Internet - BVS-INS - Instituto Nacional de Salud
Anuncio
1 2 © Segunda Edición Ministerio de Salud INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jr. Cápac Yupanqui 1400. Jesús María Telf.471-3254 I Fax: 471-7443 Lima, Perú, 1997 Diseño e impresión: Art. Lautrec S.R.LIda. 3 MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE PESTE COMITE RESPONSABLE BIg. Sara Morales de Santa Gadea Blg. Martha Glenny Araujo Blg. Carmen Flores Mendoza COMITÉ EDITOR: Dr. Alfonso Zavaleta Martíllez- Vargas Dr. César Cabezas Sánchez Dr. Carlos Carrillo Parodio Dr. Jaime Chang Neyra MINISTERIO DE SALUD . ALTA DIRECCIÓN Dr. Marino Costa Bauer Ministro Dr. Alejandro Aguinaga Recuenco Viceministro INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Dr. Carlos Carrillo Parodio Jefe. CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD Dr. César Cabezas Sánchez Director Genera 4 PERFIL DE AUTORES 8lgo. Sara Morales de Santa Gadea Bióloga Jefe del Laboratorio de Bacteriología Especial, División de Bacteriología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. 8lgo. Martha Glenny Araujo Bióloga Jefe del Laboratorio de Bacterias de Transmisión Sexual y Leptospiras, División de Bacteriología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. Dr. Carlos Carrillo Parodl Médico Cirujano, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento Académico de Microbiología, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia. . PERFIL DE WS EDITORES Dr. Alfonso Zavaleta Martínez- Vargas Médico Cirujano, Doctor en Farmacología Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA Profesor Principal, Sección Farmacología, Departamento Académico de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Miembro, Instituto de Medicina Tropical 'Alexander Von Humbolt", Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. César Cabezas Sánchez Médico Cirujano, Master en Medicina, Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales Director General, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud, M/NSA. Profesor invitado de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Carlos Carrillo Parodl Médico Cirujano, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento Académico de Microbiología, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Jefe, Instituto Nacional de Salud Dr. Jaime Chang Neyra Médico Cirujano, Master of Science in Community Health in Deueloping Countries Director Ejecutivo de Certificación y Garantía de la Calidad, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA, Investigador, Instituto de Medicina Tropical 'f\lexander Von Humbolt", Universidad Peruana Cayetano Heredia. Agradecimientos: El Comite Editor expresa su agradecimiento a los señores Doctores César Naquira Velarde, Humberto Guerra Allison, Isabel Montoya Piedra, por las valiosas sugerencias y correcciones efectuadas al manuscrito. La edición de este Manual se efectuó en el marco del Convenio de Cooperación suscrito entre el Instituto Nacional de Salud y la Universidad Peruana Cayetano Heredia. 5 INDICE Presentación ........................................................................................... ............................................7 Resolución Jefatural .............................................................................. ............................................8 CAPITULO I Introducción........................................................................................... .............................................9 CAPITULO II Obtención y envío de la Muestra ....................................................................................................10 CAPITULO III Pruebas de laboratorio para diagnóstico de Peste .......................... ............................................19 CAPITULO IV Inmunofluorescencia Directa (IFA) .................................................... ............................................22 CAPITULO V Prueba de Aglutinación en Látex........................................................ ............................................25 CAPITULO VI Aislamiento por Cultivo de Yersinia pestis...................................................................................28 CAPITULO VII Técnicas de ELISA...........................................................................................................................36 CAPITULO VIII Inoculación en ratón............................................................................ ............................................43 CAPITULO IX Normas de Bioseguridad .................................................................................................................45 CAPITULO X Referencias Bibliográficas ................................................................. ............................................46 CAPITULO XI Anexos ...............................................................................................................................................47 Anexo 1: Definiciones de casos de Peste según el laboratorio ..................................................................48 Anexo 2: Ficha de laboratorio para diagnóstico de Peste ...........................................................................49 Anexo 3:.. Sobre de envío de tiras de Nobuto (animales) ..............................................................................50 Anexo 4: Ficha para el diagnóstico de Peste en animales...........................................................................51 Anexo 5: Preparación de Medios de Cultivo y Reactivos ............................................................................52 6 PRESENTACION La Yersinia pestis es un microorganismo virulento, gramnegativo, móvil cuando se le aisla del medio ambiente, pero que se torna inmóvil en los tejidos del huésped. Tres especies de Yersinia pueden ocasionar enfermedades en el hombre: Yersinia enterocolítica, Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia pestis. Las dos primeras, se adquieren por ingestión de alimentos contaminados, mientras que la última requiere la picadura de un insecto, siendo la especie más invasiva. Son portadores de la enfermedad: las ardillas, ratas del campo, marmotas, cerdos salvajes, osos y ocasionalmente conejos. Los gatos domésticos pueden ser infectados de peste cuando cazan roedores enfermos y transmitirla a los humanos. Esta característica ha permitido que no existan problemas al escoger animales modelo para estudiar la fisiopatogenia de la enfermedad. Desarrolla bien en cultivos celulares (HeLa, Hep-2, Hence), poseyendo plasmidos de virulencia (adhesinas, invasinas y regulatorias). Una historia clínica que refiera picaduras de pulgas y/o campamentos o permanencia en áreas endémicas son importantes para el diagnóstico primario. El reconocimiento precoz de esta enfermedad es crítico para el tratamiento apropiado, tanto de los pacientes como el de los contactos y para el inicio de medidas de control que prevengan la rápida diseminación de la enfermedad potencialmente fatal. Los síntomas incluyen el síndrome parecido al resfrío viral (influenza): fiebre alta, escalofríos, malestar, dolor de cabeza, y generalmente, pero no siempre, aumento del tamaño de los nódulos linfáticos con dolor, cerca a las áreas de la inoculación primaria (áreas inguinales o axilares). El tratamiento antibiótico es esencial en peste y cuanto más precoz, mejor será la evolución de la enfermedad. Disminuir la población de roedores mediante eliminación de la basura y programas de erradicación de roedores, es una acción esencial en el control de esta enfermedad. Este manual constituye parte de la serie de Normas Técnicas que el Instituto Nacional de Salud, como Organo Normativo Referencial está publicando, para su uso en la Red Nacional de Laboratorios de Salud y por la comunidad técnico científica, en concordancia con los lineamientos de politica institucional y sectorial. Dr. Carlos Carrillo Parodi Jefe 7 8 CAPITULO I INTRODUCCION La Peste, es una infección bacteriana de animales y humanos causada por Yersinia pestis. El bacilo de la Peste fue descubierto por el bacteriólogo francés Alexander Yersin, en 1894, en Hong Kong. Se le llamó Pasteurella pestis hasta 1970. Yersinia pestis, pertenece la Familia Enterobacteriaceae, y es un bacilo Gramnegativo aerobio oxidasa negativa, que cuenta con gran número de antígenos y toxinas que desempeñan papeles importantes en la virulencia y patogenicidad de la enfermedad. La forma clínica más frecuente, es la linfadenitis regional aguda, llamada Peste Bubónica. Algunas formas menos comunes son la Septicémica y la Neumónica. La mortalidad es alta en los casos no tratados, pero el tratamiento antibiótico que se emprenda en fase temprana del curso de la enfermedad reduce notablemente la letalidad. La Peste, es de distribución mundial, con focos importantes en América, Africa y Asia. Los reservorios naturales de Yersinia pestis, son sobre todo roedores urbanos y silvestres; y se transmite entre animales y en ocasiones al hombre por la picadura de pulgas infectadas. Yersinia pestis, ha causado pandemias devastadoras con altos índices de mortalidad durante toda la historia. La primera conocida, se originó en Egipto en el año 542 D.C. y se extendió a Turquía ya Europa. La más reciente, comenzó, aproximadamente en 1860, en la provincia china de Yunnan, se extendió hacia la costa sur de China, llegando a Hong Kong en 1894. Luego, la Peste fue llevada por barco a la India y otros países de Asia, Brasil y Estados Unidos (California). Se calcula que ocurrieron 10 millones de muertes por esta enfermedad en la India durante el siglo actual. La Peste ingresó al Perú por los puertos de Pisco y Callao en 1903, afectando áreas urbanas hasta 1910. En los últimos 35 años, sólo se han presentado casos de Peste Silvestre, localizándose en los Departamentos de la Costa y Sierra Norte del país. En el laboratorio. Y. pestis crece lentamente. y es bioquímicamente inactivo en contraste con otras Enterobacterias. En caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI). Y. pestis, tiene un crecimiento característico formando estalactitas en lugar de una turbidez homogénea. Las coloraciones de Gram y Wayson no son específicos. Los criterios para la definición del caso presuntivo y confirmado de Peste, según la OMS, se muestran en el Anexo l. El diagnóstico de laboratorio, es fundamental, para la confirmación de los casos humanos y de las epizootias, así como para la vigilancia epidemiológica de la Peste. 9 CAPITULO II OBTENCION Y ENVIO DE LA MUESTRA 2.1. OBTENCION DE LA MUESTRA El éxito de los procedimientos de laboratorio depende de una buena obtención de la muestra y de la rapidez con que las mismas lleguen al laboratorio. Se debe obtener la muestra antes de la administración de antibióticos. Si se han administrado, informar de ello, al laboratorio. El material sospechoso de contener Yersinia pestis, deberá manejarse con gran cuidado usando mandil, guantes y mascarilla por el riesgo de infección. El personal de laboratorio puede infectarse por diversas vías: lesión en piel, mucosas y tracto respiratorio en accidentes de laboratorio. Deberá adoptarse toda clase de precauciones para no contaminar el material biológico y, para evitar que se dispersen en el aire gotas minúsculas que puedan causar la infección de otras personas y la propagación de la Peste Neumónica. 2.2. OBTENCION DE MUESTRAS DE CASOS HUMANOS 2.2.1. Aspirado de Bubón: Deberá ubicarse los bubones; y seleccionar el que aproximadamente mida 3 cm o más de diámetro. (Ver Foto 1) - - - Desinfecte dos veces la piel del bubón con alcohol yodado, descartando el algodón cada vez, y una tercera vez con alcohol de 70°. Antes de la punción debe haberse evaporado. Aspire con la aguja N° 20 y una jeringa de 10 cc., 0.5 mL de solución salina estéril. Sosteniendo la jeringa entre el índice y el pulgar de la mano derecha introduzca la aguja en el bubón. Con la mano izquierda, tire lentamente del émbolo de la jeringa. Deberá entrar en ésta, un líquido que puede ser sanguinolento. En el caso de que no entre líquido alguno en la jeringa, inyecte la solución salina en el bubón, empuje suavemente el émbolo con el pulgar. Imprímase a la aguja introducida en el bubón un movimiento circular; a continuación, tire lentamente del émbolo, para así obtener el líquido seroso. Retire la jeringa y limpie con alcohol de 70° el sitio de la punción. Sostenga la jeringa en posición vertical, con la aguja hacia abajo e inocule parte del aspirado del bubón en el medio de transporte CaryBlair. El resto del aspirado se usará para el frotís, para la prueba de Inmunofluorescencia 10 Directa. Dejar caer una gota de la muestra contenida en la jeringa y extiéndala con la misma aguja sobre una lámina porta-objeto limpia y desengrasada formando una capa bastante delgada. Dejar secar el frotís a temperatura ambiente. - Para descartar el material contaminado, sumerja la jeringa y la aguja en fenol al 5%, extrayendo suavemente el émbolo. Se obtendrá, además, muestras de sangre para hemocultivo y serología. 2.2.2. Sangre: La muestra se obtendrá de pacientes febriles que se encuentran en la fase septicémica de la enfermedad. A fin de obtener una mayor posibilidad de aislar el agente etiológico, se obtendrá cuatro muestras seriadas de sangre en un lapso de 90 minutos para cultivo. La primera muestra de sangre deberá ser aproximadamente de 10 mL (5 mL para serología y 5 mL para cultivo); las tres muestras restantes de 5 mL cada una para cultivo. Antes de proceder a la extracción de la sangre, limpiar con algodón embebido con alcohol yodado la tapa del frasco de cultivo; descartar el algodón y colocar nuevamente otro algodón embebido en alcohol de 70°, el que permanecerá hasta la obtención de la sangre. Localizar la vena y desinfectar la piel por dos veces con alcohol yodado y una tercera vez, con alcohol de 70°, realizando movimientos centrípetos y descartando cada vez el algodón. Extraiga 10 mL de sangre en caso de adultos y 5 mL en caso de niños. Retire el algodón del frasco de cultivo e inocule a través del tapón de jebe 5 mI. de sangre en caso de adultos y 2.5 mI en niños. (Ver Foto 2). Foto 1: Bubón en paciente con Peste Bubónica, del cual se obtendrá la 11 muestra de aspirado Foto 2: Inoculación de muestra de sangre en frasco de cultivo (medio bifásico). Foto 3: Inoculación de muestra de esputo en Medio de Transporte Cary-Blair 12 o de la sangre se transfiere a un tubo de ensayo de 13 x 100 mm sin anticoagulante para separar el suero, vertiendo suavemente la sangre por la pared del tubo para evitar la rotura de los glóbulos rojos; dejar reposar a temperatura ambiente y una vez retraído el coágulo. separar el suero. El suero obtenido se trasvasa a un vial de crioconservación (NUNC) y servirá para la realización de la prueba serológica de aglutinación en látex. 2.2.3. Esputo: a) Este tipo de muestra se obtiene solamente en caso de sospecha de Peste Neumónica. Asimismo, se obtendrá de estos pacientes muestras de sangre en paralelo para pruebas serológicas y cultivo. - El paciente deberá expectorar dentro de un recipiente estéril con tapa rosca y de boca ancha, adoptando las debidas medidas de Bioseguridad.(*) b) Preparación del frotís de esputo: - Colocar sobre la mesa de trabajo, idealmente, una hoja de papel absorbente plastificado. Colocar los envases conteniendo las muestras de esputo, previamente rotulados, sobre la mesa de trabajo. De la misma forma, colocar las láminas porta-objetos en orden correlativo, en las cuales, se preparará el frotís para realizar la prueba de Inmunofluorescencia Directa: * Flamear el asa de siembra, dejar enfriar. * Destapar cuidadosamente el envase de la muestra, manteniendo la boca del envase cerca del mechero encendido. Coger con el asa de siembra una pequeña porción de la muestra y extenderla sobre la lámina porta-objetos, haciendo movimientos de vaivén, hasta lograr que el extendido sea homogéneo (ni muy fino ni muy grueso); que no llegue a los bordes de la lámina, para evitar que el operador se contamine al manipularla. * Dejar secar a temperatura ambiente para luego fijar el extendido al calor. Terminado el frotis, pasar el asa de siembra por el frasco con arena y fenol al 5%; luego dejar el asa en la caja de metal para ser enviado a autoclavar. c) Inoculación de la muestra en Medio de Transporte: - Con ayuda del asa de siembra. extraer. parte de la muestra del recipiente e inoculada en el medio de transporte Cary-Blair. (Ver Foto 3). En cada una de las muestras y láminas con frotís. se debe poner el nombre del paciente o código que identifique la muestra y debe ir acompañada de una ficha clínico-epidemiológica (Anexo N° 2) con los datos del paciente. Se debe escribir el mismo código tanto en el tubo de medio de transporte, hemocultivo, tubo con sangre, lámina, así como en la ficha que lo acompaña. ___________________________________________ :*) Nota del Editor: Véase Capítulo IX de este manual. 13 2.2.4. Organos de pacientes fallecidos – Caso sospechoso de Peste Se deben tener en cuenta las siguientes consideraciones: a. Cuerpo no refrigerado (24 - 48 horas), realizar autopsia inmediatamente; obtener muestras de hígado, bazo y bubón. Si no se puede procesar inmediatamente, se puede guardar las muestras hasta por 06 meses en medio de transporte Cary-Blair o Thioglicolato a 4°C. Se tiene la posibilidad de recuperar en un 100% por cultivo el agente etiológico, así como realizar Inmunofluorescencia Directa. b. Cuerpo no refrigerado (después de 48 horas), obtener muestras de hígado, bazo y bubón y procesar inmediatamente. Se tiene la posibilidad de recuperar en un 20% por cultivo el agente etiológico así como realizar Inmunofluorescencia Directa y PCR. c. Muerto por largo tiempo (06 meses - muchos años), obtener muestra de médula ósea de fémur. Se realiza diagnóstico por PCR. d. No es recomendable realizar la digitomía, sólo se llevará a cabo si no es posible ejecutar lo anteriormente mencionado. La digitomía tiene un porcentaje muy bajo de obtención de un resultado positivo. 2.3. OBTENCION DE MUESTRAS DE ESPECIMENES ANIMALES 2.3.1. Roedores muertos: Deben ser recolectados, individualmente, en bolsas de polietileno conteniendo insecticida, el mismo que deberá ir acompañado de su respectiva ficha. 2.3.2. Roedores vivos: 2.3.2.1. Anestesia del roedor - El animal capturado vivo, será introducido en un saco de tela conteniendo algodón empapado con éter. Todo en su conjunto, debe ser introducido en una bolsa de polietileno de 35 x 45 cm. - Una vez adormecido el animal y sus ectoparásitos, se pasa a una bolsa de polietileno. · Se espolvorea al animal con insecticida. · Se da ligeros golpes al animal dentro de la bolsa para eliminar el insecticida y ectoparásitos adheridos al mismo. 2.3.2.2. Despulgue - Se procede al cepillado del animal sobre un lavatorio conteniendo agua. - Las pulgas colectadas se colocarán en frascos con capacidad de 2 mL. conteniendo solución salina estéril al 2.5% más Tween 20. Las pulgas, así conservadas, se enviarán al Instituto Nacional de Salud para el aislamiento de Yersinia pestis mediante cultivo. 2.3.2.3. Biometrfa - Al animal anestesiado se le coloca sobre la mesa de autopsia. - Se procede a realizar mediciones, observación del color del pelamen, sexo, peso y anotar algunas alteraciones morfológicas (presencia de bubones ). 14 2.3.2.4. Obtención de sangre - Al animal anestesiado se le desinfecta la cola/oreja. - Obtener sangre en papel filtro (tiras de Nobuto). - En la parte ancha de ,la tira, escribir con lápiz el código del animal. (Ver Foto 4) - Las tiras de Nobuto se dejan secar a temperatura ambiente. - Introducir las tiras de Nobuto secas al sobre, en el que se registrará toda la _nformación referente al animal (Ver Anexo N° 3). 2.3.2.5. Disección - La disección se realiza junto al mechero y con materiales de disección estériles. - Se procede a desnucar al animal. - El animal, es puesto en una bandeja de tecnopor descartable de 40 cm2. Colocar el roedor en posición de cúbito dorsal y prender con alfiler las patas. - Desinfectar la parte abdominal con alcohol corriente, pasar el algodón embebido de alcohol por tres veces. - Levantar la piel con una pinza, a dos dedos del escroto o vagina y realizar un piquete. - Separar la piel del cuerpo. - Realizar el corte ventral!", edio has'a la altura del corazón. (Ver Foto 5) 2.3.2.6. Obtención de muestra de Organos - Con una tijera y con ayuda de la pinza, cortar desde la base del hígado y del bazo. - Obtener muestras de bazo e hígado y colocarlos, separadamente, en una placa petri estéril. - Cortar pequeñas muestras de bazo y/o hígado para inocular en medio de transporte Cary Blair y realizar impronta, las cuales, serán remitidas al Laboratorio Regional de Referencia correspondiente. La impronta servirá para realizar la prueba de Inmunofluorescencia Directa, las que resulten positivas se sembrarán en placas de Agar sangre de carnero al 6% y BHI. (Ver Foto 6). Las muestras de órganos, sangre y lámina con frotís correspondientes al mismo animal, deberán tener el mismo código y estar acompañadas de la ficha correspondiente (Ver Anexo N° 4). 2.3.3. Animales Centinelas (perros) Extraer con una jeringa descartable de Tuberculina, 1 mL de sangre de la vena Safena de la pata posterior del animal. Depositar la sangre en dos tiras de Nobuto, de tal manera, que quede embebida la parte angosta de la tira. En la parte ancha de la tira, escribir con lápiz, el código del animal. Dejar secar a temperatura ambiente. Introducir las tiras de Nobuto secas en el sobre, en el que se registrará toda la información referente al animal. 2.4. ENVIO DE MUESTRAS Y CULTIVOS 2.4.1 Envío al Laboratorio Regional de Referencia Tanto las muestras de casos humanos como la de especímenes animales, deberán ser remitidas al Laboratorio Regional de Referencia (Piura, Chiclayo y Cajamarca) según corresponda para la realización de las pruebas de Identificación Presuntiva de Yersinia pestis (Aglutinación en Látex, Inmunofluorescencia Directa y Aislamiento primario). 15 Foto 5: Disección de espécimen animal (ratón) para extracción de órganos Yersinia pestis (Prueba de Tamizaje). Ola placa es dividida en dos secciones, cada una de ellas tiene control negativo (-) y control (+), mas 10 muestras de sueros problemas a procesarse en cada sección. FOTO 6: Siembra de muestra de órgano en placas de Agar Samgre 16 Foto 7: Yersinia pestis en una muestra por la Prueba de Inmunofluorescencia Directa a una magnificación de 1,000X Foto 8: Prueba de Aglutinación para diagnóstico de Yesenia pestis (Prueba de Tamizaje). La polaca es dividida en dos secciones, cada una de ellas tiene control negativo (-) y control positivo (+), más 10 muestras de sueros problemas a procesarse en cada sección. 2.4.2 Remisión de Cultivos al Laboratorio Nacional de Referencia 17 Los Laboratorios de Referencia Regional deberán remitir al Instituto Nacional de Salud: • Cultivos con pruebas presuntivas para identificación confirmatoria de Y. pestis, en tubos o frascos pequeños con tapa rosca o de jebe conteniendo Agar Tripticasa de Soya (TSA). Debe rotularse el frasco, de tal manera, que no se borre o pierda la identificación, acompañado de su respectiva ficha. • Dos muestras de sueros de un mismo paciente, obtenidas con un intervalo de tiempo para Confirmación Serológica de caso de Peste, con los resultados obtenidos en el Laboratorio de Referencia Regional. La remisión debe ser en tubos o frascos pequeños con tapa rosca o de jebe, crioviales de conservación; nunca debe remitirse la muestra en jeringa. Debe rotularse el frasco, de tal manera, que no se borre o pierda la identificación, acompañado de su respectiva ficha. • El 100% de las pulgas para confirmación de especie y determinación de la presencia de Y. pestis. La remisión debe hacerse en frascos con capacidad de 2 mL conteniendo solución salina más Tween 20. Debe rotularse el frasco, de tal manera, que no se borre o pierda la identificación, acompañado de su respectiva ficha. • El 10% de cráneos de animales capturados de la misma especie y procedentes de una misma zona, para verificación de especie. Debe rotularse el frasco, de tal manera, que no se borre o pierda la identificación, acompañado de su respectiva ficha. • EI 10% de los animales taxidermizados que tengan la misma morfología y procedan de la misma zona. Debe rotularse debidamente el espécimen, de tal manera, que no se borre o pierda la identificación, acompañado de su respectiva ficha. • Todas las muestras deben transportarse dentro de un recipiente seguroseguro para evitar accidentes el mismo que esté correctamente identificado por fuera, indicando la dirección a donde va a ser enviado y señalando que contiene material biológico, como se indica a continuación: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL DE PESTE Cápac Yupanqui 1400 - Jesús María, Lima II Teléfonos 471-2529, 471-9920 FAX (01)471-7443 - (01) 471-2529 CONTIENE MATERIAL BIOLOGlCO REFRIGERAR Se deberá comunicar al Instituto Nacional de Salud, vía telefónica o vía fax, la remisión de muestras. ________________________________________________________________________________________ TODO MATERIAL CBIOLOGICO REMITIDO PARA IDENTIFICACIÓN Y/O CONFIRMACION DEBERA ESTAR ACOMPAÑADO DE SU RESPECTIVA FICHA CLINICO-EPIDEMOLOGICA Y/O ENTOMOLOGICA, EN CASO CONTRARIO, NOSE REALIZARA NINGUN ESTUDIO”. ________________________________________________________________________________________ 18 19 20 21 CAPITULO IV INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFA) Prueba que es usada como Diagnóstico Presuntivo de Peste, basada en una reacción antígeno anticuerpo específica contra el antígeno capsular F1 de Yersinia pestis conjugado con Isotiocianato de Fluoresceína (FITC). Asimismo, esta prueba es usada para realizar la vigilancia de roedores silvestres y epizootias. 4.1. MUESTRAS APROPIADAS - Aspirado de bubón Esputo Cultivo Organos: Hígado, bazo, tejido de nódulo linfático 4.2. MATERIALES NECESARIOS PARA ESTA PRUEBA - - Conjugado de anticuerpo fluorescente (suero de conejo con Anti Fl conjugado con lsotiocianato de Fluoresceína).Ç Buffer Fosfato Salino (PBS), pH 7.2 0.2 Láminas porta-ebjetos (lmm de grosor) Laminillas cubre-objetos Líquido de montaje (90% Glicerol en PBS) Jarras de coloración (Koplin) Lápiz de cera o plumón de tinta indeleble Cámara húmeda Micropipeta graduable de 5 a 50 uL de un canal Tips de 1 - 100 uL Controles: Positivo y Negativo Microscopio de fluorescencia Suero fisiológico 4.3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA 4.3.1. Preparación de Frotis o Impronta: Preparar 2 láminas por cada muestra. A. Organo: - Coger con una pinza estéril un pedacito de bazo o hígado y colocarlo sobre una lámina porta-objetos limpia y desengrasada. Presionar suavemente a manera de un sello. Dejar secar a temperatura ambiente. 22 B. Cultivo: - Flamear el asa de siembra en el mechero, dejar enfriar. Colocar una gota de suero fisiológico estéril sobre una lámina portaobjetos. Coger con el asa de siembra 1 ó 2 colonias de la placa de Agar sangre y colocarla sobre la gota de suero fisiológico. Homogenizar y extender la gota formando una capa bastante delgada; dejar secar a temperatura ambiente. C. Aspirado de Bubón: - Colocar la jeringa en posición vertical con la aguja hacia abajo. Dejar caer una gota de la muestra extendiéndola sobre una lámina porta-objetos limpia y desengrasada formando una capa bastante delgada. En caso de que la muestra se encontrara en medio de transporte (tubo y/o frasco): * Flamear el asa de siembra, dejar enfriar. * Coger con el asa de siembra una pequeña porción de la muestra y extenderla en una lámina portaobjetos formando una capa bastante delgada. - En ambos casos, dejar secar a temperatura ambiente. - D. Esputo: - Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Coger con el asa de siembra una pequeña porción de la muestra y extenderla en una lámina porta-objetos formando una capa bastante delgada, dejar secar a temperatura ambiente. E. Hemocultivo: De las colonias presentes en la fase sólida del frasco de hemocultivo se prepara un frotís empleando el siguiente procedimiento: - - Usar una lámina portas-objeto limpia. Pasarla por alcohol y secarla. Colocar sobre la lámina con una pipeta Pasteur y/o asa de siembra, una gota de suero fisiológico estéril. Con ésta, coger 2 ó 3 colonias, y realizar una emulsión de las mismas con el suero fisiológico. Dejar secar a temperatura ambiente; y finalmente, fijarla al calor para realizar la prueba. 4.3.2. Coloración de las láminas - Cada prueba debe correrse paralelamente con controles preparados de una muestra que se conoce que es positiva y una muestra negativa. Calentar la lámina en el mechero para fijar las muestras, dejar enfriar y con el lápiz de cera, hacer un círculo en cada muestra. Agregar 25 uL del conjugado para cubrir cada muestra e incubar a temperatura ambiente (23-29°C) durante 30 minutos en cámara húmeda. Lavar las muestras con buffer fosfato salino (PBS) por dos veces, sumergiéndolas durante 10 minutos cada vez en las jarras de coloración. Dejar secar las muestras a temperatura ambiente. 23 4.3.3. Lectura La lámina puede observarse, directamente, en el microscopio de fluorescencia, agregando una gota de aceite de inmersión dentro del círculo que contiene la muestra. Alternativamente, algunos microscopios requieren de un montaje especial, en tal caso, agregar una gota del líquido del montaje y cubrir con una laminilla cubre-objeto. Examinar la muestra. La presencia de organismos fluorescentes verdes ovoides pequeños o partículas pequeñas se considera como una prueba positiva. Cuando los pacientes sospechosos de Peste han recibido tratamiento antibiótico previo a la obtención de muestra no se observa la morfología celular característica, pero, partículas pequeñas de material celular disperso pueden estar presentes debido a la lisis de las bacterias, por lo que, es importante, que en la Ficha ClínicoEpidemiológica se señale el esquema de tratamiento recibido por el paciente a fin de poder interpretar el resultado de la prueba. (Ver Foto 7) 4.4. FACTORES DE ERROR - La variación en el pH del buffer fosfato salino. La congelación y descongelación continua del conjugado disminuye el título del mismo. Fallas en el procedimiento de fijación de la muestra. 4.5. CONTROL DE CALIDAD Cuando es recibido el reactivo (Conjugado para Inmunofluorescencia), pequeñas alícuotas (100 uL) deben ser preparadas y conservadas a una temperatura de -20°C. Una vez que se usa una de las alícuotas, ésta debe ser conservada a 4°C en la oscuridad. El reactivo debe ser evaluado anualmente, para asegurar la reactividad del mismo. Cuando se preparan los frotices de las muestras a procesarse, también debe prepararse una batería de controles: positivo y negativo. Los microscopios de fluorescencia deben ser revisados y realineados una vez al año. 24 CAPITULO V PRUEBA DE AGLUTINACION EN LATEX Prueba de diagnóstico presuntivo que permite detectar la presencia de anticuerpos contra Yersinia pestis, es una reacción antígeno anticuerpo específica para el antígeno capsular F1 de Yersinia pestis, adherido a una partícula coloreada (látex). Asimismo, es usada para realizar la vigilancia serológica, de animales centinelas y roedores silvestre 5.1. MUESTRAS APROPIADAS - Caso humano: Suero, de preferencia no hemolizado Espécimen animal: Sangre en papel filtro (tiras de NOBUTO) 5.2. MATERIALES NECESARIOS PARA ESTA PRUEBA - - Placas de microtitulación de 96 pocillos, sin carga iónica de polipropileno y de fondo en U Micropipeta Multicanal de 12 canales de 5-50 uL de capacidad Micropipeta de un canal, de 5-50 uL de capacidad Tips para micropipetas (0.1 - 100 uL) Diluyente : Buffer Fosfato Gelatina pH 6.8 Partículas de Látex sensibilizadas con Fracción Antigénica F1 Buffer de Inhibición de la Aglutinación (Buffer Fosfato Gelatina con Fracción Antigénica F1) Buffer Borato pH 8. Tubos de prueba 10x75 mm Sueros Control: Positivo y Negativo Bafio María Centrífuga 5.3. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS 5.3.1. Preparación de sueros de casos humanos - Obtener muestra de sangre en tubo sin anticoagulante. Separar el suero por centrifugación (2,500-3,000 rpm) durante 10 minutos. Observar que el suero no esté contaminado. Inactivar el suero a 56°C durante 30 minutos. 5.3.2. Preparación de muestras de sangre de especimenes animales (Tiras de NOBUTO) - - Obtener muestra de sangre en tiras de NOBUTO. Separar la parte ancha de la tira de NOBUTO. Cortar en 2 fragmentos la sección de la tira de NOBUTO, donde se encuentra la muestra, e introducirlos en el tubo de 10x75 mm que contiene 0.4 mL de buffer Borato. Dejar en refrigeración (4°C) durante toda la noche. Presionar con aplicadores (vidrio o plástico) las tiras de NOBUTO 25 - contra la pared del tubo de 10x75 mm Separar el suero por centrifugación (5,000 rpm) durante 10 minutos. Inactivar el suero a 56°C durante 30 minutos. 5.3.3. Procedimiento A. Prueba de Tamizaje La realización de esta prueba se efectúa usando 4 pocillos por cada muestra. - Dividir horizontalmente la microplaca en dos secciones: 4 columnas hacia arriba y 4 columnas hacia abajo. Se pueden trabajar 10 muestras en cada sección, sumando además un control positivo y un control negativo en cada sección. - Utilizando la micropipeta multicanal, colocar 25 uL de buffer diluyente a cada uno de los pocillos de la microplaca. Utilizando la micropipeta de un canal, adicionar 25 uL de cada uno de los sueros problema y controles a cada pocillo de la primera fila de cada sección. - Realizar las diluciones, utilizando la micropipeta multicanal, mezclando por tres veces la muestra de suero en el primer pocillo de cada fila y luego transferir 25 uL de éste al segundo pocillo y así sucesivamente hasta el cuarto pocillo, descartando los últimos 25 uL. - Girar la placa, de tal manera, que se empiece por la última dilución al agregar con la micropipeta multicanal, los 25 uL del látex a cada pocillo. - Cubrir la microplaca y dejar en reposo durante 6 horas a temperatura ambiente (2225°C), en un lugar donde no haya vibraciones. Leer con una buena fuente de luz y fondo blanco. - El título de la prueba de tamizaje, estará dado por la última dilución en la cual se observe aglutinación. (Ver Foto 8) B. Prueba Estándar Seleccionar las muestras en las cuales se observe aglutinación con títulos > 1: 1 O en casos de humanos y 1: 128 para especímenes animales para correr, simultáneamente, la titulación final de las muestras y la Prueba de Inhibición de la Aglutinación para determinar la especificidad de la reacción. Se realiza usando 8 pocillos para la prueba de aglutinación y 4 pocillos para la prueba de inhibición de la aglutinación. - - - Dividir verticalmente la microplaca en dos secciones: una sección con 8 columnas y la otra con 4 columnas. Se pueden trabajar 6 muestras de suero sumando además un control positivo y un control negativo. Colocar 25 uL del buffer fosfato gelatina en los primeros 8 pocillos y 25 uL del buffer de inhibición a los 4 pocillos restantes. Agregar, 25 uL de las muestras de suero a cada primer pocillo de aglutinación y a cada primer pocillo de inhibición de la aglutinación. Diluir en forma seriada las muestras de suero, empezando por el primer pocillo y descargando los últimos 25 uL. Los mismos tips pueden usarse para realizar la dilución de los pocillos de inhibición. Agregar a todos los pocillos, 25 uL del látex. Cubrir la microplaca e incubar a temperatura ambiente durante 6 horas. C. Lectura Examinar los pocillos después de 6 horas de incubación de la prueba. Buscar una aglutinación clara en forma de red con bordes regulares como resultado Positivo. 26 Los pocillos negativos tendrán un botón muy bien delimitado en los bordes o un círculo bien definido. Determinar los títulos de acuerdo a la Tabla de Título Final (Tabla 1). Los resultados de Inhibición son interpretados como reacción específica. Si el título de la muestra de suero es muy alto, la inhibición de la aglutinación es reducida. Se considera, Positiva la prueba, cuando el título es > 1: 1 O en caso de humanos y 1: 128 en caso de especímenes animales. 5.4 FACTORES DE ERROR - La formación de burbujas en el momento de realizar las diluciones dificulta la interacción antígeno-anticuerpo. Temperaturas mayores de 28°C favorecen la desecación de las muestras. 5.5 CONTROL DE CALIDAD Cada lote de látex y buffer, deben ser evaluados con un panel de sueros de títulos conocidos y así asegurar que los reactivos estén funcionando en óptimas condiciones. 27 CAPITULO VI AISLAMIENTO POR CULTIVO DE Yersinia pestis 6.1 AISLAMIENTO POR CULTIVO E IDENTlFICACION DE Yers;nia pestis (EN EL MEDIO AGAR SANGRE) La confirmación absoluta de un brote de Peste, requiere del aislamiento e identificación del agente etiológico. En la fase aguda de la enfermedad, hay una intermitente bacteremia, por lo que se requiere la obtención de 4 muestras de sangre para tener mayor probabilidad de cultivo positivo. Los nódulos linfáticos también contienen abundantes organismos. Yersinia pestis puede ser identificada, presuntivamente, por la prueba de Inmunofluorescencia Directa. La confirmación se basa en pruebas adicionales que incluyen la morfología de los colonias bacterianas en cultivos de agar sangre al 6% y caldo BHI, caracterización bioquímica y sensibilidad al bacteriófago especifico de Yersin;a pestis a temperatura de 37°C como a temperatura ambiente (22 - 25°C). Si se trata de pulgas o muestras que se encuentren contaminadas, entonces, se prepara un inóculo para la inoculación en ratones. El medio de agar sangre al 6%, es el medio sólido estándar que se usa para el cultivo de Yersinia pestis. La superficie del medio de cultivo a usar debe estar completamente seca y a temperatura ambiente antes de proceder a la siembra. Las muestras obtenidas de pacientes sospechosos de Peste para cultivo pueden ser sembradas directamente (aspirado de bubón, esputo, órganos), o subcultivadas (hemocultivos), en los medios de cultivo anteriormente mencionados. 6.2 METODOLOGIA: 6.2.1. SEMBRADO Y MORFOLOGIA DE LAS COLONIAS DE Yersinia pestis EN CULTIVO En caso de muestras de aspirado de bubón, esputo, órganos, se siembra directamente la muestra en el medio; la muestra se estría en la superficie del agar e incuba por 24 horas a 37°C. Yersinia pestis, crece como colonias translúcidas blanco-grisáceas. A las 24 horas se observan colonias pequeñas como cabeza de alfiler. Después de una incubación de 48 horas, las colonias miden aproximadamente 1-2 mm de diámetro y son blanco-grisáceas y más opacas. No son hemolíticas. (Ver Foto 9 y 10). 28 Foto 9: Colonias de Yersinia pestis aisladas en Agar Sangre (48 horas de incubación). Colonias traslúcidas blanco-grisáceas, no hemolíticas. Foto 10: Colonias de Yersinia pestis a las 72 horas de incubación. 29 Foto 11: Crecimiento de Yersenia pestis en caldo infusión cerebro-corazón (BHI): Crece como pequeños acúmulos de célula, no presentando turbidez (tubo izquierdo) a diferencia de otras bacterias que sí presentan turbidez (tubo derecho). Foto 12: Pruebas de Oxidasa, el color violeta oscuro (derecha) indica la prueba positiva, la ausencia de color (izquierda) indica prueba negativa. 30 6.2.2. CRECIMIENTO EN CALDO INFUSION CEREBRO CORA ZON (BHI) El caldo de infusión cerebro corazón, es el medio estándar usado en el laboratorio para crecimiento de la bacteria. Es un caldo de aislamiento primario y de caracterización de Yersinia pestis. Antes de proceder a la inoculación de las muestras de aspirado de bubón, sangre, esputo, órganos, el medio debe encontrarse a temperatura ambiente. Con el asa de siembra se realiza la inoculación de la muestra (pequeño inóculo) en un tubo tapa rosca que contenga aproximadamente 10 mL de caldo. Incubar a 37°C durante 24 a 48 horas. Yersinia pestis, tiene un crecimiento típico y característico en el caldo de cultivo. Los organismos crecen como pequeños acúmulos de células dando la apariencia de estalactitas, usualmente, crece en los lados y fondo del tubo; el resto del caldo permanece claro. Después de 24 a 48 horas de incubación, el crecimiento característico es observado si los tubos no se mueven. Si se agita, el crecimiento sedimenta en el fondo. No produce crecimiento turbio. (Ver Foto 11) 6.2.3 AISLAMIENTO A PARTIR DE HEMOCULTIVOS En caso de hemocultivos, el frasco que contiene la muestra del paciente, se deja en incubación a 37°C. Aproximadamente a las 6 horas, se inclina el frasco de tal manera, que la fase líquida bañe la fase sólida por unos minutos. Se vuelve el frasco a su posición vertical y se deja incubar 24 horas. A las 24 horas, se observa si hay crecimiento en la fase sólida, líquida o en ambas. Si no se observa desarrollo a las 24 horas, se inclina el frasco de tal modo que la fase líquida bañe la fase sólida por unos minutos; se vuelve el frasco a su posición vertical y se deja incubando 24 horas más a 37°C. Si se observa presencia de colonias en la fase sólida, se procederá a realizar un frotis para la prueba de Inmunofluorescencia Directa y subcultivarlas en placas de agar sangre al 6% y caldo BHI. 6.3. PRUEBAS DE IDENTIFICACION PRESUNTIVA 6.3.1. PRUEBA DE OXIDASA Sobre un pedazo de papel filtro estéril en una placa de petri, se coloca un extendido del cultivo utilizando un palillo de dientes estéril y sobre el extendido se coloca 2 a 3 gotas de reactivo de oxidasa. La coloración que aparece en 10 segundos, violeta oscura o rosada (dependiendo del reactivo a usarse) indicará un resultado positivo; la ausencia de coloración indicará un resultado negativo característico de Yersinia. Como control positivo de la prueba se utiliza una cepa de Pseudomonas aeruginosa y como control negativo una cepa de Escherichia coli. (Ver Foto 12) 6.3.2. PRUEBA DE CATALASA Sobre una lámina porta-objeto limpia y desengrasada en una placa de petri, se coloca una 31 colonia utilizando el asa de siembra. Inmediatamente, agregar una gota de Peróxido de Hidrógeno al 3%. El burbujeo inmediato indicará un resultado positivo característico de Yersinia. La ausencia de burbujeo indicará un resultado negativo. Como control positivo se utiliza una cepa de Staphylococcus aureus y como control negativo una cepa de Escherichia coli. 6.3.3. MOVILIDAD EN AGAR Es una prueba de identificación presuntiva y se usa para diferenciar la Yersinia pestis (No Móvil) de la Yersinia pseudotuberculosis (Móvil). La muestra apropiada para la realización de esta prueba, es solamente cultivo puro. Con el asa de puntura, coger una colonia de la placa de agar sangre e inocularla sólo en el tercio superior del tubo rosca que contiene el medio de movilidad. Incubar a 37°C durante 24 horas. Para la lectura utilice los siguientes criterios: a. Organismo móvil: Se observa, enturbamiento homogéneo del medio y la puntura de inoculación no es visible. b. Organismo no móvil: No se observa enturbamiento en el medio y la puntura de inoculación es visible. 6.4. PRUEBAS DE IDENTIFICACION CONFIRMATORIA 6.4.1. CARACTERIZACION BIOQUIMICA Se realiza el perfil bioquímico de las colonias sospechosas de ser Yersinia pestís aisladas de cultivo. Para el estudio bioquímico se emplean la fermentación de azúcares y decarboxilación de los aminoácidos, entre otras. Son pruebas de identificación confirmatoria. La muestra apropiada para la realización de estas pruebas es solamente cultivo puro. Aunque Yersinia pestís, bioquímicamente, es notablemente inactivo, se realizan estas pruebas para su diferenciación con Yersinia enterocolítica y Y. pseudotuberculosís. Yersinia pestis es oxidasa negativa, catalasa positiva; fermenta la glucosa, xilosa, manitol y usualmente. maltosa. No fermenta lactosa ni sacarosa. Es indol negativo; reduce nitrato; lisina y omitina decarboxilasa negativa; hidroliza la esculina, no así, la úrea y gelatina. (Ver Tabla 2) Se debe realizar esta prueba, utilizando simultáneamente, controles: - Control Positivo: Cepa avirulenta Yersinia pestís A1122. ç Control Negativo: Yersinia pseudotuberculosís I-A. 32 Fermentación de Azúcares Se preparan los azúcares al 1 % en Caldo de Fermentación con indicador de Andrade. Se siembra en cada uno de los azúcares el cultivo a investigarse y se incuba a 37°C durante 24 horas. La coloración roja indica acidez en el medio (fermentación del azúcar); Yersinia pestis sólo fermenta la glucosa, manitol, xilosa y usualmente mal tosa. La persistencia del color del medio (amarillo) indicará la no fermentación del azúcar; Yersinia pestis no fermenta la lactosa ni sacarosa. (Ver Foto 13). 6.4.2. LISIS POR BACTERIOFAGO Se realiza esta prueba cuando se ha obtenido cultivo puro. Las colonias sospechosas de ser Yersinia pestis deben ser procesadas en dos placas de agar sangre de camero al 6%. Es una prueba de Identificación Confirmatoria. Las células de Yersinia pestis son sensibles a ser lisadas por un bacteriófago específico y esta actividad, es dependiente de la temperatura. El bacteriófago de Y. pestis, específicamente, lisa su célula huésped a temperatura ambiente (2225°C) y a 37°C. Yersinia pseudotuberculosis, es también lisada por el bacteriófago sólo a 37°C. En cada una de las placas de agar sangre, se coloca la tira de papel filtro impregnada con el bacteriófago de Yersinia pestis, se estría el cultivo sospechoso a cada lado de la tira, la estría debe ser delgada, aproximadamente, de 5 mm. Asimismo, se deben estriar los controles, Y. pestis A1l22 (Positivo) y Y. peudotuberculosis I-A (Negativo). Una de las placas, se incuba a 37°C y la otra placa, se deja a temperatura ambiente durante 24 horas. 33 Para la lectura emplee los siguientes criterios: a. Placa de agar sangre incubada a 37°C: Tanto Y. pestis como Y. pseudotuberculosis son lisadas por el bacteriófago a esta temperatura (hay una zona de inhibición del crecimiento cerca a la tira del bacteriófago). b. Placa de agar sangre incubada a temperatura ambiente: Sólo Y. pestis es lisada por el bacteriófago. (Ver Foto 14) Foto 13: Caracterización bioquímica de Yersenia pestis empleando el Sistema API29E, mostrando la diferencia de Y. pestis con otros gérmenes. Foto 14: Lisis de Yersenia pestis por bacteriófago. 34 35 CAPITULO VII TECNICAS DE ELISA La técnica de ELISA, nos permite detectar antígeno (F 1) de Yersinia pestis, así como anticuerpos contra el mismo, en muestras de suero de casos humanos. Prueba que nos permite determinar si se trata de una infección reciente o pasada. 7.1. ELISA PARA DETECCION DE ANTICUERPOS CONTRA Yersinia pestis Esta técnica deberá usarse como prueba complementaria a la técnica de Aglutinación en Látex. Mediante esta técnica se puede detectar Inmunoglobulina G e Inmunoglobulina M, dependiendo de la etapa de la enfermedad. El fundamento de esta prueba se basa en una reacción antígeno-anticuerpo, la cual, puede visualizarse por la interacción existente entre la enzima y el substrato. 7.1.1. Materiales necesarios para esta prueba • • • • • • • • • • Reactivos de ELISA Buffer Carbonato 0.1 M, pH 9.6. Buffer TRIS Salino más Tween 20 (TBSt), 10X. Buffer de Bloqueamiento: Suero Fetal de Ternero al 3% en IX TBSt. Conjugado: Inmunoglobulinas (lgG e IGM) unida a la enzima Fosfatasa Alcalina. Substrato: p-nitrofenilfosfato más Peróxido de Hidrógeno al 30%. Solución de stop: Hidróxido de Sodio 5N. Placas para ELISA de 96 pocillos de fondo plano Inmulon 2 Micropipeta multicanal graduable de 12 canales 50 - 200 uL Micropipeta graduable de un canal 10 - 50 uL Tips (50 - 200 uL)ç Lector de ELISA Lavador de microplacas para ELISA Computadora e impresora Controles: Suero Positivo (1) Suero Negativo (4) 7.1.2. Procedimiento • • • • • • • Sensibilizar los 96 pocillos de la microplaca con 50 uL del stock de la fracción antigénica F 1 (4 mg/mL) diluida en 1 :20 en Buffer Carbonato, pH 9. Dejar en refrigeración (4°C) toda la noche o a 37°C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. . Agregar a cada pocillo, 200 uL del buffer de bloqueamiento. Incubar a 37°C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt Agregar 50 uL de los sueros problema y controles diluidos en 1 X TBST en las siguientes diluciones: 1: 1 00 Y 1: 1 000 (todas por duplicado). Incubar a 37°C durante 1 hora. . Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt Agregar 50 uL del conjugado diluido 1 :2000 en TBSt. Incubar a 37°C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt 36 • • Adicionar 50 uL del substrato e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Adicionar 50 uL de la solución Stop. Leer de inmediato a 405 nm en el lector de ELISA. 7.1.3. Lectura Calcular el promedio de las lecturas de los controles negativo de cada una de las diluciones, con estos cálculos, determinar la desviación estándar y luego multiplicarla por 3 para determinar el cut-off. Toda muestra, cuya lectura sea mayor que el valor obtenido para el cut-off, será considerada como Positiva. El color amarillo significa positividad de la prueba 7.2. ELISA PARA CAPTURA DE IgM ANTI Yersinia pestis Nos permite detectar la infección temprana de la enfermedad, mediante la captura de anticuerpo s IgM contra Yeri;nia pestis. Técnica aplicada a muestras de suero de casos humanos. 7.2.1. Materiales necesarios para esta prueba: - Reactivos de ELISA 37 • • • • • • • Buffer Carbonato 0.1 M, pH 9.6 Buffer TRIS Salino más Tween 20 (TBSt), 10X Buffer de Bloqueamiento: Suero Fetal de Ternero al 3% en IXTBSt Conjugado: Inmunoglobulina (IgM) unida a la enzima Peroxidasa Substrato ABTS: Substrato Peroxidasa y Peróxido de Hidrógeno Solución Stock de la fracción antigénica F 1, 1:200 . Anti -Inmunoglobulina humanaIgM Solución de stop: Acido Sulfúrico 2 M. - Placas para ELISA de 96 pocillos de fondo plano Inmulon 2 Micropipeta multicanal graduable de 12 canales 50 - 200 uL Micropipeta graduable de un canal 10 - 50 uL Tips (50 - 200 uL) Lector de ELISA Lavador de microplacas para ELISA Computadora e impresora Controles: Suero Positivo conteniendo IgM anti Fl (1) Suero Negativo que no tengan Ig M (4) 7.2.2. Procedimiento - - - Sensibilizar los 96 pocillos de la microplaca con 50 uL de anti-inmunoglobulina humana IgM diluida en 1 : 1 00 en Buffer Carbonato. Dejar en refrigeración (4°C) toda la noche ó a 37°C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar a cada pocillo, 200 uL del buffer de bloqueamiento. Incubar a 37°C durante l hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar 50 uL de los sueros problema y controles diluí dos en 1 X TBST en las siguientes diluciones: 1: 10 Y 1: 100 (todas por duplicado). Incubar a 37°C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (Iavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar 50 uL de F1 (20 mglmL) dilúido en 1 X TBSt. Incubar a 37°C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar 50 uL del conjugado diluido 1:4000 en TBSt. Incubar a 37°C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Adicionar 50 uL del substrato e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Adicionar 50 uL de la solución Stop. Leer de inmediato a 405 nm en el lector de ELISA. 7.2.3. Lectura Calcular el promedio de las lecturas de los controles negativos de cada una de las diluciones, con estos cálculos determinar la desviación estándar y luego multiplicarla por 3 para determinar el cut-off. Toda muestra cuya lectura sea mayor que el valor obtenido para el cut-off será considerada como Positiva. 38 El color verde indica positiva de la prueba. 7.3. ELISA PARA CAPTURA DE ANTIGENO (FI) DE Yersinia pestis Técnica que permite dar un diagnóstico temprano de la infección de Peste y para la cual, se utiliza anticuerpos monoclonales que permiten la captura de la fracción antigénica (F 1) de Yersinia pestis. Igualmente, es aplicada a muestras de sueros de casos humanos. 7.3.1. Materiales necesarios para esta prueba Reactivos de ELISA • • • • • • • • Buffer Carbonato 0.1 M, pH 9.6 más lnmunoglobulinas anti F1 Buffer TRIS Salino más Tween 20 (TBSt), 10X Buffer de Bloqueamiento: Suero Fetal de Ternero al 3% en 1X TBSt Proteína «P» purificada FI (Monoclonal) Conjugado: Inmunoglobulinas IgG e IgM unidas a la enzima Fosfatasa A1calina Substrato: p-nitrofenilfosfato más Peróxido de Hidrógeno al 30% Solución Stock de la fracción antigénica FI (4mg/mL) Solución de stop: Hidróxido de Sodio 5N. - Placas para ELISA de 96 pocillos de fondo plano Inmulon 2 Micropipeta multicanal graduable de 12 canales 50 - 200 Ul Micropipeta graduable de un canal 10 - 50 uL - 39 - Tips (50 - 200 uL) Lector de ELISA Lavador de microplacas para ELISA Computadora e impresora Controles: Control Positivo, suero negativo más F1 Control Negativo, sueros negativo Control Inhibición FI, suero negativo diluido 1:50 con Inmunoglobulinas Anti F1 Control Buffer de Inhibición, 1X TBSt diluido 1:50 con Inmunoglobulinas Anti F1 (2) (4) (2) 7.3.2. Procedimiento a. Sensibilización de las placas - - Sensibilizar los 96 pocillos de la microplaca con 50 uL de Inmunoglobulina de conejo anti F1 diluida en 1:2000 en Buffer Carbonato. Dejar en refrigeración (4°C) toda la noche. Lavar la microplaca a 31 ciclos (Iavador de microplacas) con 1 X TBSt Agregar a cada pocillo, 200 uL del buffer de bloqueamiento. Incubar a 37°C durante 1hora. b. Preparación de Controles - Control Positivo Fl: Un suero humano negativo conocjdo (1:10 en IX TBSt). Hacer diluciones en tubos con la solución stock de F I en concentraciones de 10-1 a 10-6: Colocar en cada uno de los seis tubos 0.5 mL del suero negativo 1:10, agregar, al primer tubo 50 uL del stock de F 1 Y mezclar bien por tres veces, de éste, coger 50 uL y agregar al segundo tubo; y así sucesivamente, hasta el sexto, descartando los últimos 50 uL. - Control Inhibición Fl: Un suero humano negativo conocido (1:10) diluidos 1:50 con Inmuno-globulina de Conejo anti FI (Buffer de Inhibición). Hacer diluciones en tubos con la solución stock de FI en concentraciones de 10-1 a 10-6: Colocar en cada uno de los seis tubos 0.5 mL del suero negativo 1:10 con el buffer de inhibición, agregar al primer tubo 50 uL del stock de F1 y mezclar bien por tres veces, de éste coger 50 uL y agregar al segundo tubo y así sucesivamente hasta el sexto, descartando los últimos 50 uL. Agregar 50 uL de los sueros diluidos en cada pocillo de las secciones de la microplaca destinadas tanto al Control Positivo como Control de la Inhibición FI. - Control Suero Positivo: Un suero humano positivo de título conocido. - Control Suero Negativo: Cuatro sueros humanos negativos conocidos. c. Aplicación de muestras e incubación y lavado de las muestras Lavar la microplaca a 31 ciclos (Iavador de microplacas) con IX TBSt. Dividir la placa para cada muestra problema como para los controles negativos en dos columnas de 2 pocillos (4 pocillos por muestra). A los dos pocillos de la primera fila, agregar 50 uL de 1 X TBSt ya los dos pocillos de la segunda fila, 40 agregar 50 uL del Buffer de Inhibición FI, agregar 5 uL del suero a los 4 pocillos (1 : 10). De tal manera, que se tendrá 2 pocillos para detectar la presencia del antígeno F1 y 2 pocillos para la inhibición de FI (verifica especificidad de la prueba). Se pueden trabajar 16 muestras problema por placa. M = Muestra de suero problema - - - Incubar a 37°C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar, 50 uL del monoclonal diluido en TBSt en 1 :2000. Incubar a 37°C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar, 50 uL del conjugado diluído 1 :2000 en TBSt. Incubar a 37°C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Adicionar 50 uL del substrato e incubar a temperatura ambiente duran te 30 minutos. Adicionar 50 uL de la solución Stop. Leer de inmediato a 405 nm en el lector de ELlSA. 41 d. Lectura Calcular el promedio de las lecturas de los controles negativos de cada una de las diluciones. Con estos cálculos determinar la desviación estándar y luego multiplicarla por 3 para determinar el cut-off. Toda muestra, cuya lectura sea mayor que el valor obtenido para el cutoff, será considerada como Positiva. El color amarillo indica positividad de la prueba. 42 CAPITULO VIII INOCULACION EN RATON La inoculación en ratón, es una prueba que se realiza para la recuperación de Yersinia pestis, permitiendo determinar la patogenicidad del agente etiológico. En el laboratorio, la inoculación en ratón, no es un procedimiento de rutina. Sólo se usa cuando se tiene muestras de órganos y/o cultivos contaminados para la recuperación dé Y. pestis, así como para determinar su presencia en las pulgas. 8.1. Muestras apropiadas - Organos contaminados Cultivos contaminados Pulgas 8.2. Materiales necesarios para esta prueba - Yersinia pestis A 1122 (cepa avirulenta) Bioterio Jaulas para ratones Bebedores para ratones Cabina de flujo laminar tipo 2 Ratones de 45 días Jeringa de tuberculina descartable Aguja N° 25 Solución salina estéril Algodón Alcohol de 700 8.3. Procedimiento 8.3.1 Suspensión de la muestra Dependiendo del tipo de muestra, se realiza una suspensión homogénea en solución salina estéril. a. Organos: Homogenizar la muestra con arena estéril, agregándole, suero fisiológico estéril. b. Cultivo Contaminado: Si el cultivo se encuentra en placa de agar sangre, se realiza una suspensión homogénea de las colonias con 1 mL de suero fisiológico estéril. Si el cultivo se encuentra en caldo BHI, tomar 0.1 mL de éste y diluír con 0.9 mL de suero fisiológico estéril. c. Pulgas: Hacer un macerado de las pulgas con arena y suero fisiológico estériles. 8.3.2 Inoculación - En la cabina de flujo laminar, preparar la suspensión a inocular y absorber con la jeringa de tuberculina 0.5 mL de esta suspensión. En el cuarto de inoculación, proceder a la desinfección con alcohol de la parte 43 - abdominal de los ratones a inocular (2 ratones por muestra problema y 2 ratones para la cepa avirulenta). Inocular vía sub-cutánea 0.1 - 0.2 mL de la suspensión homogénea a cada ratón. De igual manera, proceder con los ratones controles. 8.3.3 Observación, Control y Cofirmación - Observar, diariamente, el estado de los ratones inoculados. Deben controlarse durante 21 días después de la inoculación. Entre los primeros tres a cuatro días después de la inoculación, los ratones empiezan a estar moribundos, y finalmente, fallecen por diseminación de la infección. En la cabina de flujo laminar, realizar biopsia de los órganos afectados, hígado y bazo para realizar las pruebas de Inmunofluorescencia Directa, cultivo y pruebas de identificación confirmatoria de Y. pestis. 44 CAPITULO IX NORMAS DE BIOSEGURlDAD El error humano y las prácticas impropias de laboratorio pueden comprometer las mejores medidas de protección, por ello, es indispensable que cada laboratorio adopte un código de prácticas apropiadas a su trabajo y que todo el personal lo observe estrictamente. El personal de laboratorio está expuesto a un mayor riesgo de contaminación que otros trabajadores. La mayoría de las infecciones adquiridas en el laboratorio pueden atribuírse a uno o varios de los siguientes procedimientos peligrosos comunes: - Procedimientos que generan riesgos de inhalación; por ejemplo, al sembrar placas de agar, emplear pipetas, centrifugar, homogenizar, flamear asas, abrir cultivos. Procedimientos que generan riesgos de ingestión; por ejemplo, el pipetear con la boca, manipulación de muestras, hacer frotis y cultivos. Procedimientos relacionados a la eliminación de material infeccioso. El material sospechoso de contener Yersinia pestis, deberá manejarse con gran cuidado usando mandil, guantes y mascarilla, pues gotas minúsculas pueden causar infección por vía respiratoria de otras personas y la propagación de la Peste Neumónica. Todos los procedimientos para el diagnóstico de Peste, deben ser trabajados en cabina de flujo laminar Tipo 2, lo que implica la adopción obligatoria de las siguientes medidas: - - - El personal de laboratorio debe tener una capacitación en las técnicas de laboratorio para el diagnóstico de Peste. No se debe pipetear material infeccioso con la boca (suero, muestras, cultivos ). No se permitirá comer, beber, fumar, almacenar alimentos ni aplicarse productos de tocador en el sector de los trabajos de laboratorio. El laboratorio siempre estará ordenado, limpio y libre de todo el material que no sea pertinente a los trabajos. Las mesas de trabajo serán descontaminadas antes y después de haber procesado las muestras. Todas las personas deberán lavarse antes y después de manipular material infeccioso y también al salir del laboratorio. Todos los procedimientos se realizarán cuidadosamente a fin de reducir al mínimo la formación de aerosoles. Para evitar la formación de éstos, se puede utilizar un frasco de boca ancha conteniendo arena estéril y fenol al 5% o alcohol de 70°. En todos los procedimientos que obliguen al contacto directo con el material infeccioso, el personal de laboratorio, deberá llevar mandil, guantes y mascarilla. Mientras se llevan a cabo los trabajos, las puertas del laboratorio permanecerán cerradas. Cualquier derrame peligroso, accidente o exposición manifiesta o potencial a material infeccioso se notificará al jefe de laboratorio y se procederá a descontaminar el área del accidente de inmediato. El jefe de laboratorio garantizará que solamente tengan acceso al laboratorio las personas a quienes se les han advertido los posibles riesgos y estén debidamente protegidas. 45 CAPITULO X REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. BAHMANYAR M., and CAVANAUGH D. C. (1976). Plague Manual. Organización Mundial de la Salud, Ginebra. 76 pp. 2. CAMPBELL GL and HUGHES 1M. (1995). Plague in India: A new warning from an old Nemésis. Annals ofInternal medicine, 122(2): 151-153. 3. CHU C. M. (1995). Guía para Diagnóstico de Peste (en prensa). Bacterial Zoonoses Branch. Diagnostic and Reference Section. Division ofVectorBorne Infectious Diseases. Centers for Disease Control and Prevention. Fort Collins, Colorado. 4. CLARK W.A., HOLLIS D.G., WEAVER R.E., and RILEY P. (1984). Identification ofunusual pathogenic gram-negative aerobic and facultatively anaerobic bacteria. U.S. Departament of Health and Human Services. Centers for Disease Control, Atlanta. pp: 311-329. 5. LENNETTE E., BALOWS A., and HAUSLER W. (1987). Manual de Microbiología Clínica 4ta. Ed. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, 1370 pp. 6. LYAMUYA E.F., NYANDA P., MOHAMMMED A.H. and MHALU F.S. (1992). Laboratory studies on Yersinia pestis during the 1991 outbreak of Plague in Leshoto, Tanzania. loumal of Tropical Medicine and Hygiene. 95: 335-338. 7. MARSHALL 1.D., MANGIAFICO 1.A., and CAVANAUGH D.C. (1992). Comparison ofthe reliability and sensitivity ofthree serological procedures in detecting antibody to Yersinia pestis. American Society for Microbiology. Aplied Microbiology. 24: 202-204. 8. ORGANlZACION MUNDIAL DE LA SALUD. (1993). Métodos Bási cos de Laboratorio en Bacteriología Clínica.OMS, Ginebra. 50 pp. 9. Plague in India: A new warning from an old Nemesis. Annals ofInternal Medicine. 122 (2) : 151-153. 10. SONNENWIRTH A. and JARETT L. (1983). GRADWOHL Métodos y Diagnósticos del Laboratorio Clínico. 8va. Ed. Editorial Médica Panamericana, México, págs. 1594-1701. 11. WILLIAMS J.E., ARNTZEN L., TYNDAL G.L., and ISAACSON M. (1986). Application of enzyme immunoassays for the confirmation of clinically suspect plague in Namibia, 1982. Bulletin of the World Health Organization; 64 (5): 745-752. 12. WYNGAARDEN J.B. and SMITH Ll. H. (1987). CECIL Tratado de Medicina Interna. 17va. Ed. Nueva Editorial Interamericana, México. Vol. 11, págs. 1786-1789. 46 CAPITULO XI (ANEXOS) 47 ANEXO 1 DEFINICIONES DE CASOS DE PESTE SEGUN EL LABORATORIO Para la definición de casos, por laboratorio, en humanos y especímenes animales se deben tener en cuenta los criterios dados por la Organización Mundial de la Salud: Un caso es diagnosticado como PRESUNTIVO de Peste, si reúne uno o ambos de las siguientes condiciones: - Si las muestras dan resultado positivo a la prueba de Inmunoflurescencia Directa. Si s610 CI1 una muestra de suero, se obtiene por la prueba de Aglulinación por Lálex resultados positivos > 1: 10 para casos humanos y 1: 128 para especímenes animales (Tiras NOBUTO). Un caso es determinado como CONFIRMADO de Peste, si cumple una de las siguientes condiciones: - - Si, además de Inmunofluorescencia Directa Positiva se aisla e identifica Y pestis mediante caracterización bioquímica y lisis por bacteriófago. Si, dos muestras de suero obtenidas en tiempos apropiados, demuestran mediante la prueba de Aglutinación por Látex, una diferencia de cuatro títulos con respecto al título de la primera muestra. En pacientes sin antecedentes de vacunación ni exposición, se obtiene, en una sola muestra de suero, por la prueba de Aglutinación por Látex, resultado positivo con un título> 1: 128. 48 CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA DIRECCION EJECUTIVA DE LABORATORIOS DE REFERENCIA LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL DE PESTE Cápac Yupanqui 1400 Jesús María Lima 11 Telf 471-2529 471-9920 Anexo 43 FAX 471-7443 ANEXO N° 2 FICHA DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE PESTE CODIGO N° .................. NOMBRE: ........................................................................................................................... EDAD:............................................................... ……..............SEXO: M ( ) F ( ) PROCEDENCIA: Dpto: ..................................... ……………..Provincia: ........................ Distrito: .................................. ……………..Caserío:…………….......... DIRECCION: ...................................................... ……….…….Ocupación: ...................... Estado actual: Sano ( ) Fecha de alta:... /.... /..... Fallecido ( ) Enfermo ( ) Fecha inicio sínt. : ....... /..... /..... Fecha de defunción:.... /..... /..... Bubón: SI ( ) NO ( ) Localización:..................... …………….Tamaño: ………………………....... Neumonía: ( ) Septicemia: ( ) Otro: ............................................. Recibió tratamiento: SI ( ) NO ( ) Fecha Inicio: ... /... /... Cuál:.................................................................................................................................... Dosis:........................................................ …..................Tiempo: ....................................... DIAGNOSTICO CLINICO: .............................................................................................................................................. MUESTRA: Aspirado de bubón () Esputo () Hígado () Ganglio Linfático () Fecha de obtención de la muestra:...../ ...../..... Fecha de envío de la muestra:............/ ...../..... Examen solicitado: IFA () Confinnación ( ) Hemocultivo Suero Bazo () () () Cultivo () Serología ( ) Fecha de recepción:..... l ..... l.:... Nombre del remitente: .......................................................................................................... ............................................................. Firma Establecimiento de Salud: .. ................................................................... ……………………...... .................................................................................................................................................. 49 ANEXO 3 SOBRE DE ENVIO DE TIRAS DE NOBUTO (ANIMALES) Código ............................................................................. Fecha de ......../......./......... Animal ....................................................... Colección................................................................. Nombre: ............................................................................................................................................................ ........................................................................................................................................................................... Sexo (M) ( F ) Edad (Joven, adulto) ............................................... PROCEDENCIA Localidad.................................................. Distrito........................................................... Provincia .................................................. Departamento................................................ DESCRIPCION DEL LUGAR .......................................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................................... NOMBRE DEL COLECTOR: Epizootía ( ) DIRECCION : ........................................................................................................................................................................... Ectoparásitos ( ) 50 CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA DlRECCION EJECUTIVA DE LABORATORIOS DE REFERENCIA LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL DE PESTE Cápac Yupanqui 1400 Jesús María Lima 11 Telf 471-2529 471-9920 Anexo 43 FAX 471-7443 ANEXO N° 4 FICHA PARA EL DIAGNOSTICO DE PESTE EN ANIMALES CODIGO N° .......................................................... NOMBRE DEL COLEéTOR :.................................……….FECHA: ….1...l..... PROCEDENCIA: Opto:............................................................ Provincia: .......................................... Localidad..................................................... Caserío:…………………................... Nombre vulgar del animal: ............................................................................................................................. Sexo:............................................................ Peso:................................................... Aspecto del pelamen del cuerpo: Ventral: ............................................................................................. Dorsal: .............................................................................................. Aspecto del pelamen de la cola: Ventral: .............................................................................................. Dorsal: ............................................................................................... Aspecto del pelamen de la cabeza: ............................................................................................................... Biometría: L.O. ................ …mm L.C………………….mm L.P. ................ …mm L.T…………………..mm Condición del espécimen: Vivo ( ) Muerto ( ) Capturado en: Vegetación primaria ( ) Vegetación secundaria ( ) Domicilio ( ) Peridomicilio ( ) Examen clínico: Bubón SI ( ) NO ( ) Localización: ............................................................... MUESTRA: Tamaño: .................................................. Aspirado de bubón ( ) Nódulo linfático ( ) Animal entero ( ) Sangre ( ) Hígado ( ) Bazo ( ) Cráneo ( ) Cultivo ( ) Pulgas ( ) Frotis: Si ( ) No ( ) F. de envío......./...../....... Fecha de obtención de la muestra...... l..... 1..... Fecha de recepción de la muestra ......1 .... 1..... Nombre del remitente: ................................................................................................................................ Firma:........................................................................................................................................................... Nombre del Establecimiento de Salud: ..................................................................................................................................................................................... 51 ANEXO N° 5 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 5.1. MEDIOS DE CULTIVO 5.1.1 MEDIO DE TRANSPORTE DE CARY-BLAIR Ingredientes - Trioglicolato de sodio 1.5 g Fosfato disódico 1.1 g Cloruro de sodio 5.0 g Agar 5.0 g Agua destilada 991.0 mL pH 8.4. Ajustar usando solución de NaOH ION Preparación Disolver los ingredientes en agua destilada en baño María calentando hasta que la solución se aclare (no se deje hervir). Una vez, enfriada la preparación a 50°C, añadir 9 mL de solución de cloruro de calcio al 1% recién preparada y ajustar el pH a 8.4 (con hidróxido de Sodio ION). Distribuir cantidades de 5 mL en tubos limpios y esterilizados de 13x100 con tapa de rosca dejando un pequeño espacio de aire en la parte superior y con las tapas sin enroscar. Esterilizar a vapor fluente durante 15 minutos, dejar enfriar y ajustar las tapas. De no contar con tubos se puede emplear frascos tipo penicilina con tapa de jebe. 5.1.2. MEDIO BIFASICO PARA HEMOCULTIVO CON SPS (RCS) A. Fase Sólida: Agar Infusión Cerebro Corazón o Agar Tripticasa de Soya más 1% Agar - - - - Ingredientes: Infusión de cerebro de ternera Infusión de corazón de vacuno Peptona proteosa Dextrosa Cloruro sódico Fosfato sódico dibásico Agar Agua destilada pH 7.4 0.2 200.0 g 250.0 g 10.0 g 2.0 g 5.0 g 2.5 g 15.0 g 1000.0 mL Preparación Disolver los ingredientes en agua destilada, mezclar hasta obtener una suspensión homogénea. Calentar con agitación continua hasta la ebullición para disolver completamente. Medir pH 7.4 0.2 Repartir 25 mL del medio en frascos de 100 mL ó 15 mL del medio en frascos de 60 mL con tapa de algodón. Autoclavar a 121°C por 15'. Al día siguiente, autoclavar nuevamente a la misma temperatura y tiempo. Inclinar los frascos sobre una de las paredes del frasco y dejar que se solidifique el medio en plano inclinado. 52 B. - Fase Liquida: Caldo Infusión Cerebro Polianetolsulfonato de Sodio (SPS). Corazón, 1% Gelatina y 0.025% Ingredientes: Infusión de cerebro de ternera 200.0 g Infusión de corazón de vacuno Peptona proteosa 250.0 g Dextrosa 10.0 g Cloruro sódico 2.0 g Fosfato sódico dibásico 5.0 g Agua destilada 1000.0 mL pH 7.4 ± 0.2 Preparación - Disolver los ingredientes en agua destilada, mezclar hasta obtener una suspensión homogénea. Disolver al calor a 50°C. Repartir 30 mL ó 20 mL del medio (dependiente de la capacidad de frascos de cultivos a usarse: 100 ó 60 mL) en tubos taparoscade20xl50. MedirpH 7.4 0.2. Autoclavar a 121°C por 15 minutos. - Al día siguiente, autoclavar, nuevamente, a la misma temperarura y tiempo. C. Mezcla de la Fase Sólida y Liquida - Vertir, en forma estéril, la fase líquida en el frasco que contiene la fase sólida. Finalmente, taponar usando tapones de jebe estériles tipo penicilina. El medio bifásico preparado se controla durante una semana a una temperatura de 37°C Y a temperatura ambiente hasta completar 20 días. Al término del control, colocar el precinto al frasco. 5.1.3. AGAR SANGRE AL 6% Ingredientes A. Medio Base: Agar Base de Sangre (BAB) Composición: - Infusión de carne corazón - Triptosa - Cloruro de Sodio - Agar - Agua destilada pH 6.8 ± 0.2 500.0 g 10.0 g 5.0 g 15.0 g 1000.0 mL B. Sangre de cordero desfibrinada 60.0 mL Preparación - - - Suspender 40 g del medio deshidratado en el litro de agua destilada, mezclar bien y calentar agitando, frecuentemente, hasta que hierva durante un minuto para disolver completamente el polvo. El pH final debe ser 7.3 :!: 0.2. Autoclavar a 121°C durante 15 minutos. Cuando el medio se encuentre a una temperatura entre 45-50°C, añadir en forma aséptica 60 mL de sangre desfibrinada de carnero, agitar para obtener una mezcla uniforme y repartir 20 mL en placas petri estériles. Controlar su esterilidad durante 24 horas a 37°C. 53 5.1.4. CALDO INFUSION CEREBRO CORAZON Ingredientes - Infusión de cerebro de ternera - Infusión de corazón de vacuno Peptona proteosa - Dextrosa - Cloruro sódico - Fosfato sódico dibásico - Agua destilada pH 7.4 ± 0.2 200.0 g 250.0 g 10.0 g 2.0 g 5.0 g 2.5 g 1000.0 mL Preparación - - - Suspender 37 gramos del medio deshidratado en el litro de agua destilada, mezclar bien y calentar agitando frecuentemente hasta que hierva durante un minuto para que se disuelva por completo el polvo. El pH final debe ser 7.4:f: 0.2. Distribuir 8 mL del medio en tubos tapa rosca de 16 x 125. Autoclavar a 121°C durante 15 minutos. Controlar la esterilidad del medio durante 24 horas a 37°C. Disolver los ingredientes en el litro de agua destilada, calentar a fuego lento hasta que los ingredientes se disuelvan completamente. - B. Indicador de Andrade al 1% - Ingredientes: Fucsina Acida Hidróxido de Sodio 1 N Agua destilada 5.0 g 160.0 mL 1000.0 mL Preparación Disolver los ingredientes en el litro de agua destilada. Guardar en frasco color ámbar en refrigeración (4°C) hasta el momento de ser usado. 5.1.5. MEDIO DE MOVILIDAD Ingredientes - Extracto de carne Peptona Cloruro de Sodio Agar Agua destilada pH 7.4:f: 0.2 2.0 g 10.0 g 5.0 g 4.0 g 1000.0 mL 54 Preparación Disolver los ingredientes en los 1000 mL de agua destilada, mezclar bien. Calentar y hervir por un minuto. El pH final debe ser 7.4 0.2. Repartir 3 mL del medio preparado tubos tapa rosca de 13 x 100. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. 5.1.6. MEDIO DE FERMENTACION DE AZUCARES A. Caldo Base Ingredientes: Peptona Extracto de carne Cloruro de Sodio Agua destilada - 6.0 g 1.8 g 3.0 g 600.0mL Preparación Disolver los ingredientes en el litro de agua destilada, calentar a fuego lento hasta que los ingredientes se disuelvan completamente. B. Indicador de Andrade al 1 % - Ingredientes: Fuesina Acida Hidroxido de sodio 1N Agua destilada 5.0 g 160.0 mL 1000.0 mL Preparación - Disolver los ingredientes en el litro de agua destilada. Guardar en frasco color ámbar en refrigeración (4º C) hasta el momento de ser usado. C. Azúcares al 1 % Glucosa Maltosa Salicina Lactosa Sacarosa Manitol D. Preparación - Añadir, al caldo base preparado 6 mL del Indicador de Andrade. El medio debe quedar incoloro. El pH del medio debe ser 7.1 - 7.2. Dispensar 100 mL del medio preparado en cada uno de los balones o matraces y añadir l g del azúcar a preparar. Disolver con calor y distribuir 2 mL en tubos de 12 x 75. Autoclavara 121°C por 10 minutos. 55 5.2. REACTIVOS 5.2.1. OXIDASA El reactivo de oxidasa es tóxico y deben tomarse precauciones para proteger la piel del contacto directo. 5.2.1.1 Método 1 Disolver 0.1 g de p-aminodimetilanilina oxalato en 10 mL de agua destilada. Lectura Prueba Positiva: Coloración rosada. 5.2.1.2 Método 2 - Reactivo A: Disolver 0.1 g de Alfa Naftol en 10 mL de alcohol etílico 95°. - Reactivo B: Disolver 0.1 g de p-aminodimetilanilina oxalato en 10 mL de agua destilada. - Lectura Prueba Positiva: Coloración morada. - Los reactivos deben colocarse en frascos color ámbar y guardarse entre 4 y 8 C no más de una semana; por eso, se recomienda no preparar más de 2 mL. 5.2.2. BUFFER FOSFATO SALINO (PBS) Ingredientes - NaCI Na2HP04 KH2P04 Agua destilada 7.65 g 0.724 g 02.1 g 1000.0 mL Preparación - Disolver en el agua destilada los ingredientes. Ajustar pH a 7.2 ± 0.2 con NaOH 1N. 5.2.3. BUFFER FOSFATO SALINO GELATINA Ingredientes A. Solución A - NaH2P04 0.05M Na CI 0.1% Agua destilada 1000 mL pH 6.6 ± 0.2. Ajustar usando solución de NaOH 10N B. Solución B - Gelatina Agua destilada 2% 100 mL 56 Preparación - Mezclar los ingredientes de la solución A y agitar constantemente hasta obtener una solución homogénea. Mezclar los ingredientes de la solución B, disolver con calor y hacer hervir durante un minuto para diluir bien la solución. Mezclar las soluciones A y B, tomando 800 mL de la primera y los 100 mL de la segunda. A esta mezcla adicionar 100 mL de agua destilada. Autoc1avar a 121 DC durante 15 minutos. Repartir el buffer fosfato salino gelatina junto al mechero en frascos de 100 mL con tapa rosca. 5.2.4. BUFFER BORATO Ingredientes Soluciones Stock - Cloruro de Sodio Acido Bórico Hidróxido de Sodio C1Na H3BO3 NaOH 1.5M 0.5M 1.0M (87.66g/L) (30.92g/L) (40.00g/L) Preparación Solución A En un balón de 2000 mL, mezclar 80 mL de CINa 105M, 100 mL de H3B03 O.5M, 24 mL de NaOH 1M y 796 mL de agua destilada, haciendo un volumen de 1000 mL. Solución B (Buffer de ajustamiento) En un balón de 125 mL, mezclar 5 mL de NaCI 1.5 con 70 mL de H3B03 0.5M. A la solución A añadir 2-3 mL de la solución B, mezclar bien. Ajustar pH. Seguir añadiendo la solución B hasta encontrar el pH final (8.0) del buffer. Autoclavar a 121°C durante 15 minutos. Añadir 1 g de NaN3 (Azida de Sodio). Guardar en refrigeración a 4°C. 5.2.5. FENOL ACUOSO AL 5% El ácido fénico es tóxico y deben tomarse precauciones para proteger la piel del contacto directo: - Ingredientes Acido Fénico (cristales) Agua destilada 1Kg 100mL Preparación Solución Stock 57 Al kilogramo del ácido fénico, se agrega 100 mL de agua destilada y se calienta en baño María, obteniéndose 1,100 mL de Fenol Acuoso. Solución de Trabajo Se toma 55 mL de la solución stock de fenol acuoso y se completa con 945 mL de agua destilada, obteniéndose 1000 mL de Fenol Acuoso al 5%. El cual, se conserva en un frasco ámbar. 58 ANOTACIONES …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… 59 Esta publicación se término de imprimir en diciembre de 1997 en los Talleres Gráficos de Art. Lautrec S.R.Llda. Av. Paseo de la República 731 - Lima 13 - Tel/Fax: 4237616 60
