2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS Purificación de LDH de músculo de Gallus gallus LDH Gallus gallus LDHA LDHB >sp|P00340|LDHA_CHICK L-lactate dehydrogenase A chain OS=Gallus gallus GN=LDHA PE=1 SV=3 >sp|P00337|LDHB_CHICK L-lactate dehydrogenase B chain OS=Gallus gallus GN=LDHB PE=1 SV=3 MSLKDHLIHNVHKEEHAHAHNKISVVGVGA VGMACAISILMKDLADELTLVDVVEDKLKGE MLDLQHGSLFLKTPKIISGKDYSVTAHSKLVIVT AGARQQEGESRLNLVQRNVNIFKFIIPNVVK YSPDCKLIVSNPVDILTYVAWKISGFPKHRVIG SGCNLDSARFRHLMGERLGIHPLSCHGWIVG EHGDSSVPVWSGVNVAGVSLKALHPDMGTD ADKEHWKEVHKQVVDSAYEVIKLKGYTSWAI GLSVADLAETIMKNLRRVHPISTAVKGMHGIK DDVFLSVPCVLGSSGITDVVKMILKPDEEEKIK KSADTLWGIQKELQF MATLKEKLITPVAAGSTVPSNKITVVGVGQV GMACAISILGKGLCDELALVDVLEDKLKGEM MDLQHGSLFLQTHKIVADKDYAVTANSKIVV VTAGVRQQEGESRLNLVQRNVNVFKFIIPQI VKYSPNCTILVVSNPVDILTYVTWKLSGLPKHR VIGSGCNLDTARFRYLMAERLGIHPTSCHGW ILGEHGDSSVAVWSGVNVAGVSLQELNPAM GTDKDSENWKEVHKQVVESAYEVIRLKGYTN WAIGLSVAELCETMLKNLYRVHSVSTLVKGTY GIENDVFLSLPCVLSASGL CICLO DE CORI Sangre ↑Demanda de ATP ↓O2 Hígado Glucosa ADP + GDP + Pi Piruvato NADH Gluconeogénesis Glucógeno Glucogenolisis y Glucólisis ATP + GTP ATP L-Lactato NAD+ Glucosa ADP + Pi Lactato deshidrogenasa (LDH) L-Lactato Músculo L-Lactato 2. PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA DE MÚSCULO ESQUELÉTICO DE BOVINO PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO. ¿PARA QUÉ PURIFICAR UNA PROTEÍNA? •Suero fetal bovino •Colorante de carne •Proteína liofilizada Lipasa Hexosa oxidasa Vacuna Hepatitis B Insulina Gelatina Proteínas recombinantes varias Pectinoesterasas ¿POR QUÉ QUEREMOS PURIFICAR UNA PROTEÍNA? Precisar secuencias de aminoácidos. Establecer relaciones evolutivas. Investigar la función bioquímica. Establecer relaciones estructura-función. Aplicaciones terapéuticas o biotecnológicas GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA • Definir los objetivos. Pureza, actividad y cantidad. •Definir las propiedades de la proteína de interés e impurezas. PM, pI, solubilidad, estabilidad. Componentes que puedan dañar a las proteínas (ejm proteasas). • Seleccionar la fuente de proteína. Organismo, tejido, localización celular. • Desarrollar una técnica de análisis. Para una detección rápida de la actividad de la proteína. GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA •Minimizar el manejo de la muestra. Evitar procedimientos largos. • Minimizar el uso de aditivos. Usar lo mínimo necesario. • Eliminar los contaminantes dañinos rápidamente. Por ejemplo, las proteasas. • Usar una técnica diferente en cada paso. Con el fin de aprovechar al máximo las características de la muestra en el proceso de separación. GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA •Reducir el número de pasos. Los pasos extra reducen el rendimiento e incrementan el tiempo de purificación. ¿QUÉ PARÁMETROS DEBEMOS CONSIDERAR PARA ELEGIR UNA TÉCNICA DE PURIFICACIÓN? Resolución: Depende de la selectividad y eficiencia de la técnica de separación. En general, una resolución elevada es más importante al final del proceso de purificación. Capacidad del método: Se refiere a que tanta muestra puede ser procesada por el método. La cantidad de muestra así como el volumen, disminuyen a lo largo del proceso. Velocidad: Es más importante al inicio de la purificación, donde los contaminantes como las proteasas deben ser removidas lo más rápido posible. Rendimiento: Es muy importante porque incrementa el valor de la pureza del producto. El rendimiento puede disminuir por procesos destructivos o por condiciones desfavorables para la muestra durante la purificación. DEFINIR LOS OBJETIVOS: FASES DE LA PURIFICACIÓN Las tres fases de purificación aseguran un método rápido, de buen rendimiento y económico. DEFINIR LOS OBJETIVOS: FASES DE LA PURIFICACIÓN 1. Fase I ó fase de captura, el objetivo es aislar, concentrar y estabilizar la proteína de interés. Se deben de eliminar los contaminantes críticos que comprometan la estabilidad de la proteína. 2. Fase II ó fase intermedia, el objetivo es eliminar la mayoría de las impurezas como otras proteínas, ácidos nucléicos, endotoxinas y virus. 3. Fase III ó fase de perfeccionamiento, la mayoría de las impurezas ya han sido removidas excepto aquellas que están muy relacionadas con la proteína de interés y que se encuentran en cantidades muy pequeñas. El objetivo es logar la mayor pureza posible. DEFINIR LAS PROPIEDADES DE LA PROTEÍNA DE INTERÉS Peso Molecular pI Solubilidad Polaridad Unión Específica Estabilidad •La información es útil para detectar la proteína a través de SDS-PAGE, también es importante cuando seleccionamos un método de filtración en gel. •El conocer el valor del pI puede ser utilizado con diferentes propósitos: pp isoeléctrica, selección de columna de intercambio iónico, pH de trabajo. • Afectada por temperatura, pH, fuerza iónica. Esto debe ser considerado para evitar la agregación y precipitación de la proteína. También útil para separación. •Hidrofobicidad e hidrofilicidad de la muestra, para elegir una columna de interacción hidrofóbica. •Ligandos útiles para separar la proteína. •En términos de actividad, agregación y composición de subunidades. Las características físicas y químicas de la proteína son importantes a lo largo del proceso. SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA a) b) c) La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales como: la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del que se aísla la proteína, la cantidad de la proteína de interés en el tejido y cualquier propiedad peculiar de la proteína escogida, que ayudará en su estabilización y su aislamiento. RUPTURA DE LA CÉLULA ¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE? ESTABILIDAD Las proteínas se desnaturalizan fácilmente por temperaturas elevadas, aunque algunas se pueden desnaturalizar a 25°C. La purificación de las proteínas debe llevarse a cabo a 0°C ó temperaturas cercanas. MÉTODOS •Suaves: Lisis celular (choque osmótico) Digestión enzimática (lisozima) Lisis química (detergentes) Homogenización manual Molienda Menos agresivos, previenen desnaturalización de la proteína, pero no aseguran su liberación celular. RUPTURA DE LA CÉLULA ¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE? ESTABILIDAD MÉTODOS •Moderados: Homogenización con cuchillas Molienda abrasiva Congelamiento •Vigorosos: Ultrasonicación Homogenizador Manton-Gaulin Prensa francesa Reducen viscosidad del extracto, pero pueden inactivar proteínas. SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA Buffer de Lisis Debe mantener las condiciones apropiadas para mantener e incluso mejorar la estabilidad de la proteína. pH Fuerza Iónica Aditivos Debe ser al menos una unidad arriba o abajo del pI de la proteína. Ésta diferencia previene la pp isoeléctrica, por el mantenimiento de cargas positivas o negativas en la proteína. Incrementar la fuerza iónica del medio puede reducir las interacciones iónicas entre las proteínas y las pérdidas por pp. Son componentes que previenen la degradación y mejoran la estabilidad. Se deben agregar solo si es necesario. SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA Aditivos FRACCIONAMIENTO CELULAR: CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL La centrifugación es una técnica utilizada para eliminar contaminantes o clarificar la muestra e implica la separación de los componentes con base en las diferencias en densidad, tamaño y forma. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína es diferente. De manera general, partículas más grandes y pesadas migran a lo largo del medio más rápido y se sedimentan en el fondo del tubo de centrífuga en menor tiempo. LA FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA (RCF) De esta depende qué componentes se sedimentarán y cuáles se quedarán en suspensión. Se calcula con la siguiente ecuación: RPM RFC 1.12r 1000 2 Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con una distancia r (expresada en mm). El radio usado es la distancia del centro del eje del rotor a la posición intermedia del tubo. Baja decentrifugación centrifugación Baja velocidad velocidad de 000g,g,10’) 10’) (1 000 Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación media (20 000 g, 20’) Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación alta (80 000 g, 1 h) Tejido homogenado Pellet, contiene células completas, núcleos, membranas plasmáticas Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación muy alta (150 000 g, 3 h) Pellet, contiene mitocondrias, lisosomas, peroxisomas Pellet, contiene microsomas (fragmentos de RE), vesículas pequeñas Sobrenadante contiene proteínas solubles Pellet, contiene ribosomas, macromoléculas grandes FRACCIONAMIENTO CELULAR: CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL Homogenización del tejido Diagrama para la obtención de diferentes fracciones celulares FRACCIONAMIENTO CELULAR: GRADIENTE DE DENSIDAD Las partículas pueden separarse con base en su densidad. En los oganelos, las diferencias de densidad están dadas por diferencias en la composición lipídica y protéica. Un gradiente de densidad se establece colocando cristales de sacarosa al fondo de un tubo de ensaye. La sacarosa se disuelve en la solución y difunde lentamente a lo largo del tubo hasta la parte superior. Si la densidad de la partícula es mayor que la de la solución periférica, ésta migrará hasta la zona de la solución donde la densidad sea la misma que la de partícula. Muestra Gradiente de Sacarosa Componentes menos densos Componentes más densos Fraccionamiento FRACCIONAMIENTO CELULAR: GRADIENTE DE DENSIDAD Centrifugación Otros compuestos utilizados para formar el gradiente: detergentes no iónicos, Ficoll, Percoll, Nycodenz y Optiprep. REMOVER CONTAMINANTES Y/O CONCENTRAR LA MUESTRA Después de romper las células y estabilizar las proteínas, el siguiente paso es concentrar. Se pueden utilizar diferentes métodos: Ultrafiltración Liofilización Precipitación Precipitación ¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD La solubilidad de una proteína es sensible a la temperatura, el pH, la fuerza iónica. Si afectamos alguna de éstos factores podemos disminuir o incrementar la solubilidad de la proteína. El método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH4)2SO4. ¡Y es el que vamos a hacer en la práctica! Log (S/S’) Precipitación ¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD Fuerza Iónica Precipitación ¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD Salting in Salting out Los iones adicionales proporcionados por la sal, protegen a los radicales cargados de las proteínas, evitando que interactúen entre sí. Los iones salinos, además, tienen la capacidad de formar redes de hidratación y provocan un aumento de la cantidad de agua retenida por la proteína. Competencia entre los iones adicionales y los radicales cargados de las proteínas por las moléculas de solvatación, haciendo insuficiente el volumen de disolvente. Las interacciones soluto-soluto se vuelven más fuertes que las interacciones soluto-disolvente, entonces los solutos pp. Precipitación ¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD Solubilidad Capa de Hidratación Salting in Salting out Concentración de sal Precipitación ¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD ¿CÓMO VAMOS A PURIFICAR A LA LACTATO DESHIDROGENASA DE MÚSCULO DE POLLO? ¿CÓMO CALCULAR LA CONCENTRACIÓN DE SULFATO DE AMONIO A UTILIZAR? EXISTEN TABLAS QUE NOS INDICAN CUANTO AÑADIR DE SULFATO DE AMONIO Y TAMBIÉN EN INTERNET http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl Conocer: 1. Sulfato de amonio sólido 2. Conocer el volumen de la solución 3. Y la concentración final de la sal Precipitación ¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD Otros métodos… Pp con polietilenmina (PEI). Pp con solventes orgánicos: EtOH y Acetona, a temperaturas bajas para evitar desnaturalización de proteína. Pp isoeléctrica. Al pI de la proteína con baja fuerza iónica. Pp térmica. Para proteínas termoestables, las proteínas se calientan, desnaturalizan y pp, la proteína de interés es estable y se mantiene soluble. Pp con PEG. DESALAR ¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE? FORMA Y TAMAÑO Una vez que se obtiene el pp de una mezcla proteína hay que eliminar la sal o medio utilizado para la precipitación. La sal puede interferir en los posteriores pasos de purificación La sal puede alterar las propiedades biológicas de la proteína FILTRACIÓN. A través de una membrana porosa DIÁLISIS. Es un método de separación basado en el tamaño de las moléculas en solución por la difusión selectiva a través de una membrana permeable. FILTRACIÓN EN GEL. DESALAR ¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE? FORMA Y TAMAÑO También llamada exclusión molecular, las moléculas se separan de acuerdo a su forma y tamaño. Fase sólida estacionaria . Consiste en una matriz de moléculas de gel que contienen cavidades de un tamaño molecular determinado. Fase móvil. Acarreará a la mezcla de proteína. DESALAR ¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE? FORMA Y TAMAÑO Las proteínas más grandes no serán capaces de entrar en las cavidades de las moléculas de gel, entonces tomarán un “camino más corto” y pasarán a través de la columna más rápido. Las proteínas pequeñas, serán capaces de entrar a las cavidades, recorrerán un “camino más largo” y pasarán a través de la columna lentamente. Peso molecular alto A280 Peso molecular bajo Volumen de inyección de muestra Peso molecular intermedio Equilibrio Volúmenes de Columna (CV) DESALAR ¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE? FORMA Y TAMAÑO ENSAYO ANALÍTICO Cuantificar proteína: Bradford o Lowry los más usados. Determinar actividad. SDS-PAGE. Piruvato NADH Lactato deshidrogenasa (LDH) L-Lactato NAD+ Propiedades de LDH de Gallus gallus LDH A LDH B 332 333 36514.4 36318.0 7.75 7.07 -0.004 0.087 Citoplasma Citoplasma Forma activa Homotetrámero Homotetrámero Superfamilia LDH/MDH LDH/MDH Oxidoreductasa Oxidoreductasa NAD+ NAD+ Numero de aminoácidos Peso molecular (Da) Punto isoeléctrico Promedio general de hidropaticidad (GRAVY) Localización celular Tipo de enzima Cofactor