Introducción 1. INTRODUCCIÓN 1 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Introducción 1.1. Los compuestos fenólicos y su actividad funcional antioxidante. Los compuestos fenólicos son un amplio grupo de sustancias con diferentes estructuras químicas y actividad, son constituyentes importantes de las plantas y que a su vez les otorga múltiples efectos benéficos. Están presentes generalmente en forma de glucósidos en los extractos de las frutas, hierbas, vegetales, cereales y otros materiales; lo que ha permitido su utilización por la industria alimentaria no solo por las características organolépticas que le confieren a los alimentos, sino porque retardan la oxidación de los lípidos y mejoran la calidad nutricional de los alimentos. (Muñoz A, Ramos F. 2007). Los compuestos antioxidantes juegan un papel muy importante en los alimentos. La oxidación lipídica es una de las principales causas de deterioro químico, lo que resulta en la rancidez y/o el deterioro de la calidad nutricional, color, sabor y seguridad de los alimentos, los iniciadores para esta oxidación incluyen rayos UV, luz, calor, enzimas, variedades de radicales libres, microorganismos, metales y metalopreoteínas (Albu S. y col., 2004). Además de su papel como estabilizadores de alimentos, pueden proteger las células contra los efectos de los radicales libres y por tanto, tienen un efecto destacado en la prevención de problemas cardíacos, cáncer y otras enfermedades (Suhaj, 2006). Recientes estudios han indicado el mecanismo fundamental del potencial preventivo de algunos compuestos fenólicos, los cuales juegan un rol importante por su actividad antioxidante (Kähkönen y col., 1999) , anti-inflamatoria, aumento del potencial inmune, efecto antihormonas, modificación de enzimas metabolizadoras de drogas, influencia sobre el ciclo celular y diferenciación celular, inducción de apoptosis, supresión y proliferación, angiogénesis, los cuales cumplen roles en la iniciación y modificación del estado secundario del desarrollo neoplásico (Tsuda y col., 2004). La relación estructura-actividad influye decididamente sobre la actividad biológica de los compuestos fenólicos (flavonoles, chalconas, flavonas, flavanonas, isoflavonas, taninos, estilbenos, curcuminoides, ácidos fenólicos, coumarinas, lignanos y quinonas). El número y la posición de grupos hidroxi, la glicosilación y otras substituciones determinan la actividad de secuestro de radicales por los compuestos 2 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Introducción fenólicos. Las diferencias que existen entre la actividad de secuestro de radicales están atribuidas a las diferencias estructurales de hidroxilación, glicosilación y methoxilación. Los extractos de hierbas, especias, y otros materiales vegetales ricos en compuestos fenólicos son de creciente interés en la industria alimentaria porque retardan la degradación oxidativa de los lípidos y por consiguiente, mejoran la calidad y el valor nutricional de los alimentos. Las hierbas se utilizan en muchos dominios, incluyendo la medicina, la nutrición, aromatizantes, bebidas, teñido, repelentes, perfumes, cosméticos (Djeridane A, y col., 2006). 1.2. Plantas Labiadas Las Lamiáceas (Lamiaceae), también llamadas labiadas, son una familia que comprende unos 210 géneros y alrededor de 3.500 especies, perteneciente al orden Lamiales. Tradicionalmente, esta familia era conocida por el nombre de Labiadas, pero siguiendo las recomendaciones del Código de Nomenclatura Botánica, su nombre ha sido substituido por Lamiaceae en alusión al género tipo de la familia: Lamium. Incluye varias especies muy utilizadas como condimento en alimentación, como la menta, albahaca, orégano, mejorana, tomillo y romero. Son hierbas perennes, algunos subarbustos y raramente árboles o trepadoras, que contienen aceites esenciales en todas las partes de la planta. El nombre original de esta familia era labiadas debido a la peculiar forma de la flor (generalmente de color violáceo), 5 pétalos fusionados en forma de boca con un labio superior, generalmente bilobulado y más corto, y uno inferior, trilobulado, los 5 sépalos también están unidos, sus estambres (4) conforman un androceo didínamo (2 estambres más largos y 2 más cortos). Las flores son bisexuales y surgen en ramilletes terminales de 5 ó 6 (a veces más o menos) florecillas cada uno. Los tallos son generalmente cuadrangulares con hojas aovadas, opuestas y decusadas. En el presente estudio se utilizaron tres tipos de plantas labiadas: Romero (Rosmarinus officinalis), albahaca (Ocimum basilicum) y mejorana (Origanum majorana). 3 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Introducción 1.2.1. Romero (Rosmarinus officinalis L.) Romero (Rosmarinus officinalis L.) es una hierba típica de la región y cocina Mediterránea, que se ha estudiado como un producto natural con diversas actividades biológicas tales como: anti-inflamatoria, anti-tumoral, quimiopreventiva, hepatoprotectora, contra la diabetes, antioxidante, anti-proliferativa, antiviral, antimicrobiana, anticonceptiva y antidepresiva, entre otros (Vicente G. y col., 2010). Hojas de romero y extractos de las hojas se utilizan cada vez más como alimento y gracias a su contenido en sustancias antioxidantes se los utiliza para remplazar antioxidantes sintéticos como butilado Hidroxianisol (BHA) y butilhidroxitolueno (BHT) (Etter, 2005). La composición química del aceite esencial de romero varía ampliamente dependiendo de las condiciones agrícolas de cultivo, así como con las técnicas de extracción utilizadas. Las sustancias principales asociadas con la actividad antioxidante son los diterpenos fenólicos tales como: carnosol, rosmanol, ácido carnósico, metil carnosato, y los ácidos fenólicos como los ácidos rosmarínico y cafeico (Ibáñez y col., 2003; Terpenic y col., 2009; Napoli y col., 2010; Zaouali y col., 2010). En particular, el ácido carnósico y carnosol han sido reconocidos como los compuestos antioxidantes más abundantes presentes en los extractos de romero. 1.2.2. Albahaca (Ocimum basilicum) La albahaca Ocimum basilicum es una hierba que se utiliza muy comúnmente como condimento en la comida; también es muy valiosa debido a sus propiedades farmacéuticas, por ejemplo, el aceite volátil producido de sus hojas se utiliza como antioxidante (Harsh y col., 2002). Muchos estudios científicos demostraron que el extracto de albahaca es un fuerte eliminador de radicales y puede considerarse como una buena fuente de antioxidantes naturales (Javanmardi y col., 2003; Lee y col., 2005; Abas y col., 2006). 4 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Introducción Estudios realizados por Javanmardi y col., (2003) sugirieren que el 71% de la capacidad antioxidante de la albahaca no se origina únicamente por los compuestos fenólicos sino que también puede provenir de la presencia de metabolitos secundarios, tales como aceites volátiles, carotenoides, vitaminas y otras sustancias. Jayasinghe y col., (2003) mostraron la existencia de un efecto sinérgico antioxidante en el extracto de albahaca entre el ácido rosmarínico y α-tocoferol. En el trabajo de Yamasaki y col., (1998) se reporta que extractos acuosos de albahaca dulce tienen un efecto anti-VIH. Además estudios realizados por Pérez- Gutiérrez y col., (1992) sugieren que los extractos acuosos de albahaca poseen una acción sobre el sistema cardiovascular y los extractos alcohólicos una actividad similar a la de la atropina. La albahaca (Ocimum basilicum) contiene altos niveles de ácidos fenólicos que contribuyen a su capacidad antioxidante (Javanmardi, Khalighi y col., y Vivanco, 2002, Lee & Scagel, 2009, 2010). Las concentraciones del ácido rosmarínico, en particular se han asociado con las cualidades medicinales de la hierba (Petersen y Simmonds, 2003). El ácido rosmarínico se observa en la literatura como compuesto fenólico prevalente en la albahaca (Javanmardi y col., 2002, Lee & Scagel, 2009), pero otros derivados del ácido cafeico, tal como ácido chicorésico (Lee, 2010; Lee y Scagel, 2009, 2010), también se encuentran en altas concentraciones. La albahaca es conocida por su gran diversidad genética que tienen entre 65 y 150 especies reportadas, que son basadas en variaciones de características morfológicas tales como: hábitat de crecimiento, color de la hoja, el tamaño, la forma y la composición aromática (Kintzios y Makri, 2007). Varios estudios realizados por (Labra y col., (2004); Javanmardi y col., (2002) reportan que existen variaciones en la composición del aceite esencial, compuestos fenólicos y actividad antioxidante entre las distintas variedades de albahaca debido a su diferentes rasgos genéticos. Estudios realizados por Kwee y Niemeyer (2011) demuestran la influencia de los cultivares en la composición fenólica y propiedades antioxidante de 15 cultivares comunes de albahaca (ver Tabla 1). 5 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Introducción Tabla 1. Concentraciones promedio de ácidos fenólicos (mg / g peso seco) en las variedades de albahaca estudiadas. Fuente: Kwee E.M., Niemeyer E.D. Food Chemistry 128 (2011) 1044–1050 1.2.3. Mejorana (Origanum majorana L.) La mejorana aromática comprende varias hierbas que pertenecen a distintas especies, el más conocido es el Origanum majorana L. (syn. Majorana hortensis Moench, M. Vulgaris Miller), nativo del sur de Chipre y Turquía. También se cultiva extensivamente como mejorana dulce, que es una hierba anual, en varias zonas de Europa, Norte de África, América y Asia. Las hojas secas de mejorana dulce son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria como agentes aromatizantes de aderezos, sopas, en la formulación de vermut y amargos, entre otros (Kokkini S. 1993). Desde la antigüedad ha sido conocida la actividad biológica de su aceite esencial en particular sus propiedades antibacterianas, antimicóticas y antioxidantes, por lo que la investigación de la composición y sabor de esta materia prima es de gran interés (Baratta, M y col., 1998). Su aceite esencial y extractos alcohólicos se aplican en productos farmacéuticos, perfumes y los cosméticos (Bauer, Garbe y Surburg, 1990; Price 1995) 6 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Introducción Algunos estudios han demostrado que la composición y aroma puede variar con el origen de las plantas y las condiciones de cultivo (Vera R. y col., 1995). Por ejemplo, algunos aceites esenciales de mejorana se han obtenido con altos contenidos de alcoholes monoterpénicos mientras que en otros los fenoles son los principales constituyentes. En algunos aceites, el componente principal, es el 4-terpineol solo o junto con otros alcoholes monoterpénicos tales como el cis y trans-sabineno hidrato y α-terpineol; timol y carvacol se detrminaron en pequeñas cantidades (Vági E. y col., 2004). El aceite esencial posee propiedades antimicrobianas contra enfermedades transmitidas por bacterias y hongos micotoxigénicos (Baratta y col., 1998; Daferea y col., 2000; Decanos y Svoboda, 1990; Ezzeddine y col., 2001). Según los estudios realizados por Vági y col., (2004) tanto en la extracción alcohólica y supercrítica el componente principal del aceite esencial de mejorana es el 4-terpinenol, además de otros compuestos minoritarios como se muestra en la Tabla 2. Tabla 2. Composición del aceite esencial de mejorana, obtenidos por extracción alcohólica y supercrítica (% área pico analizó por GC y métodos de GC-MS) Fuente: E. Vági y col., Food Research International 38 (2005) 51–57. 7 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Introducción Los extractos etanólicos y supercríticos mostraron una composición similar, aunque en el extracto supercrítico el contenido de 4-terpineol es casi dos veces superior al del extracto etanólico. 1.3. Procedimientos tradicionales e innovadores para la extracción de compuestos fenólicos a partir de plantas labiadas. Actualmente una de líneas más importantes de la investigación en la tecnología de los alimentos es el aislamiento de compuestos naturales con propiedades funcionales a partir de fuentes naturales. Aislamiento de compuestos puros o incluso grupos de compuestos con propiedades terapéuticas, tales como antioxidantes, normalmente se hace por HPLC a escala preparativa (Esaki H., y col., 1998). Las tecnologías tradicionales para la producción de extractos de plantas incluye la extracción sólido-líquido (solid-liquid extraction, SLE), utilizando diferentes tipos de disolventes: variando el disolvente de la extracción de acuerdo a los compuestos que se quiera obtener. Por ejemplo, los carotenoides son fácilmente extraídos por medio de disolventes no polares (hexano, pentano, éter de petróleo) o disolventes moderadamente polares (tetrahidrofurano, diclorometano) incluyendo sus mezclas con disolventes polares tales como alcoholes (Rodríguez-Bernaldo de Quirós y Costa, 2006). Por otro lado, los compuestos fenólicos se extraen generalmente utilizando agua (Bergman y col., 2003) y los lípidos usando etanol o metanol (Maeda y col., 2010). La SLE o lixiviación es un proceso por el cual se extrae uno o varios solutos de un sólido, mediante la utilización de un disolvente líquido. Ambas fases entran en contacto íntimo y el soluto o los solutos pueden difundirse desde el sólido a la fase líquida, lo que produce una separación de los componentes originales del sólido; es una técnica utilizada tradicionalmente para la extracción de determinados compuestos en matrices vegetales, con diferentes tipos de disolventes según la clase de analito que se quiera obtener; por ejemplo en la industria alimenticia las aplicaciones más frecuentes son: extracción de aceites y grasas animales y vegetales, lavado de precipitados, obtención de extractos de materias animales o vegetales, obtención de azúcar, fabricación de té y café instantáneo, entre otras. 8 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Introducción Esta técnica tradicional de extracción tiene ciertos problemas como son lentitud, laboriosidad, empleo de grandes cantidades de disolventes tóxicos, poca selectividad, entre otras; por lo que la creciente demanda de mayor productividad en los laboratorios, análisis más rápidos y métodos más automatizados ha llevado al estudio y creación de nuevas técnicas de extracción que permitan mayor rapidez, eficacia, fiabilidad, sencillas, sin empleo de disolventes tóxicos, etc. El desarrollo de nuevas técnicas de separación para las industrias química y alimentaria ha recibido mucha atención últimamente debido a las nuevas restricciones del Reglamento para el medio ambiente, salud pública y la necesidad de minimizar los costos de energía (Coelho L.A.F. y col., 1996). El uso de disolventes orgánicos para obtener extractos de plantas, además de las dificultades asociadas con la restricción de los mismos para ser utilizados por la industria alimentaria tiene la desventaja de la transformación oxidativa durante la separación del disolvente (S.L. Sebastián y col., 1998). Técnicas de extracción alternativas con mejor selectividad y eficacia son altamente deseadas, con el fin de eliminar o disminuir el uso de disolventes, evitar la degradación o la pérdida de sustancias sensibles, reducir la energía y la mano de obra de los procesos convencionales. La extracción acelerada con disolventes (Accelerated Solvent Extraction, ASE), es una nueva técnica de extracción que usa los disolventes habituales a presiones y temperaturas elevadas, lo que permite extracciones rápidas y efectivas de muestras sólidas; las altas temperaturas producen efectos interesantes como mejor solubilidad de los analitos en líquidos y aumento de las cinéticas de desorción de los compuestos de la matriz. Está basada en una técnica más antigua denominada "soxhlytic extraction" que reduce el consumo de disolvente y el tiempo de preparación de muestra. El disolvente es bombeado hacia un recipiente de extracción que contiene la muestra a extraer. La muestra es calentada y presurizada. El disolvente presurizado se mantiene en forma líquida a una temperatura por encima de su punto de ebullición y así se acelera la cinética de desorción del analito de la matriz de la muestra; tiene varios beneficios como son: ahorro de tiempo: 10-15 minutos es el tiempo típico en realizar una extracción, 9 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Introducción reducción de coste de disolvente: el equipo utiliza alrededor de 15 ml de disolvente por cada gramo de muestra, reducción de disolventes de desechos; principalmente. La extracción asistida con ultrasonidos (Ultrasound Assisted Extraction, UAE) se considera una prometedora tecnología para la industria de procesamiento de alimentos (The Sonochemistry Centre, 2006). Son señales de alta intensidad que se utilizan para modificar un proceso o un producto (Mulet et al., 1999). Con una frecuencia más baja y mayor potencia producen cambios físicos y químicos en el medio a través de la generación y subsiguiente colapso de burbujas de cavitación, las cuales aparecen, crecen y colapsan dentro del líquido. Esto ocurre asimétricamente cerca de las interfases y golpes sobre la superficie sólida. Se requiere de un medio líquido, un generador de energía y un transductor, el cual convierte energía eléctrica, magnética o cinética en energía acústica (Mulet et al., 2003). La ventaja de utilizar ultrasonido en la extracción de plantas ya se ha aplicado a un sin número de compuestos de interés, tanto en la farmacología y la industria alimentaria (Vinatoru y col., 1999 ). La mejora observada en la extracción de compuestos orgánicos por ultrasonido se atribuye a una intensificación de la transferencia de masa, debido al fenómeno de cavitación producido en el disolvente por el paso de una onda ultrasónica o sonora. Las ondas sonoras son ondas de presión que se transmiten a través de un medio material, en ausencia de este es imposible su transmisión. Precisamente por ello las ondas sonoras provocan la contracción y posterior expansión del medio en el cual se propagan. Cuando este medio es un disolvente pueden formarse burbujas o cavidades en el líquido que terminen por explotar en un proceso que se conoce como cavitación. Estas burbujas explotan violentamente produciendo un incremento local de presión y temperatura muy notable que no es perceptible en el sistema como un conjunto debido al pequeño tamaño de las burbujas El ultrasonido también ejerce un efecto mecánico, permitiendo una mayor penetración de disolvente en el cuerpo de la planta. Esto, junto con una mayor transferencia de masa y la ruptura significativa de las células, a través del colapso de cavitación de la burbuja, tiene el efecto de liberar el contenido de las células en el volumen del medio (Albu y col., 2004 ). 10 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Introducción Además puede producir algunos efectos químicos debido a la producción de radicales libres dentro de las burbujas de cavitación. La sonicación de agua resulta en la formación de radicales hidroxilo altamente reactivos que pueden combinarse para formar peróxido de hidrógeno que puede o no ser beneficioso para el proceso de extracción en sí (Paniwnyk y col., 2001). No obstante, otros disolventes como etanol, acetato de etilo o butanona producen menos radicales libres que el agua bajo condiciones similares de sonicación, y ya se ha observado que la extracción de ácido carnósico se mejora significativamente por sonicación (Albu y col., 2004). La extracción con fluidos supercríticos (Supercritical Fluid Extraction, SFE), es una técnica que ha tenido un gran desarrollo en los últimos años en las industrias química, farmacéutica y alimentaria debido a sus numerosas aplicaciones y ventajas. Es una técnica de extracción benigna con el medio ambiente, eficiente para materiales sólidos, elimina el problema del disolvente tóxico residual en los productos, permite el uso temperaturas más bajas que conducen a una menor deterioro de los componentes térmicamente lábiles, retiene las características organolépticas de las materias a partir de especias, entre otras (Simandi, 1998). La SFE es una operación unitaria que aprovecha el poder disolvente de fluidos a temperaturas y presiones por encima de su punto crítico. Un fluido supercrítico es cualquier fluido que a temperatura y presión superior a sus valores críticos tiene propiedades intermedias entre un líquido y un gas; es decir poseen densidades similares a la de los líquidos pero su viscosidad es mucho menor (entre 5 y 20 veces menor), lo que hace que los coeficiente de difusión de los solutos sean mucho mayores que en un disolvente líquido. Es por ello que las extracciones llevadas a cabo con fluidos supercríticos son en primer lugar tan completas como las llevadas a cabo con disolventes líquidos, ya que ambos presentan similares características solvatantes y, en segundo lugar, mucho más rápidas y eficientes, ya que su baja viscosidad favorece los fenómenos de transferencia de materia y la penetrabilidad en los poros de la matriz de la muestra. Entre las tecnologías de procesos innovadores, la extracción con fluidos supercríticos (SFE) es en efecto, la aplicación más ampliamente estudiada; en la práctica la SFE se lleva a cabo generalmente utilizando dióxido de carbono (CO2) por 11 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Introducción varias razones prácticas: tiene moderadamente baja presión crítica (74 bar) y temperatura (32°C), no es tóxico, no inflamable, disponible en alta pureza a un coste relativamente bajo, es reconocido como GRAS (Generally Recognized as Safe), y se elimina fácilmente a partir del extracto. El CO2 supercrítico tiene una polaridad similar al líquido pentano y por lo tanto es adecuado para la extracción de compuestos lipófilos. Por ejemplo, teniendo en cuenta las características lipofílicas de los aceites esenciales de las plantas, por todas estas razones el CO2 es el más utilizado (Fornari T. y col., 2012). Uno de los inconvenientes que presenta el CO2 supercrítico es su baja polaridad lo que dificulta la extracción de solutos polares; para la extracción de esta clase de compuestos se utiliza un cosolvente que es un disolvente orgánico que se añade al fluido supercrítico en pequeñas cantidades (hasta un 10% v/v). Algunos cosolventes utilizados son: dimetil sulfóxido, hexanol, 2-propanol, 2-metoxietanol, agua, ácido fórmico, etc. El parámetro más relevante en el proceso de SFE de la planta matriz es la presión de extracción, que puede ser usada para ajustar la selectividad del disolvente supercrítico. La regla general es: cuanto mayor es la presión, mayor es el poder disolvente y menor es la selectividad de la extracción (B. Simandi y col., 1998). Con respecto a la temperatura de extracción, en el caso de compuestos termolábiles los valores se debe establecer en el intervalo de 35-50°C, en las proximidades del punto crítico, y tan bajo como sea posible para evitar degradación (Fornari T. y col., 2012). Varios estudios reportan el uso del etanol y otros alcoholes de bajo peso molecular en la SFE de plantas y hierbas. En estos casos, los compuestos antioxidantes eran el blanco de estudio. Leal y col., (2008); estudiaron la SFE de albahaca con agua como codisolvente a diferentes concentraciones (1, 10 y 20%); los autores concluyeron que el rendimiento de extracción aumenta a medida que aumenta el porcentaje de cosolventes, con una reducción del contenido de compuestos terpénicos y un aumento del contenido de los ácidos fenólicos en los extractos. Menaker y col., (2004); y Hamburger y col., (2004); también observaron un incremento en el rendimiento de extracción cuando se emplea etanol como codisolvente 12 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Introducción en la SFE de albahaca; se observó una disminución sustancial de los componentes de aceites esenciales cuando aumenta la cantidad del codisolvente y la densidad del CO2, por el contrario el extracto es enriquecido en compuestos de tipo flavonoide. Fornari T. y col., (2012) estudiaron el efecto de etanol como codisolvente en la extracción supercrítica de hojas de romero a diferentes presiones de extracción como se muestra en la Tabla 3. La cantidad de aceite esencial extraído, el cual está representado en la tabla por sus principales constituyentes no se incrementa significativamente cuando el etanol se emplea como codisolvente, aunque si se observa un aumento en la cantidad de ácido carnósico y el carnosol. El principal efecto de emplear etanol como codisolvente en la SFE de romero se observa en la recuperación de sus compuestos fenólicos antioxidantes, pero no en la extracción de sustancias del aceite esencial. Tabla 3. Efecto del cosolvente en la extracción supercrítica de hojas de romero Fuente: Fornari T. y col., Journal of Chromatography A, 1250 (2012) 34–48 13 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Objetivos 2. OBJETIVOS 14 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Objetivos 2.1. Objetivo General • Estudiar el efecto del uso de ultrasonidos como etapa previa a la Extracción con Fluidos Supercríticos de hojas de romero (Rosmarinus officinalis), albahaca (Ocimum basilicum) y mejorana (Origanum majorana), para potenciar la extracción de compuestos fenólicos y minimizar la cantidad de etanol empleada en el proceso. 2.2. Objetivos Específicos • Comparar diferentes técnicas de extracción, en términos de rendimiento, relación etanol/planta utilizada, tiempo de extracción y concentración de compuestos fenólicos obtenidos en los extractos. • Analizar mediante cromatografía de líquidos (HPLC) los extractos obtenidos para identificar y cuantificar los compuestos fenólicos. • Explorar la posibilidad de obtener extractos con altos contenidos de ácido rosmarínico. • Determinar el contenido de polifenoles totales en los extractos obtenidos para valorar la eficacia de las distintas técnicas de extracción. . 15 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Materiales y Métodos 3. MATERIALES Y MÉTODOS 16 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Materiales y Métodos 3.1. Material vegetal Las hojas secas de las plantas labiadas utilizadas en el presente estudio son romero (Rosmarinus officinalis), albahaca (Ocimum basilicum) y mejorana (Origanum majorana), proceden de Herboristería MURCIANA. La molienda de las hierbas se realizó en un molino de cuchillas Grindomix modelo GM200; logrando un diámetro final de partícula homogéneo. 3.2. Productos químicos y reactivos El dióxido de carbono CO2 (N38) utilizado en el presente estudio tiene una pureza de 99,5% en relación (w/w) suministrado a partir de Carburos Metálicos Madrid. El disolvente polar utilizado es el etanol de grado espectroscópico. Los patrones de A. Carnósico (≥ 96%) y carnosol (≥ 98%) fueron adquiridos de Bioquímica de Alexis (Madrid, España). El ácido rosmarínico (97%) proviene de Sigma-Aldrich (Madrid, España). El ácido fosfórico de grado HPLC de Panreac. Acetonitrilo grado HPLC fue del Laboratorio de exploración (Gliwice, Polonia). 3.3. Métodos de Extracción 3.3.1. Extracción sólido-líquido (SLE).- Los experimentos se llevaron a cabo utilizando 1 g de muestra con 100 ml de etanol a 50 º C, presión de 1 bar en un agitador orbital aparato de Stuart S150 durante 24 h. Después de la extracción se separó el disolvente por evaporación bajo vacío usando un rotavapor. Finalmente, el extracto se secó en una corriente de N2 hasta peso constante. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. Las muestras secas obtenidas se almacenaron a 4°C en la oscuridad hasta su análisis. 3.3.2. Extracción acelerada con disolventes (ASE).- Las extracciones se realizaron con etanol como disolvente en un sistema de ASE 350 Dionex Corporation (Sunnyvale, CA, EE.UU.) equipado con una unidad controladora de disolvente. Cada celda de extracción (10 ml de capacidad) se llenó con 1 g de muestra sólida y 1 g de arena de mar como un emparedado, y luego se ubicó en un horno. Posteriormente se llenó la celda con disolvente hasta alcanzar una presión correspondiente a 103 bar y se calentó hasta alcanzar la temperatura deseada. Se 17 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Materiales y Métodos realizaron extracciones estáticas a 150 ºC durante 10 min. Después de la extracción las celdas se lavaron con el disolvente y posteriormente el disolvente se purgó desde la celda utilizando gas N2 hasta que la despresurización completa se llevó a cabo. Los extractos fueron recuperados en viales de vidrio y el disolvente se eliminó por evaporación bajo vacío y se secó en una corriente de N2. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. Las muestras secas se almacenaron a 4ºC en la oscuridad hasta su análisis. 3.3.3. Extracción Asistida con Ultrasonidos (UAE).- Las extracciones se realizaron en un baño de ultrasonidos marca JP Selecta modelo 3000513. Las hojas secas de cada una de las plantas labiadas molidas previamente (5g) se colocaron en un matraz erlenmeyer de 250 cm3; se añaden 100 cm3 de etanol. El matraz y su contenido se sumergieron en un baño de ultrasonidos y se realizó el sonicado durante 5, 15 y 30 min; el rango de temperatura se mantuvo a ≤ 30 0C y presión de 1 bar. Se efectuó la extracción con ultrasonidos con el mismo procedimiento arriba mencionado para la materia prima vegetal remanente (hojas secas de romero, albahaca y mejorana) luego de ser extraída por el procedimiento SFE combinado con ultrasonidos que se describe en la sección 3.3.5. Los extractos obtenidos fueron filtrados al vacío y recuperados en viales de vidrio, el disolvente se eliminó utilizando un rotavapor y se secó en una corriente de N2. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. Las muestras secas se almacenaron a 4ºC en la oscuridad hasta su análisis. 3.3.4. Extracción con fluidos supercríticos (SFE).- Las extracciones con fluidos supercríticos se llevaron a cabo en una planta a escala piloto modelo (Thar Technology, Pittsburgh, PA, USA, model SF2000). La planta tiene una celda de extracción con una capacidad de 2 L y dos separadores diferentes (S1 y S2), cada uno de 0,5 L de capacidad. Todos ellos tienen controladores independientes de presión y temperatura. La celda de extracción tiene una relación altura / diámetro de 5,5 (0,42 m de altura, 0.076 m de diámetro interior). La planta de extracción también incluye un sistema de recirculación en el cual el CO2 se condensa y se bombea hasta la presión de extracción deseada. 18 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Materiales y Métodos Las extracciones se realizaron a una temperatura de 400C y a una presión de 150 bar; el caudal de inyección del CO2 fue de 30 g/min y 60g/min dependiendo del tipo de experimento. El tiempo de extracción para los experimentos fue de 3 horas aproximadamente. Los extractos obtenidos fueron filtrados al vacío y recuperados en viales de vidrio, el disolvente se eliminó utilizando un rotavapor y se secó en una corriente de N2. Las muestras secas se almacenaron a 4ºC en la oscuridad hasta su análisis. 3.3.5. Extracción con fluidos supercríticos combinada con etapa previa de ultrasonidos (US-SFE).- En el caso de la extracción con fluidos supercríticos combinada con ultrasonidos se efectuó una etapa previa a la SFE en donde las hojas secas de romero, albahaca y mejorana previamente molidas, se mezclaron en un vaso de precipitación con etanol en una relación 2:3 (peso de materia prima/ volumen de disolvente); luego se sometió la mezcla a sonicado durante 30 min cuidando que la temperatura del baño se mantenga ≤ 300C; el pastiche obtenido se sometió a SFE a las mismas condiciones arriba mencionadas. 3.3.6. Análisis por HPLC.- La cuantificación de ácido carnósico, carnosol y ácido rosmarínico de los extractos se analizaron empleando un HPLC equipado con un MICROSORB-MV-100, columna C18 (Varian) de 250 mm x 4,6 mm y 5 µm de tamaño de partícula. La fase móvil consistió en acetonitrilo (disolvente A) y 0,1% de ácido fosfórico en agua (disolvente b) aplicando la siguiente gradiente: 0-8 min, 23% A y 825 min, 77% de A. Esta última composición se mantuvo durante 15 minutos y las condiciones iniciales fueron ganadas en 5 min. Tiempo total de análisis fue de 45 minutos. La velocidad de flujo fue constante a 0,7 mL / min. Volumen de inyección fue de 20 µL y la detección se llevó a cabo mediante el uso de una red de diodos de detección del sistema de Varian la misma que almacena la señal a una longitud de onda de 230, 280 y 350 nm. 3.3.7. Estimación del contenido de Polifenoles Totales.- Para esta prueba se utilizó el Método Folin-Ciocalteu que es un método colorimétrico descrito anteriormente por Gao y col., (2000). En tubos de ensayo se mezclan en el siguiente orden 3 ml de H2O Mili Q, 50 µL muestra o patrón y 250 µL de reactivo de Folin19 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Materiales y Métodos Ciocalteu; se incuban a temperatura ambiente durante 3 min. Luego se añade a la mezcla 0,75 ml de Carbonato de sodio al 20% y 0,95 ml de H2O Mili Q; se agita en el vortex y se dejan las muestras en reposo durante dos horas en la oscuridad. La absorbancia del color azul resultante fue medida en un espectrofotómetro a 760 nm. La cuantificación se hace con respecto a las curvas de concentración de ácido gálico; los resultados finales se expresan como mg de ácido gálico / mg muestra. 20 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 21 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión 4.1. RESULTADOS 4.1.1. Análisis comparativo de la eficiencia de la extracción de compuestos fenólicos a partir de hojas de romero (Rosmarinus officinalis), albahaca (Ocimum basilicum) y mejorana (Origanum majorana) utilizando diferentes técnicas de extracción. Las Tablas 4, 5 y 6 muestran el resumen de los resultados obtenidos al aplicar diferentes técnicas de extracción (SLE, ASE y UAE) utilizando etanol como disolvente líquido de extracción para recuperar compuestos fenólicos a partir de hojas de romero, albahaca y mejorana. Algunos resultados corresponden a trabajos previos del grupo de investigación (tal como se indica en las tablas correspondientes) pero se incluyen en esta memoria a efectos de establecer una comparación fundamentada de las diferentes técnicas de extracción. Tabla 4. SLE con etanol a 50°C, a presión ambiente, durante 24 horas. AC: ácido carnósico; CAR: carnosol; AR: ácido rosmarínico. Planta % rendimiento % peso % peso % peso AR total AC extraído (mg / g planta) mg AC / mL etanol mg AR / mL etanol AC CAR Romero 20,66 12,36 1,29 2,43 25,54 0,3 0,05 Albahaca 11,60 - - 1,18 - 0,01 Mejorana 11,90 - - 3,13 - 0,04 Fuente: Datos previos del grupo de investigación. Tabla 5. ASE con etanol a 150°C, a 103 bar y tiempo de extracción 10 min. AC: ácido carnósico; CAR: carnosol; AR: ácido rosmarínico. Planta % rendimiento % peso % peso % peso AR total AC extraído (mg / g planta) mg AC / mL etanol mg AR / mL etanol AC CAR Romero 63,83 4,63 1,29 2,49 29,63 1,5 0,80 Albahaca 14,90 - - 2,88 - 0,22 Mejorana 39,25 - - 5,29 - 1,04 Fuente: Datos previos del grupo de investigación. 22 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión Tabla 6. UAE con etanol a temperatura ≤ 30°C y presión de 1 bar. AC: ácido carnósico; CAR: carnosol; AR: ácido rosmarínico. Planta Tiempo % rend. % peso AC % peso CAR % peso AR mg AC / mL etanol mg AR / mL etanol 5 9 20,44 2,20 1,25 0,92 0,06 15 12,8 18,52 1,76 1,36 1,19 0,09 30 25,6 12,94 0,59 2,09 1,66 0,27 5 1,50 - - 1,66 - 0,01 15 1,84 - - 1,74 - 0,02 30 1,66 - - 1,51 - 0,01 5 2,19 - - 3,89 - 0,04 15 7,12 - - 2,13 - 0,08 30 10,99 - - 1,85 - 0,10 (min) Romero* Albahaca** Mejorana** * Datos previos del grupo de investigación. ** Este trabajo. Las Figuras 1 a 3 muestran los cromatogramas correspondientes al análisis por HPLC de las muestras obtenidas mediante la extracción con ultrasonidos (30 min) de cada una de las plantas estudiadas. Se indica en las correspondientes figuras el pico correspondiente al ácido rosmarínico, uno de los antioxidantes objetivo del estudio de extracción. Asimismo, en los cromatogramas correspondientes a la albahaca y mejorana pueden observarse otros picos importantes, muy posiblemente correspondientes a otros compuestos fenólicos que no ha sido posible identificar en este trabajo. Por esto, se consideró utilizar la determinación del contenido de polifenoles totales como medida de la recuperación de antioxidantes fenólicos en los extractos. Por otro lado, en el cromatograma correspondiente al extracto de romero se indican los picos 23 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión correspondientes a carnosol y ácido carnósico (antioxidantes reconocidos como los mayoritarios). Como puede verse en las tablas, los rendimientos de las extracciones ASE (10 min) son considerablemente mayores que en el caso de la SLE (24 h) o de la UAE (5-30 min). Las altas temperaturas de extracción aplicadas en las extracciones ASE, así como el efecto de la alta presión, incrementa considerablemente la disolución de analitos en el disolvente, cuando se la compara con las extracciones sólido-líquido a presión ambiente o incluso con la extracción asistida por ultrasonidos. Sin embargo, la concentración de los antioxidantes identificados no es mucho mayor en los extractos ASE y, particularmente, es sensiblemente inferior en lo que respecta a la extracción de ácido carnósico del romero. Este hecho puede explicarse en términos de los altos rendimientos obtenidos en las extracciones ASE, lo que implica una importante co-extracción de compuesto no deseados, que puede disminuir la concentración de antioxidantes en el extracto. En cuanto a la extracción de ácido rosmarínico (AR) la extracción ASE es la que produce extractos con mayor concentración (% en peso) de este ácido fenólico. Este resultado, sumado a los altos rendimientos ASE obtenidos, hacen que esta técnica sea la que, indudablemente, permite la mayor recuperación de AR de las plantas estudiadas (tanto por g de planta como por mL de etanol empleado). En cuanto a la variedad de planta, los extractos de mejorana son los que presentan mayor contenido de AR (particularmente en la extracción ASE, dónde se extraen unos 21 mg de AR por gramo de hojas), seguidos de los extractos de romero (16 mg/g) y de albahaca (4 mg/g). En el caso del romero el rendimiento global de extracción UAE a los 30 min, con un total de 25,6%, es el segundo mejor valor luego de la extracción ASE refiriéndose a las técnicas de extracción; en cuanto al % peso de ácido carnósico (AC) se observa que disminuye a mayor tiempo de extracción UAE (20,44% en 5 min y 12,94% en 30 min) y en cuanto a la eficiencia en consumo de etanol el mejor resultado corresponde a la extracción UAE durante 30 min (1,66 mg AC / mL etanol). Los extractos de hojas de albahaca obtenidos por UAE presentan valores de rendimiento de extracción considerablemente inferiores (hasta 10 veces menores) en comparación con las técnicas SLE y ASE. Además, el rendimiento de extracción y el % 24 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión en peso de ácido rosmarínico no se ve afectado al aumentar el tiempo, tal como se observa en las otras dos plantas en estudio; los resultados obtenidos en los tres tiempos 5, 15 y 30 min se mantienen prácticamente constantes y del mismo orden que los obtenidos en los extractos SLE y ASE. Figura 1. Cromatograma del extracto UAE de romero (2.5 mg/ml). Figura 2. Cromatograma del extracto UAE de albahaca (2.5 mg/ml). Figura 3. Cromatograma del extracto UAE de mejorana (2.5 mg/ml). 25 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión La extracción UAE de mejorana presenta el segundo mejor valor en cuanto al rendimiento, con un total de 10,99%. El rendimiento de extracción se incrementa al aumentar el tiempo de experimentación aunque el % peso de AR disminuye; la mayor cantidad de AR se extrae en 30 min con una concentración de 1,85% en peso, lo que equivale a 2 mg AR / g planta (10 veces menor a la recuperada mediante la extracción ASE). Por otro lado, en cuanto a la eficiencia en el uso del disolvente, puede observarse de las Tablas 4, 5 y 6 que las extracciones ASE y UAE son mucho más eficaces por mL de etanol utilizado, con recuperaciones de ácido carnósico del romero unas 3-5 veces mayor que la SLE. La eficiencia del uso del disolvente depende no sólo de la variedad de planta sino también del componente que se desea recuperar. Por ejemplo, en el caso del romero tanto la extracción ASE como UAE producen similar recuperación de AC por mL de etanol consumido (mayor concentración de AC y menor rendimiento en la UAE, resultan en valores similares de mg AC / mL etanol al obtenido en la extracción ASE). En cambio, tal como se mencionó anteriormente, para la recuperación de AR es la extracción ASE la que resulta más eficiente, tanto en el caso del romero como en el de la mejorana y la albahaca. La Tabla 7 muestra los resultados de repetir la extracción con ultrasonidos durante 30 min, pero utilizando como materia prima el material remanente en la celda de extracción, luego de una extracción combinada US-SFE. Estos ensayos se llevaron a cabo puesto que, tal como se explicará luego, se observó que en la extracción combinada US-SFE no era posible extraer ácido rosmarínico. Por lo tanto, se esperaba que al volver a extraer el material ya procesado, se obtendría un extracto con un alto contenido de ácido rosmarínico. Sin embargo, como puede verse en la Tabla 7, la concentración de ácido rosmarínico en los extractos sólo aumenta considerablemente (se duplica) en el caso de la mejorana; para romero y albahaca el %AR se mantiene del mismo orden de magnitud del obtenido en los ensayos UAE utilizando la materia prima vegetal original. Además, se puede observar que en el caso del romero y la mejorana el rendimiento resultante disminuyó, como era de esperar, ya que la materia prima tuvo una etapa previa de extracción; la albahaca, por el contrario, mantuvo porcentajes de rendimiento similares al obtenido cuando se procesa la materia prima vegetal original. 26 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión Tabla 7. UAE con etanol a temperatura ≤ a 30°C y presión de 1 bar del material vegetal previamente extraído por US-SFE. AC: ácido carnósico; CAR: carnosol; AR: ácido rosmarínico. Planta Tiempo % rendimiento (min) % peso % peso % peso AC CAR AR Romero 30 8,55 8,98 1,82 1,63 Albahaca 30 1,64 - - 1,37 Mejorana 30 2,02 - - 3,67 4.1.2. Extracción supercrítica con y sin cosolvente (etanol) de hojas de romero, albahaca y mejorana En cuanto a las extracciones utilizando la tecnología de fluidos supercríticos, los resultados se muestran en las Tablas 8 y 9, correspondientes a la extracción utilizando CO2 puro (Tabla 8) y CO2 con etanol como cosolvente (Tabla 9). Tabla 8. SFE de hojas de romero, albahaca y espinaca a 40°C, 300 bar y 60 g/min de CO2. AC: ácido carnósico. tiempo (min) Rend. % % peso Rend. % % peso S1 AC S2 AC total AC extraído (mg / g planta) Romero 360 4,52 10,89 - - 4,92 Romero* 420 2,83 16,90 1,53 3,12 5,26 Albahaca 300 1,96 Majorana 300 2,03 Planta *SFE con fraccionamiento del extracto en dos separadores en línea. Fuente: Datos previos del grupo de investigación. 27 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión Tabla 9. SFE con etanol como cosolvente a 40°C, 150 bar y 60 g/min de CO2. AC: ácido carnósico. Planta peso materia prima (g) tiempo (min) % etanol cosolvente rend. % % peso AC % peso CAR mg AC / mL etanol Romero 400 210 5,02 7,99 30,64 4,77 12,38 Albahaca 400 210 3,77 3,23 - - - Mejorana 300 190 3,16 2,88 - - - Los resultados de las extracciones SFE con CO2 puro, corresponden a trabajos previos del grupo de investigación, tal como se indica en la correspondiente tabla. Por otro lado, las condiciones seleccionadas para llevar a cabo las extracciones con cosolvente (presión, temperatura, porcentaje de cosolvente) se basan en la experiencia previa del grupo de investigación (Vicente y col., 2012). Las Figuras 4, 5 y 6 corresponden a los cromatogramas obtenidos para los extractos producidos utilizando etanol como cosolvente. Figura 4. Cromatograma del extracto de romero obtenido por SFE con etanol como cosolvente (concentración 2,5 mg/ml). 28 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión Figura 5. Cromatograma del extracto de albahaca obtenido por SFE con etanol como cosolvente (concentración 5 mg/ml). Figura 6. Cromatograma del extracto de mejorana obtenido por SFE con etanol como cosolvente (concentración 5 mg/ml). Tal como se esperaba, la extracción SFE utilizando etanol como cosolvente (en bajas concentraciones, < 5 %) mejora los rendimientos de extracción para todas las plantas estudiadas en comparación con la SFE utilizando CO2 puro. En el caso del romero el rendimiento aumenta un 75%, para la albahaca un 90% y para la mejorana el aumento es del orden de 40%. También, tal como se esperaba, y en base al análisis de la concentración de ácido carnósico en los extractos de romero, puede observarse que el uso de etanol como cosolvente mejora considerablemente la recuperación de antioxidantes: en la extracción SFE sin cosolvente se recuperan unos 5 mg de AC por g de hojas de romero procesadas, mientras que en la extracción SFE con etanol como cosolvente se recuperan casi 25 mg 29 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión de AC por g de hojas. Este valor es del mismo orden que los obtenidos en la extracción ASE y UAE de romero (29-33 mg AC / g planta). Por otro lado, es importante destacar que comparando la eficiencia en términos de cantidad de etanol empleado puede decirse que la SFE con etanol cosolvente logra recuperaciones de AC por mL de etanol mucho mayores que la extracción ASE o UAE (12,38 mg vs.1,5-1,66 mg). Como desventaja, se observa que no ha sido posible extraer ácido rosmarínico de ninguna de las plantas estudiadas mediante la SFE con etanol cosolvente. 4.1.3. SFE de hojas de romero, albahaca y mejorana combinada con una etapa previa de extracción con ultrasonidos (US-SFE) Teniendo en cuenta la alta eficiencia en cuanto al consumo de etanol que presenta la extracción SFE con etanol cosolvente, se investigó el efecto de combinar una etapa previa de sonicación con la posterior extracción por SFE (US-SFE). Estos estudios constituyen una etapa preliminar para preparar la construcción de una celda de extracción de alta presión acoplada a una sonda de generación de utltrasonidos. La Tabla 10 muestra los resultados obtenidos de la extracción combinando una etapa previa de ultrasonidos (30 min con etanol en proporción 2:3 peso planta / mL etanol) seguida de la extracción SFE con CO2 (40°C y 150 bar). Como puede verse en la tabla, esta extracción combinada permitió un aumento importante del rendimiento de extracción de romero y mejorana, aunque no así de la albahaca. La Figura 7 corresponde al cromatograma del extracto de hojas de romero producido utilizando US-SFE, en donde se identifican el ácido carnósico y carnosol. Particularmente, en el caso del romero, se observa una disminución en el % peso de antioxidantes (ácido carnósico y carnosol) pero un aumento de la cantidad de AC recuperado por mL de etanol empleado, cuando se compara la US-SFE con la SFE con etanol. Asimismo, la reducción del flujo de CO2 de 60 g/min a 30 g/min, permitió obtener un extracto de romero con considerablemente mayor rendimiento (15,03% vs. 7.99%) y mejor eficacia en términos de la cantidad de etanol empleada (23,19 mg vs. 12,38 mg AC por mL de etanol empleado), aunque con un contenido de antioxidantes algo menor (25.9% vs. 35.4%). 30 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión Por otro lado, y a pesar de la etapa previa de ultrasonidos, la extracción de ácido rosmarínico no se logró en ninguna de las plantas estudiadas. Evidentemente, es necesario emplear mayores cantidades de cosolvente polar y, posiblemente, mayores densidades de CO2 para recuperar ácido rosmarínico mediante SFE. Tabla 10. Extracción combinada US-SFE. Planta CO2 (g/min) tiempo (min) % etanol en el CO2 rend. % peso % peso CAR mg AC / mL etanol % AC Romero 60 210 3,81 11,48 23,69 2,86 18,12 Romero 30 180 4,44 15,03 23,15 2,70 23,19 Albahaca 60 180 4,44 2,47 - - - Mejorana 60 180 3,33 4,61 - - - Figura 7. Cromatograma del extracto US-SFE de romero (flujo de CO2 30 g/min) (concentración 2,5 mg/ml) 4.1.4. Contenido de polifenoles totales de los extractos obtenidos de romero, albahaca y mejorana con diferentes técnicas de extracción. En las Tablas 11 y 12 se muestra los resultados obtenidos de la prueba de polifenoles totales realizada con el método Folin-Ciocalteu de los extractos obtenidos de las hojas de romero, albahaca y mejorana con las diferentes técnicas de extracción. Para el caso del romero el resultado más alto en concentración de polifenoles totales 31 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión corresponde a la extracción realizada con fluidos supercríticos con etanol como cosolvente (aproximadamente un 5% de etanol) con un valor del 0,25 mg de ácido gálico por mg de muestra; los datos obtenidos para la US-SFE son ligeramente menores. Asimismo, se observa una correlación entre el valor FOLIN resultante y el contenido de antioxidantes determinado para las distintas muestras. Para completar este estudio se determinará la actividad antioxidante de los distintos extractos. Los valores FOLIN obtenidos para las hojas de albahaca son de la misma magnitud tanto en la extracción UAE, SFE con etanol cosolvente y US-SFE. En cambio, para la mejorana el valor más alto corresponde al extracto US-SFE con un total del 0,16 mg de A. gálico / mg muestra. Por otro lado, los valores FOLIN de los extractos de romero son mayores que los de mejorana, y éstos mayores que los de albahaca. Esto concuerda con el orden de actividad antioxidante (romero > mejorana > albahaca) determinada en el grupo de investigación para extractos ASE obtenidos para estas variedades de plantas utilizando distintos disolventes. Nuevamente, se observa que se completará el estudio que se presenta en esta memoria cuantificando por distintos métodos la actividad antioxidante de los extractos obtenidos. Tabla 11. Comparación de polifenoles totales de los extractos de hojas de romero obtenidos por SFE con etanol cosolvente y US-SFE. Planta Romero Técnica Absorbancia a 760nm Concentración mg de A. gálico / mg muestra (FOLIN) % peso antioxidantes (AC + CAR + AR) SFE con etanol cosolvente ( ≈ 5%) 0,903 0,25 35,41 US-SFE caudal CO2 30 g/min 0,687 0,20 26,55 US-SFE caudal CO2 60 g/min 0,731 0,21 25,85 32 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión Tabla 12. Comparación de polifenoles totales de los extractos de hojas de albahaca y mejorana obtenidos por SFE con etanol cosolvente y US-SFE. Técnica Absorbancia a 760nm Concentración mg de A. gálico / mg muestra UAE (30 min) 0,331 0,11 SFE con etanol cosolvente ( ≈ 5%) 0,387 0,12 US-SFE caudal CO2 60g/min 0,357 0,11 UAE (30 min) 0,275 0,09 SFE con etanol cosolvente ( ≈ 5%) 0,412 0,13 US-SFE caudal CO2 60g/min 0,534 0,16 Planta Albahaca Mejorana 4.2. DISCUSIÓN En general, en relación al tipo de técnica, los extractos resultantes de los diferentes métodos con extracción supercrítica tienen siempre rendimientos inferiores en relación a las técnicas de extracción sólido-líquido, ASE y ultrasonidos, para todas las variedades de plantas estudiadas. En cuanto a los rendimientos de extracción de hojas de romero el Gráfico 1 compara los resultados obtenidos para todos los ensayos. El rendimiento ASE es, incuestionablemente superior a todos los demás, con un total de 63,83 %. Analizando los rendimientos donde interviene la extracción supercrítica, la extracción combinada US-SFE es la que presenta los rendimientos más altos. En cuanto a las extracciones de albahaca y mejorana, las conclusiones son similares a las del romero; el rendimiento de extracción de las dos plantas son los más altos para la extracción ASE con valores de 14,9 y 39,25% respectivamente como se muestra en la Gráfico 2. Por otro lado, sólo en el caso de la mejorana la extracción combinada US-SFE presenta mejores rendimientos que la SFE con etanol cosolvente, tal cómo se observó para el romero. Para la extracción de albahaca, la etapa previa de 33 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión ultrasonidos no es capaz de producir un incremento de los rendimientos rendimientos de extracción supercrítica. Gráfico 1. Rendimiento de extracción de hojas de romero (Rosmarinus Rosmarinus officinalis L.) L. con diferentes técnicas de extracción. % Rendimiento de hojas de romero con diferentes técnicas de extracción. US-SFE CO2 30g/min US-SFE CO2 60g/min SFE cosolvente etanol SFE UAE materia remanente UAE (30 min) ASE SLE 0 10 20 30 40 50 60 70 Gráfico 2. Rendimiento de hojas de albahaca (Ocimum basilicum) y mejorana (Origanum majorana) con diferentes técnicas de extracción. % Rendimiento de hojas de albahaca y mejorana con diferentes técnicas de extracción. US-SFE flujo CO2 60g/min SFE cosolvente (etanol) SFE Mejorana UAE materia remanente Albahaca UAE (30 min) ASE SLE 0 5 10 15 20 25 30 35 40 34 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión Con respecto a la recuperación de compuestos fenólicos el Gráfico 3 compara los resultados para el ácido carnósico (AC) en los extractos de romero, y el Gráfico 4 para el ácido rosmarínico (AR) en las tres variedades variedades de planta estudiadas. En el caso de la SLE de romero, el % en peso de AC obtenido tiene un valor intermedio (12,36%) en comparación con el resto de las técnicas de extracción analizadas; pero este porcentaje en relación a la cantidad de etanol empleado presenta el resultado más bajo (0,3 mg AC / mL etanol) como se muestra en el Gráfico 3. Esto significa que la técnica requiere un alto consumo de etanol, con una relación de etanol utilizada en este trabajo de 100 ml / g planta. Los costos adicionales que significan la evaporación y recuperación del disolvente para su reciclado demandan minimizar el consumo de disolvente. En este sentido, con respecto a la recuperación de ácido carnósico del romero, en la extracción ASE se obtuvo un total de 1,5 mg ácido carnósico arnósico / mL etanol (aunque el % peso era tan solo de 4,63%) mejorando considerablemente el consumo de etanol con respecto a la extracción sólido-líquido. sólido Gráfico 3. Concentración y recuperación de ácido carnósico en los extractos de romero obtenidos mediante distintas técnicas de extracción. Concentración de ácido carnósico en extractos de romero de distintas técnicas de extracción. US-SFE SFE (flujo CO2 30g/min) US-SFE SFE (flujo CO2 60g/min) SFE cosolvente (etanol) UAE materia remanente UAE (30 min) ASE SLE 0 5 % peso ácido carnósico 10 15 20 25 30 35 mg ácido carnósico/ml etanol 35 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión En el caso de los resultados obtenidos en la SFE de hojas romero el rendimiento de extracción aumenta significativamente de 4,52% a 7,99% al utilizar etanol como cosolvente. Así, el incremento es alrededor de un 75% en cuanto a los mg ácido carnósico / g planta; los valores han pasado de 4,92 a 24,29 mg/g, es decir, prácticamente se ha quintuplicado el total de ácido carnósico presente en el extracto final. Al combinar la extracción supercrítica con una etapa etapa previa de ultrasonidos (US(US SFE) el aumento de rendimiento es aún mayor, como era de esperar, ya que la técnica de ultrasonidos favorece la liberación de analitos de las células vegetales, tal como se mencionó anteriormente. En este caso los rendimientos son 11,48% y 15,03% para extracciones iones con flujos de CO2 de, respectivamente, 60 y 30 g/ min; es decir una reducción del flujo de CO2 mejoró la recuperación del ácido carnósico de la materia prima. Este resultado puede deberse a una solubilización más lenta del etanol en el CO2 supercrítico ico que, a su vez, favorece la extracción de analitos. Por otro lado, aunque el % en peso de AC es mayor en la SFE con etanol los resultados finales de mg AC / mL etanol son considerablemente mayores mayore para las extracciones US-SFE. Gráfico 4. Concentración de ácido rosmarínico (% en peso) en extractos de romero albahaca y mejorana obtenidos con diferentes técnicas de extracción. Concentración de ácido rosmarínico en extractos de romero, albahaca y mejorana obtenidos con diferentes técnicas de extracción UAE materia remanente UAE (30 min) UAE (5 min) ASE SLE 0 1 Mejorana 2 Albahaca 3 4 5 6 Romero 36 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Resultados y Discusión En cuanto al ácido rosmarínico (AR) la extracción ASE presenta las concentraciones y recuperaciones más altas para las tres plantas analizadas (ver Gráfico 4), con % en peso de AR de 2,49; 2,88 y 5,29 para romero, albahaca y mejorana respectivamente. Teniendo en cuanta el correspondiente rendimiento de extracción esto significa 15,89; 4,29 y 20,76 mg AR / g planta. Este resultado se debe no sólo a la polaridad del disolvente utilizado (que es el mismo que se utilizado en las otras técnicas) sino también a la posibilidad de aplicar altas temperaturas en esta técnica de extracción. Si bien uno de los objetivos planteados en el uso combinado de ultrasonidos con la extracción supercrítica ha sido la recuperación de ácido rosmarínico, en ninguno de los tratamientos donde interviene la SFE fue posible su extracción, por lo que es necesario continuar la investigación analizando otras variables (por ejemplo, mayor cantidad de etanol y/o mayor densidad de CO2) y procedimientos combinados en los métodos de extracción. 37 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Conclusiones 5. CONCLUSIONES 38 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Conclusiones 5. Conclusiones Se ha obtenido resultados positivos en la extracción supercrítica de hojas de romero combinada con una etapa previa de ultrasonidos (US-SFE) en lo que se refiere la optimización de la cantidad de etanol empleada en el proceso, la concentración de antioxidantes en el extracto y el rendimiento de extracción. Los mg de ácido carnósico (AC) extraídos por mL de etanol consumido aumentan en el siguiente orden: 0,3 para la SLE, 1,6 para ASE y UAE, 5,0 para SFE con CO2 puro, 12,4 en la SFE con etanol cosolvente, y 23,2 en la extracción combinada US-SFE. Es decir, la US-SFE duplica prácticamente la recuperación de AC por mL de etanol consumido respecto de la SFE con cosolvente. En cuanto a la concentración de antioxidantes en los extractos de romero, el % en peso de ácido carnósico + carnosol + ácido rosmarínico sigue el siguiente orden: 8,4% en ASE, un 16% en SLE y UAE, 20% en SFE con CO2 puro y fraccionamiento del extracto, 25,9% en US-SFE y 35,4 en SFE con cosolvente. Y los rendimientos globales de extracción: 63,8% para la extracción ASE, 25,6% UAE, 20,7% SLE, 15% US-SFE, 8% SFE con cosolvente y 3% en SFE con CO2 puro y fraccionamiento del extracto. Es decir, el rendimiento US-SFE es el doble que en la SFE con cosolvente y 5 veces mayor que en la SFE con CO2 puro y fraccionamiento del extracto, logrando también un alta concentración de antioxidantes. Evidentemente, la extracción supercrítica es más selectiva que las otras técnicas para la extracción de ácido carnósico del romero y los efectos físicos como turbulencia, aglomeración de partículas y la alteración de la célula que producen los ultrasonidos favorece la liberación de ácido carnósico de la matriz vegetal, que luego es más fácilmente extraído con CO2 supercrítico. También en el caso de la extracción de hojas la mejorana se ha obtenido resultados positivos con la US-SFE. Si bien los rendimientos de las extracciones supercríticas son, en general, mucho menores que los de la extracción ASE, SLE o UAE, se observa en la US-SFE un 39 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Conclusiones incremento del rendimiento de extracción de un 47% referente al rendimiento obtenido en la SFE con etanol cosolvente. Además, los resultados del análisis de polifenoles totales indican que los extractos USSFE son los que tienen mayor contenido de compuestos fenólicos, con un total de 0,16 mg ácido gálico / mg extracto. En el caso de la extracción de hojas de albahaca la US-SFE no produce ventaja alguna frente a las otras técnicas en lo que se refiere a rendimiento o contenido de polifenoles totales. Por el contrario, la US-SFE parece producir una pequeña disminución del rendimiento de extracción respecto de la SFE con cosolvente, y el contenido de polifenoles totales es similar en todos los extractos analizados. La extracción acelerada (ASE) con etanol es la técnica que resulta en la mayor recuperación de ácido rosmarínico para todas las variedades de plantas estudiadas. La extracción supercrítica (SFE) con CO2 puro, o utilizando etanol como cosolvente, o combinada con ultrasonidos, no ha sido capaz de extraer ácido rosmarínico de ninguna de las plantas labiadas estudiadas. Esto puede afectar negativamente la calidad antioxidante de los extractos obtenidos, puesto que el ácido rosmarínico es reconocido como un potente antioxidante. Por esto, para completar este estudio, se llevará a cabo la determinación de la actividad antioxidante de los extractos utilizando distintos métodos de análisis. 40 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Bibliografía 6. BIBLIOGRAFÍA 41 Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico Bibliografía • Abas, F., Lajis, N. H., Israf, D. A., Khozirah, S., & Kalsom, Y. U. (2006). Antioxidant and nitric oxide inhibition activities of selected Malay traditional vegetables. Food Chemistry, 95(4), 566–573. • Aneta Wojdyło, Jan Oszmianski, Renata Czemerys (2007). Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs Food Chemistry 105940–949. • Anna Menaker, Marina Kravets, Mihkel Koel, Anne Orav (2004). Identification and characterization of supercritical fluid extracts from herbs. C. R. Chimie 7 629-633. • Azuola Rocío, Vargas Pedro (2007). 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