTCACCTGCTCAGAAT 3’; Cebador
α-Antisense ⇒ 5’ GAAGAGGTAGCTGTGGAGGTCAC 3’. Para la amplificación de MIP-1β son:
Cebador β-Sense ⇒ 5’ CGCAACTTTGTG-GTAGATTACTAT 3’; Cebador β-Antisense ⇒ 5’ AAATAATGGAAATGACACCTAATA 3’, todos ellos validadados en trabajos anteriores de nuestro
laboratorio.
Normalización del ADNc
Para valorar el estado de la muestra y normalizar los resultados a un parámetro común, todas las
muestras fueron amplificadas con cebadores específicos (Oligo Etc, Wilsonville, OR, USA) para el
gen de la enzima de expresión constitutiva
GAPDH (glutaraldehido-fosfato-deshidrogenasa)
diseñados en nuestro laboratorio (24): Cebador
Sense: 5’ CTTCTTTTGCGTCGCCAG 3’; Cebador
Antisense: 5’ TCTTCTTTTGCGTCGGCCAG 3’.
Para esta amplificación también se realiza un Hot
Start a 80º C, seguida por 25 ciclos del siguiente
programa: 30 s a 94º C, 30 s a 63º C y 30 s a 72º C,
con un extensión final de 5 min a 72º C. La amplificación se evalua con 5µl del amplímero en un gel
de agarosa al 2% agarosa (Estándar media EEO,
Ecogen, Barcelona, España).
Diseño del Estándar Interno
Para generar el Estándar Interno (EI) se utilizó
una pequeña región del gen de la insulina (zona 3’
no codificante), ya que presenta un tamaño (339 pb)
P. A DREANI ET AL.
parecido al de los amplímeros en estudio [MIP-1a
(404pb) y MIP-1β (316pb), además de presentar en
su secuencia una diana de restricción para la endonucleasa MspI (CCGG). A partir de los cebadores
(ILJ3 e ILJ2) utilizados para estudiar el citado fragmento del gen de la insulina, se diseñaron dos cebadores híbridos (IEI1 e IEI2) que manteniendo en 3’
las secuencias de ILJ3 e ILJ2, se les yuxtapuso consecutivamente en sus extremos 5’ las secuencias de
los cebadores para MIP-1α y para MIP-1β. Para facilitar su clonación y manipulación, se introdujo también en estos cebadores híbridos las secuencias diana de las enzimas de restricción BamHI y NsiI. (Ver
esquema de la Fig. 1), más 2-3 bases en el extremo
5’ para que asegurasen una buena eficiencia en la
digestión. Así, IEI1 es el oligonucleótido resultante
de combinar las secuencias de BamHI + β-Sense + αSense + ILJ3, mientras que IEI2 presenta las secuencias NsiI + β-Antisense + α-Antisense + ILJ2 (según
dirección 5’-3’ convencional). En la base del esquema que se presenta en la figura 1 se detallan las
secuencias concretas de IEI1 e IEI2.
Utilizando los cebadores IE1 e IE2 y las condiciones optimizadas para la amplificación del gen de la
insulina con ILJ3 e ILJ2 (35 ciclos del siguiente programa: 20 s a 95º C, 30 s a 65º C y 30 s a 72º C, con
un extensión final de 7 min a 72º C) y partiendo de
100 ng de ADN genómico humano, se obtuvo un
amplímero de 448 pb. Dicho fragmento se purificó
por electroelución en cámara de Biotrap (Schleicher
& Schuell; Dassel, Germany) tras electroforesis en
agarosa y se clonó por ligación en el vector pZErO2 (Invitrogen; Paisley, Scotland). Su fácil crecimiento en bacterias permite la obtención de un preparado homogéneo que una vez cuantificado posibilita
su utilización como estándar interno en una reacción de RT-AFLP (Amplification fragment length polymorphism) competitiva.
PCR Semicuantitativa
Debido a la elevada homología existente entre
los locus A y B de las quimiocinas MIP-1α y MIP1β a nivel de la secuencia nucleotídica, optamos
por estudiar los niveles de expresión de cada uno
de los loci a través de una RT-PCR competitiva
semicuantitativa, a la que asociamos la capacidad
discriminativa entre loci de los patrones de restricción en base a la endonucleasa MspI. MspI es
una enzima de restricción que reconoce la
secuencia CCGG que en el caso de MIP-1α s e
encuentra 3 veces en el producto amplificado del
locus A, pero sólo 1 vez en el locus B; mientras
que en el caso de MIP-1β sólo se encuentra una
única vez presente en la secuencia amplificada
del locus A (ninguna en el locus B). Así, de manera secuencial utilizamos la siguiente metodología: Partiendo de 2 µl de ADNc, se añaden a la
reacción 2 µl del Estándar Interno (EI) recombi-
187
DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LA EXPRESIÓN DE ARNm DE LAS ISOFORMAS DE MIP-1α Y MIP-1β
20 NÚM. 4 / 2001
lEl2
77 b
NsiI
β-as
9b
α-as 25 b
23 b
ILJ2 20 b
MspI
α-s ILJ3 19 b
β-s
20 b
BamHI
24 b
8b
lEl1
71 b
VOL.
Gen Insulina 339 pb
lEl1: CGGGATCC CGCAACTTTGTGGTAGATTACTAT TTCCGTCACCTGCTCAGAAT TGGAGATGGGTGGGAGTGT
BamHI
β-sense
α-sense
ILJ3
lEl2: CCAATGCAT AAATAATGGAAATGACACCTAATAC GAAGAGGTAGCTGTGGAGGTCAC AGGGCTTTATTCCAT
NsiI
β-antisense
α-antisense
ILJ2
Figura 1. Esquema del estándar interno(EI) utilizado en nuestra aproximación de RT-PCR. En línea gruesa, se presenta el amplímero del gen de la insulina con el punto de corte para MspI. En trazo más fino asociado al amplímero del gen
de la insulina se representan los cebadores híbridos IEI1 e IEI2, cuya secuencia concreta se precisa en la base del esquema señalando los nucleótidos correspondientes a las secuencias de los cebadores de la insulina (ILJ3 y ILJ2), MIP-1α (αsense y α-antisense) y MIP-1β(β-sense y β-antisense) además de las dianas de restricción (BamH1 y NsiI). Las abreviaturas b y pb se refieren las longitudes de las diversas regiones expresadas en bases y pares de bases respectivamente.
nante a concentraciones conocidas (en el mismo
tubo). Las amplificaciones de MIP-1α y MIP-1β,
se realizan sobre muestras separadas utilizando
los oligonucleótidos correspondientes. El producto así obtenido es sometido a digestión (37º
+
C durante 1h) en tampón (Y /Tango) con 10 U de
la enzima MspI (Fermentas; Vilnius, Lithuania).
P o s t e r i o rmente la definición del patrón de re stricción se realiza en gel de agarosa al 2 %. La densitometría de las distintas bandas electro f o r é t icas permite la cuantificación de las muestras
tanto a nivel relativo (proporción de locus A respecto a locus B) como absoluto (en relación con
el EI precuantificado). Cabe reseñar aquí, que el
EI no sólo permite controlar la amplificación del
ADNc sino que también a través de su nivel de
digestión (porcentaje de digestión de EI sobre el
no digerido) se obtiene otro parámetro básico en
esta valoración cuantitativa: el control de la
digestión. Este aspecto es fundamental para la
evaluación de MIP-1β, puesto que el locus B, al
no presentar diana de restricción para MspI, puede confundirse con la parte no digerida del locus
A (las digestiones parciales son habituales) y por
tanto conocer el grado de digestión del EI permite ponderar las cuantificaciones reales de las quimiocinas de interés.
miocinas a estudio, decidimos emplear una aproximación basada en la metodología de PCR a tiempo
real (Real Time PCR o rt-PCR). La monitorización
de la rt-PCR se realizó con el fluorocromo intercalante SYBRGreen (Roche; Mannheim, Germany)
con el equipo LightCycler® (Roche; Mannheim,
Germany). Para ello, utilizamos diluciones seriadas
tanto de amplímeros precuantificados de los loci en
estudio, como del EI (realizando el estudio tres veces
con muestras por duplicado). Los ensayos se desarrollaron bajo los siguientes parámetros: 1µl de la
mezcla de reactivos de rt-PCR 10X (Taq ADN polymerase, reaction buffer dNTP mix [con dUTP en
lugar de dTTP], SYBR Green I dye y 10 mM MgCl2);
1,2 µl de MgCl2 25mM (concentración final 4 mM);
0,5 ml de cebador sense (10 µM); 0,5µl cebador
antisense (10 µM); 3 µl de molde-muestra; 4,8 µl de
H2O. El estudio realizado tanto con MIP-1α como
con MIP-1β, se presenta aquí sólo para MIP-1β.
Las amplificaciones se realizaron en 35 ciclos
del siguiente programa: 30 s a 95º C, 30 s a 59º C,
30 s a 72º C con una extensión final de 5 min a
72º C. Las lecturas de fluorescencia se realizaron
a 72º C en cada ciclo y la evaluación de la temperatura de fusión de los productos amplificados
durante el período final de desnaturalización entre
45º C y 95º C.
Real Time PCR
RESULTADOS
Para comprobar que las cantidades de amplímero producido por la PCR del EI era equiparables con
las que se producen en la amplificación de las qui-
1. Obtención de un estándar interno co-amplificable con el ADNc nativo de MIP-1α y MIP-1β como
control de RT-PCR.
188
INMUNOLOGÍA
P. A DREANI ET AL.
La necesidad de controlar el proceso de amplificación de los loci de MIP-1α y MIP-1β, nos llevó a diseñar unos cebadores híbridos que tras la
amplificación de un gen no-relacionado nos rind i e ron un producto de PCR de distinto peso
molecular al de los amplímeros en estudio, pero
que contenía en sus extremos las secuencias de
los cebadores que se pretenden utilizar para
amplificar el ADNc tanto de MIP-α como de MIP1β (ver Fig. 1). En el caso de MIP-1α (Fig. 2A),
los productos amplificados en esta RT-PCR competitiva con los cebadores α-sense y α-antisense
se distinguen por su peso molecular, ya que mientras el amplímero del gen rinde un producto de
404-407 pb (404 pb según la secuencia de locus
A y 407 pb para el locus B), el producto del amplificado con el EI es de 382 pb (menor peso molecular que el gen de interés). En cambio para MIP1β (Fig. 2B), la RT-PCR competitiva con los
cebadores β-sense y β-antisense produce sobre el
EI un amplímero de mayor peso molecular (431
pb) que el del MIP-1β (316 pb tanto para locus A
como para locus B). Cabe destacar que en ambos
casos es demostrable durante la reacción de
amplificación la competición entre el ADNc de
interés y el ADN del EI.
2. La PCR competitiva permite la cuantificación
en número de copias del gen de interés.
Partiendo de ADNcs, normalizados para GAPDH,
la PCR competitiva permite deducir el número de
copias iniciales (de MIP-1α o MIP-1β) en el ADNc
problema, a partir de un número de copias conocidas en el EI coamplificado. La figura 3 muestra un
ejemplo con una de estas cuantificaciones para MIP1β, en una muestra proviniente de células U-937
estimuladas con LPS y tratadas con cicloheximida.
De hecho la metodología atribuye el número de
copias iniciales que la PCR amplifica por comparación con el número de copias iniciales del EI. Así, en
sentido estricto, sólo si la cantidad del amplímero
obtenido de MIP-1β (que incluye las amplificaciones de locus A y de locus B) tuviera su concentración molar igual a la del EI, podríamos deducir que
E.I.
cDNA
5
10
+
10
+
4
3
10
+
E.I.
cDNA
A. Co-amplificación de E.I.( ) y MIP-1α (→)
40.000
→
X
X
30.000
Phix174
RF/Rsal
E.I. 103 E.I. 103 E.I. 104 E.I. 10 5 – Phix174
RF/Rsal
cDNA cDNA cDNA cDNA cDNA –
–
20.000
cDNA
X
X
10.000
105
104
103
E.I
Copias
Figura 3. Cuantificación de la reacción competitiva. En
B. Co-amplificación de E.I.( ) y MIP-1β (
)
Figura 2. Comparación de las co-amplificaciones de
EI con MIP-1α o MIP-1β de U-937 estimuladas. En A
se muestra la co-amplificación del estándar Interno
(EI) y el ADNc de MIP-1α donde la banda superior
corresponde al amplímero de MIP-1α (404 pb) y la
banda inferior al EI (382 pb). En B se muestra la coamplificación del EI y el ADNc de MIP-1β, donde la banda
superior corresponde al EI (431 pb) mientras que la
banda inferior corresponde al amplímero del ADNc de
MIP-1β (316 pb).
el lado izquierdo de la figura se muestra la electroforesis en
gel de agarosa de una coamplificación del Estándar Interno
5
4
3
(EI) a concentraciones decrecientes (10 , 10 y 10 ) y del
ADNc de las muestras de MIP-1β de U-937 estimuladas
(cantidad fija). En la zona izquierda del lado derecho de la
figura, se muestra la graficación lineal de esta amplificación, para extrapolar y cuantificar la cantidad de MIP-1β
total de la muestra problema. Para ello se grafican (de
manera logarítmica) las copias iniciales del EI respecto a
las densidades ópticas de sus amplímeros electroforéticamente resueltos (unidades arbitrarias) y densitométricamente evaluados (X de color gris). A partir del valor densitométrico del ADNc (X de color negro) de la muestra problema (en su dilución más equivalente a la amplificación
del EI), se extrapola de la gráfica el número de copias iniciales de la muestra.
189
DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LA EXPRESIÓN DE ARNm DE LAS ISOFORMAS DE MIP-1α Y MIP-1β
la concentración inicial también era idéntica.
Cuando los valores no son idénticos (lo habitual),
procedemos a graficar la relación que existe entre el
EI y la muestra en la amplificación más semejante
(se grafican los valores densitométricos de las citadas bandas electroforéticas o si se introduce marcaje radioactivo la señal radioactiva de dichos amplímeros) tal y como se muestra en la figura 3,
deduciendo a partir de la gráfica el número de copias
en el problema. En cualquier caso, la realización del
cálculo de ratios en proporción logarítmica (25) permite la cuantificación más exacta de los productos
amplificados.
3. El estándar interno actúa como control de la
digestión para la evaluación por AFLP posterior de
la pro p o rción de los loci A y B de MIP-1α y
MIP-1β.
El protocolo de co-amplificación pro p u e s t o
p e rmite, a través de la digestión con MspI, distinguir el nivel de expresión de los loci A y B tanto de MIP-1α como de MIP-1β (Fig. 4). Dado que
el EI coamplificado presenta una diana de restricción, este estándar nos permite monitorizar esta
digestión al liberar dos fragmentos de restricción
de distinto peso molecular (Tabla I). Así tras la
amplificación del ADNc y el EI con los cebadores de MIP-1α tal y como se ha comentado, se
obtienen dos amplímeros de 404-407 pb por parte de MIP-1α (404 pb según la secuencia de locus
A y 407 pb para el locus B) y de 382 pb por parte
del EI. La digestión con MspI digiere los 382 pb
del EI en dos fragmentos de 265 y 117 pb que son
perfectamente distinguibles de la longitud de los
fragmentos de restricción procedentes de MIP1α: 176, 138, 62 y 28 pb por parte del Locus A (4
bandas) y 231 y 176 pb por parte del locus B (2
bandas). Para la amplificación del ADNc y el EI
con los cebadores de MIP-1α, se obtienen un
a m p l í m e ro de 431 pb por parte del EI y otro de
316 pb por parte de MIP-1b. En este caso (Fig. 4),
la digestión con MspI produce fragmentos de 290
y 141 pb provenientes del EI y de 316 (locus B),
190 y 126 pb (correspondientes al locus A) por
lo que se refiere a MIP-1β. De hecho es en el estudio de MIP-1β donde se demuestra la mayor utilidad del EI como control de la digestión con
MspI, puesto que debido a que la valoración del
locus B es sólo posible por la ausencia de la diana de MspI en el locus B, es imprescindible un
buen control que permita valorar el nivel de
digestión parcial de la misma. Este nivel de digestión, calculado como porcentaje de la densidad
restante de la banda de 431 pb respecto a la de
290 pb ponderada por 1,48 (la relación entre las
431 bases y las 290 de ambas bandas), nos permite reevaluar, con un mayor nivel de precisión,
la cuantificación densitométrica del locus B, evitando que se sobrevalore su expresión por la prop o rción de locus A no digerido y a su vez la del
locus A que si no, se vería subvalorado.
190
VOL.
20 NÚM. 4 / 2001
Digerido
No
Digestivo con Mspl
Estándar Interno
(431 pb)
Digestión parcial E.I.
cDNA
Locus A + Locus B
(316 pb)
Locus B (315 pb)
Fragmento 1 Estándar
Interno (290 pb)
Fragmento 1 Locus A
(190 pb)
Fragmento 2 Estándar
Interno (141 pb)
Fragmento 2 Locus A
(126 pb)
Figura 4. Discriminación de los isotipos de MIP-1β.
La figura muestra la resolución electroforética de la
digestión (locus A del MIP-1β y el Estándar Interno
(EI)) con la enzima de restricción MspI en relación con
la misma muestra sin digerir. El carril izquierdo muestra el ADNc de MIP-1β y del EI sin digerir, definiéndose 2 bandas: una de 431 pb (correspondiente al EI) y la
otra de 316 pb (que corresponde a los ADNc del locus A
y del locus B). El carril derecho muestra la digestión de
la misma muestra por la enzima MspI, la cual origina
5 bandas: 2 que corresponden al EI (290 pb y 141 pb),
2 al ADNc del locus A (190 pb y 126 pb) y una al ADNc
del locus B (315 pb) que no es digerible por la enzima.
Además se señala con una flecha superior los restos de
EI que permanecen por falta de digestión (digestión
parcial).
Tabla I
Longitud (en pb) de los productos de amplificación y de los fragmentos de restricción tras
RT-AFLP para MIP-1α y MIP-1β
MIP-1α
Digestión Mspl
Moldes para PCR
-
MIP-1β
+
-
265
EI
382
290
431
117
407 (B)
cDNA
404 (A)
+
141
231 (B)
176 (A y B) 316 (B)
316 (B)
138 (A) 316 (A)
190 (A)
62 (A)
126 (A)
28 (A)
En la tabla se muestran los pesos moleculares (en pares de bases) de los productos de amplificación con los cebadores específicos para MIP-1α y MIP-1β y de los
subsiguientes fragmentos de restricción obtenidos tras la digestión con Mspl. En
la tabla se separan los productos del EI y de los genes de interés (el molde usado
son los cDNA obtenidos tras retrotranscripción de los RNA´s extraidos de los
muestras a estudio) aunque en la metodología propuesta los fragmentos de uno
y otro se entremezclan en la electroforesis convencional sobre gel de agarosa.
Entre paréntesis se expresan los loci génicos de los que provienen los amplímeros y fragmentos discriminados. Las flechas indican la procedencia de los fragmentos.
INMUNOLOGÍA
P. A DREANI ET AL.
4. Uso de la 1a RT-AFLP para la evaluación de la
inducción génica de MIP-1α y MIP-1β.
A partir de la cuantificación densitométrica de los
fragmentos de restricción con MspI, se determina
semicuantitativamente el número de copias trascritas por el locus A o el locus B de ambas β-quimiocinas, obteniendo a su vez una información exacta de
la proporción en que ambos loci contribuyen a la síntesis de cada quimiocina. En la figura 5 se muestra
como esta estrategia aplicada al estudio de MIP-1β
permite discriminar la inducción diferenciable entre
el locus A y el locus B frente a diversos estímulos y
tipos celulares. La figura 5A ejemplifica en uno de
los geles para el estudio de la expresión de MIP-1β
en la línea mielomonocítica U-937 frente a la estimulación con Ionomicina, LPS y PMA. En la figura
5B, se grafican los resultados densitométricos de este
experimento una vez analizados y ponderados, dis-
PMA
A
LPS
3h
6h
24h
3h
6h
+ -
+ -
+ -
+ -
+ -
tinguiendo la contribución a la inducción de la
expresión de los loci de MIP-1β. De hecho, tanto esta
figura de ejemplo como otros datos propios (en preparación para su publicación) realizados con esta
estrategia nos han permitido demostrar que los estímulos inductores actúan a niveles y con cinéticas
muy distintos para locus A y locus B de MIP-1β lo
cual implica diferencias en sus promotores, que hasta ahora no han sido estudiados de forma comparativa. De manera equivalente, la metodología es aplicable al estudio de los locus A y B de MIP-1α.
5. Comparacación de las cinéticas de la reacción de
amplificación del EI con la de los ADNcs de MIP-1β.
Evaluación conjunta de la cinética de co-amplificación.
Dado que la metodología de la co-amplificación
competitiva respecto a un estándar precuantificado
presupone que el comportamiento del estándar es
equivalente al del gen que se estudia, planteamos
lonomicina
24h
No
estim.
MIP-1β
+ -
+ -
Dig.Mspl
3h
-
6h
+
--
24h
++
-
+
GAPDH
1. Cuantificación de la expresión
de MIP-1β Locus A
B
2. Cuantificación de la expresión
de MIP-1β Locus B
12000
900
8000
600
4000
300
0
0
0h
3h
6h
PMA
0h
24h
LPS
Ionom.
3h
6h
24h
No estim.
Figura 5. Análisis semicuantitativo de MIP-1β tras la estimulación de células U-937. En A se muestra la resolución electroforética de la cinética (situación basal, 3h, 6h y 24h post-estímulo) de inducción de la expresión tanto del locus A como del
locus B del MIP-1β tras la estimulación de la línea celular U-937 con PMA, LPS e Ionomicina. También se muestra la digestión (+) y la no digestión (-) con la enzima MspI en cada uno de los casos. Las muestras fueron normalizadas previamente con
GAPDH (imagen inferior de la figura). En B se representan las cuantificaciones normalizadas de la expresión del MIP-1β tanto
del locus A (lado izquierdo) como del locus B (lado derecho) tras las citadas estimulaciones con PMA, LPS e Ionomicina.
191
DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LA EXPRESIÓN DE ARNm DE LAS ISOFORMAS DE MIP-1α Y MIP-1β
analizar la veracidad de esta afirmación mediante
el uso de la PCR en tiempo real (rt-PCR). Para ello,
comparamos las cinéticas de amplificación de los
ADNcs de los genes a estudio respecto al EI, mediante la monitorización continuada que ofrece la rtPCR. Concretamente, la figura 6 muestra las curvas
de amplificación para los cebadores de MIP-1β aplicados a amplímeros de MIP-1β (precuantificados y
7
6
diluidos hasta 10 y 10 copias iniciales) en relación
a las curvas del EI que hemos desarrollado (pre7
6
5
cuantificados y diluidos a 3x10 , 10 y 10 copias
iniciales). Las curvas de amplificación del EI, si bien
no son idénticas a las propias del MIP-1β, sí que son
globalmente equiparables, en especial las pendientes de las mismas que definen la eficiencia de amplificación y por tanto la cantidad de copias del molde
de partida. De hecho, el estudio demostró que esta
similitud de comportamiento se produce especial7
5
mente en el rango de 10 -10 copias iniciales. Por
debajo y por encima de ello existe una mayor divergencia entre el EI y el producto normal (datos no
mostrados). En cualquier caso, estos resultados nos
demuestran que el EI puede considerarse una aproximación absolutamente aceptable en la evaluación
semicuantitativa de la expresión de los transcritos
de los genes de MIP-1β.
20 NÚM. 4 / 2001
cuantitativa por RT-PCR del ARNm de las quimiocinas MIP-1α y MIP-1β, de manera sencilla y
fiable. Conceptualmente, el interés real de esta
aproximación radica en el estudio de las funciones de las quimiocinas, al quedar bien establecido que su expresión define la localización de las
células inmunitarias y, por tanto, el funcionamiento del sistema inmunitario (26) y de los
órganos linfoides (27-28), en situaciones fisiológicas y patológicas (29-30). Su valoración en
todas estas condiciones, a menudo requiere de la
evaluación de los ácidos nucleicos codificantes.
La cuantificación de los transcritos es necesaria
en las quimiocinas inducibles, como MIP-1α y
M I P - 1β, en las que se conoce que los cambios
relativos se relacionan con comport a m i e n t o s
funcionales distintos (31). El uso de la RT- P C R
sin duda posibilita esta evaluación, aunque la
diversidad de comportamiento de la PCR en las
diversas circunstancias de los ensayos y su cinética que converge hacia la meseta de máxima
amplificación hacen necesario el uso de controles del proceso. Existen diversas aproximaciones
para controlar el proceso, pero hasta la reciente
irrupción de la PCR en tiempo real, el uso de cont roles internos (en cada tubo de amplificación)
se ha demostrado como la mejor apro x i m a c i ó n
metodológica.
La existencia de 4 loci genéticos codificantes
(locus A y locus B) de MIP-1α y MIP-1β obliga a
diseñar estrategias para su análisis por separado si
se desea estudiar su contribución individual al conjunto. Dada la gran similitud entre estas isoformas
DISCUSIÓN
Los resultados presentados muestran que el
d e s a rrollo y uso del fragmento competidor
recombinante (EI) permite la valoración semi35,0
32,5
30,0
27,5
VOL.
3x107 EI
106 MIP-1β
106 EI
25,0
22,5
20,0
17,5
107 MIP-1β
105 MIP-1β
15,0
12,5
10,0
7,5
5,0
2,5
0,0
-2,5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Cycle Number
Figura 6. Comparación de cinéticas de amplificación del EI o fragmento competidor respecto al ADNc de MIP-1β. Se
presentan las curvas obtenidas por rt-PCR (PCR a tiempo real) que muestran cinéticas de amplificación tanto del MIP-1β
7
6
5
como del EI. Las curvas corresponden a las amplificaciones de las diferentes diluciones del EI (3x10 , 10 , y 10 copias), y
7
5
de amplímeros pre-cuantificados de MIP-1β (10 , y 10 copias). Merece la pena observar que las cinéticas, si bien no son
idénticas, sí que pueden considerarse equivalentes, en especial respecto a las pendientes de amplificación de las mismas.
192
INMUNOLOGÍA
(los mensajeros no sólo son prácticamente iguales
en cuanto a longitud, sino que incluso las secuencias son más de un 99% homólogas), este estudio
requiere la combinación de otra metodología que
se añade a la simple RT-PCR. En nuestro caso, planteamos como estrategia metodológica el uso de
MspI que posibilita la discriminación de ambos loci
por la longitud de los fragmentos de restricción de
los amplímeros (RT-AFLP). Para poder cuantificarlos, hay que controlar los dos parámetros que
podrían introducir más variaciones en este doble
proceso: la diversidad de la cinética de amplificación del ADNc y la eficiencia de la digestión con
MspI. Con este objetivo, de nuevo el EI será una
herramienta imprescindible puesto que permite a)
controlar la eficiencia de la digestión con la citada
endonucleasa sobre cada tubo, distinguiendo los
fragmentos no digeridos (no presentan esta diana),
y b) recuantificar de manera precisa los valores calculados por densitometría. De hecho en el caso
concreto de MIP-1β, los loci A y B presentan una
homología muy elevada en su secuencia codificante (ADNc), aunque difieren en algunas bases. Esta
diferencia es clave para la identificación de cada
locus al utilizar la enzima MspI que reconoce la
secuencia CCGG, presente sólo en el locus A (el
locus B presenta la secuencia CTGG). Cuando se
produce el corte, se generan 2 fragmentos en el
locus A; mientras que el locus B queda intacto.
Estos fragmentos son perfectamente visualizables
en un gel de agarosa. Merece la pena destacar aquí,
que en algunos casos también se puede distinguir
una forma truncada del locus B, que presenta 15 pb
menos (datos no mostrados).
Esta aproximación metodológica se demuestra
simple y útil para el estudio de la expresión de las
quimiocinas MIP-1α y MIP-1β, aunque presenta
algunas limitaciones que podrían cuestionar su
exactitud. Por un lado, tal y como se describe, se
trata de una estrategia que más que cuantitativa
debe adjetivarse como semi-cuantitativa (y así se
cataloga a lo largo del trabajo) El prefijo semi- debe
aplicarse porque los valores de copias iniciales de
transcrito no son absolutos, ya que no se correlacionan exactamente con los ARNm de partida. El
control que aporta el EI se aplica a partir del ADNc,
por lo que no monitoriza los procesos previos
(específicamente la extracción de ARN desde las
células y la posterior retrotranscripción). Si bien
no resulta demasiado atrevido asumir eficiencias
equivalentes para estos procesos previos a la amplificación, en sentido estricto sería conveniente
introducir el control desde la extracción. Para ello
bastaría con transcribir el EI in vitro a partir del plásmido recombinante (aprovechando para ello la
secuencia promotora Sp6 del pZErO-2), cuantificar el ARN producido y añadirlo a la concentración
adecuada en el mismo momento de la extracción.
De este modo, este EI en forma de ARNm controlaría la eficiencia de todo el proceso. Es obvio que
P. A DREANI ET AL.
esta estrategia aunque más precisa, resulta técnicamente más compleja y delicada, y si bien puede
ser requerida en determinadas aplicaciones (por
ejemplo evaluación de cargas virales para virus
ARN), en general no suele exigirse en el estudio de
la expresión de genes eucariotas, asumiendo que
la aplicación de un control a partir de la PCR permite obtener resultados que “sólo pueden considerarse semicuantitativos” (como es nuestro caso).
En este sentido, el uso de un EI competidor (incluso en forma de ARN) de distinto peso molecular
presupone que éste mantiene la misma eficiencia
de amplificación que el ADNc de interés. Y de nuevo esta presunción, si bien en general es aceptable,
en sentido estricto es como mínimo imprecisa. De
hecho, nuestros resultados (Fig. 6) demuestran
esta imprecisión, puesto que las diferencias de
secuencia de los moldes (en este caso debido al distinto peso molecular) influyen en la eficiencia de
la amplificación. Por ello, se diseñan EI de peso
molecular muy similar al del producto a estudio,
prefiriendo usar en general, estándares internos de
mayor peso molecular (como MIP-1β) que de
menor peso (como MIP-1α). Con ello, se busca
sobreestimar el gen de interés (en general los amplímeros de menor peso molecular se amplifican
mejor), evitando la infravaloración que un EI
menor que el gen de interés pudiera producir al
competir con mayor eficiencia.
Todas estas limitaciones conceptualmente se
evitan con la aplicación de la RT-PCR a tiempo real,
puesto que el seguimiento continuo de la reacción
que permiten estos equipos hace innecesaria la
introducción de un EI de distinto peso en la muestra. En la rt-PCR, son los parámetros de la cinética
de amplificación (pendiente, señal de fondo, meseta final, etc.) los que permiten asegurar la cuantificación por comparación respecto a muestras previamente cuantificadas que se amplifican en
reacciones simultáneas (e incluso previamente
almacenadas). Es posible que en aras de una máxima precisión fuera aconsejable cuantificar globalmente MIP-1α o MIP-1β por rt-PCR, añadiendo a
posteriori el EI amplificado para que controlara el
nivel de eficacia de la digestión, permitiéndonos
así definir la contribución de cada loci a esta cantidad global de CC-quimiocinas. En cualquier caso,
nuestros resultados con rt-PCR, confirman que la
aproximación más clásica con el EI parece proporcionar resultados globalmente equiparables a los
de la rt-PCR y por lo tanto igualmente aceptables,
lo cual sin duda es importante dado que los equipos de PCR en tiempo real todavía no están disponibles más que en contados centros. El desarrollo
propuesto se ha diseñado para evaluar preferentemente la expresión de los loci A y B de MIP-1β, más
que de los correspondientes de MIP-1α. De hecho
los loci de MIP-1β son mucho más homólogos
entre ellos que las secuencias de las isoformas de
MIP-1α, para las que otras estrategias más simples
193
DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LA EXPRESIÓN DE ARNm DE LAS ISOFORMAS DE MIP-1α Y MIP-1β
pueden ser tanto o más útiles. En cualquier caso,
este artículo no pretende definir las peculiaridades
de regulación de ambos loci de MIP-1β, sino ilustrar la fiabilidad de la metodología desarrollada.
Así pues, en resumen, este trabajo permite afirmar
que a través de nuestra aproximación es posible
cuantificar de una manera fácil, rápida y económica la cantidad de mensajero de MIP-1α y MIP-1β,
definiéndose además la participación en esta expresión de los transcritos codificados por el locus A y
los codificados por el locus B.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha podido ser realizado gracias a la
financiación del Fondo de Investigaciones
Sanitarias (FIS99/1063). Agradecemos especialmente al Dr. Yaqoub Ashhab y al Dr. Orlando
Domínguez, quienes habiendo realizado trabajos
previos en nuestro laboratorio nos abrieron la línea
de investigación que ha condicionado y guiado el
desarrollo del trabajo presentado en nuestro artículo. También quisiéramos extender nuestro agradecimiento a Pilar Armengol, por su orientación
durante el desarrollo del trabajo, así como su
paciencia y dedicación.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
CORRESPONDENCIA:
Manel Juan i Otero
Unitat d´ Immunologia, Lirad-CTBT
Hospital Universitari Germans Trias i Pujol
Ctra. Canyet s/n. P.O. BOX 72
08916 Badalona (Barcelona). España
18.
19.
20.
21.
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