Bioquímica y Biología Molecular

Manuales Departamentales
Programa Académico, objetivos del curso, contenido temático y
manual de prácticas de laboratorio
Bioquímica y
Biología Molecular
Primer año
2009-2010
Departamento de Bioquímica
Facultad de Medicina
Universidad Nacional Autónoma de México
Cd. Universitaria, D.F. Agosto de 2009.
1
FACULTAD DE MEDICINA
MANUALES DEPARTAMENTALES
Obra general ISBN: 968-36-2767-6
Este volumen ISBM: 970-32-1866-0
© 2004
Nueva edición revisada y estructurada.
© 2005 primera reimpresión.
© 2006 primera reimpresión.
Derechos reservados conforme a la ley.
Facultad de medicina, UNAM.
Folio CAPES: 008/2005
El contenido de este Manual esta protegido por la Ley de
Derecho de Autor y no puede ser reproducido, total o
parcialmente, por ningún medio mecánico, electrónico o
cualquier otro, sin el permiso escrito del Comité Asesor de
publicaciones de la Facultad de Medicina de la Universidad
Autónoma de México.
El cuidado editorial estuvo a cargo del Comité Asesor de
Publicaciones de la Facultad de Medicina, UNAM.
El contenido de este Manual es responsabilidad de sus
Autores ya que constituye un auxiliar en la enseñanza.
2
FACULTAD DE MEDICINA
Dr. Enrique Luis Graue Wiechers
Director
Dra. Rosalinda Guevara Guzmán
Secretario General
Dr. Pelayo Vilar Puig
Jefe de la División de Estudios de Posgrado
e Investigación
Dr. Juan José Mazón Ramírez
Secretaria de Enseñanza Clínica, Internado
y Servicio Social
Dra. Irene Durante Montiel
Dr. Melchor Sánchez Mendiola
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Secretario de Educación Médica
Dr. Ricardo Valdivieso Calderon
Secretario de Servicios Escolares
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Secretario de Planeación
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Dr. Guillermo Robles Díaz
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C.P. Francisco Cruz Ugarte
Secteraría Jurídica y de Control Administrativo
Coordinador de Investigación
Coordinadora de Ciencias Básicas
Coordinador de Servicios a la Comunidad
Secretario Administrativo
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
Dr. Edgar Zenteno Galindo
Jefe del Departamento de Bioquímica
M. en C. Alicia Cea Bonilla
Coordinadora de Enseñanza de Bioquímica
y Biología Molecular
Dr. Raúl Chávez Sánchez
Coordinador de Enseñanza de Inmunología
Dr. Guillermo Mendoza Hernández
M. en C. Rebeca Milán Chávez
Coordinador de Investigación
Coordinadora del Laboratorio de Prácticas
3
Colaboradores
OBJETIVOS DEL CURSO
metabolismo del colesterol, estructura y metabolismo
de las lipoproteínas, regulación del metabolismo de
Guillermo Álvarez Llera
Patricia del Arenal Mena
Alicia Cea Bonilla
lípidos).
Haydée
Leonor Fernández Rivera Río
Rebeca Milán Chávez
Torres
Guerrero
(modificaciones
postraduccionales).
Aída Uribe Medina (características de la materia viva).
Sara Morales López
Celia Virginia Sánchez Meza
Alejandro
Zentella
Dehesa
(virus,
oncogenes
y
transformación).
SYLLABUS
Guillermo Álvarez Llera (agua, ciclo de Krebs, oxidación de
los
aminoácidos,
química
y
metabolismo
de
carbohidratos, química y metabolismo de lípidos).
Patricia del Arenal Mena (ciclo celular).
Alicia
Cea
Bonilla
proteínas,
(fundamentos
enzimas
y
del
coenzimas,
metabolismo,
estructura
de
carbohidratos,
metabolismo
de
carbohidratos,
regulación de la glucemia, regulación del metabolismo
de lípidos, síntesis y degradación de fosfolípidos,
regulación
e
integración
metabólica,
biología
INTRODUCCIÓN AL MANUAL DE PRÁCTICAS
DE LABORATORIO Y CASOS DE CORRELACIÓN
BIOQUÍMICA Y PRÁCTICA MÉDICA
Alicia Cea Bonilla (potenciometría y electroforesis).
Rebeca Milán Chávez (gota).
Celia Virginia Sánchez Meza.
ELABORACIÓN O REVISIÓN DE LAS PRÁCTICAS
DE LABORATORIO
molecular).
Leonor Fernández Rivera Río (nucleótidos).
Óscar Flores Herrera (figuras: ciclo energético, vías que
siguen los protones en las levaduras, ciclo de Krebs y
esquema de un potenciómetro).
Alberto
Hamabata
Nishimuta
(aspectos
básicos
de
fisicoquímica, niveles de regulación de la expresión
genética).
Noemí Meraz Cruz (síntesis y degradación de fosfolípidos,
regulación del metabolismo de lípidos).
Rebeca Milán Chávez (equilibrio hidroelectrolítico).
Sara Morales López (agua, química y metabolismo de
carbohidratos, química y metabolismo de lípidos).
Celia Virginia Sánchez Meza (tabla periódica, enlaces,
fundamentos
del
metabolismo,
equilibrio
hidroelectrolítico,
proteínas,
radicales
libres,
descarboxilación del piruvato, regulación de la
glucemia, síntesis y degradación de fosfolípidos,
1. Soluciones. Celia Virginia Sánchez Meza y Rebeca
Milán Chávez.
2. Regulación del equilibrio ácido-base después de
ejercicio muscular intenso y de la ingestión de
bicarbonato de sodio. Concepción González López,
Celia Virginia Sánchez Meza y Juan Luis Rendón
Gómez.
3. Cinética enzimática. Efecto de la concentración del
sustrato en la velocidad de la reacción enzimática.
Celia Virginia Sánchez Meza, Rebeca Milán Chávez y
Jesús Antonio Oria Hernández.
4. Estudio del bombeo de protones por levaduras; efecto
de los inhibidores de la cadena de transporte de
electrones y de los desacoplantes. Juan Pablo Pardo
Vázquez y Federico Martínez Montes.
5. Efecto de la insulina sobre la glucemia de la rata.
Leonor Fernández Rivera Río.
4
6. Radicales libres (lipoperoxidación). José Gutiérrez y
Celia Virginia Sánchez Meza.
7. Estudio general del metabolismo de los carbohidratos.
Celia Virginia Sánchez Meza y Rebeca Milán Chávez.
8. Determinación de la transaminasa glutámico-pirúvica
sérica. Ma. Eugenia García Salazar y Celia Virginia
Sánchez Meza.
9. Determinación de glucosa en sangre total. Rebeca Milán
Chávez y Eugenia Flores Robles.
10. Integración Metabólica. Rebeca Milán Chávez y
Eugenia Flores Robles.
11. Huella génica. Rebeca Milán Chávez y Eugenia Flores
Robles.
La revisión y la actualización de los Objetivos del curso se
realizó en colaboración con el proyecto: Mejoramiento de la
Enseñanza de la Bioquímica y Biología Molecular (EN206603) del Programa de Apoyo a Proyectos
Institucionales para el Mejoramiento de la Enseñanza
(PAPIME), siendo el responsable del proyecto el doctor
Federico Martínez Montes.
Corrección y cuidado de la edición: Edgar Zenteno
Galindo, Alicia Cea Bonilla, Rebeca Milán Chavez y
Eugenia
Flores
Robles.
5
CONTENIDO
PROGRAMA ACADÉMICO
I.
Misión de la Facultad de Medicina 8
II.
Introducción
III.
Datos generales de la asignatura 12 -----
IV.
Objetivos de aprendizaje
12
V.
Metodología educativa
12
VI.
Estructura del curso
13
VII.
Lineamientos de evaluación
19
VIII.
Obligaciones de los profesores y
IX.
10
alumnos
25
Bibliografía
25
Unidad Temática 1: Estructura molecular
I. Lógica molecular de la vida
A. Características de la materia viva
B. Niveles de la organización celular
B.1 Bioelementos
B.2 Moléculas precursoras y
macromoléculas
B.3 Estructuras, orgánulos, células, tejidos
Organismos
27
29
29
29
y
29
II. Aspectos fisicoquímicos del funcionamiento
celular
A. Aspectos básicos de fisicoquímica aplicados
a la bioquímica
31
B. Agua
33
C. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base
35
D. Aminoácidos y proteínas
37
D.1. Aminoácidos
37
D.2. Proteínas
37
E. Enzimas y coenzimas
40
E.1. Características de un sistema enzimático40
E.2. Cinética enzimática
40
E.3. Aspectos médicos de la
enzimología
40
Unidad Temática II: Metabolismo
III. Metabolismo y bioenergética
A. Fundamentos del metabolismo celular
B. Carbohidratos
46
48
B.1. Estructura
48
B.2. Digestión y absorción
48
C. Metabolismo energético
50
C.1. Glucólisis
50
C.2. Papel de la mitocondria en las funciones
oxidativas
51
C.3. Descarboxilación del piruvato
52
C.4. Ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo
de Krebs)
52
C.5. Cadena de transporte de electrones
(cadena respiratoria)
54
C.6. Fosforilación oxidativa
54
C.7. Radicales libres
56
D. Otras vías metabólicas de los carbohidratos.58
D.1. Gluconeogénesis
58
D.2. Glucogenólisis y glucogénesis
59
D.3. Vía del fosfogluconato (ciclo de las
pentosas)
59
D.4. Regulación de la glucemia
60
E. Lípidos
62
E.1. Estructura
62
E.2. Digestión, absorción y transporte
62
F. Metabolismo de lípidos
64
F.1. Oxidación de los ácidos grasos (ßoxidación)
64
F.2. Síntesis y utilización de los cuerpos
cetónicos
65
F.3. Síntesis de ácidos grasos
65
F.4. Síntesis y degradación de triacilgliceroles
66
F.5. Síntesis y degradación de fosfolípidos 67
F.6. Metabolismo del colesterol
67
F.7. Estructura y metabolismo de las
lipoproteínas
68
F.8. Regulación y alteraciones del
metabolismo de lípidos
69
G. Metabolismo de los compuestos
nitrogenados.
72
G.1. Aminoácidos y proteínas
72
G.2. Nucleótidos
74
H. Regulación e integración metabólica
76
Unidad Temática III: Biología Molecular
IV Biología Molecular
A. Organización del genoma
B. Flujo de la información genética
B.1. Flujo de la información genética
B.2. Síntesis del DNA (duplicación)
B.3. Transcripción
B.4. Traducción
80
83
83
83
85
86
VI
C. Mutaciones y reparación del DNA
D. Niveles de regulación de la expresión
genética
E. Virus, oncogenes y transformación
F. Técnicas de manipulación del DNA
89
90
93
95
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO
I. Conceptos teóricos iniciales
El método científico
99
El Sistema Internacional de Unidades (SI)
101
Matemáticas para el laboratorio
104
Notación científica o exponencial
104
El método del factor unitario en los cálculos 105
Logaritmos
106
Gráficas
107
Algunos métodos utilizados en bioquímica
109
Centrifugación
109
Potenciometría
110
Electroforesis
113
Soluciones
116
Manejo de material biológico
116
Medidas de seguridad
123
II. Experimentos
Práctica 1. Soluciones
133
Práctica 2. Regulación del equilibrio ácido-base
después de ejercicio muscular intenso y de la
ingestión de bicarbonato de sodio
137
Práctica 3. Cinética enzimática. Efecto de la
concentración del sustrato en la velocidad
de la reacción enzimática
140
Práctica 4. Efecto de la insulina sobre la Glucemia
de la rata.
145
Práctica 5. Estudio del bombeo de protones
por levaduras; efecto de los inhibidores
de la cadena de transporte de electrones
y de los desacoplantes
146
Práctica 6. El efecto del etanol sobre la lipoperoxidación
149
Práctica 7. Estudio general del metabolismo
de carbohidratos
150
Práctica 8. El efecto del tetracloruro de carbono
sobre las transaminasas
1155
Práctica 9.Determinaión de glucosa en sangre
total.
156
Práctica 10. Integración metabólica
Práctica 11. Huella génica
160
168
III. Casos de correlación bioquímica y práctica
médica
Caso 1. Cólera
174
Caso 2. Oclusión intestinal. Acidosis metabólica.
Deshidratación grave
175
Caso 3. Hipoglucemia secundaria a intoxicación
Alcohólica
177
Caso 4. Cetosis por inanición. Obesidad
178
Caso 5. Hipercolesterolemia y aterosclerosis 179
Caso 6. Gota
181
VII
PROGRAMA ACADÉMICO
I. Misión de la Facultad de Medicina
“Formar a los líderes de las próximas
generaciones de médicos mexicanos y contribuir a
establecer un sistema de salud capaz de preservar
y desarrollar las capacidades físicas y mentales de
nuestra población y colaborar en la preparación de
investigadores en el campo de las ciencias
médicas.
•
Para ello, será necesario fortalecer el compromiso
social de sus estudiantes y su vocación
humanística para tener a la vida humana y a la
dignidad del hombre como valores supremos, por
lo que será necesario que los alumnos adquieran
los conocimientos científicos más avanzados para
responder cabalmente a las necesidades de salud
de la sociedad mexicana.
•
La educación y la formación médica en la Facultad
deberán ser factores de cambio e innovación en
las instituciones de salud y contribuir a incrementar
las aportaciones de la medicina mexicana al
conocimiento universal.
El apego a la prestación de servicios de la más
alta calidad, la curiosidad científica y el
compromiso
irrestricto
con
los
principios
fundamentales de la ética médica deberán ser la
característica de sus egresados. Para ello será
necesario organizarse en un ambiente de libertad
intelectual, en el que se conjuguen el talento de
profesores y alumnos, fomentando la creatividad y
la productividad individual y colectiva”.
En suma, la Facultad de Medicina deberá
caracterizarse por su calidad académica, su
vitalidad, su compromiso decidido con la
investigación original y los principios humanísticos
de la profesión para poder consolidar el liderazgo
que legítimamente le corresponde.
•
•
Calidad
académica.
Que
significa
favorecer la formación más allá de la
simple información en sus estudiantes,
fortaleciendo su preparación en las
ciencias básicas de la medicina que les
permita seguir el ritmo de los avances en
el conocimiento y sus aplicaciones en la
clínica.
Vitalidad. Para poder enfrentar el futuro
en el contexto del cambio científico y
tecnológico y de las modificaciones que
experimenten
las
condiciones
socioeconómicas de nuestra población.
Para ello, será necesario rescatar la
enseñanza tutorial orientada a la solución
de problemas de manera original e
innovadora y capaz de inducir en el
estudiante una conciencia clara de sus
necesidades de actualización permanente
y educación continua.
Investigación original. Por cuanto que es
un elemento indispensable para alcanzar
un sistema de salud de alta calidad y
eficiencia, y porque es la única vía para
atender
cabalmente
los
complejos
fenómenos que inciden en el proceso de la
salud y la enfermedad en medicina,
educación
e
investigación
son
inseparables.
Humanismo. Porque el fin último del
médico es el hombre mismo. Para ello
habrá de desarrollar una sensibilidad
singular ante el dolor y la angustia de los
enfermos, ante su ignorancia y sus
problemas, para que pueda ayudar a
superarlos. Para poder servir a la sociedad
y los individuos con plena conciencia de
sus valores y potencialidades habrá que
inducir en nuestros estudiantes una actitud
humanitaria.
8
•
Liderazgo. Entendiendo éste como la
capacidad para mantener una actitud de
vanguardia y compartir conocimientos y
experiencia; para orientar la educación
médica nacional y fortalecer tanto la
investigación en salud como nuestro
sistema de educación superior; para
transformar la medicina mexicana y
responder cada vez mejor a una sociedad
que se esfuerza en superarse y demanda,
con razón, una mayor calidad a todo el
sistema de salud.
Congruente con la Misión de la Facultad de
Medicina, la función del médico se caracteriza de
la siguiente manera:
El médico es un profesional comprometido a
preservar, mejorar y restablecer la salud del
ser humano; sus acciones se fundamentan en
el conocimiento científico de los fenómenos
biológicos, psicológicos y sociales. Su
ejercicio
profesional
se
orienta
primordialmente a la práctica clínica, la cual
debe ejercer con conocimiento, diligencia,
humanismo, prudencia y juicio critico,
guiándose por un código ético que considera a
la vida humana como valor supremo.
EL PERFIL PROFESIONAL DEL EGRESADO DE
LA CARRERA DE MÉDICO CIRUJANO
El egresado de la Facultad de Medicina de la
Universidad Nacional Autónoma de México que
cumple satisfactoriamente los objetivos y adquiere
los conocimientos, habilidades, destrezas y
actitudes que integran el Plan Único de Estudios:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
aspectos
afectivos,
emocionales
y
conductuales de los pacientes bajo su
cuidado.
Conoce con detalle los problemas de
salud de mayor importancia en nuestro
país y es capaz de ofrecer tratamiento
adecuado a los pacientes que los
presentan.
Promueve el trabajo en equipo con otros
médicos y profesionales de la salud y
asume la responsabilidad y el liderazgo
que le corresponden, según su nivel de
competencia y papel profesional.
Dispone de conocimientos sólidos acerca
de las ciencias de la salud, lo que le
permite utilizar el método científico como
herramienta de su práctica clínica habitual
y lo capacita para optar por estudios de
posgrado, tanto en investigación como en
alguna especialidad médica.
Tiene una actitud permanente de
búsqueda de nuevos conocimientos, por lo
que cultiva el aprendizaje independiente y
autodirigido, lo que le permite actualizarse
en los avances de la medicina y mejorar la
calidad de la atención que otorga.
Se mantiene actualizado en relación a los
avances científicos y tecnológicos más
recientes; utiliza la información y la
tecnología
computacional
para
la
adquisición de nuevos conocimientos y
como una herramienta de trabajo dentro
de su práctica profesional.
Es un profesional capacitado para ofrecer
servicios de medicina general de alta
calidad y, en su caso, para referir con
prontitud y acierto aquellos pacientes que
requieren
cuidados
médicos
especializados.
En la atención de los pacientes, además
de efectuar las acciones curativas, aplica
las medidas necesarias para el fomento a
la salud y la prevención de las
enfermedades, apoyándose en el análisis
de
los
determinantes
sociales
y
ambientales, especialmente el estilo de
vida.
Se conduce según los principios éticos y
humanistas que exigen el cuidado de la
integridad física y mental de los pacientes.
Como parte integral de su práctica
profesional examina y atiende los
9
II. INTRODUCCIÓN:
1. Mapa curricular:
ANATOMÍA
PRIMER AÑO
BIOLOGÍA CELULAR Y TISULAR
BIOLOGÍA DEL DESARROLLO
BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
PSICOLOGÍA MEDICA I
SALUD PÚBLICA I
ASIGNATURAS DE LIBRE
ELECCIÓN***
ASIGNATURAS DE LIBRE ELECCIÓN***
CIRUGÍA I
SEGUNDO AÑO
FARMACOLOGÍA
FISIOLOGÍA
INMUNOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
SALUD PÚBLICA II
ASIGNATURAS DE LIBRE ELECCIÓN***
ASIGNATURAS DE LIBRE
ELECCIÓN***
TERCER AÑO
PROPEDÉUTICA Y
FISIOPATOLOGÍA*
PATOLOGÍA
MEDICINA GENERAL I*
PSICOLOGÍA MÉDICA II**
SALUD PÚBLICA III***
GENÉTICA CLÍNICA*
CUART
O AÑO
SEMINARIO CLÍNICO*
ASIGNATURAS DE LIBRE ELECCIÓN***
ASIGNATURAS DE LIBRE
ELECCIÓN***
SALUD PÚBLICA IV**
HISTORIA Y FILOSOFÍA DE LA
MEDICINA
10
MEDICINA GENERAL II*
CIRUGÍA II*
ASIGNATURAS DE LIBRE ELECCIÓN***
ASIGNATURAS DE LIBRE
ELECCIÓN***
SEXTO AÑO
S E R V I C I O
URGENCIAS ♦
COMUNIDAD ♦
GINECOLOGÍA Y
OBSTETRICIA ♦
CIRUGÍA ♦
MEDICINA
INTERNA ♦
PEDIATRÍA ♦
QUINTO AÑO
INTERNADO MÉDICO*
S O C I A L
* Estas asignaturas son la base del entrenamiento en el área clínica, en éllas el alumno
adquirirá los conocimientos acerca de la patología de los diversos aparatos y sistemas,
así como las habilidades y destrezas necesarias para el manejo de los problemas de
salud más frecuentes.
** Estas asignaturas corresponden al área sociomédica.
*** Su propósito es permitir que el alumno profundice o complemente de acuerdo a sus
preferencias algunos contenidos del plan de estudios; tenga la posibilidad de capacitarse
en ciertas áreas no consideradas en dicho plan, así como también dar flexibilidad al
currículo.
♦ Áreas de rotación bimestral.
11
2. Importancia de la asignatura en la carrera.
La segunda mitad del siglo XX fue el marco
temporal de una expansión acelerada de nuestro
entendimiento del mundo y del Universo en
general y, como consecuencia, la orientación de
una mayor cantidad de recursos humanos y
materiales hacia la investigación en todas las
áreas de la ciencia. El campo de la medicina ha
tenido grandes avances, particularmente en las
áreas del conocimiento de la Bioquímica y de la
Biología Molecular. La información generada por
estas disciplinas ha sido fundamental para
comprender mejor el fenómeno de la vida y para
abordar el estudio de las enfermedades.
Los conocimientos aportados por la Bioquímica y
la Biología Molecular no sólo permiten entender
mejor la manera en la que están estructuradas las
células y los tejidos, el funcionamiento del
organismo y cuáles son las fundamentos de la
patogénesis existente, sino que proporcionan las
bases para el uso racional de las estrategias
terapéuticas, principalmente en el campo del
descubrimiento de fármacos efectivos con un
mínimo de efectos indeseables.
Si bien es cierto que los avances son
extraordinarios, aún quedan muchas interrogantes
por contestar. Día con día se avanza en la
búsqueda de tales respuestas. En consecuencia,
la Bioquímica y la Biología Molecular forman parte
de esa gran plataforma de los programas actuales
de formación académica de los médicos cirujanos.
El Departamento de Bioquímica ofrece a los
estudiantes de la carrera de médico cirujano el
programa de contenidos de este curso, el cual está
dirigido e integrado con un enfoque médico,
adaptado a las necesidades de una modernidad
inquisitiva, demandante de conocimientos cada
vez más aproximados a un contexto que permita
esa aspiración superior de contar con una
medicina de alta calidad.
Por otro lado, ahora que inicias tus estudios
profesionales es importante que sepas que el
aprendizaje
es
una
experiencia activa de descubrimiento, por lo que
no sólo deberás esperar que tus maestros te
guíen a lo largo de tus estudios.
Entre las habilidades que deberás adquirir durante
tu formación profesional están la búsqueda de
información y la autoenseñanza.
Los conocimientos mínimos necesarios para
aprobar el curso de Bioquímica y Biología
Molecular se encuentran descritos en este Manual
de objetivos del curso y prácticas de laboratorio,
por lo que te sugerimos que los revises
cuidadosamente; en caso de que algún concepto
no se estudie en la clase, es tu responsabilidad
buscar
la
información
correspondiente
y
aprenderla. Te deseamos que el aprendizaje de
esta disciplina te resulte grato y que lo lleves a
feliz término.
III DATOS GENERALES DE LA ASIGNATURA
1. Coordinación:
Bioquímica
2. Tipo de Asignatura:
3. Ubicación
4. Duración
5. N° de horas
Departamento
de
Teórica y práctica
Primer año
Anual
Teoría: 160 h
Práctica: 120 h
6. N° de créditos
22
7. Clave
1115
8. Requisitos académicos
Cubrir
los
requisitos de ingreso a la licenciatura
IV OBJETIVOS DE APRENDIZAJE
1. Que el estudiante entienda los fenómenos
biológicos desde el punto de vista molecular y
que sea capaz de integrar este conocimiento
en la estructura fisiológica de la célula, del
tejido y del organismo.
2. Que el estudiante conozca los mecanismos
moleculares del funcionamiento del organismo
humano de una manera dinámica e integral y,
al mismo tiempo, comprenda cómo esos
mecanismos se encuentran alterados en la
enfermedad.
3. Que el estudiante demuestre, mediante
actividades ex profeso, que ha podido integrar
el conocimiento a nivel molecular como una
herramienta fundamental para la comprensión
de los procesos fisiológicos y de la
fisiopatología y con ello entienda los principios
en los que se apoya la tecnología empleada
en el diagnóstico de enfermedades.
4. Que el estudiante aplique el método científico
como una herramienta en la identificación, el
análisis y la solución de problemas médicos.
V. METODOLOGÍA EDUCATIVA
Con base en lo descrito en el Plan Único de
Estudios respecto a este tema en los puntos A. 1,
12
2, 4, 6, 7, 8 y 9 y B. 1 y 2, el profesor utilizará, en
la medida de lo posible, algunos procedimientos y
técnicas que impliquen una metodología centrada
en la solución de problemas, la vinculación teóricopráctica de los conocimientos (el desarrollo y
discusión de prácticas de laboratorio de interés
médico), la aplicación de técnicas de enseñanza
que favorezcan la participación activa de los
estudiantes (como seminarios, discusión de casos,
las semanas de integración básica-clínica), así
como la búsqueda y análisis crítico de la
información, sea de libros como de fuentes
automatizadas, para lograr los objetivos de
aprendizaje.
VI. ESTRUCTURA DEL CURSO
1. ACTIVIDADES PROPUESTAS:
Inicio del curso 25 de agosto de 2008 y termino el
20 de mayo de 2009.
El curso se divide en TRES UNIDADES
TEMÁTICAS:
a) Estructura molecular (correspondiente al 25%
de la calificación).
b) Metabolismo (correspondiente al 50% de la
calificación).
c) Biología molecular (correspondiente al 25% de
la calificación).
El contenido educativo del curso consiste en:
a) Teoría.
b) Trabajo de laboratorio y programas de
aprendizaje de la bioquímica asistida por
computadora.
c) Revisión de casos de correlación bioquímicapráctica médica.
d) Solución de problemas.
e) Semanas de Integración básica-clínica
2.
UNIDADES TEMÁTICAS Y CONTENIDO
TEMÁTICO:
UNIDAD TEMÁTICA I: Estructura molecular
I. Lógica molecular de la vida
A. Características de la materia viva
B. Niveles de la organización celular
B.1 Bioelementos
B.2 Moléculas
precursoras
y
macromoléculas
B.3 Estructuras, orgánulos, células, tejidos y
organismos
II. Aspectos
fisicoquímicos
del
funcionamiento celular
A. Aspectos básicos de fisicoquímica aplicados
a la bioquímica
B. Agua
C. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base
D. Aminoácidos y proteínas
D.1. Aminoácidos
D.2. Proteínas
E. Enzimas y coenzimas
E.1. Características
de
un
sistema
enzimático
E.2. Cinética enzimática
E.3. Aspectos médicos de la enzimología
UNIDAD TEMÁTICA II: Metabolismo
III. Metabolismo y bioenergética
A. Fundamentos del metabolismo celular
B. Carbohidratos
B.1. Estructura
B.2. Digestión y absorción
C. Metabolismo energético
C.1. Glucólisis
C.2. Papel de la mitocondria en las funciones
oxidativas
C.3. Descarboxilación del piruvato
C.4. Ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo
de Krebs)
C.5. Cadena de transporte de electrones
(cadena respiratoria)
C.6. Fosforilación oxidativa
C.7. Radicales libres
D. Otras vías metabólicas de los carbohidratos
D.1. Gluconeogénesis
D.2. Glucogenólisis y glucogénesis
D.3. Vía del fosfogluconato (ciclo de las
pentosas)
D.4. Regulación de la glucemia
E. Lípidos
E.1. Estructura
E.2. Digestión, absorción y transporte
F. Metabolismo de lípidos
F.1. Oxidación de los ácidos grasos (ßoxidación)
F.2. Síntesis y utilización de los cuerpos
cetónicos
F.3. Síntesis de ácidos grasos
F.4.Síntesis y degradación de triacilgliceroles
F.5. Síntesis y degradación de fosfolípidos
F.6. Metabolismo del colesterol
F.7. Estructura y metabolismo de las
lipoproteínas
F.8. Regulación
y
alteraciones
del
metabolismo de lípidos
13
G. Metabolismo
de
los
compuestos
nitrogenados
G.1. Aminoácidos y proteínas
G.2. Nucleótidos
H. Regulación e integración metabólica
UNIDAD
Molecular
TEMÁTICA
III:
Biología
B. Flujo de la información genética
B.1. Flujo de la información genética
B.2. Síntesis del DNA (duplicación)
B.3. Transcripción
B.4. Traducción
C. Mutaciones y reparación del DNA
D. Niveles de regulación de la expresión
genética
E. Virus, oncogenes y transformación
F. Técnicas de manipulación del DNA
IV Biología Molecular
A. Organización del genoma
14
3. CALENDARIO DE ACTIVIDADES:
CALENDARIO SUGERIDO PARA CUBRIR LAS ACTIVIDADES DE LA PRIMERA UNIDAD TEMÁTICA
(BLOQUE 1)
Semana
Fecha
1
10 al 15 de agosto
2
17 al 22 de agosto
B. Agua
Práctica: Soluciones
3
24 al 29 de agosto
B. Agua
Amortiguadores
C. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base
Práctica: Soluciones
Revisión del caso clínico: CÓLERA
4
31 de agosto al 5 de
septiembre
C. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base
Revisión del caso clínico: OCLUSIÓN INTESTINAL
5
7 al 12 de septiembre
D. Aminoácidos y Proteínas
Práctica: Equilibrio ácido-base
6
14 al 19 de septiembre**
D. Aminoácidos y Proteínas
Práctica: Equilibrio ácido-base
7
21 al 26 de septiembre
E. Enzimas y coenzimas
Práctica: Cinética Enzimática
8
28 de septiembre al 3 de
octubre
E. Enzimas y coenzimas
Práctica: Cinética enzimática
9
5 al 10 de octubre
Tema
Lógica molecular de la vida: Características de la materia viva y
jerarquía de la organización celular.
A. Aspectos básicos de Fisicoquímica aplicados a la
Bioquímica.
a
2 . Unidad
A. Fundamentos del metabolismo
B. Estructura y Digestión de carbohidratos
10
12 al 17 de octubre
B. Estructura y digestión de carbohidratos
16 DE OCTUBRE
PRIMER EXAMEN DEPARTAMENTAL: 9:00-11:00 HRS
* Día de asueto
/ Exámenes departamentales
15
CALENDARIO SUGERIDO PARA CUBRIR LAS ACTIVIDADES DE LA SEGUNDA UNIDAD TEMÁTICA
(BLOQUE 2)
Semana
Fecha
Tema
1
19 al 24 de octubre/
2
26 al 31 de octubre///
C. Glucólisis
Descarboxilación del piruvato
C. Ciclo de los ácidos tricarboxilicos
Práctica: Efecto de la insulina sobre la Glucemia
de la rata
3
3 al 7 de noviembre/
C. Ciclo de los ácidos tricarboxilicos
Práctica: Efecto de la insulina sobre la Glucemia
de la rata
4
9 al 14 de noviembre
C. Cadena de transporte de electrones
C. Fosforilación oxidativa
Práctica: Bombeo de Protones
5
16 al 21 de noviembre*
6
23 al 28 de noviembre
7
30 de noviembre al
5 de diciembre
8
7 al 11 de diciembre//
D. Regulación de la glucemia
9
12 de diciembre 09
al 2 de enero 10
4 al 9 de enero 2010
Vacaciones de Navidad
10
7 de enero 2010
C. Radicales libres
D. Gluconeogénesis
Práctica: El efecto del etanol sobre la Lipoperoxidación
1ª. Semana de Integración Básica-Clínica
MIELOMENINGOCELE E INSUFICIENCIA RENAL
D. Vía del fosfogluconato
D.Glucogénesis y glucogenólisis
Discusión Semana de Integración
D.
Regulación de la glucemia
Revisión del caso clínico: HIPOGLUCEMIA E
INTOXICACIÓN ALCOHÓLICA
Práctica: El efecto del etanol sobre la Lipoperoxidación
Práctica: Estudio General del metabolismo de
Carbohidratos
SEGUNDO EXAMEN DEPARTAMENTAL: 09:00 -11:00
* Día de asueto
/ Exámenes departamentales
16
CALENDARIO SUGERIDO PARA CUBRIR LAS ACTIVIDADES DE LA SEGUNDA UNIDAD TEMÁTICA
(BLOQUE 3)
Semana
Fecha
7 al 9 de enero 2010
Tema
11 al 16 de enero
F. Oxidación de los ácidos grasos
F. Síntesis y utilización de cuerpos cetónicos
18 al 23 de enero
F. Síntesis de ácidos grasos
F. Síntesis y degradación de triacilgliceroles
25 al 30 de enero
Revisión del caso clínico CETOSIS POR INANICIÓN Y OBESIDAD
F. Metabolismo del colesterol
Metabolismo de lipoproteínas
F. Regulación y alteraciones del metabolismo de lípidos
Revisión del caso clínico: HIPERCOLESTEROLEMIA Y
ATEROSCLEROSIS
1
2
3
4
1 al 6 de febrero/
5
6
8 al 13 de febrero
15 al 20 de febrero
7
22 al 27 de febrero
8
9
1 al 6 de marzo
10
8 al 13 de marzo//
11
17 de marzo
•
•
E. Estructura y Digestión de lípidos
G. Metabolismo de los compuestos nitrogenados
1. Aminoácidos y proteínas
2. Ciclo de la urea
G. Nucleótidos
1. Purinas
Práctica: El efecto del tetracloruro de carbono sobre las
Transaminasas
G. Nucleótidos
2. Pirimidinas
Revisión del caso clínico: GOTA
Práctica: El efecto del tetracloruro de carbono sobre las
Transaminasas
H. Regulación e integración metabólica
Práctica: Integración metabólica
H. Regulación e integración metabólica
Práctica: Integración metabólica
TERCER EXAMEN DEPARTAMENTAL: 9:00-11:00 HRS.
Día de asueto
/ Exámenes departamentales
17
CALENDARIO SUGERIDO PARA CUBRIR LAS ACTIVIDADES DE LA TERCERA UNIDAD TEMÁTICA
(BLOQUE 4)
Semana
Fecha
Tema
1
18 al 20 de marzo
A. Flujo de la información genética
B. Estructura de los ácidos nucleicos y sus funciones
22 al 27 de marzo
C. y G Organización del DNA y organización del genoma
D. Mecanismos de síntesis del DNA
Semana Santa
2
3
4
29 de marzo al 3 abril
5 al 10 de abril
12 al 17 de abril
5
2ª. Semana de integración básica-clínica
E. Mecanismos de transcripción
Modificación postranscripcional
F. Mecanismos de traducción
F. Mecanismos de traducción
F. Modificación postraduccional
6
19 al 24 de abril
H. Mutaciones y reparación del DNA
I. Niveles de regulación de la expresión genética
Práctica: Huella Génica
7
26 al 30 de abril
Niveles de regulación de la expresión genética
Práctica: Huella Génica
8
3 al 7 de mayo//*
7 de mayo
J. Virus, oncogenes y transformación
K. Técnicas de manipulación del DNA
CUARTO EXAMEN DEPARTAMENTAL: 9:00-11:00 hrs.
* Día de asueto
/ Exámenes departamentales
Los contenidos específicos correspondientes a este programa, tanto teóricos, como las prácticas de
laboratorio y los casos clínicos a que hace referencia esta calendarización de actividades se encuentran en el
manual de objetivos y prácticas de laboratorio de la Asignatura de Bioquímica y Biología Molecular.
18
VII. LINEAMIENTOS DE EVALUACIÓN
Pendiente
VIII OBLIGACIONES DE LOS PROFESORES Y
ALUMNOS
3. deberán adquirir y utilizar el Manual de objetivos
y de laboratorio en el aula, tanto de teoría como de
laboratorio.
4. No podrán realizar la práctica del laboratorio si
no traen el manual correspondiente y una bata
blanca.
5. Se abstendrán de introducir alimentos a las
aulas y/o laboratorios de enseñanza.
Profesores
IX BIBLIOGRAFÍA
Con base en el artículo 56 y 61 del Estatuto de
Personal Académico de la UNAM, el profesor de
Bioquímica y Biología Molecular:
1. Impartirá sus clases teóricas y/o prácticas con
puntualidad, según el horario que le haya asignado
el Departamento, en el calendario escolar
correspondiente.
2.
Impartirá su enseñanza y calificará los
conocimientos de sus estudiantes sin hacer
ninguna distinción entre ellos. Para realizar dicha
evaluación considerará diversos aspectos como
asistencia, desempeño en teoría y laboratorio,
como aparece en los lineamientos de evaluación
de la sección previa de este programa académico.
3. Cumplirá con el programa de la asignatura de
Bioquímica y Biología Molecular aprobado por el
Consejo Técnico de la Facultad y se los dará a
conocer a sus estudiantes el primer día de clases,
así como la bibliografía correspondiente al curso.
4. Aplicará los exámenes departamentales en las
fechas y lugares indicados por la Coordinación de
Enseñanza de la asignatura. Hará la retroalimentación de sus estudiantes después de los
exámenes departamentales y/o finales.
5. Se abstendrá de impartir clases particulares
remuneradas o no a sus propios alumnos.
Alumnos
Los alumnos de la asignatura de Bioquímica y
Biología Molecular:
1. deberán cumplir con el 80% de asistencias al
curso teórico y al laboratorio y aprobar este último
para tener derecho a la calificación final.
2. deberán presentar los exámenes, tareas y
trabajos que el profesor considere indispensables
para tener derecho a calificación final (Juicio del
Profesor).
BÁSICAS
1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2004.
2. Laguna J, Piña E. Bioquímica de Laguna.
5a.ed. México: Editorial El Manual Moderno;
2002.
3. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 2005.
4. McKee T, McKee RJ. Bioquímica. 3a. ed.
España: McGraw-Hill Interamericana Editores;
2003.
5. Murray KR, Granner DK, Mayes PA, Rodwell
VW. Bioquímica de Harper. 16a. ed. México:
IPN/Editorial El Manual Moderno; 2004.
6. Stryer L. Bioquímica. 5a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2003.
COMPLEMENTARIAS
1. Alberts B, Bray D, Lewis J. Biología molecular
de la célula. 3a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 1992.
2. Bloomfield MM.Química de los organismos
vivos. México: Editorial Limusa; 1997.
3. Holum JR. Fundamentos de química general,
orgánica y bioquímica para ciencias de la
salud. México: Editorial Limusa Wiley; 2001.
19
CONTENIDO TEMÁTICO
Primera Unidad Temática
ESTRUCTURA MOLECULAR
20
I
LÓGICA MOLECULAR DE LA VIDA
Al finalizar esta unidad, el alumno conocerá la naturaleza química de los seres vivos y
su organización. La unidad se divide en:
A. Características generales de la materia viva.
B. Niveles de la organización celular.
A. Características generales de la
materia viva
Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá las
características de la materia viva.
A.1
A.2
Discutirá la organización de los seres vivos
(procariotos,
eucariotos,
autótrofos
y
heterótrofos) con base en la complejidad de
las estructuras que los constituyen y la
función específica que tienen.
Discutirá con base en la figura I.1 la
capacidad de los seres vivos para obtener,
transformar y utilizar la energía, así como su
capacidad
de
autorregulación
y
de
autoduplicación.
Los sistemas vivientes son organizaciones en
extremo complejas que operan bajo principios
fisicoquímicos. Esta organización de la vida hace
posible
un
elevado
número
de
procesos
fundamentales que se llevan a cabo en forma
organizada y regulada en todos los sistemas
vivientes. Se ha propuesto que la vida está limitada
por los principios de la física y la química, pero lo
cierto es que logra trascender hasta los más
elevados principios biológicos.
Todos los seres vivos son sistemas organizados y
funcionando en forma coordinada, constituidos
fundamentalmente por moléculas de carbohidratos,
lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Estos sistemas
Fig. I.1. Ciclo del CO2 y del O2 en los seres vivos.
Modificada de: Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega; 2005.
intercambian materia y energía con su entorno, del
cual están separados por una membrana. Las
funciones básicas de transformación y utilización de
la energía realizadas por estos sistemas, así como su
reproducción se llevan a cabo con un alto grado de
precisión por proteínas catalíticas específicas
llamadas enzimas. Estas enzimas están presentes en
las células y actúan como catalizadores que hacen
posible que se lleven a cabo reacciones sin que la
célula sufra daño alguno.
La materia evoluciona aumentando su
complejidad debido al incremento en la variedad de
unidades que la constituyen y a la especialización
que éstas alcanzan. Cuanto más complejo es un
21
sistema más especializadas son sus partes y, por
ello, más dependen unas de otras.
Las características universales de los
sistemas se encuentran a nivel bioquímico. Todas las
células obtienen energía, ya sea de la luz del sol o de
las moléculas de alimento ricas en energía y la
almacenan en una molécula con un alto contenido
energético: el ATP. Las células han desarrollado
fundamentalmente tres vías para generar ATP:
fermentación, respiración y fotosíntesis.
Todas las células tienen la capacidad de
autoduplicarse: las moléculas en las que se
almacena esta propiedad son el DNA y el RNA. La
universalidad de estas moléculas en todos los
organismos vivos revela que todas las formas de vida
sobre la Tierra tienen un origen común.
La importancia del DNA en la reproducción y
el crecimiento de las células residen en la
información contenida en los genes. Las moléculas
de DNA son polímeros de unidades, llamadas
nucleótidos, constituidos por un azúcar, un fosfato y
una base nitrogenada de cuatro tipos diferentes. La
secuencia precisa de bases en el DNA constituye la
información genética. La función clave de esta
información es la de especificar la composición de las
proteínas. Más que ninguna otra molécula, las
proteínas hacen que un organismo sea lo que es.
El copiado exacto del DNA, aunque esencial
para el desarrollo individual, no es suficiente para
permitir los cambios evolutivos; tiene que existir una
fuente de variación que proviene, fundamentalmente,
de la aparición de mutaciones o de la recombinación
del material genético. Las mutaciones surgen por un
error en el proceso de copiado.
Los organismos más complejos a nuestro
alrededor son multicelulares. La célula es la unidad
estructural y funcional de los seres vivos, así como el
átomo es la unidad fundamental de las estructuras
químicas.
Resumiendo, la diversidad de los organismos
depende de un programa genético codificado por los
ácidos nucleicos, ejecutado por medio de complejos
reguladores
que
controlan
las
actividades
bioquímicas de las células, lo que da como resultado
diferentes niveles estructurales en la organización
molecular y celular de dicho organismo.
Hay dos principales clases de células: las
procarióticas y las eucarióticas. Las células
procarióticas tienen un solo cromosoma que ocupa
un espacio dentro de la célula denominado nucleoide
y se halla en contacto directo con el citoplasma. Las
células eucarióticas poseen varios cromosomas
contenidos en un núcleo verdadero con una
envoltura nuclear. Adicionalmente presentan una
serie de orgánulos que realizan funciones
especializadas como por ejemplo, las mitocondrias
que son potentes generadoras de ATP.
Se ha propuesto en la teoría de la
endosimbiosis que, desde el punto de vista evolutivo,
las células procarióticas son antecesoras de las
eucarióticas.
Con base en el mecanismo que utilizan para
obtener la energía necesaria para realizar sus
funciones vitales podemos agrupar a todas las
células y organismos en otras dos clases principales:
los autótrofos, que utilizan el proceso de fotosíntesis
para transformar moléculas inorgánicas en glucosa, a
partir de la cual se construyen moléculas más
complejas, y los heterótrofos, que obtienen la energía
de moléculas complejas que han sido sintetizadas
por organismos autótrofos. La energía que contienen
estas
moléculas
complejas
es
liberada
principalmente por su oxidación hasta CO2 y agua en
un proceso llamado respiración.
He
H
Li
Be
Na Mg
K Ca
Sc Ti
Rb Sr
Y
Cs Ba
B C N O F
Ne
Al Si P S Cl
Ar
V Cr Mn Fe Co Ni Cu Zn Ga
Zr Nb
Mo Tc
Hf
W
Ta
Ru Rh Pd Ag Cd
Re Os
Ir
Pt
In
Au Hg Tl
Ge
As Se Br
Kr
Sn
Sb Te
I
Xe
Pb Bi
Po At Rn
Fr Ra
Figura I.2. Elementos que forman parte de la materia viva. Los
más abundantes o macroelementos (negritas), los presentes en
pequeñas cantidades en todos los organismos o microelementos
(cursivas), y los que son necesarios en algunos organismos en
cantidades mínimas o elementos traza (subrayados).
22
Se llama metabolismo al total de reacciones que
ocurren en la célula. Hay reacciones catabólicas por
las cuales las sustancias complejas se degradan
a sustancias más simples y reacciones anabólicas
que realizan el proceso inverso.
En resumen, las células tienen las siguientes
características:
1) Un programa genético específico que permite la
reproducción de nuevas células del mismo tipo. 2)
Una membrana celular que establece un límite que
regula todos los intercambios de materia y energía.
3) Una maquinaria biológica que puede utilizar la
energía adquirida por la célula a partir de la energía
luminosa o de los alimentos.
4) Una maquinaria para la síntesis de proteínas y
todas las demás moléculas que integran a las células
de un organismo.
B.1.3
B.2
que hacen que estos elementos
sean
apropiados
como
constituyentes de la materia viva.
Describirá los tipos de enlace (tabla
I.1, pág. 4) y funciones químicas que
aparecen en las moléculas biológicas
(alcohol, carboxilo, carbonilo, éster,
amida, amino, éter y tiol).
Moléculas precursoras y macromoléculas.
B.2.1
Conocerá
los
aminoácidos,
nucleótidos, monosacáridos y ácidos
grasos
como
precursores
de
proteínas,
ácidos
nucleicos,
polisacáridos y lípidos, así como las
diversas funciones que llevan a cabo
en el organismo.
B. Niveles de la organización celular
B.3
Al finalizar esta subunidad, el alumno analizará y
discutirá los diferentes niveles de la organización
celular.
B.1
Bioelementos.
B.1.1 Identificará en una tabla periódica
(figura I.2) los elementos que forman
parte de la materia viva.
B.1.2 Conocerá
las
características
fisicoquímicas
(configuración
electrónica, electronegatividad e
hibridación) del carbono, nitrógeno,
oxígeno, hidrógeno, azufre y fósforo,
Estructuras, orgánulos, células, tejidos y
organismos.
B.3.1 Describirá la manera cómo se
ensamblan las macromoléculas para
obtener un nivel mayor de
organización.
B.3.2 Describirá la estructura de las
membranas biológicas.
B.3.3 Definirá a la célula como la unidad
mínima de organización de la
materia viva.
23
Tabla I.1
CARACTERÍSTICAS DE LOS ENLACES QUÍMICOS
Tipo de enlace
IÓNICO
COVALENTE
•Simple
•Coordinado
•Polar
•Múltiple
Enlaces
intermoleculares
PUENTE DE
HIDRÓGENO
FUERZAS DE
VAN DER WAALS
INTERACCIONES
HIDROFÓBICAS
INTERACCIÓN
IÓN DIPOLO
Descripción general
Es la fuerza de atracción entre iones con signos
contrarios que se forman por la transferencia completa
de electrones desde el átomo con mayor tendencia a
perderlos, al que tiene mayor afinidad por ellos.
Resulta de compartir electrones entre dos o más
átomos que tienen una afinidad electrónica semejante
Se forma mediante la donación de un electrón por parte
de cada átomo que participa en el enlace.
Ambos elctrones los da uno solo de los átomos que
participan en la formación del enlace.
Se establece cuando los electrones del enlace
covalente se encuentran más cerca del elemento de
mayor electronegatividad. En el enlace se forma un
polo relativamente positivo y otro relativamente
negativo.
En algunos compuestos de los átomos comparten más
de un par electrónico (enlaces dobles o triples).
Fuerzas de atracción débiles entre diferentes
moléculas y iones
Interacción dipolo-dipolo. Se establece cuando un
átomo de hidrógeno sirve como puente entre dos
átomos electronegativos, unido a uno con un enlace
covalente, y al otro, con fuerzas de naturaleza
electrostática.
Son fuerzas electrostáticas transitorias. La atracción se
establece entre los extremos de dipolos momentáneos
con cargas opuestas.
Enlaces polares. Las moléculas se reunen
conjuntamente asociándose entre sí en el seno del
agua debido a que las interacciones agua-agua son
muy fuertes y rodean a las moléculas apolares
Es la atracción de un ión positivo por el extremo
negativo de las moléculas de un disolvente polar
(solvatación). Cuando el disolvente es el agua, se dice
que las partículas de soluto se hidratan.
Energía de enlace
10-20 kcal/mol
42-84kJ/mol
Para la unión:
C–C
83 kcal/mol
348 kJ/mol
___
O–H
111kcal/mol
464kJ/mol
C–C
146kcal
611kJ/mol
___
2.5kcal/mol
8-21kJ/mol
1kcal/mol
4kJ/mol
1-2kcal/mol
4-8kJ/mol
0.01 kcal/mol
0.04kJ/mol
24
II
ASPECTOS FISICOQUÍMICOS
DEL FUNCIONAMIENTO CELULAR
Al finalizar esta unidad, el alumno deberá conocer y aplicar los conceptos
fundamentales de fisicoquímica a la comprensión de la estructura y comportamiento de
las moléculas biológicas en la célula y en su interacción con el ambiente; además,
conocerá algunos aspectos médicos de ellos. La unidad se divide en:
A.
A.
Aspectos básicos de fisicoquímica aplicados a la bioquímica.
B.
Agua.
C.
Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base.
D.
Aminoácidos y proteínas.
E.
Enzimas y coenzimas.
Aspectos básicos de fisicoquímica
aplicados a la bioquímica
Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá los
conceptos básicos de fisicoquímica necesarios para
la comprensión de la bioquímica.
A.4
A.5
A.6
A.1
Definirá el concepto de sistema y conocerá
sus diferentes tipos con base en su
capacidad de intercambiar materia y energía
con su ambiente (sistemas abiertos y
cerrados).
A.2
Conocerá las leyes de la termodinámica y
definirá el concepto de entropía, entalpía así
como energía interna.
A.3
Definirá el concepto de energía libre de
Gibbs y de energía libre estándar de una
reacción y su empleo como criterio de
espontaneidad de un proceso.
Identificará los procesos exergónicos y
endergónicos y los relacionará con procesos
reversibles e irreversibles.
Analizará la estrategia de las reacciones
acopladas. Se sugiere usar como ejemplo
una reacción catalizada por una cinasa.
Definirá los conceptos de energía de
activación y de estado energizado de una
reacción.
En termodinámica un sistema se define como la parte
del Universo en estudio. Por lo tanto, un sistema
puede ser un tubo de ensayo, una máquina, una
planta o el hombre.
El resto del Universo se conoce como
ambiente. El organismo humano es un sistema
abierto porque es capaz de intercambiar materia y
energía con el ambiente que lo rodea; toma los
nutrimientos, oxígeno y agua del ambiente; elimina
productos de desecho, y genera trabajo y calor.
25
La primera ley de la termodinámica, o ley de
la conservación de la energía, dice que la energía no
se crea ni se destruye, sólo se transforma.
∆U = U final – U inicial = q – w (1)
Esta expresión matemática muestra que el
cambio de energía, pérdida o ganancia que sufre un
sistema (∆U) corresponde a la diferencia entre el
contenido de energía al principio (U inicial) y al término
(U final) del estudio.
La segunda relación matemática: (∆U = q –
w) significa que parte de ese cambio de energía se
utiliza para hacer trabajo (w) sobre el ambiente y el
resto se libera en forma de calor (q). Los procesos en
los cuales el sistema libera calor se llaman
exotérmicos (q con signo negativo por convención), y
a los que absorben calor se les llama endotérmicos
(q con signo positivo).
La medida de este intercambio de calor,
liberado o absorbido con el ambiente, se llama
entalpía (∆H):
H = qp (2)
donde qp se lleva a cabo a presión constante.
La segunda ley de la termodinámica dice que
el Universo tiende hacia el máximo desorden. Esta
ley provee un criterio para determinar si un proceso
es espontáneo. Un proceso espontáneo ocurre en
una dirección que aumentaría el desorden del
sistema y del ambiente. La medida del desorden del
sistema se llama entropía (S) y el cambio puede ser
en el sentido de aumentar el desorden (∆S con signo
positivo) o de disminuir el desorden (∆S con signo
negativo).
La tercera ley de la termodinámica o ley cero
dice que a una temperatura de 0°K (-273 °C) la
entropía de un sistema es igual a cero.
J. Willard Gibbs (1878) formuló el concepto
de energía libre (G) que engloba los dos indicadores
de espontaneidad de un proceso a temperatura y
presión constantes:
G = H – TS
y los cambios quedarían indicados como:
∆G = ∆H – T∆S (4)
De esta manera, un cambio en la energía
libre sería la suma algebraica del cambio de la
entalpía y el cambio de la entropía multiplicada por la
temperatura (°K).
Un proceso con ∆G negativo (espontáneo y
exergónico) puede darse por una disminución en la
entalpía (liberación de calor) o por un aumento en la
entropía (aumento de desorden). Por el contrario, un
proceso endergónico, no espontáneo, tiene un ∆G
positivo, caracterizado por un aumento en la entalpía
(absorción de calor) o por una disminución en la
entropía. El ∆G representa la energía que se emplea
para ejercer un trabajo.
En muchos sistemas, entre ellos los
biológicos, un valor negativo grande predice que la
reacción se puede llevar a cabo de manera
espontánea, pero no dice nada acerca de la
velocidad del proceso, ni del camino que éste sigue.
Por ejemplo, en algunas reacciones químicas, el ∆G
puede ser negativo, y esto predice que la reacción
será espontánea, pero como el camino ocurre a
través de un estado energizado (de mayor contenido
de energía) de los reactivos, el proceso no se lleva a
cabo a menos que se introduzca energía al sistema
para que se alcance ese estado energizado (energía
de activación); entonces, el proceso se realizaría de
manera espontánea. La introducción de enzimas
para realizar una reacción, tiene el efecto de
disminuir la energía de activación de dicha reacción
(debido a la formación del complejo enzima-sustrato).
Una estrategia que se sigue en los sistemas
biológicos para lograr que las reacciones no
espontáneas, con ∆G positivo, se lleven a cabo,
consiste en acoplarlas a otras reacciones
relacionadas que tengan un ∆G muy negativo. De
esta manera, en las vías metabólicas las reacciones
exergónicas “empujan” o “jalan” a las reacciones
endergónicas y desplazan el equilibrio químico. Por
ejemplo, la fosforilación de la glucosa por ATP
catalizada por la hexocinasa:
(3)
26
B.3.1
B.1
Definirá lo que es una reacción
química
y
sus
componentes.
Describirá la ley de acción de masas
y definirá la constante de equilibrio y
su significado.
Conocerá la reacción de ionización
del agua, su constante de equilibrio y
el producto iónico del agua.
Conocerá el concepto de pH y
establecerá su escala de medición.
Aplicará dicho concepto para calcular
los valores de pH a partir de la
concentración de iones hidronio y de
la concentración de H+ a partir de los
valores de pH.
B.3
Uno de los compuestos más abundantes en nuestro
planeta es el agua. Se cree que fue en los océanos
primitivos donde se originaron los primeros indicios
de vida. El agua constituye el medio en el cual se
realizan la mayoría de los procesos celulares (de
hecho podría decirse que la conformación que toman
las moléculas dentro de las células depende del
agua). Es por ello que el agua es una molécula muy
importante para sostener la estructura de las células
y los organismos.
Las características peculiares del agua
derivan de su estructura química particular, en la cual
los dos hidrógenos y el oxígeno se encuentran
formando un tetraedro irregular en el que el oxígeno
ocupa el centro y los hidrógenos, junto con los dos
orbitales del oxígeno no compartidos, están dirigidos
hacia los vértices. La diferencia de electronegatividad
entre el oxígeno y los hidrógenos hace que los
enlaces entre ellos sean covalentes polares, dando
cargas parciales positivas y negativas a la molécula
que la constituyen como un dipolo. Esta
característica permite que exista una fuerza de
atracción entre los extremos cargados opuestamente
de las moléculas vecinas.
La atracción entre las moléculas de agua
permite que se establezcan enlaces débiles llamados
puentes de hidrógeno que configuran redes
transitorias cuya existencia continuada confiere al
agua sus propiedades fisico-químicas características:
ser líquida a temperatura ambiente, alto punto de
Ecuación:

∆G (kcal/mol)
Glucosa + Pi = Glucosa 6 fosfato + H2O
+3.3
+
ATP + H2O = ADP + Pi + H
–7.3
B.3.2
+
Glucosa + ATP = Glucosa 6 fosfato + ADP + H –4.0
B.
Agua
Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá las
propiedades fisicoquímicas del agua y los conceptos
de reacción química, pH, ácido, base y amortiguador.
Conocerá
las
siguientes
propiedades
fisicoquímicas del agua: su composición, sus
enlaces químicos, densidad electrónica,
características de dipolo, puentes de
hidrógeno, estructura en sus estados físicos,
calor latente de vaporización, calor
específico, tensión superficial, conductividad
térmica, constante dieléctrica y su papel
como solvente.
B.2
Soluciones acuosas.
B.2.1 Definirá qué es una solución y los
diferentes tipos de soluciones que
existen.
B.2.2 Explicará los cálculos y los
procedimientos
para
preparar
soluciones porcentuales molares,
osmolares y normales, así como las
diferentes diluciones de estas.
Conocerá la composición de las
siguientes soluciones utilizadas en
medicina: solución isótonica, de
Ringer, de Darrow, de Hartman.
B.2.3 Revisará las propiedades coligativas
de las soluciones y su importancia en la
medicina.
B.2.4 Definirá
los
conceptos
de
osmolaridad,
osmolalidad,
hiper
e
hipoosmolaridad, así como el de isotonicidad.
Realización de la práctica 1 "Soluciones" (ver pág.
133)
Analizará el concepto de pH.
B.3.3
27
fusión, alto punto de ebullición, elevada tensión
superficial, alta constante dieléctrica, alta capacidad
calorífica y baja tensión de vapor.
Todas esas propiedades permiten que el
agua desempeñe muy variadas funciones en los
seres vivos; por ejemplo, servir como medio universal
de solución, de suspensión y de reacción para todas
las moléculas, o intercambiar cantidades importantes
de calor sin mucha variación de su temperatura, lo
cual le permite mantener constante la temperatura
del organismo y controlarla mediante los fenómenos
de vasoconstricción y de sudoración. El transporte de
sustancias entre los diversos órganos y tejidos del
cuerpo humano se hace por el plasma y los líquidos
extracelulares, ambos de naturaleza acuosa. Las
interacciones del agua con las diversas moléculas
permiten el mantenimiento de las estructuras
celulares. La presencia de partículas en solución va a
modificar las propiedades características del agua y
da origen a lo que se conoce como propiedades
coligativas de las soluciones (propiedades que
dependen del número de partículas en la solución y
no de su naturaleza). Entre éstas, la más notable es
la aparición de la presión osmótica.
Una molécula de agua tiene la capacidad de
ceder un protón a la molécula vecina y esto ocasiona
que la molécula que cedió su protón quede con una
carga neta negativa y la molécula de agua que lo
acepta quede con una carga positiva. Esto indica que
el agua se ioniza, ya que actúa como un ácido al
+
donar protones (H ) y como una base al aceptarlos,
según la teoría de Brönsted y Lowry. Así, el agua
puede encontrarse en dos especies iónicas: el
+
hidronio H3O , que funcionaría como ácido, y el
–
hidroxilo OH , que es la especie que queda al ceder
la molécula de agua su protón, y que funciona como
una base, ya que puede aceptar protones. Para
facilitar la expresión de la ionización del agua se
simplifica así:
+
–
H 2O
H + OH
A las sustancias que tienen esta capacidad
se las llama anfóteras o anfolitos.
La velocidad de las reacciones químicas
depende de la concentración de las moléculas
implicadas en ellas, así como de una constante de
velocidad de la reacción (k), que es una medida
indirecta de la capacidad intrínseca de las moléculas
para reaccionar entre sí. En la reacción:
A+B
C+D
la velocidad (v) es igual a k [A][B].
Como la mayoría de las reacciones son
reversibles, existen dos constantes de velocidad, una
correspondiente a la reacción directa y una
correspondiente a la reacción inversa. Cuando la
velocidad de la reacción directa es igual a la
velocidad de la reacción inversa se establece una
condición de equilibrio en la que hay una relación
particular del producto de las concentraciones de los
productos entre el producto de las concentraciones
de los reactivos. Esta relación es lo que se conoce
como constante de equilibrio (Keq) y es igual a ki/kd
o [C] [D] / [A] [B]. La constante de equilibrio es
característica para cada reacción y permite conocer
si la reacción es más favorable hacia los productos (a
la derecha), en cuyo caso el valor será siempre
mayor a la unidad, o más favorable a la aparición de
los reactantes (a la izquierda) cuando el valor de la
constante será menor a la unidad. Si el valor es igual
a uno no hay una tendencia clara en ninguna de las
direcciones.
En el caso del agua, la Keq tiene un valor de
–16
1.8 X 10 mol/l, que es mucho menor a la unidad, lo
cual indica que la molécula tiende a estar asociada;
la concentración del agua sin disociar es tan elevada
que puede considerarse constante. Cuando el valor
de esta concentración se multiplica por la Keq se
obtiene el valor del producto de la concentración de
+
–
ambos iones H y OH , lo que se conoce como Kw o
+
–
producto iónico del agua, donde Kw = [H ] [OH ] = 1
–14
2 2
X 10 mol /l . Aquí la concentración de ambos iones
–7
es de 1 X 10 . A partir de esta constante (Kw) se
puede deducir el carácter de una solución diluida
respecto a su grado de acidez o basicidad; se ha
+
+
elegido al ion hidronio (H3O ), simplificado como H ,
como valor numérico para expresarla. Como las
concentraciones que se manejan son tan pequeñas,
aun
expresadas
matemáticamente
como
submúltiplos de 10 (potencias negativas de 10), su
manejo puede resultar “complicado” por lo que se
utiliza el -log de base 10 para expresarlo. Esto es lo
28
que se conoce como “p” y referido a la concentración
+
de H se denomina pH. El pH, entonces, corresponde
al -log de la concentración de hidrogeniones, o sea:
+
+
pH = –log [H ] o bien pH = log 1/[H ]
Nótese que la “p” es minúscula, ya que se
trata de una sigla que indica potencial.
Si se considera que el valor de la
–7
concentración de protones es de 1 x 10 , se tiene
que:
–7
–7
pH = log 1/ (1 x 10 ) = log 1 – log 1 x 10 = 0 – (–7)
=7
Es a partir del agua que se define la escala
de pH, por lo cual se habla de soluciones ácidas
cuando tienen valores de concentración de
–7
hidrogeniones mayores de 1 X 10 o pH menores de
7 y de soluciones alcalinas con concentraciones de
–7
hidrogeniones menores de 1 X 10 y pH mayores a
7.
Cuando la concentración de hidrogeniones
en solución acuosa es de 1.0 M, el valor del pH es 0,
ya que el log10 1 es 0. En el otro extremo, cuando la
+
–14
concentración de H es (1 X 10 ) el pH es de 14. El
punto de neutralidad es de pH = 7 o en concentración
+
–7
de H de 1 X 10 . El intervalo de pH para indicar la
acidez de una solución va del 0 al 7, mientras que el
correspondiente a la basicidad o alcalinidad de una
solución va del 7 al 14.
C.
Equilibrio hidroelectrolítico
y ácido-base
Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá los
conceptos de electrólito, ácido, base y amortiguador;
así como la composición de los compartimientos
líquidos del organismo, el balance del agua y de los
electrólitos.
C.1
C.2
Definirá los conceptos de anión, catión,
electrólito, anfolito
y conocerá la
composición
electrolítica
de
los
compartimentos líquidos del organismo
(plasma, líquidos intracelular e intersticial,
jugo gástrico, jugo pancreático y bilis).
Definirá los conceptos de ácido y base, su
fuerza, y analizará los cambios del pH de una
solución al agregar un ácido o una base
explicando el porqué de este fenómeno.
C.3
C.4
Analizará
el
concepto
de
sistema
amortiguador.
C.3.1 Definirá
el
concepto
de
amortiguador, de pK y explicará la
importancia
de
los
sistemas
biológicos de amortiguación.
C.3.2 Aplicará la ecuación de HendersonHasselbalch al cálculo del pH y de la
concentración de sal o de ácido de
diferentes soluciones.
C.3.3 Identificará
los
sistemas
amortiguadores más importantes en
los medios intra y extracelular.
Explicará cómo se regula el pH de los
líquidos orgánicos y la participación de los
sistemas amortiguadores, el intercambio
iónico,
así
como
los
mecanismos
respiratorios y renales.
C.4.1 Revisará las principales alteraciones
del equilibrio ácido-base en el
organismo y los mecanismos para su
control.
Realización de la práctica 2 "Regulación del equilibrio
ácido-base después del ejercicio muscular intenso y
de la ingestión de bicarbonato de sodio" (ver pág.
137).
Discusión de los casos clínicos 1 "Cólera" y 2
"Oclusión
intestinal.
Acidosis
metabólica.
Deshidratación grave" (ver págs. 174-175).
Es importante recordar que un ión es una especie
química (átomo o conjunto de átomos) con carga
eléctrica positiva (catión) o negativa (anión) por
ganancia o pérdida de electrones; los iones disueltos
en agua pueden conducir la electricidad. El paso de
la electricidad a través de una solución con iones se
llama electrólisis. Los solutos que pueden liberar
iones en el agua por disociación o ionización y que
forman una solución conductora de electricidad se
llaman electrólitos.
29
El agua es el mayor constituyente de los
seres vivos; su cantidad debe mantenerse dentro de
un margen estrecho ya que tanto su carencia como
su exceso producen problemas clínicos que se
conocen como desequilibrios hídricos.
El agua corporal la encontramos en
diferentes compartimentos y su cantidad en éstos,
depende de las concentraciones de ciertos
+
+
–
2+
2+
electrólitos como Na , K , Cl , HCO3 , Mg y Ca ,
fosfatos y proteinatos. Las concentraciones de estos
electrólitos se mantienen dentro de ciertos límites
que al alterarse, producen desequilibrios que pueden
llegar hasta la muerte.
En la práctica médica está indicada la
cuantificación de electrólitos en cualquier paciente
con síntomas neuromusculares. El tratamiento de las
alteraciones hidroelectrolíticas se basa en la
evaluación del agua corporal total y su distribución,
así como en las concentraciones de electrólitos y en
la osmolaridad del suero.
Agua corporal
El agua en el cuerpo humano ocupa cerca de 70%
del peso corporal dependiendo de la edad, el sexo y
la grasa corporal. La cantidad de agua puede variar
desde alrededor de un 40% en personas mayores a
más de un 75% en niños recién nacidos. Su
porcentaje también es mayor en personas delgadas
que en obesas, así como un hombre tendrá mayor
cantidad de agua que una mujer. La cantidad de
agua presente en los diferentes tejidos varía de
acuerdo con las funciones y características de cada
uno,
siendo
más
abundante
en
células
metabólicamente muy activas (~ 90%) y de menos
del 10% en el tejido adiposo o aún menor, en
estructuras relativamente inactivas como el
esqueleto.
El agua se encuentra distribuida en el líquido
intracelular (30-40% del peso corporal total) y el
líquido extracelular que, a su vez, está conformado
por el líquido intersticial y la linfa (15%), el plasma
(4.5%) y los fluidos transcelulares que incluyen los
fluidos gastrointestinales, peritoneal, sinovial, líquido
cefalorraquídeo, entre otros.
Electrólitos
La composición electrolítica del líquido intracelular
(LIC) y del líquido extracelular (LEC) difiere en forma
+
sustancial. Para fines prácticos el LIC tiene al K
como el principal catión y como aniones al fosfato y a
+
las proteínas, mientras que en el LEC, el Na es el
catión más importante y el cloruro como anión.
La concentración total de cationes presentes
en el plasma es aproximadamente de 150 mmol/l,
siendo la concentración de sodio de 140 mmol/l. Los
aniones presentes en el plasma más abundantes son
el cloruro, con una concentración aproximada de 100
mmol/l y el bicarbonato, con una concentración de 25
mmol/l. Dado que en cualquier sistema biológico la
suma de los cationes debe ser igual a la suma de los
aniones, el resto de los aniones que constituyen la
diferencia o brecha aniónica del plasma son el
fosfato, el sulfato, las proteínas y los ácidos
orgánicos como son el lactato, el citrato, el piruvato,
el acetoacetato y el 3-β-hidroxibutirato.
En la práctica, esta brecha aniónica se
calcula de acuerdo a la siguiente ecuación:
+
+
-
-
Brecha aniónica = {[Na ] + [K ]} – {[Cl ] + [HCO3 ]}
Calculada de esta forma, la brecha aniónica
es de aproximadamente 12 mmol/l. Puede aumentar
muchas veces en ciertos desórdenes como cuando
los ácidos inorgánicos y los aniones orgánicos se
acumulan, por ejemplo, en la cetoacidosis diabética y
en la insuficiencia renal.
El potasio es el principal catión en el LIC,
cuya concentración es de 110 mmol/l, es
aproximadamente 30 veces más alta que la que se
encuentra en el LEC. La concentración de sodio y
cloruro en el LIC es de 10 mmol/l y 4 mmol/l,
respectivamente.
La movilización y el metabolismo de los
principales cationes extra e intracelulares depende
de la actividad celular así como de transportadores
específicos, entre los cuales se encuentra la bomba
+ +
de Na /K . Los cambios en la concentración de iones
conlleva a cambios en la osmolaridad del medio.
30
Osmolaridad
Las diferentes moléculas disueltas en el agua
corporal contribuyen a la presión osmótica, la cual es
proporcional a la concentración molar de la solución.
Un cambio en la concentración iónica en cualquiera
de los compartimentos celulares crea un gradiente de
presión y como consecuencia, existe un cambio en la
cantidad de agua que fluye del compartimiento que
presenta una menor osmolaridad hacia el de mayor.
Para determinar la concentración osmolar de
una solución que contiene una mezcla de electrólitos
y no electrólitos hay que tener en cuenta las
concentraciones
individuales
de
todos
sus
componentes. Una fórmula sencilla para cuantificar la
osmolaridad del suero y que ofrece una utilidad
clínica es:
+
Osmolaridad =2(Na mmol/l) + glucosa mmol/l + BUN
mmol/l
= 280 a 320 mOsm
D.1
Aminoácidos.
D.1.1 Identificará en la fórmula de un
aminoácido los grupos funcionales
carboxilo y amino.
D.1.2 Relacionará las cadenas laterales de
los
aminoácidos
con
sus
propiedades y los clasificará en
grupos.
D.1.3 Reconocerá a los aminoácidos como
ácidos débiles e identificará los
valores de sus pKs y su punto
isoeléctrico.Usar
como
modelos
glicina, fenilalanina, ácido aspártico,
lisina e histidina.
D.1.4 Identificará la carga eléctrica de los
amino-ácidos en soluciones de
diferentes valores de pH y su
movilidad en un campo eléctrico.
D.1.5 Conocerá las fórmulas de los
aminoácidos presentes en las
proteínas.
D.1.6 Conocerá las funciones generales
de los aminoácidos proteicos y no
proteicos en los seres vivos.
D.2
Proteínas.
D.2.1 Identificará
los
productos
de
hidrólisis de las proteínas.
D.2.2 Clasificará a las proteínas con base
en su composición, función y
localización.
D.2.3 Conocerá las características más
importantes de la unión peptídica.
Describirá qué es un péptido y
mencionará
algunos
de
los
polipéptidos
importantes
en
medicina.
D.2.4 Describirá el estado nativo de las
proteínas y sus diferentes niveles de
organización: estructuras primaria,
secundaria, terciaria y cuaternaria y
mencionará las fuerzas que las
estabilizan. Describirá el proceso
general de la desnaturalización.
D.2.5 Relacionará la función de las
proteínas con su estructura:
Osmolaridad = 2(Na+ meq/l) + glucosa mg/dl + BUN mg/dl
——--——-18
——-----—
2.8
donde el factor 2 se debe a que se consideran los
+
–
aniones asociados al Na (Cl y HCO3–); 1 mOsm de
glucosa equivale a 180 mg/l (18 mg/dl) y 1 mOsm de
nitrógeno ureico (NUS o BUN de sus siglas en inglés)
a 28 mg/l (2.8 mg/dl) que corresponde a la masa
molecular de 2 átomos de nitrógeno en la urea.
+
–
Los electrólitos Na , Cl y HCO3–, contribuyen
con más del 92% a la osmolaridad del suero; los
otros electrólitos, junto con las proteínas séricas,
glucosa y urea son responsables del restante 8%.
El mantenimiento del agua extracelular
+
depende básicamente de la concentración del Na . El
organismo mantiene esta concentración por medio de
la hormona antidiurética. Cambios de hasta 2 meq de
sodio en sangre estimulan los receptores osmolares
y causan retención renal de agua cuando aumenta y
su eliminación cuando la osmolaridad disminuye.
D.
Aminoácidos y proteínas
Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá las
características más importantes de los aminoácidos y
de las proteínas, así como sus funciones generales.
31
D.2.6
D.2.7
Globulares
(albúmina
y
hemoglobina).
Fibrosas (colágena, miosina y
actina).
De reconocimiento (receptores de
insulina o complejo mayor de
histocompatibilidad).
De membrana (porina, ATPasa de
sodio/potasio).
Describirá los diferentes métodos de
purificación de las proteínas con
base
en
sus
propiedades:
ultracentrifugación, precipitación por
sales, electroforesis y cromatografía
por peso molecular, por intercambio
iónico y por afinidad.
Conocerá el propósito de estudiar las
proteínas plasmáticas en medicina.
Las proteínas están formadas por una o varias
cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales está
constituida por 20 diferentes aminoácidos unidos por
enlaces tipo amida (enlaces peptídicos) en una
secuencia específica para cada proteína. La masa
molecular de una proteína varía desde cerca de 6
000 (>50 aminoácidos) hasta 1 000 000 Da o más.
(Da o Dalton es la unidad de masa atómica y es igual
–27
a 1.6605655 X 10 kg).
Las proteínas pueden dividirse, según su
composición, en dos grupos principales: proteínas
simples y proteínas conjugadas. Las proteínas
simples están constituidas sólo por aminoácidos,
mientras que las proteínas conjugadas presentan,
además de los aminoácidos, otro componente, que
puede ser de diferente naturaleza química y en
ciertos casos es llamado grupo prostético. Algunos
ejemplos de proteínas conjugadas son las
glucoproteínas (contienen azúcares como grupo
prostético),
las
lipoproteínas
(contienen
triacilglicéridos, fosfolípidos y colesterol), las
nucleoproteínas (asociadas a ácidos nucleicos) y las
metaloproteínas (que pueden unir iones metálicos
como en el grupo hemo).
Los aminoácidos son compuestos alifáticos,
aromáticos o heterocíclicos que contienen por lo
menos un grupo amino y un grupo carboxilo. En los
aminoácidos biológicamente activos, el grupo amino
se encuentra en el átomo de carbono alfa con
respecto al grupo carboxilo. Este carbono alfa es un
carbono asimétrico (con excepción de la glicina)
porque presenta cuatro grupos
funcionales
diferentes: el grupo amino, el grupo carboxilo, un
hidrógeno y una cadena lateral. Los aminoácidos
proteicos pueden clasificarse en función de las
cadenas laterales que presentan. Así, tenemos
aminoácidos no polares, aminoácidos polares sin
carga y aminoácidos polares con carga, la que puede
ser negativa o positiva a pH neutro. Todos los
aminoácidos (con excepción de la glicina) son
ópticamente activos y pertenecen a la serie L en los
organismos superiores. Los aminoácidos tienen por
lo menos dos grupos ionizables: el grupo alfa amino y
un carboxilo. Cada aminoácido en solución tiene un
pH característico en el que no se mueve en un
campo eléctrico, es decir, tiene un pH en el que se
presenta en forma de ion dipolo o zwitterion, donde
tanto el grupo alfa amino como el grupo carboxilo se
encuentran ionizados y, por lo tanto, tiene el mismo
número de cargas positivas y negativas (punto
isoeléctrico). Junto a los grupos ionizables
principales, algunos aminoácidos contienen otros
grupos que pueden ionizarse: grupos amino,
carboxilo, sulfhidrilo, hidroxilo o imidazol. A pH
fisiológico, estos grupos pueden estar ionizados y
confieren al aminoácido que los contiene cargas
positivas o negativas, según sea la naturaleza del
grupo
ionizado.
Las
proteínas,
como
los
aminoácidos, se encuentran cargadas en solución; la
magnitud de la carga depende del tipo de proteína y
del pH. Cada proteína posee un punto isoeléctrico
característico; a pH por arriba del punto isoeléctrico
presenta carga negativa, mientras que a pH por
abajo del punto isoeléctrico tiene carga positiva.
Organización estructural de las proteínas
La función de las proteínas sólo puede entenderse
en términos de la estructura de la proteína, es decir,
de las relaciones tridimensionales entre los átomos
32
que componen las proteínas. Se han descrito cuatro
niveles de organización:
1. La estructura primaria es la secuencia de
aminoácidos en la cadena polipeptídica unidos
mediante enlaces peptídicos.
2. La estructura secundaria es el arreglo espacial
local de los átomos del esqueleto de un polipéptido
sin considerar la conformación de sus cadenas
laterales. La estructura secundaria es mantenida
por puentes de hidrógeno entre el oxígeno y el
nitrógeno involucrados en los enlaces peptídicos
de aminoácidos. El enlace peptídico tiene una
estructura plana, rígida, que es consecuencia de
interacciones de resonancia (a) que le dan 40% de
carácter de doble enlace entre los átomos de C y
N (b), esta última estructura es la que le permite
establecer puentes de hidrógeno.
a)
b)
O
C
C
O
N
C
H
C
N+
H
Pauling y Corey determinaron que los grupos
peptídicos asumen una configuración trans, es
decir, los carbonos alfa sucesivos están en lados
opuestos del enlace peptídico que los une.
Pueden existir varios tipos de estructura
secundaria; entre ellos destacan dos: la alfa hélice,
en la que los aminoácidos de la cadena
polipeptídica se presentan formando una especie
de cilindro orientado a la derecha y la lámina beta
plegada, en la que los aminoácidos se acomodan
de manera paralela o antiparalela, uno respecto al
otro y se conectan entre sí por puentes de
hidrógeno.
3. La estructura terciaria se refiere al arreglo
tridimensional de un polipéptido y está determinada
por las estructuras primaria y secundaria. Se forma
espontáneamente y depende del tamaño, forma y
polaridad de los aminoácidos que forman la
proteína, los que interactúan entre sí y con el
medio en el que se encuentran. Esta estructura
puede estar estabilizada por enlaces de hidrógeno,
enlaces iónicos, interacciones hidrofóbicas, los
enlaces covalentes disulfuro, etcétera. Por ejemplo,
las cadenas peptídicas de las proteínas globulares
se organizan en una forma muy compacta en la
que los aminoácidos hidrofílicos se encuentran en
la superficie externa mientras que los residuos
hidrofóbicos permanecen enterrados en el interior
de la molécula.
4. La estructura cuaternaria es el arreglo espacial de
las diversas subunidades polipeptídicas que
componen algunas proteínas.
Desnaturalización
Se dice que una proteína se desnaturaliza cuando
pierde sus diversos niveles de organización
estructural. Algunos agentes que desnaturalizan las
proteínas son: el calor, los pH extremos, los rayos X,
la luz UV, o la agitación vigorosa. La
desnaturalización es causada por un colapso de la
estructura original con la ruptura de los enlaces de
hidrógeno, de los enlaces iónicos y de las
interacciones hidrofóbicas, sin cambios en la
estructura primaria. La desnaturalización va
acompañada de la disminución de la solubilidad,
cambios en la rotación óptica, pérdida de la función
biológica y una mayor susceptibilidad al ataque de
las enzimas digestivas. En algunos casos, al eliminar
los agentes que causan la desnaturalización, la
proteína recupera su conformación original; a este
fenómeno se le conoce como renaturalización.
Una mezcla de proteínas puede separarse a
partir de las diferentes movilidades en un campo
eléctrico (electroforesis), por cromatografía de
distintos tipos o por su diferente solubilidad.
Clasificación de las proteínas
Las proteínas pueden ser clasificadas en función de
aspectos tan diversos como su composición, su
disposición espacial, su función biológica y su
localización.
Atendiendo a su composición la proteínas pueden
ser:
• Simples: aquellas compuestas únicamente de
aminoácidos.
• Conjugadas: cuando además de aminoácidos
poseen un componente no proteico, el que puede ser
de origen orgánico o inorgánico y que se denomina
33
grupo
prostético.
Algunos
ejemplos
son:
nucleoproteínas, formadas por la asociación de la
cadena polipeptídica con ácidos nucleicos; las
glucoproteínas,
cuyo
grupo
prostético
son
carbohidratos; las fosfoproteínas, asociadas con
fósforo o como las metaloproteínas, cuando un ión
metálico está enlazado directamente a la proteína,
entre otras.
Con base en su disposición espacial, las proteínas
pueden clasificarse en globulares y fibrosas. Las
proteínas globulares son de forma esférica y solubles
en agua. La mayor parte de las enzimas, hormonas y
anticuerpos tienen estructura globular.
Las proteínas formadas por cadenas polipeptídicas
dispuestas paralelamente a un eje, reciben el nombre
de proteínas fibrosas, como la colágena y la fibrina.
Estas proteínas son de forma alargada, baja
solubilidad en agua y resistentes a la tracción.
Clasificación de las proteínas de acuerdo a su
función. Las proteínas desempeñan una amplia
variedad de funciones muy importantes en el
organismo. La lista siguiente, aunque no es
exhaustiva, da una idea de la diversidad de las
funciones biológicas en las cuales se sabe que
intervienen las proteínas:
•Catalítica: las enzimas catalizan casi todas las
reacciones que se efectúan en los organismos vivos.
•Estructural: las proteínas proporcionan a las
células forma y soporte mecánico (como la colágena
y las proteínas contráctiles).
•Reguladora: algunas proteínas son hormonas o
sirven como receptores de las hormonas (insulina y
glucagón).
•Protectora: por ejemplo las inmunoglobulinas que
defienden al organismo contra las infecciones virales
y bacterianas.
•Transporte: las proteínas se pueden unir a otras
moléculas a fin de transportarlas en el organismo
(albúmina, transferrina).
•Trabajo mecánico: por ejemplo la contracción de
los músculos, el movimiento de los flagelos y la
separación de cromosomas en la mitosis (miosina y
actina).
Entre las funciones que son comunes a todas las
proteínas encontramos:
•Capacidad amortiguadora: debido a que las
proteínas son compuestos anfóteros y poseen
muchos grupos ionizables (con valores diferentes de
pK), funcionan como amortiguadores para reducir al
mínimo cambios súbitos en el pH.
•Energética: liberan 4 kcal/g de proteína oxidada
hasta CO2 y H2O. Los aminoácidos pueden ser
desaminados para formar cetoácidos, los cuales
pueden movilizarse para producir energía calórica o
transformarse en carbohidratos y lípidos.
•Participan en el mantenimiento del equilibrio
osmótico entre los diferentes compartimentos del
organismo. Las proteínas, por ser grandes moléculas
coloidales, no son difusibles, esto es, no pueden
atravesar las membranas y ejercen una presión
osmótica coloidal, la cual sirve para mantener un
volumen normal de sangre y un contenido normal de
agua en el líquido intersticial y los tejidos.
•Fuente de nutrición para los tejidos (sobre todo, la
albúmina): por constituir una fuente de los
aminoácidos indispensables para el organismo, las
proteínas son una forma de almacenamiento de
aminoácidos.
Por último, en función de su localización, las
proteínas pueden clasificarse en:
•Hísticas o tisulares: son las proteínas de los
tejidos.
•Plasmáticas o hemáticas: son las proteínas de la
sangre.
Las proteínas de la sangre (la hemoglobina en los
eritrocitos y las proteínas plasmáticas), por su gran
accesibilidad, son muy utilizadas en el laboratorio
clínico.
E.
Enzimas y coenzimas
Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá qué
es una enzima y cómo actúa; podrá calcular sus
principales parámetros cinéticos y el efecto de
algunas moléculas que modifican su acción y
34
describirá ciertas aplicaciones médicas de las
enzimas.
E.1
Características de un sistema enzimático.
E.1.1 Conocerá qué son las enzimas y su
clasificación de acuerdo con su
función.
E.1.2 Identificará los componentes de un
sistema enzimático y mencionará las
coenzimas
y
cofactores
que
participan.
E.1.3 Analizará el papel de vitaminas
hidrosolubles como precursores de
las coenzimas e identificará al
magnesio, al manganeso y al fierro
como
ejemplos
de
cofactores
metálicos.
E.1.4 Definirá los conceptos de zimógeno
e isoenzima.
E.1.5 Conocerá el modo de acción de las
enzimas y en qué consiste su
especificidad.
E.2
Cinética enzimática.
E.2.1 Analizará una reacción enzimática
para identificar al sustrato, al
complejo enzima-sustrato y al
producto.
E.2.2 Definirá lo que es la velocidad de
una reacción enzimática y conocerá
cómo se calcula su constante de
equilibrio; mencionará el significado
de dicha constante.
E.2.3 Analizará
las
ecuaciones
de
Michaelis Menten y de LineweaverBurk; describirá sus usos e
identificará el significado de los
valores de Vmáx y de Km.
E.2.4 Conocerá las estrategias de control
de la actividad de las enzimas: disponibilidad
de
sustrato,
modificación
covalente,
alosterismo,
retroalimentación
y
concentración de la enzima.
E.2.5 Describirá
la
acción
de
los
inhibidores
competitivos
y
no
competitivos y de los moduladores
alostéricos sobre la actividad de las
enzimas.
E.2.6
E.3
Conocerá el efecto del pH y de la
temperatura sobre la actividad
enzimática.
Aspectos médicos de la enzimología.
E.3.1
Conocerá que el uso de la
determinación de la actividad de
algunas enzimas en el diagnóstico
contribuye al seguimiento de ciertas
enfermedades
(transaminasas,
lactato deshidrogenasa, creatina
cinasa, fosfatasas y amilasa).
E.3.2 Describirá la etiología de algunos
padecimientos
congénitos
del
metabolismo
y
la
actividad
enzimática empleada para su
diagnóstico
(fenilcetonuria,
albinismo,
anemia
hemolítica,
glucogenosis).
E.3.3 Describirá el uso de ciertas enzimas
como reactivos de laboratorio en la
cuantificación de algunos metabolitos
(determinación de glucosa, de
colesterol y de ácido úrico).
Realización de la práctica 3 "Cinética enzimática.
Efecto de la concentración de sustrato sobre la
velocidad de una reacción enzimática" (ver pág.140).
Las enzimas son proteínas especializadas de
actividad catalítica. Algunas de ellas están formadas
únicamente de aminoácidos mientras que otras
presentan algún otro componente de naturaleza no
aminoácida. La parte proteica se denomina
apoenzima, mientras que la parte no proteica se
denomina coenzima; cuando se encuentran aisladas,
ambas son no funcionales, pero juntas forman una
proteína funcional denominada holoenzima.
Las coenzimas funcionan a menudo en la
transferencia de electrones o de grupos funcionales.
Generalmente son derivados de vitaminas, las cuales
no pueden ser sintetizadas en las células de los
organismos superiores, por lo que deben ser
adquiridas en la dieta.
Las enzimas presentan algunas características que
las diferencian de los catalizadores químicos, como:
35
1. Mayor velocidad de reacción, ya que las
reacciones catalizadas enzimáticamente alcanzan
velocidades de reacción de 106 a 1 012 veces
mayores que las reacciones no catalizadas y de
varios órdenes de magnitud mayor que las
catalizadas químicamente.
2 .Condiciones de reacción más suaves, ya que
trabajan a temperaturas relativamente bajas, a
presión atmosférica y en condiciones de pH neutro.
3. Mayor especificidad de reacción, ya que presentan
una gran selectividad por la identidad de los grupos
químicos de sus sustratos y productos, de tal
manera que rara vez se obtienen productos
colaterales o secundarios.
4. Capacidad de regulación, es decir, que sus
actividades varían de acuerdo con la concentración
de otras moléculas diferentes de sus sustratos. Los
mecanismos de regulación incluyen la inhibición,
control alostérico, modificación covalente de la
enzima y variación en la cantidad de enzima
sintetizada.
Las enzimas aceleran las reacciones biológicas al
disminuir la energía de activación de una reacción
dada sin alterar su equilibrio. Su mecanismo de
acción consiste en la formación de un complejo entre
la enzima y el sustrato (ES), el cual realiza la
reacción química adecuada y permite la recuperación
de la enzima original en el momento en que el
complejo enzima-producto se rompe para liberar al
producto.
El sustrato se une a la enzima en el sitio activo, el
cual consiste en un arreglo espacial de algunos
aminoácidos de la proteína donde se encuentran
generalmente el grupo prostético o la coenzima y que
tienen la capacidad de interactuar con el sustrato.
Hay algunas enzimas que se sintetizan directamente
en su forma activa, otras se sintetizan en forma de
proenzimas inactivas o zimógenos y deben ser
activadas por procesos especiales para llegar a ser
funcionales. Algunas otras enzimas presentan sitios
diferentes del sitio activo donde se asocian moléculas
que modulan su actividad. Estas enzimas se conocen
como enzimas alostéricas y el sitio donde interactúan
con el modulador se llama sitio alostérico.
La velocidad de las reacciones enzimáticas
depende de:
a)
La concentración y la actividad de la enzima.
La velocidad de las reacciones enzimáticas se
ve modificada por la cantidad de enzima y por
su capacidad de interactuar con su sustrato.
Una enzima puede atacar, dado que interactúa
con su sustrato, por un reconocimiento
espacial, tridimensional o estereoespecífico. Si
la especificidad es absoluta, la enzima puede
actuar sobre un único compuesto, mientras
que, si es relativa, puede usar como sustrato
varios
compuestos
relacionados.
La
estereoespecificidad indica que una enzima
acepta sólo un cierto estereoisómero (L ó D).
Un sustrato puede ser transformado por una o
varias reacciones teóricamente posibles
catalizadas por diferentes enzimas. Esto es
importante en algunos procesos de control
metabólico.
Las unidades con que se mide la velocidad de
una enzima se determinan como unidades
internacionales (UI). Una UI es la cantidad de
enzima en miligramos que convierte un
micromol de sustrato por minuto, en katales
(kat), que es la cantidad de enzima que
convierte un mol de sustrato por segundo. La
actividad específica de una enzima se expresa
en unidades por mg de proteína.
b) La concentración del sustrato. A bajas
concentraciones de sustrato la reacción
enzimática sigue una cinética de primer orden,
es decir, la velocidad de la reacción es
proporcional a la concentración del sustrato. A
altas concentraciones de sustrato, la reacción
es de orden cero, es decir, la enzima está
saturada por su sustrato y, por lo tanto, se
encuentra en su velocidad máxima. Cada
enzima tiene su característica constante de
Michaelis o Km, que define la concentración de
sustrato a la que la reacción enzimática
alcanza la mitad de la velocidad máxima.
c) El pH y la composición de la solución en que
se lleve a cabo la reacción. Toda reacción
catalizada enzimáticamente tiene su pH
óptimo.
d) La temperatura. Toda reacción catalizada
enzimáticamente tiene una temperatura óptima.
36
e)
La presencia de activadores e inhibidores. La
actividad enzimática puede ser modificada
positiva
o
negativamente
por
algunos
compuestos. Los activadores aumentan la
reacción enzimática propiciando la formación de
un sitio activo funcional y a menudo son iones
2+
2+
metálicos como Mg , Zn , etcétera. La
activación de las enzimas alostéricas que están
compuestas por subunidades es de gran
importancia en el control de los sistemas
multienzimáticos y se realiza generalmente por
varias moléculas orgánicas.
Los inhibidores enzimáticos pueden ser de
varios tipos; los más importantes son los
competitivos y los no competitivos. Los
inhibidores competitivos interactúan con el sitio
activo de la enzima y se parecen al sustrato en
su estructura, por lo que compiten con él para
unirse al sitio activo. En general, se remueven
con un exceso de sustrato.
Los inhibidores no competitivos reaccionan
con
otra
estructura
importante
de
la
molécula.enzimática. La inhibición puede ser
reversible o irreversible en el caso de que el
inhibidor realice un cambio permanente de un
grupo funcional de la enzima. El efecto de un
inhibidor no competitivo no puede revertirse por
un exceso de sustrato.
El comportamiento cinético de las enzimas,
así como el efecto de los diferentes tipos de
moléculas sobre la actividad enzimática, puede
ser estudiado mediante diversas técnicas
cinéticas y gráficas. Así, al graficar la velocidad
de la reacción enzimática contra la concentración
de sustrato se obtiene una hipérbola rectangular
(fig. II.1), descrita matemáticamente por la
ecuación de Michaelis-Menten. Las enzimas
alostéricas
presentan
un
comportamiento
sigmoidal y los moduladores positivos desplazan
la curva hacia la izquierda, mientras que los
moduladores negativos hacen más pronunciado
el efecto sigmoidal (fig. II.2).
Otra manera de estudiar el comportamiento
cinético de las enzimas, es graficar la inversa de
la velocidad inicial contra la inversa de la
concentración de sustrato, lo que genera una
línea recta, descrita matemáticamente por la
ecuación de Lineweaver-Burk. En la figura II.3 se
observa este comportamiento lineal de la enzima
con y sin inhibidores.
37
In vivo, la mayoría de las enzimas se organiza en
sistemas multienzimáticos, los cuales se unen a
estructuras celulares o están libres en diversos
compartimientos celulares y son una forma de hacer
más eficiente la acción de las enzimas involucradas
en una vía, así como su regulación.
Las enzimas pueden clasificarse en seis grandes
grupos según el tipo de reacción que llevan a cabo:
OXIDORREDUCTASAS.
Transfieren
electrones
o
hidrógenos.
TRANSFERASAS. Transfieren
entre dos moléculas.
grupos
funcionales
HIDROLASAS. Realizan reacciones de ruptura de
enlaces con entrada de la molécula de agua.
LIASAS. Realizan reacciones de adición a dobles
enlaces y ruptura no hidrolítica del sustrato.
ISOMERASAS.
Realizan
interconversiones
de
isómeros.
LIGASAS. Realizan reacciones de formación de
enlaces con gasto de ATP.
38
CONTENIDO TEMÁTICO
Segunda Unidad Temática
METABOLISMO
39
III
METABOLISMO Y BIOENERGÉTICA
Al finalizar esta unidad, el alumno conocerá en forma integral las rutas metabólicas de las diversas
moléculas biológicas en las células y las alteraciones que aparecen asociadas a su disfunción en algunas
enfermedades. La unidad se compone de:
A.
B.
C.
D.
E.
F.
G.
H.
A.
Fundamentos del metabolismo celular.
Carbohidratos.
Metabolismo energético.
Otras vías metabólicas de los carbohidratos.
Lípidos.
Metabolismo de los lípidos.
Metabolismo de los compuestos nitrogenados.
Regulación e integración metabólica.
Fundamentos del metabolismo celular
en nutrimientos y las vías metabólicas a las
que entran para satisfacer las demandas de
energía y mantenimiento de los tejidos
(homeostasis) con base en el esquema
general del metabolismo
Al finalizar esta unidad, el alumno conocerá los
principios generales del metabolismo intermediario
de una célula normal.
A.1
Conocerá las
metabolismo.
funciones
generales
del
A.2
Definirá los conceptos de vía metabólica,
complejo multienzimático y encrucijada
metabólica.
A.3
En un esquema general del metabolismo
identificará, con base en sus características,
las vías anabólicas, catabólicas y anfibólicas.
A.4
Describirá el papel central del piruvato, la
+
acetil CoA, el par NAD(P) /NAD(P)H y el
ciclo del
ATP en
el metabolismo
intermediario. Definirá los conceptos de
fosforilación oxidativa y fosforilación a nivel
de sustrato.
A.5
Conocerá la transformación de los diferentes
componentes de la dieta
A.6
Conocerá los diferentes niveles de regulación
del metabolismo: síntesis de enzimas
(inducción-represión), compartimentalización,
actividad enzimática (activación, inhibición y
enzimas alostéricas).
El metabolismo puede definirse como el conjunto de
todas las reacciones químicas que ocurren en el
organismo. Los organismos se caracterizan por
poseer miles de reacciones catalizadas por enzimas,
constituyendo las vías metabólicas. El objetivo del
metabolismo es mantener las funciones vitales del
organismo tales como el trabajo mecánico, el
transporte activo de moléculas contra gradientes de
concentración y la biosíntesis de moléculas
complejas, entre otras.
Las rutas o vías metabólicas son secuencias
de reacciones en donde un precursor o sustrato se
convierte en un producto final a través de una serie
de
intermediarios
metabólicos.
El
término
metabolismo intermediario se aplica a las actividades
40
combinadas de todas las vías metabólicas que
interconvierten sustratos, metabolitos y productos.
Por ejemplo, la secuencia consecutiva de A —> B —
> C —> D —> E tiene el mismo efecto neto que
A —> E.
Toda esta actividad celular muy coordinada y
dirigida tiene como objetivo el que los sistemas
multienzimáticos cooperen para cumplir cuatro
funciones básicas:
1. Obtener energía química a partir de la energía
solar en los organismos fotótrofos o de la energía
contenida en los nutrientes obtenidos del ambiente
en los organismos quimiótrofos.
2. Convertir las moléculas nutrientes en las
moléculas características de la propia célula,
incluidos los precursores macromoleculares.
3. Transformar los precursores monoméricos en
polímeros (proteínas, ácidos nucleicos, lípidos,
polisacáridos y otros componentes celulares).
4. Sintetizar y degradar las biomoléculas requeridas
en las funciones celulares especializadas.
El metabolismo
anabolismo
se
divide
en
catabolismo
y
El catabolismo, del griego katá, "abajo" es la fase
degradativa del metabolismo en la que nutrientes
orgánicos como carbohidratos, lípidos y proteínas se
convierten en productos más pequeños y sencillos
(H2O, CO2, NH3). Las rutas catabólicas generan
transportadores electrónicos reducidos (NADH,
FADH2 y NADPH) y liberan energía, parte de la cual
se conserva en la molécula del ATP.
En el anabolismo, del griego aná, "arriba",
también llamado biosíntesis, los precursores
pequeños y sencillos se transforman en moléculas
más grandes y complejas propias de cada célula
(polisacáridos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos).
Las reacciones anabólicas requieren un aporte
energético, que proviene generalmente de la
hidrólisis del ATP y del poder reductor del NAD(P)H.
En el siguiente cuadro aparece el resumen
de las características de estos dos tipos de procesos.
Catabolismo
Anabolismo
Biodegradativa.
Biosintética.
Oxidativa.
Reductora.
Generador de energía.
Consumidor de energía.
Variedad de materiales
iniciales, pero productos
finales bien definidos
(convergente)
Materiales iniciales bien
definidos y variedad en
los productos
(divergente)
Dentro de la gran complejidad del
metabolismo es posible distinguir algunos puntos de
convergencia:
1. La mayoría de las vías metabólicas son
irreversibles y exergónicas.
2. Cada vía tiene una etapa obligada. Generalmente,
al principio de cada vía existe una reacción
exergónica irreversible que permite que el
intermediario que produce continúe a lo largo de la
vía.
3. Todas las vías metabólicas están reguladas. La
regulación tiene el objeto de ejercer un control
enzimático sobre el flujo de metabolitos a través de
una vía metabólica. En toda vía existe una reacción
enzimática que funciona tan lentamente que impide
que sus sustratos y productos se equilibren. Dado
que la mayoría de las otras enzimas funcionan
próximas al equilibrio, esta reacción enzimática es
la que determina la velocidad de la vía, y por lo
tanto, su regulación. Esta es la forma más eficaz
de ejercer el control porque evita la síntesis
innecesaria de metabolitos de la vía.
Una manera de controlar la actividad de la
enzima limitante es regulando su actividad catalítica,
mediante interacciones alostéricas (como en la
inhibición por producto) o por modificaciones
covalentes. Otra manera sería controlando la
velocidad de la síntesis de enzimas particulares.
El hecho de que las vías de síntesis y
degradación de moléculas
sean
diferentes,
contribuye también a la regulación metabólica.
41
4.
las
glicoproteínas
y
de
los
glicolípidos y conocerá su función
como receptores y moléculas de
reconocimiento.
En
las
células
eucarióticas,
la
compartimentalización permite la localización
específica de las vías metabólicas y su control.
B. Carbohidratos
Al finalizar esta subunidad, el alumno explicará la
estructura química de los carbohidratos, sus fuentes,
su digestión, su absorción y la función que
desempeñan en la célula.
B.1
Estructura.
B.1.1 Definirá qué son los carbohidratos y
cuál es su importancia biológica.
B.1.2 Conocerá la clasificación de los
carbohidratos con base en el número
de unidades sacáridas que los
componen (mono, di, tri, oligo y
polisacáridos) y con base en su
composición
(homo
y
heteropolisacáridos).
B.1.3 Conocerá la estructura química de
los monosacáridos con base en su
grupo carbonilo, en su estructura
lineal o cíclica y en el número de
átomos de carbono. Señalará las
siguientes
características
fisicoquímicas:
solubilidad
y
propiedades ópticas. Definirá el
concepto de carbono asimétrico y los
diferentes tipos de isómeros ópticos:
epímero, enantiómero y anómero.
B.1.4 Describirá la estructura de los
carbohidratos
de
importancia
fisiológica: ribosa, glucosa, fructosa,
manosa,
galactosa,
sacarosa,
lactosa, maltosa, almidón, glucógeno
y celulosa.
B.1.5 Describirá
la
estructura
y
características de los principales
heteropolisacáridos
(quitina,
heparina, sulfato de dermatan,
condroitin
sulfato,
glicosaminoglucanos,
peptidoglicanos). Reconocerá los
carbohidratos como componentes de
B.2
Digestión y absorción.
B.2.1 Señalará las fuentes dietéticas de los
carbohidratos y el papel de la celulosa
en la dieta de los mamíferos.
B.2.2 Conocerá el proceso de la digestión y
la absorción de los carbohidratos de la
dieta.
B.2.3 Conocerá
los
cinco
principales
transportadores de glucosa (GLUT 1 a
GLUT 5) y su distribución en los
diferentes tejidos.
Realización de la práctica 4 "Efecto de la insulina
sobre la glucemia de la rata" (ver pág.145).
Lecturas recomendadas
1.
Díaz HD, Burgos HLC. ¿Cómo se transporta
la glucosa a través de la membrana celular?
IATREA. 2002; 15 (3): 179-189.
2.
Maeder T. Sweet Medicine. Scientific
American. 2002; 287(1): 24-31.
Los carbohidratos, o sacáridos, son las biomoléculas
más abundantes en la naturaleza y son
indispensables en los organismos vivos. Se les llama
carbohidratos debido a que su estructura química
semeja formas hidratadas del carbono y se
representan con la fórmula (CH2O)n; químicamente
se definen como derivados aldehídicos y cetónicos
de alcoholes polivalentes y no puede haber menos
de 3C para constituir un carbohidrato.
42
Transportador
GLUT 1
Distribuidor
Propiedades
Eritrocitos,
Ingreso
barrera
de glucosa.
basal
hematoencefáli
Km 1.6 mM.
ca,
placenta,
retina,
riñón y cerebro.
GLUT 2
Hígado,
Transportador
páncreas
de
e
galactosa
intestino
delgado
glucosa,
y
fructosa.
Sensor
de
glucosa
en
páncreas.
Km de 15 mM o
más.
GLUT 3
Cerebro,
placenta,
hígado, riñón
y corazón.
Ingreso basal
de glucosa.
KM 2 mM.
Transportador
de glucosa y
galactosa.
maltosa, la lactosa y la celobiosa; oligosacáridos, con
3 a 10 unidades de monosacárido y polisacáridos,
con más de 10 unidades de monosacárido, que
tienen alto peso molecular, como el almidón, el
glucógeno y la celulosa.
Los carbohidratos provienen de la dieta; se
encuentran en los cereales (maíz, trigo y arroz),
hortalizas (bulbos, raíces, verduras), legumbres (frijol,
garbanzo, lenteja), tubérculos (papa, yuca), frutas,
leche y productos lácteos, así como en algunos
productos procesados como dulces, jaleas,
mermeladas y pastas. Los carbohidratos son los
componentes más abundantes de la dieta del
humano, aportan aproximadamente el 55% de las
calorías de la dieta.
Los carbohidratos tienen diversas funciones
en el organismo son: a) La fuente principal de
energía (1 g de carbohidrato produce 4 Cal); b)
Precursores en la bio-síntesis de ácidos grasos y
algunos aminoácidos; c) Constituyentes de moléculas
complejas
importantes
como
glucolípidos,
glucoproteínas, ácidos nucleicos y nucleótidos.
Estructura de los monosacáridos
GLUT 4
GLUT 5
Tejido
adiposo,
corazón
y
músculo
esquelético.
Yeyuno,
espermatozoi
des,
riñón,
cerebro.
Dependiente
de insulina.
Km de 5 mM.
Transportador
de
fructosa.
Se clasifican según el número de unidades
sacáridas en monosacáridos y polisacáridos. Los
monosacáridos, según el número de carbonos en su
molécula, se dividen en triosas (3C), tetrosas (4C),
pentosas (5C), hexosas (6C), heptosas (7C),
etcétera. Según su función carbonilo pueden ser
aldosas o cetosas, por ejemplo, la glucosa es una
aldohexosa y la fructosa una cetohexosa. Los
polisacáridos son carbohidratos que resultan de la
unión de varias moléculas de monosacáridos. Este
grupo se puede clasificar en disacáridos, con dos
unidades monosacáridas, como la sacarosa, la
Los alcoholes y los aldehídos o cetonas pueden
reaccionar entre sí para producir hemiacetales y
hemicetales. Cuando existen estos grupos hidroxilo y
carbonilo en una misma molécula provocan que la
molécula se ciclice. La naturaleza del ciclo depende
de la posición del grupo hidroxilo que participa. Si el
compuesto es una aldosa y tiene 5 carbonos será el
C 4 el que reaccione y el anillo formado es un furano.
De la misma manera, si el compuesto tiene 6
carbonos, será el C 5 el que reaccione y se formará
un anillo de pirano. La transferencia de un protón del
grupo hidroxilo al oxígeno del carbonilo ocasiona un
nuevo carbón asimétrico. La posición del hidroxilo en
este carbono determina dos formas isoméricas alfa o
beta que, en solución, guardan un equilibrio con la
forma lineal (forma carbonilo).
Glucósidos
Son los compuestos resultantes de la unión
covalente de azúcares con varias moléculas. Se
clasifican en homoglucósidos, si se unen
exclusivamente carbohidratos (osas) mediante
43
enlaces glucosídicos, y en heteroglucósidos, si
forman enlaces con otro tipo de moléculas como
proteínas o lípidos. Los homoglucósidos pueden
clasificarse según el número de unidades en:
disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Los
polisacáridos, también llamados poliósidos, pueden
clasificarse en homopolisacáridos, que pueden ser de
reserva, como el almidón, el glucógeno, la inulina, o
estructurales, como la celulosa, la lignina y la quitina,
y en heteropolisacáridos, que pueden dividirse en no
nitrogenados, como las pectinas, el agar y la goma
arábiga,
o
nitrogenados,
como
los
glucosaminoglucanos.
Muchos de los alimentos que se ingieren a
diario contienen almidón y glucógeno que son
polisacáridos de reserva. El almidón forma gránulos
en las células de las plantas y el glucógeno se
encuentra en el citoplasma de las células musculares
y hepáticas de los animales. El azúcar que constituye
la unidad estructural de estas moléculas es la
glucosa, la cual se encuentra formando dos tipos de
enlaces: los enlaces α 1
4 se encuentran en la
amilosa (formada por unidades de maltosa) y el
enlace α 1
6 conecta a la estructura llamada
amilopectina. La estructura del glucógeno es similar a
la del almidón, pero con una mayor cantidad de
ramificaciones. El almidón está compuesto por 3 000
residuos de glucosa y tiene un peso molecular
5
cercano a 5 X 10 ; el glucógeno tiene un peso
6
molecular de 1 a 4 X 10 . La degradación de estos
polisacáridos es diferente si se realiza en el aparato
digestivo o en el interior de las células; es hidrolítico
en el primer caso y fosforolítico en las células.
Durante la digestión, la amilosa es
hidrolizada por una alfa amilasa, la cual rompe los
 4. Los productos primarios son
enlaces α 1
oligosacáridos con 6 a 7 residuos; los últimos
productos son una mezcla de maltosa y glucosa. En
la cadena de amilopectina, la alfa amilasa rompe los
enlaces α 1
4, pero no los α 1
6; éstos son
hidrolizados por una α 1
6 glucosidasa. El
resultado de la acción de las dos enzimas es la
hidrólisis de la amilopectina hasta glucosa y maltosa.
Existe también otra enzima llamada maltasa
(alfa amilasa), que hidroliza los enlaces α1
4
glucosídicos de la malto-sa; la acción de esta enzima
facilita la formación de la dextrina límite. Esta
partícula está constituida por moléculas de
amilopectina que tienen una gran cantidad de
ramificaciones. Las dextrinas límite son degradadas
por la α 1
6 glucosidasa y se obtiene
una mezcla de glucosa y maltosa.
Los productos de la digestión de los
carbohidratos se absorben en el intestino a través de
GLUT2 y GLUT5 o por cotransporte con sodio y
pasan a la circulación portal.
C. Metabolismo energético
Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá las
vías involucradas directamente en la generación de
la energía de la célula.
C.1
Glucólisis.
C.1.1 Describirá las reacciones de la vía
glucolítica, indicando las reacciones
irreversibles y aquellas que generan
NADH o ATP por fosforilación a nivel
de sustrato.
C.1.2 Señalará los productos de la vía y su
destino en presencia y en ausencia
de oxígeno; discutirá la importancia
fisiológica de la formación de lactato.
C.1.3 Conocerá el balance energético y la
regulación de la vía glucolítica; hará
énfasis en el papel de las siguientes
moléculas: ATP, ADP, AMP, fructosa
2,6-bisfosfato, alanina y citrato.
C.1.4 Señalará la importancia de la
glucólisis en los eritrocitos, en las
células musculares, en las células
nerviosas y en los hepatocitos.
Las células de los organismos heterótrofos obtienen
su energía de reacciones oxidativas en las cuales los
electrones de un sustrato donador se transfieren a un
aceptor.
Bajo
condiciones
anaeróbicas,
un
compuesto orgánico sirve como aceptor de
electrones; bajo condiciones aeróbicas, el oxígeno es
el aceptor final.
Los sustratos preferidos por la célula para
obtener la energía requerida para sus funciones
vitales
son
los
azúcares
(mono,
di
y
homopolisacáridos). Asimismo, las células son
44
capaces de usarlos también como intermediarios
para la formación de otros compuestos importantes
en biología.
La glucólisis es la vía metabólica por la que
se degrada la glucosa; filogenéticamente, es la vía
más antigua y consiste en una secuencia de
reacciones enzimáticas en las cuales se degrada la
glucosa. La glucólisis puede dividirse en dos fases:
una de activación y una oxidativa. La fase de
activación consiste en la transferencia de fosfatos a
la glucosa con gasto de dos ATP y en su ruptura en
dos moléculas de gliceraldehído 3 fosfato; en la fase
oxidativa, el gliceraldehído 3 fosfato es transformado
en piruvato con la obtención de cuatro moléculas de
ATP por fosforilación a nivel de sustrato.
Las reacciones de la glucólisis ocurren en el
citoplasma y no están ligadas a estructuras celulares.
El producto de la vía es el piruvato, el cual
puede seguir diversos destinos según las
condiciones de la célula. En condiciones
anaeróbicas, el piruvato se transforma en lactato por
acción de la lactato deshidrogenasa en presencia del
+
NADH + H
obtenido en la oxidación del
gliceraldehído 3 fosfato. En las levaduras, el piruvato
se descarboxila a acetaldehído y se forma etanol por
la reducción del acetaldehído con el NADH mediante
la acción de la deshidrogenasa alcohólica. Bajo
condiciones aerobias, el piruvato se descarboxila en
las mitocondrias y produce NADH y acetil CoA, la
cual es el sustrato principal del ciclo de Krebs.
Sólo una pequeña parte de la energía
almacenada en la molécula de la glucosa se libera en
la glucólisis (2 ATP netos por cada molécula de
glucosa). En estricta anaerobiosis, la glucólisis es la
única fuente de energía de la célula.
La regulación de la vía glucolítica se realiza a
nivel de la transformación de la fructosa 6 fosfato en
fructosa 1,6 bisfosfato. Esta reacción es catalizada
por la fosfofructocinasa I, la que es una enzima
alostérica cuya actividad se estimula por AMP, ADP y
fructosa 2,6 bisfosfato y se inhibe por ATP y citrato.
La deshidrogenasa de gliceraldehído 3 fosfato
también desempeña un papel importante en la
regulación de la glucólisis.
C.2
Papel de la mitocondria en las funciones
oxidativas.
C.2.1
C.2.2
C.2.3
Conocerá la biogénesis de la
mitocondria.
Señalará la estructura de la
mitocondria
y
describirá
las
características
de
su
matriz,
membrana
externa,
membrana
interna y espacio intermembranal;
hará énfasis en su papel en la
transducción de energía.
Reconocerá que en la mitocondria se
realizan, entre otras, las siguientes
vías: síntesis de algunas proteínas,
descarboxilación del piruvato, ßoxidación, ciclo de Krebs, cadena de
transporte
de
electrones
y
fosforilación oxidativa.
La respiración celular es una secuencia de
reacciones de óxidorreducción de la que los
organismos
obtienen
energía
para
formar
compuestos como el ATP. La base molecular de este
proceso es una oxidación, paso a paso, de los
compuestos orgánicos hasta CO2 y la transferencia
de hidrógeno (protones más electrones) al oxígeno
con la formación de una molécula de agua. La
energía obtenida por la respiración celular es, por
tanto, una parte de la energía liberada en la reacción
del hidrógeno con el oxígeno. Todos estos procesos
se realizan en las mitocondrias de los organismos
eucariotos y en las membranas plasmáticas de los
organismos procariotos.
Las
mitocondrias
son
orgánulos
relativamente autónomos cuya estructura está
adaptada a su función principal, es decir, a la
conversión de la energía de oxidación en aquella de
los compuestos de reserva con un alto contenido
energético. Una mitocondria está constituida por dos
membranas separadas: una membrana externa lisa y
muy permeable y una membrana interna con
plegamientos irregulares (crestas) y selectivamente
permeable. El interior de la mitocondria está
constituido por la matriz. Cada compartimiento tiene
un contenido característico de enzimas y moléculas
de acuerdo con los procesos que se realizan en ellos.
La cadena de transporte de electrones (cadena
respiratoria) y la generación de enlaces de alta
energía asociada a esta transferencia de electrones
45
tiene lugar en la membrana interna. La mitocondria
contiene además un DNA circular específico y todos
los componentes necesarios para la síntesis de
proteínas, lo que podría indicar que el origen de la
mitocondria pudo ser una bacteria que estableció una
simbiosis con una célula eucariótica a la que infectó.
C.3
Descarboxilación del piruvato.
C.3.1 Conocerá las reacciones de la
descarboxilación
oxidativa
del
piruvato e indicará sus productos y el
destino de los mismos.
C.3.2 Analizará el carácter irreversible de
la descarboxilación del piruvato y su
regulación
por
producto,
por
alosterismo y por modificación
covalente.
En los organismos aeróbicos el piruvato, producto de
la glucólisis, entra a la mitocondria para ser oxidado a
acetil CoA y CO2. Este proceso oxidativo irreversible
es realizado por la piruvato deshidrogenasa, un
complejo de tres enzimas y cinco diferentes
coenzimas o grupos prostéticos: pirofosfato de
tiamina (TPP), lipoato, flavin adenin dinucleótido
(FAD), CoA y nicotin adenin dinucleótido (NAD).
En la primera reacción se forma CO2 y un
grupo α-hidroxietilo derivado del piruvato, el cual se
une covalentemente al TPP de la piruvato
deshidrogenasa (E1). En el siguiente paso el grupo
α-hidroxietilo es oxidado a acetato y se transfiere al
lipoato unido covalentemente a la dihidrolipoil
transacetilasa (E2). El TPP se regenera en este
paso.
La siguiente reacción consiste en transferir el
grupo acetato del lipoato a la CoA para formar acetil
CoA. El lipoato permanece reducido. Los siguientes
pasos tienen como finalidad regenerar la forma
oxidada de este lipoato. Para ello, el FAD unido a la
dihidrolipoil deshidrogenasa (E3) remueve los
+
electrones del lipoato y los entrega al NAD
+
reduciéndolo a NADH + H
La actividad del complejo de la piruvato
deshidrogenasa es regulada por tres mecanismos:
1. Inhibición por producto: tanto el acetil CoA como el
+
NADH + H actúan como moduladores alostéricos
negativos.
2. Por disponibilidad de sus sustratos: deben existir
concentraciones adecuadas de piruvato, CoA y
+
NAD .
3. Por modificación covalente: la piruvato
deshidrogenasa (E1) existe en dos formas: una
fosforilada (inactiva) y otra desfosforilada, que es
activa. La fosforilación es llevada a cabo por una
2+
proteína cinasa dependiente de Mg
y ATP,
mientras que la desfosforilación la realiza una
fosfoproteína fosfatasa, cuya actividad es
2+
estimulada por altas concentraciones de Ca . Este
último evento ocurre cuando existe una
concentración elevada de ADP, el cual es indicador
de carencia energética.
Los individuos que tienen deficiencia de
tiamina, como ocurre en el beriberi, presentan
problemas a nivel neurológico debido a que el
cerebro obtiene toda su energía por oxidación
aeróbica de la glucosa.
C.4
Ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo de
Krebs).
C.4.1 Definirá
el
concepto
de
óxidorreducción,
par
redox
y
potencial de óxidorreducción.
C.4.2 Señalará la localización subcelular
de la vía en función de sus
alimentadores y precisará el papel
del ciclo en la generación de la
energía celular.
C.4.3 Describirá
las
reacciones
enzimáticas involucradas en el ciclo,
sus sustratos y productos, así como
las sustancias que intervienen en la
regulación de la vía.
C.4.4 Conocerá el papel anfibólico de la
vía y los diferentes destinos de sus
intermediarios: citrato, isocitrato, αcetoglutarato, succinil CoA, malato y
oxaloacetato.
C.4.5 Definirá el concepto de reacción
anaplerótica y conocerá las enzimas
involucradas en estas reacciones
para el ciclo de Krebs.
C.4.6 Conocerá el balance energético de la
vía y hará énfasis en el número y tipo
de coenzimas reducidas producidas
46
en la oxidación de una molécula de
acetil CoA.
La mayor parte del ATP generado en los organismos
aerobios se produce en el proceso de la fosforilación
oxidativa en el cual, los hidrógenos extraídos de los
metabolitos
mediante
las
reacciones
de
deshidrogenación son cedidos a la cadena
respiratoria, en donde se genera el potencial
protonmotriz que sirve de fuerza impulsora para la
síntesis
del
ATP.
La
mayoría
de
las
deshidrogenaciones de los metabolitos se llevan a
cabo en una secuencia cíclica de reacciones
conocida como ciclo de Krebs, ciclo del ácido cítrico
o ciclo de los ácidos tricarboxílicos. El ciclo de Krebs
se lleva a cabo por enzimas solubles (a excepción de
la succinato deshidrogenasa que es parte integral de
la membrana interna) de la matriz mitocondrial y
durante él se oxidan los residuos de acetato activo
(acetil CoA) provenientes de la glucosa, los ácidos
grasos y los aminoácidos, hasta CO2 y coenzimas
reducidas. Aproximadamente dos tercios del ATP
utilizado por los organismos aerobios se genera
como resultado de la oxidación de los restos de
acetato en el ciclo de Krebs.
El ciclo de Krebs es una vía de confluencia
para el catabolismo celular (fig. III.1) que, en una
secuencia de ocho reacciones oxida al residuo
acetato de la acetil CoA conforme a la ecuación
siguiente:
CH3 – COOH + 2H2O
+
2CO2 + 4(2H )
En el ciclo ocurren dos reacciones en las que
se desprende CO2 y hay cuatro deshidrogenaciones,
+
de las cuales tres donan sus hidrógenos al NAD y
una al FAD.
a) La oxidación de la Acetil CoA derivada de la
glucosa, los ácidos grasos y los aminoácidos es
la función primaria del ciclo de Krebs, el cual la
procesa en una serie de reacciones que se
inician y terminan con el oxaloacetato; en cada
vuelta del ciclo de Krebs se produce un GTP por
fosforilación a nivel del sustrato y se liberan
cuatro pares de hidrógeno que alimentan la
b)
c)
d)
e)
f)
cadena respiratoria con la producción de 9 ATP
en la fosforilación oxidativa.
Además de su papel central en la oxidación de la
acetil CoA, el ciclo de Krebs participa en los
siguientes procesos metabólicos:
Gluconeogénesis. Reúne numerosos sustratos que
se convierten en oxaloacetato. Este compuesto
sale de la mitocondria en forma de malato, citrato
o aspartato y se transforma en el citosol, primero
en fosfoenol piruvato y después en glucosa.
Biosíntesis de los ácidos grasos. Aporta la molécula
de citrato que, al salir de la mitocondria, es
transformada con gasto de un ATP por la citrato
liasa en oxaloacetato y acetil CoA, que es el
alimentador inicial de la biosíntesis de los ácidos
grasos. El oxaloacetato se reduce a malato, el
cual es oxidado por la enzima málica para la
producción de NADPH, coenzima indispensable
en la biosíntesis de los ácidos grasos.
Interconversión
de
Aminoácidos.
Numerosos
aminoácidos entregan sus carbonos al ciclo de
Krebs al transformarse, por reacciones
sucesivas, en alguno de los metabolitos clave del
ciclo: α-cetoglutarato, succinil-CoA, fumarato y
oxaloacetato; una vez ahí, mediante las
reacciones del ciclo de Krebs, pueden
transformarse en algún otro aminoácido que se
derive de otro intermediario del ciclo.
Biosíntesis de Purinas y Pirimidinas. El ciclo de
Krebs alimenta la síntesis de bases púricas y
pirimídicas aportando, de manera indirecta,
aspartato y glutamina.
Biosíntesis de Porfirinas. El ciclo de Krebs aporta
uno de los sustratos iniciales necesarios para
que se lleve a cabo esta vía: la succinil-CoA.
Regulación del ciclo de Krebs
Por el hecho de que entrega NADH y FADH2 a la
cadena respiratoria y recibe de ella las mismas
coenzimas oxidadas, el ciclo de Krebs funciona bajo
el control de la cadena respiratoria y depende en
última instancia de la fosforilación oxidativa. Sin
embargo, el ciclo de Krebs responde a moduladores
47
C.5.2
C.5.3
C.5.4
C.5.5
Identificará los alimentadores de la
vía, así como su sitio de entrada a
ésta y el último aceptor de los
electrones.
Señalará el sitio de acción de los
siguientes inhibidores de la cadena
respiratoria:
amital,
rotenona,
antimicina, cianuro, NaN3, CO y H2S.
Describirá los sistemas de transporte
de los equivalentes reductores a la
mitocondria (lanzaderas).
Citará
algunos
ejemplos
de
alteraciones en los componentes
mitocondriales, como las isoenzimas
e isoformas de la citocromo c
oxidasa, entre otras.
Lecturas recomendadas
1.
Schon EA. Mitochondrial genetics and disease.
TIBS. 2000; 25(11): 555-5560.
2.
Raha S, Robinson BH. Mitochondria, oxygen free
radicals, disease and aging. TIBS. 2000; 25(10):
502-508.
3.
Cardellach F, Casademont J. Enfermedades
mitocondriales: un diagnóstico todavía difícil.
Medicina Clínica. 2000; 114 (4): 139-140.
4.
Rubio JC, Matín MA, del Hoyo P, Bustos F,
Campos Y, Arenas J. Déficits de los complejos
enzimáticos
de
la
cadena
respiratoria
mitocondrial. Rev Neurol. 1998; 26 (supl 1): S15-
alostéricos generados en el propio ciclo y también en
otras vías del metabolismo; son moduladores
negativos NADH, ATP, citrato, succinil CoA y
2+
oxaloacetato y moduladores positivos ADPy Ca .
Las
enzimas
citrato
sintasa,
isocitrato
deshidrogenasa y α-cetoglutarato deshidrogenasa
son las enzimas reguladoras del ciclo.
C.5
Cadena de transporte de electrones (cadena
respiratoria).
C.5.1 Describirá la naturaleza de los
componentes de la cadena de
transporte de electrones y señalará
su secuencia con base en los
potenciales
de
oxidorreducción.
Calculará la energía generada en
cada paso del transporte de
electrones.
S20.
5.
Castro-Gago M, Novo MI, Eirís J. Tratamiento de
las
enfermedades
mitocondriales
durante
la
infancia y adolescencia. Rev Neurol. 1998; 26
(supl 1): S92-S98.
C.6
Fosforilación oxidativa.
C.6.1 Describirá brevemente la hipótesis
quimiosmótica
propuesta
para
explicar la síntesis de ATP y los
datos que existen en favor de ella.
Definirá
los
conceptos
de
vectorialidad,
impermea-bilidad,
fuerza protonmotriz e ionóforo,
empleados en esta hipótesis.
C.6.2 Con base en el cálculo de energía
libre de Gibbs, señalará el número
48
C.6.3
de ATP que se genera al reoxidarse
las coenzimas NADH y FADH2 en la
cadena respiratoria. Definirá el
concepto de control respiratorio
indicando el papel del ADP, del
transportador de adenin nucleótidos
y del acarreador de fosfatos y su
efecto sobre la síntesis de ATP.
Señalará el sitio de acción de los
inhibidores de la ATP sintasa
(oligomicina y venturicidina), de los
desacoplantes sintéticos y naturales
(dinitrofenol y termogenina) de los
procesos de transporte de electrones
y la fosforilación oxidativa
y el
inhibidor del translocador de adenin
nucleótidos (atractilósido) y hará
énfasis en su efecto sobre la síntesis
de ATP.
Realización de la práctica 5 "Estudio del bombeo de
protones por levaduras; efecto de los inhibidores de
la cadena de transporte de electrones y de los
desacoplantes" (ver pág.146).
Lectura recomendada
1. Hinkle PC. ¿Cómo fabrican ATP las células?
Investigación y Ciencia 1978; 20: 58-75.
Mientras que el CO2 se forma por la oxidación del
sustrato durante el ciclo del ácido cítrico en la matriz
mitocondrial, la secuencia de las reacciones que
participan en la transferencia de hidrógenos y
electrones (la cadena respiratoria) se localiza en la
membrana interna de la mitocondria. La cadena se
puede dividir en cuatro complejos: el complejo I o
NADH deshidrogenasa (que cede sus electrones a la
coenzima Q); el complejo II o las deshidrogenasas
que ceden sus electrones al FADH2 (como la
succinato deshidrogenasa) y a través de él a la
misma coenzima Q; el complejo III o citocromo c
reductasa, y el complejo IV o citocromo c oxidasa,
que transfiere los electrones al oxígeno, que es el
aceptor final.
Los componentes de la cadena respiratoria
están arreglados de acuerdo con potenciales de
oxidorreducción crecientes (de valores negativos a
positivos). La energía liberada en el curso de la
transferencia de hidrógeno y electrones a través de la
cadena respiratoria se utiliza para la formación de
ATP por la llamada fosforilación oxidativa. La energía
requerida para la formación de un ATP a partir de un
ADP es equivalente a una diferencia de potencial
redox de 0.15 V. En promedio, la oxidación de una
molécula de NADH da origen a 2.5 moléculas de
ATP, mientras que se forman 1.5 moléculas de ATP
cuando se oxida FADH2 vía succinato (no involucra
NADH). El rendimiento de energía de la fosforilación
oxidativa es alrededor de 40% del valor teórico de la
energía liberada en la reacción del hidrógeno con el
oxígeno.
El transporte de los electrones entre los
diferentes componentes de la cadena respiratoria
puede ser inhibido por diversos compuestos, entre
ellos: los barbituratos, la rotenona, la antimicina, el
CO, las azidas, el H2S y el cianuro, los que actúan en
distintos sitios de la cadena respiratoria.
Las reacciones de la cadena respiratoria y la
fosforilación oxidativa están acopladas; si se
desacoplan, la energía se pierde como calor y no hay
síntesis de ATP. Pueden desacoplarse in vitro por 2,4
dinitrofenol o compuestos similares e, in vivo, por la
termogenina presente en tejido adiposo pardo, el que
es abundante en recién nacidos.
La membrana interna de la mitocondria debe
estar intacta para generar ATP. Las moléculas de
ATP formadas en el interior de la mitocondria son
translocadas al exterior en intercambio con moléculas
de ADP presentes fuera de la mitocondria por medio
de un acarreador altamente específico presente en la
membrana mitocondrial: la translocasa de los adeninnucleótidos.
Hay otro mecanismo de síntesis de ATP no
asociado al transporte de electrones en el que los
donadores de la energía y del fosfato final del ATP
son compuestos con enlaces fosfato de alta energía.
Este tipo de fosforilación se conoce como
fosforilación a nivel de sustrato.
Los sustratos metabolizados dentro de la
mitocondria son transportados al exterior por
mecanismos específicos (transporte de ácidos
dicarboxílicos, de aminoácidos, de iones, etcétera).
Este transporte, como el del ATP, se convierte en
49
uno de los factores de control en la función
mitocondrial.
Dado que la membrana interna de la
+
mitocondria es impermeable para el NAD y el NADH
y a que una forma eficiente, energéticamente
hablando, de reoxidar al NADH que se obtiene en la
glucólisis es un proceso mitocondrial, existen
lanzaderas que son sistemas de transporte de los
hidrógenos citoplasmáticos (equivalentes reductores)
a través de la membrana mitocondrial. Las dos
lanzaderas más importantes son la del glicerol fosfato
y la del malato.
C.7
Radicales libres.
C.7.1 Definirá el concepto de radicales
libres y cuáles son derivados del
oxígeno.
C.7.2 Describirá cómo y dónde se generan
los radicales superóxido, hidroxilo y
otras moléculas reactivas: peróxido
de hidrógeno y singulete de oxígeno.
C.7.3 Describirá el efecto de estos
radicales y moléculas reactivas sobre
otras
moléculas,
células
y
organismos y su contribución en las
siguientes condiciones: fagocitosis,
inflamación,
lipoperoxidación
y
perfusión postisquemia.
C.7.4 Describirá las condiciones en las que
se genera el radical NO y su relevancia
fisiológica.
C.7.5 Describirá los mecanismos protectores
del organismo contra las especies
reactivas de O2: superóxido dismutasa,
catalasa,
glutatión
peroxidasa,
vitaminas E y C y β-carotenos.
Realización de la práctica 6 "El efecto del etanol
sobre la lipoperoxidación" (ver pág.149).
Lecturas recomendadas
1.
Piña GE, Huberman A, Chávez R, Lascurain
R, Zenteno E, Frenk S. Los radicales libres.
Beneficios y problemas. Gac Méd Méx 1996;
132 (2): 183-203.
2.
Fernández AA, Abudara V, Morales FR. El
óxido nítrico como neurotransmisor y
3.
neuromodulador. Actas de Fisiología. 1999;
5: 39-77.
Raha S, Robinson BH. Mitochondria, oxygen
free radicals, disease and aging. TIBS. 2000;
25 (10): 502-508.
Un gran número de enfermedades, como el
Parkinson, aterosclerosis, enfisema pulmonar y
cáncer, entre otras, tienen su origen en una
producción excesiva o anormal de derivados del
oxígeno, químicamente muy activos: los radicales
libres.
Un radical libre es cualquier especie química,
molécula o átomo, portadora de uno o más
electrones desapareados. Se llama electrón
desapareado al electrón que se encuentra solo en un
orbital. La presencia de un electrón desapareado
hace que los radicales libres sean muy reactivos,
pues buscan con avidez completar su par electrónico.
No obstante, existen radicales libres relativamente
estables, como las moléculas con estructuras
resonantes (con múltiples enlaces dobles), que
permiten la deslocalización del electrón desapareado.
La colocación de un punto, generalmente al final de
la fórmula química, indica el carácter de radical libre
de una molécula (•).
Los radicales libres son capaces de alterar
reversible
o
irreversiblemente
compuestos
bioquímicos de todo tipo y pueden modificar en forma
importante su estructura y, como consecuencia,
alterar la capacidad funcional de las sustancias
atacadas. El principal blanco de los radicales libres
son las insaturaciones de los lípidos de membrana en
los cuales provocan una peroxidación. La presencia
de lípidos peroxidados en las membranas biológicas
disminuye su fluidez, lo que se traduce en
alteraciones de la permeabilidad a sustancias o,
incluso, su integridad, lo que provoca la lisis celular.
Los radicales libres también son capaces de inactivar
o destruir enzimas y otras proteínas y atacar a los
ácidos nucleicos. El daño al DNA puede causar
mutaciones y dar origen a cánceres. La acción sobre
los carbohidratos puede alterar su función como
receptores (de hormonas o neurotransmisores). Es
decir, los radicales libres influyen sobre actividades
celulares tanto a nivel de la membrana como en las
vías metabólicas y en la expresión genética.
50
Una de las características más importantes
de las reacciones de los radicales libres es que se
forman por reacciones en cadena; esto significa que
un radical libre puede dar lugar a la formación de
otro, de manera que este mecanismo permite que la
actividad se propague y que el daño se generalice.
Los radicales derivados del oxígeno
Las especies reactivas del oxígeno son el anión
superóxido, el peróxido de hidrógeno, el hidroxilo y el
singulete de oxígeno.
Anión superóxido. La transformación del
oxígeno en radical libre puede efectuarse cuando el
oxígeno acepta un electrón que transforma este
elemento en un radical con carga negativa, el anión
•–
superóxido: O2 .
Probablemente la fuente más importante de
producción de radicales superóxido sea el estallido
respiratorio (aumento súbito del consumo de
oxígeno) de los macrófagos y de los leucocitos
polimorfonucleares en respuesta a una señal
inmunitaria provocada por alguna infección.
Peróxido de hidrógeno. El anión superóxido
sufre espontáneamente, o bajo la acción de la
enzima superóxido dismutasa (SOD), una reacción
de dismutación: dos radicales libres reaccionan entre
sí, uno de ellos perdiendo electrones y el otro
ganándolos. Esta dismutación produce agua
oxigenada, que no es realmente un radical libre, pero
este compuesto por captación de un electrón y de un
protón, puede dar lugar a la formación de especies
oxigenadas muy activas, especialmente al radical
hidroxilo.
Radical hidroxilo. El •OH es un oxidante
extremadamente reactivo que interactúa con casi
todas las moléculas a velocidades sólo limitadas por
su difusión. El radical hidroxilo es formado por la
ruptura de una molécula de agua bajo el efecto de
una radiación gamma o en el ciclo de Haber-Weiss:
•
+
1. 2 O2 – + 2 H
O 2 + H 2O 2
2+
3+
•
–
2. H2O2 + Fe
Fe + OH + OH
3+
•
2+
3. Fe + O2 –
Fe + O2
el ciclo global se expresa:
2+
1. La dismutación del radical anión superóxido
produce peróxido de hidrógeno.
2. El peróxido de hidrógeno se descompone en el
2+
radical hidroxilo con intervención del Fe (reacción
de Fenton).
2+
3. La regeneración del Fe por medio del radical
anión superóxido.
Singulete de oxígeno. El singulete de
1
oxígeno, representado gráficamente como O2*, se
caracteriza por tener un par electrónico antiparalelo
en su última órbita; no es realmente un radical, sin
embargo, es incluido aquí por ser un derivado muy
oxidante del oxígeno. Se forma principalmente en
reacciones en las que los pigmentos biológicos,
como el retinal, las flavinas o las porfirinas, son
expuestos a la luz en presencia de oxígeno.
Antioxidantes
Para controlar los efectos devastadores de los
radicales libres existen mecanismos protectores.
Estos sistemas tienen la función de neutralizar el
efecto de los radicales libres o evitar su aparición. El
nivel primario de defensa lo constituyen tres enzimas
especializadas.
1. Superóxido dismutasa. Existe en las mitocondrias
2+
2+
(SOD de Mn ) y en el citosol (SOD de Cu y de
2+
Zn ). Cataliza la dismutación del radical anión
superóxido para dar oxígeno molecular y peróxido
de hidrógeno:
•
2 O2 – + 2 H
+
O 2 + H 2O 2
2. Glutatión peroxidasa. Existe principalmente en el
citosol y contiene selenio. Cataliza la siguiente
reacción:
2GSH + H2O2
GSSG + 2H2O
(donde: GSH-glutatión reducido y GSSG-glutatión
oxidado).
3. Catalasa. Existe principalmente en los
peroxisomas y su función es destruir el agua
oxigenada por dismutación:
H 2O 2 + H 2O 2
2H2O + O2
3+
Fe /Fe
O2•– + H2O2
•
O2 + OH + OH
–
51
Otro tipo de protección contra los radicales
libres es la que prestan unas sustancias capaces de
neutralizar a los radicales o limitar su reactividad,
llamadas atrapadoras. Entre ellas cabe mencionar:
Vitamina E (tocoferol) y beta caroteno.
Reaccionan con los radicales peróxido y suspenden
la cadena de reacciones radicalares. Son liposolubles
y por eso pueden proteger las membranas.
Vitamina C. Reacciona directamente con los
superóxidos, con el singulete de oxígeno y con el
radical hidroxilo; regenera la vitamina E al reaccionar
con el radical tocoferilo y lo convierte en radical
ascorbilo, también muy estable.
Algunos minerales como el selenio, el cinc, el
cobre y el manganeso, constituyentes de las enzimas
antes mencionadas; proteínas y péptidos como el
glutatión, la albúmina, la ceruloplasmina, la ferritina,
la transferrina, etcétera y, por último, sustancias
quelantes que evitan que el hierro, cobre y otros
metales de transición catalicen reacciones de
oxidación.
D.
Otras
vías
metabólicas
carbohidratos
de
los
Al finalizar esta subunidad, el alumno podrá analizar
en forma integral el metabolismo de los
carbohidratos, identificar su papel como combustible
celular y como generador de intermediarios de otras
vías metabólicas y podrá explicar en forma integral la
regulación de la glucemia.
D.1
Gluconeogénesis.
D.1.1 Señalará en qué consiste la
gluconeogénesis,
los
sustratos
gluconeogénicos,
los
compartimentos celulares de la vía y
los tejidos con mayor actividad
gluconeogénica.
D.1.2 Comparará
y
analizará
las
reacciones de esta vía con las de la
glucólisis desde el punto de vista
energético
y
describirá
los
mecanismos empleados para evitar
las barreras energéticas.
D.1.3
D.1.4
D.1.5
Indicará el destino metabólico del
producto de la gluconeogénesis
hepática.
Describirá el ciclo de Cori y el ciclo
de la alanina y el significado
fisiológico de ambos.
Elaborará el balance energético y
explicará la regulación de la
gluconeogénesis y hará énfasis en
el papel de la fructosa 2,6 bisfosfato.
Es el proceso por el cual se sintetiza la glucosa a
partir de diversos sustratos como son:
a) Lactato o piruvato.
b) Aminoácidos glucogénicos (Ala, Arg, Cys, Asp,
Glu, Gly, His, Met, Pro, Ser, Tre, Val).
c) Cualquier otro intermediario que pueda ser
metabolizado vía piruvato (o que entre al ciclo de
Krebs).
La gluconeogénesis no puede verse como la
vía en sentido contrario de la glucólisis ya que
algunas de las reacciones de esta última son muy
exergónicas, lo que las hace irreversibles. Tal es el
caso de las reacciones catalizadas por la
piruvatocinasa (transforma al fosfoenolpiruvato en
piruvato), la fosfofructocinasa (paso de fructosa 6
fosfato a fructosa 1,6 bisfosfato) y la hexocinasa
(glucosa a glucosa 6 fosfato). Estas reacciones se
evitan por medio de las siguientes alternativas:
1. La formación del fosfoenolpiruvato a partir de
oxaloacetato. El oxaloacetato se forma en la
mitocondria por carboxilación del piruvato con una
enzima dependiente de biotina y ATP llamada
carboxilasa del piruvato. También se puede obtener
el oxaloacetato en el citoplasma por carboxilación del
piruvato y reducción con NADPH para formar el
malato, el cual se deshidrogena para producir el
oxaloacetato.
Estas reacciones son llevadas a cabo por la enzima
málica. La fosforilación del oxaloacetato con GTP o
ITP y su descarboxilación simultánea por la
fosfoenolpiruvato
carboxicinasa
producen
el
fosfoenolpiruvato.
2. La degradación hidrolítica de la fructosa 1,6
bisfosfato a fructosa 6 fosfato catalizada por la
fructosa 1,6 bisfosfatasa.
52
3. La degradación de la glucosa 6 fosfato a glucosa
por la glucosa 6 fosfatasa.
La síntesis de una molécula de glucosa a
partir de dos moléculas del piruvato requiere seis
moléculas de ATP.
La posibilidad de que la gluconeogénesis
proceda completamente (es decir, que su producto
final sea glucosa) depende de la presencia de todas
las enzimas clave en un tejido determinado. Se lleva
a cabo con facilidad en el hígado y en los riñones; no
ocurre en el cerebro ni en el músculo esquelético ya
que la glucosa 6 fosfatasa se encuentra ausente en
estos tejidos. Es por esto que el producto de la
degradación del glucógeno muscular (glucosa 6
fosfato) no puede servir como una fuente para
mantener el nivel de la glucosa sanguínea. En el
músculo, el glucógeno se degrada hasta lactato que
sale a la circulación sanguínea y se transfiere al
hígado donde se transforma en glucógeno hepático o
en glucosa libre por la vía de la gluconeogénesis.
Esta contribución indirecta del lactato del músculo a
la glucosa sanguínea se conoce como el ciclo de
Cori. El músculo también contribuye a mantener la
glucemia, al transformar el piruvato en alanina, la que
sale a la circulación y en el hígado se convierte otra
vez en piruvato para entrar a la gluconeogénesis.
D.2
Glucogenólisis y glucogénesis.
D.2.1
D.2.2
D.2.3
D.2.4
Conocerá la distribución tisular del
glucógeno.
Describirá las reacciones de la
glucogenólisis y de la glucogénesis e
indicará
los
sustratos
y
los
productos, así como la localización
subcelular de las vías.
Discutirá el balance energético y la
regulación de ambas vías por
alosterismo (glucosa, glucosa 6
2+
fosfato, AMP y Ca ). Revisará el
papel de las las hormonas epinefrina,
glucagón e insulina en la regulación
de estas vías.
Indicará
las
diferencias
del
metabolismo del glucógeno en el
músculo y en el hígado.
D.2.5
Mencionará los defectos enzimáticos
de las siguientes glucogenosis: von
Gierke, McArdle y Andersen.
El glucógeno es un polisacárido de reserva localizado
en forma de gránulos en el citoplasma de las células;
es osmóticamente inactivo y facilita la rápida y
reversible transformación de la glucosa en una
molécula de reserva, según la situación energética
de la célula. La degradación del glucógeno se
conoce como glucogenólisis y su síntesis como
glucogénesis (glucogenogénesis).
La glucogenólisis se inicia por una ruptura
fosforolítica del glucógeno por la fosforilasa. En
presencia de fosfato, se separa una glucosa del
glucógeno como glucosa 1 fosfato y ésta, por acción
de una fosfoglucomutasa, se transforma en glucosa 6
fosfato, la que puede entrar entonces a la vía
glucolítica. La energía invertida para la inclusión de
una molécula de glucosa en el glucógeno y su
regreso a glucosa 6 fosfato es de dos moléculas de
ATP.
La síntesis de glucógeno se inicia con la
fosforilación de la glucosa para formar glucosa 6
fosfato que se transforma posteriormente en glucosa
1 fosfato por acción de la fosfoglucomutasa. Esta
molécula reacciona con UTP por acción de la UDPglucosa pirofosforilasa y origina UDP-glucosa, que es
el sustrato de la glucógeno sintetasa. Las numerosas
ramificaciones presentes en el glucógeno son
introducidas por la acción de una enzima ramificante.
La degradación y la síntesis de glucógeno
están finamente reguladas por el AMP cíclico a
través de la actividad de la proteína cinasa. En una
secuencia de reacciones, este compuesto se
involucra en la conversión de la fosforilasa b
(inactiva, no fosforilada) en fosforilasa a (activa,
fosforilada).Inversamente, la glucógeno sintetasa que
está en su forma activa (no fosforilada o forma I)
cambia a su estado inactivo (fosforilado o forma D).
La concentración intracelular de AMP cíclico (AMPc)
es regulada por las hormonas epinefrina y glucagon,
las que aumentan la concentración de AMPc, y por la
insulina, que la disminuye.
D.3
Vía
pentosas).
del
fosfogluconato
(ciclo
de
las
53
D.3.1
D.3.2
D.3.3
D.3.4
D.3.5
Indicará la distribución tisular de
esta vía.
Señalará las reacciones de la fase
oxidativa y de la no oxidativa e
indicará sus productos y su destino
metabólico.
Mencionará las relaciones de la vía
del fosfogluconato con otras vías
metabólicas como la glucólisis, la
síntesis de nucleótidos, la síntesis de
ácidos grasos, la síntesis de
colesterol y los sistemas oxidantes
de las células fagocíticas.
Discutirá la regulación de la actividad
de la vía y hará énfasis en su
importancia
para
las
síntesis
reductoras.
Mencionará la consecuencia de la
deficiencia de la glucosa 6 fosfato
deshidrogenasa en eritrocitos.
El ciclo de las pentosas es una vía colateral a la
glucólisis. Presenta dos fases: una oxidativa y una no
oxidativa. En la fase oxidativa, una molécula de
glucosa es gradualmente degradada y se forma el
NADPH; en la fase no oxidativa, la ribosa 5-fosfato y
la eritrosa 4 fosfato son formadas por una
interconversión de ésteres fosfóricos de azúcares de
3C, 4C, 5C, 6C y 7C.
En el sentido biosintético, las reacciones del
ciclo de las pentosas sirven para la fijación de bióxido
de carbono durante la fotosíntesis.
Algunos de los intermediarios de esta vía
están relacionados con la glucólisis como la glucosa
6 fosfato, la fructosa 6 fosfato y el gliceraldehído 3
fosfato. Las enzimas del ciclo de las pentosas, al
igual que las de la glucólisis, son solubles en el
citoplasma.
El ciclo de las pentosas no es una vía
principal para el metabolismo de la glucosa y sus
relaciones con la glucólisis pueden variar de acuerdo
con el tipo de tejido y sus funciones biológicas.
Las reacciones de este ciclo no pueden ser
utilizadas en la obtención de energía, ya que la
oxidación del NADPH no forma ATP directamente.
El ciclo de las pentosas es importante en
todas las células ya que es la principal forma de
obtener el NADPH necesario en los procesos de
síntesis (reductoras); asimismo, es la fuente de la
ribosa 5-fosfato, la cual es precursora de la
biosíntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos.
D.4
Regulación de la glucemia.
D.4.1 Explicará el significado de los términos:
glucemia, hipo e hiperglucemia.
D.4.2 Discutirá la importancia biológica de
mantener una glucemia normal.
D.4.3 Discutirá el papel de las siguientes
hormonas:
epinefrina,
glucagon,
cortisol e insulina en la regulación de la
glucemia normal indicando las vías
metabólicas, los tejidos involucrados y
las fuentes endógenas y exógenas de
los carbohidratos.
D.4.4 Reconocerá
la
glucosilación
no
enzimática
de
las
proteínas
(hemoglobina
glucosilada
y
fructosaminas) como consecuencia de
una hiperglucemia prolongada.
Realización de la práctica 7 "Estudio general del
metabolismo de los carbohidratos" (ver pág.150).
Discusión del caso clínico no. 3 “Hipoglucemia
secundaria a intoxicación alcohólica” (ver pág. 177).
Lecturas recomendadas
1.
Beisswenger PJ, Szwergold BS, Yeo KT.
Glycated proteins in diabetes. Clin Lab Med.
2001; 21 (1): 53-78.
2.
Cohen MP. Intervention strategies to prevent
pathogenetic effects of glycated albumin.
Arch Biochem Biophys. 2003; 419 (1): 25-30.
3.
Desmond A. Glicosilación no enzimática de
proteínas: su rol en las complicaciones
crónicas de la diabetes y el envejecimiento.
Acta Bioquím Clín Latinoamer. 1995; 29 (2):
173-190.
La concentración sanguínea de la glucosa o glucemia
debe mantenerse dentro de límites muy estrechos
debido a que algunas células como las nerviosas y
los eritrocitos utilizan a la glucosa como única fuente
de energía, lo que las hace especialmente sensibles
54
a la disminución de la glucemia. Por otro lado, el
aumento de las concentraciones de glucosa en
sangre se asocia a problemas de hiperosmolaridad y
a la aparición de proteínas glucosiladas que se
asocian a algunas patologías, como la diabetes y sus
consecuencias.
La concentración normal de glucosa en
sangre en ayunas es de 80-100 mg/dl, y sus límites
extremos son 65 y 120 mg/dl. Los niveles superiores
a los valores normales se conocen como
hiperglucemia, mientras que los inferiores se
designan como hipoglucemia.
La glucosa sanguínea puede provenir de dos
fuentes: una exógena (la dieta) y una endógena
(glucogenólisis y gluconeogénesis hepática). En el
primer caso, después de una comida que contenga
carbohidratos, la glucemia se incrementa para volver
en unas dos horas a los niveles basales. Si por el
contrario, el individuo está en ayunas la glucosa
desciende pero nunca por debajo de 60 mg/dl. Esto
hace un contraste notable con las grandes
variaciones en la concentración de los ácidos grasos
que pueden aumentar hasta 10 veces y en el caso de
los cuerpos cetónicos hasta 100 veces.
La principal regulación de la glucemia se
realiza por hormonas. Las principales son: glucagon,
insulina, epinefrina, gluco-corticoides y las hormonas
tiroideas.
Cuando la concentración de glucosa
disminuye, como en el ayuno, el páncreas secreta
glucagón El resultado neto es que en el hígado se
detienen las vías de utilización de la glucosa
(glucogénesis y glucólisis) y se activan las vías
productoras
de
glucosa
(glucogenólisis
y
gluconeogénesis). Por otra parte, la disminución en el
consumo de glucosa por los tejidos insulinodependientes (músculo y tejido adiposo), causada
por la disminución en los niveles de esta hormona,
contribuye a preservar la glucosa para que pueda ser
utilizada por el cerebro, ya que la glicemia inferior a
los 60 mg/dl, provoca que este órgano no reciba las
cantidades de glucosa suficientes para obtener la
energía necesaria para realizar adecuadamente sus
funciones, por lo que, si esta situación se prolonga,
pueden sobrevenir el coma y la muerte. Otras
hormonas que intervienen para aumentar la glucemia
en el caso de ayunos prolongados son los
glucocorticoides, quienes provocan la hidrólisis de
proteínas musculares a fin de proveer de sustratos
gluconeogénicos al hígado, mientras que las
hormonas tiroideas estimulan la glucogenólisis
hepática.
Por otro lado, cuando la glucemia aumenta,
como después de una dieta rica en carbohidratos, los
islotes de Langerhans detectan este aumento y
secretan insulina. Esta hormona produce un
incremento en el transporte de glucosa al interior del
músculo y del tejido adiposo, por los receptores
GLUT 4 y, activa la glucógeno sintasa, tanto
muscular como hepática. De esta manera, la
glucemia disminuye y los depósitos de glucógeno
hepático y muscular aumentan.
El aumento de los valores de glucosa en
sangre presenta algunos efectos fisiológicos que
pueden explicarse por las propiedades osmóticas y
químicas de la glucosa. Entre dichos efectos se
encuentran la deshidratación de los tejidos y el
envejecimiento de proteínas. En el primer caso, la
salida del agua al torrente circulatorio causa que los
tejidos pierdan, además del agua, algunos iones
importantes, como el potasio. En el segundo caso,
las concentraciones altas de glucosa sanguínea
(superiores a 120 mg/dl) aceleran el envejecimiento
proteínico por glucosilación no enzimática o glicación.
La glucosa reacciona con los grupos amino
expuestos de las proteínas y cambia las propiedades
catalíticas y estructurales de las mismas. La
hemoglobina, la colágena, las proteínas del cristalino
y muchas más sufren glicación en proporción a la
concentración de glucosa en la circulación. Este
efecto permite comprender el origen de algunas de
las complicaciones que aparecen en el caso de los
diabéticos, como la aparición de cataratas por la
glicación irreversible de las proteínas del cristalino, o
los elevados niveles de hemoglobina glicada
(hemoglobina A1c), que en los diabéticos llegan a ser
de dos a tres veces mayores que en los individuos
normales. El nivel de hemoglobina A1c revela la
concentración de glucosa en sangre durante un
período de varias semanas, por lo que su
determinación puede ser muy útil para comprobar si
los pacientes diabéticos han sido tratados
adecuadamente.
55
E. Lípidos
Al finalizar esta subunidad, el alumno explicará las
características principales de los lípidos, sus
estructuras, el papel que desempeñan en los seres
vivos, así como su digestión y absorción.
E.1
E.2
Estructura.
E.1.1 Definirá qué son los lípidos, cuál es
su importancia biológica.
E.1.2 Conocerá
las
propiedades
fisicoquímicas
de
los
lípidos:
solubilidad,
naturaleza
química,
apolaridad.
E.1.2 Reconocerá las fórmulas de los
lípidos que emplea la célula: ácidos
grasos,
triacigliceroles,
fosfoglicéridos
y
glicolípidos,
terpenos y esteroides.
E.1.3 Clasificará a los lípidos con base en
su composición, en su grado de
complejidad y en su grado de
polaridad.
E.1.4 Identificará a los lípidos como los
componentes principales de las
membranas celulares y relacionará el
contenido y las características
químicas de los lípidos con la
impermeabilidad y fluidez de la
membrana.
E.1.5
Mencionará las diferencias en cuanto
a la asimetría y la composición de las
membranas celulares (citoplasmática
y mitocondrial).
Digestión, absorción y transporte.
E.2.1
E.2.2
E.2.3
Señalará la fuente dietética de los
lípidos.
Conocerá el mecanismo por el cual
el organismo realiza la digestión y
absorción de los lípidos.
Conocerá el transporte de los lípidos
de la dieta en el organismo
(quilomicrones).
Los lípidos son sustancias biológicas solubles en
solventes orgánicos, pero escasamente solubles en
el agua. Pertenecen a este grupo moléculas tan
diversas como las grasas, los aceites, algunas
vitaminas y hormonas, así como todos los
componentes no proteicos de las membranas.
Los lípidos pueden clasificarse en dos
grandes grupos: los saponificables y los no
saponificables. Los primeros tienen la característica
de que, en soluciones alcalinas, se hidrolizan
produciendo ésteres de ácidos grasos, mientras que
los segundos no son objeto de hidrólisis alcalina. A
los
lípidos
saponificables
pertenecen
los
acilgliceroles, los fosfoacilgliceroles, los esfingolípidos y las ceras, mientras que en el grupo de los
lípidos insaponificables encontramos los terpenos,
los esteroides y las prostaglandinas, así como los
compuestos relacionados con éstos. Asimismo,
existen lípidos con un grupo extremo polar y otro
grupo opuesto no polar. Este grupo se conoce como
lípidos anfipáticos y son los responsables de
estabilizar las emulsiones o forman parte de la bicapa
lipídica de las membranas.
Los
ácidos
grasos
biológicamente
importantes son ácidos monocarboxílicos con
cadenas alifáticas de diverso tamaño, con un número
par de átomos de carbono, que pueden ser saturados
o insaturados. En el caso de los insaturados, los de
origen natural son isómeros geométricos cis; pueden
ser monoinsaturados o poliinsaturados y son líquidos
a temperatura ambiente. Los ácidos grasos
poliinsaturados no son sintetizados en el organismo
por lo que se consideran esenciales. En soluciones
fisiológicas se encuentran en forma ionizada
formando sales o "jabones". Los ácidos grasos de
cadena larga son insolubles en agua, pero los
jabones forman micelas. Los ácidos grasos forman
ésteres con alcoholes y tioésteres con la coenzima A.
Las prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos son
derivados de ácidos grasos poliinsaturados de 20
carbonos, especialmente del ácido araquidónico.
Los acilgliceroles son compuestos en los que
uno o más de los grupos hidroxilo del glicerol están
esterificados. Pueden dividirse en monoacilgliceroles,
diacilgliceroles
y
triacilgliceroles.
En
los
triacilgliceroles los tres grupos hidroxilo están
56
esterificados con ácidos grasos, que pueden o no ser
iguales. Las propiedades de los triacilgliceroles están
determinadas por la naturaleza de sus ácidos grasos
componentes y se dividen en aceites (líquidos) o
grasas (sólidos) de acuerdo con la longitud de sus
cadenas o con su grado de saturación. Los
triacilgliceroles son hidrofóbicos y no forman micelas.
Los fosfoacilgliceroles o fosfoglicéridos son
derivados del ácido fosfatídico, es decir, del Lglicerolfosfato esterificado con dos ácidos grasos. El
ácido fosfatídico se esterifica, a su vez, a través de
su grupo fosfato, con un alcohol y forma las diversas
familias de fosfoglicéridos, las cuales poseen un
carácter anfipático.
Los plasmalógenos son glicerofosfolípidos en
los que la posición 1 del glicerol fosfato está
combinado con un alcohol de cadena larga mediante
una unión tipo éter.
Los esfingolípidos son lípidos complejos
derivados de un alcohol insaturado llamado
esfingosina, el que se une con un ácido graso de
cadena larga por medio de un enlace amida para
formar una ceramida. Las esfingomielinas contienen
una ceramida esterificada con fosforilcolina o
fosforiletanolamina. Cuando la ceramida se combina
con un azúcar forma los glucoesfingolípidos, que
pueden subdividirse en cerebrósidos (si sólo
contienen una unidad de azúcar), sulfátidos
(contienen un sulfato esterificado en la unidad de
azúcar) y gangliósidos (contienen oligosacáridos con
uno o más ácidos N-acetilneuramínicos).
Los
esteroides
son
derivados
del
ciclopentanoperhidrofenantreno. El núcleo esteroide
es una estructura rígida, casi plana, no polar. Los
esteroides más importantes son el colesterol y sus
derivados (los ácidos biliares, las hormonas
esteroidales
–estrógenos,
progestágenos,
glucocorticoides, mineralcorticoides y andrógenos– y
la vitamina D que, aunque no es propiamente un
esteroide, deriva del colesterol).
Los terpenos son polímeros de dos o más
unidades de isopreno, que pueden ser lineales o
cíclicos, con dobles enlaces trans en su mayoría. Las
vitaminas A y K, así como el escualeno, pertenecen a
este grupo.
En la dieta, la grasa constituye cerca de 60 g,
de los cuales 90% son triacilgliceroles. Es de todos
conocida la dificultad para digerir la grasa, que en
mucho está determinada por su casi nula solubilidad
en agua. Esto ocasiona que se aglomere la grasa y
que forme vacuolas, lo que impide que sea atacada
fácilmente por las enzimas digestivas. Para facilitar
su hidrólisis, durante el proceso digestivo que se
inicia en la boca la lipasa lingual hidroliza algunos
triacilglicéridos y produce ácidos grasos libres y
monoacilglicéridos que, junto con otros ácidos grasos
libres, posibilitan que las vacuolas de grasa se hagan
más pequeñas y formen gotitas. Tanto los
monoacilglicéridos como los fosfolípidos funcionan
como factores tensoactivos. La acción de esta lipasa
lingual es muy breve ya que, al llegar al estómago, es
inhibida por el pH ácido y es hasta llegar al duodeno
donde se continúa el proceso de digestión. Puede
considerarse que la dificultad de la digestión de los
lípidos se supera si se aumenta el área entre la fase
acuosa y la lipídica y se logra un aumento en la
solubilización de los productos de hidrólisis con
detergentes (sales biliares). El aumento del área y la
solubilización suceden cuando en el duodeno, por
efecto de la colecistocinina, que es una hormona
secretada por la llegada de los lípidos al duodeno, se
estimula la contracción de la vesícula biliar con la
consecutiva salida de sales biliares y otros lípidos,
que forman agregados que reciben el nombre de
micelas mixtas; éstas son diferentes a las gotitas
emulsionadas. La acción de las sales biliares es
romper la tensión superficial de la gotita de grasa
favoreciendo la interacción con el agua y su
fragmentación; así se origina la micela. Este proceso
también recibe el nombre de emulsificación. Al
mismo tiempo, la lipasa pancreática, que es
secretada como proenzima, hidroliza, al igual que la
lingual, la unión alfa éster de los triacilglicéridos y
deja libres dos ácidos grasos y un monoacilglicérido
que también serán emulsificados por las sales
biliares.
Además de la lipasa, el jugo pancreático
contiene otras esterasas que actúan sobre los
ésteres de colesterol, monoacilglicéridos y los
ésteres de vitamina A. Los fosfolípidos son
hidrolizados por fosfolipasas específicas, pero la más
abundante en el jugo pancreático es la fosfolipasa A2
que hidroliza la unión éster beta del ácido graso. La
presencia de sales biliares es necesaria para la
57
absorción de otros lípidos, como el colesterol y las
vitaminas A y K.
Se ha calculado que una persona sana
absorbe cerca de 70 a 90% de los lípidos, tanto
exógenos como endógenos; otro de los productos
derivados de la hidrólisis de los acilglicéridos, el
glicerol, se absorbe por difusión facilitada. Las sales
biliares son absorbidas en forma muy eficaz por el
intestino y son llevadas por la vena porta
nuevamente al hígado, de ahí a la bilis y una vez más
al intestino; a esta circulación de las sales biliares se
le llama circulación enterohepática.
En la célula intestinal los lípidos son
resintetizados formando triacilglicéridos por efecto de
una enzima que activa a los ácidos grasos y los une
a los monoacilglicéridos; también se forman
fosfolípidos y ésteres de colesterol. La absorción de
los lípidos y la actividad del retículo endoplásmico
liso de la célula intestinal dan como resultado la
formación de vesículas que se enriquecen con
proteínas (apoproteínas), lo que genera los
quilomicrones, partículas ricas en triacilglicéridos.
F.
Metabolismo de los lípidos
Al finalizar esta subunidad, el alumno podrá definir en
forma integral el metabolismo de los lípidos en
relación con su función como combustibles. Analizará
la regulación del metabolismo de los lípidos en
algunos estados fisiológicos.
F.1
Oxidación de los ácidos grasos (ß-oxidación).
F.1.1 Describirá la reacción de activación
de los ácidos grasos en el citoplasma
y el mecanismo de transporte al
interior de la mitocondria.
F.1.2 Describirá las reacciones de la ßoxidación e identificará sus sustratos
y productos.
F.1.3 Conocerá las reacciones adicionales
necesarias para la oxidación de los
ácidos grasos insaturados y de
cadena impar.
F.1.4 Calculará el número de moléculas de
ATP generadas en la oxidación
completa del ácido palmítico y
señalará los tejidos que dependen
energéticamente de esta vía.
Los ácidos grasos almacenados en los tejidos son
utilizados por la célula para la producción de energía
en magnitudes que varían de tejido a tejido, así como
del nivel metabólico del organismo. Son los
músculos, principalmente el cardiaco y el esquelético,
los que más dependen de los ácidos grasos como
fuente de energía.
La mayoría de los ácidos grasos que se
oxidan en los tejidos provienen de los triacilglicéridos
del tejido adiposo, desde donde son liberados por la
acción de la enzima lipasa sensible a hormonas y
transportados en la circulación como complejos
albúmina-ácidos grasos. Al llegar al hígado y a las
células de otros tejidos, el ácido graso es activado en
el citosol mediante la acción de la acil coenzima A
sintetasa (tiocinasa) con gasto de ATP, en esta
reacción se produce un acil coenzima A (acil CoA) y
AMP. El proceso de oxidación del ácido graso se
realiza dentro de la mitocondria; sin embargo, su
membrana es impermeable a los ácidos grasos y
derivados del acil CoA, por lo que se requiere de un
transportador: la molécula de carnitina es la
encargada de llevar al ácido graso al interior de la
mitocondria. Una vez dentro de la mitocondria, el acil
CoA sufre una serie de cambios que permiten
obtener un fragmento de dos carbonos, la acetil CoA.
Los cambios preparan al acilo para quedar
nuevamente activado y éstos son realizados por: a)
Una deshidrogenasa que requiere de FAD y
transforma al grupo acilo en uno enoilo (molécula con
un doble enlace entre el carbono alfa y beta); b) Una
hidratasa que elimina la doble ligadura y deja un
hidroxilo en el carbono beta. Esta molécula se llama
β-hidroxiacil-CoA; c) Otra deshidrogenasa específica,
+
cuya coenzima es el NAD , transforma el grupo
hidroxilo de la posición beta en un grupo ceto; d) Una
tiolasa que requiere de una coenzima A (HSCoA)
para unirla al carbono que tiene la nueva función
cetona y romper entre el carbono beta y alfa para
producir una molécula de acetil-CoA. Estas cuatro
enzimas siguen trabajando con el acil CoA que en
cada vuelta pierde dos carbonos como acetil CoA. Al
mismo tiempo, el FADH2 y el NADH obtenido en cada
58
ciclo de la oxidación generan 4 ATP en la cadena
respiratoria y las acetil CoA entran al ciclo de Krebs
para ser totalmente oxidadas con la ganancia de 10
ATP netos por cada acetil CoA que entra al ciclo. Así
tenemos que, por ejemplo, un palmitato (16C) genera
108 ATP al oxidarse hasta CO2 y H2O. Si
consideramos el gasto de la fase de activación del
ácido graso, obtenemos una ganancia neta de 106
ATP.
F.2
Síntesis
cetónicos.
F.2.1
F.2.2
F.2.3
F.2.4
y
utilización
de
los
cuerpos
Describirá la estructura de los
cuerpos cetónicos: acetoacetato, ßhidroxibutirato y acetona.
Conocerá las vías de síntesis y de
utilización de los cuerpos cetónicos e
indicará sus sustratos y sus
productos.
Señalará los tejidos involucrados en
la síntesis y utilización de los
cuerpos cetónicos.
Analizará la importancia fisiológica
de los cuerpos cetónicos en el
ayuno, la diabetes
y dietas
deficientes en carbohidratos.
Cuando bajan los niveles de glucosa se estimula la
gluconeogénesis a partir del oxaloacetato y se
incrementa la vía de oxidación de los ácidos grasos,
lo que provoca el aumento concomitante de los
niveles de acetil CoA. En el hígado, el exceso de
acetil CoA se transforma en un grupo de moléculas
conocidas genéricamente como cuerpos cetónicos.
La vía de síntesis de los cuerpos cetónicos
(cetogénesis) se inicia con la condensación de dos
moléculas de acetil coenzima A; al producto de la
reacción, acetoacetil CoA, se le une una tercera
molécula de acetil CoA para formar el ß-hidroxi-ßmetil glutaril CoA. Esta molécula, al romperse por
una liasa (HMGCoA liasa), produce una acetil CoA y
un ácido acetoacético o acetoacetato. Este producto
+
se reduce con NAD y forma el ß-hidroxi-butirato; el
acetoacetato,
por
una
descarboxilación
no
enzimática, produce la acetona.
El acetoacetato es utilizado por otros
órganos, como el músculo cardiaco y el cerebro,
donde, por acción de una transferasa en presencia
de succinil coenzima A, se transforma en acetoacetilCoA, molécula que se rompe por una tiólisis, en
presencia de otra CoA para formar dos acetil CoA; la
enzima responsable de esta reacción es una tiolasa.
Las dos acetil CoA resultantes son oxidadas para la
obtención de energía en los órganos mencionados.
Al incremento de acetoacetato en la sangre
se le llama cetonemia. Puede deberse a una
deficiencia en el metabolismo de los carbohidratos
con el consiguiente aumento en el catabolismo de las
grasas y la desviación de la acetil CoA a la síntesis
de cuerpos cetónicos. Algunos ejemplos de
situaciones en las que ocurre lo anterior son: la
diabetes, el ayuno prolongado y la dieta deficiente en
carbohidratos.
F.3
Síntesis de ácidos grasos.
F.3.1
Indicará
las
fuentes
de
los
alimentadores de la ß-reducción:
acetil CoA y NADPH. Mencionará el
papel del citrato y de las lanzaderas
(malato-aspartato y citrato) como
transportadores
del
acetil-CoA
mitocondrial.
F.3.2
Describirá la síntesis de novo de un
ácido graso e indicará las enzimas
involucradas, sustratos, coenzimas y
productos.
F.3.3
Describirá las reacciones necesarias
para el alargamiento e insaturación
de los ácidos grasos, así como la
localización
subcelular
de
los
sistemas involucrados en este
proceso.
F.3.4
Señalará la fuente de los carbonos
del ácido palmítico y calculará el
gasto energético de la síntesis de
dicho ácido.
F.3.5
Conocerá la función de los ácidos
grasos
poliinsaturados
como
precursores de prostaglandinas,
tromboxanos,
leucotrienos
y
lipoximas e indicará la función de
59
estos eicosanoides en el organismo
humano.
Cuando el requerimiento de energía en la célula ha
sido satisfecho y existen suficientes sustratos
oxidables, procede su almacenamiento bajo la forma
de triacilglicéridos que constituyen la reserva de
energía a largo plazo más importante de las células y
del organismo. El primer paso de este proceso es la
biosíntesis de los ácidos grasos, la cual se realiza en
el citoplasma celular a partir de la acetil CoA, el ATP
y el NADPH proveniente del ciclo de las pentosas y
de otros sistemas generadores de poder reductor.
La biosíntesis de los ácidos grasos se inicia
con la salida de la acetil-CoA desde la mitocondria en
forma de citrato y su transformación en malonil CoA
mediante la fijación del CO2 por una sintetasa
dependiente de biotina, que utiliza ATP. Tanto la
acetil CoA como la malonil-CoA se unen a un
complejo multienzimático llamado sintetasa de los
ácidos grasos. Este complejo está formado por un
conjunto de proteínas enzimáticas dispuestas
alrededor de la proteína transportadora de acilos
(PTA). En pasos sucesivos ocurre la condensación
de la acetil y la malonil CoA con desprendimiento de
CO2 y el resto del acetoacetilo de cuatro carbonos es
llevado por el brazo central de la PTA a los sitios
activos de las enzimas del complejo para
transformarlo, sucesivamente, en hidroxiacilo, enoilo
y acilo saturado, mediante el gasto de dos NADPH.
El ciclo se repite al incorporar dos carbonos del
malonil-CoA en cada vuelta, hasta que se completa
el ácido palmítico, un ácido graso saturado de 16 C.
El citrato desempeña un papel muy
importante en la síntesis de los ácidos grasos ya que
al salir al citoplasma se convierte en acetil CoA y
oxaloacetato. Este proceso alimenta con carbonos a
la síntesis de los ácidos grasos y aporta NADPH por
la acción de la enzima málica sobre el sistema
oxaloacetato-malato-piruvato. Por otra parte, el
citrato es un modulador positivo de la malonil CoA
sintetasa (también llamada acetil CoA carboxilasa),
que es la principal enzima reguladora de la síntesis
de los ácidos grasos.
F.4
Síntesis y degradación de triacilgliceroles.
F.4.1
F.4.2
F.4.3
F.4.4
F.4.5
Conocerá la estructura química y la
distribución
tisular
de
los
triacilglicéridos en función de su
carácter
de
combustible
con
importancia fisiológica.
Describirá la vía de degradación de
los tri-acilglicéridos (lipólisis) e
identificará sus enzimas, sustratos,
productos y función en el organismo.
Señalará las fuentes de sustratos
para la síntesis de triacilglicéridos:
acil CoA y glicerol fosfato.
Describirá la síntesis de los
triacilglicéridos
(lipogénesis)
e
identificará sus intermediarios y
enzimas.
Explicará
tanto
la
regulación
hormonal como la metabólica de la
lipólisis y de la lipogénesis e indicará
el papel de la concentración de
sustratos y productos de las vías, así
como el estado energético celular.
Una vez formados los ácidos grasos procede la
lipogénesis o síntesis de los triacilglicéridos: dos
ácidos grasos activados como acil CoA reaccionan
con una molécula del glicerol fosfato para formar el
ácido fosfatídico. Esta última molécula es precursora
de los triacilglicéridos y de los fosfolípidos. Para
sintetizar los primeros se hidroliza el fosfato, con
producción del diacilglicerol, el cual recibe enseguida
otra molécula de acil CoA, con la cual se completa el
triacilglicérido. La mayoría de las enzimas
participantes en este proceso son aciltransferasas y
tiocinasas.
En el organismo humano la acción de la
insulina estimula todo el proceso de la lipogénesis al
favorecer la entrada de la glucosa a los adipocitos, el
ciclo de las pentosas, la descarboxilación del
piruvato, la biosíntesis de los ácidos grasos y la
acumulación de los triacilglicéridos.
La hidrólisis de los triacilglicéridos en el tejido
adiposo, llamada también lipólisis, es estimulada a
nivel de la triacilglicérido lipasa en una acción
mediada a través de AMP cíclico, por numerosas
hormonas entre las cuales se cuentan: la epinefrina,
el glucagón, los glucocorticoides, la tiroxina y el
60
ACTH; mientras que es inhibida por la insulina y por
el incremento de la concentración de ácidos grasos
libres. La hidrólisis se completa por la acción de la
diacilglicérido lipasa y la monoacilglicérido lipasa que
en conjunto liberan un glicerol y tres ácidos grasos de
cada triacilglicérido.
F.5
de la cabeza polar de la fosfatidiletanolamina por una
serina.
Las fosfatidilcolinas proporcionan ácidos
grasos para la síntesis de los ésteres de colesterol de
las HDL por la reacción de LCAT, mientras que la
dipalmitoilfosfa-tidilcolina es el principal componente
del surfactante pulmonar.
Síntesis y degradación de fosfolípidos.
F.5.1
Describirá la síntesis de novo de los
fosfoglicéridos
y
de
los
esfingolípidos,
indicando
los
sustratos, intermediarios, enzimas y
productos de las vías.
F.5.2 Describirá la degradación de los
fosfoglicéridos
y
de
los
esfingolípidos.
La síntesis de los fosfoglicéridos es similar en los
pasos iniciales a la síntesis de los TAG: el glicerol 3fosfato se esterifica con dos acil CoA para formar
ácido fosfatídico. Este compuesto es el precursor de
todos los fosfoglicéridos. Existen dos estrategias para
la obtención de los fosfolípidos que contienen
glicerol, según la naturaleza de la cabeza polar.
En la formación de fosfatidilinositoles y de
cardiolipina, el ácido fosfatídico reacciona con CTP
para formar CDP-diacilglicerol, el cuál reacciona con
la cabeza polar (inositol o fosfatidilglicerol) para
formar el fosfoglicérido correspondiente.
El fosfatidilinositol puede ser fosforilado para
formar la familia de los fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato.
Estos compuestos son hidrolizados por la fosfolipasa
C en respuesta al estímulo de algunas hormonas y
producen dos segundos mensajeros muy potentes:
IP3 y el diacilglicerol, los cuales causan movilización
2+
de Ca del retículo endoplásmico y proveen de ácido
araquidónico para la síntesis de prostaglandinas,
tromboxanos y leucotrienos.
En la síntesis de fosfadiletanolamina y de
fosfatidilcolina, el ácido fosfatídico pierde su fosfato y
el diacilglicerol resultante reacciona con CDP-colina o
CDP-etanolamina.
La fosfatidiletanolamina también puede
obtenerse por descarboxilación de fosfatidilserina y la
fosfatidilcolina por metilación de fosfatidiletanolamina,
utilizando S-adenosil metionina como donador de
metilos. La fosfatidilserina se obtiene por recambio
Degradación de fosfoglicéridos.
Los fosfoglicéridos son hidrolizados por diversos
tipos de fosfolipasas que se clasifican según su sitio
de acción: la fosfolipasa A1 libera los ácidos grasos
de la posición de 1; la fosfolipasa A2 los libera de la
posición 2. La fosfolipasa C libera la cabeza polar
fosforilada que se encuentra en la posición 3 del
glicerol, mientras que, la fosfolipasa D libera la
cabeza polar.
Síntesis de esfingolípidos
Los esfingolípidos contienen una molécula de
esfingosina en lugar del glicerol. Sus precursores son
serina y palmitoil CoA. Los ácidos grasos activados
(acil CoA) reaccionan con el grupo amino de la
esfingosina para formar las ceramidas, quienes son
las precursoras de esfingomielinas, cerebrósidos y
gangliósidos.
Las esfingomielinas se obtienen de la reacción de la
ceramida con CDP-colina.
Los cerebrósidos se obtienen por la unión
directa de galactosa o glucosa a la ceramida. El
donador del azúcar es UDP-galactosa o UDPglucosa.
Los gangliósidos se forman por la adición
secuencial y ordenada de residuos de azúcar a la
ceramida. Los donadores de estos azúcares son
UDP-azúcares o el CMP-NeuAc (ácido Nacetilneuramínico o ácido siálico).
Los esfingolípidos son degradados por
enzimas
lisosomales
(hexosaminidasas,
αgalactosidasa, la sialidasa o la esfingomielinasa)
hasta
dar
ceramidas
y
los
azúcares
correspondientes. Existen una serie de defectos
genéticos en los que faltan estas enzimas lo que
conduce a una acumulación de gangliósidos que
causan graves consecuencias a la salud.
F.6
Metabolismo del colesterol.
61
F.6.1
F.6.2
F.6.3
F.6.4
Mencionará la importancia fisiológica
del colesterol.
Describirá la vía de síntesis del
colesterol
e
identificará
sus
sustratos, intermediarios y enzimas.
Conocerá la regulación de la
colesterogénesis a nivel enzimático,
a nivel de la síntesis de las enzimas,
así como por modificación covalente
inducida por hormonas (glucagon,
insulina y ACTH).
Describirá las modificaciones que
sufre el colesterol para la síntesis de
sales biliares, hormonas esteroidales
y vitamina D.
El colesterol es una molécula muy importante por su
interés clínico y el gran número de compuestos que a
partir de él se sintetizan, como las hormonas
esteroidales, las sales biliares y la vitamina D.
La síntesis del colesterol (colesterogénesis)
es una vía citoplásmica que se inicia a partir de la
unión de tres moléculas de acetil CoA, las que
forman el ß-hidroxi-ß-metilglutaril-CoA, precursor del
mevalonato. La enzima que produce este último
compuesto en la colesterogénesis es la ß-hidroxi-ßmetil glutaril-CoA reductasa, dependiente de NADPH.
Después de tres fosforilaciones para activar la
molécula, el mevalonato se descarboxila para formar
el isopentenil pirofosfato, unidad isoprenoide de
todos los terpenos. El isopentenil pirofosfato se une
con uno de sus isómeros para formar el geranil
pirofosfato, de 10 átomos de carbono que, por
combinación con otra molécula de isopentenil
pirofosfato, forma el farnesil pirofosfato, de 15
carbonos. Dos moléculas de farnesil pirofosfato se
unen por un enlace especial (cabeza-cabeza) para
formar el escualeno, de 30 carbonos.
El escualeno se cicliza y, por cambios
sucesivos
de
oxidación, descarboxilación
y
reacomodo de electrones y grupos químicos, forma el
lanosterol, el zimosterol y finalmente el colesterol. La
vía de la colesterogénesis se regula principalmente
por colesterol endógeno o el que se obtiene a partir
de la dieta a nivel de la enzima ß-hidroxi-ßmetilglutaril-CoA reductasa.
El colesterol puede seguir diversos caminos:
a) Migra a la membrana, donde regula la fluidez de la
misma; b) Se transforma químicamente para producir
ácidos biliares por oxidación de su cadena lateral; c)
Pierde una cadena de seis átomos de carbono para
producir la pregnenolona, el precursor de todas las
hormonas esteroidales, sean progestágenos (como la
progesterona),
mineralcorticoides
(como
la
aldosterona), glucocorticoides (como el cortisol),
andrógenos (testosterona) y estrógenos (estrona y
estradiol); d) El colesterol también es precursor de la
vitamina D, que se obtiene por la ruptura del anillo B.
El colesterol se excreta principalmente como
sales biliares, aunque una parte puede eliminarse en
las heces como coprostanol, producto de la
degradación bacteriana del colesterol en el intestino
grueso.
F.7
Estructura
y
metabolismo
de
las
lipoproteínas.
F.7.1 Describirá los mecanismos de
transporte de los ácidos grasos
provenientes de la lipólisis y el de los
otros lípidos (TAG, ésteres de
colesterol y fosfolípidos) en el
organismo.
F.7.2 Conocerá la composición y la función
de las lipoproteínas (quilomicrones,
LDL, VLDL, HDL y Lp[a]).
F.7.3 Describirá el metabolismo de las
diferentes lipoproteínas.
Los lípidos son compuestos prácticamente insolubles
en agua que se transportan en el torrente circulatorio
mediante las lipoproteínas.
Las lipoproteínas son partículas globulares
de alto peso molecular con un núcleo formado por
lípidos hidrofóbicos –TAG y ésteres de colesterol–,
los cuales aportan la mayor parte de la masa de la
partícula, y por una sola capa superficial de
moléculas de fosfolípidos, colesterol y proteínas o
polipéptidos que rodean al núcleo y estabilizan la
partícula para que permanezca en solución dentro
del plasma.
La fracción proteica de las lipoproteínas se
conoce como apolipoproteína o apoproteína, de las
que se han aislado y caracterizado seis clases
62
principales: A, B, C, D, E y (a). Algunas de éstas son
integrales y no pueden ser removidas, en tanto que
otras pueden ser transferidas a otras lipoproteínas.
Las lipoproteínas principales que circulan en
el plasma humano se clasifican con base en su
densidad en quilomicrones, lipoproteínas de muy
baja densidad (LMBD o –según la sigla inglesa–
VLDL), las lipoproteínas de baja densidad (LBD o
LDL) y las lipoproteínas de alta densidad (LAD o
HDL). La densidad de las lipoproteínas refleja la
relación existente entre la cantidad de lípidos y de
proteínas.
Los quilomicrones transportan los lípidos de
la dieta desde el enterocito al tejido adiposo, la
glándula mamaria, el músculo y el hígado. Los lípidos
endógenos, principalmente los triacilglicéridos y el
colesterol se transportan desde el hígado a los
tejidos mediante las lipoproteínas VLDL. Las
apoproteínas características de las VLDL son la apo
B-100, apo-C y apo-E, de las cuales las dos últimas
son compartidas con los quilomicrones, los que
tienen además la apo-B48 y la apo-A. Tanto los
quilomicrones como las VLDL son llevados hasta los
capilares de los tejidos en donde su apo-CII activa a
la lipoproteína lipasa, quien hidroliza la mayor parte
de los triacilgliceroles de estas lipoproteínas hasta
glicerol y ácidos grasos, los que son tomados por los
tejidos para ser oxidados o almacenados en el tejido
adiposo.
Los restos de VLDL, que han perdido la
mayor parte de sus triacilgliceroles y algunas
apoproteínas y fosfolípidos, se convierten en LDL.
Las LDL contienen apo B-100 y transportan
colesterol a los tejidos.
Las lipoproteínas más pequeñas son las
HDL; éstas son ricas en fosfolípidos y proteínas y
dentro de sus funciones se cuenta el intercambio de
apoproteínas A, C y E con las demás lipoproteínas y
el transporte del colesterol extrahepático al hígado
(transporte inverso del colesterol).
El colesterol es transportado en la sangre por
tres diferentes lipoproteínas: las LDL (60 a 75%), las
HDL (15 a 35%) y las VLDL (10%). Las LDL y las
HDL tienen una función combinada en la
conservación del equilibrio del colesterol; las LDL
llevan el colesterol hacia las células y regulan la
síntesis de novo del colesterol en ellas; las HDL lo
eliminan de las células, es decir, captan el colesterol
liberado en el plasma procedente del recambio de
membranas y de células que mueren y lo llevan al
hígado para su metabolismo o excreción.
Además de las clases ya mencionadas de
lipoproteínas existe la lipoproteína (a) [Lp(a)], la cual
tiene una composición lipídica muy similar a la LDL,
contiene apoB-100 y una glucoproteína llamada
apo(a). La apo(a) es polimórfica (de longitud y
secuencia) y tiene una gran homología con el
plasminógeno. Esta homología es importante porque
la Lp(a) se asocia con el bloqueo de la activación del
plasminógeno y la consiguiente lisis de los coágulos
de fibrina, así como con la estimulación de la
proliferación de células musculares lisas, procesos
que pueden estar en el origen de lesiones
ateroscleróticas. Además, la apo(a) dificulta el
catabolismo mediado por el receptor de LDL al que
se fija e interfiere, de esta manera, con el
metabolismo y transporte del colesterol. La
concentración de Lp(a) en sujetos normales es de ~5
mg/dl; las cifras >30 mg/dl constituyen otro valor de
predicción de un alto riesgo de aterosclerosis y
trombosis.
F.8
Regulación y alteraciones del metabolismo
de lípidos.
F.8.1 Describirá el estado del metabolismo
lipídico y sus alteraciones en el
estrés,
obesidad,
dislipoproteinemias,
hígado
graso
e
hipercolesterolemias, quienes son
factores de riesgo de aterosclerosis.
F.8.2 Identificará el papel de la leptina en
la regulación del peso corporal y del
apetito.
Discusión de los casos clínicos 4 “Cetosis por
inanición. Obesidad” y 5 “Hipercolesterolemia y
aterosclerosis” ver pág. (178 y 179).
Lecturas recomendadas
1.
Libby P. Atherosclerosis the new view.
Scientific American. 2002; 286( 5): 28-37.
2.
NIH (National Institutes of Health) consensus
conference. Triglyceride, HDL, and coronary
heart disease. JAMA. 1993; 269 (4): 505-510.
63
3.
4.
5.
6.
Alba ZayasL, Pereira RG, Aguilar BA.
Lipoproteína (a): estructura, metabolismo,
genética y mecanismos patogénicos. Rev
Cub Invest Biomed. 2003; 22(1): 32-40.
Martínez AE, González MO. La leptina, una
hormona novedosa. Investigadores Médicos.
2003; IV (5):1097-1103.
Sabath EFS. Leptina. Rev Inv Clín. 2002; 54
(2): 161-165.
Villaseñor A. El papel de la leptina en el
desarrollo de la obesidad. Rev Endocrin
Nutr. 2002; 10 (3):135-139.
Los lípidos son compuestos que se han relacionado
con varias patologías.
La regulación del metabolismo lipídico se
ejerce en respuesta a las diferentes necesidades
energéticas y los estados de la dieta de un
organismo (ayuno-alimentación). La síntesis y la
degradación de los TAG y del colesterol son
procesos que afectan a todo el organismo, con sus
órganos y tejidos formando una red interdependiente
conectada por la corriente sanguínea. La sangre
transporta los TAG en forma de quilomicrones y
VLDL, los ácidos grasos en forma de complejos con
albúmina y el colesterol asociado a VLDL, LDL y
HDL. Las células pancreáticas perciben los estados
de la dieta del organismo y responden liberando
hormonas (insulina o glucagon) que regulan la
velocidad de las rutas opuestas del metabolismo de
lípidos y controlan si se han de degradar o sintetizar
los ácidos grasos, los TAG, los fosfolípidos o el
colesterol.
La regulación metabólica se puede ejercer a
corto plazo (disponibilidad de sustratos, interacciones
alostéricas y modificaciones covalentes) o a largo
plazo (control de la síntesis y degradación de las
enzimas). Otro nivel de regulación se relaciona con el
transporte de los lípidos de un tejido a otro.
Los lípidos más abundantes del organismo
son los TAG almacenados en el tejido adiposo, los
cuales se hidrolizan por la acción de una lipasa
sensible a hormonas como el glucagon, la epinefrina
y los glucocorticoides, obteniendo glicerol y ácidos
grasos que salen a la circulación. Estos últimos se
asocian a albúmina y se transportan al hígado,
corazón y músculo para ser oxidados hasta CO2 y
H2O, con la producción consecuente de ATP. Las
condiciones
fisiológicas
y
metabólicas
que
determinan la movilización de grasas del tejido
adiposo pueden ser alteradas por situaciones de
estrés (dolor, fiebre, infecciones, miedo, hemorragia,
hipoglucemia) en las que se estimula la
adenohipófisis, que secreta ACTH, induciendo la
secreción de glucocorticoides. La ACTH y los
glucocorticoides aceleran la hidrólisis de los TAG.
La concentración de los TAG almacenados
en los adipocitos depende de la velocidad de su
recambio (síntesis e hidrólisis). Cuando el
almacenamiento de energía en forma de TAG en el
tejido adiposo es excesivo, se establece una
condición llamada obesidad, la cual correlaciona con
un promedio de vida menor y con un aumento en
problemas de salud, principalmente de tipo
cardiovascular. Muchos factores conducen a ella,
pero la causa básica es una ingesta calórica por
encima de los requerimientos energéticos estándar.
El apetito se regula por la presencia de
compuestos antianoréxicos. La síntesis de estos
compuestos se ve afectada por la presencia de una
proteína pequeña que se libera por las células
adiposas: la leptina. La ausencia de esta proteína o
de su receptor en las células del hipotálamo
implicadas en la regulación del apetito se asocia con
la aparición de obesidad en ratones. Su papel está
actualmente en estudio en humanos.
Existen otras alteraciones de los lípidos
asociadas al metabolismo de las lipoproteínas. Estas
alteraciones se conocen en general como
dislipoproteinemias, en las que hay modificaciones
de los niveles de colesterol y/o TAG en sangre.
En las hipercolesterolemias familiares, los
receptores celulares para lipoproteínas de baja
densidad (LDL) son deficientes. Por lo tanto las LDL
no pueden ser captadas por las células y degradadas
por las enzimas lisosomales. El consecuente
incremento de LDL en sangre se asocia con
xantomas (depósitos de lípidos, frecuentemente
encontrados bajo la piel) y enfermedades de arterias
coronarias. En las hipertriacilgliceridemias se
encuentran bajos niveles de lipoproteína lipasa (LPL)
o apo CII (el activador de LPL) y TAG aumentados.
Estas deficiencias se asocian con xantomas
característicos e intolerancia a comidas ricas en
64
grasas. El tratamiento involucra dietas bajas en
ácidos grasos saturados y colesterol y el uso de
agentes
hipolipemiantes
como
las
resinas
secuestradoras de ácidos biliares, la niacina y los
inhibidores de la 3-hidroxi-3 metilglutaril- CoA (HMGCoA) reductasa.
En condiciones de estrés metabólico, la
capacidad para secretar VLDL no es suficiente para
la síntesis aumentada de TAG. Esto ocasiona que el
depósito de AG y TAG en el tejido hepático se vuelva
excesivo
estableciéndose una condición tóxica
llamada hígado graso. Sin embargo, el hígado graso
ocurre especialmente en condiciones tóxicas graves,
cuando la síntesis de las apolipoproteínas,
requeridas para la formación de VLDL, es inferior a la
disponibilidad de ácidos grasos, ocasionando su
acumulación.
Esta
situación
se
observa
frecuentemente en las personas que ingieren
constantemente grandes cantidades de etanol y una
dieta hipoproteica. La oxidación del etanol
proporciona la energía necesaria para mantener las
funciones celulares, pero también favorece la síntesis
de ácidos grasos debido a un aumento en la
disponibilidad de NADH y al aumento en la actividad
de la fosfatidato fosfohidrolasa.
Finalmente la obesidad, sobre todo el patrón
masculino de depósito centrípeto o visceral de la
grasa, favorece una dislipidemia aterogénica que se
caracteriza por el aumento de los TAG plasmáticos,
la disminución de HDL y la intolerancia a la glucosa.
La aterosclerosis involucra la formación de placas
ricas en lípidos en la íntima de las arterias. Las
placas empiezan como rayas grasas conteniendo
células espumosas, las cuales son inicialmente
macrófagos llenos de lípidos, particularmente ésteres
de colesterol. Estas lesiones primarias desarrollan
placas fibrosas que pueden ocluir la arteria y causar
un infarto cerebral o al miocardio. La formación de
estas placas está frecuentemente asociada como se
mencionó anteriormente, con anormalidades en el
metabolismo
de lipoproteínas plasmáticas. En
contraste con estas lipoproteínas, las lipoproteínas
de alta densidad (HDL) tienen un efecto protector.
Como parte de la estrategia general para limitar la
aterosclerosis hay que controlar la hipertensión, si
fuera necesario con farmacoterapia. La mayoría de
los enfermos con diabetes mellitus fallece a
consecuencia
de
aterosclerosis
o
sus
complicaciones. El control riguroso de la glucemia en
estos enfermos disminuye las complicaciones
microvasculares de la diabetes, por lo que se
recomienda prestar atención al control de la
glucemia.
La leptina es una hormona de naturaleza
proteica constituida por 167 aminoácidos que circula
en el plasma sanguíneo y regula el peso corporal y
los depósitos de grasa, a través de sus efectos en el
metabolismo y el apetito. En general, induce una
disminución en el apetito y un incremento en el gasto
energético.
La leptina es producida y liberada por el
tejido adiposo blanco fundamentalmente como una
señal de saciedad, aunque se ha visto también que
se produce en tejido adiposo marrón, en la placenta y
en algunos tejidos fetales, como el corazón, hueso y
cartílago.
La síntesis y la secreción de leptina están
directamente relacionadas con la cantidad de grasa
corporal y el tamaño del adipocito. Aunque factores
como la edad, el sexo, el índice de masa corporal, la
actividad física, el fumar, la hipertensión, el colesterol
en HDL, la concentración plasmática en ayuno de
triacilgliceroles, de glucosa y de insulina también
afectan la secreción de leptina. Así por ejemplo, la
concentración de la hormona es hasta cuatro veces
mayor en mujeres que en hombres. El fumar puede
traer cambios en el peso corporal, al modificar la
sensibilidad de los receptores del hipotálamo a la
leptina y en consecuencia modular la síntesis de
hormona, reduciendo el peso corporal.
El hipotálamo es el sitio de mayor acción de
leptina. La acción más importante de la leptina en
este órgano es la disminución en la producción del
neuropéptido Y (NPY). Las implicaciones de estos
cambios son las siguientes:
Incremento en el NPY
Incremento en la leptina
(disminución de leptina)
(diminución en el NPY)
Se presenta hiperfagia.
Hipofagia.
Aumento en la secreción de
Incremento
insulina mayor respuesta a la
energético.
en
el
gasto
insulina en tejido adiposo.
Aumento de peso.
Pérdida de peso.
65
proceso;
señalará
sus
consecuencias fisiológicas.
G.1.7 Identificará a los aminoácidos
precursores
de
α-cetoglutarato,
piruvato, acetoacetato, fumarato y
oxaloacetato.
G.1.8 Identificará a los aminoácidos
precursores
de
las
siguientes
aminas: acetilcolina, catecolaminas,
serotonina, carnitina, poliaminas y
creatinina.
G.1.9 Conocerá las bases metabólicas de las
siguientes alteraciones congénitas
del
metabolismo:
acidemia
propiónica, acidemia metilmalónica,
hipervalinemia,
fenilcetonuria
y
alcaptonuria.
En general podemos decir que la concentración de la
leptina aumenta después de la ingesta de alimento y
disminuye durante el ayuno y la diabetes. La insulina
y los glucocorticoides aumentan la síntesis de esta
hormona, mientras que las catecolaminas, los
andrógenos y los ácidos grasos de cadena larga la
inhiben.
G. Metabolismo
nitrogenados
de
los
compuestos
Al finalizar esta subunidad, el alumno describirá los
procesos más importantes del metabolismo de los
compuestos nitrogenados.
G.1
Aminoácidos y proteínas.
G.1.1 Conocerá de manera general cómo
se realiza en el organismo la
digestión de las proteínas y la
absorción de los aminoácidos.
G.1.2 Identificará las fuentes nutricionales
de los aminoácidos.
G.1.3 Describirá
las
reacciones
de
transaminación y desaminación e
identificará la localización subcelular,
sustratos, enzimas y productos de la
actividad de estas enzimas.
G.1.4 Identificará el papel de la glutamina y
del
ácido
glutámico
en
el
metabolismo de los compuestos
nitrogenados. Describirá el papel de
la glutamino sintetasa, de la
glutamato deshidrogenasa, de las
transaminasas y de la glutaminasa
en
el
metabolismo
de
los
compuestos nitrogenados.
G.1.5 Señalará las causas de la toxicidad
del ión amonio y los mecanismos del
organismo para combatirla.
G.1.6 Describirá el proceso de síntesis de
la urea e indicará la localización
subcelular, sustratos, enzimas y
productos de la vía. Describirá la
regulación de la síntesis de urea, así
como los defectos en el metabolismo
que producen alteraciones en este
Realización de la práctica 8
"El efecto del
tetracloruro de carbono sobre las transaminasas” (ver
pág. 155).
Los aminoácidos son el sustrato más importante del
metabolismo nitrogenado en los organismos
superiores pues de ellos derivan proteínas, purinas,
pirimidinas, porfirinas, péptidos y hormonas, entre
otros compuestos y, además, sus esqueletos
carbonados se oxidan para liberar energía.
Todos los aminoácidos de los sistemas vivos
se encuentran como parte de un “pool” o poza
(reserva) metabólica cuya magnitud se mantiene
constante mediante un equilibrio entre la entrada y la
salida de aminoácidos. Desde la poza, los
aminoácidos son llamados hacia sus diferentes
destinos metabólicos:
1. Participar en el proceso de la nutrición por medio
de la síntesis de nuevas proteínas.
2. La síntesis de compuestos nitrogenados no
proteicos.
3. Su entrada a la gluconeogénesis para sintetizar
glucosa.
4. Su degradación oxidativa para la producción de
energía.
1.
Nutrición. Los aminoácidos son oxidados
constantemente en los animales y el nitrógeno
excretado tiene que ser repuesto para mantener un
66
balance nitrogenado que, en los adultos normales,
se encuentra en equilibrio; en los jóvenes, las
embarazadas y los convalecientes es positivo y en
los ancianos, los enfermos y los desnutridos el
balance nitrogenado es negativo.
Los aminoácidos ingresan al organismo
humano formando parte de las proteínas de la
dieta que, por lo general, aportan alrededor de 10%
de las kilocalorías diarias; sin embargo, el valor
principal de los aminoácidos recibidos reside en el
aporte de las estructuras moleculares que el
organismo humano no puede sintetizar por sí
mismo y que son los aminoácidos indispensables o
esenciales cuya presencia determina en gran parte
la calidad de la dieta; ellos son: ARGinina, LISina,
METionina,
HIStidina,
TREonina,
VALina,
FENilalanina, LEUcina, IsoLEucina y TRIptofano
(ALM-HTV-FLIT).
Compuestos nitrogenados. Los aminoácidos
participan en la síntesis de numerosos compuestos
nitrogenados que no son proteínas, por ejemplo,
los oligopéptidos glutatión y carnosina; las bases
nitrogenadas de los ácidos nucleicos y los
fosfolípidos;
las
hormonas
derivadas
de
aminoácidos como la epinefrina, tiroxina y
serotonina; las hormonas peptídicas como el
glucagón, la ACTH y la oxitocina; los
neurotransmisores como la dopamina y el
aminobutirato gamma; los neuropéptidos como las
endorfinas y los factores liberadores; las porfirinas
como el grupo hemo; los pigmentos como la
melanina; las aminas como la histamina y varios
compuestos más.
3. Gluconeogénesis. Una porción considerable de la
síntesis diaria de glucosa que se realiza en el
hígado se hace a partir de los aminoácidos que
reciben, por esto, el nombre de aminoácidos
glucogénicos. Con la excepción de la leucina y la
lisina, todos los aminoácidos tienen la capacidad
de aportar todo o parte de su esqueleto carbonado
para que se incorpore a la síntesis de la glucosa y
esto se logra, en un primer paso, mediante la
pérdida del grupo amino por transaminación, lo
cual deja libre la cadena carbonada bajo la forma
de un cetoácido.
2.
Los cetoácidos mitocondriales resultantes:
alfa-cetoglutarato,
succinil-CoA,
fumarato,
oxaloacetato y piruvato confluyen hacia la
formación del oxaloacetato citoplásmico que
ingresa al eje central del metabolismo y se
transforman en fosfoenol piruvato que alimenta la
gluconeogénesis. Dos moléculas de este último
siguen el reverso de la vía glucolítica hasta su
transformación en glucosa.
4. Oxidación. Para la oxidación de su esqueleto
carbonado los aminoácidos pierden primero al
grupo amino, lo cual se lleva comúnmente a cabo
mediante la transaminación acoplada a la
desaminación
oxidativa
(transdesaminación),
proceso reversible en el cual un aminoácido
transamina primero con el alfa-cetoglutarato y le
transfiere su grupo amino para formar glutamato y
éste es desaminado enseguida por la glutamato
deshidrogenasa con producción de NADH y
liberación de amonio. El metabolismo del esqueleto
de carbono se aparta entonces de la ruta seguida
por el grupo amino ya que, para el primer caso, los
carbonos pueden ser llevados hacia la oxidación
en el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria, o
bien, incorporarse a la gluconeogénesis en el
hígado para la síntesis de glucosa; en tanto que el
ion amonio será transportado hasta el hígado en
donde será tomado por la vía metabólica del ciclo
de la urea.
La oxidación del esqueleto carbonado de
los aminoácidos procede mediante su agrupación
en “familias” o grupos de aminoácidos que, al
transformarse en el metabolismo, confluyen hacia
alguno de los intermediarios de la glucólisis, la
descarboxilación del piruvato o del ciclo de Krebs.
Los glucogénicos son de la familia del:
Piruvato:Tre, Gli, Ser, Ala, Met, Cis y Tri
Alfa-cetoglutarato: Pro, His, Arg, Gln y Glu
Succinil-CoA: Ile, Val, Met
Fumarato: Tir, Fen, Asp
Oxaloacetato: Asn, Asp
Y los cetogénicos son de la familia del:
Acetoacetato: Leu, Tir, Fen
Acetoacetil-CoA: Tri, Lis
Acetil-CoA: Tre, Leu, Ile
67
El ciclo de la urea
El mecanismo de la transdesaminación permite el
acopio de los grupos amino de los diferentes
aminoácidos en la molécula del glutamato, la cual, al
ser
desaminada
oxidativamente
por
la
deshidrogenasa del glutamato, libera el ion amonio.
Dado que este compuesto es muy tóxico para el
sistema nervioso central, se elimina mediante la
síntesis de urea. Esta síntesis se lleva a cabo en el
hígado mediante un proceso metabólico denominado
el ciclo de la urea, la primera parte del cual se realiza
en la mitocondria y el resto en el citoplasma de la
célula hepática.
El ciclo de la urea (fig. III.2) que permite
mantener una muy baja concentración de amonio
libre, se inicia con la síntesis del carbamil fosfato a
partir del amonio y el CO2 con un gasto de 2 enlaces
de alta energía. El carbamil fosfato entrega el grupo
carbamino a la molécula de ornitina, la cual actúa
como portadora de grupos en las cuatro reacciones
del ciclo:
1. Transferencia del carbamino a la ornitina para
formar citrulina: ornitina transcarbamilasa.
2. Condensación de la citrulina con el aspartato. Se
forma el arginino-succinato con gasto de 2ATP:
arginino-succinato sintetasa.
3. Ruptura del arginino-succinato. Se desprende
fumarato y se produce arginina: arginino-succinato
liasa.
4. Hidrólisis de la arginina para regenerar a la ornitina
y liberar urea: arginasa.
G.2.2 Con base en un esquema general de
la síntesis de las bases púricas y
pirimídicas
describirá
sus
mecanismos de regulación.
G.2.3 Identificará los sustratos y productos
de las vías de ahorro en la síntesis
de purinas.
G.2.4 Identificará
las
causas
y
consecuencias fisiológicas de la
sobreproducción de ácido úrico.
G.2.5 Describirá el efecto del alopurinol
sobre la xantina oxidasa y el que
ejercen
algunas
drogas
anticancerígenas,
como
la
mercaptopurina, el 5-fluorouracilo, el
metotrexato y la tioguanosina sobre
la síntesis de purinas y pirimidinas.
Discusión del caso clínico 6 "Gota" (ver pág.
En resumen, para formar una molécula de urea se
requiere de un ion amonio, un CO2 y un aspartato. Se
produce una molécula de fumarato y una de urea,
con gasto de cuatro enlaces de alta energía
provenientes del ATP.
G.2
Nucleótidos.
G.2.1
Conocerá
las
características
generales de las bases nitrogenadas,
los nucleósidos y nucleótidos:
estructura química y funciones.
181).
Los nucleótidos están formados por ribosa o
desoxirribosa, una base nitrogenada que puede ser
una purina o una pirimidina, y una, dos o tres
moléculas de ácido fosfórico. Dependiendo del
68
número de grupos de fosfato presentes, los
nucleótidos pueden ser mono, di, o trifosforilados.
Ácido fosfórico—Ribosa—Base nitrogenada
Los nucleósidos se diferencian de
nucleótidos en que no tienen ácido fosfórico.
los
Ribosa — Base nitrogenada
Las bases nitrogenadas pueden ser purinas o
pirimidinas. Las purinas están formadas por dos
anillos heterocíclicos (formados por diferentes tipos
de átomos), uno con seis miembros y otro con cinco
miembros, y son la adenina y la guanina. Las
pirimidinas están formadas por un anillo heterocíclico
de seis miembros y las más importantes son: uracilo,
timina y citosina.
Los nucleótidos y nucleósidos púricos tienen
funciones muy variadas en los seres vivos; entre las
más importantes están la de servir como sustratos
acarreadores de energía, segundos mensajeros,
neurotransmisores, coenzimas, etcétera.
Los nucleótidos pirimídicos intervienen como
acarreadores en la biosíntesis de polisacáridos y de
fosfolípidos. Los nucleótidos púricos y pirimídicos
forman parte de los ácidos nucleicos y
desoxirribonucleicos.
La síntesis de purinas se lleva a cabo en el
citoplasma celular y comprende las siguientes tres
fases:
1. Activación, en la que la ribosa 5 fosfato adquiere
dos moléculas de fosfato que se asocian al
carbono 1 de la molécula; esta reacción es llevada
a cabo por la fosforribosil pirofosfato sintetasa, la
cual es una de las enzimas reguladoras de la
síntesis de purinas y de pirimidinas.
2. Formación de los anillos heterocíclicos, en donde
varias enzimas intervienen añadiendo los
diferentes átomos que componen al anillo purínico
hasta formar inosina monofosfato.
La primera reacción, catalizada por la enzima
fosforribosilglicinamida sintetasa, es reguladora de la
síntesis de purinas y su velocidad depende de las
concentraciones de sus sustratos.
3. A partir de la inosina monofosfato se sintetizan la
guanosina monofosfato y la adenosina monofosfato
por medio de dos vías metabólicas que se regulan
mutuamente. Las altas concentraciones de GTP
estimulan la síntesis de AMP y las altas
concentraciones de ATP estimulan la síntesis de
GMP.
La síntesis de pirimidinas también se lleva a
cabo en el citoplasma y se inicia con la síntesis de
carbamilfosfato a partir de glutamina, CO2 y ATP en
una reacción catalizada por la enzima carbamilfosfato
sintetasa citoplasmática que es una reacción
parecida a la que ocurre en la mitocondria para la
biosíntesis de la urea; posteriormente, se adiciona
ácido aspártico para producir ácido orótico al cual se
une una molécula de fosforribosilpirofosfato y se
descarboxila para dar la uridina monofosfato. A partir
de ésta se sintetizan la citidina monofosfato y la
timidina monofosfato.
Las purinas se catabolizan por dos caminos
metabólicos:
1. En la vía del ahorro de las purinas, la adenina, la
hipoxantina o la guanina son reaprovechadas y,
por medio de la enzima fosforribosiltransferasa
correspondiente, se vuelve a formar el AMP, IMP o
GMP.
2. En una secuencia de reacciones cuyo producto
final es el ácido úrico, que es la forma en la que se
excretan las bases púricas.
El catabolismo de las pirimidinas se lleva a
cabo por una serie de reacciones cuyos productos
finales son la malonil-CoA y la metilmalonil CoA;
estos dos productos se catabolizan hasta CO2 y
agua. El exceso en el catabolismo de purinas genera
una sobreproducción de ácido úrico que tiende a
acumularse en las articulaciones distales, lo que
produce el síndrome de gota. Esto se debe a que el
ácido úrico es insoluble en ambientes con un pH
menor a 6.0, lo que hace que no se pueda eliminar
por la orina. Este síndrome se produce cuando las
concentraciones de purinas son altas, ya sea por
aporte elevado o por exceso en el catabolismo de las
mismas.
Los análogos de los nucleótidos se han
utilizado como inhibidores de algunas enzimas; por
ejemplo, la azaserina y la acivicina, análogos de la
glutamina, se usan como inhibidores de la enzima
glutamina amino transferasa que interviene en la
síntesis de purinas. El metotrexato y el 5-fluorouracilo
69
se usan como inhibidores de la síntesis de dTMP. La
aplicación de estos inhibidores en pacientes con
procesos neoplásicos da como resultado la
disminución de la síntesis del DNA y del crecimiento
celular.
El alopurinol se usa en el tratamiento del
síndrome de gota porque es un análogo de la
hipoxantina y actúa como inhibidor de la enzima
xantina oxidasa y de la producción de ácido úrico.
H.
Regulación e integración metabólica
Al finalizar esta subunidad, el alumno será capaz de
analizar los mecanismos de regulación del
metabolismo y de su integración en algunas
condiciones fisiológicas.
H.1
H.2
H.3
Conocerá cómo se lleva a cabo la regulación
del metabolismo.
Analizará los cambios adaptativos que
ocurren en las siguientes condiciones
normales y patológicas: ejercicio intenso,
embarazo-lactancia, vejez, ayuno, obesidad,
desnutrición, diabetes mellitus y gota.
Conocerá los mecanismos de acción
hormonal e identificará los receptores
membranales
y
las
cascadas
de
amplificación: la adenilato ciclasa (AMP
cíclico), la fosfolipasa C (fosfoinosítidos,
calcio) y la GMPc fosfodiesterasa (GMP
cíclico).
Realización de la práctica
Metabólica” (ver pág. 168).
10
"Integración
Lecturas recomendadas
1.
Scott JD, Pawson T. Cell communication the
inside story. Scientific American. 2000; 282
(6): 54-61.
2.
Kholodenko BN, Westerhoff HU. The
macroworld
versus
microworld
of
biochemical regulation and control. TIBS.
1995; 20: 52-54.
Las células y los organismos son sistemas
relativamente aislados en un estado casi
estacionario. Las funciones de los organismos vivos
como un todo o como sus partes están reguladas con
el objetivo de asegurar un máximo de supervivencia.
Ya que los sistemas vivos reaccionan en el espacio y
el tiempo, se emplea tanto una regulación en el
espacio y en el tiempo.
La regulación espacial se expresa a través
del grado de organización de las estructuras; el
mantenimiento de la estabilidad estructural de las
proteínas, en la asociación de las enzimas que
cooperan en los complejos multienzimáticos, su
localización
en
compartimentos
definidos
(mitocondria, retículo endoplásmico) y por la
especialización de células y tejidos mediante
procesos de diferenciación.
El tiempo está involucrado en la regulación
principalmente en términos de modificación de las
velocidades de reacción (metabólica, de transporte y
otras). En la práctica, se utilizan ambas dimensiones
simultáneamente.
En bioquímica una de las principales señales
para regular los procesos metabólicos es la
concentración de moléculas. Los mecanismos
regulatorios son efectivos a diferentes niveles de
organización pero sus bases son siempre
moleculares. Las funciones de un organismo pueden
regularse a través de reacciones que se realizan en
las células (regulación metabólica) y a nivel de todo
el organismo (control hormonal y nervioso). En una
célula, los procesos metabólicos están controlados
principalmente por regulación de la actividad de las
enzimas individuales.
Las enzimas pueden regularse de varias
maneras:
1. Cambiando la concentración de los sustratos
(como una señal metabólica) lo que resulta en
cambios en la actividad enzimática, permaneciendo
constante la cantidad de enzima involucrada. Los
cambios en la concentración de un compuesto
señal se logran muchas veces a través de la
compartimentalización, es decir, a través de
membranas que separan la célula del medio
extracelular y por los pequeños compartimentos en
el interior de la célula, éstas siendo separadas
espacialmente (por membranas) o funcionalmente
(por acarreadores).
2. Cambiando la concentración de los efectores
(activadores o inhibidores) en las enzimas
70
alostéricas. Al interactuar con el sitio alostérico de
la enzima, estos efectores pueden aumentar o
disminuir la actividad enzimática con base en los
cambios cooperativos de la conformación de las
subunidades que componen a la enzima. La
cantidad de la enzima alostérica no cambia durante
el proceso.
3.
Por inducción o por represión cuando, en
contraste con los dos mecanismos anteriores, la
cantidad de enzima y, por tanto, su actividad total
en el sistema cambian. La cantidad de enzima por
célula depende de la presencia de una proteína
represora que es codificada por un gen regulador y
que, en su forma activa, se une a una región del
DNA (operador) e impide la unión de la RNA
polimerasa al promotor. De esta manera, inhibe la
síntesis de algunas enzimas (represión). Algunos
compuestos de bajo peso molecular (inductores)
pueden interactuar con el represor y cambiarlo a
una forma inactiva que no puede inhibir la síntesis
de una enzima dada esto es la inducción de su
síntesis Fundamentalmente, no se abren nuevas
vías metabólicas, simplemente se liberan o se
bloquean las ya existentes, principalmente por el
principio de retroalimentación, en el que la
regulación se ejerce sobre la actividad de la
enzima en una forma prácticamente instantánea y
reversible.
Los sistemas multienzimáticos son aquellos
en los cuales las enzimas individuales están
organizadas de tal manera que el producto de una
reacción sirva como sustrato de la siguiente enzima.
Aquí, la regulación por retroalimentación juega un
papel importante, ya que el producto de una
secuencia de reacciones controla la actividad de una
de las enzimas precedentes, generalmente la primera
de la secuencia. El control por retroalimentación
generalmente es negativo, es decir, un aumento en la
concentración del producto inhibe a la enzima
regulatoria. En los sistemas multienzimáticos, una de
las reacciones parece ser la reacción limitante de la
velocidad, es decir, procede a su velocidad máxima
posible. Otra manera de regular los procesos es a
través de isoenzimas.
La regulación al nivel de un organismo
requiere la existencia de células y de estructuras
diferenciadas especiales con una función de control
(células nerviosas, glándulas endócrinas). Se sabe
que estas células producen ciertos compuestos que
pueden ser considerados como portadores de
información, señales que se transportan de una parte
del organismo a otra.
La regulación del metabolismo celular puede
llevarse a cabo por las hormonas, moléculas de
diversa naturaleza química que pueden alcanzar a
algunas células del organismo quienes presentan
receptores para ellas (tejidos blanco) y afectar su
función, Para aumentar la eficiencia de la regulación,
las hormonas se transportan a menudo de la célula
que las origina hasta el tejido blanco en asociación
con una proteína específica. Se ha asumido que el
proceso básico de la regulación hormonal es la unión
de la hormona a su receptor, el que puede
encontrarse en la superficie celular o en el
citoplasma.
En el primer caso la hormona no penetra en
la célula sino que, en algunos casos, reacciona con
una proteína asociada a la adenilato ciclasa, que a
su vez cataliza la formación de AMP cíclico a partir
de ATP. Por eso el AMP cíclico se conoce a menudo
como el "segundo mensajero" porque afecta a un
gran número de reacciones intracelulares (por
ejemplo, la activación de la proteína cinasa A). La
fosforilación de proteínas produce cambios en la
actividad de algunas enzimas claves en el
metabolismo de los carbohidratos y de los lípidos.
Otras hormonas, al interactuar con su receptor
extracelular activan a la fosfolipasa C, produciendo
los «segundos mensajeros» Inositol trifosfato y
diacilglicerol, los cuales regulan la concentración de
calcio citoplásmico, quien es una nueva señal de
regulación metabólica. Una tercera molécula que
actúa como segundo mensajero intracelular es el
GMP cíclico.
Existe otro mecanismo por el que actúan las
hormonas cuyo receptor se encuentra en la
membrana. En este caso, la interacción de la
hormona con el receptor, provoca que éste se
autofosforile y una vez ocurrido este evento, el
receptor fosforila a otras proteínas blanco. El proceso
secuencial fosforilación de proteínas, se convierte en
la manera en la que la señal se transmite a las
moléculas implicadas en la regulación de algunas
71
vías. La hormona insulina actúa mediante este
mecanismo.
Otras hormonas –como las esteroidales y las
tiroideas– cruzan la membrana celular y reaccionan
con una proteína receptora en el citoplasma. El
complejo viaja entonces hasta el núcleo donde, a
nivel del DNA, aumenta la producción del RNAm y
del RNAr específicos. Éstos controlan entonces la
síntesis de las enzimas que intervienen en la
regulación de los procesos metabólicos.
72
CONTENIDO TEMÁTICO
Tercera Unidad Temática
BIOLOGÍA MOLECULAR
73
IV
Biología molecular
Al finalizar esta unidad, el alumno será capaz de identificar las diferentes moléculas
informacionales de la célula y su organización; los mecanismos por los que fluye la
información genética; los mecanismos por los que se regula la expresión genética en los
diferentes estadios del ciclo celular, y el empleo de algunas técnicas de manipulación del
DNA útiles en medicina. La unidad se divide en:
A. Organización del genoma.
B. Flujo de la información genética.
C. Mutaciones y reparación del DNA.
D. Niveles de regulación de la expresión genética.
E. Virus, oncogenes y transformación.
F. Técnicas de manipulación del DNA.
A. Organización del genoma
Al finalizar esta unidad el alumno conocerá la
estructura de los ácidos nucleicos y sus
diferentes niveles de organización.
A.1 Estructura de los ácidos nucleicos.
A.1.1 Identificará
los
diversos
componentes de los ácidos
nucleicos
y
señalará
las
diferencias que existen entre el
DNA y los diversos tipos de RNA.
Conocerá el significado de los
patrones de metilación del DNA
como
mecanismo
de
identificación de su origen.
A.1.2 Reconocerá
las
diferentes
conformaciones del DNA (A, B y
Z).
A.1.3 Describirá
las
estructuras
primaria, secundaria y terciaria
de los ácidos nucleicos y hará
énfasis en lo dinámico de estas
moléculas.
La información genética es el conjunto de
datos que determinan la estructura y
propiedades funcionales en las células. La
información genética es almacenada en el
núcleo de los eucariotos en estructuras
llamadas cromosomas. En el caso de los
procariotos, el cromosoma se encuentra
disperso en el citosol. El núcleo es un
orgánulo separado del citoplasma por la
membrana nuclear, que de hecho, es una
doble membrana que presenta poros con un
diámetro de 30 a 100 nm, a través de los
cuales
las
macromoléculas
pueden
intercambiarse entre el citoplasma y el
núcleo. La membrana nuclear, además,
participa directamente en la duplicación del
74
DNA y permite la comunicación directa del
núcleo con el medio que lo rodea. La mayoría
del material nuclear está formado por
nucleoproteínas cuyo principal componente
es el ácido desoxirribonucleico (DNA); en un
núcleo en interfase las nucleoproteínas
forman filamentos de grosor variable (30 nm
en promedio). El grosor de estos filamentos
depende de la presencia o la ausencia de
proteínas que interactúan con la doble hélice
del DNA, mientras que su longitud depende
del peso molecular de las cadenas del DNA.
Así, un cromosoma contiene oléculas del
DNA de varios centímetros de longitud y
10
tiene aproximadamente 10
de peso
molecular.
Además
del
ácido
desoxirribonucleico, existe otro tipo de ácido
nucleico: el RNA. Se conocen tres tipos
diferentes del RNA: los RNA mensajeros
(RNAm), que llevan la información para una
cadena polipeptídica; los RNA ribosomales
(RNAr), que forman parte de la estructura de
los ribosomas y que son de diferente tamaño
(16S, 5S y 23S, en el caso de procariotos;
18S, 5S, 5.8S y 28S, en el caso de
eucariotos; los RNA 16S y 18S se
encuentran en la subunidad pequeña de los
ribosomas, mientras que los otros se
encuentran en la subunidad grande de los
mismos) y los RNA de transferencia (RNAt),
que sirven de adaptadores en el proceso de
síntesis de proteínas porque traducen el
mensaje codificado en nucleótidos a un
lenguaje de aminoácidos. En los organismos
eucariotos, los ácidos ribonucleicos (RNA) se
sintetizan en el núcleo.
Las moléculas del DNA son
polinucleótidos, o sea, cadenas compuestas
de mononucleótidos en las que la parte
externa de la estructura está constituida por
los esqueletos de desoxirribosa fosfato
unidos entre sí por enlaces fosfodiéster, de
tal manera que el grupo 5'-fosfato de la
desoxirribosa de un nucleótido está
esterificado con el grupo 3'-OH de la
desoxirribosa del nucleótido vecino. Las
moléculas de DNA contienen dos tipos de
bases nitrogenadas, dos bases pirimídicas
(timina T y citosina C) y dos bases púricas
(adenina A y guanina G). Estas bases se
1
1
unen entre el C de la desoxirribosa y el N
9
de las pirimidinas o el N de las purinas por
enlaces N-glucosídicos. La secuencia de
bases es altamente específica para cada
molécula del DNA.
Las moléculas del DNA en solución
presentan la estructura de una doble hélice
que gira a la derecha alrededor de un eje
común.
Las
dos
cadenas
son
complementarias,
corren
de
manera
antiparalela entre ellas. Se conectan entre sí
a través de puentes de hidrógeno que se
forman entre bases yuxtapuestas A-T (dos
puentes de hidrógeno) y C-G (tres puentes
de hidrógeno); las bases se mantienen
perpendicularmente al eje longitudinal de la
molécula del DNA. Además, se estabilizan
por interacciones hidrofóbicas entre bases
vecinas de la misma hebra.
Las bases son hidrofóbicas y están
colocadas en forma muy empaquetada y
prácticamente no entran en contacto con el
agua. El agua interacciona con la parte
hidrofílica de la molécula formada por
residuos de azúcar y grupos fosfato cargados
negativamente. Dependiendo del contenido
de agua del medio, las moléculas de DNA
pueden existir en tres formas: A, B y Z. Las
diferentes formas difieren en el número de
nucleótidos
por
vuelta
y
en
sus
características estructurales. Se supone que
la forma B es la predominante de las
moléculas del DNA in vivo.
Aparte del DNA lineal, existen
moléculas de DNA en forma de círculos
cerrados que pueden arreglarse en
estructuras similares a eslabones de una
cadena (en mitocondrias, bacterias y virus).
A.2
Organización del DNA.
75
A.2.1 Identificará los distintos niveles
de
organización
del
DNA;
reconocerá al nucleosoma, la
fibra de 30 nm (solenoide), el superenrollamiento
de
300
nm
(dominios estructurales en bucle)
y el cromosoma en metafase.
A.2.2 Reconocerá a las histonas y a
otras proteínas no histonas como
responsables
empaquetamiento
del
del
DNA.
Reconocerá la importancia de los
siguientes
dominios
proteicos:
hélice-vuelta-hélice, cremalleras
de leucina, dedos de cinc, en su
interacción con el DNA y entre
proteínas que interactúan con el
DNA.
A.2.3 Relacionará los cambios en el
empaquetamiento
del
cromosoma con la función del
DNA. Definirá el significado de
los
siguientes
conceptos:
cromatina, centrómero, telómero,
eucromatina y heterocromatina.
Lecturas recomendadas
1.
Collins
FS,
Jegalian
KG.
Deciphering the code of the life.
Scientific
American.
1999;
281(6): 86-91.
2.
Kornberg RD, Lorch Y. Twentyfive years of the nucleosome,
fundamental particle of the
eukaryote chomosome. Cell.
1999; 98: 285-294.
Dado que el tamaño del núcleo impediría la
existencia de los cromosomas en forma
extendida, el DNA se compacta formando
estructuras superenrolladas que se asocian
a proteínas básicas (histonas) para formar
superestructuras cada vez más complejas
como son: los nucleosomas, el solenoide o
fibra de 30 nm, las fibras de 300, 700 y 1
400 nm y, finalmente, las macroestructuras
de los cromosomas mitóticos en donde se
alcanza la máxima condensación posible,
como se ve en el microscopio electrónico.
Las proteínas nucleares pueden
dividirse, en general, en proteínas del tipo de
las histonas y proteínas no histonas. Las
histonas son proteínas de peso molecular
entre 10 000 y 25 000 con un alto contenido
de aminoácidos básicos como arginina y
lisina, los cuales pueden representar de 23 a
30% de todos los aminoácidos que
componen a la proteína.
Las histonas pueden clasificarse en
cinco diferentes grupos según su tamaño y
su composición de aminoácidos. La función
de las histonas consiste en organizar los
largos filamentos de DNA en formas más
compactas
que
permitan
su
empaquetamiento en el núcleo. Esto se lleva
a cabo a través de las interacciones
electrostáticas de las histonas con las cargas
negativas de los grupos fosfato del DNA.
Además de las histonas existen proteínas no
histonas que interactúan con el DNA.
Las no histonas son una gran
variedad de proteínas que difieren en
abundancia, tamaño y composición de
aminoácidos. Algunas de ellas presentan
dominios que son muy comunes como los
dedos de cinc y los zippers o cremalleras de
leucina. Estas proteínas son responsables de
la selectividad e inhibición transitoria en la
transcripción del RNA a través de su unión a
ciertos segmentos de DNA implicados en su
regulación o a través de la modificación de la
organización del DNA. Además, regulan la
transcripción de los genes de las mismas
histonas.
A.3
Organización del genoma.
A.3.1 Discutirá el concepto de gen y
señalará el número aproximado
de
genes
contenidos
en
el
genoma humano.
A.3.2 Señalará las características más
importantes de los genes únicos
76
y redundantes, de mantenimiento
y tejido específicos, estructurales
y
reguladores,
recesivos
y
dominantes,
ligados
al
sexo
(conocerá las Leyes de Mendel).
A.3.3 Señalará
las
regiones
hiperconservadas y las regiones
hipervariables del DNA (intrones
y exones).
celular. Este DNA es de origen materno y
constituye la llamada "herencia de Eva".
La mayoría de los genes para
preRNA (RNAhn) son genes únicos, pero
pueden ser transcritos miles de veces. Los
RNAm resultantes de la maduración de estos
preRNA pueden traducirse cientos de veces,
lo que provoca la aparición de una gran
cantidad de proteína codificada en dichos
genes.
A.3.4 Conocerá las diferentes clases
de DNA: genes que codifican
B. Flujo de la información genética
proteínas, genes que codifican
para RNA de transferencia y
ribosomales, seudogenes, DNA
repetitivo y DNA espaciador.
Al finalizar esta subunidad el alum no
conocerá los procesos involucrados
en el flujo de la inform ación genética.
A.3.5 Señalará las características del
DNA
mito-condrial
y
la
B.1. Flujo de la información genética.
información contenida en él.
B.1.1 Conocerá las funciones de los
ácidos nucleicos y los flujos de la
Realización de la práctica 11 “Huella génica”
(ver pág. 168).
Cuando se analiza el contenido del DNA que
se expresa como preRNAm, RNAr, RNAt y
otros tipos de RNA, se observa que éste
constituye sólo 10% del DNA total (este DNA
se conoce como DNA informativo); el
restante 90% contiene seudogenes, DNA
espaciador y DNA repetitivo. Todo esto
constituye el genoma. De todo el DNA, el
repetitivo constituye 30 a 40% y está
compuesto de secuencias de longitud
variable que pueden estar repetidas diez, mil
o más veces. Las secuencias repetidas
pueden agruparse, como el caso del DNA
satélite asociado al centrómero del
cromosoma, o presentarse disperso, como la
secuencia ALU, de la cual existen ± 500 000
copias dispersas en todos los cromosomas y
que está posiblemente relacionada con los
orígenes de la duplicación.
Del DNA celular, 0.1% es mitocondrial. En él
hay 13 genes que codifican para proteínas
de gran importancia para la bioenergética
información
genética
(dogma
central de la Biología Molecular).
B.2 Síntesis del DNA (duplicación).
B.2.1 Describirá el ciclo celular con sus
fases y conocerá las diferentes
moléculas que se generan en
cada una de éstas.
B.2.2 Examinará qué es la duplicación
del DNA y en qué fase del ciclo
celular ocurre.
B.2.3 Identificará
los
sucesos
más
importantes catalizados por el
“replicosoma”.
1.
2-
Lecturas recomendadas
Hübscher U. Eukaryotic DNA
polymerases a growing family.
TIBS. 2000; 25 (3): 143-147.
Collins
FS,
Jegalian
KG.
Deciphering the code of the life.
Scientific American. 1999; 281
(6): 86-91.
77
Las moléculas del DNA son
sintetizadas a partir de desoxirribonucleótidos
en presencia de un molde de DNA y de
varios tipos de enzimas, entre las que se
encuentran dos DNA polimerasas, con
diferente función en el proceso: una RNA
polimerasa (primasa), una topoisomerasa de
tipo II denominada DNA girasa y una serie de
proteínas que catalizan la separación de las
dos hebras del DNA, entre las que destacan
las helicasas.
Las DNA polimerasas son enzimas
que pueden unir desoxirribonucleótidos sólo
en la dirección 5´
3´, aunque también
tienen actividad de exonucleasas en la
dirección
5 ´
3´y en la dirección
3´
5´. Esta capacidad de polimerización
sólo en la dirección 5´
3´ se conoce
como direccionalidad de la duplicación y es la
responsable de algunas peculiaridades del
proceso.
Dado que las DNA polimerasas no
pueden iniciar la síntesis del DNA a menos
que posean un extremo 3´OH terminal al que
puedan añadir el desoxirribonucleótido
entrante, se hace necesaria la actividad de
una RNA polimerasa (primasa) que genere
dicho extremo 3´ OH terminal. Tomando
como molde una de las hebras, la primasa
cataliza la formación de un pequeño
segmento (5-20 ribonucleótidos) de RNA que
sirve como “cebador" para la síntesis de la
nueva cadena de DNA por la DNA
polimerasa III. Las cadenas formadas de
novo son antiparalelas a la cadena que les
sirve de molde. Después de la sustitución del
"cebador" del RNA a cargo de la DNA
polimerasa I, los segmentos de la cadena
formada de DNA son unidos por la DNA
ligasa. El papel de la DNA polimerasa I,
además de la función de sustitución de los
"cebadores" del RNA, se encarga de la
reparación de las hebras del DNA.
Diversos
experimentos
han
demostrado que una de las cadenas del DNA
resultante provienen del progenitor y la otra
es la que se sintetizó de novo, la cual indica
que
la
duplicación
del
DNA
es
semiconservativa. Este mecanismo permite
la transmisión de la información genética de
una generación a la siguiente.
A consecuencia de la direccionalidad
de la actividad de la DNA polimerasa III se
descubrió que hay una diferencia en la
velocidad de síntesis entre las dos cadenas
del DNA, encontrándose que hay una cadena
líder y una retardada. Esto permitió
determinar que la duplicación de la cadena
retardada se realiza en forma discontinua,
apareciendo una serie de secciones
pequeñas de DNA (entre 100 y 1 000 pares
de bases), conocidas como fragmentos de
Okazaki, y que son posteriormente unidas
por la DNA ligasa para formar la hebra
completa.
Durante su vida, las células realizan
diversas funciones, a veces se dedican
principalmente a crecer, otras a dividir su
material genético, o a repartirlo en lo que
serán, dos nuevas células hijas. Estas
diferentes etapas constituyen lo que se
conoce como el ciclo celular, integrado por 4
fases bien definidas: M (mitosis), G1 (unión
1), S (síntesis)
y G2 (unión 2).
Morfológicamente sólo se han definido dos
etapas de división e interfase, en esta última
están incluidas G1, S y G2.
Durante la etapa G1, la célula crece,
lo que implica un gran gasto energético y
síntesis de sus componentes. El paso a la
etapa S, requiere de señales precisas para
que se inicie la síntesis del DNA, de tal forma
que, al terminar esta etapa, la célula tiene ya
un contenido equivalente al doble de DNA.
Para poder distribuir este DNA entre dos
células hijas y dividirse (fase M), la célula
pasa por una etapa de preparación para la
mitosis llamada G2. Numerosos genes se
prenden y apagan durante cada etapa del
ciclo celular en forma específica y altamente
precisa.
78
Cuando una célula se diferencia,
como es el caso de las neuronas, al llegar a
la etapa G1, la célula toma un camino
alternativo a S, dejando de dividirse para
estacionarse en una etapa llamada G0.
Durante esta etapa, un gran número de
genes tejido-específico se prenden dando a
la célula la identidad de acuerdo a la estirpe
a la cual pertenece.
B.3
Transcripción.
B.3.1 Identificará en qué consiste, en
qué compartimiento subcelular y
en qué fase del ciclo celular se
lleva a cabo la transcripción.
B.3.2 Identificará
las
enzimas,
sustratos y los sucesos más
importantes del proceso de
transcripción.
B.3.3 Describirá en qué consisten los
procesos
de
modificación
postranscripcional que sufren el
RNAm, el RNAt y el RNAr y hará
énfasis en el papel de las
ribozimas.
B.3.4 Revisará el efecto de la
rifamicina, de la actinomicina D y
de la α-amanitina sobre la
transcripción.
Lectura recomendada
1Proudfoot
N.
Connecting
transcription to messenger RNA
processing. TIBS 2000; 25 (6):
290-293.
Todas las moléculas del RNA son
sintetizadas
en
el
núcleo
mediante
transcripción de la información genética
codificada en la secuencia de las bases del
DNA mediante la acción de una RNA
polimerasa dependiente de DNA.
La RNA polimerasa dependiente del
DNA es una enzima que está compuesta de
6 subunidades: α2, ß, ß´, θ y una proteína
acídica designada como σ que se requiere
para la identificación y unión al promotor, es
decir, el sitio donde debe iniciarse la
transcripción. Esta enzima utiliza un molde
de DNA para sintetizar una cadena de RNA,
la cual crece en la dirección 5´
3' hasta
llegar a una señal de terminación en el DNA,
lo que provoca la entrada de la proteína rho
la cual separa la RNA polimerasa de la
cadena molde del DNA.
En el caso de los organismos
eucariotos, sus RNA polimerasas son
diferentes,
aunque
el
proceso
es
básicamente el mismo. Una de las
diferencias en la transcripción entre
procariotos y eucariotos es que los RNAm de
los procariotos suelen ser policistrónicos, es
decir, llevan la información para más de una
cadena polipeptídica, mientras que los de
eucariotos son monocistrónicos.
Los productos de la transcripción en
eucariotos sufren, a su vez, una serie de
modificaciones postranscripcionales. Los
RNA mensajeros adquieren en su extremo 5´
terminal un "casquete", es decir, un
nucleótido poco común con un enlace
especial (7 metilguanosina unida por un
enlace 5´
5´) que lo protege de la
acción de las nucleasas. Asimismo,
adquieren una cola de poli A en el extremo 3´
terminal y pierden algunas secuencias que
no llevan información para ninguna cadena
polipeptídica (intrones). El producto de este
proceso de edición es el que será leído en
los ribosomas durante la traducción o síntesis
de proteínas.
Los RNA ribosomales se sintetizan
principalmente en el nucleolo, se asocian a
las
proteínas
ribosomales
y
las
nucleoproteínas formadas son transportadas
al citoplasma donde llevan a cabo su función.
Los RNA de transferencia también
son editados, es decir, se modifican hasta
adquirir la estructura funcional. Pierden
secuencias o algunas de sus bases sufren
modificaciones (por ejemplo, se reducen para
producir dihidrouridina, se metilan para
79
producir ribotimina, etcétera) lo que les
confiere resistencia a las nucleasas.
proceso participan los tres diferentes tipos de
RNA (el mensajero, el ribosomal y el de
transferencia);
uno
contribuye,
de
manera específica, a la obtención de una
B.4 Traducción.
B.4.1 Proceso de la traducción.
B.4.1.1 Describirá en qué consiste
y en qué compartimiento
subcelular se realiza la
traducción,
tanto
de
proteínas
intracelulares,
como
proteínas
de
de
secreción.
B.4.1.2 Conocerá el alfabeto del
código
genético
concepto
de
y
codón
el
y
anticodón.
B.4.1.3 Identificará las moléculas
que
intervienen
en
el
proceso de traducción.
B.4.1.4 Conocerá las fases del
proceso y la función que
desempeña el ribosoma
en el mismo.
B.4.1.5 Conocerá el efecto de los
siguientes
sobre
la
proteínas:
inhibidores
síntesis
de
tetraciclinas,
estreptomicina,
cloranfenicol, eritromicina,
puromicina,
dehidroemetina,
cicloheximida y la toxina
diftérica.
La síntesis de proteínas es un proceso
complejo en el que intervienen de manera
coordinada más de cien macromoléculas
para unir los residuos de los 20 aminoácidos
en una secuencia codificada en el RNA
mensajero.
cada
Asimismo,
la
síntesis
de
proteínas requiere de grandes cantidades de
energía y se regula rigurosamente. En este
proteína funcional.
El lenguaje codificado en nucleótidos
en los ácidos nucleicos es traducido a un
lenguaje de aminoácidos mediante una serie
de RNAs de transferencia (RNAt) cargados
cada uno con un aminoácido determinado, el
que es especificado por el asa del anticodón,
según un código de lectura: el código
genético. Este código presenta cuatro
características:
1. Está basado en tripletas, es decir, una
secuencia de 3 nucleótidos determina un
aminoácido.
2. El código no se sobrepone y no tiene
espacios, es decir, que la información se
almacena en tripletas de bases seguidas.
3. El código es universal. Es el mismo para
todos los organismos.
4. El código es degenerado. Esto significa
que más de una tripleta puede codificar
para un aminoácido. Sin embargo, los
primeros dos nucleótidos de una tripleta
son generalmente los mismos para un
aminoácido determinado.
El proceso de la síntesis de
proteínas puede dividirse en diferentes
etapas:
a) La activación de los aminoácidos, es
decir, la formación de los aminoacil RNAt
por sintetasas específicas.
b) La iniciación es la primera fase del
proceso; en ella se requiere la presencia
de tres proteínas conocidas como
factores de iniciación necesarios para
disociar
los
ribosomas
en
sus
subunidades y para acarrear el aminoacil
RNAt inicial (generalmente metionil RNAt
o su análogo formilado). Además, se
necesita la asociación del RNA
mensajero con la señal de inicio de la
traducción (generalmente la tripleta
AUG) a la subunidad pequeña del
80
ribosoma y del aminoacil RNAt inicial al
sitio peptidilo (P) del ribosoma. Todo este
complejo de proteínas, de RNAs y de la
subunidad
pequeña
del ribosoma
constituye el complejo de iniciación, al
que se une la subunidad grande para
formar el ribosoma activo.
c) El
alargamiento
de
la
cadena
polipeptídica se realiza a partir de este
momento por la llegada del siguiente
aminoacil RNAt al sitio aminoacilo (A) del
ribosoma con la ayuda de un factor de
alargamiento asociado a GTP, que lo
coloca en el sitio adecuado con gasto de
un enlace de alta energía. Enseguida se
forma el enlace peptídico por la acción
de la peptidil transferasa que se
encuentra asociada a la subunidad
grande del ribosoma y el movimiento del
ribosoma sobre la molécula de RNAm
para colocar al nuevo peptidil RNAt en el
sitio P y dejar libre el sitio A del ribosoma
y continuar el alargamiento de la cadena.
El movimiento del ribosoma se realiza
por la acción de otro factor de
alargamiento (factor G) con hidrólisis de
una nueva molécula de GTP.
d) La terminación se realiza cuando los
factores de terminación (factores R)
encuentran una tripleta sin sentido (UAA,
UGA, UAG), lo que provoca la activación
de la peptidil transferasa que hidroliza el
enlace peptidil RNAt y libera a la cadena
polipeptídica. El RNAt y el RNAm se
liberan al igual que el ribosoma, que
ahora puede volver a disociarse para
iniciar un nuevo ciclo de traducción. El
polipéptido
liberado
adquiere
sus
estructuras
secundaria
y
terciaria
correspondientes.
Esta descripción de la síntesis de
proteínas
corresponde
a
proteínas
que
permanecerán intracelularmente. En el caso
de los organismos eucarióticos, las proteínas
que serán excretadas, o que forman parte de
la
membrana
plasmática,
del
retículo
endoplásmico, del aparato de Golgi o de los
lisosomas,
se
forman
en
ribosomas
firmemente unidos al retículo endoplásmico.
Conforme el polipéptido se va sintetizando,
entra en cisternas endoplásmicas y es
transportado al aparato de Golgi donde se
concentra y se modifica, por ejemplo, con
adición
de
azúcares.
Más
tarde
estas
proteínas son englobadas en vesículas que
viajan a la superficie celular y se fusionan
con la membrana para verter su contenido al
espacio extracelular. Las proteínas cuyo
destino son los organelos intracelulares se
sintetizan en retículo endoplásmico y se
transportan a su destino mediante una señal
interna que es reconocida en dicho organelo.
B.4.2 Modificación
postraduccional
y
degradación de proteínas.
B.4.2.1 Mencionará
en
qué
consisten
las
modificaciones
postraduccionales:
plegamiento,
modificaciones
lentes
covareversibles
(fosforilación, acetilación y
ADP
ribosilación)
e
irreversibles
(glucosilación,
hidroxilación,
proteólisis
controlada, unión a grupos
prostéticos) y cuál es su
posible función.
B.4.2.2 Comprenderá el concepto
de vida media de una
proteína.
B.4.2.3 Describirá cuáles son los
procesos lisosomal y no
lisosomal,
que
se
mediante
los
degradan
las
proteínas.
81
Lectura recomendada
1.
Goldberg AL. The cellular
chamber of pomm. Scientific
American. 2001; 284 (1): 56-61.
se les realice un corte de tipo proteolítico
para que adquieran su forma activa, como es
el caso de los zimógenos y las prohormonas.
El corte de la preproteína hacia su forma
Las modificaciones postraduccionales de las
proteínas
pueden
incluir
desde
el
plegamiento de los polipéptidos con la ayuda
de proteínas como las chaperonas y
chaperoninas, cambios en el extremo aminoterminal y en aminoácidos específicos,
procesamiento proteolítico,
formación de
puentes disulfuro y otras como la unión de
carbohidratos, metales, grupos prostéticos,
etcétera.
Una de las modificaciones más
comunes en el extremo amino terminal que
se da en las células eucarióticas es el de
remover los residuos de metionina, con las
que se inicia la síntesis de la misma; en las
células bacterianas se remueve la formilación
presente en la metionina y, en algunos
casos, ésta también es recortada. Además
de este tipo de modificaciones que ocurren
en la secuencia del extremo amino terminal
de una proteína, los aminoácidos presentes
en la proteína también se pueden modificar;
por ejemplo, los aminoácidos serina, treonina
y tirosina pueden unir grupos fosfatos a sus
cadenas laterales, es decir, son susceptibles
de ser fosforilados en sus cadenas laterales.
Este tipo de transformaciones se usa por la
célula para comunicar cambios en el medio
ambiente
que
tienen
como
respuesta
modificaciones en la regulación de vías
metabólicas. Algunos aminoácidos, como la
lisina,
puede
metilarse,
otros
como
la
cisteína, añadir grupos isoprenílicos u otros
lípidos a su cadena lateral, lo cual facilita la
unión de la proteína con la membrana. Los
residuos de cisteína pueden formar de
manera
específica
puentes
disulfuro.
Finalmente, muchas de las proteínas son
sintetizadas de tal forma que requieren que
biológicamente activa se realiza por una
proteasa específica y se encuentra regulado
por los diferentes eventos celulares.
¿Qué determina la estabilidad de las
proteínas?
Todas las células contienen gran cantidad
de proteasas con diferente especificidad.
Estas las podemos dividir en tres grupos
generales:
1. Algunas proteasas cortan a la proteína en
sitios específicos dando origen a proteínas
maduras que son de menor tamaño que su
proteína precursora. Estas proteasas
participan en diferentes procesos que
incluyen el corte de la secuencia señal de
una proteína de exportación y el
procesamiento de proteínas citosólicas
para dar origen a sus formas maduras.
2. La internalizacion de proteínas de
membrana
(algunos
receptores)
en
respuesta a la unión del ligando genera
como primer evento la unión de clatrina
alrededor de la membrana; ésta se
invagina al citoplasma y forma vesículas
rodeadas de clatrina . El destino de estas
vesículas son los endosomas temprano,
tardío y finalmente el lisosoma que es el
responsable de la degradación de
macromoléculas por medio de enzimas
hidrolíticas.
3. Finalmente, la vida media de las proteínas
varía entre algunos segundos, días y
excepcionalmente toda la vida (cristalino).
Para ser degradadas, las proteínas son
marcadas para ser reconocidas por el
proteosoma, el cual es un complejo de alto
peso molecular que se encarga de la
degradación de proteínas citosólicas. Los
sustratos
de
este
sistema
son
principalmente
proteínas
que
están
alteradas en su plegamiento, por lo que el
82
proteosoma actúa como un sistema de
control
de
calidad.
También
está
involucrado en la degradación de proteínas
como un mecanismo de regulación, por
ejemplo en el caso de las ciclinas para que
se complete el ciclo celular. El primer paso
en este sistema es el marcar a la proteína
alterada (proteína blanco) para que sea
degradada. La marca es una pequeña
proteína llamada ubiquitina, la cual se
une covalentemente a la proteína blanco.
Son tres los componentes del sistema de
ubiquitinación:
a) E1 enzima activadora de la ubiquitina,
dependiente de ATP
b) E2 enzima que conjuga a la ubiquitina
con la proteína blanco
c) E3 ligasa de ubiquitina, selecciona a la
proteína blanco
d) El complejo multiproteico del proteosoma
(20S) degrada rápidamente a las
proteínas unidas a la ubiquitina. Este
complejo
está
formado
por
14
subunidades apiladas una sobre otra y
que son las responsables de la actividad
proteolítica.
Para que la proteína sea degradada
intrones, exones y genes estructurales
y dará ejemplos: talasemias, anemia
de células falciformes, etcétera.
C.3
Identificará
los
mecanismos
que
existen para la reparación del DNA:
uvr, fotoliasa, excinucleasa, sistema
SOS, entre otros.
Durante
la
duplicación
puede
ocurrir
espontáneamente un número pequeño de
errores en el orden o tipo de las bases
nitrogenadas. La probabilidad de uno de
estos errores puede incrementarse bajo la
influencia de diferentes agentes mutágenos
(químicos o físicos). Estos cambios en la
secuencia de bases nitrogenadas en el DNA
se conocen con el nombre de mutaciones.
Existen varios tipos de mutaciones:
las
que
cambian
una
base
por
otra
(sustitución) y pueden ser de una base púrica
por otra base púrica o de una pirimidina por
otra pirimidina; lo que se conoce como
transición. Si el cambio es de una purina por
una pirimidina, o viceversa, la mutación se
conoce como transversión. Existe otro tipo de
necesita tener varias ubiquitinas unidas.
mutaciones en las que hay un cambio de
marco de lectura para la traducción. Hay dos
C. Mutaciones y reparación del dna
tipos de mutaciones de este tipo: la inserción,
alumno
en la que la entrada de uno o dos nucleótidos
conocerá los diferentes cambios que puede
modifica el marco en que se leerá el mensaje
sufrir el DNA y sus consecuencias. Conocerá
por los ribosomas, y la supresión (deleción),
también los mecanismos de reparación del
en la que la pérdida de uno o dos nucleótidos
DNA.
provoca el mismo efecto.
C.1
puntuales, en las que sólo hay cambio de
Al
finalizar
esta
subunidad
el
En
Conocerá
los
diferentes
tipos
de
UV,
cambiada casi imperceptiblemente y las
acridina,
mutantes pueden sobrevivir. Cuando cambia
naranja
de
bromuro de etidio, 5 bromouracilo.
Efecto de mutaciones en promotores,
operadores,
genes
reguladores,
un
mayor
información
mutaciones
agentes
radiaciones,
C.2
las
una
luz
la
caso de
mutaciones y la acción de algunos
mutágenos:
base,
el
número
de
genética
bases,
es
ocurren
alteraciones importantes en la secuencia de
un gen, lo que puede ser incompatible con la
existencia de esa mutante.
83
secuencias
especiales,
vida
media del RNAm.
D.3.5 Regulación del proceso de
síntesis proteica.
Con el fin de sobrevivir, la célula tiene
mecanismos para reparar el DNA dañado. En
ese
3’
sentido
la
actividad
exonucleasa
5’ de las DNA polimerasas, la de los
productos de algunos genes, como los uvr
ABC, los de la fotoliasa y la de la uracilo-DNA
glucosidasa
desempeñan
un
D.4
Revisará un modelo de regulación en
procariotos y otro en eucariotos
(operón de lactosa y regulación de la
expresión de los genes de las
inmunoglobulinas).
D.5
Conocerá la relación que existe entre
el ciclo celular, el tipo de célula y los
procesos antes descritos, y el proceso
de diferenciación celular.
papel
importante.
D. Niveles de regulación de la
expresión genética
Al
finalizar
esta
subunidad
el
alumno
conocerá los diferentes niveles de regulación
genética (en procariotos y en eucariotos), así
como los diversos mecanismos implicados en
ella.
D.1
Lecturas recomendadas
1.
Describirá los niveles de posible control
de la expresión de la información
genética
(transcripcionales,
traduccionales,
postranscripcionales
y
postraduccionales).
D.2
2.
modificaciones
3.
Conocerá cómo la información que el
organismo recibe del medio exterior se
4.
transforma en señales que se traducen
en diferentes acciones.
D.3
Conocerá los posibles mecanismos
que operan en los diferentes niveles de
regulación:
D.3.1 Cambios en la molécula del
DNA: pérdida amplificación y
rearreglo de genes.
D.3.2 Control de la transcripción en
eucariotos (a nivel del rearreglo
de la cromatina, de la iniciación y
a nivel de los mecanismos de
acción
de
los
receptores
intracelulares).
D.3.3 Control de modificaciones del
transcrito primario.
D.3.4 Control de la traducción por la
presencia del casquete, de
5.
Etchergary P. Rhytmic histone
acetylation
underlies
transcription in the mammalian
circadian clock. Nature. 2003;
421: 177-182.
Pombo A. Cellular genomics:
which genes are transcribed,
when and where? TIBS. 2003;
28 (1): 6-9.
Konberg
RD.
Eucaryotic
transcriptional control. TIBS.
Millenium Issue 1999; M46-M48.
Papin JA. Metabolic pathways in
the post genome era. TIBS.
2003; 28(5): 250-258.
Le Hir H, Nott A, Moore M. How
introns influence and enhance
eukaryotic gene expression.
TIBS. 2003; 28(4): 215-220.
Las bacterias son capaces de controlar la
expresión de las enzimas necesarias para
utilizar nutrientes del medio, o bien, aquellas
enzimas requeridas para la síntesis de
biomoléculas que intervienen en su
funcionamiento
y
proliferación.
Estos
cambios de expresión ocurren con gran
rapidez y precisión y fueron el primer ejemplo
claro de la manera en que se regula la
expresión génica. Cuando una enzima se
expresa en respuesta a una necesidad
bacteriana se habla de un proceso de
84
inducción génica, mientras que, cuando su
expresión se apaga, se habla de represión
génica.
Los cambios en la expresión de un
gen están controlados por la interacción de
su región reguladora con diversas proteínas
nucleares que favorecen o interfieren con la
unión de la RNA polimerasa al sitio de
iniciación de la transcripción. El ejemplo más
sencillo de esta regulación es la manera
como se controla la expresión de un conjunto
de genes, llamado operón de lactosa, cuya
expresión depende de la presencia de
lactosa en el medio; normalmente, la
expresión de este operón se encuentra
reprimida. El gen regulador codifica para una
proteína que se une con gran afinidad a la
región del DNA que controla la expresión del
operón y que previene que la RNA
polimerasa pueda iniciar la transcripción. Por
su función, a esta proteína se le denomina el
represor del operón de lactosa. La presencia
de lactosa, en ausencia de otros nutrientes,
favorece que una pequeña porción de dicha
lactosa sea transformada enzimáticamente a
un metabolito que puede unirse al represor
con gran afinidad; el resultado de esta unión
es una inactivación alostérica del represor. A
este metabolito de la lactosa se le denomina
inductor del operón ya que, al disminuir la
cantidad de represor funcional, favorece de
manera indirecta la iniciación de la
transcripción de los otros genes del operón.
Un nivel más de control queda de manifiesto
cuando las bacterias reprimen la expresión
del operón de lactosa cuando en el medio
aparecen otros nutrientes como la glucosa. A
este efecto represor de la glucosa se le
conoce como represión catabólica y ocurre
gracias a que la presencia de glucosa reduce
los niveles intracelulares de AMP cíclico
(cAMP). Normalmente, el cAMP se une a una
proteína denominada proteína receptora de
cAMP (CRP, también denominada CAP) y
forma un complejo que se une a la región
reguladora de los operones y favorece su
transcripción. Por tanto, cuando la glucosa
reduce los niveles de cAMP, la proteína CRP
pierde su afinidad por la región reguladora
del operón y se interrumpe la expresión.
Una forma alternativa de regular la
expresión génica es acoplar la transcripción a
la traducción lo cual favorece la terminación
temprana de la transcripción. Este proceso
se conoce como atenuación y el operón de
triptofano constituye un buen ejemplo.
Cuando hay triptofano en el medio se
favorece la terminación de la transcripción y
el operón nunca logra expresarse; sin
embargo, cuando el triptofano se agota, la
transcripción continúa y se expresan las
enzimas necesarias para su síntesis. La
expresión de otros operones necesarios para
la síntesis de aminoácidos, como histidina,
fenilalanina, leucina, treonina e isoleucina, es
controlada por atenuación.
Mientras que en las bacterias
cualquier individuo puede expresar todos sus
genes, en las células animales esto no
siempre es cierto. Por ejemplo, todas las
células del cuerpo humano poseen la misma
información
genética
codificada
5
aproximadamente en 10 genes distintos; sin
embargo, no hay ningún tipo celular que
exprese todos estos genes simultáneamente.
De hecho, cualquier célula expresa sólo un
número reducido de estos genes, la gran
mayoría de los cuales codifica para proteínas
necesarias para las funciones generales de
cualquier tipo celular. La expresión de estos
genes es lo que hace similares a los distintos
tipos celulares; un ejemplo claro de este tipo
de genes lo constituye los que codifican para
las enzimas glucolíticas, proteínas que se
expresan de manera constitutiva como
resultado de que las regiones reguladoras de
estos genes responden a factores de
transcripción presentes en todas las células.
Los transcritos primarios son editados
inmediatamente para dar origen al RNA
mensajero maduro que es traducido por
ribosomas libres para sintetizar un péptido
85
que, al adquirir su conformación nativa,
posee actividad enzimática. Así como la
expresión de los genes constitutivos confiere
similitudes a los distintos tipos celulares, la
expresión de genes tejido específico es la
que le da a cada tipo celular sus
características. Los hepatocitos, por ejemplo,
expresan albúmina, pero no miosina, como lo
hacen las células musculares, ni tampoco
expresan las enzimas que permiten la
síntesis de neurotransmisores como lo hacen
las neuronas. La expresión de estos genes
tejido-específico está controlada por sus
regiones reguladoras las cuales requieren de
factores de transcripción especiales que
aparecen en dos etapas. En la primera, la
expresión de estos factores ocurre en
respuesta a estímulos hormonales o de
factores
de
crecimiento
durante
la
diferenciación celular. En la segunda, la
presencia de estos factores de transcripción
se hace independiente del estímulo hormonal
y de factores de crecimiento o diferenciación
y se convierte en proteínas que se expresan
de manera permanente en la célula
diferenciada. Muchas de las hormonas que
activan este proceso requieren de receptores
de membrana y sistemas de transducción
que llevan la señal al núcleo a través del
citoplasma. Otros, como las hormonas
esteroides, se unen a receptores nucleares
que sirven como factores de transcripción.
En algunas ocasiones la regulación
implica un cambio de la secuencia del DNA,
como se ejemplifica a continuación. En el
humano, como en todos los organismos
diploides, la mayoría de los genes está
presente en dos copias, una de origen
paterno y una de origen materno. Algunas
veces, el origen paterno o materno del gen
determina que este gen pueda ser transcrito
o no, fenómeno al que se le denomina
“impronta genética”. El resultado de esta
inactivación es que la expresión del gen se
reduce a la mitad, ya que sólo una de las dos
copias es activa, como es el caso de los
genes localizados en el cromosoma X. En
contraposición, existen genes que pueden
estar presentes en un mayor número de
copias como resultado de una amplificación;
tal es el caso de los genes que codifican para
los RNA ribosomales, de los cuales las
células requieren muchas copias. En genes
que codifican para los anticuerpos en células
B y los receptores de las células T ocurre un
rearreglo de las secuencias primarias del
DNA, lo que es responsable de la gran
diversidad de antígenos naturales y
artificiales que pueden ser reconocidos por el
sistema inmune. Este proceso es controlado
por los distintos factores que regulan la
maduración de las células B y las células T.
Además de la capacidad de
transcribir o no ciertos genes con mayor o
menor eficiencia, existen otros niveles en los
que se puede regular la función del producto
final por medio de la modulación tanto en
cantidad como en calidad. El primer nivel de
regulación se refiere al control de la vida
media de los RNA mensajeros determinada
por la existencia de secuencias en los
extremos no codificantes que regulan su
velocidad de degradación. Durante el
proceso de maduración de los mensajeros,
en el cual se eliminan intrones, también
pueden eliminarse uno o varios exones y dar
lugar a una mayor diversidad de proteínas; a
este proceso se le denomina edición
alternativa. Una vez que el mensajero ha
madurado, existen varios mecanismos que
pueden aumentar o disminuir la eficiencia
con la que los ribosomas traducen la
información a un péptido.
En muchas
ocasiones la proteína tiene un destino final
diferente al citoplasma, el cual puede ser
mitocondrial, lisosomal, de membrana celular
o una proteína de secreción; esta información
se encuentra codificada en el extremo amino
terminal del péptido naciente y puede
constituir un punto más de control. El último
punto de regulación consiste en aumentar o
disminuir la velocidad de degradación de las
86
proteínas por el sistema de la ubiquitina; este
mecanismo
nuevamente
contribuye
a
controlar la cantidad del producto génico. A
pesar de la diversidad de los niveles de
regulación de la expresión génica, los
mecanismos más comunes son los que
modulan la eficiencia de la transcripción y los
que modulan la actividad biológica por
modificaciones postraduccionales, entre los
que destacan la fosforilación y la
desfosforilación.
Hemos mencionado los rasgos más
sobresalientes de la manera en que las
células regulan la expresión génica, pero aún
es poco lo que se sabe con respecto a cómo
se integran e interaccionan. Por ejemplo, aún
resulta difícil explicar cómo distintos factores
de crecimiento, con diferentes receptores de
membrana y sistemas de transducción,
estimulan a los mismos factores de
transcripción, pero conducen a respuestas
celulares diversas. El gran número de niveles
a los cuales se puede regular la expresión
génica y las múltiples combinaciones y
secuencias en las que pueden presentarse
sugiere una gran complejidad. El resultado
final de esta complejidad determina al tipo de
genes que participan y la secuencia en la que
se expresan para dar origen a los diferentes
tipos celulares.
E. Virus, oncogenes y
transformación
Al finalizar esta subunidad el alumno
conocerá la estructura general de los virus,
su clasificación y su posible implicación en la
transformación celular. Conocerá la relación
entre la función de los productos de los
oncogenes y la transformación celular.
E.1
Describirá la estructura general de los
virus.
E.2
Conocerá la clasificación de los virus
con base en su ácido nucleico y dará
ejemplos de cada uno.
E.3
Definirá los conceptos de oncogén y
protooncogén.
E.4
Revisará algunos mecanismos por los
cuales un protooncogén se transforma
en oncogén, como:
E.4.1 Inserción de un promotor o de un
intensificador (amplificador).
E.4.2 Mutación puntual.
E.4.3 Traslocaciones cromosómicas.
E.4.4 Amplificación.
E.5
Estudiará el producto de algunos
oncogenes como son: src, sis, erb B,
ras y myc y establecerá la relación
entre la función de dichos productos y
la transformación celular.
Los virus son partículas subcelulares
constituidas por ácidos nucleicos en forma de
DNA o de RNA de cadena doble o sencilla,
proteínas y, en ocasiones, membranas
lipídicas. Su genoma compacto está
constituido por un reducido número de genes
que codifican para proteínas estructurales de
la cápside, enzimas de duplicación, así como
enzimas y secuencias de DNA que permiten
la inserción del genoma viral al genoma de la
célula huésped, entre otros.
Los virus son incapaces de
multiplicarse de manera autónoma, pero
pueden hacerlo cuando se encuentran en el
interior de una célula. En la mayoría de los
casos la infección viral conduce a la
multiplicación viral a expensas de la célula
infectada. El daño ocasionado al destruir las
células es responsable de una gran variedad
de enfermedades de menor gravedad, como
la influenza, o enfermedades más serias,
como la viruela, e incluso enfermedades
mortales,
como
el
síndrome
de
inmunodeficiencia adquirida. En algunos
casos la infección viral se asocia a una
mayor frecuencia en el desarrollo de tumores
y cáncer, como es el caso del virus del
papiloma y el cáncer cervicouterino. Es
87
interesante notar que un tipo de virus sólo
puede infectar a un restringido tipo de células
y a ninguna otra, por ejemplo, el virus del
herpes infecta las células de los nervios
periféricos. A este fenómeno de especificidad
de infección se le denomina tropismo y se
debe a que el virus y su célula blanco
interactúan por la unión de una proteína de la
envoltura viral con un antígeno presente en la
membrana celular.
Las enfermedades por virus son
difíciles de tratar debido a que, fuera del
momento en que las partículas virales viajan
hasta sus células blanco y penetran en su
interior, no pueden ser neutralizadas por
anticuerpos.
El problema del reconocimiento de
antígenos virales por anticuerpos se dificulta
si uno considera que en poco tiempo emerge
un gran número de partículas virales de una
célula infectada y que el tiempo en que se
logran títulos protectores de anticuerpos es
relativamente largo. A estas dificultades se
suma una característica genética de los virus
que les permite tolerar cambios de
secuencias o incluso eliminar o adquirir
nuevos genes a lo largo de su multiplicación,
lo que les confiere una gran diversidad
genética. Estos cambios en secuencias son
particularmente nocivos cuando ocurren en
regiones del DNA que codifican para los
antígenos que son reconocidos por
anticuerpos.
Las proteínas virales que se
seleccionan son aquellas que continúan
teniendo la función requerida por el virus,
pero que no pueden ser reconocidas por los
anticuerpos. La velocidad con la que estos
cambios se propagan a toda la población
viral es sorprendentemente rápida y
previenen el uso eficaz de vacunas contra
varias enfermedades virales. Además de los
anticuerpos, el organismo produce factores
proteicos solubles llamados interferones que
aceleran la muerte de la célula infectada e
interrumpen la expresión de proteínas virales.
El que los virus se aíslen del sistema inmune,
su ciclo de vida y su gran diversidad
genética, son responsables de que no haya
medidas eficaces para su eliminación y son
la causa de su gran impacto, tanto en la
salud pública, como en la economía
agropecuaria y agrícola.
En su mayoría, los virus son capaces
de activar la maquinaria de síntesis del DNA
de la célula infectada, evento ligado al ciclo
celular y al control mismo de la proliferación;
al interferir con este aspecto de la vida
celular los virus aseguran su multiplicación.
No es sorprendente entonces que en
ocasiones los virus hayan incorporado a su
reducido genoma versiones de genes
celulares que controlan la proliferación
celular. Un ejemplo de este tipo de genes es
ras, que codifica para una proteína G
monomérica que transduce la señal
proliferativa de diversos factores de
crecimiento. La versión celular de ras (c-ras)
posee homólogos virales (v-ras), la mayoría
de los cuales presenta alteraciones que dan
lugar a una proteína permanentemente activa
y que no está sujeta a la regulación celular.
Así, mientras que c-ras sólo entra en función
cuando los receptores o factores de
crecimiento
son
activados,
v-ras
constantemente obliga a la célula a proliferar.
Cuando los virus, en lugar de lisar a una
célula, integran su genoma al material
genético de ésta, los genes virales pueden
expresarse de manera constitutiva; si esto
ocurre con genes como v-ras, se favorece
una proliferación celular descontrolada y se
dice que la célula ha sido transformada. Hay
proteínas virales que pueden interferir con la
proliferación celular, como el antígeno grande
T del adenovirus o las proteínas E7 del virus
del papiloma.
No sólo la integración viral puede dar
origen a la expresión de genes que
promueven la proliferación celular, también la
aparición de mutaciones espontáneas puede
dar origen a versiones de c-ras que al igual
88
que v-ras estimulan continuamente la
proliferación. A estas versiones mutadas se
les denomina oncogenes, ya que están
asociadas al desarrollo de neoplasias,
tumores y diversos tipos de cáncer. A los
genes celulares que al ser mutados pueden
dar origen a oncogenes se les denomina
protooncogenes; a éstos pertenece una larga
lista de receptores y proteínas de
transducción de diferentes factores de
crecimiento y proteínas que controlan el ciclo
celular. Mientras que los protooncogenes son
todos parte de las señales que activan la
proliferación, también existen genes cuyos
productos sirven para frenarla. A estos frenos
de la proliferación se les denomina genes
supresores de tumores o antioncogenes. Si
un gen supresor de tumores se muta y pierde
su función, el resultado puede compararse
con la pérdida de un freno de la proliferación
celular. Cuando esto ocurre también puede
presentarse un crecimiento descontrolado,
ahora como resultado de la falta de un
mecanismo de freno.
Las células transformadas poseen
mutaciones, tanto en protooncogenes como
en genes supresores de tumores, lo que da
como resultado una señal permanente de
proliferación, por un lado, y la falta de
mecanismos de freno, por el otro. Esta
combinación hace que estas células
presenten una duplicación descontrolada y
mucho más veloz que las células normales,
lo que, en parte, es responsable del
crecimiento desmesurado de las masas
tumorales.
F. Técnicas de manipulación del DNA
Al finalizar esta subunidad el alumno
conocerá las diferentes técnicas de
manipulación del DNA y sus posibles
aplicaciones.
F.1
Señalará la importancia de la
tecnología del DNA recombinante en el
campo de la medicina.
F.2
Definirá qué son las enzimas de
restricción y conocerá cuál es su
utilidad y función en el estudio y la
manipulación del DNA.
F.3
Definirá qué es un vector de clonación
y un vector de expresión; tomará como
ejemplo los plásmidos.
F.4
Conocerá
en
qué
consiste
el
procedimiento
básico
de
la
metodología de clonación y cuál es su
utilidad, al tomar en cuenta:
F.4.1 Cómo se fragmenta el DNA.
F.4.2 Cómo se unen los fragmentos de
DNA a los vectores.
F.4.3 Cómo se introduce el DNA
recombinante en las células
hospederas (transfección).
F.4.4 Cómo se seleccionan las células
que
contienen
DNA
recombinante.
F.4.5 Cuál es la utilidad del DNA
recombinante.
F.5
Conocerá
los
mecanismos
de
recombinación in vitro (ingeniería
genética).
F.6
Conocerá el significado de los téminos:
transgen, sobreexpresión, knock out,
huella digital del DNA y polimorfismo.
Las técnicas modernas de biología molecular
han permitido un gran control sobre la
caracterización y manipulación del material
genético tanto de DNA como de los distintos
tipos de RNA. Debido a su especificidad y
gran capacidad de detección, estas técnicas
han tenido un gran impacto en la medicina.
Inicialmente, la biología molecular se ha
aplicado al diagnóstico de entidades
patológicas y para determinar la presencia de
agentes infecciosos como microorganismos y
89
virus. En la actualidad se estudia con gran
interés la posibilidad de una terapéutica
génica que pueda corregir alteraciones
fisiopatológicas derivadas de la pérdida de la
función parcial o total de un gen; esto abre
una nueva era en las aplicaciones de la
biología molecular en la medicina.
La biología molecular recibió un gran
impulso con el descubrimiento de entidades
circulares de DNA llamadas plásmidos que,
además de poseer genes que confieren
resistencia a los antimicrobianos, pueden
contener y expresar muchos otros genes.
Dos herramientas cruciales de la biología
molecular son la posibilidad de cortar el DNA
con enzimas de restricción, endonucleasas
que sólo cortan secuencias específicas, y el
uso de ligasas, que generan un enlace
covalente entre los extremos obtenidos por la
acción de las enzimas de restricción. Estos
dos principios básicos permiten remover o
insertar cualquier porción de DNA contenida
entre dos sitios de restricción y se dice que
se ha clonado esta secuencia de DNA. La
clonación hace posible introducir en un
plásmido, no sólo secuencias de DNA de
otros plásmidos, sino también de cualquier
origen: viral, bacteriano, animal o vegetal. La
reciente aplicación de transcriptasas reversas
de origen viral, enzimas que sintetizan DNA
complementario mediante RNA como molde,
y de polimerasas termostables que permiten
“amplificar” un segmento de DNA, ha
simplificado aún más el uso de técnicas de
biología molecular.
El tener secuencias de DNA o DNA
complementario al RNA mensajero ha
resultado de gran utilidad para el estudio de
genes y RNA mensajeros. Los fragmentos de
DNA obtenidos de la clonación en plásmidos,
o por transcripción reversa y amplificación,
pueden unirse a nucleótidos marcados con el
32
P, o
isótopo radiactivo del fósforo
"derivatizados" con moléculas fluorescentes;
la marca permite seguir a estas moléculas
que sirven como sondas para localizar a sus
secuencias complementarias. La gran
especificidad y elevada capacidad de
detección de la hibridación de la sonda con
su secuencia complementaria permite el
análisis de DNA para detectar la presencia y
número de copias de un gen (técnica
denominada Southern); también se aplica en
la identificación y la cuantificación de RNA
mensajeros (técnica a la que se le denomina
Northern).
Los segmentos de DNA cuyo estudio
ha resultado de mayor interés son aquellos
que contienen toda la información de un gen
o de las regiones reguladoras. Sin embargo,
introducir un gen o un promotor a unas
cuantas moléculas de plásmido sería
problemático para estudios bioquímicos,
genéticos y estructurales por la reducida
cantidad de material. Esta limitación había
sido resuelta previamente, ya que los
plásmidos pueden ser introducidos a
bacterias a través del proceso de
transformación. Normalmente los plásmidos
contienen secuencias que les permiten
multiplicarse una vez que están dentro de
una bacteria; a estas secuencias se les
denomina origen de duplicación. Gracias a
que los plásmidos contienen genes que
confieren resistencia a los antimicrobianos,
las bacterias que han sido transformadas con
un plásmido pueden distinguirse de las que
no lo han sido al hacerlas crecer en medio de
cultivo que contiene al antimicrobiano en
cuestión; los antimicrobianos más utilizados
son la ampicilina y la kanamicina. Este simple
proceso de selección logra dos resultados
prácticos: por una parte, elimina a las
bacterias no transformadas y, por otra,
asegura la multiplicación masiva del plásmido
que se duplica junto con el genoma
bacteriano. El resultado es un cultivo de
bacterias con un alto contenido de plásmidos
y, por tanto, del segmento de DNA que se
desea estudiar. La multiplicación del
segmento de DNA por estudiar asegura
90
suficiente material para cualquier otro
propósito.
A los plásmidos que sirven para
insertar DNA ajeno al plásmido y permiten su
multiplicación se les denomina vectores de
clonación, pero existen también plásmidos
más complejos en los que el sitio en el que
se puede insertar el DNA exógeno se
encuentra frente a una región reguladora que
permite la síntesis de RNA mensajero. A
estos plásmidos se les llama vectores de
expresión, ya que permiten que el DNA sea
transcrito a RNA; estos plásmidos pueden
presentar regiones reguladoras reconocidas
por bacterias o por células de animales.
Hemos dicho que la transformación consiste
en introducir el DNA a una bacteria y
expresarlo; cuando esto ocurre en una célula
eucariótica: levadura, célula animal o vegetal,
el proceso se denomina transfección. Una
aplicación particularmente útil de la biología
molecular se ha derivado del uso de vectores
de expresión en bacterias y células animales.
La expresión de proteínas exógenas por
bacterias y levaduras ha permitido obtener
cantidades
suficientes
para
estudios
bioquímicos, estructurales e, incluso, ha sido
la principal fuente para la cristalización. La
transfección y la expresión de proteínas
exógenas en células de mamíferos y en
células vegetales ha permitido identificar
versiones
de
genes
que
contienen
alteraciones en sus secuencias que dan
como resultado proteínas con una función
alterada. Con esta aproximación se han
identificado mutaciones responsables de
enfermedades como el cáncer y la diabetes.
Una aplicación sorprendente ha sido la de
identificar la función de genes recién
descubiertos que al ser insertados en
vectores de expresión no sólo han permitido
obtener proteínas puras en cantidades
suficientes
para
su
caracterización
bioquímica, sino también han dado la
oportunidad de conocer su función, al
expresarlas en un ambiente celular normal.
91
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO
I
CONCEPTOS TEÓRICOS INICIALES
92
EL MÉTODO CIENTÍFICO
La cultura no puede comprenderse sin hacer
científico, tomado aisladamente, forma parte
referencia al método científico. La ciencia no
de la actuación cotidiana de todos los seres
es un sector de la civilización que pueda
humanos, pero, en su conjunto, utilizados
separarse del resto de ella, sino un esfuerzo
sistemáticamente,
creativo con su propio sistema de valores
poderosa herramienta que ha diseñado la
que, poco a poco, ha llegado a formar parte
humanidad para conocer y controlar a la
de los valores generales en la sociedad
naturaleza.
constituyen
la
más
moderna.
La ciencia está basada en el método
Observación
científico; su capacidad y limitaciones están
definidas por él y dondequiera que el método
El
científico sea aplicable, puede haber ciencia.
observación. Lo que no puede observarse,
El origen de la ciencia se pierde en
método
científico
se
directa o indirectamente
inicia
con
la
por medio de
el más remoto pasado. Mucho antes de que
instrumentos o de modificaciones de la
existieran los registros históricos de la
conducta, no puede ser investigado por la
humanidad, la magia primitiva dio origen
ciencia.
también a la religión y, mucho antes, al arte.
La observación debe ser repetida en
Ciencia, religión y arte difieren en métodos,
forma
independiente
por
observadores
pero coinciden en metas: comprender e
diversos. Las observaciones únicas, que no
interpretar al universo y la interacción de sus
se repiten ni actual ni potencialmente, no
partes para promover el progreso material y
pueden ser objeto de estudio científico.
espiritual de la humanidad.
Problema
El objetivo de la ciencia es hacer
teorías. Las teorías científicas explican los
Después de que una observación se hace y
hechos
se repite, el segundo tiempo del método
y predicen con alto grado de
probabilidad
la
ocurrencia
de
hechos
similares.
científico es plantear un problema; en otras
palabras, se hacen preguntas sobre la
La secuencia del método científico
observación: ¿Cómo es que los hechos
es: observar, plantear problemas, hacer
ocurren de esta manera? ¿Qué es lo que
hipótesis, experimentar y formular teorías.
determina su desarrollo, evolución y término?
Cada uno de los procesos del método
Es en este punto donde el científico difiere
93
del
hombre
común;
hacen
problema a dos alternativas posibles que
observaciones pero sólo el primero muestra
puedan contestarse con claridad, afirmativa o
curiosidad científica sobre ellas.
negativamente; pero en muchas ocasiones
Plantear
un
ambos
problema
es
hacer
preguntas, pero, hacer “buenas preguntas” al
los resultados del experimento sólo conducen
a soluciones parciales.
igual que hacer “buenas observaciones” es
La experimentación es la parte más
un arte muy preciado. Para que tengan valor
ardua
científico
experimento es un caso en sí mismo; el
los
significativos
problemas
y
deben
tener
ser
respuestas
comprobables por técnicas apropiadas.
o
¿qué?
se
resuelven
método
conocimiento
anterior
científico.
y
la
Cada
experiencia
ayudan técnicamente para decidir la forma en
Las preguntas que se inician por
¿cómo?
del
que una hipótesis puede ser comprobada
mejor,
experimentalmente. La elección correcta del
científicamente, que las que comienzan con
experimento y su interpretación es lo que
¿por qué?, pero los investigadores pueden
separa
formular los problemas para que adopten la
investigación.
al
genio
del
aficionado
a
la
forma adecuada.
Teoría
Hipótesis
Las pruebas experimentales son la base del
quinto peldaño, final del método científico: la
Una vez planteado un problema adecuado, el
formulación de una teoría. Cuando una
científico
hipótesis se ha sostenido por pruebas
procede
al
tercer
tiempo
del
método: formular una explicación o hipótesis.
convincentes,
Por supuesto que un problema puede tener
laboratorios e investigadores independientes,
varias explicaciones posibles, pero sólo una
se propone una teoría que consiste en una
de ellas es la verdadera. Las respuestas
afirmación con límites mucho más amplios
casuales a un problema son generalmente
que los experimentos en que se basa y que
erróneas; pero el científico con su intuición,
expresa la creencia o probabilidad de que
su experiencia y, a veces por incidentes
sea valedera en cualquier combinación de
afortunados, acierta en la hipótesis. Esto se
sujeto, tiempo y lugar en donde se reúnan
sabe al emplear el cuarto tiempo del método
condiciones similares.
científico.
obtenidas
por
muchos
Desde este punto de vista una buena
teoría permite hacer “predicciones.” Las
Experimentación
El
objetivo
predicciones científicas tienen siempre un
de
es
soporte experimental muy sólido y aun
comprobar la validez de la hipótesis. Si los
cuando no afirman que un hecho ocurrirá con
experimentos demuestran que la hipótesis es
certidumbre, sí plantean que tiene una gran
errónea, se hace una nueva y se la sujeta a
probabilidad de ocurrir.
comprobación.
la
puede
Unas pocas teorías han probado su
prolongarse por mucho tiempo al formular
validez tan universalmente, y expresan tan
nuevas hipótesis y tratar de comprobarlas
alto grado de probabilidad, que se las conoce
experimentalmente.
con el nombre de leyes naturales. Por
La
El
experimentación
procedimiento
situación
experimentación
consiste
ideal
en
la
ejemplo, ninguna excepción se conoce al
en
reducir
el
hecho de que una manzana desprendida de
94
su árbol caerá al suelo si no es sostenida de
Un sistema de medidas
preciso
alguna manera. La ley de gravitación se basa
requiere unidades bien definidas. La Oficina
en esta observación.
Internacional de Pesas y Medidas revisa
la
periódicamente el sistema para incorporar los
investigación científica. Si en el análisis de un
Las
leyes
naturales
orientan
adelantos tecnológicos y mejorar la exactitud
hecho se elimina lo imposible, aquello que es
y precisión de las medidas.
contrario a las leyes naturales, lo que resta,
Se han hecho muchos esfuerzos
aunque sea muy raro y poco probable, debe
para desarrollar un sistema de unidades
ser la verdad. La verdad son los hechos que
universalmente aceptable. El producto de
nos rodean. Aunque acontecen sin cesar a
estos esfuerzos es el Sistema Internacional
nuestro alrededor, muy pocas personas y
de Unidades (cuya abreviatura es SI en todos
muy pocas veces se hace un análisis
los
científico de ellas.
intercambio de información científica este
idiomas).
A
partir
del
creciente
Si se emplean las leyes naturales
sistema ha sido aceptado por toda la
para marcar lo imposible, con el resto posible
comunidad y en especial en medicina. El SI
se hacen nuevas hipótesis, se comprueban
es esencialmente una versión ampliada del
por
sistema métrico decimal.
experimentos,
teorías
y
se
se
acumula
formulan
el
nuevas
conocimiento
El
SI
comprende
tres
tipos
de
científico que ha permitido al hombre situarse
unidades: las unidades de base, las unidades
en un Universo observable que tiene un radio
derivadas, las unidades suplementarias y una
(r) de millares de millones de años luz y que
serie de prefijos que permiten tomar múltiplos
incluye un microcosmos tan pequeño que se
y submúltiplos decimales de las unidades
expresa en órdenes de magnitud menores de
utilizadas.
10
–20
m y adquirir un dominio incuestionable
sobre su ambiente.
Unidades de base
SISTEMA INTERNACIONAL DE UNIDADES
El SI consta de siete unidades básicas que
(SI)
son dimensionalmente independientes. Las
unidades básicas están anotadas en el
Los resultados de todos los experimentos en
cuadro I.1, junto con los símbolos que hay
que se basan las teorías científicas y las
que utilizar para indicar estas cantidades.
leyes naturales derivan de las mediciones de
objetos o de sus propiedades.
Unidades SI derivadas
Medir es comparar magnitudes; toda
Al multiplicar una unidad de base por sí
medición comprende un número y una
misma o al asociar dos o más unidades de
unidad. La unidad identifica la clase de
base por una simple multiplicación o división,
dimensión y el número expresa las veces que
se puede formar un amplio grupo de
la unidad está contenida en el objeto o la
unidades llamadas SI derivadas (cuadro I.2).
propiedad medida. La medición es un arte
Ejemplo: la unidad derivada de volumen es el
muy refinado; en la actualidad emplea
metro elevado al cubo, o metro cúbico.
instrumentos muy complejos y alcanza una
precisión extraordinaria.
La combinación de unidades de base
para formar las unidades derivadas es una
95
de las grandes ventajas del SI. En el SI no es
una serie de prefijos que permiten formar
preciso memorizar factores de conversión; el
múltiplos y submúltiplos decimales de las
factor a que se recurre para formar las
unidades SI (cuadro I.4).
Los
unidades derivadas es 1 (unidad), cualidad
prefijos
SI
se
anteponen
directamente al nombre de la unidad, sin
que hace al SI coherente.
signo
de
puntuación
alguno
(ejemplo:
Cuadro I.1. Unidades básicas del SI.
nanómetro y no nano-metro).
Magnitud
Longitud
Masa
Tiempo
Cantidad de
sustancia
Temperatura
termodinámica
Intensidad luminosa
Nombre
metro
kilogramo
segundo
mol
Símbolo
m
kg
s
mol
también directamente al símbolo de la
kelvin
K
candela
cd
Intensidad de
corriente eléctrica
ampere
A
El símbolo del prefijo se antepone
unidad, sin espacios intermedios ni signos de
puntuación (ejemplo: mm, milímetros; nmol,
nanomol que equivale 10
moles).
Cuadro I.3. Unidades SI derivadas con
nombres especiales
Magnitud
Cuadro I.2. Algunas unidades derivadas
simples
–9
Nombre
Símbolo
Definición
2
Fuerza
Newton
Nm.
kgm/s
Presión
Pascal
Pa
N/m2
Trabajo;
Joule
J
Nm
Coulomb
C
Watt
W
J/s
Volt
V
W/A
°C
energía;
Magnitud
Superficie
Volumen
Concentración
de sustancia
Velocidad
Nombre
metro
cuadrado
metro
cúbico
mol/metro
cúbico
metro
por
segundo
Símbolo
2
m
m
calor
Carga
3
mol/m
cantidad de
A.s
eléctrica;
3
cantidad de
electricidad
m/s
Potencia;
flujo
A cierto número de unidades SI derivadas se
energético
les ha dado nombres especiales, en su
Tensión
mayor parte tomados de los hombres de
eléctrica;
ciencia
contribuciones
potencial
notables al conocimiento del tema de estudio
eléctrico
correspondiente (cuadro I.3).
Temperatura
Grado
Celsius
Celsius
que
han
hecho
K–273,16
Prefijos SI
Cuando las unidades SI derivadas resultan
demasiado grandes o demasiado pequeñas
para
determinados
fines
(sería
desproporcionado, por ejemplo, utilizar el
metro cúbico para expresar el volumen de
sangre del cuerpo humano), el SI contiene
96
Cuadro I.4. Prefijos SI.
Factor
10
10
10
10
10
10
10
exa
E
Peta
P
12
10
10
Símbolo
15
10
10
Prefijo
18
10
Los símbolos de las unidades no toman la
9
6
3
–9
–12
–15
se escribe 2 ml, y no 2 mls).
Los símbolos de las unidades jamás
van seguidos de un punto, salvo si están al
Tera
T
Giga
G
Mega
M
Kilo
k
Mili
m
tríos, dispuestos a la derecha y a la izquierda
Micro
µ
de la coma, y separados entre sí por un
Nano
n
pequeño espacio. Ejemplo:
Pico
p
Femo
F
ato
q
–3
–6
terminación del plural (ejemplo: dos mililitros
–18
final de una frase (ejemplo: 5 ml y no 5 ml.).
Cuando se escriben cifras, la coma
sólo se puede utilizar para indicar los
decimales; las cifras deben agruparse en
forma correcta:
1 000 000
0,003 278
0.003 278
forma incorrecta: 1,000,000
Unidades no pertenecientes al SI
0.003,278
Ciertas unidades ajenas al SI son de uso tan
frecuente que en cierto modo forman parte
La multiplicación de las unidades se
de nuestra vida cotidiana y se acordó
indica con un punto a nivel o elevado
utilizarlas juntamente con el SI (cuadro I.5).
(newton.metro=N.m) o un espacio (N m). La
Algunas
de
estas
unidades,
en
especial el litro y las unidades de tiempo, son
división se puede indicar mediante una barra
oblicua o por exponentes negativos:
de gran importancia en las profesiones de la
1/s = s
salud. Conviene señalar que el litro es un
nombre especial que se da al submúltiplo,
mol por metro cúbico puede expresarse por:
decímetro cúbico, de la unidad SI de
volumen.
–1
3
–3
tiene
muchas
mol/m o mol.m
El
SI
ventajas
y
algunas desventajas, pero se reconoce la
Cuadro
I.5.
Algunas
unidades
no
pertenecientes al SI.
Magnitud
Unidad
realidad del esfuerzo para implantarlo como
una forma de expresar los datos científicos,
Símbolo
Valor en
comprensible para todos. Se recomienda
SI
desechar las unidades que no pertenecen al
minuto
min
60 s
SI a la mayor brevedad posible, pero la
hora
H
3 600 s
realidad del uso de otras unidades en textos
Día
D
86 400 s
y comunicaciones científicas no se puede
Volumen
Litro
loL
10 m
-3
negar. En este Manual las unidades SI se
Energía
caloría
cal
4.185J
Tiempo
3
anotarán entre paréntesis cuando se juzgue
conveniente.
Reglas de escritura de símbolos y cifras.
97
Algunas recomendaciones para utilizar
Concentración de iones hidrógeno.
el SI en bioquímica
La concentración de hidrogeniones en los
líquidos biológicos se expresa en nmol/l, así
PARA EXPRESAR CONCENTRACIONES
como en unidades de pH. El valor del pH se
La concentración de sustancias cuya masa
define como el logaritmo negativo de la
molecular se conoce se expresa en forma de
actividad de los iones hidrógeno (pH = -log
cantidad de sustancia, es decir, en moles (o
H ),
en
potenciométricamente con la ayuda de un
submúltiplos
como el
milimol
o
el
nanomol) por litro. Ejemplo:
+
esta
actividad
puede
determinarse
pH-metro.
Ácido úrico en el suero o plasma:
Actividad enzimática. La unidad SI de
Varones: 0.18 a 0.53 mmol/l.
actividad catalítica es mol por segundo: mol/s
Mujeres: 0.15 a 0.45 mmol/l.
(también llamado katal, símbolo: kat) y
Colesterol en el suero o plasma: 3.9 a 7.2
corresponde
mmol/l.
Glucosa en el suero o plasma: 3.6 a 6.1
transformado por segundo como resultado de
mmol/l.
la
catálisis.
proporcional
Vitamina A en el suero: 0.53 a 2.1 µmol/l.
La
cantidad
concentración
de
denominada
sustancia
en
forma
de
no
debe
ser
“concentración
molar”
o
molaridad, ni utilizar el símbolo M en vez de
mol/l (como tampoco mM, nM, etcétera, en
vez de mmol/l, nmol/l, etcétera).
La concentración de sustancias cuya
masa molecular se desconoce o es dudosa
se expresa en kg/l, g/l, mg/l, etcétera.
Ejemplo:
a
la
La
a
cantidad
velocidad
la
cantidad
de
sustrato
medida
de
es
enzima
presente.
La actividad también puede ser
expresada en términos de unidades (símbolo:
U). Por definición, una unidad es igual a la
concentración de enzima necesaria para la
formación de un micromol de producto por
minuto (µmol/min). La actividad específica de
una enzima se define como la concentración
de producto que se forma por 1 miligramo de
enzima por minuto.
MATEMÁTICAS PARA EL LABORATORIO
Proteína sérica total: 60 a 80 g/l.
Albúmina sérica: 33 a 55 g/l.
Notación científica o exponencial.
Globulina sérica: 20 a 36 g/l.
Cuando se expresan cantidades muy
grandes o muy pequeñas, como es el caso
frecuente en bioquímica, la dificultad de
Fibrinógeno en el plasma: 2 a 6 g/l.
Hormona antidiurética en plasma: 2 a 12
pg/ml
Concentración de sustancias en tejidos.
Se expresa en unidades de masa (si no se
conoce la masa molecular) o en moles (si se
conoce la masa molecular) por kilogramo de
tejido seco o húmedo. Ejemplo:
g/kg, mg/kg o mol/kg, mmol/kg, etcétera.
No se recomienda expresarla en unidades
de volumen, es decir en mg/ml, g/l, etcétera.
escribir y manipular muchos ceros se evita
con el uso de la notación exponencial o
científica.
En la notación exponencial todo
número puede expresarse como una
potencia entera de 10, o como un producto
de dos números, uno de los cuales es una
potencia entera de 10. Ejemplo: el número de
Avogadro seiscientos dos sextillones se
escribe:
98
602 000 000 000 000 000 000 000
y en la notación exponencial como una
6
cantidad decimal multiplicada por 10 elevada
23
a la potencia apropiada = 6.02 x 10 . Como
9
ya que 6 x 3 = 18 y 10
6
6+3
= 10
3
6 x 10 entre 3 x 10 = 2 x 10
ejercicio, examine las cantidades siguientes:
200 = 2 x 10 x 10 = 2 x 10
3
6 x 10 por 3 x 10 = 18 x 10 = 1.8 x 10
ya que 6/3 = 2 y 10
6–3
= 10
10
9
3
3
2
2
205 = 2.05 x 10
5
205 000 = 2.05 x 10
–1
0.205 = 2.05 x 10
Para la adición y la sustracción usando
notación científica, primero se escribe cada
–4
0.000 205 = 2.05 x 10
–7
0.000 000 1= 1/10 000 000 = 1 x 10
El exponente de la base 10 para
números mayores de la unidad es el número
de lugares desde la coma o punto decimal
separada de la primera cifra significativa:
cantidad con el mismo exponente n. Luego
se realiza la operación deseada entre los
valores N1 y N2, donde N1 y N2 son los
números obtenidos con el mismo exponente;
estos últimos permanecen iguales. Ejemplo:
2
3
3
(5.1 x 10 ) + (3.4 x 10 ) = (0.51 x 10 ) + (3.4 x
3
10 ) = 3.91 x 10
3
2
205 = 2.05 x 10 = 2 lugares
El método del factor unitario en los
Para fracciones decimales menores
de la unidad se separa la primera cifra
distinta de cero después de la coma decimal
Cálculos.
y se cuentan los lugares hacia la izquierda
hasta la coma decimal, incluso la cifra
separada y el número es el exponente
de unidades se denomina método del factor
negativo:
• Cualquier número al ser multiplicado por
El
procedimiento
que
se
utilizará
para
resolver problemas que incluyan conversión
unitario.
Esta
técnica
se
basa
en
las
propiedades del número 1, es decir:
uno, sigue siendo el mismo número (1 x 5 =
0.000 205 = 0.000 “2”05
5).
del 2 a la coma decimal son 4 lugares; por lo
4
tanto, es 2.05 x 10– .
Las operaciones de multiplicar y
dividir, elevar a potencias o extraer raíces se
facilitan manipulando los exponentes según
reglas muy sencillas. La porción decimal no
exponencial se opera en forma ordinaria, lo
que
reduce
el
manejo
a
tres
cifras
• El número 1 puede ser escrito como el
cociente de cualquier número dividido por si
mismo (3/3 ó 6/6).
• Se puede tomar cualquier ecuación y
dividirla por uno de los miembros para
obtener una razón igual al número 1.
Por ejemplo, dada la ecuación:
1 minuto = 60 segundos, obtener la razón
igual al número 1.
significativas como máximo; los exponentes
se suman algebraicamente para multiplicar,
se restan para dividir, se multiplican por una
potencia deseada para tener el exponente de
la misma y para encontrar raíces se divide el
exponente
Ejemplos:
entre
el
índice
de
la
raíz.
1 minuto
=
1 minuto
1=
60 segundos
1 minuto
60 segundos ó
1 minuto
1=
1 minuto
60 segundos
99
Estas razones o factores que son
requiere para obtener el número. Si el
equivalentes al número 1 se conocen como
número “a” elevado a la potencia “n” (a ) es
factores unitarios, factores de conversión o
igual al número “N”, entonces “n” es el
coeficientes de conversión.
logaritmo de base “a” del número “N.” Es
El
recíproco
de
cualquier
factor
n
decir:
n
unitario es también un factor unitario.
si a = N entonces n = loga de N
En ambos casos el numerador y el
denominador describen la misma cantidad,
La base “a” puede ser cualquier
por lo que se puede efectuar conversiones
número; en la práctica médica se usa como
entre diferentes unidades que miden la
base
misma cantidad.
resultantes se conocen como logaritmos
El método del factor unitario consiste en:
“comunes” o de Briggs. Su símbolo es: log o
log.10
el
número
10
y
los
logaritmos
Los logaritmos son indispensables
1. Tomar una relación entre unidades y
expresarla en forma de una ecuación,
para manejar los datos bioquímicos; constan
2. Luego expresar la relación en forma de
de dos partes que se separan por una coma
una
fracción
(llamada
factor
de
o
punto
decimal;
característica
conversión) y, por último;
3. Multiplicar la cantidad dada por ese factor.
a
la
corresponde
izquierda,
al
orden
la
de
magnitud y puede ser positiva o negativa
unidades
según sea la cantidad mayor o menor de la
idénticas se multiplican o cancelan como
unidad. El exponente de la base 10 para
si fueran números.
números mayores de la unidad es siempre
En
esta
multiplicación,
las
Ejemplo: ¿Cuántos µl hay en 0.00005 L (5 x
-5
positivo. Cuando es negativo se indica con el
signo menos arriba del número que la
10 L)?
representa:
-6
6
1) 1 µl = 10 L ó 1 L = 10 µl
2)
6
10 µl
0.001 = 10
-3
característica 3
1 000 = 10
-3
característica 3
1L
A la derecha, la mantisa es la
3) 5 x 10
-5
L x= 5 x 10
[-5+ 6]
1
= 5 x 10 µl =
fracción
decimal
de
exponente
que
corresponde a los dígitos que ocupan el
50µl.
orden de magnitud; se obtiene de tablas o de
En este método las unidades
se
acarrean en todo el proceso del cálculo, por
lo tanto si la ecuación se establece en forma
calculadoras electrónicas y siempre tiene
valor positivo:
2
log = 0,3010 esto es 10
0.3010
=2
correcta, todas las unidades se cancelan
excepto la deseada.
Cuando la característica y la mantisa
son de diferente signo (+ o –) se opera con el
Logaritmos
cologaritmo que se obtiene por la suma
algebraica de la mantisa positiva con la
El logaritmo de un número es el exponente o
potencia de una base determinada que se
característica negativa es un número todo
negativo, ver el siguiente ejemplo:
100
Log 0.002 = 3.3010 = -2.6990
0.9079
3.000
+ 0.0001
+0.3010
0.9080; log 8091 = 3.9080
-2.6990 cologaritmo
El
antilogaritmo
es
el
número
que
La característica indica la posición del punto
corresponde a un logaritmo dado. Para
decimal en la cifra representada por la
encontrarlo se busca la mantisa en la tabla
mantisa y se determina por inspección del
de antilogaritmos, se determina el número a
número.
que corresponde y se fija la posición del
Para un número mayor que 1, la
punto decimal según la característica. Por
característica es uno menos que el número
ejemplo el antilogaritmo de 1.6747 es 47.29:
de cifras antes del punto decimal; así: la
la característica es 1 (hay dos dígitos a la
característica de 100 es 2 porque el número
izquierda del punto decimal) y la mantisa es
cien tiene 3 dígitos a la izquierda del punto
0.6747, que se buscaría en la tabla de
decimal. Para un número menor que 1, la
logaritmos
característica es numéricamente uno más
corresponde a 4 729.
donde
se
hallaría
que
que el número de ceros que siguen al punto
Los estudiantes deben familiarizarse
decimal; así: la característica de 0.000 000 1
con el uso de logaritmos en las operaciones
es 7 con signo negativo.
comunes.
Para encontrar el logaritmo de un
El logaritmo del producto de dos
número, por ejemplo: 0.000 809, se busca en
números es igual a la suma de sus
la tabla las dos primeras cifras distintas de
logaritmos:
cero de izquierda a derecha (80) en la
primera columna vertical de las tablas
se
log a x b = log a + log b
columna 9, que es el otro número, en donde
El logaritmo del cociente de dos
números es igual al logaritmo del dividendo
menos el logaritmo del divisor:
se lee 9 079, que es la mantisa requerida. La
log a/b = log a – log b
mantisa para 809, 8.09, 0.0809, etcétera; es
El logaritmo de la potencia “n” de un
número es igual a "n" veces el logaritmo del
número:
sigue la horizontal correspondiente hasta la
la
misma
(9
079),
pero
difiere
la
característica. Así:
3
log a = 3 x log a
Log 0.000 809 = 4.9079 = -3.0921
Si el número del cual se requiere el
Gráficas
logaritmo tiene cuatro cifras, la cuarta se
"Una figura equivale a mil datos en una tabla
busca en la misma columna horizontal en la
numérica" y así como se construye un
parte
“partes
modelo para visualizar un conjunto complejo
y debe agregarse a la
de hechos, se utiliza una gráfica para
de
la
proporcionales”
tabla
que
dice
mantisa como diez milésimos.
Por ejemplo, para el número 8 091:
presentar los datos experimentales en tal
forma que fácilmente se asimilen y aprecien
sus relaciones cuantitativas.
Mantisa para 809 = 9 079
parte proporcional para 1 = 1
Se llama gráfica a la representación
esquemática de las variaciones que sufren
101
las distintas magnitudes que intervienen en
Nota: por lo general, es mejor que la
los fenómenos físicos, químicos, biológicos,
curva llene una parte considerable de la
sociales o de cualquier otra índole. Tiene por
página. Muy bien puede usarse la misma
objeto mostrar rápida e intuitivamente la
unidad de medida sobre los dos ejes, pero a
relación
menudo los valores tienen un campo de
que
guardan
las
magnitudes
comparadas.
Entre
variabilidad
las
diferentes
clases
de
gráficas que existen las más importantes son:
muy
amplio,
lo
cual
hace
necesario usar diferente escala para cada
uno de los ejes.
en
Diagrama en barras. Cuando se
expresar las variaciones de un fenómeno
quieren expresar simples comparaciones de
continuo
de
medidas entre sí o para representar un
representar la marcha de dicho fenómeno por
fenómeno discontinuo se emplean las barras,
medio de una línea que une esos puntos.
que pueden ser horizontales o verticales.
Gráfica
por
poligonal.
medio
de
Consiste
puntos
y
Para elaborar una gráfica poligonal
Barras verticales. Las magnitudes se
se trazan en un papel, de preferencia
representan por medio de rectángulos, barras
milimétrico, dos rectas perpendiculares entre
de base igual que descansan en el eje de las
sí que se corten en cero. En cada una de
abscisas y cuya altura es proporcional a la
ellas se representará una de las magnitudes
intensidad del fenómeno y se mide en el eje
que se van a relacionar. El punto cero (0) se
de las ordenadas.
Barras
llama origen y la rectas son los ejes; 0X es el
horizontales.
Las
barras
eje X y 0Y es el eje Y. Para referirse al eje X
descansan sus bases en el eje de las
generalmente se dice: eje horizontal o eje de
ordenadas y el fenómeno se mide en el eje
las abscisas (variable independiente) y para
de las abscisas.
Gráfica de sectores circulares. Para
el eje Y: eje vertical o eje de las ordenadas
(variable dependiente).
hacer una gráfica de este tipo hay que tener
Los ejes dividen su propio plano en
cuatro regiones llamadas cuadrantes que se
en cuenta que el círculo debe tener el total de
las magnitudes que se van a representar.
numeran I, II, III y IV. En el laboratorio
utilizamos
habitualmente
sólo
el
primer
cuadrante (figura I.1).
Los
sectores
proporcionales
a
las
circulares
son
magnitudes
que
representan; magnitud que se mide en
Las distancias a la derecha de 0, a lo
grados de circunferencia. Para determinar el
largo del eje X, se consideran como positivas
número de grados que deben tener dichas
y las de la izquierda como negativas.
partes se plantearán una serie de reglas de
Similarmente, hacia arriba de 0, a lo largo del
tres para cada una de ellas en las cuales se
eje Y, se miden las distancias positivas y
consideran:
hacia abajo de 0 las negativas.
como
Después se trazan los puntos cuyas
distancias
a
uno
de
los
ejes
sean
proporcionales a la magnitud que se va a
100%
a
la
suma
total
de
las
magnitudes que se quieren graficar, para
obtener
correspon
en
cada
diente;
caso
el
una
vez
porcentaje
obtenido
representar y, finalmente, al unir estos puntos
por medio de segmentos de recta, se tiene la
gráfica poligonal.
102
de agua en un tubo de centrífuga y se rota a
2 000 rpm (revoluciones por minuto) a una
distancia radial de 16 cm, la fuerza es:
2
f = 0.01096 x 2000 x 1 x 16 = 701 440 dinas
Si transformamos las dinas a peso,
entonces el gramo de agua tiene peso
porque es atraído al centro de la Tierra de
acuerdo con la ley de la gravitación y es
atraído en estado normal, con 980 dinas de
fuerza. Si usamos, por lo tanto, peso en vez
de dinas como la unidad de nuestro problema
tendremos:
2
éste, se pasará a grados, considerando
360o como 100% y procediendo entonces a
hacer la gráfica.
f = 0.01096 x n mr = 717 g
980
o sea, interpretando la fórmula, la fuerza de
contención para sostener la unidad masa (el
ALGUNOS MÉTODOS UTILIZADOS EN
gramo) e impedir que se vaya del centro de
BIOQUÍMICA
rotación es la fuerza que la gravedad ejercía
sobre 716 g o, dicho de otra manera, el
Centrifugación
gramo a esa velocidad pesa en el fondo del
Un método muy útil en el laboratorio para
separar sustancias de diferente densidad
suspendidas
en
un
líquido
es
la
centrifugación; en ella, la acción de la fuerza
centrífuga (fuerza necesaria para desplazar
hacia
afuera
un
determinado
peso
en
dirección radial) da como resultado que las
partículas más pesadas se sedimenten más
rápido que las partículas ligeras.
tubo de la centrífuga 716 gramos comparado
con el tubo en reposo o 716 veces la fuerza
de la gravedad (g).
La
centrifugación
y
ultracentrifugación son operaciones que se
basan en el principio anterior y que permiten
separar los componentes de una mezcla.
Las centrífugas ordinarias operan a
rotaciones menores de 10 000 revoluciones
por minuto (rpm). Las condiciones que limitan
La fuerza centrífuga depende de la
esta velocidad son la resistencia de la parte
cantidad de materia (m) que se desplaza
de la centrífuga que sostiene el rotor (brazo),
hacia afuera cuando está rotando a una
la fricción con el aire y el calentamiento.
velocidad por minuto de (n) veces a una
Las
ultracentrífugas
operan
en
distancia radial (r) y se expresa por la
cámaras refrigeradas, evacuadas de aire, y el
fórmula:
rotor no gira sostenido por un “brazo” sino
2
f (en dinas) = 0.01096 n m r
impulsado por chorros de aceite o aire
comprimido que se aplica a una porción
En el sistema métrico decimal, la unidad de f
externa del rotor sostenido por una pared
es la dina, la de m es el gramo y la de r es el
muy gruesa de una cámara cilíndrica de
centímetro. Ejemplo: si se coloca un gramo
103
rotación. Se alcanzan velocidades de 20 000
peso determinado debe estar otro, en la
a
misma posición, con el mismo peso. El
70 000 rpm.
La
sedimentación
ultracentrífuga
se
expresa
en
en
la
unidades
descuido de esta regla implica un desnivel
que,
a
las
velocidades
y
fuerzas
Svedberg (símbolo: S) y se aplica a la
señaladas, puede romper los tubos y
comparación
tamaños
dañar el aparato. Para balancear por
moleculares que no sólo dependen de la
pares los tubos lo mejor es usar una
masa de las moléculas implicadas sino
balanza de dos brazos y ajustar el peso
también
hasta que sea idéntico.
de
práctica
su
forma.
de
Es
importante
considerar que los valores de Svedberg no
2. Para no forzar el motor arránquese
son aditivos, es decir, dos partículas 5S no
gradualmente la centrífuga hasta alcanzar
crean una partícula 10S. Sin embargo, hay
una correspondencia tosca que para las
proteínas esféricas es de:
la velocidad requerida.
3. Nunca se frene una centrífuga; déjese
parar por su propia inercia; el no hacer
esto conduce a que se agite el contenido
2 S = 10 kdal
4 S = 50 kdal
8 S = 160 kdal
16 S = 400 kdal
de los tubos y se eche a perder el trabajo.
4. No alzar las tapas de la centrífuga cuando
está en movimiento.
5. Ante cualquier dificultad o duda consulte
La unidad Svedberg es igual a 10
–13
al profesor.
segundos; no pertenece al SI y puede
Potenciometría
suplirse por 0,1 picosegundo (ps) o 100
Muchas de las reacciones que se realizan en
femtosegundo (fs). En las moléculas menos
las células son reacciones de oxidación y de
densas que el medio de suspensión, como
reducción, es decir, en las que se transfieren
las lipoproteínas, el desplazamiento es hacia
electrones.
la superficie y se expresa en Svedberg de
La
flotación (Sf) y permite la clasificación en:
reacciones
LDL, HDL y VHDL (low density, high density
transferencia de uno o más electrones.
y very high density) con Sf de 0 a 10, 10 a
La oxidación es la pérdida o liberación de
400 y las muy densas que no flotan y tienen
electrones y la molécula que los cede se
una densidad mayor de 1.
denomina agente reductor.
El peligro del mal uso de la centrífuga deriva
La reducción es la ganancia de electrones y
de la enorme fuerza que alcanza en el radio
la molécula que los acepta se denomina
de rotación y el “peso” de las sustancias
agente oxidante.
colocadas en el campo gravitacional del
aparato.
Se debe tener cuidado con los
electroquímica
químicas
en
estudia
las
que
las
hay
Cuando se oxida un agente reductor,
se transforma en su forma oxidada y como la
reacción es reversible las formas oxidada y
siguientes puntos:
reducida del compuesto constituyen un par
1. Los tubos en las centrífugas deberán
conjugado llamado par redox o par de
colocarse por pares para que no haya
oxidorreducción.
diferencia de peso en un lado de la
El proceso de oxidación siempre va
centrífuga. Enfrente de un tubo de un
acompañado del proceso de reducción ya
104
que los electrones que cede una molécula
electrodo (E) a la diferencia de potencial
reductora son aceptados por una molécula
respecto
oxidante, lo cual constituye las reacciones de
arbitrario y depende de la concentración de
oxidorreducción o reacciones redox.
las moléculas en la solución y de la
La determinación cuantitativa de la
a
un
electrodo
de
referencia
temperatura.
concentración de las moléculas oxidantes y
En general, el potencial de los
reductoras en una solución es el objeto de
electrodos
estudio de la potenciometría. En esta técnica
electrodo de hidrógeno al que se le ha
se determina el potencial eléctrico generado
asignado.
por la transferencia de electrones en una
En general, el potencial de los electrodos se
reacción redox en la cual estén involucradas
mide
las moléculas a estudiar. Este potencial se
hidrógeno
mide en una celda electroquímica. La celda
arbitrariamente un potencial de cero a 25o C
más común es la de Daniell (Fig. I.2), en la
a una concentración de 1 mmol/L y una
que en dos compartimientos separados que
contienen ZnSO4 y CuSO4 se colocan cinc y
presión del gas de una atmósfera. Sin
cobre metálico, respectivamente; las dos
porque se trata de un electrodo gaseoso.
se
con
mide
con
referencia
al
que
al
se
le
referencia
electrodo
ha
al
de
asignado
embargo, en la práctica es inconveniente
soluciones se conectan por un puente salino
(un tubo que contiene agar embebido en una
solución de un electrolito como el KCl).
Cuando los dos electrolitos se conectan por
un alambre metálico, ocurre un flujo de
electrones del electrodo de cinc al electrodo
de cobre, el cual puede ser medido por
medio de un voltímetro. Cuando el cinc cede
los electrones se convierte en ion soluble,
mientras que el cobre disuelto, al aceptar los
electrones, se convierte en cobre metálico
que se deposita en el electrodo. El puente
salino cierra el circuito eléctrico entre las dos
soluciones.
El hecho de que fluya una corriente
eléctrica del polo positivo (ánodo, que en
este caso es el electrodo de cinc) al polo
negativo (cátodo, que en este caso es el
electrodo de cobre), significa que hay una
diferencia de potencial entre los electrodos
denominada fuerza electromotriz (fem) de la
celda. Dado que el potencial de un electrodo
está relacionado con la magnitud de cargas
positivas existentes, la diferencia de potencial
compara las cargas relativas existentes en
dos puntos. Se denomina potencial de
Fig. 1.2 Celda de Daniell
Es por ello, que se usan otros
electrodos de referencia, como el de calomel,
en el cual el sistema de medición es mercurio
y cloruro mercuroso. En el caso de este
electrodo, como sucede con todos los pares
redox, debe calibrarse con respecto al
electrodo de hidrógeno.
Los pares redox de interés para el
bioquímico
incluyen
a
menudo
al
ion
hidrógeno como reactivo o como producto,
por lo que tales sistemas están en función del
pH del medio.
105
Hay diferentes tipos de electrodos:
El electrodo de vidrio consiste en una
los metálicos (como los de la celda de
membrana de vidrio situada al final de un
Daniell), los metálicos-sal insoluble (como el
tubo de vidrio o plástico de paredes más
de plata/cloruro de plata), los gaseosos
gruesas. En el tubo se encuentra ácido
(como el de hidrógeno, que se adsorbe sobre
clorhídrico diluido saturado de cloruro de
platino), los electrodos selectivos de iones
plata y un hilo de plata que conecta a la
(que pueden ser para aniones o para
terminal del voltímetro con un electrodo de
cationes) y los de vidrio (que son electrodos
referencia. El pH se determina midiendo la
selectivos
para
diferencia de potencial a través de la
determinar H ). Estos últimos son los más
membrana de vidrio que separa la solución a
utilizados ya que una de las aplicaciones
la cual se quiere determinar el pH, de la
prácticas
solución de referencia cuya concentración de
de
iones,
especiales
+
más
importantes
de
la
potenciometría es la determinación del pH.
hidrogeniones se conoce.
Dentro del electrodo de vidrio hay un
El
esquema
del
circuito
de
un
alambre de plata con un extremo sumergido
potenciómetro típico se encuentra en la figura
en una solución de HCl 0.1M. El bulbo de la
I.3. La sensibilidad del medidor se puede
parte inferior es de un vidrio especial,
ajustar para cambios de acuerdo a la
+
permeable a los iones H . La superficie
temperatura
interior de esta membrana de vidrio está en
temperatura). Con el botón de calibración a
contacto con la solución de HCl y la exterior
cero se introduce un voltaje lateral en el
con la solución cuyo pH se quiere determinar.
circuito
En las dos superficies la membrana de vidrio
corresponda al pH de la solución reguladora
absorbe agua y forma una capa de gel a
tipo. Los medidores de pH se construyen de
través
de
la
cual
difunden
los
que
(botón
permite
de
que
control
la
de
lectura
iones
tal manera que el cero de la escala del
hidrógeno y desplazan a otros iones de la
potenciómetro corresponda a un pH de 7. El
estructura del vidrio (como sodio) y esto
medidor se calibra antes de usarlo, primero
provoca el establecimiento de un potencial.
En una solución amortiguadora que contenga
–
Cl se sumerge un electrodo de Ag/AgCl.
Cuando el electrodo se coloca en una
solución cuyo pH es diferente al de la
solución
amortiguadora,
diferencia
de
potencial
aparece
entre
los
una
dos
extremos, lo cual es una medida de la
diferencia de los dos valores de pH.
La determinación más precisa del pH
se realiza en un pH-metro que consiste,
fundamentalmente,
en un
potenciómetro
diseñado para emplearse con un sistema de
electrodo de vidrio. Como una unidad de pH
corresponde a 59 milivoltios a 25º C, el
con una solución reguladora de pH 7,
mismo medidor se puede usar con dos
ajustando el cero para que dé la lectura
escalas para hacer lecturas en mv o en pH.
exacta; se lava el electrodo con agua
106
destilada o desionizada y se calibra con una
del medio en que se mueve, la facilidad con
segunda solución reguladora de pH 4 ó 10;
la que se mueve una partícula cargada
se ajusta nuevamente el medidor, ahora con
depende
el control de temperatura, para que dé la
inversamente
lectura exacta; luego se determina el pH de
viscosidad del medio.
la solución problema.
directamente
de
su
de
su
tamaño
carga
y
de
e
la
Existen dos tipos de electroforesis: la
frontal y la zonal.
Electroforesis
Electroforesis frontal o en medio
Una partícula coloidal o un ion provistos de
líquido. Es el método clásico de Tiselius en el
carga eléctrica emigran hacia el ánodo o el
que la separación de los componentes de
cátodo bajo la influencia de un campo
una mezcla se realiza en varios frentes o
eléctrico externo. Si las partículas de una
límites que se traslapan a lo largo del
mezcla tienen diferentes velocidades de
procedimiento. El movimiento de los frentes
desplazamiento, puede aprovecharse esta
se realiza en un canal vertical y la densidad
propiedad para separarlas. El empleo de
de la solución por debajo del frente debe ser
fuerzas eléctricas para lograr esta separación
mayor que la de arriba, ya que en caso
se
depende
contrario el sistema de frentes se destruiría.
fundamentalmente de la carga y no de la
En el método, la solución a separar se coloca
masa molar de las partículas cargadas. Esta
encima del medio amortiguador conductor.
técnica
llama
se
electroforesis
la
La técnica es difícil y costosa, aunque puede
péptidos,
presentar la ventaja de que se evitan las
nucleótidos, ácidos orgánicos y porfirinas,
interacciones de los solutos con cualquier
entre
importante
superficie y se eliminan así los efectos
considerar que en el caso de una proteína su
adsorbentes y desnaturalizantes. Además,
carga depende del pH del medio, por lo que
puede operarse en medios acuosos, a baja
es posible emplear la técnica para determinar
temperatura y bajo condiciones favorables de
el punto isoeléctrico de la misma.
pH y fuerza iónica.
Electroforesis zonal. Uno de los
separación
otros
ha
y
de
empleado
proteínas,
compuestos.
Es
en
Si se aplica un campo eléctrico a
través de una solución, la fuerza que actúa
sobre las moléculas cargadas de soluto
depende de la carga eléctrica (e); del número
de cargas en la molécula (z), y de la fuerza
del campo eléctrico (E). Inmediatamente
después de poner a funcionar el campo, las
partículas cargadas se aceleran hasta que
alcanzan un equilibrio, o sea, cuando la
carga electrostática queda equilibrada por la
fuerza de fricción que ejerce el medio
disolvente; entonces, se mueven a una
velocidad constante. La velocidad por unidad
de campo eléctrico se denomina movilidad
electroforética. Dado que la fricción depende
del tamaño de la partícula y de la viscosidad
problemas que presenta la técnica anterior es
la necesidad de estabilizar las zonas de
soluto contra la convección gravitacional y la
difusión. Esto originó el empleo de otra
técnica de electroforesis: la electroforesis
zonal. En ella, el empleo de gradientes de
densidad, sólidos porosos o fibrosos y geles
permite resolver el problema de la difusión y
de la convección gravitacional.
En este tipo de electroforesis la
mezcla de solutos a separar se aplica como
una mancha o una banda delgada en un
punto del canal electroforético. Los solutos
migran con distintas velocidades (de acuerdo
a su movilidad) y se separan en zonas
discretas. La distancia de migración es
107
directamente proporcional al voltaje aplicado
y al tiempo. Los solutos migran a través del
solvente que baña un soporte sólido. Este
soporte puede ser de diversa naturaleza y
cada uno presenta algunas ventajas y
desventajas en su uso. Los soportes más
comunes son papel, acetato de celulosa,
almidón, agar, agarosa y poliacrilamida.
Dado que en el caso de los geles es posible
un manejo del tamaño del tamizado para
lograr una máxima eficiencia en la
separación, este método es el más usado en
bioquímica.
tal manera que se establezca el contacto con
las soluciones en que están los electrodos.
Los
aparatos
se
tapan
para
evitar
la
evaporación y para mantener una atmósfera
húmeda dentro del aparato.
Electroforesis en geles de agar y
agarosa.
El
agar
polisacáridos que
es
una
mezcla
de
se obtiene de ciertas
especies de algas marinas. Está constituido
de dos componentes principales: uno lineal o
agarosa y uno ramificado y muy ácido
llamado agar o pectina. El agar y la agarosa
son solubles en soluciones acuosas a 100oC
En la técnica hay que cuidar algunos
y solidifican a temperatura ambiente; forman
aspectos que pueden afectar la separación
geles de buena firmeza cuando se usan a
como: la selección adecuada del soporte, del
una concentración de 0.5 a 2%. Su estructura
amortiguador, vigilar la temperatura de la
se mantiene por numerosos puentes de
cámara, la intensidad del campo eléctrico, el
hidrógeno entre cadenas adyacentes de
tiempo, etcétera.
polisacáridos. El gel de agarosa ofrece
Electroforesis en papel y en acetato
ciertas ventajas sobre otros soportes; posee
de celulosa. La electroforesis en papel fue el
una porosidad elevada y uniforme, lo que
primer método de separación en zonas en un
favorece
campo eléctrico. Es una técnica sencilla y
sustancias cargadas, lo cual se traduce en
rápida, que requiere pequeñas cantidades de
una mayor resolución.
la
migración
regular
de
las
muestra y que es especialmente útil en las
Para realizar la electroforesis en
electroforesis de alto voltaje para separar
estos medios se prepara el gel sobre una
moléculas de bajo peso molecular como
superficie de vidrio. Una vez solidificado el
aminoácidos, péptidos, oligonucleótidos y
gel, se hacen pocillos en él para aplicar en
otros compuestos orgánicos con grupos
ellos la muestra. Se lleva a cabo, o se
cargados. Ha sido muy utilizada en el mapeo
"corre", la electroforesis y, al final, se fija la
bidimensional de proteínas (huella génica),
preparación, se tiñe y se seca. La técnica se
para identificar diferencias entre proteínas
ha
similares,
inmunodifusión en el análisis inmunológico
probar
que
una
proteína
es
producto de otra de mayor tamaño, etcétera.
Dado que el papel tiene una alta
usado
en
combinación
con
la
de proteínas y en la cuantificación de
proteínas inmunoprecipitables.
actividad endosmótica*, lo que causa algunos
La electroforesis en agarosa ha
problemas en la electroforesis, ha sido
permitido el estudio de las moléculas del
sustituido por el acetato de celulosa, que
DNA, cuyo tamaño impide que puedan
tiene una estructura microporosa uniforme,
penetrar en los geles de poliacrilamida, pero
actividad endosmótica baja y en el que la
que penetran fácilmente en geles de agarosa
adsorción de las proteínas ha sido eliminada.
a 0.2%, si tienen un peso hasta de 150 x 10 ,
En los aparatos en que se realizan
6
6
o a 0.8% si pesan hasta 50 x 10 .
estas técnicas el soporte se humedece al
sumergirlo en el amortiguador y colocarlo de
108
Es posible separar moléculas de
como la urea y el SDS sin que sean
DNA que difieren sólo 1% de peso molecular
afectados.
También
según sea la concentración de la agarosa.
agentes
reductores
Para detectar las bandas, se sumerge el gel
mercaptoetanol o ditiotreitol para romper los
en una solución de bromuro de etidio el cual
puentes disulfuro de las proteínas.
se pega al DNA y fluoresce cuando se excita
pueden
emplearse
como
el
2
Las dos aplicaciones principales de
con luz ultravioleta. El peso molecular se
la
determina por la distancia de migración.
determinación de la pureza de proteínas y el
También se han usado estos geles de
análisis de los componentes de una mezcla.
agarosa para la obtención de mapas de
La electroforesis en gel de poliacrilamida en
restricción, los que permiten ver diferencias
presencia de SDS también se ha empleado
entre dos moléculas de DNA, localizar
en la determinación de los pesos moleculares
mutaciones, detectar recombinaciones de
de proteínas.
fagos, aislar fragmentos de DNA deseados,
Electroenfoque. Si se coloca una proteína en
distinguir entre el DNA lineal, circular o
un gradiente de pH sujeto a un campo
superenrollado.
eléctrico, se moverá hasta alcanzar su punto
Electroforesis
en
geles
de
electroforesis
isoeléctrico,
discontinua
donde
son
permanecerá
la
sin
poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida
moverse. Esta técnica es lo que se conoce
son geles totalmente sintéticos que han
como
sustituido a los geles de almidón en el
gradiente estable y continuo de pH se usan
estudio rutinario de proteínas por métodos
anfolitos sintéticos de una gran variedad de
electroforéticos. Esto ha sido posible gracias
pesos moleculares y rangos de pH. Cuando
a la gran facilidad con que puede variarse
se establece el campo eléctrico, los anfolitos
según el contenido total del monómero y su
migran y generan el gradiente de pH según
grado
su
sus propios puntos isoeléctricos. Esta técnica
capacidad de filtrador molecular, se ha
ha sido utilizada en combinación con la
empleado para separar compuestos con
separación por pesos moleculares en la
base en su peso molecular para lo que se
electroforesis bidimensional como método de
usa lauril sulfato de sodio (SDS) con el objeto
análisis de proteínas.
de evitar las diferencias individuales en las
*Nota:
cargas de las proteínas.
eléctrico a un líquido contenido en un soporte
Los amortiguadores que se usan pueden ser
no conductor el líquido se moverá hacia uno
continuos (en los que se utiliza el mismo
u otro electrodo, en favor o en contra del
amortiguador
movimiento
de
entrecruzamiento.
en
los
Dada
tanques
de
los
electroenfoque.
Cuando
se
Para
aplica
electroforético,
formar
un
un
potencial
alterando
la
electrodos y los sistemas electroforéticos) y
movilidad electroforética de las partículas
discontinuos, en los que hay dos tipos de
cargadas. Este fenómeno se conoce como
geles: el de separación, o de poro cerrado,
endosmosis. Si el soporte está cargado,
en el cual se resuelven los componentes de
induce la orientación de las cargas con signo
una mezcla (aquí es importante el uso del
opuesto en el líquido, lo que ocasionará al
amortiguador
aplicar la corriente eléctrica que ocurra un
adecuado)
y
el
gel
concentrador, o de poro abierto, que sirve
flujo
para concentrar la muestra. A los geles se les
electroforético. Este fenómeno es lo que se
puede
conoce como actividad endosmótica y puede
incorporar
sustancias
disociantes
del
líquido
dentro
del
canal
109
causar
problemas
en
las
separaciones
electroforéticas.
cuantitativa, el soluto ni el solvente; los
métodos cuantitativos más comunes, que
sirven para expresar
la concentración (la
SOLUCIONES
medida numérica de la cantidad relativa de
Una solución es una mezcla homogénea de
soluto en la solución) de las soluciones, son
por lo menos dos componentes: una fase
las porcentuales, las molares y las normales.
dispersa, que es el soluto (sustancia que se
disuelve), y una dispersora que constituye el
Soluciones porcentuales
solvente o disolvente (la sustancia que
En las soluciones porcentuales no se toma
disuelve al soluto) y que, generalmente, se
en cuenta el peso fórmula del soluto. En este
encuentra
Las
tipo de soluciones se debe especificar si la
soluciones más utilizadas en bioquímica son
relación es peso a peso (p/p), peso a
las que tienen agua como solvente.
volumen (p/v) o volumen a volumen (v/v).
en
mayor
proporción.
La solubilidad de un soluto en un
Ejemplos:
solvente depende de la naturaleza de éstos,
Solución porcentual p/p. Solución al
de la temperatura y, en el caso de un gas, de
10% de NaCl contiene 10 g de la sal por 100
la presión. La solubilidad generalmente está
g de solución. El peso/peso porcentual
dada en gramos de soluto por 100 g de
expresa el número de gramos del soluto en
solvente.
100 gramos de la solución final.
Se llaman soluciones diluidas las que
contienen
una
proporción
relativamente
%p/p = g de soluto
pequeña de soluto; se llaman soluciones
x 100
100 g de solución
concentradas las que contienen una gran
cantidad
posibles
Solución porcentual p/v. Solución de NaCl
soluciones concentradas cuando el soluto es
de
soluto.
Sólo
son
a 10% p/v: 10 g de NaCl en 100 ml de
muy soluble.
solución. Esto expresa el número de gramos
Una solución saturada contiene la
de soluto en 100 ml de la solución final. En
cantidad de soluto disuelto necesaria para la
bioquímica, si no se especifica otra situación,
existencia
las
de
un
equilibrio
entre
las
moléculas disueltas y las moléculas en
soluciones
porcentuales
deben
entenderse como p/v.
exceso que no están disueltas. Esta solución
se forma por medio de una vigorosa agitación
con exceso de soluto. Existe una solución
sobresaturada cuando en la solución hay
presente más soluto que en una solución
saturada. Para prepararla se forma una
solución saturada a temperatura elevada y se
enfría
cuidadosamente
para
evitar
la
cristalización. Las soluciones sobresaturadas
son inestables y con facilidad se convierten
en soluciones saturadas.
Las mencionadas soluciones son
poco precisas y no indican, de manera
%p/p = g de soluto
x 100
100 ml de solución
Solución porcentual v/v. Se utiliza
cuando el soluto y el solvente son líquidos. El
v/v indica el número de volúmenes de soluto
por 100 volúmenes de solución. Solución de
etanol a 30% v/v: 30 ml de éste en 100 ml de
solución. Esto quiere decir que por cada 100
ml de solución, 30 ml corresponden al soluto
y el resto, hasta completar 100 ml, al agua
destilada o al solvente empleado.
110
%v/v = volumen de soluto
x 100
Resultado: necesitamos 10.41 ml de
100 volúmenes de solución
Es
importante
insistir
alcohol de 96% y completar con agua
que
los
destilada hasta un volumen final de 50 ml.
términos porcentuales expresan siempre una
relación,
es
decir,
podemos
variar
los
volúmenes siempre y cuando no perdamos
dicha relación. Por ejemplo, si nos pidieran
preparar 50 ml de una solución de alcohol
etílico a 20%, seguiríamos el siguiente
Soluciones molares
Una solución molar se define como el
número de moles de soluto en un litro de
solución:
M= No. de moles
planteamiento:
litro de solución
100 ml de sol. tienen 20 ml de alcohol puro
50 ml de sol. tienen x ml de alcohol puro
donde un mol es igual al peso atómico o
molecular expresado en gramos (átomo
X = 20 x 50 x 10
100
gramo o molécula gramo). Un mol contiene el
número
de
23
Avogadro
(6.023x10 )
de
partículas, átomos o moléculas.
Resultado: necesitamos 10 ml de
alcohol puro y completar un volumen de 50
ml.
El alcohol etílico común es de 96%
de pureza (v/v). Por lo tanto, si no contamos
con alcohol puro y quisiéramos preparar una
solución de alcohol a 20%, seguiríamos el
siguiente planteamiento:
100 ml de sol. tienen 96 ml de alcohol puro
Si un mol de una sustancia se
disuelve en agua hasta un volumen de un
litro, se obtiene una solución 1 molar (1M).
Por ejemplo, si quisiéramos preparar
una solución 1 molar de NaCl, tendríamos
que considerar, primero, su peso molecular
(Na: 23 + Cl: 35.5 = 58.5) y este valor en
gramos disolverlo en agua, hasta completar
un litro.
X ml de sol. tienen 20 ml de alcohol puro
Ahora bien, si nos piden preparar 400
ml de una solución 0.5 M de NaCl: ¿cuántos
X= 20 x 100 = ml de solución
96
Resultado: necesitamos 20.83 ml de
solución de alcohol a 96% y completar un
volumen de 100 ml.
Si tan sólo queremos 50 ml de esta
nueva solución, entonces:
100 ml de sol. de alcohol a 20% tienen
gramos de NaCl deben pesarse?
1. Sabemos que un mol de NaCl es de 58.5
g.
2. Haremos el siguiente planteamiento:
Una sol. 1M tiene 58.5g de NaCl.
Una sol. 0.5M tiene X g de NaCl.
X= 0.5 x 58.5 = 29.25 g de NaCl
20.83 ml de alcohol a 96%
100
50 ml de sol. de alcohol a 20% tienen X ml
de alcohol a 96%
3. De acuerdo con la definición de solución
molar,
X= 50 x 20.83 = 10.41ml
los
29.25
g
de
NaCl
los
consideramos en un litro de solución, pero
100
111
como nos piden preparar 400 ml haremos
Ejemplo: el peso equivalente de un
el siguiente planteamiento:
ácido se calcula dividiendo el peso molecular
En 1000 ml de sol. hay: 29.25g de NaCl
entre el número de átomos de hidrógeno
En 400 ml de sol. hay: X g de NaCl
sustituibles en la molécula. El ácido sulfúrico
(H2SO4), de peso molecular 98, tiene dos
X= 400 x 29.25 = 11.7 g de NaCl
átomos de hidrógeno sustituibles en cada
1000
molécula; por lo tanto, su peso equivalente
es: 98/2 = 49.
Resultado: necesitamos 11.7 g de
NaCl
y
disolverlo
hasta
completar
El peso equivalente de un hidróxido
un
se calcula dividiendo el peso molecular entre
En este ejemplo, como podemos ver,
el número de grupos hidroxilo (OH ) de la
molécula. El hidróxido de aluminio Al (OH)3
–
volumen de 400 ml.
hemos
multiplicado
la
molaridad
–
del
contiene tres grupos OH por molécula; su
problema (0.5 mol/L) por el peso molecular
peso molecular es de 78; por lo tanto, su
de NaCl (58.5 g) y por el volumen del pro-
peso equivalente es 78/3 = 26.
blema (400 ml). Posteriormente dividiremos
El peso equivalente de una sal se
entre 1 litro (1 000 ml). Para simplificar el
calcula dividiendo el peso molecular entre la
procedimiento podemos aplicar la siguiente
valencia
fórmula:
positivas) que contenga la fórmula. La
V x PM x M = gramos de la sustancia
1000
total
de
los
cationes
(cargas
valencia del sodio es 1, y el sulfato de sodio
Na2SO4 (peso mo-lecular 144) tiene dos
iones de sodio en cada molécula; por lo
tanto, el peso equivalente del sulfato de sodio
En donde:
V=
Volumen del problema en ml.
PM =
Peso molecular de la sustancia en g.
M=
Molaridad del problema.
será 144/2 = 72.
El peso equivalente de un oxidante
(reductor) se calcula dividiendo el peso
molecular entre el número de electrones
ganados (o perdidos) que puedan aportar por
Soluciones normales
Son las que contienen el peso equivalente de
una sustancia en gramos por litro de
solución:
molécula.
Recordemos la fórmula utilizada para
calcular la cantidad de sustancia necesaria
para preparar cualquier cantidad de una
N = peso equivalente
litro de solución
solución determinada:
Para calcular la cantidad de una sustancia
que se necesita pesar para preparar un
donde el peso equivalente de una sustancia
es el número de unidades de esta sustancia
que puede combinarse con una unidad de
hidrógeno:
volumen determinado de una solución de
cualquier normalidad, se aplica una fórmula
semejante:
V x Eq x N = gramos de la sustancia
Peso equivalente = peso molecular
1000
n
n = número de hidrógenos sustituibles.
112
Ejemplo: preparar una solución 0.1 N
de cloruro de calcio (CaCl2) para obtener un
osmolalidad; en las soluciones muy diluidas,
volumen de 300 ml:
medidas son tan cercanas que con gran
como son las del cuerpo humano, las dos
frecuencia se utilizan indistintamente.
V =
300 ml
N =
Eq =
0.1
peso molecular del CaCl2
111/2 = 55.5
Sustituyendo=300 ml x 55.5 g x 0.01 N= 1.67
1000
La presión osmótica depende del
número de partículas y no de su carga, ni de
su masa; la misma fuerza osmótica es
ejercida por una molécula grande, como una
proteína, con peso molecular de varios miles
y muchas cargas, como por una molécula de
+
Resultado: necesitamos 1.67 g de
CaCl2 para preparar 300 ml de una solución
–
glucosa o un ion de Na o de Cl . Así para
determinar
el
efecto
osmótico
de
una
solución hay que sumar los efectos de todas
0.1 N.
las partículas incapaces de atravesar la
membrana independientemente de su peso
Soluciones osmolares
molecular.
El fenómeno de la ósmosis se presenta
cuando una solución está separada de su
Por ejemplo: el cloruro de sodio en
solución
acuosa
se
disocia
casi
+
solvente por una membrana semipermeable.
completamente en iones sodio (Na ) y cloruro
La ósmosis es la difusión de solvente a
(Cl ). Por lo tanto, cada molécula da origen a
través de la membrana desde la parte de
dos partículas osmóticamente activas, y una
menor a la de mayor concentración. La
solución osmolar contiene media molécula
presión osmótica es la presión que debe
gramo
aplicarse
gramos) por litro, o sea:
sobre
la
solución
de
mayor
–
(peso
molecular
expresado
en
concentración a fin de impedir el paso del
1 osm/l = 58.5/2 = 29.25 g/l ó también
solvente (ósmosis) a través de la membrana.
1 mol de NaCl = 2 osm/l
Las membranas biológicas tienen
permeabilidades dis-tintas y se dice que son
semipermeables,
es
decir,
que
son
permeables de forma selectiva para las
moléculas
del
solvente
o
En cambio, la glucosa en solución no
se disocia y para esta sustancia la solución
osmolar contiene un mol en gramos por litro:
pequeñas
1 mol de glucosa = 180 g/l = 1 osm/l
moléculas, pero no permiten el paso libre de
La mayoría de los líquidos corporales
todas las moléculas disueltas.
cuantitativas
tiene una presión osmótica que concuerda
demuestran que la presión osmótica es
con la de una solución de cloruro de sodio a
proporcional a la concentración molar (para
0.9 % y se dice que esta solución es
sustancias no disociables) del soluto, por lo
isosmótica con los líquidos fisiológicos.
Las
mediciones
que una solución osmolar es aquella que
contiene un mol de la sustancia en gramos
Soluciones isotónicas
en un litro de solución; el osmol es una
Las soluciones isotónicas con respecto unas
medida del número total de partículas en
a otras ejercen la misma presión osmótica;
solución. La concentración expresada en
es decir, contienen la misma concentración
osmol por litro se llama osmolaridad; el osmol
de partículas osmóticamente activas. Cuando
por kilogramo de disolvente se denomina
se
habla
de
soluciones
isotónicas
en
113
el
laboratorio, suele tratarse de las que
tienen la misma presión osmótica que el
plasma
sanguíneo,
ximadamente
de
que
0.3
es
osmolar
apro(300
miliosmoles). Las soluciones fisiológicas de
concentración menor a 300 mosm/l se llaman
hipotónicas; cuando su concentración es
mayor
de
300
mosm/l
se
denominan
hipertónicas.
Una solución es isotónica con
respecto a una célula viva cuando no ocurre
unidad de solución original diluida a un
volumen final de 10, esto es, 1 volumen de
solución original con 9 volúmenes
solvente (volumen final = 10).
Para calcular la concentración de la
solución diluida se multiplica la concentración
de la solución original por la dilución
expresada como fracción.
Ejemplo: una solución de 300 mg/100
ml se diluye en la razón 1:10. La
concentración de la solución final es:
ganancia ni pérdida neta de agua en la
célula, ni se produce ningún otro cambio en
ésta cuando entra en contacto con la
solución.
El término isotónico, que significa:
igualdad de tono, se emplea en medicina
como sinónimo de isosmótico; pero los
términos isotónico y tonicidad sólo deben
emplearse en relación con un líquido
fisiológico. Por ejemplo, una solución de
ácido bórico que es isosmótica con la sangre
y el líquido lagrimal, sólo es isotónica con el
líquido lagrimal, ya que esta solución
ocasiona hemólisis de los eritrocitos porque
las moléculas de ácido bórico atraviesan
libremente la membrana eritrocitaria a
cualquier concentración. En consecuencia,
isotonicidad
connota
compatibilidad
fisiológica, mientras que isoosmoticidad, no
necesariamente. En otras palabras, la
tonicidad es una fracción de la presión
osmótica total de la solución; por tanto, la
tonicidad de una solución no se puede
predecir únicamente por su composición ya
que intervienen también las propiedades
distintivas de la membrana limitante.
de
300 x 1/10 = 30 mg /100 ml.
Si se hace más de una dilución, a
partir
de
una
misma
solución,
la
concentración de la solución final se obtiene
al multiplicar la concentración original por el
producto de las diluciones. Ejemplo: la
solución anterior se diluye a su vez en la
razón 1:100. La concentración de la solución
será: 300 x 1/10 x 1/100 = 0.3 mg/100 ml.
La dilución y redilución sistemáticas
de
una
solución
se
llaman
diluciones
seriadas. Para encontrar la concentración en
un tubo dado de la serie, se multiplica la
dilución en ese tubo por cada una de las
diluciones precedentes, incluida la del tubo
original.
Ejemplo: hacer una dilución seriada
1:2, 1:4, 1:8, etcétera, a un volumen final de
1 ml.
Paso 1: a 0.5 ml de la solución a
diluir,
añadirle
etiquetarlo
0.5
como
ml
tubo
del
1
diluyente
(dilución
y
1:2,
volumen 1 ml).
Paso 2: transferir a otro tubo 0.5 ml
de la dilución anterior y agregarle 0.5 ml de
diluyente (dilución 1:2). La dilución final
Cálculo y expresión de diluciones
La dilución consiste en preparar una solución
menos concentrada a partir de una solución
inicial más concentrada. Las diluciones se
expresan usualmente como una razón
matemática, como 1:10. Esto significa una
obtenida se calcula al multiplicar la dilución
del tubo 1 (o anterior) con la nueva dilución
(1/2 x 1/2), igual a 1:4. Los pasos siguientes
se hacen igual que para el paso 2. En el
siguiente cuadro se muestra un resumen de
lo anterior.
114
Tubo
Dilución
1. 0.5 ml(1)
= 0.5 ml (1) = 1:2(4)
0.5 ml (1) + 0.5 ml (2)
2. 0.5 ml(1)
1 ml (3)
= 0.5 ml (1) = 1:4 (4)
0.5 ml (1) + 0.5 ml (2)
1 ml (3)
es decir:
1/2 x 1/2
= 1:4
3.
1/4 x 1/2
= 1:8
4.
1/8 x 1/2
= 1:16
5.
1/16 x 1/2
= 1:32
(1) Volumen de la solución original a diluir.
(2) Volumen del agua necesaria para la
dilución.
(3) Volumen final.
(4) Dilución obtenida.
(5) Volumen de la solución diluida 1:2 (o
anterior).
MANEJO DE MATERIAL BIOLÓGICO
Se le llama material biológico al conjunto de
seres vivos o sus productos utilizado en el
desarrollo del trabajo en el laboratorio. La
utilidad e importancia de este material es
muy grande ya que muchos fenómenos de
los seres vivos sólo pueden estudiarse en
ellos
mismos,
por
ejemplo,
la
experimentación de nuevos fármacos o los
mecanismos que se presentan en entidades
patológicas y la producción de las mismas en
forma experimental. Del correcto manejo
dependerá en gran parte el éxito de la
experimentación y la veracidad de los
resultados obtenidos. A continuación se
darán algunas generalidades sobre el manejo
del material biológico utilizado en las
prácticas de este Manual.
Animales
El animal utilizado más comúnmente en el
laboratorio de bioquímica es la rata. Para su
correcto manejo es importante la forma cómo
se sujeta, lo cual se hará con firmeza, pero a
la vez, en forma suave para no lesionarla; no
debe demostrársele miedo o repugnancia
para evitar que se ponga nerviosa e
intranquila, lo que puede ocasionar que
muerda.
La palma de la mano se coloca sobre
el dorso del animal; la cabeza de éste entre
el dedo pulgar y el dedo índice; de esta
manera se logra su inmovilidad y es posible
levantar el animal y moverlo de lugar.
Muchas veces es necesaria la
inyección intraperitoneal de alguna sustancia,
para lo cual se sostendrá al animal con una
mano, como se indicó antes, mientras con la
otra se introduce la aguja de la jeringa
formando un ángulo de 10º con la pared
abdominal en el cuadrante inferior izquierdo,
ligeramente a la izquierda de la línea media;
es importante mantener el ángulo de la aguja
porque, si éste se abre, la aguja puede llegar
a la vejiga o al intestino. Para tener la
seguridad de estar en la cavidad peritoneal,
hay que jalar el émbolo de la jeringa para que
se haga el vacío; si el vacío no se hace y, por
el contrario, se extrae líquido, es probable
que se haya puncionado la vejiga.
Para la extracción de vísceras, como el
hígado, es necesario sacrificar al animal, lo
cual se logra fácilmente y con menor
sufrimiento para la rata anestesiándola
o
descerebrándola, o sea, seccionando la
médula espinal a nivel del cuello mediante un
golpe certero en este lugar contra el borde de
una mesa. Después se prosigue a la
extracción de la víscera y se abre la pared
abdominal con unas tijeras o bisturí.
Extracción de sangre para análisis
El profesor a cargo del grupo deberá estar
presente en el momento de la extracción; de
lo contrario, por ningún motivo, el alumno
podrá hacerla por su cuenta.
Procedimiento para obtener una muestra
de sangre venosa:
115
1. Para que un alumno sea considerado
obtener la muestra (por lo general,
como voluntario deberán tomarse en
aparece una gota de sangre en la base de
cuenta algunos antecedentes como: no
la aguja). Una succión excesiva puede
padecer o haber padecido hepatitis o
causar colapso de la vena. Tirar del
alguna
émbolo de la jeringa hasta que se haya
otra
enfermedad
infectocontagiosa; no tener problemas de
extraído la cantidad de sangre deseada.
coagulación y no ser muy aprensivo. El
5. Soltar la ligadura antes de extraer la aguja
donador (de preferencia con las venas
con un movimiento rápido y uniforme
visibles), estará sentado con el brazo
mientras que se ejerce una presión sobre
sobre la mesa.
la herida con una torunda.
2. Con una ligadura elástica, aplicar un
6. Mantener la presión por un momento o
torniquete en el brazo por encima del sitio
hasta que se haya detenido el sangrado.
de la punción (esto causa congestión
Cubrir la punción con una cinta adhesiva.
venosa y evita el retorno de la sangre). El
7. Retirar la aguja de la jeringa en el
uso prolongado del torniquete causa
contenedor de punzocortantes y vaciar lo
estasis
y
más pronto posible la muestra de sangre
hemoconcentración. Si las venas no se
de
la
sangre
en un tubo de centrífuga procurando
hacen prominentes, pedir al donador que
deslizar la sangre suavemente por la
cierre y abra la mano varias veces.
pared del tubo (si es que no se utilizó el
Escoger una vena fija y de buen calibre,
sistema Vacutainer).
localizarla y palparla con el dedo para
sentir su consistencia y trayectoria; antes
de puncionar, asegurarse de que la
jeringa no contenga aire y que el émbolo
se deslice suavemente. Las dimensiones
de la aguja y la jeringa dependen de la
cantidad de sangre que se necesita así
como del tamaño e integridad de la vena
que se usa. También se puede usar el
sistema Vacutainer que consiste en un
tubo al vacío, un mango y una aguja
recolectora de muestras múltiples.
3. Limpiar minuciosamente la zona con una
torunda humedecida con alcohol de 70º y
dejar secar espontáneamente. Sujetar la
piel con el pulgar izquierdo; puncionar
primero la piel y luego penetrar la vena
con el bisel de la aguja hacia arriba
siguiendo el trayecto de la vena.
4. Después que se ha entrado a la vena, la
sangre llenará los tubos vacíos del
sistema vacutainer. Si se usa jeringa, se
necesita una ligera succión con ésta para
Alerta clínica
Si es difícil detener el sangrado de la
punción, elevar la zona y aplicar una cubierta
que presione. Los hematomas se pueden
evitar:
• Usando una buena técnica.
• Aflojando el torniquete antes de retirar la
aguja.
• Aplicando la presión suficiente sobre el
sitio de punción después de completar el
procedimiento.
La sangre obtenida puede tratarse de
diferentes maneras según el empleo que se
le vaya a dar.
Para obtener suero. La sangre se
recibe en un tubo de ensayo o de centrífuga
seco y se deja coagular a temperatura
ambiente o en una estufa o baño de agua a
37º C. Si se va a trabajar inmediatamente
con el suero, separar con un aplicador de
madera el coágulo y centrifugar el resto del
tubo. Si se desea la separación espontánea
del suero, se deja a temperatura ambiente
116
por unas horas para que el coágulo se
Precauciones generales: Se refieren a las
retraiga. Debe evitarse que el suero se
medidas
mezcle con porciones de coágulo; si esto
enfermedades transmisibles, especialmente
sucede, es necesario centrifugar y volver a
hepatitis B o SIDA y para evitar incendios,
separar el suero con una pipeta Pasteur.
cortaduras o exposiciones simples, de corta
Para obtener plasma. Hay que evitar
la
coagulación
por
medio
de
un
anticoagulante (heparina, citrato de sodio o
EDTA) en el tubo que recibe la sangre.
para minimizar
duración
o
la difusión de
accidentales
a
sustancias
químicas peligrosas.
1. Manejar
cualquier
sangre,
plasma,
líquido
suero,
corporal,
orina,
tejido,
Mezclar suavemente por inversión.
cadáver o cultivo como potencialmente
Centrifugar a 2 500 rpm durante 5 minutos y
infeccioso. Todas las sustancias químicas
extraer enseguida el plasma sobrenadante
proporcionadas, equipos y materiales del
con una pipeta Pasteur; pasarlo a otro tubo.
laboratorio deberán ser utilizados con el
La sangre, el plasma o el suero y
todos los recipientes que los contengan
deben
considerarse
potencialmente
como
infectante,
material
atendiendo
a
las
indicaciones de peligrosidad y cuidados
específicos, según el caso.
2. Se debe conocer los símbolos y los
(torundas, agujas, tubos, etcétera) deberán
códigos de color sobre las precauciones y
depositarse, de acuerdo a su clasificación,
los peligros en el laboratorio. Asegurarse
en envases que tengan impreso el símbolo
de
de riesgo biológico y entregarse a la
extinguidores, del botiquín y de las salidas
coordinación
de emergencia.
laboratorio
lo
cuidado,
que
del
por
máximo
para
su
desinfección y desecho.
el
la
localización
de
3. Usar bata en el laboratorio, la cual deberá
estar cerrada durante todo el tiempo que
MEDIDAS DE SEGURIDAD
Durante
conocer
desarrollo
del
curso
de
se permanezca en el laboratorio.
bioquímica, en el laboratorio se pueden llegar
4. Lavar las manos y usar guantes. Los
a utilizar sustancias o muestras biológicas
guantes deben usarse para efectuar
que,
riesgos
punciones vasculares y para manipular
potenciales a la salud, debido a que pueden
sangre, líquidos corporales, cultivos de
ser: corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas,
microorganismos, sustancias o superficies
inflamables o biológico infecciosas.
contaminadas.
en
ocasiones
Aunque
representan
los
laboratorios
se
Después
del
uso
de
cualquier material biológico, se procede al
consideran en general lugares de trabajo
lavado
seguros, esto es así sólo cuando conocemos
puestos. Después de quitarse los guantes
y
debemos
seguimos
las
normas
de
seguridad
existentes en la materia acerca de la
clasificación, manejo y disposición final de
estas
sustancias,
lo
cual
nos
permite
identificar los peligros y disminuir los riesgos.
de
manos
lavarnos
con
los
guantes
nuevamente
las
manos.
5. Todos los materiales desechables y no
desechables se deben descontaminar en
una solución 1:10 de hipoclorito de sodio
de 4 a 7 % de concentración, durante más
Manejo
de
materiales
peligrosos
y/o
de 20 minutos antes de ser desechados.
biológico infecciosos
117
6. Los
elementos
punzocortantes
desecharse en recipientes
deben
especiales
destinados para ello, los cuales deben
estar etiquetados con la leyenda que
indique "Peligro, residuos punzocortantes
biológico-infecciosos" y marcados con el
símbolo universal de riesgo biológico.
Nunca reencapuchar las agujas
contaminadas con hipoclorito de sodio al
1%, con alcohol al 70% o con agua
oxigenada.
las
fuertes y compuestos venenosos.
9. Seguir las indicaciones del profesor y del
personal a cargo del área de prácticas. Es
una regla de laboratorio que todos los
accidentes personales, por triviales que
sean, se comuniquen inmediatamente al
profesor.
7. Limpiar las superficies potencialmente
8. Todas
fuertes, productos cáusticos, oxidantes
Nunca
realizar
actividades
experimentales sin la supervisión del
responsable del grupo.
10. Manejar
adecuadamente
los
residuos
peligrosos derivados de las prácticas,
sustancias
químicas
son
identifique
su
nivel
de
riesgo
y
el
potencialmente tóxicas y peligrosas, por
mecanismo para su desecho. Queda
lo que se deberá:
prohibido desechar sustancias a la tarja o
a) Conocer las propiedades (venenosas,
cáusticas o corrosivas) y el uso correcto
de las mismas.
del responsable del grupo. Las hojas de
seguridad correspondientes incluyen qué
hacer en caso de accidentes y la forma
b) Nunca probar, así como tampoco inhalar,
directamente
por cualquier otro medio, sin autorización
las
sustancias.
Para
determinar el olor se acerca la tapa del
frasco cuidadosamente a la nariz, o bien,
si se trata de sustancias volátiles o
vapores acercar éstos con la mano a la
nariz.
c) Evitar el contacto de sustancias con la
piel, especialmente la cara; usar bata y
guantes para proteger la ropa y el cuerpo;
nunca dirigir un tubo de ensayo o la boca
correcta de desechar los residuos.
11. Indicaciones
incendios
o
generales
para
explosiones
solventes
al
evitar
utilizar
inflama-
bles. Los solventes inflamables (alcohol,
éter, cloroformo, acetona, tolueno, xilol,
etcétera)
se
utilizan
en
todos
los
laboratorios, por lo que se recomiendan
las siguientes precauciones:
a) No fumar en el interior del laboratorio.
de un matraz con líquidos en ebullición o
b) No utilizar la llama del mechero sin
material de reacción hacia el vecino, o a
cerciorarse de que no hay cerca líquidos
sí mismo, ya que puede proyectarse el
inflamables. No mantener el mechero
contenido; para las sustancias que no
encendido cuando esté fuera de uso.
tienen un efecto pronunciado sobre la
piel, pero cuya ingestión es peligrosa,
evitar la contaminación de alimentos,
cigarros o manos que después se llevarán
a la boca o con las que se tocarán
c) Si se vierten accidentalmente sobre las
mesas, secar de inmediato con un trapo
húmedo y enjuagar éste en el chorro de
agua, exprimiéndolo.
alimentos (nunca ingerir alimentos en el
d) Nunca calentar un líquido orgánico sobre
laboratorio). Por último, nunca pipetear
una flama. Para calentar, usar baño de
con la boca, especialmente los ácidos
agua o parrilla eléctrica.
118
En caso de incendio debe hacerse lo
encontrar
pictogramas
(símbolos
siguiente: para un incendio pequeño en un
internacionalmente aceptados y reconocidos)
vaso, un matraz, etcétera, éste se cubrirá con
que indican los riesgos principales. Los
un recipiente mayor o se ahogará el fuego
pictogramas de seguridad son:
con un trapo mojado o se combatirá con un
extinguidor.
RIESGO BIOLÓGICO
Cuando el fuego sea de un solvente
derramado sobre la mesa o el piso, se
utilizará
un
extinguidor
de
bióxido
de
carbono. Si el fuego no puede vencerse de
inmediato, se evacuará el laboratorio y se
avisará al departamento contra incendios de
Todo aquello que pueda contener
la institución.
bacterias, virus u otros microorganismos con
12. Los
accidentes
más
frecuentes
que
capacidad de infección o cuando contiene
ocurren en el laboratorio son las lesiones
toxinas producidas por microorganismos que
debidas a cortes, laceraciones, etcétera,
causen efectos nocivos a los seres vivos.
por cristalería rota.
Ejemplo: jeringas, sangre.
En caso de heridas pequeñas dejar
Medidas de prevención: evitar el
que sangre unos segundos; tener cuidado de
contacto con los ojos, la piel y las vías
no dejar partículas de vidrio en la herida y
respiratorias. Utilizar elementos de protección
aplicar un desinfectante.
personal.
Las heridas de mayor importancia
deben ser atendidas por un médico. Mientras
E = EXPLOSIVO
tanto, evitar el sangrado aplicando presión en
un punto más arriba la herida o antes de ella
(no mantener la presión por más de 5
minutos).
10. Casi siempre, los choques eléctricos en
el laboratorio son de poca importancia;
las
precauciones
de
seguridad
se
deducen de la naturaleza del peligro.
Nunca tocar un aparato eléctrico con las
manos húmedas o cuando se esté
parado sobre un piso húmedo. Siempre
apagar y desconectar los aparatos antes
de cualquier manipulación.
Es toda sustancia sólida o líquida o
mezcla
de
sustancias
que
pueden
desprender gases a una temperatura, presión
y velocidad tales que pueden detonar,
producir violentas deflagraciones, o explotar
al
exponerse
al
calor
cuando
están
parcialmente confinadas. Ejemplo: azida de
plomo, fluoruro de carbono.
Medidas
Pictogramas de seguridad
de
prevención:
En las etiquetas de productos químicos de
almacenarlas alejadas de otros productos,
uso
la
evitar todo choque, fricción y mantener
identificación del contenido, calidad y límite
alejadas de fuentes de calor, chispas o
de pureza de lo que contiene, podemos
fuego.
en
el
laboratorio
además
de
119
F+ = EXTREMADAMENTE INFLAMABLE
Sustancias cuyo punto de ignición es menor
O = OXIDANTE
de 0°C y su punto de ebullición máximo de
Sustancias
oxígeno
cuando
capaces
de
reaccionan
aportar
con
otra
35°C.
F = INFLAMABLE
sustancia, por lo que cuando entran en
Sustancias líquidas cuyo punto de ignición es
contacto con combustibles o inflamables
menor a 40°C. Ejemplo: etanol, tolueno, éter
avivan
dietílico.
la
reacción
pudiendo
desarrollar
reacciones violentas. Ejemplo: nitrito de
sodio, hiposulfito de sodio.
Medidas de prevención: mantener
alejado de fuentes de calor, de ignición o
Medidas de prevención: mantener
alejadas de las sustancias combustibles o
eventuales
chispas,
de
materiales
combustibles y oxidantes.
inflamables, ya que pueden favorecer los
incendios y dificultar su extinción.
N = NOCIVO PARA EL MEDIO
AMBIENTE
Xn = NOCIVO
Sustancias de menor toxicidad pero
Aquellas
sustancias
o
preparados
que
pueden causar daños a la salud. También se
cuando son liberados al medio ambiente
incluyen aquellas mezclas o preparados que
pueden presentar un efecto inmediato o
tienen alguna sustancia que puede ser tóxica
diferido,
pero
especie. Ejemplo: tiourea, o-toluidina.
que
se
encuentra
a
una
baja
peligro
a
alguna
los derrames alcancen los desagües, tratar
Xi = IRRITANTE
que
en
Medidas de prevención: evitar que
concentración en la mezcla.
Sustancias
poniendo
pueden
causar
irritación a la piel, mucosas, o los ojos, por
los residuos en condiciones ambientalmente
adecuadas.
contacto inmediato, prolongado o repetido,
pudiendo
también
provocar
inflamación.
Ejemplo: cloroformo, SDS, hipoclorito de
sodio, aminoantipirina.
Medidas de prevención: evitar el
contacto con los ojos, la piel y las vías
respiratorias. Utilizar elementos de protección
personal.
T+ = ALTAMENTE TÓXICO, T TÓXICO
Sustancias que pueden causar daño en
forma aguda o crónica a la salud o causar la
120
muerte si son inhaladas, ingeridas o se
El símbolo de la N.F.P.A. (National Fire
absorben por la piel, aún en pequeñas
Protection Association)
cantidades.
Ejemplo:
azida
de
sodio,
dinitrofenol, bromuro de etidio.
identificación de riesgos de un producto
Medidas de prevención: evitar todo
contacto
directo.
protección
Utilizar
personal.
El símbolo de la N.F.P.A. es un sistema de
elementos
Emplear
de
químico,
en
tres
categorías
"salud",
"inflamabilidad"
y
principales:
"reactividad"
estrictas
indicando el grado de severidad por medio de
medidas de higiene personal y del ambiente
una escala numérica desde (4) que indica el
del laboratorio.
riesgo mayor, (3) riesgo severo, (2) riesgo
moderado, (1) riesgo menor, hasta (0) que
representa ausencia de riesgo.
Este símbolo es útil para alertar
acerca del riesgo de ese producto y, a su
vez, puede ayudar a determinar los cuidados
a tener en cuenta en el almacenamiento y en
C = CORROSIVO
caso
Sustancias capaces de atacar y destruir los
tejidos orgánicos si entran en contacto con
ellos
o
bien
atacar
ciertos
metales
o
materiales. Ejemplo: hidróxido de sodio,
ácido clorhídrico, ácido acético.
de
derrames
o
información
se
presenta
por
medio de una estructura espacial en forma
de rombo principal, dividido a su vez en otros
cuatro.
contacto con los ojos, la piel y las vías
respiratorias. Utilizar elementos de protección
personal.
El rombo azul a la izquierda identifica
el riesgo para la salud. El rombo rojo en la
parte
superior
indica
el
riesgo
por
inflamabilidad. El rombo amarillo a la derecha
señala
Identificación
sobre
los
riesgos
específicos y los consejos de prudencia
asignado
a
esa
el
riesgo
por
reactividad
o
inestabilidad. El rombo blanco en la parte
inferior indica riesgos especiales tales como:
Frases "R" éstas advierten acerca del riesgo
común
emergencias,
La
Medidas de prevención: evitar el
más
de
salpicaduras.
sustancia
W reactivo al agua, COR corrosivo, AIR
reactivo al aire, OXY oxidante. Ejemplo:
química, por medio de la enumeración de
riesgos específicos en frases cortas que son
adaptables a las distintas sustancias.
Las frases "S" brindan los consejos
de prudencia o las medidas de prevención
más importantes relacionadas con el riesgo
b
C
o
n
asignado a esa sustancia química y que
permitirán
su
almacenamiento
manipulación
en
forma
segura.
y
En
algunos casos se mencionan combinaciones
Ácido clorhídrico
de frases R o de frases S, cuando dos o más
riesgos tienen relación entre sí (cuadro I.6).
121
Hojas de seguridad
Residuos
especiales
CRETI:
son
Cada práctica cuenta con las hojas de
aquellos residuos que constituyen un peligro
seguridad para cada reactivo o sustancia que
para
se utilice en el laboratorio.
agresivas
Las
hojas
de
seguridad
proveen
la
salud
por
tales
Reactividad,
sus
características
Corrosividad,
como:
Explosividad,
Toxicidad
e
información sobre (cuadro I.7, pág. 100):
Inflamabilidad Es importante no olvidar que,
• Los componentes de un producto, su
la mezcla de residuos municipales con
reactividad,
las
principales
o
medidas
las
precautorias
advertencias
más
importantes.
residuos biológico infecciosos hace que se
consideren en su totalidad como biológico
infecciosos, mientras que la mezcla de
• Los elementos de protección personal que
residuos biológico infecciosos con peligrosos
se recomienda emplear en la manipulación.
CRETI se deben consideran como peligrosos
• Las vías de ingreso y los órganos blanco.
CRETI.
• Las medidas por derrame accidental y de
primeros auxilios.
Envasado y etiquetado de RPBI para su
• La información toxicológica.
• Las
recomendaciones
para
su
almacenamiento.
• Las condiciones para la disposición de los
residuos.
instituciones
de
enseñanza
o
investigación así como en hospitales y
clínicas contienen residuos no peligrosos o
municipales, residuos biológico infecciosos y
residuos especiales.
Residuos
peligrosos
biológico
infecciosos (RPBI): es todo aquello que ha
en
contacto
con
pacientes
o
animales, sus muestras biológicas y/o cepas
de microorganismos, se clasifican en: sangre,
cultivos, patológicos (tejidos, órganos, partes
y fluidos corporales, etcétera), no anatómicos
(gasas, algodones, jeringas, etcétera)
y
punzocortantes (lancetas, agujas, pipetas
Pasteur, etcétera).
Residuos municipales: son aquellos
que no representan peligro para la salud y
sus
acuerdo con sus características físicas y
biológico infecciosas conforme la norma
Es importante destacar que todos los
Los residuos que se generan en laboratorios
entrado
Los residuos RPBI deben ser envasados de
oficial mexicana 087-ECOL-95 (cuadro I.8).
Clasificación de los residuos
de
desecho.
características
son similares
residuos domésticos comunes.
a los
envases tengan impreso el símbolo universal
de riesgo biológico y leyendas que indiquen
la peligrosidad de los residuos y el tipo de
residuos que contienen.
Los
contenedores
para
punzocortantes deben de ser: • De color rojo.
• De paredes rígidas.
• De polipropileno.
• Resistentes
a
fracturas
y
pérdida
del
contenido al caerse.
• Destruibles por métodos fisicoquímicos.
• Esterilizables y con tapa, la que puede tener
o no separador de agujas.
Precauciones: depositar los RPBI, de
acuerdo a su clasificación, inmediatamente
después de su generación.
No compactar los residuos durante el
envasado y no mezclar residuos de diferente
clasificación.
Una vez identificados, separados y
envasados
peligrosos,
correctamente
el
personal
los
residuos
responsable
del
122
laboratorio se encargará de su recolección,
tratamiento y disposición final así como de
las medidas necesarias para la desinfección,
esterilización y limpieza del material y equipo
utilizado en el laboratorio.
Frases R
Frases S
Combinación de frases
R7
Puede provocar incendios
S3
Conservar en sitio fresco R 20/21
Nocivo por inhalación y contacto por la piel
R 23
Tóxico por inhalación
S 20
No comer ni beber
durante la manipulación
R 39/25
Tóxico: peligro de efectos irreversibles graves por
ingestión
R 36
Irrita los ojos
S 29
No tirar los residuos por
los desagües
S 3/7
Mantenga el contenedor bien cerrado y en un lugar
fresco
R 45
Puede ser cancerígeno
S 37
Llevar guantes de
protección adecuados
S 36/37/39
Utilice ropa protectora adecuada, guantes y
protección facial o gafas
Cuadro I.6 Ejemplos de frases S y R
Manejo de residuos CRETI
El manejo, consistente en la separación,
envasado y almacenamiento de cada uno de
los reactivos peligrosos CRETI utilizados en
las prácticas deberá realizarse de acuerdo a
cada reactivo en cuestión según lo indicado
en las hojas de seguridad.
El manejo de accidentes, tales como
derrames, ingestión o salpicaduras, así como
la aplicación de primeros auxilios deberán de
realizarse de acuerdo al reactivo en cuestión
según lo indicado en la hoja de seguridad.
Las hojas de seguridad serán proporcionadas
para cada práctica en el laboratorio.
De manera general, los envases
destinados a los residuos CRETI deben
ser de cristal de color ámbar, con
capacidad de uno a cuatro litros, latas de
aluminio para solventes (capacidad
máxima de 20 litros) y, en algunos casos
recipientes de plástico, siempre y cuando
las características fisicoquímicas de la
sustancia a envasar lo permita. Cada
residuo debe envasarse en forma
individual y colocar en el frasco
respectivo el pictograma de seguridad
correspondiente.
123
Ácido clorhídrico
Identificación
Fórmula química: HCl
Apariencia y olor: solución de color ligeramente
amarillo o incolora
con olor característico muy penetrante.
Marcaje liquído corrosivo
Sinónimos: ácido muriático, cloruro de hidrógeno.
Generalidades
Está presente en el sistema digestivo de muchos
mamiferos y una deficiencia de éste provoca
problemas en la digestión; un exceso provoca
úlceras gastricas. La disolución acuosa grado
reactivo contiene aproximadamente 38% de HCl.
Propiedades física y químicas
PM: 36.46
Solubilidad: soluble en agua
pH de disoluciones acuosas: 0.1 (1.0N), 4.0(0.001N).
Reacciona con la mayorÍa de los metales
desprendiendo hidrógeno.
Con agentes oxidantes como peróxido de hidrogeno
genera cloro, el cual es muy peligroso.
Niveles de toxicidad.
DL50 (oral en conejos): 900 mg/Kg, inhalación en
ratas): 3124 ppm/1 h.
CLMo
(concentración
(inhalación
en
letal
humanos)
minima
1300
publicada):
ppm/30
min;
3000ppm/5 min.
Riesgos
Produce gas inflamable cuando se encuentra en
contacto con metales. Se generan v apores tóxicos e
irritantes de cloruro de hidrógeno cuando se calienta.
Inhalación: elgas causa dificultad para respirar, tos,
inflamación y ulceración de nariz, tráquea y laringe.
Exposiciones severas causan espasmo de la laringe
y edema en los pulmones.
Contaco con los ojos y piel: es un irritante severo de
ojos y piel, puede causar quemaduras serias,
dermatitis, reducir la visión o, incluso, la pérdida total
de ésta.
Ingestión: produce corrosión de las membranas
Primeros auxilios
Ojos: lavar inmediatamente con agua corriente
durante 15 mi nutos.
Piel: quitar ropa y zapatos contaminados, lavar
inmediatamente la zona dañada con abundante
agua.
Inhalación: mover a la persona al aire fresco; si se
dificulta la respiración proporcionar oxigeno y
mantenerlo caliente y en reposo, no dar a ingerir
nada.
Ingestión: no provocar vómito y dar a beber agua
continuamente, por ejemplo, una cucharada cada 10
minutos o dar a beber leche de magnesia.
En todos los casos de exposición, el afectado debe
ser transportado al hospital tan pronto como sea
posible.
Manejo y almacenamiento
Peligro: corrosivo y venenoManténgase en envase
de vidrio, en lugares secos, bien ventilados, alejados
de materiales oxidantes y fuentes de ignición o calor.
Tratamiento en caso de accidente
Control de fuego: en caso de accidente utilizar CO2,
polvo químico seco o arena seca. Los extinguidotes
de fuego se eligen dependiendo de los alrededores,
ya que el HCl no arde.
Fugas y derrames: ventilar el área y protegerse con
el equipo de seguridad necesario. Cubrir el derrame
con bicarbonato de sodio o una mezcla de 50:50 de
hidroxido de calcio y cal
sodada, mezclar
cuidadosamente. Mantener el materil lejos de fuentes
de agua y drenajes hasta no ser neutralizado como
se indicó anteriormente.
Desechos
Neutralizar las soluciones concentradas de ácido
clorhídrico con carbonato de calcio o cal y diluir con
agua cuidadosamente. La disolución resultante
puede verterse al drenaje, con abundante agua. En
caso de soluciones diluidas,
mucosas de la boca, esófago y estómago, causa
náusea, vómito, disfagia, sed intensa y diarrea
Cuadro I.7. Hoja de seguridad para el ácido Clorhídrico.
124
Cuadro I.8 Envasado y etiquetado de RPBI para su desecho.
TIPO DE RESIDUO
ESTADO FÍSICO
ENVASADO
COLOR
Sangre
Sólido
Líquido
Bolsa de plástico
Recipiente hermético
Rojo
Cultivos y cepas de
agentes infecciosos
Sólidos
Líquidos
Bolsa de plástico
Recipiente hermético
Rojo
Residuos
anatómicos
Sólidos
Líquidos
Bolsa de plástico
Recipiente hermético
Rojo
Sólidos
Líquidos
Bolsa de plástico
Recipiente hermético
Amarillo
Sólidos
Recipientes rígidos
Rojo
Patológicos
Objetos
punzocortantes
usados y sin usar
no
125
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO
II
EXPERIMENTOS
126
Práctica 1
Soluciones
Tiempo de la práctica: 3 horas
Objetivos
Que el alumno:
1. Identifique la existencia de soluciones
en los sistemas biológicos.
2. Explique los cálculos y procedimientos
para preparar soluciones porcentuales,
molares y normales, así como las
diferentes diluciones de éstas.
3. Presente ejemplos de soluciones
utilizadas
en
medicina
(solución
isotónica, Ringer, Darrow y Hartman).
Responda a las siguientes preguntas:
1.¿Qué es una solución?
2.¿Cuántas
clases
de
soluciones
existen?
3.¿Qué
significan
los
siguientes
términos: mol, solución molar y solución
normal?
4.¿Qué significan: v/v, p/v, p/p y ppm?
5.¿Cuál es la composición de las
siguientes soluciones: solución isotónica
de cloruro de sodio, suero glucosado al
5%, Ringer-lactato?
6.¿Cuáles son los tipos de soluciones
que existen in vivo? Mencionar ejemplos.
7.¿Qué es una solución isotónica?
8.¿Qué es una solución osmolar?
9.¿Cómo se calcula la osmolaridad de
una solución?
10.¿Qué les pasa a los eritrocitos
cuando se ponen en contacto con
soluciones
salinas
de
diferente
osmolaridad?
11.¿Qué se entiende por dilución y
dilución seriada de las soluciones?
Material
Por equipo:
• 3 vasos de precipitado de 10 ml
• 1 pipeta de 1.0 ml
• 1 pipeta de 5.0 ml
•1 pipeta de 10.0 ml
•Gradilla con 9 tubos de ensayo
•Eritrocitos humanos lavados en solución
salina isotónica
•Solución de azul de metileno al 1.0%
•Cloruro de sodio en cristales (NaCl)
•Balanza granataria
Por grupo:
• 1 Microscopio marca Leica.
Procedimiento
1. Hacer los cálculos correspondientes
para comprobar que la solución a 0.9%
de NaCl es isotónica con respecto al
plasma (ver pag. 121). Considerar que:
a) El cloruro de sodio se disocia en
solución acuosa en los iones sodio y
cloruro, por lo que la concentración
iónica se duplica (1 mmol/l = 2 mosm/l).
b) La presión osmótica normal del
plasma es de 290-310 mosm/l.
2. Preparar 20 ml de una solución de
NaCl a 4.5% (etiquetar como solución 1).
3. A partir de la solución anterior,
preparar 25 ml a 0.9% (solución 2) y 50
ml a 0.045% (solución 3).
4. Colocar en tres tubos de ensayo las
diferentes soluciones de cloruro de sodio
preparadas en los puntos 2 y 3. Con la
ayuda de un gotero (dejando caer
lentamente por las paredes del tubo) 2
gotas de eritrocitos lavados. Mezclar con
cuidado y dejar reposar 5 minutos a
temperatura.ambiente. Valorar el grado
de hemólisis que sufren los eritrocitos
cuando se ponen en contacto con las
diferentes soluciones.
5. De las 3 soluciones prepradas tomar
una gota de cada una y por separado
colocarlas en un porta-objetos, colocar
un cubre-objetos y observarlas al
127
microscopio, para valorar el efecto de los
eritrocitos.
Leer las intrucciones para el uso del
microscopio
6. Hacer la dilución y redilución (dilución
seriada) de la solución de azul de
metileno como se muestra en el
siguiente cuadro:
DILUCIÓN SERIADA DE
METILENO
de
Tubo H2O (ml) Sol
azul
de
metileno
1
2
0.5 ml*
2
2
3
2
4
2
5
2
6
2
-
2. Hacer los cálculos para prepar una
solución de CaCl2 0.25 M se requieren
15 ml.
3. Calcular el volumen de H2SO4 que se
requiere para preparar una solución 3N
40 ml volumen final. (densidad=
1.84g/ml).
4.- Prepare 500 ml de una solución 0.125
M de NaHC03
AZUL DE
5.-250 ml de H2SO4 0.1 M
Volumen de
transferenci
a
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
*Nota: para mezclar al hacer las
diluciones se debe succionar y soplar
con cuidado la pipeta en cada tubo
varias veces antes de transferir la
dilución al siguiente tubo.
Resultados
1. Expresar en forma ordenada los
cálculos efectuados para cada uno de los
ejercicios.
2. Deducir el movimiento o no del
solvente cuando se ponen en contacto
eritrocitos con soluciones hipo, hiper e
isoosmóticas.
3.
Calcular la dilución y la concentración de azul de metileno en cada uno
de los seis tubos de la dilución seriada
(ver pág. 93). Asegúrese que la
coloración
obtenida
disminuya
gradualmente conforme avanza la
dilución.
Problemas
1. Hacer los cálculos para preparar una
solución de KCl al 3%.
6.-100 ml de glucosa 0.5 M
7.-Cuantos mililitros de HCl 0.1M
contiene 0.025 mol de HCl
8.-Cuantos gramos de soluto se
requieren para preparar las siguientes
soluciones:
125 ml de NaCl al 10%
50 ml de Ca(NO3)2 al 3.35 %
750 ml de CaCl2 al1.5%
9.-Cual presenta la osmolaridad más alta
NaCl 0.1M o Na2SO4 0.08 M
10.-A un enfermo hay que inyectarle 15 g
de KCl y 126 g de glucosa (C6O6H12)
¿Cuánta agua habrá que añadirles para
que resulte un suero 0.4 osmolar?
11.- Calcular la osmolaridad a partir de la
composición de algunas soluciones
como Dextrosa a 10 % en solución salina
a 0.45%.
12.-Calcular la osmolaridad a partir de
Dextrosa a 5 % en solución salina a 0.2
%.
Buscar las composiciones de las
siguientes soluciones. Hartman, Ringer y
Darrow.
Referencias
1. Villazón SA, Cárdenas CO,Villazón
DO, Sierra UA. Fluidos y electrólitos.
México: JGH Editores; 2000.
128
2. Peña-Díaz A, Arroyo BA, Gómez PA,
Tapia IR, Gómez EC. Bioquímica.
Undécima reimpresión de la 2a. ed.
México: Editorial Limusa; 2004.
3. Laguna J, Piña E. Bioquímica de
Laguna. 5a.ed. México: Editorial El
Manual Moderno; 2002: p. 41-56.
4. Holum JR. Fundamentos de química
general, orgánica y bioquímica para
ciencias de la salud. México: Editorial
Limusa Wiley; 2001.
5. Farias GM. Química clínica. Décima
edición México: Editorial El Manual
Moderno; 1999.
6. Bloomfield MM.Química
organismos vivos. México:
Limusa; 1997.
de los
Editorial
129
INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO MARCA LEICA
1. Nunca use un adaptador entre el
cable y la fuente de alimentación.
utilizando el
micrométrico.
2. Use siempre el microscopio sobre una
superficie dura y estable.
11. Ajuste los tubos oculares a la
distancia de los ojos.
3. Conecte el cable de alimentación del
microscopio a una toma de corriente con
conexión a tierra. Se suministra un cable
de tres terminales con toma a tierra.
12. Al término del uso del microscopio
retirar la muestra de la platina.
4. Encienda el microscopio girando el
interruptor de control de la iluminación
situado en la parte inferior izquierda del
instrumento.
5. Coloque el interruptor de control de la
iluminación en el nivel más bajo. El
control de iluminación le permite ajustar
la intensidad de luz.
6. Abra completamente el diafragma de
apertura del condensador girando el
anillo hacia el extremo derecho.
7. Usando el botón de enfoque del
condensador, suba el condensador hasta
el
extremo
superior
de
su
desplazamiento.
Iluminación
critica
únicamente: si el desplazamiento del
condensador es excesivo, limítelo con
el tornillo situado debajo de la platina
hasta que la lente superior del
condensador se encuentre debajo de la
superficie de la platina.
8. Coloque la preparación de la muestra
con la muestra en la platina.
9. Gire el revólver hasta situar el
objetivo 4X en la posición de trabajo.
(pag X)
mando
de
enfoque
13. Bajar la platina hasta el tope y
regresarla a su posición original si es
necesario.
14. Colocar el revolver de los objetivos
de manera que el objetivo de 4X sea el
que quede en dirección de la lámpara.
15. Desconectar el equipo y enrollar el
cable.
16. Limpiar la platina y oculares con un
paño humedecido con metanol o con un
limpia cristal comercial.
17. Colocar al microscopio la funda
contra el polvo para mantenerlo en
buenas condiciones físicas y mecánicas.
Partes del microscopio:
1) Oculares.
2) Revolver con 4 objetivos 4X, 10X, 40X
y 100X.
3) Platina.
4) Diafragma.
5) Lámpara.
Tornillo de la platina para desplazar la
muestra.
Interruptor de control de la iluminación.
Tornillo macrométrico.
Tornillo micrométrico.
1
10. Suba la platina girando el mando de
enfoque macrométrico
hasta que
observe la preparación y, finalmente,
enfoque la muestra con precisión
6
9
3
4
8
130
7
5
Práctica 2
Regulación del equilibrio ácido-base
después del ejercicio muscular intenso
y de la ingestión de bicarbonato de sodio
Tiempo de práctica: 3 horas
Objetivos
1. Al finalizar la práctica, el alumno
constatará las actividades reguladoras
del pulmón y el riñón para mantener el
equilibrio ácido-base en condiciones que
tienden a romperlo.
2. Mediante la determinación del pH
observará
la
variación
de
la
concentración de hidrogeniones en la
orina de un individuo que ha realizado
ejercicio muscular intenso.
3. Relacionará los resultados obtenidos
con los cambios metabólicos originados
por el ejercicio muscular intenso.
Conteste las siguientes preguntas:
1. ¿Por qué es importante que se
mantenga constante, dentro de ciertos
límites, el pH en el organismo?
+
2. ¿Cuáles son las fuentes de iones H
en el organismo?
3. ¿Cuáles son los sistemas reguladores
+
que facilitan la eliminación del H
producido en el organismo con el fin de
mantener constante el pH sanguíneo?
4. ¿Cuáles son las reacciones de
formación del ácido carbónico (H2CO3) a
partir de CO2 y H2O, y de su disociación
para formar el ion bicarbonato?
Escríbalas.
5. ¿Qué sistemas amortiguadores
participan directamente en la regulación
del pH sanguíneo?
6.
¿Cuáles
son
los
sistemas
extrasanguíneos que tienden a mantener
el pH extracelular?
Escriba la ecuación de Henderson y
–
Hasselbalch aplicada al sistema HCO3
/H2CO3 y, con base en ella, conteste la
siguiente pregunta:
a).¿Cómo
participan
el
aparato
respiratorio y el riñón en el control del pH
sanguíneo?
INTRODUCCIÓN
Dentro de los mecanismos de regulación
de que dispone el organismo para
mantener la integridad fisiológica,
aquellos involucrados en la homeostasis
del pH en los fluidos extracelulares
desempeñan un papel crucial para la
supervivencia del individuo. En este
sentido cabe señalar que, como
resultado de la oxidación de los
alimentos, un humano adulto promedio
produce alrededor de 20 moles de CO2
al día, Al difundir a la sangre, gran parte
de dicho gas se combina con al agua en
el interior de los eritrocitos, produciendo
ácido carbónico (H2CO3), reacción que
es seguida por la disociación del H2CO3
para producir el anión bicarbonato HCO3y un ión hidrógeno (H+). Dado el carácter
de ácido débil del H2CO3, la fracción
disociada del mismo es pequeña; sin
embargo, considerando la gran cantidad
de CO2 que produce el organismo, la
acidificación de los fluidos extracelulares
sería importante en ausencia de
131
mecanismos reguladores. En el hombre,
la intervención de los pulmones y los
riñones evita que ocurra tal acidificación
manteniendo en un nivel constante la
concentración de H+ y, por consiguiente,
del pH.
Para entender el papel que
juegan
ambos
órganos
en
la
homeostasis del equilibrio ácido-base,
debe tenerse presente que el sistema del
ácido carbónico implica la participación
de un componente gaseoso o volátil (el
CO2) y dos componentes no volátiles (el
HCO3- y el H+). En la sangre, el equilibrio
entre dichos componentes determina el
valor del pH sanguíneo, que puede
evaluarse mediante la bien conocida
ecuación de Henderson-Hasselbach. En
el individuo normal, dicho valor fluctua en
un promedio 7.4, siendo la sangre
venosa –enriquecida en CO2 ligeramente
más ácida en relación con la sangre
arterial. Ahora bien, ya que a
temperatura ambiente el CO2 existe en
estado gaseoso, la cantidad de CO2
disuelto en la sangre dependerá de la
presión parcial (PCO2) ejercida por el
mismo a nivel de los alvéolos
pulmonares. En el humano, la magnitud
de dicha PCO2 es de aproximadamente 40
mmHg lo que se traduce en una
concentración de CO2 sanguíneo de
aproximadamente 25 mM; este último
valor incluye no solo el CO2 como tal,
sino también el bicarbonato y el ácido
carbónico.
Considerando
el
pH
sanguíneo normal y el pKa del sistema
bicarbonato-ácido carbónico, la relación
[HCO3-] / [H2CO3
+ CO2] es de
aproximadamente 20. Es precisamente
la PCO2 la que es controlada por los
pulmones, ya que durante el proceso de
la
exhalación
se
elimina
CO2,
manteniendo constante la PCO2 en los
alvéolos y evitando así que que aumente
el nivel de CO2, disuelto en la sangre.
Todo proceso o patología que se
manifieste en una alteración en la
frecuencia y/o profundidad del proceso
de inhalación-exhalación, dará como
resultado una alteración de la PCO2
alveolar
–
aumentandola
o
disminuyéndola, -con la siguiente
modificación del del nivel de CO2 disuelto
en sangre y, por consiguiente, del pH.
Por lo que respecta a los riñones,
su participación en el mantenimiento de
un pH extracelular constante se da a
través de dos mecanismos: la excreción
de equivalentes ácidos (H+) hacia la orina
y la regulación de la cantidad de HCO3reabsorbido hacia la sangre desde el
filtrado glomerular. A diferencia del
intercambio gaseoso en los pulmones,
los mecanismos de regulación renal son
de largo plazo, por lo que su efecto será
manifiesto en cuestión de horas. Su
importancia se enfatiza en situaciones
patológicas
donde
se
altera
el
intercambio de gases pulmonar (es decir,
en la acidosis y alcalosis respiratorias),
en cuyo caso es necesario aumentar o
disminuir la tasa de reabsorción del
HCO3- , o bien en estados fisiológicos
que producen cantidades importantes de
ácidos orgánicos (por ejemplo, en la
diabetes no controlada o durante el
ejercicio intenso) donde se incrementa la
excreción de H+ Gran parte de este
último aparece en la orina acomplejado
con el amoniaco en forma de ión amonio
(NH4+) o asociado con el fosfato en forma
de fosfato monobásico de sodio
(NaH2PO4), representando este último la
llamada acidez titulable. En general, el
pH de la orina será un reflejo de la
producción de ácidos no volátiles por el
organismo.
El resultado final de los
mecanismos fisiológicos que participan
en el mantenimiento del equilibrio ácidobase es el de mantener el pH
extracelular en un rango compatible con
el
funcionamiento
adecuado
del
organismo.
Material
• Diez probetas o vasos de precipitado.
• Orina.
• Solución de bicarbonato de sodio a 3%.
• Potenciómetro.
132
Método
Un alumno por equipo desayunará o
comerá normalmente (evitar ingestión de
jugos ácidos); después hará lo que se
indica a continuación.
1. Tomar 250 ml de agua una hora antes
de la clase práctica. Vaciar la vejiga y
descartar esa orina.
2.
Tomar
250
ml
de
inmediatamente antes de la
práctica.
agua
clase
3. Orinar en un vaso de precipitado de
100 ml. Anotar el volumen de la muestra.
4. Ingerir 250 ml de agua.
5. Realizar ejercicio muscular intenso,
como subir y bajar varias veces las
escaleras de tres o cuatro pisos u otro
ejercicio sugerido por el profesor.
6. Obtener muestras de orina cada 15
minutos, como en el inciso 3, hasta
completar por lo menos cinco muestras.
7. A cada muestra se le determinará el
pH inmediatamente después de haber
sido obtenida ya que con el tiempo el pH
tiende a aumentar debido a la pérdida de
dióxido de carbono y a que el
crecimiento
bacteriano
produce
amoniaco a partir de la urea.
Análisis de resultados
2. Mediante la medición del pH, observar
la variación de la concentración de
hidrogeniones en la orina de un individuo
que ha ingerido una carga de
bicarbonato de sodio.
Hipótesis
Elabore la hipótesis apropiada.
Material
Orina
Solución de bicarbonato de sodi al 3%
Potenciómetro
Método
1. Tomar 250 ml de agua una hora antes
de la clase práctica. Vaciar la vejiga y
descartar esa orina.
2.
Tomar
250
ml
de
inmediatamente antes de la
práctica.
agua
clase
3. Orinar en un vaso de precipitado de
100 ml. Anotar el volumen de la muestra.
4. Ingerir 250 ml de agua con 7.5 g de
bicarbonato de sodio.
5. Obtener muestras de orina cada 15
minutos, hasta completar por lo menos 5
muestras.
6. A cada muestra se le determinará el
pH inmediatamente después de haber
sido obtenida.
Análisis de resultados
Una vez obtenido el valor del pH para
cada una de las 5 muestras de orina,
trazar una gráfica de pH contra tiempo;
interpretar los resultados y discutirlos en
grupo.
Objetivos (Segunda parte)
1. El alumno constatará el papel del riñón
en el mantenimiento del equilibrio ácidobase en una situación de alcalosis
metabólica provocada por la ingestión de
bicarbonato de sodio.
Análisis de resultados
Una vez obtenido el valor del pH para
cada una de las cinco muestras de orina,
trazar una gráfica de pH contra tiempo;
interpretar los resultados y discutirlos en
grupo.
Referencias
1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto
con aplicaciones clínicas. 4a. ed.
Barcelona: Editorial Reverte; 2004.
2. Montgomery R. Bioquímica: casos y
texto. 6a. ed. Editorial Harcourt-Brace;
1998: cap.4.
3. Villazón SA, Cárdenas CO, Villazón.
133
Práctica 3
Cinética enzimática.
Efecto de la concentración del sustrato
sobre la velocidad de reacción enzimática
Tiempo de práctica: 2 horas
Objetivo
La enzima que sirve de modelo en esta
práctica es la glucosa oxidasa acoplada a la
peroxidasa.
El alumno:
1. Explicará el efecto de la concentración
de sustrato sobre la velocidad de una
reacción enzimática.
2. Calculará por métodos gráficos la
velocidad máxima y la constante de
Michaelis de una reacción enzimática.
3. Conocerá los diferentes tipos de
inhibidores que existen y estudiará su efecto
sobre la Km y V máx.
4. Conocerá
aspectos
básicos
de
fotocolorimetría (ver pág, 115).
Para lograr los objetivos de esta práctica
contestar las siguientes preguntas:
1. ¿Qué es la velocidad de una reacción
enzimática?
2. ¿Cómo se define la constante de
Michaelis (Km) de una reacción enzimática?
3. ¿Cómo se define la velocidad máxima (V
máx) de una reacción?
4. ¿Para qué le sirve a un médico la
determinación de la actividad de algunas
enzimas?
5. ¿Cuáles son las
enzimas cuya
determinación tiene valor diagnóstico?
Hipótesis
Si la velocidad de una reacción enzimática
es proporcional a la concentración del
sustrato; cuando la concentración del
sustrato es muy alta, por lo tanto la enzima
se satura y alcanza su velocidad máxima.
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son las proteínas más
notables de la naturaleza; sin ellas, la vida
como la conocemos no sería posible. Las
enzimas son catalizadores, esto es,
aceleran la velocidad de las reacciones
sobre las que actúan sin consumirse en el
proceso. El poder catalítico de las enzimas
es mucho mayor que el de los catalizadores
inorgánicos, algunas de ellas están
limitadas solo por la velocidad con que
colisionan
con
sus
sustratos;
son
catalizadores perfectos.
Aunque las reacciones que ocurren
en la célula son termodinámicamente
favorables, la velocidad a la cual transcurren
la mayoría de ellas es extremadamente
lenta; sin la presencia de las enzimas, las
reacciones necesarias para sostener la vida
ocurrirían a una velocidad incompatible con
ésta. Además de su enorme poder
catalítico, las enzimas son altamente
específicas por sus sustratos y tienen la
capacidad de regular su velocidad en
respuesta a las concentraciones de sustrato
y la presencia de inhibidores, activadores,
reguladores alostéricos, etc. Así pues, las
enzimas desempeñan un papel central en
los
procesos
biológicos,
son
las
responsables de degradar y sintetizar las
moléculas que nos forman y de extraer,
transformar y utilizar toda la energía
relacionada con estos procesos. Por último,
las enzimas son las responsables de regular
y coordinar todas las reacciones que
134
ocurren en un organismo para lograr el
delicado balance que representa la vida.
El primer modelo matemático que
explicó de manera general la cinética de las
enzimas no alostéricas, donde la velocidad
de
la
reacción
se
incrementa
hiperbólicamente conforme aumenta la
concentración de sustrato, fue propuesto en
1913 por Leonor Michaelis y Maud Menten a
partir de los trabajos previos de Victor Henri
y Archibald Hill. Este modelo postula la idea
central de que la enzima y el sustrato libres
establecen un equilibrio rápido con el
complejo enzima-sustrato; en un segundo
paso más lento, este complejo se rompe
liberando el producto y regenerando la
enzima libre. La ecuación de MichelisMenten explica la relación entre la velocidad
de la reacción catalizada por una enzima y
la concentración de sustrato a través de los
dos parámetros de la ecuación, Vmax y Km.
La ecuación de Michaelis-Menten puede ser
re-arreglada matemáticamente para obtener
su forma lineal, permitiendo determinar de
manera sencilla los parámetros cinéticos de
una enzima a través del grafico de
Lineweaver-Burk. Este mismo gráfico
permite inspeccionar rápida y visualmente
las diferentes formas de inhibición
enzimática.
El estudio de las enzimas es de
suma importancia dentro de las ciencias
médicas; las enzimas están implicadas en el
origen, diagnostico y tratamiento de una
gran cantidad de patologías y es claro que
en el futuro, su preponderancia será cada
vez mayor. Por ejemplo, la deficiencia de
algunas enzimas, como las proteasas de la
coagulación en la hemofilia, es causa de
enfermedades hereditarias. La presencia
anormal de algunas enzimas en el torrente
sanguíneo ayuda a diagnosticar el daño
específico de tejidos, este es el caso de la
amilasa y lipasa en las patologías
pancreáticas y las transaminasas en las
enfermedades hepáticas. Las enzimas son
también el blanco de varios fármacos: la
aspirina inhibe a la ciclooxigenasa, el
omeprazol a la ATPasa de protones y el
captopril a la enzima convertidora de
angiotensina; estas inhibiciones redundan
en un efecto terapéutico. La capacidad de
producir enzimas recombinantes abrió la
posibilidad de utilizarlas rutinariamente con
fines terapéuticos, tal es el caso de la
estreptocinasa para la terapia fibrinolítica en
el infarto agudo al miocardio. Es claro que
todas estas aplicaciones no serian posibles
sin la previa y profunda comprensión de la
estructura y función de estas fascinantes
moléculas.
Fundamento
El método se basa en el hecho de que la
glucosa, en presencia del oxígeno del aire y
con la participación de la glucosa oxidasa,
se oxida hasta ácido glucónico. El peróxido
de hidrógeno que se forma en el curso del
proceso se descompone mediante la
peroxidasa. El oxígeno atómico que se
desprende en esta última reacción se
combina con un cromógeno que se colorea
al oxidarse. La intensidad de la coloración
del cromógeno oxidado es proporcional a la
concentración de glucosa.
La glucosa oxidasa (ß-D-glucosa: oxígeno
óxidorreductasa, EC1.1.2.4) tiene un peso
molecular de 160 000. Existe en forma
dimérica y contiene dos moles de FAD
como grupo prostético por mol de enzima.
La glucosa oxidasa es altamente específica,
hecho que ha permitido su empleo para el
análisis cuantitativo de glucosa. La reacción
consiste de dos pasos:
1. Glucosa+glucosa oxidasa-FAD
δ-gluconolactona + glucosa oxidasa-FADH2
2. Glucosa oxidasa-FADH2 + O2
glucosa oxidasa-FAD + H2O2
La
δ4-gluconolactona
se
hidrata
espontáneamente dando ácido glucónico.
La reacción global se expresa:
Glucosa oxidasa
Glucosa + O2
Acido glucónico +
H2O2
La peroxidasa cataliza la transferencia de
oxígeno del peróxido a un aceptor que es
135
cromógeno como la ortotoluidina, la
ortodianisidina,
la
2,2-azino-bis
(3etilbencentiazolin-6-sulfónico) o la 4-aminoantipirina (y fenol) que se colorean al
oxidarse. La reacción se expresa:
E+S
ES
E+P
Material y reactivos
• 2 Gradillas con 8 tubos de ensaye cada
una.
• 1 Pipeta de 5 ml.
• 2 Pipetas de 5 ml.
• 1 Matraz Erlemeyer de 100 ml.
• Fotocolorímetro con filtro azul.
• Solución estándar de glucosa 40 mmol/l y
una dilución 1:10 de ésta para los tubos 2, 3
y 4.
• 2 frascos con solución de enzimas: 41.6
Uml–1 de glucosa oxidasa, 4.6 Uml–1 de
peroxidasa, ortodianisidina 0.21 mmol/l.
• Solución de azida de sodio 400 mmol/l
como inhibidor.
• Gotero con HCl.
Método II (sin inhibidor)
1.- Preparar nuevamente una serie de tubos
como lo indica la tabla 1.
2.- Repetir los paos 3 y 4 del Método I
Leer ambas series de tubos en el
fotocolorímetro; utilizar como blanco el tubo
1
Resultados (cuadro 5.2)
2. Preparar la siguiente serie de tubos (tabla
1).
1. Cálculo de la concentración inicial de
sustrato en cada tubo; tomar en cuenta que
la solución de glucosa contiene 40 µmolas
ml–1.
2. La velocidad será igual a las unidades
Klett por .5 min-1 de incubación.
3. Con los datos obtenidos completar el
cuadro 5.2 y hacer las dos gráficas en papel
milimétrico.
4. Hacer una segunda gráfica con los
valores de 1/v vs 1/[S].
5. Calcular el valor de la velocidad máxima
(Vmáx) y de la constante de Michaelis (Km)
con y sin inhibidor.
6. Determinar el tipo de inhibidor de
acuerdo con las gráficas del punto anterior.
7. Analizar si los resultados obtenidos están
de acuerdo con la hipótesis planteada.
Instrucciones para la operación del
fotocolorímetro Klett-Summerson
1. Antes de encender el fotocolorímetro
cerciórese que el filtro (F) está en su
3.- Considerar un intervalo de 30 segundos
para cada tubo al agregar la enzima.
Tubo Solución
No.
glucosa (ml)
Método I (con azida de sodio)
1. En un matraz Erlenmeyer de 100 ml
preincubar 20 minutos la solución de
enzimas con 0.3 ml del inhibidor.
4.- Agitar cada tubo e incubar 5 minutos
temperatura ambiente y de inmediato
detener la reacción agregando 3 gotas de
HCl concentrado. Considerar un intervalo de
30 segundos para cada tubo al agregar el
HCl.
1
2
3
4
5
6
7
8
dil 1:10
dil 1:10
dil 1:10
de H2O
(ml)
0.0
0.1
0.25
0.5
0.1
0.25
05.
1.0
1.0
0.9
0.75
0.5
0.9
0.75
0.5
0.0
Soución
de
enzimas
(ml)
3
3
3
3
3
3
3
3
136
2.
3.
4.
5.
6.
7.
sitio. La luz sin el filtro puede dañar la
fotocelda.
Asegúrese que la aguja indicadora (C)
está en cero. En caso contrario, ajústese
a cero con la perilla (D) que sólo debe
usarse cuando la lámpara del colorímetro
esté apagada.
Encienda el foco con el interruptor de la
derecha y deje que el instrumento se
caliente hasta que se equilibre su
operación.
Cinco
minutos
son
suficientes.
Ajuste la escala del potenciómetro (B) a
cero usando la perilla (A).
Ponga una cubeta limpia llena con el
blanco de reactivos en el hueco del
instrumento en tal forma que la marca
del tubo (ej. Pyrex) se sitúe directamente
al frente. Es una buena práctica limpiar la
superficie externa de la cubeta con un
pañuelo desechable antes de cada
lectura. Sólo deben usarse tubos
seleccionados como "cubetas" para las
determinaciones.
Por medio de la perilla (G) ajuste la
lectura del galvanómetro a cero; esto es,
la aguja (C) debe coincidir con el trazo
central y, al mismo tiempo, con la escala
(B) en cero.
Para leer las soluciones problema retire
el “blanco” y ponga en el hueco del
instrumento la cubeta con la solución
problema. La aguja (C) se desviará de su
posición en la línea de cero; por medio
de la perilla (A) gírese la escala (B) hasta
que la aguja (C) sea llevada
exactamente a cero. La lectura de la
escala (B) se anota y corresponde a la
lectura del problema; léase únicamente
hasta la marca más próxima. Cualquier
intento de apreciar mayor exactitud es
innecesario, pues la construcción del
instrumento no proporciona una precisión
mayor.
8. Continúe con la lectura de otros
problemas y, de vez en cuando,
compruebe el cero con el “blanco.”
Referencias
1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2004.
2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 2005.
3. Mathews CK, van Holde KE. Bioquímica.
3a.
ed.
España:
McGraw-Hill
Interamericana; 2003.
4. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentals
of biochemistry. USA: John Wiley and
Sons; 1999.
137
Tubo
No.
Concentración de
sustrato µmolas
de glucosa inicial
ml-1
ABCISAS (X)
Velocidad de la
reacción unidades
Klett 5 min-1 1/V
ORDENADAS (Y)
1
2
3
4
5
6
7
8
Cuadro 5.2 Resultados
Velocidad de la
reacción con
INHIBIDOR 1/V
Unidades Klett
5 min–1 (Y)
Tubo
No.
Concentración de
sustrato µmolas
de glucosa inicial
ml-1
ABCISAS (1/X)
Velocidad de la
reacción unidades
Klett 5 min-1
ORDENADAS (1/Y)
Velocidad de la
reacción con
INHIBIDOR
Unidades Klett
5 min -1
1
2
3
4
5
6
7
8
Cuadro 5.3 Resultados (inverso)
138
Práctica 4
Efecto de la insulina sobre la glucemia de la rata
Tiempo de Práctica: 2 Horas
Esta
práctica
es
una
simulación
compuratizada de un fenómeno bioquímico;
tiene el propósito de que los alumnos se
ejerciten en el manejo de los datos
obtenidos por medio de experimentación
simulada estrictamente controlada.
Objetivos
1. Que el alumno compruebe el efecto de la
insulina sobre la glucemia de la rata.
2. Relacione sus conocimientos sobre el
metabolismo de la glucosa y los
mecanismos del control de la glucemia y los
mecanismos del control de la glucemia en
un modelo experimental sencillo.
Conteste a las siguientes preguntas:
1. ¿Qué es la insulina y cuál es su función?
2. ¿Dónde se sintetiza y cuántas cadenas
tiene?
3. ¿Qué se sabe del mecanismo por medio
del cual actúa?
4. ¿Por qué la insulina se tiene que inyectar
y no se debe administrar por vía bucal?
Hipótesis
Si la glucemia en la rata se modifica por la
acción de la insulina, la rata control
mostrará una glucemia diferente a la
experimental.
Analizar
la
hipótesis
apropiada.
Método
1. Encender la computadora y localizar el
icono del programa. El efecto de la insulina
sobre la glucemia de la rata. Hacer doble
clic sobre este icono.
2. Hacer clic sobre los botones que indican
cada de las partes de la práctica; empezar
por leer las
instrucciones, los objetivos y el fundamento
de la práctica para continuar con la parte
experimental.
3. Seguir todos los pasos de la práctica;
poner especial atención en la obtención de
los datos experimentales que dberán ser
anotados en papel como cualquier práctica
convencional.
4. Repetir el experimento las veces que el
usuario quiera, o las veces que sean
necesario, hasta obtener los datos
completos del experimento. Se sugiere
repetirlo por lo menos dos veces y hacer un
promedio de los datos obtenidos.
5. Hacer una tabla con dichos datos,
graficarlo, analizar el significado de los
mismos y, de acuerdo a lo anterior, validar o
rechazar la hipótesis del experimento.
Análisis de resultados
1. Analizar si los resultados obtenidos están
de acuerdo con la hipótesis planteada.
2. Plantear cuál sería el resultado esperado
si se hubiera trabajado con ratas diabéticas.
3. Relacionar los datos con el control
hormonal de la glucemia.
4. Hacer el informe de la práctica con los
resultados y las conclusiones que de éstos
se deriven.
Referencias
1. Stryer L. Bioquímica. 5a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2003.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 5a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2001.
3. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 2005.
139
Práctica 5
Estudio del bombeo de protones por levaduras;
efecto de los inhibidores de la cadena de
transporte de electrones y de los desacoplantes
Tiempo de práctica: 2 horas
Objetivos
1. Que el alumno relacione el consumo de
glucosa con los cambios de pH producidos
por las levaduras.
2. Que el alumno describa las vías por las
cuales la glucosa genera los cambios de
pH.
3. Que el alumno interprete el efecto de
los inhibidores y los desacoplantes sobre
la salida de protones.
Responda a las siguientes preguntas:
1. ¿Cuáles son las fuentes de carbono
que usa la levadura?
2. ¿Cuáles son las vías metabólicas que
catabolizan a los carbohidratos?
3. ¿En qué consisten la glucólisis y la
fosforilación oxidativa?
4. ¿Cuáles son los productos finales del
catabolismo de los carbohidratos en las
levaduras?
5. ¿Cuáles son los inhibidores de la
cadena respiratoria de los sitios I, II y III?
Describa su efecto sobre el consumo de
O2 y la síntesis del ATP.
6. ¿Cuál es el mecanismo por medio del
cual los protonóforos desacoplan la
fosforilación oxidativa? Describa su efecto
sobre el consumo de O2 y la síntesis del
ATP.
Las levaduras Saccharomyces cerevisiae
son organismos unicelulares que se
dividen por gemación. En común con otras
células eucariontes, las levaduras tienen
un núcleoen donde reside la información
genética de la célula, mitocondrias en
donde se lleva a cabo la síntesis de ATP y
un retículo endoplásmico y aparato de
Golgi que se encargan de la síntesis de
proteínas cuya localización final es la
membrana plasmática o el exterior.
A nivel de la membrana plasmática, las
levaduras tienen una ATPasa de H+ que
acopla la hidrólisis del ATP con el bombeo
de protones hacia afuera de la célula.
Esta proteína es semejante desde un
punto de vista estructural y funcional a la
ATPasa de Na+/K+ de las células animales
y, al igual que la bomba de sodio/potasio,
se
inhibe
con
concentraciones
micromolares
de
vanadato.
Como
resultado de la actividad de la ATPasa de
H+ en la levadura, se genera un gradiente
electroquímico de protones que se utiliza
para impulsar el transporte de nutrientes al
interior de la célula, proceso catalizado por
sistemas
de
transporte
llamados
simportadores o uniportadores. Para darse
una idea de la importancia de esta enzima
en la economía celular y en la
energización de la membrana celular,
basta decir que la ATPasa de H+ consume
hasta un 25 % del ATP que se sintetiza en
la célula.
+
Además de esta ATPasa de H de la
membrana plasmática, las levaduras
tienen otra bomba de protones en la
membrana interna de las mitocondrias, la
ATP sintasa, que se encarga de la síntesis
del ATP. En contraste con la enzima de
membrana plasmática, el flujo de protones
a través de la ATP sintasa induce la
140
síntesis de ATP. Uno de los inhibidores
más efectivos de esta enzima es la
oligomicina.
Así, se puede proponer uno de los
muchos ciclos en los que interviene el
ATP en la levadura: por un lado, el ATP se
sintetiza en la mitocondria por medio de la
ATP sintasa, y a nivel de la membrana
+
plasmática, la ATPasa de H lo hidroliza
para bombear protones al exterior de la
célula. El factor común en ambos casos es
un flujo de protones a través de la
membrana.
Hipótesis
Si las levaduras consumen glucosa, se
observará una disminución progresiva de
su concentración en el medio de cultivo
con el tiempo y cambios en el pH
extracelular.
3. Adicionar 5 ml de glucosa a 10 %, agitar
y medir el pH.
4. Determinar el pH de la solución cada 5
minutos 4 veces, y luego cada 10 minutos
2 veces más.
EXPERIMENTO 2 (DINITROFENOL)
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de
agua destilada.
2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.2
ml de la solución de dinitrofenol 40 mmol/l,
concentración final de 200 µmol/l.
3. Determinar el pH de la solución y repetir
la medición dos veces más con intervalos
de 3 minutos para obtener la línea basal.
4. Esperar 5 minutos.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento
control.
EXPERIMENTO 3 (AZIDA)
Material
• Tres vasos de precipitado de 100 ml.
• Pipetas de 5 y 10 ml.
• Potenciómetro.
• Piceta para enjuagar el electrodo del
potenciómetro.
• Levadura (Saccharomyces cerevisiae)
200 mg/ml.
• Solución de glucosa (10%) para una
concentración final de 1%.
• Solución de dinitrofenol 40 mmol/l en
etanol.
• Solución de azida de sodio 400 mmol/l.
• Agua destilada.
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de
agua destilada.
2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.5
ml de la solución de azida de sodio 400
mmol/l, concentración final de 5 mmol/l.
Agitar con cuidado.
3. Determinar el pH de la solución y repetir
la medición dos veces más con intervalos
de 3 minutos para obtener la línea basal.
4. Esperar 5 minutos.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento
control.
6. Registrar sus datos en la siguiente
tabla.
Método
Experimento 1 (control)
1 .Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de
agua destilada.
2. Determinar el pH de la solución y repetir
la medición dos veces más con intervalos
de 3 minutos para obtener la línea basal.
141
Tiempo
(min)
pH
Glucosa
Azida de
Dinitrofe
sodio
nol
0
5
10
15
20
30
40
Análisis de resultados
mamíferos
(ver
3. Hacer una relación de las vías que
producen estos cambios; tomar en cuenta
que las levaduras poseen una ATPasa de
protones en la membrana mitocondrial que
se encarga de sintetizar ATP y que tienen
otra ATPasa de protones en la membrana
plasmática cuya función es similar a la
+
+
bomba de Na /K en las células de los
7.1).
Referencias
1. Peña A. Studies on the mechanism of
K+ transport in yeast. Arch Biochem
Biophys. 1975; 167:397-409.
+
2. Pardo JP. La ATPasa de H de la
membrana plasmática de los hongos.
Mensaje Bioquímico. 1990; 13: 119-172.
Glucosa
1. Hacer una gráfica de cada uno de los
experimentos; utilizar los valores de las
lecturas de pH contra tiempo.
2. Analizar el significado de los cambios
de pH en el experimento control, con
dinitrofenol como desacoplante y con
azida de sodio.
fig.
ADP + Pi
Glucosa
+
H
ATP
+
H
ADP
ATP
Etanol
+
H
+
+
H H
+
H
NAD NADH ADP + Pi
ATP
Acetaldehído
Mitocondria
ADP
ADP
142
Práctica 6
El efecto del etanol sobre la lipoperoxidación
Tiempo de Práctica: 2 Horas
Esta
práctica
es
una
simulación
compuratizada de un fenómeno bioquímica;
tiene el propósito de que los alumnos se
ejerciten en el manejo de los datos
obtenidos por medio de experimentación
simulada estrictamente controlada.
Método
1. Encender la computadora y localizar el
icono del programa. El efecto de la insulina
sobre la glucemia de la rata. Hacer doble
clic sobre este icono.
2. Hacer clic sobre los botones que indican
cada de las partes de la práctica; empezar
por leer las instrucciones, los objetivos y el
fundamento de la práctica para continuar
con la parte experimental.
3. Seguir todos los pasos de la práctica;
poner especial atención en la obtención de
los datos experimentales que deberán ser
anotados en papel como cualquier práctica
convencional.
4. Repetir el experimento las veces que el
usuario quiera, o las veces que sean
necesario, hasta obtener los datos
completos del experimento. Se sugiere
repetirlo por lo menos dos veces y hacer un
promedio de los datos obtenidos.
5. Hacer una tabla con dichos datos,
graficarlo, analizar el significado de los
mismos y, de acuerdo a lo anterior, validar o
rechazar la hipótesis del experimento.
Referencias
1. Stryer L. Bioquímica. 5a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2003.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 5a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2001.
3. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 2005.
143
Práctica 7
Estudio general del metabolismo
de los carbohidratos
Tiempo de práctica: 3 horas
Objetivos
1. Aplicar los conocimientos generales
sobre los carbohidratos a su estudio en los
tejidos o líquidos corporales.
2. Conocer el metabolismo de la glucosa.
3. Conocer las alteraciones más
frecuentes del metabolismo de los
carbohidratos.
4. Conocer los aspectos básicos de las
determinaciones del laboratorio clínico
para valorar el funcionamiento del
metabolismo de los carbohidratos.
5. Describir los principios analíticos para la
determinación de glucosa y fructosaminas,
llevar a cabo sus determinaciones y
correlacionar los valores obtenidos con
los valores normales de glucosa y
fructosaminas en suero o plasma.
Conteste las siguientes preguntas:
1. ¿Qué son los carbohidratos y cómo se
clasifican?
2. ¿Cuáles son las funciones que
desempeñan los carbohidratos en el
organismo humano?
3. ¿Cómo se lleva a cabo la digestión y
absorción de los carbohidratos?
4. ¿Cuáles son las vías metabólicas en las
que participan los carbohidratos?
5. ¿Qué es la glucemia y cómo se regula?
6. ¿Cuáles son las principales alteraciones
de la digestión, absorción y metabolismo
de
los
carbohidratos
(déficit
de
glucosidasas intestinales, malabsorción
intestinal de azúcares, enfermedades del
metabolismo de la fructosa y de la
galactosa, diabetes mellitus, secuelas de
la diabetes, glucogenosis, etcétera)?
7. ¿Cuál es el mecanismo por el cual la
glucosa puede causar daño a los tejidos
(glucosilación proteica: formación de
bases de Schiff, puentes glucosídicos
AGE).
8. ¿Cuáles son las pruebas de laboratorio
más utilizadas para el estudio de los
carbohidratos corporales?
INTRODUCCIÓN
La glucosa es cuantitativamente el
carbohidrato más importante del que
dispone el cuerpo, ya sea por absorción
de la dieta o por síntesis interna. Por
consiguiente, la mayoría de las pruebas
clínicas están basadas en el estudio del
metabolismo de la glucosa. Se conocen
varias alteraciones de este metabolismo,
clasificándolas como:
•Primarias, alteraciones en el metabolismo
de carbohidratos (diabetes mellitus,
hiperinsulinismo, entre otras).
•Secundarias,
manifestaciones
que
acompañan
a
otras
enfermedades
(síndrome
de
Cushing,
afecciones
hepáticas, hipofisiarias o tiroideas, entre
otras).
Entre los procedimientos diagnósticos
para valorar el funcionamiento del
metabolismo de los carbohidratos los más
importantes son los siguientes:
• Glucosa plasmática en ayunas.
• Glucosa en orina.
•
Cuerpos
cetónicos
en
sangre
(cetonemia) y en orina (cetonuria).
144
• Prueba oral de tolerancia a la glucosa.
• Hemoglobina glucosilada.
• Fructosaminas.
•
Determinación
de
hormonas
relacionadas con el metabolismo de
carbohidratos (insulina, péptido "C" y
glucagón).
• Determinaciones de enzimas y sustratos
hidrocarbonados en células y tejidos.
•
Otras
determinaciones
(microalbuminuria,
determinaciones
inmunológicas
y
determinación
de
receptores).
Para llevar a cabo la determinación de
glucosa plasmática en ayunas (basal)
utilizaremos un método enzimático
colorimétrico y para la determinación de
glucosa y cuerpos cetónicos en orina
utilizaremos tiras reactivas.
Material
• Gradilla con 3 tubos de ensayo.
• Pipetas de 0.1 y 1 ml.
• Solución reactiva para glucosa: TRIS 92
mmol/l, pH 7.4; fenol 0.3 mmol/l, glucosa
oxidasa 15 000 U/l, peroxidasa 1000 U/l y
4-aminofenazona 2.6 mmol/l.
• Solución reactiva para determinación de
fructosaminas 1: proteinasa K 786 U/ml,
peroxidasa 60 U/ml, amortiguador de pH y
diversos estabilizadores.
• Solución reactiva para determinación de
fructosaminas 2: cetoamina oxidasa 9
U/ml, 4-aminoantipirina 10.5 mmol/l, EDTA
50 mmol/l, amortiguador de pH y
estabilizadores.
•Solución estándar de glucosa 100 mg/dl.
•Solución estándar de fructosamina 150
µmol/l.
•Curva patrón de fructosaminas (DA
contra concentración) 50, 100, 200, 400
µmol/l. Gráfica proporcionada por la
coordinación.
•Suero o plasma problema (estable 3 días
a 2-8°C).
• Espectrofotómetro a 505 y 620 nm.
Método
DETERMINACIÓN DE LA GLUCEMIA BASAL
POR GOD-POD/TRINDER
El método más utilizado en el laboratorio
clínico es el de la glucosa oxidasa (GOD).
Esta enzima cataliza la reacción de la
glucosa presente en la muestra.
GOD
Glucosa + O2 + H2O
H2O2 +
Gluconato
La cuantificación de los resultados puede
llevarse a cabo de la siguiente manera:
Mediante polarografía, determinación del
consumo de oxígeno con la ayuda de un
electrodo de oxígeno. La cantidad de
glucosa en la muestra es directamente
proporcional a la cantidad de oxígeno
consumido. Método muy utilizado en
sistemas automatizados de análisis
clínico.
Enzimático
colorimétrico,
por
determinación de la quinona producida por
la acción de la peroxidasa (POD), en
donde un cromógeno pasa de su forma
reducida (incolora) a su forma oxidada
(coloreada). El método utilizado para esta
determinación es el de Trinder. En él la
intensidad del color es directamente
proporcional a la cantidad de glucosa
presente en la muestra.
POD
2H2O + Fenol + 4-AF
Quinona +
H2O
Preparar la siguiente serie de tubos:
No. de tubo
1. Blanco
2. Estándar
3. Suero
Estándar
-
10 µl
Suero
-
-
10 µl
1 ml
1 ml
1 ml
problema
-
problema
Solución
reactiva para
glucosa
Mezclar e incubar
temperatura ambiente.
15
minutos
a
145
La coloración es estable 30 minutos.
Medir la absorbencia (A) frente a blanco
de reactivos a 505 nm.
Cálculo:
ASuero
X[Estándar.g / dl] = [ Albúmina.g / dl]
AEstándar
El resultado se obtiene en mg/dl (x 0.0555
= mmol/l).
El método es lineal hasta valores de 500
mg/dl.
Diluir el suero 1:2, si la concentración de
glucosa es mayor a 500 mg/dl con
solución salina.
La hemólisis hasta 0.3 g/dl de
hemoglobina no interfiere.
Los anticoagulantes como el EDTA,
oxalato, heparina o fluoruro no afectan a
los resultados.
La glucosa en suero o plasma es estable
tres días a 2-8°C. A temperatura
ambiente, la glucosa presente en una
muestra de sangre entera puede
desaparecer por completo al cabo de 6
horas debido a la glucólisis en los
eritrocitos. Además, la contaminación
bacteriana y la presencia de cantidades
elevadas de leucocitos, pueden también
aumentar
dicho
proceso,
por
consiguiente:
Siempre que la muestra sea sangre total,
la determinación de la glucosa debe
realizarse durante la media hora siguiente
a su recolección.
De lo contrario, añadir un conservador que
inhiba la glucólisis (fluoruro sódico).
GLICACIÓN NO ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS.
FRUCTOSAMINAS Y HEMOGLOBINA GLICADA
El término glicosilación no enzimático de
las proteínas se refiere a la reacción entre
los azúcares reductores con los grupos
amino
libres de las proteínas, por un mecanismo
diferente al empleado en la reacción
catalizada
por
las
enzimas
glucosiltransferasas, por lo que la unión
que se establece entre el azúcar y la
proteína no es de naturaleza glucosídica.
Se prefiere el uso del término glicación en
lugar de glicosilación o glucosilación (para
el caso de la unión de glucosa con la
proteína) para este tipo de reacción. La
glicación
es
una
reacción
de
condensación entre la función aldehído o
cetona de un azúcar reductor y un grupo
amino libre de una proteína (residuo
amino terminal o épsilon amino de una
lisina) en la que se genera una base de
Schiff, que se transforma en una
cetoamina estable llamada producto de
Amadori o fructosamina.
La glicación depende exclusivamente de
los niveles de glucosa en los líquidos
corporales y del tiempo de contacto entre
ésta y las proteínas. De ahí que, la
determinación de los productos de
glicación puede emplearse como medida
del nivel promedio de la glucosa
sanguínea durante un cierto período de
tiempo, el cual dependerá de la vida
media de la proteína que se analice.
La hemoglobina glicada y las proteínas
séricas glicadas (fructosaminas) se utilizan
como parámetros de medida a largo plazo
de la evaluación del estado del
metabolismo de los carbohidratos en el
diagnóstico, control y tratamiento de la
diabetes (una enfermedad caracterizada
por los niveles de glucosa circulante
elevados). Hay un consenso general en
que las complicaciones crónicas de la
diabetes
como
las
retinopatías,
nefropatías,
neuropatías
y
la
aterosclerosis acelerada, entre otras, son
consecuencia de los niveles altos de
glucosa en la sangre, los que pueden ser
determinados midiendo la concentración
de proteínas glicadas.
146
El primer indicador retrospectivo del curso
de la glicemia en el tiempo, que se puso al
alcance de los laboratorios clínicos fue la
hemoglobina glicada (HbA1 ó HbA1c).
Ésta refleja el promedio de la glucemia de
las 6 a 8 semanas previas a la toma de la
muestra. La hemoglobina tiene una
velocidad de recambio menor que las
proteínas plasmáticas, por lo que, la
determinación de fructosaminas puede
emplearse como índice del control de la
glucemia en un periodo más corto, de
alrededor de dos semanas previas a la
toma de sangre. Es decir, que cubre un
periodo de tiempo intermedio
entre la determinación instantánea de la
glucemia y la valoración a largo plazo
dada por la HbA1.
La determinación de la Hb glicada puede
diferenciar un proceso agudo que cursa
con hiperglucemia, una hiperglucemia
transitoria secundaria al estrés y una
diabetes mellitus.
La determinación del nivel de glicación de
la albúmina plasmática (glicoAlb), que
tiene una vida media de 14 a 20 días,
refleja el promedio de la glucemia (y por
tanto, el grado de control del paciente) en
un periodo que va desde 1 a 3 semanas
previas a la extracción de sangre. Aunque
la albúmina es el componente sérico
glicado cuantitativamente más importante,
otras proteínas séricas también sufren
glicación. La vida media de estas
proteínas circulantes es de sólo unos
pocos días, por lo cual la determinación de
las proteínas séricas glicadas totales
(PSG) refleja la glucemia promedio de los
15 días previos a la toma de muestra.
La determinación de estos productos
glicados se lleva a cabo mediante las
siguientes reacciones: La proteinasa K
digiere las proteínas glucosiladas para dar
fragmentos de proteínas, los cuales por
medio de la cetoamida oxidasa, oxidan
sus enlaces cetoamida, dando como
resultado aminoácidos y peróxido de
hidrógeno. La peroxidasa cataliza la
transferencia de oxígeno del peróxido a un
aceptor que es un cromógeno, que se
colorea al oxidarse. La absorbencia del
cromógeno oxidado a 620 nm es
proporcional a la concentración de
proteína glicada.
Procedimiento para la determinación de
fructosaminas:
1. Vaciar en un tubo de ensayo 0.5 ml
(500 µl) de reactivo 1 para fructosaminas.
2. Agregar 0.02 ml (20 µl) de suero o
plasma problema.
3. Incubar 10 minutos a temperatura
ambiente.
4. Agregar 0.1 ml (100 µl) de reactivo 2
para fructosaminas.
5. Mezclar, leer la absorbencia inicial al
cabo de 30 segundos a 620 nm.
6. Leer nuevamente la absorbencia al
cabo de 1 minuto.
Cálculo:
Anotar la ∆A del tubo e interpolar en la
gráfica de ∆A contra concentración de
fructosamina en µmol/l que será
proporcionada en la coordinación de
prácticas.
Valores esperados 122 - 236 µmol/l.
El método es lineal hasta 1734 µmol/l.
Determinación de glucosa y de cuerpos
cetónicos en orina con tiras reactivas
Aunque los cuerpos cetónicos son
productos intermedios del metabolismo de
los ácidos grasos, la variación de sus
niveles en sangre y en orina informa
indirectamente acerca del metabolismo de
los carbohidratos.
147
Recolectar una muestra de orina en un
recipiente de plástico o de vidrio limpios (si
la muestra no se procesa durante la
primera hora después de su obtención,
deberá refrigerarse).
Sumergir la tira reactiva en la orina y
retirarla inmediatamente.
Colocar la tira reactiva horizontalmente
sobre un papel absorbente, en el
transcurso de 30 segundos a 2 minutos
interpretar los resultados para ello:
Comparar la tira reactiva con los bloques
de colores que aparecen en la caja de las
tiras reactivas (cambios en la coloración
después de 2 minutos no tienen
importancia clínica).
Composición de las tiras reactivas es la
siguiente:
Glucosa, 10.54% de glucosa oxidasa
(Aspergillus, 250 UI), 0.2% de peroxidasa
(rábano, 2500 UI) y 5% yoduro de potasio.
Cetonas, 4.5% de nitroprusiato de sodio.
Referencias
1.González de Buitrago JM. Bioquímica
clínica.
McGraw-Hill
Interamericana
Editores; 1999.
2.D’Ocon, C. Fundamentos y técnicas de
análisis bioquímico. Editorial Paraninfo;
1998.
3.Chernecky CC. Pruebas de Laboratorio
y Procedimientos Diagnósticos. 2a. ed.
McGraw-Hill Interamericana Editores;
1999.
4.Gaw, A. Bioquímica clínica. 2a. ed.
Editorial Harcourt; 2001.
5.Anderson SC, Cockayne S. Química
clínica.
México:
McGraw-Hill
Interamericana Editores; 1995.
6.Actis SM, Rebolledo O. Avances en la
valoración de fructosamina: ventajas de un
nuevo equipo diagnóstico aplicado a
estudios poblacionales. Acta Bioquím Clín
Latinoamer. 1991; 25 (4): 391-402.
148
Práctica 8
El efecto del tetracloruro de carbono sobre
las transaminasas
Tiempo de Práctica: 2 Horas
Esta práctica es una simulación
compuratizada
de
un
fenómeno
bioquímica; tiene el propósito de que los
alumnos se ejerciten en el manejo de los
datos
obtenidos
por
medio
de
experimentación simulada estrictamente
controlada.
Método
1. Encender la computadora y localizar el
icono del programa. El efecto de la
insulina sobre la glucemia de la rata.
Hacer doble clic sobre este icono.
2. Hacer clic sobre los botones que
indican cada de las partes de la práctica;
empezar por leer las instrucciones, los
objetivos y el fundamento de la práctica
para continuar con la parte experimental.
3. Seguir todos los pasos de la práctica;
poner especial atención en la obtención
de los datos experimentales que deberán
ser anotados en papel como cualquier
práctica convencional.
4. Repetir el experimento las veces que
el usuario quiera, o las veces que sean
necesario, hasta obtener los datos
completos del experimento. Se sugiere
repetirlo por lo menos dos veces y hacer
un promedio de los datos obtenidos.
5. Hacer una tabla con dichos datos,
graficarlo, analizar el significado de los
mismos y, de acuerdo a lo anterior,
validar o rechazar la hipótesis del
experimento.
Referencias
1. Stryer L. Bioquímica. 5a. ed.
Barcelona: Editorial Reverté; 2003.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto
con aplicaciones clínicas. 5a. ed.
Barcelona: Editorial Reverté; 2001.
3. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
149
Práctica 9
Determinación de glucosa en sangre total
Objetivos
1. Que el estudiante comprenda el
metabolismo de la glucosa en sujetos
sanos en diferentes condiciones
metabólicas.
2. Que el estudiante corrobore los
cambios de glucosa que ocurren
después de la ingesta de alimentos.
4. Que el alumno sea capaz de analizar
e interpretar los resultados obtenidos a
partir de la determinación de glucosa
en sangre total.
INTRODUCCIÓN
La glucosa es el proveedor de energía
más importante del organismo junto
con los ácidos grasos y los cuerpos
cetónicos.
El principal aporte proviene del intestino
(glucosa alimentaria), el hígado y los
riñones.
En los animales superiores el
metabolismo de los carbohidratos está
sujeto a mecanismos de regulación
complejos en los que participan las
hormonas, los metabolitos y las
coenzimas.
El cerebro, la médula suprarrenal y los
eritrocitos son los que más dependen
del suministro continuo de glucosa, por
que no disponen de ninguna reserva
importante de la misma1.
El sistema nervioso requiere de
aproximadamente 150 gr de glucosa al
día para realizar sus funciones
normales2.
La principal función bioquímica de la
glucosa es la de proporcionar energía
para los procesos de la vida. El
adenosín trifosfato ("ATP") es la fuente
de energía universal para las
reacciones biológicas. La oxidación de
la glucosa por las vías glucolítica y del
ácido cítrico es la fuente principal de energía
para la biosíntesis del ATP.
El exceso de glucosa es almacenado en las
células como el polímero glucógeno para
demandas posteriores de energía.
El papel de la insulina es desviar la glucosa
extracelular a los sitios de almacenamiento
intracelular en la forma de macromoléculas
(como el glucógeno, lípidos y proteínas). Es así
que la glucosa es almacenada en tiempos de
abundancia para los momentos de necesidad.
Algunos minutos después de la ingesta de una
comida, los niveles de insulina sanguínea
aumentan. La glucosa y los aminoácidos de la
dieta tales como la leucina, isoleucina y lisina,
son estimulantes potentes de las células beta del
páncreas haciendo que éstas segreguen insulina.
La mayor parte de las células periféricas
responden al aumento de la glucosa sanguínea
con un aumento rápido del transporte de la
glucosa dentro de las células. De esta manera,
los niveles de glucosa sanguínea aumentan
solamente de un 20% a un 40% en los individuos
no-diabéticos. Sin embargo, aproximadamente el
80% de la entrada de glucosa no es insulino
dependiente, ya que el cerebro, los glóbulos
rojos, el hígado y los intestinos no requieren de
insulina para la entrada creciente de glucosa
cuando está presente glucosa sanguínea
elevada. El músculo es el tejido dependiente de
insulina más importante. Los niveles crecientes
de insulina y glucosa sanguíneas inhiben la
lipólisis así como a aproximadamente el 60% de
la liberación normal de glucosa hepática3.
Se han realizado estudios del comportamiento de
la glucosa en sangre en sujetos normales en la
cual se puede observar que a los 30 a 60
minutos posteriores a la ingesta de alimentos la
concentración
de
glucosa
alcanza
su
concentración máxima y a las dos horas vuelve a
su estado basal6.
Algunos minutos después de la ingesta de
una comida, los niveles de insulina sanguínea
aumentan6.
Las concentraciones de glucosa en el suero son
aproximadamente 15% más altas que las
150
concentraciones de glucosa en la
sangre total esto es debido a que la
glucólisis continúa en los eritrocitos.
El uso del glucómetro es de mucha
utilidad en el autocontrol de pacientes
diabéticos, lo que ayuda a medir una
glucosa en sangre casual.
El valor calórico total diario de los
alimentos deberá ser entre 25 y 30
Kcal/Kg/día,
para
las
personas
sedentarias y de 30 a 40 Kcal/Kg/día
para una persona físicamente activa o
que realiza ejercicio de manera
regular4,5.
Referencias
1.-Koolman J, Roehm KH (2004).
Bioquímica Texto y Atlas: 3ª Edición,
Ed. Médica Panamericana, pp.: 158,
308-310
2.-Smith, C; Marks, A. D. & Lieberman, M.
(2005). Marks’ Basic Madical
Biochemestry. 2a Edición. Ed. Lippincott
Williams & Wilkins. Pag. 24-26
3.-Kaplan LA, Pesce AJ. (2002). Química
Clínica. Teoría, análisis y correlación. 3ª
Edición. Ed. Pesce Kaplan Publicaciones,
Capítulo: 32.
4.- NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM015-SSA2-1994, “Para la prevención,
tratamiento y control de la diabetes
mellitus en la atención primaria”. Listado
de Normas Oficiales Mexicanas de la
Secretaría de Salud.
5.-MODIFICACIÓN a la Norma Oficial
Mexicana NOM-015-SSA2-1994, Para la
prevención, tratamiento y control de la
diabetes. Listado de Normas Oficiales
Mexicanas de la Secretaría de Salud.
6.- Manual para el manejo de las insulinas
2001. 2ª Edición. Subsecretaría de
Prevención y Protección de la Salud.
Centro
Nacional
de
Vigilancia
Epidemiológica. SSA. Mexico.
Material
• Dietas:
a).-Rica en carbohidratos (X gr. spaghetti).
b).- Dieta rica en lípidos (hamburguesa).
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Dos sujetos sanos sedentarios y dos horas
mínimas de ayuno.
Dos sujetos con actividad física constante y
dos horas mínimas de ayuno.
Glucómetros One Touch Ultra.
Tiras reactivas One Touch Ultra [Glucosa
oxidasa (Aspergillus níger)].
Dispositivo de punción.
Lancetas estériles con discos protectores
One Touch UltraSoft.
Recipiente para material punzo cortante.
Recipiente para material biológico-infeccioso.
Jabón para manos.
Torundas de algodón con alcohol.
Método
1.- Dos sujetos que consumiran una dieta rica en
carbohidratos.
2.- Dos sujetos que consumiran una dieta rica en
proteínas.
3.- A cada uno de los sujetos en cualquiera de
las condiciones y consumo de dietas se les
determinará la concentración de glucosa en
sangre total por medio de un glucómetro en los
siguientes tiempos:
0 minutos (antes de ingerir los alimentos).
30 minutos, 60 minutos y 120 minutos, después
de ingerir los alimentos
Para realizar la determinación de glucosa en
sangre total seguir los siguientes pasos:
4.-Para Insertar la lanceta
a) Gire la tapa One Touch
UltraSoft hacia la izquierda
para quitarla
b) Inserte una lanceta en el
portalancetas
y
empújela
firmemente hasta que quede
bien asentada
5.- Cargue el dispositivo de
punción. Deslice el botón
cargador hacia atrás hasta que
haga clic. El dispositivo de
punción ya esta preparado
para su uso.
151
6.- Lave sus manos y limpie
con una torunda de algodón
con alcohol la zona donde
se realizará la punción.
12.- Inserte la tira reactiva en
el puerto de análisis, con el
extremo de las barras e
contacto de primero y
mirando hacia arriba.
Empújela hasta que no
7.- Coloque el dispositivo de
punción
en
posición.
Sostenga
el
dispositivo
firmemente
contra
el
costado
de
su
dedo.
Presione el botón de
liberación
avance más.
13.-Lectura. El resultado de la
prueba de glucosa de su
sangre aparecerá después de
que el medidor cuente en
forma regresiva de 5 a 1.
Anotar el resultado en la tabla
correspondiente Tabla 14.1.
8.- Aplique masaje a la
punta de su dedo.
Un suave masaje en la
punta del dedo le
ayudará a obtener una
gota
de
sangre
adecuada. No exprima
en exceso el área de punción.
P´’9.- Inserte la tira reactiva en el
puerto de análisis, con el extremo de
las barras de contacto de primero y
mirando hacia arriba.
Empújela hasta que no avance más
10.-Acerque
y
mantenga la gota de
sangre en el canal
estrecho del borde
superior de la tira
reactiva
14.-Es
importante
desechar
con
mucho
cuidado la lanceta usada
luego de cada uso, con el
fin de evitar que se
produzcan
lesiones
accidentales con las
puntas de la lancetas. Para el desecho de las
lancetas siga los siguientes pasos:
15.- Gire la tapa One Touch Ultra Soft en
dirección contraria a las manecillas del reloj.
16.Apunte
el
dispositivo
de
punción hacia a hacia
usted. Presione el
botón de liberación
para asegurarse que
el
dispositivo
de
punción no esté en posición de cargado.
Deslice el botón cargador hacia delante y
deposite la lanceta en un recipiente para
material punzo cortante
11.- Hasta que la
ventana
de
confirmación
este
completamente llena
de sangre, antes que
el medidor comience
la cuenta regresiva.
17.- Desechar las tiras reactivas en una bolsa
para material biológico-infeccioso junto con las
torundas de algodón empleadas en la práctica.
a)
Muestra
adecuada
b) Muestra
insuficiente
18.-Con los datos obtenidos completar el
cuadro 14.1 y hacer una gráfica de todas las
variantes en papel milimétrico.
3
b
a
152
Tabla 14.1 Resultados
Fecha:_________________
Nombre:
Edad:
Sexo:
Sedentario:
Actividad física constante:
Tipo de dieta
Tiempo
(min.)
[Glucosa mg/dl]
0
30
60
120
153
Práctica 10
Integración Metabólica
Objetivos
1.-Que el alumno pueda integrar las vías
metabólicas de los carbohidratos, de los
lípidos y proteínas en (condiciones
normales) en un paciente sano.
2.-Que el alumno reconozca los sitios
denominados encrucijadas metabólicas y
las enzimas de las vías reguladoras.
3.-Que el alumno pueda correlacionar el
papel que tienen las hormonas en la
regulación de las vías.
4.-Que el alumno sea capaz de analizar
los datos de las pruebas clínicas en un
sujeto normal.
5.-Que el alumno relacione que vías se
encuentran alteradas en un paciente
diabético.
Los alimentos que ingerimos deben estar
constituidos por los 6 componentes
básicos que son proteínas, carbohidratos,
lípidos, vitaminas, minerales y agua, la
cantidad que se requiere ingerir de cada
uno de los componentes varía de acuerdo
a la constitución y la actividad física que se
realiza, tanto la falta como en el exceso de
consumo de alguno de los componentes
básicos conlleva a diversos trastornos
metabólicos.
Aproximadamente del 40 al 45% de
nuestra ingesta calórica proviene del
consumo
diario
de
carbohidratos
complejos los cuales al ser digeridos dan
lugar a los diferentes monosacáridos entre
los que se encuentra la glucosa, la cuál se
distribuye por la sangre a las células para
poder captar la glucosa, siendo la principal
fuente de energía. Algunos tipos celulares
son dependientes de la liberación de
insulina por el páncreas como es el caso
de las células musculares. Si la insulina no
funciona adecuadamente, la glucosa se
queda en el flujo sanguíneo causando
elevación de los niveles de glucosa en la
sangre y a esto se le denomina
hiperglucemia; una de las enfermedades
que se caracteriza por la hiperglucemia en
sus primeras etapas es la diabetes
mellitus.
La diabetes mellitus esta caracterizada por
una hiperglucemia resultante de defectos
en la secreción de insulina, en la acción de
la insulina o en ambas. La hiperglucemia
crónica de la diabetes está asociada a
lesiones, disfunción y fallo de varios
órganos, especialmente de los ojos, los
riñones, el corazón y los vasos
sanguíneos.
Varios procesos patogénicos están
implicados en el desarrollo de la diabetes.
Estos van desde una destrucción
autoinmunológica de las células β del
páncreas, con la consiguiente deficiencia
de insulina, hasta anormalidades, en las
que el páncreas no produce suficiente
insulina o la que produce no es eficiente.
La acción deficiente de la insulina en los
tejidos diana es la responsable del
metabolismo anómalo de los carbohidratos
de carbono, grasas y proteínas en la
diabetes.
La acción deficiente de la insulina
ocasiona una respuesta inadecuada en
uno o más puntos de la compleja trama
metabólica en la que esta hormona tiene
papel regulatorio.
Frecuentemente coexisten en el mismo
paciente una inadecuada secreción de
insulina así como defectos de la acción de
ésta, en la actualidad no se sabe si una de
154
estas anormalidades es la consecuencia o
la causa de la otra. En cualquier caso, el
resultado es la hiperglucemia.
La gran mayoría de los casos de diabetes
pueden incluirse en dos amplias
categorías etiopatogénicas. En el primer
caso (diabetes de tipo I) la causa es una
deficiencia absoluta en la secreción de
insulina. Los individuos con alto riesgo de
desarrollar este tipo de diabetes pueden
ser a menudo identificados mediante
evidencias serológicas de un proceso
autoinmune que se produce en los islotes
pancreáticos
y
también
mediante
marcadores genéticos. En la segunda
categoría (diabetes de tipo II), mucho más
prevalente, la causa es una combinación
de una resistencia a la acción de la
insulina y de una inadecuada respuesta
secretora compensadora. La diabetes tipo
II se caracteriza por estar presente
muchos años antes de ser detectada una
hiperglucemia sin síntomas clínicos (sed,
perdida de peso), pero suficiente para
ocasionar
cambios
patológicos
y
funcionales sobre los órganos blanco.
Durante este período asintomático, es
posible demostrar trastornos en el
metabolismo
de
los
carbohidratos
midiendo la glucosa plasmática en ayunas
o después de una sobrecarga de glucosa
por vía oral.
El exceso en la ingesta de carbohidratos
no solamente mantiene la reserva de
energía en forma de glucógeno sino que
también el exceso de carbohidratos es
convertido en triacilgliceroles. En el hígado
los triacilgliceroles se sintetizan a partir de
acil CoA y glicerol 3-fosfato siendo
empaquetados con apoproteínas y en
lipoproteínas de muy baja densidad
(VLDL), secretados al torrente sanguíneo
siendo almacenados en tejido adiposo.
Para su consumo los triacilgliceroles son
hidrolizados a glicerol y ácidos grasos. En
la dieta es importante la presencia de
lípidos ya que son precursores de
diferentes componentes de la célula como
los fosfolipidos, uno de los lípidos que
tiene una gran importancia en la célula es
el colesterol, ya que proporciona rigidez a
las membranas celulares y es precursor de
las sales biliares así como de hormonas
esteroideas. El colesterol se puede
obtener por la alimentación y por síntesis
del propio organismo, siendo las células
hepáticas y las suprarrenales las de mayor
síntesis. Para llevar a cabo la síntesis de
colesterol se requiere la presencia de
acetil-CoA el cual proviene de la
degradación de glucosa, ácidos grasos y
aminoácidos por lo cual se denomina a la
acetil-CoA la encrucijada metabólica.
El colesterol es insoluble en agua por lo
que transportado en la sangre por tres
lipoproteínas que son de muy baja
densidad (VLDL), de baja densidad (LDL)
y las de alta densidad (HDL). Los niveles
normales de colesterol total en sangre en
un adulto son de < 200 mg/dl y cuando
estos valores se ven aumentados se
asocian a la formación de placas
ateroscleroticas que pueden ocluir los
vasos sanguíneos y como consecuencia
provocar infarto al miocardio y alteraciones
cardiovasculares.
La cuantificación de las LDL representa un
papel clave en la esclerosis coronaria ya
que concentraciones elevadas indican
desarrollo de la aterosclerosis.
En el caso de las HDL al dismunuir su
concentración aumenta el riesgo de
desarrollar aterosclerosis.
Las proteínas constituyen la fuente
primaria del metabolismo del nitrógeno en
el organismo,
Los aminoácidos producto de la digestión
de las proteínas que se consumen en los
alimentos, son utilizados para la síntesis
de
proteínas
y
de
compuestos
nitrogenados o se puede oxidar para
producir energía.
155
El hígado es el órgano principal en donde
se realiza la oxidación de los aminoácidos.
El nitrógeno de los aminoácidos forma
amoniaco el cual es toxico para el
organismo. El amoniaco y los grupos
amino se convierten en urea en el hígado,
que no es toxica y se elimina fácilmente
por la orina ya que es hidrosoluble.
Otro de los componentes del metabolismo
nitrogenado son los nucleotidos. Las
purinas y las pirimidinas, que son
esenciales para la síntesis de nucleótidos
y ácidos nucleicos.
Los nucleótidos son precursores del DNA
y el RNA, así como también forman parte
de la estructura de muchas coenzimas
además de ser componentes del
metabolismo energético.
La degradación de las purinas no genera
energía y el producto de la degradación
del anillo purínico es el ácido úrico, que se
elimina por la orina, tiene una solubilidad
limitada por lo que su exceso da como
resultado la formación de cristales en
regiones del organismo como pueden ser
los dedos gordos del pie, trastorno que se
conoce como gota.
Los valores elevados de ácido úrico se
presentan en: ingestión de alimentos ricos
en nucleoproteínas, insuficiencia renal,
azoemias prerrenales.
Otro de los componentes del metabolismo
nitrogenado es la creatinina que en el
músculo en su forma fosorilada sirve como
almacén de alta energía y se transforma
con facilidad en ATP por la enzima
creatina fosfocinasa. La creatina fosfato es
inestable y se cicla espontáneamente
forma la creatinina que se elimina en la
orina. La producción de creatinina es
proporcional a la masa muscular corporal.
La cantidad de creatinina que se elimina
diariamente
puede
utilizarse
como
indicador de la normalidad de la función
renal
Material.
Dietas:
Dos sujetos sanos sedentarios y dos horas
mínimas de ayuno.
Dos sujetos con actividad física constante
y dos horas mínimas de ayuno.
a).-Dieta rica en carbohidratos (g
spaghetti).
b).-Dieta rica en proteínas.
Determinación de glucosa
Glucómetros One Touch Ultra.
Tiras reactivas One Touch Ultra [Glucosa
oxidasa (Aspergillus níger)].
Dispositivo de punción.
Lancetas estériles con discos protectores
One Touch UltraSoft.
Recipiente para material punzo cortante.
Recipiente
para
material
biológicoinfeccioso.
Jabón para manos.
Torundas de algodón con alcohol.
Glucómetros.
Determinación
de
colesterol
y
triacilgliceroles
Accutrend Roche para determinación de
colesterol y triacilgliceroles.
Tiras reactivas para determinación de
colesterol.
Tiras reactivas para determinación de
triacilgliceroles.
Lancetas estériles.
Determinación
de
hemoglobina
glicosilada.
Micromat
HbA1c
BIO-RAD
para
determinación de hemoglobina glicosilada
en sangre total.
Lancetas estériles.
Las determinaciones de urea, creatinina y
ácido úrico, se realizaran en orina.
La muestra de orina deberá ser del alumno
a quien se le haya determinado glucosa,
colesterol y triacilgliceroles para poder
discutir todos los valores en conjunto y
156
poder enlazar en un mismo individuo el
efecto que tiene la dieta sobre el
metabolismo.
Determinación de urea
Pipetas automáticas (10 a 200µl)
Puntas para micropipetas
Propipetas.
Reactivo para urea.
Estándar de urea (50 mg/dl).
Espectrofotómetro.
Celdas.
Agua destilada.
Pipetas Pasteur de plástico.
Determinación de creatinina
Reactivo para creatinina.
Estándar de creatinina (2 mg/dl).
Determinación de ácido úrico
Pipetas de 5 ml.
Gradilla con 2 tubos de ensaye.
Reactivo para ácido úrico.
Estándar de ácido úrico (6 mg/dl).
Método
Determinación de glucosa
1.-Dos sujetos sedentarios, uno de los
cuales consumirá una dieta rica en
carbohidratos y el otro una dieta rica en
lípidos.
2.-Dos sujetos con actividad física
constante, uno de los cuales consumirá
una dieta rica en carbohidratos y el otro
una dieta rica en lípidos.
3.-A cada uno de los sujetos en cualquiera
de las condiciones y consumo de dietas se
les determinará la concentración de
glucosa en sangre total por medio de un
glucómetro en los siguientes tiempos:
0 minutos (antes de ingerir los alimentos).
30 minutos, 60 minutos y 120 minutos,
después de ingerir los alimentos. Para
realizar la determinación de
glucosa en sangre total
seguir los siguientes pasos:
UltraSoft hacia la izquierda para quitarla.
b) Inserte una lanceta en el
portalancetas
y
empújela
firmemente hasta que quede
bien asentada.
5.- Cargue el dispositivo de
punción. Deslice el botón
cargador hacia atrás hasta
que haga clic. El dispositivo de
punción ya esta preparado para
su uso.
6.- Lave sus manos y limpie
con una torunda de algodón
con alcohol la zona donde se
realizará la punción.
7.- Coloque el dispositivo de
punción en posición. Sostenga
el dispositivo firmemente contra
el costado de su dedo.
Presione el botón de liberación.
8.- Aplique un suave masaje a
la punta de su dedo que le
ayudará a obtener una gota de
sangre adecuada No exprima
en exceso el área de punción.
9.-Acerque y mantenga la gota
de sangre en el canal estrecho
del borde superior de la tira
reactiva
10 a) Muestra adecuada
b) Muestra insuficiente
a
b
4.-Para Insertar la lanceta
a) Gire la tapa One Touch
157
11.- Inserte la tira reactiva en el puerto de
análisis, con el extremo de
las barras de contacto de
primero y mirando hacia
arriba. Empújela hasta
que no avance más.
Deslice el botón cargador hacia delante
y deposite la lanceta en un recipiente
para material punzo cortante.
12.- Hasta que la ventana
de confirmación este
completamente llena de
sangre, antes que el
medidor comience la
cuenta regresiva.
13.-Lectura el resultado de la prueba de
glucosa de su sangre aparecerá después
de que el medidor cuente en forma
regresiva de 5 a 1.
18.-Con los datos obtenidos
completar el cuadro 15.1 y hacer
una gráfica de todas las variantes
en papel milimétrico.
Anotar el resultado
correspondiente
Tabla 15.1
en
la
tabla
14.-Es importante desechar con mucho
cuidado la lanceta usada luego de cada
uso, con el fin de evitar que se produzcan
lesiones accidentales con las puntas de la
lancetas.
Para el desecho de las lancetas siga los
siguientes pasos:
15.- Gire la tapa One
Touch Ultra Sofá en
dirección contraria a las
manecillas del reloj.
16.- Apunte el dispositivo de
punción hacia el recipiente
para el material punzo
cortante Presione el botón
de
liberación
para
asegurarse
que
el
dispositivo de punción no esté en posición
de cargado.
17.- Desechar las tiras reactivas en una
bolsa para material biológico-infeccioso
junto con las torundas de algodón
empleadas en la práctica.
Cuadro 15.1 Resultados
Fecha:_________________
Nombre:
Edad:
Sexo:
Sedentario:
Actividad física constante:
Tipo de dieta
Tiempo
(min.)
0
30
60
120
[Glucosa mg/dl]
Determinación
de
colesterol
y
triacilgliceroles
Accutrend®GCT.
1.-Lavarse las manos cuidadosamente
esto es con la finalidad de retirar residuos
de crema o grasa en las manos para
evitar
determinaciones
erróneas
principalmente cuando se realiza la
determinación de triacilgliceroles.
2.- Con la ayuda de unas pinzas extraer
una tira reactiva del envase y taparlo
inmediatamente para evitar que las tiras
se sequen.
3.-Con la tapa cerrada D inserte en la
ranura F, en la dirección indicada por la
158
flecha, la tira reactiva con el cuadrado
amarillo hacia arriba hasta que encaje y
deje verse la marca TG o CHOL impresa
en la tira reactiva.
4.-Frote y masajee la yema del dedo para
facilitar la extracción y aplicación de la
sangre.
5.-Con la lanceta introduzca para hacer la
punción y realice la toma de muestra.
6.-Aplicar directamente la gota de sangre a
la tira reactiva y proceder a la lectura de la
concentración
de
colesterol
y
triacilgliceroles según sea el caso, si no se
llena completamente el equipo le marca R5.
7.-Realice la lectura.
8.-Anote la lectura.
9.-Si esto llegara a suceder volver a tomar
otra tira reactiva para proceder a iniciar
completamente desde el paso uno.
Determinación
de
hemoglobina
glicosilada
Guía rápida Micromat II. (Detección de
hemoglobina glicosilada).
1.-Insertar el cartucho de análisis.
2.-Girar el cartucho a la posición 1.
3.-Extracción de muestra capilar o venosa.
4.-Comenzar la incubación, presionar
enter
5.-Invertir 3 veces.
6.-Dispensar la muestra en el embudo
central.
7.-Girar el cartucho a la posición 2, sacar
Celda
1
2
Muestra
25 µl
-Estándar
-25 µl
Solución reactiva
1 ml
1 ml
para urea
el tubo de la solución de lavado (tapón
azul).
8.-Verter la solución de lavado al embudo
central.
9.-Girar el cartucho a la posición 3, sacar
el tubo de la solución eluyente (tapón
transparente).
10.-Verter el eluyente al embudo central.
11.-Girar el cartucho a la posición de
partida.
12.-Extraer el cartucho de análisis, el
resultado se observará en la pantalla.
13.-Presionar enter para un nuevo análisis.
Determinación de urea en orina
La urea presente en la muestra reacciona
con el o-ftaldehído en medio ácido
originando un complejo coloreado puede
identificar
Celda
1
2
se
Orina
100
espectrof
µl
otométric
Estándar
100
amente.
µl
Solución
reactiva
de creatinina
1 ml
1 ml
Urea + oftaldehído
Isoindolina
La urea es estable 5 días a 2-8 °C.
1.-Diluir la muestra 1:50 con agua
destilada mezclar y multiplicar el resultado
por el factor de dilución (50).
2.-Para realizar la dilución 1:50 recupere la
orina con la pipeta
Pasteur de plástico hasta la marca (lo que
corresponde a 0.5 ml) y colóquelo en un
tubo Falcón que ya contiene 24.5 ml de
agua, con ello se tendrá una dilución 1:50,
de ahí tomar la muestra como se
esquematiza en el cuadro.
La determinación se realiza directamente
en las celdas con la finalidad de tomar la
lectura de las absorbancias exactamente
al minuto (A1) y a los dos minutos (A2).
Mezclar y poner en marcha el cronómetro,
anotar las absorbancias a los 60 (A1) y 120
(A2) segundos.
159
Leer frente blanco de reactivos en el
espectrofotómetro a 520 nm.
Calcular el incremento de la absorbencia
∆A = A2 – A1.
Con las diferencias de absorbancias
anotadas ∆A, aplicar la siguiente ecuación:
∆A Muestra X [Estándar] = [Urea]
∆A Estándar
El resultado se obtiene en mg/dl.
Determinación de creatinina en orina
1.-Diluir la muestra 1:50 con agua
destilada mezclar y multiplicar el resultado
por el factor de dilución (50).
2.-Para realizar la dilución 1:50 recupere la
orina con la pipeta Pasteur de plástico
hasta la marca (lo que corresponde a 0.5
ml) y colóquelo en un tubo Falcón que ya
contiene 24.5 ml de agua, con ello se
tendrá una dilución 1:50, de ahí tomar la
muestra como se esquematiza en el
cuadro.
La determinación se realiza directamente
en las celdas con la finalidad de tomar la
lectura de las absorbancias exactamente a
los 30 (A1) y a los 90 (A2) segundos.
Mezclar y poner en marcha el cronómetro,
anotar las absorbancias a los 30 (A1) y a
los 90 (A2) segundos.
Leer frente blanco de reactivos en el
espectrofotómetro a 492 nm.
Calcular el incremento de la absorbencia
∆A = A2 – A1.
Con las diferencias de absorbancias
anotadas ∆A, aplicar la siguiente ecuación:
∆A Muestra X [Estándar] = [Creatinina]
∆A Estándar
El resultado se obtiene en mg/dl.
Determinación de ácido úrico en orina.
1.-Diluir la muestra 1:10 con agua
destilada, mezclar y multiplicar el resultado
por el factor de dilución (10).
2.-Para realizar la dilución 1:10 recupere
la orina con la pipeta Pasteur de plástico
hasta la marca (lo que corresponde a 0.5
ml) y colóquelo en un tubo Falcón que ya
contiene 9.5 ml de agua, con ello agregue
agua hasta la marca de 5 ml con ello
tendrá una dilución 1:10 de ahí tomar la
muestra como se esquematiza en el
cuadro.
La determinación se realiza en tubos de
ensaye.
Mezclar e incubar 10 minutos a
temperatura ambiente.
Leer
la
absorbancia
(A)
en
el
espectrofotómetro frente a blanco de
reactivos a 520 mn.
Cálculo de la concentración de ácido úrico.
A Muestra X [Estándar] = [Ácido úrico]
A Estándar
El resultado se obtiene en mg/dl.
Referencias
1.-Koolman J, Roehm KH (2004).
Bioquímica Texto y Atlas: 3ª Edición, Ed.
Médica Panamericana, pp.: 158, 308-310
2.-Smith, C; Marks, A. D. & Lieberman, M.
(2005). Marks’ Basic Madical
Biochemestry. 2a Edición. Ed. Lippincott
Williams & Wilkins. Pag. 24-26
3.-Kaplan LA, Pesce AJ. (2002). Química
Clínica. Teoría, análisis y correlación. 3ª
Edición. Ed. Pesce Kaplan Publicaciones,
Capítulo: 32.
4.- NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM015-SSA2-1994, “Para la prevención,
tratamiento y control de la diabetes
mellitus en la atención primaria”. Listado
de Normas Oficiales Mexicanas de la
Tubo
1
2
Orina
100 µl
Estándar
100 µl
Solución reactiva
1 ml
1 ml
de ácido úrico
160
Secretaría de Salud.
5.-MODIFICACIÓN a la Norma Oficial
Mexicana NOM-015-SSA2-1994, Para la
prevención, tratamiento y control de la
diabetes. Listado de Normas Oficiales
Mexicanas de la Secretaría de Salud.
7.- NORMA OFICIAL MEXICANA NOM030-SSA2-1999, Para la prevención,
tratamiento
y
control
de
la
hipertensión arterial. Listado de Normas
Oficiales Mexicanas de la Secretaría de
Salud.
6.- Manual para el manejo de las insulinas
2001. 2ª Edición. Subsecretaría de
Prevención y Protección de la Salud.
Centro
Nacional
de
Vigilancia
Epidemiológica. SSA. México.
161
Práctica 11
Huella génica
Objetivos
1. Que el estudiante conozca la aplicación de
las técnicas de DNA recombinante.
2. Que el estudiante sea capaz de analizar e
interpretar los datos generados a partir de una
prueba de huella génica.
3. El alumno adquirirá la capacidad de
manejar muestras para análisis de ácidos
nucleicos.
4. El alumno desarrollará destreza en la
interpretación de resultados de metodologías
básicas de análisis molecular.
FUNDAMENTO
El DNA es un polímero lineal formado
por desoxirribonucleótidos que contienen a las
bases
nitrogenadas
adenina,
guanina,
citosina, timidina. La interacción de las bases
nitrogenadas por puentes de hidrógeno
permite la formación de la doble cadena de
DNA. Cada grupo fosfato está unido al
carbono 5´ de una subunidad de azúcar y al
carbono 3´ de la subunidad de azúcar del
nucleótido contiguo.
Las cadenas se mantienen unidas por
puentes de hidrógeno entre las bases. Las
cuales son completamente lineales.
En la molécula de DNA que reside la
información genética de un organismo,
específicamente en la secuencia de los
nucleótidos, de tal manera que cada tres
bases forman un codón que corresponde a su
vez a uno de los 20 aminoácidos, teniendo un
total de 64 codones posibles, los cuales
conforman el código genético. En el DNA se
encuentran dos tipos de secuencia, la que es
capaz de ser leída para dar origen a una
proteína lo que permite que una célula u
organismo crezca desarrolle también la no
codificante una que codifica para las
funciones celulares y otra no codificante, que
participa en la regulación de su expresión.
Algunas de las secuencias de nucleótidos no
codificantes se caracterizan por ser cortas,
están alineadas en tándem y se repiten miles
de veces de manera constante a lo largo del
DNA. Un ejemplo de esta secuencia puede
ser
la
siguiente.
ATTCGGTATTCGGTATTCGGT.
A estas
secuencias se les denomina STR por sus
siglas en inglés (Short Tandem Repeat). El
genoma eucariótico contiene muchas de estas
secuencias de DNA, y se ha visto que el
número de unidades repetidas presenta
diferencias de individuo a individuo que con
las huellas digitales. En el caso de gemelos
idénticos estas secuencias son idénticas.
Estas regiones pueden ser aisladas del DNA
con enzimas de restricción apropiadas y
separadas de acuerdo a su longitud mediante
electroforesis en gel. Cuando se completa el
proceso de separación el resultado se parece
a un código de barras de un envase de
supermercado. Este código de barras de DNA
ha permitido esclarecer algunos hechos
criminales y pruebas de paternidad, a la cual
se denomina técnica de “Huella génica”
Es muy frecuente que en la escena de
un crimen se encuentren, en pequeñas
cantidades muestras de naturaleza biológica a
partir de las cuales se puede extraer el DNA
como son la sangre, la saliva, la piel, el
músculo, el cabello, el semen, los dientes y el
hueso, entre otros.
Un método que permite tomar una
pequeña cantidad de DNA y en pocas horas
sintetizar millones de copias de una porción,
es el método de amplificación conocido como
PCR (reacción en cadena de la polimerasa),
el cual se desarrollo por K. Mullis (1990), En
este método se requiere conocer la secuencia
de nucleótidos de los extremos del fragmento
que se desea amplificar. Estas secuencias se
usan para diseñar desoxioligonucleótidos
sintéticos de DNA complementarios a cada
uno de estos extremos de la cadena de la
doble hélice. La muestra de DNA se coloca en
una solución que contiene una DNA
polimerasa,
grandes
cantidades
de
desoxinucleótidos y los desoxioligonucleótidos
sintetizados previamente. El método se basa
en la repetición cíclica de tres reacciones
162
sucesivas: en la primera reacción, la solución
se calienta para que el molde de DNA se
separe en sus dos cadenas. En la segunda
reacción, la temperatura se reduce para
permitir que los desoxioligonucleótidos se
apareen por complementariedad de bases
con el DNA molde y en la tercera reacción, la
DNA
polimerasa
cataliza
la
síntesis
simultánea de las dos cadenas a partir de
cada desoxioligonucleótido que actúa como
cebador. Al cabo del primer ciclo de tres
reacciones, el fragmento de DNA elegido se
ha duplicado y por lo tanto, la cantidad de
DNA molde disponible para el segundo ciclo
es doble, lo mismo ocurre cada ciclo de
duplicación.
La obtención de múltiples copias requiere 20
a 40 veces la repetición de los ciclos. El éxito
de esta técnica radica en el uso de una DNA
polimerasa termoestable, que no se
desnaturaliza por los repetidos ciclos de
calentamiento. Esta enzima se aisló
originalmente de la bacteria termófila Thermus
aquaticus.
La base de la técnica conocida como
huella génica se basa en las diferencias
individuales de estas secuencias. Esto,
generalmente se trata de cambios en un solo
par de bases pertenecientes a diferentes
individuos, que se presentan una vez cada
500 a 1,000 pares de bases, como promedio.
forense. Acta Científica Venezolana. 50: 2428, 1999.
Andréa Carla de Souza Góes, Dayse
Aparecida da Silva, Cristiane Santana
Domingues, Joáo Marreiro Sobrinho, Elizeu
Fagundes de Carvalho. Identification of a
criminal by DNA typing in a rape case in Rio
de Janeiro, Brazil. Sáo Paulo Medical Journal.
Revista Paulista de Medicina. 120 (3): 77-80,
2002.
Centre for
Genetics Education. Genetic
Testing and Screening II –Forensic and Other
Applications. Directory of Genetics Support
Groups, Services and Information. Genetics.
235-239, 2004-2005.
Jeffreys Alec Genetic Fingerprinting Naure
Medicine Vol 11(10).1035-1039. 2005.
Mullis K.B the Unusual Origen of the
Polymerase Chain Reaction Science Am. 262
(4) 56-65. 1990.
Referencias
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Editorial Médica Panamericana.
Lewin, B; Genes VI. Editorial Oxford.
Nelson, D; Cox, M; Lehninger. Principios de
Bioquímica. Tercera edición.
Ediciones
Omega.
Yuri Sivolap, Ph.D., G. Krivda, Ph.D., N.
Kozhuhova., S. Chebotar., and Mark Benecke,
PH.D. A Homicide in the Ukraine. DNA-based
identification of a Boiled, Skeletozined, and
Varnished Human Skull, and of Bone
Fragments Found in a Fireplace. The
American journal of Forensic Medicine and
Pathology. 22 (4): 412-414 ,2001.
Lennie Pineda Bernal. El análisis de DNA
para pruebas de paternidad e identificación
163
SESIÓN 1 DE LABORATORIO PARA LA
PRÁCTICA DE HUELLA GÉNICA
ESCENA DEL CRIMEN
El crimen se lleva a cabo en la calle Lago
Manitoba No. 520, Col. Ampliación Granada,
Delegación Miguel Hidalgo, en el sofá de la
sala se encuentra el cuerpo de la dueña de la
casa, una mujer de 42 años de edad. El
cadáver presenta signos de estrangulamiento
pero sin marcas de sogas o cinturones;
tampoco se encuentran huellas digitales en su
cuello. La víctima presenta una lesión
defensiva en el brazo derecho con arma
punzo cortante. En el sofá se observan varias
manchas de sangre, algunas de ellas secas.
Las más abundantes todavía están frescas.
Se ignora si la sangre pertenece a la víctima o
a sus agresores.
El laboratorio forense se encarga de recopilar
la información de la escena dando a conocer
los siguientes aspectos: el cuerpo de la
víctima se descubrió 20 minutos después del
asesinato. Presentaba con un golpe en la
cabeza, presenta señales de forcejeo en su
brazo y debajo de las uñas se encuentran
depositados restos de piel, sangre, y de
cabellos. Algunos de ellos presentan folículos.
Todo señala que la víctima forcejeó con su o
sus agresores.
En el lugar también se halló un florero con
restos de sangre, la cual no se sabe si
corresponde a la de la víctima o a los
agresores. En un extremo del sofá se
encuentra una pieza dental y, debido a que la
víctima conserva su dentadura completa, es
probable que el diente sea del victimario. En
el brazo izquierdo, la victima presenta varias
mordidas, algunas con sangre coagulada y
otras con restos de saliva mezclados con
sangre.
En el interior de la casa faltan algunas piezas
de valor, lo que sugiere que el móvil fué el
robo.
La policía cuenta con varios sospechosos,
entre los que se encuentra el esposo, con el
cual la víctima tuvo una discusión la noche
anterior. Se desconoce el tema de la
discusión y el paradero el esposo. Otros
sospechosos son los dos repartidores del gas
que una hora antes habían proporcionado el
servicio. Uno de ellos tiene problemas con la
dentadura y aclara que se encuentra en
tratamiento dental, ya que ha presentado
sangrado y pérdida de algunas piezas
dentales. Los otros sospechosos son los dos
empleados de la casa, el jardinero que tiene
una antigüedad de 4 años y presenta una
lesión en el brazo que confiesa se hizo
arreglando el jardín y la cocinera quien tiene
sólo 3 meses laborando en la casa.
Con esta evidencia se compara el DNA de
cada sospechoso para encontrar al culpable
o culpables del crimen, por lo que debe
determinar si las muestras de sangre,
cabellos, pieza dental y saliva sirven para
estudiar
el
DNA y establecer las
características que permiten utilizar alguna o
todas las muestras para el estudio.
Cada equipo debe escoger alguna de las
evidencias previamente descritas y justificar
su elección.
Para realizar la comparación entre el DNA
encontrado en la escena con el DNA de los
sospechosos deben contarse con muestras
proporcionadas por los mismos. Mencione de
dónde obtendría dicho material. En el caso del
esposo debe tenerse en cuenta que no se
conoce su paradero, por lo cual la muestra
debe ser extraída de algún objeto de uso
personal; defina cuál sería éste y justifique la
elección del mismo.
164
SESION 2 DE LABORATORIO PARA LA
PRÁCTICA FINGERPRINTING
MATERIAL
- DNA de la escena del crimen con
amortiguador.
- DNA del sospechoso 1 con amortiguador.
- DNA del sospechoso 2 con amortiguador.
- DNA del sospechoso 3 con amortiguador.
- DNA del sospechoso 4 con Amortiguador.
- DNA del sospechoso 5 con amortiguador.
- Mezcla de enzimas de restricción EcoRI/Pstl,
1800 U.
- Agua estéril, 2.5 ml.
- Marcador de DNA de fago lambda digerido
con Hind III 0.2µg /µl, 100 µl.
1.- 23,130 pb
2.9,416 pb
3.6,557 pb
4.4,361 pb
5.2,322 pb
6.2,027 pb
- Colorante de DNA (Biorad biosafe).
- Microtubos de colores.
- Microtubos blancos.
- Geles de agarosa al 1.0%.
- Amortiguador de electroforesis TAE (TrisAcetato-EDTA). Tris-base 39 mM, ácido
acético glacial 18 mM, EDTA 10 mM.
- Gradillas para microtubos.
- Recipiente para teñir geles.
- Pipeta automática de 10-100 µl.
- Puntas para pipetas automáticas.
- Marcador indeleble.
- Fuente de poder.
- Cámara horizontal de electroforesis.
- Parrilla para baño maría.
- Vaso de precipitado de 300 ml.
- Recipiente con hielo.
- Microfuga.
3.-A cada tubo adicionar 10 µl de la muestra
correspondiente; utilizar una punta nueva para
cada muestra.
4.-Adicionar 10 µl de la mezcla de enzimas de
restricción a cada uno de los tubos que
contienen la muestra de DNA. Se debe tener
cuidado de no contaminar la mezcla de
enzimas, por lo cual se sugiere el empleo de
una punta nueva por cada tubo.
Muestra de
la escena
Sospechoso
1 azul
Sospechoso
2 naranja
Sospechoso
3 violeta
Sospechoso
4 rojo
Sospechoso
5 amarillo
Muestras
de DNA
Enzimas de
restricción
EcoRI y
PstI
Volumen total
de la
reacción
10 µl
10 µl
20 µl
10 µl
10 µl
20 µl
10 µl
10 µl
20 µl
10 µl
10 µl
20 µl
10 µl
10 µl
20 µl
10 µl
10 µl
20 µl
5.-Cierre los microtubos y mezcle la muestra
golpeando suavemente los tubos con los
dedos. Si se cuenta con una microfuga
aplique un pulso de 2 segundos para
asegurarse que toda la muestra se quede en
el fondo del microtubo, permitiendo que se
mezcle adecuadamente y se lleve a cabo la
reacción.
6.-Coloque los tubos en la gradilla e incúbelos
a 37ºC por 45 minutos.
PROCEDIMIENTO
1.-Marcar los microtubos de la siguiente
forma:
a) Tubo verde (muestra de la escena)
b) Tubo azul (sospechoso 1)
c) Tubo naranja (sospechoso 2)
d) Tubo violeta (sospechoso 3)
e) Tubo rojo (sospechoso 4)
f) Tubo amarillo (sospechoso 5)
7.-Transcurrido el tiempo de incubación,
adicione 10 µl del amortiguador de carga a
cada tubo tápelos y agítelos suavemente con
los dedos.
2.-Colocar los tubos marcados en la gradilla.
9.-Adicione 275 ml del amortiguador de
corrida o lo que se requiera para que se
cubran los pozos.
8.-Coloque en la cámara de electroforesis el
gel de agarosa, teniendo cuidado que los
pozos se encuentren orientados hacia el
cátodo [polo negativo (terminal negra)].
165
10.-Coloque las muestras en el gel
empleando una punta nueva para cada
muestra, las cuales se depositan de izquierda
a derecha amortiguador en el siguiente orden:
a) Carril 1: marcador de peso
molecular, HindIII,10 µl
b) Carril 2: escena del crimen verde,
10 µl
c) Carril 3: sospechoso 1 azul, 10 µl
d) Carril 4: sospechoso 2 naranja, 10
µl
e) Carril 5: sospechoso 3 violeta, 20
µl
f) Carril 6: sospechoso 4 rojo, 10 µl
g) Carril 7: sospechoso 5 amarillo,
10 µl
11-Cierre la cámara de electroforesis y
asegúrese que concuerden las terminales rojo
con rojo y negro con negro. Conecte la
cámara a la fuente de poder, manteniendo la
orientación de las terminales.
12.-Encienda la fuente de poder. Ajuste el
voltaje a 100 V y realice la electroforesis por
40– 60 minutos.
13.-Detenga la electroforesis cuando la
muestra llegue a una distancia aproximada de
2 cm del final del gel. Apague la fuente de
poder, remueva la tapa y
retire
cuidadosamente el gel.
Cortar en pequeñas
piezas con enzimas
de restricción
DNA total
de
una
persona
-ve
Más
grandes
Fragmentos
de DNA en el
gel
+ve
Fragmentos separados y
transferidos a membrana
de nylon
Más
pequeñas
14.-Coloque en una charola 120 ml de la
solución teñidora 100X y el gel, asegurándose
que se encuentre sumergido en la solución.
Tiña los geles por 2 minutos.
15.- Después se deben colocar los geles en
una charola que contenga 500 – 700 ml de
agua limpia y caliente (40-55ºC), agite
suavemente el gel por aproximadamente 10
segundos y retire el agua, realizar los lavados
que sean necesarios con agua limpia hasta la
aparición de las bandas de DNA y hacer la
comparación de las muestras.
Referencias
1.-Biotechnology Explorer DNA Fingerprinting
Kit
Instruction Manual BIORAD
166
III
Casos de correlación bioquímica
y práctica médica
167
Caso 1
Cólera
Un hombre de 38 años de edad con peso
de 71 kg relata que su padecimiento actual
se inició con anorexia, dolor abdominal y
diarrea. Un día después siguió con náusea
intensa, vómito y diarrea muy abundante y
líquida. Ingresó al hospital con hipotensión
postural y deshidratación. Se pudo aislar
Vibrio cholerae toxígeno de sus heces. El
paciente mejoró rápidamente al reponerle
agua, electrólitos y administrarle tetraciclina
por vía oral.
Preguntas de bioquímica
1. ¿Qué procesos de la membrana
resultan afectados por Vibrio cholerae
en un caso de cólera?
2. ¿Qué valores de laboratorio clínico
podrían estar alterados en este
paciente?
3. ¿Cuáles serían los datos de laboratorio
que permitirían precisar el tratamiento
hidroelectrolítico?
4. ¿Por qué en este caso hay que añadir
glucosa al tratamiento hidroelectrolítico
por vía oral?
5. ¿Cuáles
son
los
signos
de
deshidratación?
6. ¿Cuál fue la situación ácido-base del
paciente al momento de su ingreso al
hospital?
Conceptos y áreas de aprendizaje
1. Describir
la
composición,
las
propiedades y las funciones de las
membranas biológicas.
2. Estudiar la base bioquímica de algunos
trastornos que afectan la función de las
membranas.
3. Modelos de transporte transepitelial.
4. Describir los mecanismos por los cuales
los
organismos
enteropatógenos
ocasionan pérdida intestinal de agua y
electrolitos.
5. Control del agua y de la osmolaridad.
6. Equilibrio ácido-base.
7. Deshidratación
y
tratamiento
de
reposición hidroelectrolítica.
REFERENCIAS
1. Villazón SA, Cárdenas CO, Villazón DO,
Sierra UA. Fluidos y electrólitos. México:
JGH Editores; 2000.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto
con aplicaciones clínicas. 4a. ed.
Barcelona: Editorial Reverté; 2004.
3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y
texto. 6a. ed. Barcelona: Editorial
Harcourt-Brace; 1998: cap. 4 y 12.
168
Caso 2
Oclusión intestinal. Acidosis metabólica.
Deshidratación grave.
Se trata de un paciente masculino de 35
años de edad quien acude al servicio de
urgencias de un hospital por presentar
dolor abdominal intenso acompañado de
vómitos frecuentes y abundantes de
contenido intestinal. El paciente presenta
un cuadro de deshidratación importante.
A la exploración física se obtuvieron los
siguientes datos:
Tensión arterial (TA): 80/50 mmHg
Frecuencia cardiaca (Fc): 120/min
Frecuencia respiratoria (Fr): 32/min
Temperatura (T): 36o C
Los estudios de laboratorio mostraron lo
siguiente:
Electrolitos séricos:
+
Na = 128 mEq/l
+
K = 2.8 mEq/l
–
Cl = 100 mEq/l
Gasometría arterial:
t
CO2 = 12
pH = 7.29
pCO2 = 24 mmHg
pO2 = 95 mmHg
HCO - = 11.2 mmol/l
3
EB (exceso de base) = 20
Química sanguínea:
Glucosa = 5.2 mmol/l (95 mg/dl)
BUN = 15 mmol/l
El tratamiento consistió, primero, en el
restablecimiento del balance de líquidos
con solución salina a 0.9%, electrólitos
+
(reposición de K ) y cirugía.
Preguntas de bioquímica
1. Evaluar el estado ácido-base del
paciente; tomar en cuenta los valores
de pH y presión parcial de bióxido de
carbono (pCO2), el valor de bicarbonato
–
plasmático (HCO3 ), etcétera.
2. ¿Es normal el estado ácido-base del
paciente? ¿Qué tipo de desequilibrio
presenta? ¿Cuál podría ser la causa de
ese desequilibrio?
3. ¿Qué
relación
existe
entre
el
metabolismo de los electrolitos y el
agua y entre los trastornos ácido-base y
los electrolitos?
4. ¿Qué tipos de alteraciones de líquidos y
electrolitos corporales existen?
5. Calcule la osmolaridad sérica (tome en
cuenta la concentración de las
sustancias que mayormente contribuyen
a establecerla) como aparecen en las
pags. 98 y 113.
6. ¿Cuáles
son
los
signos
de
deshidratación?
7. ¿Qué terapéutica recomendaría a este
paciente para equilibrar sus líquidos y
electrolitos?
Conceptos y áreas de aprendizaje
1. Propiedades fisicoquímicas del agua.
2. Concepto de pH.
3. Explicar el significado de las variaciones
de los valores normales de pH y de la
composición electrolítica de la sangre.
169
4. Sistemas amortiguadores del plasma,
líquido intersticial y células. La
aplicación de la ecuación de Henderson
y Hasselbalch al cálculo del pH y de la
concentración de bióxido de carbono y
bicarbonato.
5. Equilibrio
ácido-base
y
su
mantenimiento.
6. Equilibrio
hidroelectrolítico
y
su
mantenimiento.
REFERENCIAS
1. Harrison. Principios de medicina interna.
15a.
ed.
Madrid:
McGraw-Hill
Interamericana
Editores; 2001; cap:
Líquidos y electrólitos y Obstrucción
intestinal aguda. p. 184.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto
con aplicaciones clínicas. 4a. ed.
Barcelona: Editorial Reverté; 2004.
3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y
texto. 6a. ed. Barcelona: Editorial
Harcourt-Brace, 1998; cap. 4.
4. Laguna J, Piña E. Bioquímica de
Laguna. 5a.ed. México: Editorial El
Manual Moderno; 2002: 41-76.
5. Villazón SA, Cárdenas CO,Villazón DO,
Sierra UA. Fluidos y electrólitos. México:
JGH Editores; 2000.
170
Caso 3
Hipoglucemia secundaria
a intoxicación alcohólica
Se trata de un paciente de 58 años,
alcohólico crónico, cuyos familiares relatan
que ha ingerido una gran cantidad de
alcohol en los dos últimos días con un
consumo muy escaso de alimentos. Inició
su padecimiento con náusea, vómito,
mareo, sudación, cefalea, visión borrosa y
confusión; presentó, en una sola ocasión,
una convulsión, por lo que es llevado al
servicio de urgencias. A la exploración se
encuentra semiconsciente con aliento
alcohólico e hipotermia.
Se procede a un lavado gástrico para
remover el alcohol aún no absorbido; se
mantienen
permeables
las
vías
respiratorias; se instala oxígenoterapia y se
le administra solución glucosada por vía
endovenosa.
Los resultados de laboratorio muestran:
Alcohol
300 mg/dl
Glucosa
2.0 mmol/l
Lactato
9.0 mmol/l
pH
7.2
Preguntas de bioquímica
1. ¿Cuáles son los síntomas de la
hipoglucemia?
2. ¿De qué forma el etanol produce acidosis
láctica e hipoglucemia? ¿Cómo se
encuentra la relación intracelular de
+
NADH/NAD ? ¿Qué procesos metabólicos
se favorecen con los niveles altos de
NADH?
3. El alcoholismo es la base de muchas
deficiencias
vitamínicas.
¿Qué
implicaciones metabólicas tienen estas
deficiencias (complejo B)?
Conceptos y áreas de aprendizaje
1. Hipoglucemia. Regulación de la glucemia.
2. Acidosis láctica.
3. Metabolismo de carbohidratos.
4. Trastornos del metabolismo de vitaminas.
5. Metabolismo del etanol.
REFERENCIAS
1. Murray KR, Granner DK, Mayes PA,
Rodwell VW. Bioquímica de Harper. 16a.
ed. México: Editorial El Manual Moderno;
2004. p. 980-981
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2004.
3. Harrison. Principios de medicina interna.
15a.
ed.
Madrid:
McGraw-Hill
Interamericana Editores; 2001. Capítulos:
Acidosis láctica, hipoglucemia, alcohol y
alcoholismo, deficiencia y exceso de
vitaminas.
4. Academia Nacional de Medicina. Tratado
de medicina interna. 2a. ed. México:
Editorial El Manual Moderno; 1994.
Capítulos: Acidosis láctica e intoxicación
aguda por alcohol etílico.
171
Caso 4
Cetosis por inanición.
Obesidad
Una mujer de 27 años llega al servicio de
urgencias médicas después de haber sufrido
un desmayo. Al interrogarla, relata que lleva
15 días a dieta de agua, té y verduras
cocidas para bajar de peso, sin ningún
control médico. Se detectó aliento con olor a
manzana, cetonuria, cetonemia, ácidos
grasos libres elevados, triacilgliceroles
elevados, hipoglucemia y presión arterial
baja; su peso al iniciar la dieta era de 78 kg y
su estatura de 1.59 m. Se diagnostica
cetoacidosis por inanición y obesidad
exógena.
El estudio de su dieta mostró que gran
parte de su ingesta calórica era en forma de
carbohidratos (galletas, chocolates, pasteles,
refrescos, dulces, etcétera).
El tratamiento consistió en administrar
parenteralmente solución glucosada y
continuar con una dieta normocalórica.
Preguntas de bioquímica
1. En esta mujer de 27 años: ¿corresponde
el peso a su talla? Determinar su índice
de masa corporal, grado de obesidad y el
porcentaje de sobrepeso.
2. ¿Cómo es posible que se formen grandes
almacenes de energía en forma de
grasas,
si
la
dieta
contiene
predominantemente carbohidratos?
3. ¿Cuáles
son
las
interrelaciones
metabólicas de los principales tejidos
(hígado, tejido adiposo,
cerebro, músculo, etcétera) en la
obesidad?
4. ¿Cuáles
son
las
interrelaciones
metabólicas de los principales tejidos en
el estado de ayuno temprano y en la
inanición?
5. ¿Cuál es el papel de los cuerpos
cetónicos en el metabolismo?
6. ¿Qué régimen dietético recomendaría a
esta persona para bajar de peso?
Conceptos y áreas de aprendizaje
1. Describir las principales rutas de
biosíntesis,
catabolismo
y
almacenamiento de lípidos.
2. Conocer la estructura y función de los
triacilgliceroles, ácidos grasos y cuerpos
cetónicos.
3. Establecer las bases bioquímicas de la
cetosis y obesidad producidas por
anomalías en el metabolismo de los
lípidos.
4. Describir las alteraciones del equilibrio
ácido-base que se producen en la cetosis.
5. Conocer las interrelaciones metabólicas
de los principales tejidos corporales en los
estados de buena nutrición, de ayuno
temprano, de inanición, de renutrición, de
homeostasis calórica, etcétera.
REFERENCIAS
1. Harrison. Principios de medicina interna.
15a.
ed.
Madrid:
McGraw-Hill
Interamericana Editores; 2001.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2004.
3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y texto.
6a. ed. Harcourt-Brace; 1998.
4. Casanova E. Nutriología médica. Editorial
Médica Panamericana; 1995.
172
Caso 5
Hipercolesterolemia y aterosclerosis
Un hombre de 56 años acudió al médico
por presentar dolor precordial en reposo que
se incrementaba con el esfuerzo. Se le
detectó hipercolesterolemia que, al análisis
de los lípidos plasmáticos, mostró que la
mayoría del colesterol plasmático elevado se
encontraba en la fracción de lipoproteína de
baja densidad (LDL). Se le realizó una
arteriografía coronaria la cual mostró un
estrechamiento de las arterias. La evaluación
de la dieta indicó que consumía gran
cantidad de alimentos ricos en colesterol,
aunque en los últimos meses había seguido
una dieta baja en grasas.
Fue diagnosticado de aterosclerosis en las
arterias coronarias.
El tratamiento consistió en una dieta sin
colesterol y en administrar preparados de
lovastatina, un inhibidor de la HMGCoA
reductasa.
Fue tratado también con colestiramina,
una resina que capta las sales biliares. La
resina no se absorbe y permanece en la luz
intestinal donde se une a las sales y aumenta
la cantidad de las mismas que se excreta con
las heces.
Preguntas de bioquímica
1. ¿Cuáles son algunos alimentos ricos en
colesterol?
2. ¿Cuál es el destino del colesterol de la dieta?
3. ¿Cuál es la función de la bilis en la digestión?
4. ¿Qué conexión metabólica existe entre el
colesterol y las sales biliares?
5. ¿Cómo disminuye la resina de colestiramina
la concentración plasmática de colesterol?
6. ¿Por qué se le ha llamado al colesterol-LDL:
“colesterol malo” y al colesterol-HDL:
“colesterol bueno”?
7. ¿Cómo puede la hipercolesterolemia producir
aterosclerosis,
infarto
del
miocardio,
xantomatosis, etcétera?
8. ¿Por qué el hecho de disminuir la
concentración plasmática de colesterol puede
ser útil para la salud de este paciente?
9. ¿Qué papel desempeña la HMG-CoA
reductasa en la biosíntesis del colesterol?
10. ¿Cuál es la razón del uso de la lovastatina
para el tratamiento del paciente?
Conceptos y áreas de aprendizaje
1. Estructura del colesterol y otros esteroles
importantes.
2. Biosíntesis, metabolismo y excreción del
colesterol y de los ácidos biliares.
3. Describir la función de la bilis y su relación
con el colesterol.
4. Considerar el papel del colesterol en el
desarrollo de la aterosclerosis y de la relación
entre hipercolesterolemia e ingesta dietética
de lípidos en esta enfermedad.
5. Comentar los principios del transporte de
lípidos en el sistema circulatorio.
6. Describir
la
composición,
estructura,
metabolismo y función de los principales
tipos de lipoproteínas plasmáticas.
7. Describir los defectos del metabolismo
lipídico que tienen relevancia clínica en
relación con la hipercolesterolemia.
REFERENCIAS
1. PLM.
Diccionario
de
especialidades
farmacológicas. 49 ed. 2004.
2. Montgomery R. Bioquímica. Casos y texto.
6a. ed. Barcelona: Editorial Harcourt-Brace,
1998: cap. 10 y 11.
3. Harrison. Principios de medicina interna. 15a.
ed. Madrid: McGraw-Hill Interamericana
Editores; 2001: Capítulos: Aterosclerosis y
173
otras
formas
de
arteriosclerosis
e
hiperlipoproteinemias y otros trastornos del
metabolismo lipídico.
4. Pennachio D. Lineamientos para la detección
de hipercolesterolemia. Atención Médica
1997;10/2:30-43.
5. Vogel RA. Coronary risk factors, endothelial
function, and atherosclerosis. Clin Cardiol
1997; 20:426-432.
6. Goodman & Gilman’s. The pharmacological
basis of therapeutics. 10th ed. McGraw-Hill
Interamericana Editores; 2002.
7.
Mecanismo
de
acción
de
los
hipercolesterolemiantes.
Rev
Médico
General. 1997; 2(7): 71-74.
174
Caso 6
GOTA
Un hombre de 53 años relata que su
padecimiento actual se inició con una
inflamación aguda del ortejo mayor del pie
derecho e intenso dolor, el cual se
intensificaba con el frío y el movimiento.
Además, asegura que poco antes de
presentar este episodio agudo el paciente
había incrementado el consumo de carne,
vísceras, leguminosas y vino de mesa en
abundancia.
Fue tratado con fenilbutazona, pero
presentó daño gástrico, por lo que se cambió
el medicamento por alopurinol y naproxén.
Preguntas de bioquímica
1. ¿Qué alteraciones metabólicas pueden traer
como consecuencia un aumento en los
niveles séricos de ácido úrico?
2. ¿Son necesarias las purinas y las pirimidinas
en la dieta?
3. ¿Qué alimentos son ricos en purinas y
pirimidinas?
4. ¿Qué valores de laboratorio podrían estar
alterados en este paciente?
5. ¿Son importantes los antecedentes familiares
de este paciente?
6. ¿Cuál es la base bioquímica para sospechar
que una dieta rica en proteínas puede
provocar ataques de gota en pacientes
susceptibles?
7. ¿Cómo se relaciona la ingestión de etanol
con el incremento de la concentración
plasmática de ácido úrico?
8. ¿Qué régimen dietético le recomendaría a
esta persona para mejorar sus niveles de
ácido úrico?
9. ¿Cuál es la base bioquímica para la acción
de los medicamentos utilizados en la gota?
Conceptos y áreas de aprendizaje
1. Características estructurales de los ácidos
nucleicos.
2. Biosíntesis y catabolismo de purinas y
pirimidinas.
3. Explicar
cómo
interfieren
algunos
medicamentos utilizados en el tratamiento de
la gota con el metabolismo de los
nucleótidos.
REFERENCIAS
1. Harrison. Principios de medicina interna. 15a.
ed. Madrid: McGraw-Hill Interamericana
Editores; 2001.
2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverté; 2004.
3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y texto.
6a. ed. Barcelona: Editorial Harcourt-Brace;
1998: Cap. 13.
4. Rodríguez Carranza R y col. Vademécum
académico de medicamentos. 4a. ed.
México: Facultad de Medicina, UNAM y
McGraw-Hill Interamericana Editores; 2004.
175