ANALISIS CROMATOGRAFO 1

1
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA
METODOS EN BIOTECNOLOGIA
CROMATOGRAFÍA DE GASES
Biol. Laura Patricia Olguín Pérez
Biol. Héctor M. Rodríguez Magadán
8 de Junio de 2004
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CONTENIDO
Antecedentes/Historia
Mecanismos de la cromatografía
Fundamentos teóricos
Nomenclatura
Fase móvil
Puerto de inyección
Horno de la columna
Fase estacionaria
Soporte
Columna cromatográfica
Detectores
1
2
2
5
6
6
7
8
9
10
15
Métodos
Análisis cualitativo
Métodos de coincidencia
20
20
21
Aplicaciones
Comida, saborizantes y fragancias
Químicos y petróleo
Ambientales
Médicas y biológicas
Industria
Otras aplicaciones
Aplicaciones prácticas
Cromatografía de gases como método principal
31
31
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35
35
37
38
38
40
Innovaciones
41
Páginas web
45
Bibliografía
45
1
Antecedentes/Historia
La cromatografía es un método físico de separación en el cual los componentes a ser
separados son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria mientras la otra
se mueve en una dirección definida. Los componentes son separados por sus diferentes
tazas de migración (IUPAC). La cromatografía puede ser clasificada por su utilidad y en
base al material que se utilice como eluyente para separar los solutos. De acuerdo a su
utilidad la cromatografía se clasifica en: analítica, utilizada para determinar los químicos
presentes en una mezcla y en que concentración; y preparativa, utilizada para purificar
grandes cantidades de químicos.
La primera técnica cromatográfica fue ideada por el botánico ruso Mikhail Tswett en 1906,
quien utilizó alúmina para separar los pigmentos coloreados de las hojas de las plantas.
Tswett en su experimento original, metió dentro de un tubo de vidrio un fino polvo
(sacarosa) para producir una columna de una altura deseada. Posteriormente, extrajo los
pigmentos de hojas y los colocó en un solvente (éter de petróleo) y agregó un poco de la
solución dentro de la columna. Cuando toda la solución había pasado a través de la
columna se formó una estrecha zona inicial bajo la capa inicial del adsorbente. Después
agregó más solvente y aplicó presión en la parte de arriba de la columna. Mientras el
solvente iba pasando a través de la columna, los pigmentos se iban separando
individualmente (Fig. 1). La clave del éxito de la columna de Tswett, fue la aplicación de la
mezcla dentro de la columna en una zona inicial estrecha y la posterior aplicación del
solvente fresco.
Fig. 1. Columna cromatográfica de Tsweet3. Y = amarillo, G = verde
2
En 1931, fue redescubierta por Richard Kuhn al utilizarla para el análisis de polienos. Los
primeros en utilizar un gas como fase móvil fueron A. T. James y A. J. Martin en 1952,
para separar ácidos grasos cortos. Posteriormente Dabrio, en 1971, la utilizó para separar
metilaminas, aminas alifáticas y homólogos de piridina.
Mecanismos de la cromatografía
El movimiento de las substancias durante la cromatografía es el resultado de dos fuerzas
oponibles, la fuerza de manejo de la fase móvil y la fuerza resistente o acción de retardo del
sorbente. La fuerza de manejo mueve las substancias del origen de la columna en dirección
del flujo de la fase móvil. La acción de retardo impide el movimiento de las substancias
arrastrándolas del flujo y adhiriéndolas al adsorbente. Las moléculas se encuentran
alternando entre estar pegadas al adsorbente o despegadas en el flujo, esto da como
consecuencia que pese a que el flujo es constante, solo una fracción de las moléculas se
están moviendo. Las substancias que se mueven más lentamente es porque están siendo
unidas más fuertemente a la fase estacionaria, mientras que aquellas que se mueven más
rápidamente es por que son menos solubles o de poca afinidad.
La habilidad de tener una migración diferencial entre los componentes de la mezcla es el
resultado de la selectividad del sistema cromatográfico. El flujo de la fase móvil no es
selectivo en el sentido de que no afecta el movimiento de los solutos. Como parte del
sistema cromatográfico, sin embargo, la fase móvil debe ser un poco selectiva para ayudar a
la absorción de los solutos con la fase estacionaria. La fase estacionaria también juega un
papel importante dentro del cromatograma debido a su acción resistiva como una fuerza
selectiva de la velocidad de flujo de los solutos.
Fundamentos teóricos
Se han propuesto muchas teorías con complejos modelos matemáticos para explicar el
comportamiento de los solutos en las columnas cromatográficas. Las más estudiadas son:
•
•
•
Teoría de las placas teóricas (Martin y Synge)
Teoría cinética (Van Deenter, Zuiderweg, Klinkenberg y Sjenitzer)
Teoría desarrollada para columnas capilares (Golay)
La principal es la teoría de las placas teóricas (theoretical plates theory), la cual plantea
que una columna cromatográfica está constituída por una serie de placas contenidas en la
fase estacionaria. Supone como constante el volumen de la fase estacionaria en cada placa;
que el volumen de fase móvil entre placas es constante; que las dos fases están en equilibrio
en cada placa, y que el valor de coeficiente de distribución es constante e independiente de
la concentración del soluto. Desventaja: además de que se basa en muchas suposiciones, la
principal desventaja es la falta de conexión entre la eficiencia de la columna y las
propiedades fisicoquímicas de la partícula.
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La ecuación de esta teoría1:
N=16(tr/w)2
N= número de placas teóricas, adimensional
tr= tiempo de retención de un compuesto, minutos
w= ancho del pico a media altura, minutos
La teoría cinética considera el comportamiento en un proceso cromatográfico en función de
los factores cinéticos que intervienen:
Variaciones en las velocidades de flujo, debido a las diferentes rutas que puede tomar el
analito durante su migración a través del empaque.
Difusión axial o longitudinal del soluto en la fase móvil.
Resistencia a la transferencia de masas entre la fase móvil y la fase estacionaria.
La ecuación de Van Deemter1:
HETP o H=A+B/u+Cu
HETP o h= altura equivalente a una placa teórica, milímetros.
u= L/ tr aire promedio de la velocidad lineal, cm/seg
A= 2λdp difusión aparente
B= 2γDm coeficiente del término debido a la difusión molecular
C= (8/π)(k’/[1+ k’]2)(df/Ds) coeficiente del término debido a la resistencia a la transferencia de
masas
En la teoría para las columnas capilares se considera que la difusión aparente no contribuye
de manera apreciable al ensanchamiento de los picos en este tipo de columnas. El
coeficiente relacionado con la difusión molecular tiene un valor de uno debido a que la
distancia que recorre la partícula es igual a la longitud de la columna. El término
relacionado con la transferencia de masas viene dado en función del diámetro de la
columna, pues en este tipo de columna es más importante que el tamaño de partícula de
relleno.
La ecuación de esta teoría es un caso particular de la ecuación de la teoría cinética, en este
caso se omite el término A pues su valor es despreciable; se relacionan las magnitudes que
caracterizan la geometría del soporte y el término C se presenta de manera distinta pues en
este tipo de columna es más importante la fase móvil que el tamaño de partícula.
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Circulación del gas portador
La ley de Darcy1 correlaciona la velocidad lineal de un gas que circula por una columna
con el gradiente de presión.
u= - (k/η) (dP/ dz)
u= velocidad lineal en un punto de la columna
z=distancia a la entrada de la columna
η= viscosidad del gas
dP= gradiente de presión de un elemento
dz= longitud de columna
k=constante de permeabilidad.
Las respectivas integraciones de la ecuación permiten obtener una que relaciona el valor de
la presión con la posición de la columna, otra que indica la velocidad media, la
compresibilidad o factor de obstrucción
Coeficiente de reparto (K)
Propiedad termodinámica del sistema soluto-fase estacionaria-fase móvil independiente del
proceso cromatográfico. Concentración de soluto en la fase estacionaria frente a
concentración de soluto en fase móvil a temperatura constante.
Factor de capacidad (k’)
Depende de las propiedades termodinámicas del sistema (K) y además es función de las
características de la columna en particular. Probabilidad de encontrar una molécula
determinada de soluto en la fase estacionaria o en la fase móvil
Relación frontal (Rf)
La relación frontal y el factor de capacidad son dos maneras de medir el mismo fenómeno.
Representa la relación entre las velocidades medias del soluto y la fase móvil en su
recorrido por la columna.
Tiempo muerto ( tm)
Es el tiempo de retención de una sustancia insoluble en la fase estacionaria (K=0).
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Volumen de retención (VR)
Es el volumen de fase móvil necesario para transportar el soluto de un extremo a otro de la
columna. Se denomina volumen de retención neto al volumen verdadero y corregido, el
cual se obtiene a partir de la ecuación que involucra además la compresibilidad del gas
portador. El volumen de retención específico está delimitado por la temperatura.
Retención relativa (rx:p)
Conservan las propiedades del coeficiente de reparto y son fáciles de calcular, su manejo se
dificulta al momento de elegir un patrón adecuado. Se utiliza para disminuir el efecto de
errores, sobre todo, en el conocimiento del peso de la fase estacionaria en la columna.
Resolución
Cada sustancia se desplaza a una velocidad característica dada por el valor de su relación
frontal en dichas condiciones. Altura equivalente a una placa teórica. Por tratarse de un
método donde se separa por elución es mejor referirse a tiempo de elución más que a
distancias recorridas.
Eficacia
Una columna será más eficaz mientras mayor sea el número de placas teóricas que tenga.
Para poder hacer comparaciones entre columnas es necesario establecer condiciones
similares de trabajo.
Nomenclatura
Desde el primer cromatógrafo de Tswett hasta los cromatógrafos de ahora siguen utilizando
la misma nomenclatura para sus componentes:
Un tubo de metal o vidrio se llena con un sólido activo (adsorbente) para formar una
columna cromatográfica. La mezcla a separar es aplicada en una zona inicial y es lavada
con un solvente, líquido de lavado o revelador. La serie de resultados se denomina
cromatograma, y el lavado de la zona inicial para formar el cromatograma es la formación
o desarrollo del mismo.
Cuando el agente a detectar se trata con un agente químico para formar un color, se dice
que la cromatografía está siendo revelada. La combinación del solvente, la mezcla y el
adsorbente son llamados sistema cromatográfico. Cada sistema cromatográfico está
compuesto por una fase móvil (solvente) y una fase estacionaria (la columna).
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Si los componentes de la mezcla son analizados cuantitativamente, recibe el nombre de
evaluación o cuantificación. Si el soluto es separado del adsorbente por lavado antes del
análisis, entonces se le llama elución y al agente a ser analizado se le llama eluyente, al
líquido que sale de la columna se le nombra efluente. Cuando la fase móvil es líquida, la
técnica suele recibir un nombre relacionado con la forma en que se dispone la fase
estacionaria (columna, capa fina, papel, etc.). Existen tres formas de desarrollar este
proceso: elución, análisis frontal y desplazamiento. Cuando la fase móvil es un gas,
solamente se utilizan columnas y el proceso siempre se realiza por elución.
La forma más usual de hacer cromatografía de gases es utilizando un líquido como fase
estacionaria; recibe entonces el nombre de cromatografía gas-líquido (CGL). También se
utilizan absorbentes, dando lugar a la cromatografía gas-sólido (CGS), pero en mucho
menor proporción.
La cromatografía de gases es una técnica analítica que puede ser utilizada para separar
compuestos orgánicos basada en sus volatilidades. También provee información cualitativa
y cuantitativa de los componentes presentes en una mezcla. Los componentes son
separados por sus diferencias de partición entre la fase móvil gaseosa y la fase estacionaria
en la columna, permitiendo que sean separados en tiempo y espacio.
Un cromatógrafo de gases consiste de:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Fase móvil.
Puerto de inyección.
Horno de la columna.
Columnas
Fase estacionaria.
Detector.
Sistema de registro de datos.
Fase móvil (mobile phases)
Gaseosa, líquida o fluido supercrítico (potencia disolvente de los fluidos a temperaturas y
presiones superiores al punto crítico). Estas fases son generalmente gases inertes como
Helio, Argón o Nitrógeno. El gas portador lleva las moléculas del analito a través de la
columna, este movimiento es inhibido por la adsorción que presenta el analito tanto en las
paredes de la columna cuanto en los materiales empaquetados en la misma.
Puerto de inyección (inyection port)
Es un dispositivo que permite la introducción de la muestra en la corriente del gas portador.
Existe cierta variedad de diseños según el tipo de muestra que se trata de analizar. El más
común es el inyector de líquidos, que puede utilizarse para sólidos (en disolución) y gases
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(mediante jeringas especiales). El inyector se trata de una cámara situada a la entrada de la
columna y calentada independientemente de ésta (a temperatura superior del punto de
ebullición del componente más volátil de la muestra, generalmente), que suele tener una
membrana de caucho a través de la cual se introduce la muestra con la ayuda de una
microjeringa hipodérmica.
Inyección de la muestra evaporada e introducirla a la columna a través de un septo de
plástico (estable a la temperatura de inyección, debe ser reemplazado periódicamente).
Temperatura de inyección debe ser de 10° a 50° mayor a la temperatura de la columna.
Jeringas: varios estilos disponibles. Aguja fija, removible. Varios tamaños y ángulos.
Volúmenes de la muestra desde 1 µl, líquidos de 0.1-10 µl y gases 0.5-5 ml. Inyección
rápida para introducirla en una sola descarga y no debe haber aire al momento del llenado.
Precisión de la inyección +/-1%. Incremento de la precisión al utilizar circuitos (gas
sampling loops) y válvulas para introducir cantidades constantes. Equipo no caro y requiere
temperatura constante.
La técnica de inyección de muestra recomendada para líquidos en cromatografía de gases
es el método de flujo del solvente. El solvente puro es introducido a la jeringa seguido de
una bolsa de aire, después se coloca la solución muestra, y finalmente otra bolsa de aire. Se
lee el volumen de la muestra y posteriormente se inyecta al cromatógrafo.
Horno de la columna
En el interior se sitúa la columna, donde se debe tener una buena regulación de la
temperatura. Dentro del horno la columna se conecta en un extremo al puerto de inyección,
y en el otro al detector. La columna debe estar en el centro del horno sin tener contacto con
las paredes (Fig. 2).
Percha de
la columna
Columna de
capilaridad
Fig. 2. Horno con columna capilar.
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Fase estacionaria (stacionary phase)
La fase estacionaria es la encargada de separar los componentes de la muestra. Esta puede
ser un sólido o un líquido, dispuestos sobre un sólido que actúa como soporte (columna). El
sólido de la fase estacionaria puede ser de aluminio, sílica gel, carbón o tierra de diatomeas;
y el líquido de la fase estacionaria debe tener una baja viscosidad y una alta y diferencial
solubilidad. Cuando la fase estacionaria es un sólido, la interacción que puede tener con la
fase móvil se puede clasificar en: Adsorción, intercambio iónico y de filtración sobre geles
porosos. Cuando es un líquido, la interacción con la fase móvil recibe el nombre de reparto,
esta última es la forma más usual de hacer cromatografía de gases.
Para obtener la mejor resolución de dos substancias dentro de la columna, se requiere tener
una fase estacionaria donde su retención relativa sea mayor a la unidad. Esto depende del
punto de ebullición y el coeficiente de actividad de los solutos en dicha fase. De aquí que
en series homólogas el orden de elución sea el de los puntos de ebullición crecientes,
independientemente de la fase empleada, salvo en casos especiales. Por otra parte, dos
sustancias de punto de ebullición idéntico, pero de estructura química diferente, podrán
separarse fácilmente con base en su distinta solubilidad.
Para la elección de la fase estacionaria se deben de tener en cuenta las siguientes
consideraciones:
Los límites de temperatura del líquido elegido, considerando su viscosidad y volatilidad.
Un descenso en la temperatura de la columna aumenta el tiempo de retención de los
solutos y en ocasiones puede mejorar las separaciones. Pero cuando la viscosidad de la fase
estacionaria se hace demasiado alta, o se alcanza el punto de fusión, generalmente la
eficacia de la columna baja enormemente.
La posibilidad de reacciones irreversibles con la columna. Este fenómeno podría impedir el
uso de una fase que para diferentes solutos resultaría excelente. Por ejemplo, los ácidos no
pueden analizarse en fases de carácter básico, ni los aldehídos en THEED (tetrahidroxietiletilendiamina), pues reaccionan para formar acetales, que se quedan en la columna. Con
frecuencia la reacción no ocurre con la fase misma, sino con impurezas en ella.
La fuerza de interacción soluto-solvente que han de influir en los coeficientes de actividad
de los componentes de la mezcla. La elección de la fase se hace teniendo en cuenta la
polaridad de los solutos a separar y de su tiempo de retención en la fase a medida que su
polaridad aumenta.
La elección de la fase estacionaria dependerá no solo de la presencia de polaridad dentro
de los solutos, sino más bien de una visión de conjunto de la mezcla compleja que se desee
separar. Puesto que el grado de separación de dos sustancias depende de sus respectivos
coeficientes de reparto en la fase estacionaria, cada mezcla particular debe tener, al menos
teóricamente, una fase que efectúe la separación mejor que las demás. Dependiendo del
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tipo de material es la temperatura máxima a la que se puede trabajar. Las fases se pueden
clasificar en:
•
No polares: para separar sustancias poco o nada polares. El más utilizado son las
gomas de silicona OV-1, OV-101 o SE-30, para trabajar hasta más de 300ºC donde
se consiguen eficacias de columna extraordinarias.
•
Con carácter ligeramente polar: utilización general, buena selectividad para
mezclas mixtas. Sebacato de dietil (2 etil hexilo), aceite de silicona, gomas de
silicona.
•
De polaridad media o alta: no aptos para hidrocarburos no aromáticos. Aceite de
Ucon LB-550X, polifenil éter, Carbowax 1 540, succinato de butanodiol.
Columnas con fase mixta: para resolución de separaciones parciales con dos o más líquidos.
Posibilidad de separar hasta 50 sustancias mezclando dos, tres y cuatro líquidos para formar
la columna final. Aunque es más laboriosa y poco práctica la representación gráfica esto ha
sido simplificado al utilizar programas computacionales.
Soporte (Support)
La función básica del soporte sólido es sostener la fase estacionaria. El soporte debe de
tener elevada superficie por unidad de volumen, estabilidad térmica, dureza mecánica,
inactividad química y baja resistencia al paso de un gas.
La mayoría está hecho de tierra de diatomeas (diatomita o Kieselguhr), principalmente se
trata de sílice hidratada microamorfa, la calcinación de esta tierra dará lugar a diversos
productos según la forma y temperatura de tratamiento.
Fundente carbonato sódico, productos blancos utilizados para filtración. Celita, Celatom.
Tiene menor actividad superficial residual. El cromosorbo G es utilizado en columnas con
poca fase estacionaria y se obtienen mejores eficacias. El cromosorbo A es utilizado en
escala preparativa.
Sin fundente y a mayor temperatura, productos rosados utilizado para ladrillos refractarios.
Sil-O-Cel, Sterchamol, C-22. Son de mayor superficie y mejor resistencia mecánica, pero
son los que presentan mayor actividad superficial residual.
Todos los soportes porosos tiene cierta actividad residual debida a la presencia de iones
metálicos o defectos de superficie, y a los grupos OH de las moléculas. Esta actividad
modifica el desarrollo normal del cromatograma, por lo tanto este efecto debe ser
disminiudo desactivando el soporte.
Una manera es cubrirlos con la misma fase estacionaria, la cua se adsorbe fuertemente en
estos puntos y el efecto sobre el soluto es menor. También se puede hacer por lavado ácido
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o básico, aunque el sistema más utilizado es hacer reaccionar los grupos hidroxilo de la
superficie del soporte con reactivos adecuados.
El más común es la silanización, en el que se hace reaccionar con dimetil diclorosilano, y
pueden encontrarse comercialmente con el mismo nombre que el material original
(Cromosorbo) o nombres especializados. Aunque para casos extremos pueden presentarse
aún fenómenos de adsorción que se eliminan añadiendo una pequeña cantidad de fase
estacionaria muy polar (Carbowax).
Columna cromatográfica
Las columnas están hechas de cobre, acero inoxidable o tubos de vidrio, dobladas o
enrrolladas. Excepto para las de vidrio, las columnas son empacadas mientras se están
doblando. Las columnas analíticas tienen una longitud de 1-6 m. de longitud y de 2-4 mm.
de diámetro. Según se encuentre en ella distribuida la fase estacionaria y el valor que
alcance la relación de fases se originan los diferentes tipos de columnas. La separación de
la mezcla se realiza dentro de la columna, por lo tanto, es la parte más importante del
cromatógrafo.
La primera columna utilizada fue una de relleno (James & Martin, 1952), posteriormente
fue introducida la columna capilar, siendo así los dos extremos en la gama de columnas
utilizadas en la cromatografía de gases. El criterio para la diferenciación de columnas es
con base en dos propiedades de éstas:
•
Relación de fases: volumen de fase móvil/volumen de fase estacionaria; Vm/Vs
•
Permeabilidad: representada por una constante dependiente de las características
geométricas de la columna; k
Con base en estas dos características se encuentran los siguientes tipos de columnas, en las
que Vm/Vs y k aumetan en orden progresivo1:
1.
2.
3.
4.
Clásicas de relleno
Capilares rellenas
Capilares de capa porosa
Capilares abiertas
La elección de las columnas es lo más crítico, existen dos diferencias fundamentales que
deben ser cosideradas para la elección de la columna: la cantidad de muestra que admiten
(capacidad de carga) y los valores de los flujos del gas portador. La capacidad de carga se
define como la cantidad de muestra que se puede inyectar sin pérdida apreciable de eficacia
y está relacionado con la cantidad de fase estacionaria por unidad de longitud de la
columna.
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Las columnas empaquetadas contienen un soporte sólido inerte con una cubierta delgada de
la fase líquida. El soporte sólido es frecuentemente tierra de diatomeas. La fase líquida
puede tener una viscosidad baja y una alta solubilidad para la mezcla de componentes.
Las columnas de capilaridad originalmente contenían una película del líquido cubriendo la
pared interna de la columna de vidrio o metal. Las columnas de capilaridad ahora contienen
una capa de revestimiento sólido dentro de ella con poro en el centro. Estas columnas son
mejores porque se les puede aplicar una velocidad óptima de flujo más rápida (aprox. de 25 ml por min en lugar de 1 ml por min). Debido a este tipo de columnas, los análisis han
podido ser más sensibles.
La cantidad de muestra que admite una columna capilar sin que sufra sobrecarga es mucho
menor que en una columna clásica. La sobrecarga se alcanza cuando la concentración de
soluto en la fase estacionaria es tan grande que la isoterma de distribución deja de ser
lineal.
1.- Columnas clásicas de relleno
Constituídas por un tubo de metal o vidrio con relleno de soporte granular con la superficie
recubierta por una película de la fase estacionaria.
Longitud 1-10 m
Diámetro interno 2-4 mm hasta 5 cm en escala preparativa
Tamaño de la partícula de relleno diez veces menor que el diámetro del tubo
Capacidad de carga grande
Relación de fases pequeña
Permeablilidad baja
A mayor tamaño de partícula del relleno mayor será su permeabilidad, cuanto más rugosa
sea su superficie mayor capacidad de carga se obtendrá. Por esta razón es el único tipo de
columna que se usa a escala preparativa.
La suspensión del soporte en la disolución de la fase estacionaria debe agitarse
mecánicamente y, si es necesario, calentar ligeramente para evaporar la mayor parte del
solvente. El tubo de la columna debe estar perfectamente limpio, para rellenarlo se debe
introducir un extremo de ésta en el relleno preparado con la ayuda de un embudo, mientras
que por el otro extremo se hace vacío con una bomba. Como tapones es conveniente utilizar
lana de vidrio o cuarzo y una malla metálica fina (Fig. 3).
2.- Columnas capilares rellenas
Se distinguen de las columnas clásicas de relleno por le diámetro interno del tubo, no
excede un milímetro. Además, la relación entre los diámetros del tubo y de la partícula de
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relleno es del orden de tres a cinco veces. Esto hace que sea un relleno más irregular y una
permeabilidad del orden de diez veces superior.
Longitud de 10-50 m.
Diámetro interno de 1 mm.
Tamaño de la partícula de relleno de 3 a 5 veces
Capacidad de carga pequeña
Relación de fases grande
Permeablilidad mayor que las clásicas
Al ser mayor la permeabilidad pueden construirse columnas más largas (10-50 m). Guichon
(1966) y Halasz (1967) han hecho estudios muy detallados de este tipo de columna.
Este tipo de columnas no está comercializado, debido a lo difícil de introducir un soporte en
un tubo capilar metálico de esa longitud. Por el contrario, es más sencillo cuando se trata de
tubos de vidrio. Se rellena un tubo Pyrex con el soporte elegido antes de estirarlo, entonces
al capilar resultante contiene ya el soporte en su interior. La fase estacionaria se introduce
de manera similar a las columnas capilares abiertas (Fig. 3).
3.- Columnas capilares de capa porosa
En este caso el soporte es depositado en la pared interior del tubo, después es recubierto por
la fase estacionaria y la parte central del capilar permanece vacía.
Longitud de 25-200 m
Diámetro interno de 0.1-0.5 mm
Tamaño de la partícula de relleno varía entre el de un soporte clásico y las partículas de
carbono producidas por la pirólisis de una sustancia orgánica.
Permeablilidad valores máximos (al igual que las capilares abiertas)
El procedimiento dependerá de la naturaleza de la columna y del soporte.
Columna metálica: se prepara una suspensión del soporte, se llena la columna con la
suspensión, se cierra un extremo y se evapora el agente dispersante quedando así adheridos
a la pared del capilar.
Columna de vidrio: similar al de columnas capilares rellenas. La diferencia consiste en
introducir una varilla de acero inoxidable un el tubo de vidrio y situar el soporte entre
ambos. Después se procede al estirado manteniendo fija la varilla (Fig. 3).
4.- Columnas capilares abiertas
También conocidas como columnas Golay, quien fue el primero en utilizarla (Golay, 1958).
La fase estacionaria va depositada en la pared interior del tubo que actúa como soporte.
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Longitud hasta 200 m, los más utilizados varían entre 50-100 m
Diámetro interno 0.1-0.5 mm
Capacidad de carga muy pequeña
Relación de fases es la más alta
Debido a la pequeña cantidad de fase estacionaria por unidad de longitud de la columna
tiene una capacidad de carga muy pequeña. Necesita detrectores más sensibles.
La naturaleza del tubo y el procedimiento seguido para su limpieza son de gran importancia
en este tipo de columnas, ya que la pared del mismo sirve como soporte y su capacidad de
retención del solvente influirá notablemente en la uniformidad de la película formada. Uno
de los métodos consiste en llenar el tubo con una disolución diluida de la fase estacionaria
en un disolvente volátil, cerrar un extremo e introducirla en una estufa con una temperatura
superior al punto de ebullición del solvente, la fase quedará depositada sobre la pared del
capilar.
Temperatura programada. Entre homólogos el tiempo de retención aumenta
exponencialmente con el número de carbonos. Conforme aumenta el tiempo de retención,
el ancho aumenta y la altura disminuye haciendo imposible la detección después de que
algunos picos han eluído. Como la solubilidad de un gas en un líquido disminuye conforme
la temperatura se eleva, se puede reducir la retención de un material aumentando la
temperatura de la columna.
Se debe considerar la solubilidad, cambios en la volatilidad y estabilidad de los solutos,
cambios en el flujo y estabilidad de la fase estacionaria. La temperatura debe de estar
dentro de Tmin/Tmax de la columna. Algunos GC permiten programación más compleja
que el simple incremento gradual de la temperatura.
Determinar la temperatura inicial y el tiempo basado en la mejor separación posible de los
primeros picos. Repetir uno para los últimos picos para encontrar la mejor temperatura y
tiempo. Experimentar con varias rampas para el resto de los componentes.
Los flujos del gas portador que se utilizan en columnas capilares suelen ser del orden de
0.5-3 ml/min, mientras que en una columna clásica ascienden a un orden de 30-100 ml/min.
Para poder utilizar la columna capilar con éxito será necesario intoducir entre el inyector y
la columna un dispositivo denominado divisor de flujo, cuya finalidad es permitir la entrada
en la columna de una pequeña fracción solamente del flujo que pasa por el sistema de
inyección. La relación de división (flujo al exterior/flujo que pasa por la columna) suele
oscilar entre 50 y 120. Esto permite disminuir la cantidad de muestra que pasa por la
columna (que queda reducida a la fracción que indica la relación de división) y aumentar la
velocidad lineal del gas portador en el sistema de inyección en la cantidad indicada por la
relación de la división (la difusión molecular en esta parte del instrumento se hace muy
pequeña).
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Entre los factores que disminuyen la eficacia de una columna se encuentran:
•
Longitud de la columna. Limita en cuanto a las velocidades lineales del gas
portador, originando tiempos de análisis muy largos y sin mejorar la resolución.
•
Diámetro de la columna. Más importante en columnas capilares abiertas, por la
resistencia que opone la fase móvil a la transferencia de masas.
•
Tamaño de la partícula de relleno.
•
Naturaleza de las fases. Fase estacionaria: no afecta. Gas portador: viscosidad y
valores del coeficiente de difusión en la fase móvil.
•
Cantidad de fase estacionaria. A menor cantidad mayor eficacia.
•
Temperatura de la columna. Al aumentar esta disminuye la eficacia al afectar
directamente en el coeficiente de reparto.
•
Velocidad del gas portador. Una velocidad elevada es la óptima.
•
Cantidad de muestra inyectada.
Clásica
de
relleno
Capilar de
capa porosa
Capilar
abierta
Tubo
o
Fase estacionaria
Grano de soporte
Fig. 3. Tipos de columnas cromatográficas.
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Detectores
Los detectores son dispositivos que indican y miden los solutos en la corriente del gas
acarreador, convirtiendo una señal no medible directamente en una señal elaborable de
una propiedad física. Esta señal es elaborada por una comparación entre el gas acarreador
puro (blanco) y el mismo gas llevando cada uno de los componentes previamente
separados en la columna, esto es traducido en una señal eléctrica que es amplificada y
registrada al momento de salir de la columna.
Un buen detector es altamente sensible (sensibilidad), tiene una respuesta lineal
(linearidad) sobre un amplio rango de concentración y es relativamente insensible a
variaciones de flujo y temperatura (rango dinámico lineal).
Pueden ser clasificados por:
•
•
•
•
Grado de selectividad: universales que responden a la mayoría de los solutos;
específicos-selectivos con respuesta a un grupo particular de sustancias.
Recuperación de la muestra: en referencia a si la muestra es destruída o no.
Modo de respuesta: dependientes de flujo de masa (cantidad de soluto
independientemente de la cantidad de gas portador); dependientes de concentración
(cantidad de soluto por unidad de volumen de gas portador).
Proceso de detección: ionización; óptico-espectroscópico; electroquímico.
Los detectores más ampliamente utilizados son el detector de conductividad térmica (TCD)
y el detector de ionización de flama (FID).
Detector de conductividad térmica (TCD thermal conductivity detector)
Consiste de dos celdas metálicas idénticas, cada una conteniendo un filamento de alambre
de tungsteno o de tungsteno con lámina de oro. El efluente fluye a través de una celda y el
gas portador (He o H2) fluye a través de la otra. En un lado de la muestra el gas fluye por el
filamento mientras que en el lado de referencia el gas puede pasar sobre el alambre del
filamento y difundir a través de él. Los filamentos son calentados por una corriente
eléctrica. La temperatura del elemento censor depende de la conductividad térmica del gas
que fluye alrededor. Cambios en conductividad térmica, como cuando las moléculas
orgánicas desplazan un poco al gas portador, provocan un incremento en la temperatura del
elemento el cual está siendo monitoreado como un cambio en la resistencia.
Dos pares del TCD son utilizados en cromatógrafos de gases, un par localizado en la salida
de la columna para detectar los componentes separados mientras van saliendo, el otro par
localizados antes del inyector o en una columna de referencia separando las resistencias de
los dos pares y están acomodados en un circuito de puente.
Para un máximo de sensibilidad, la temperatura del filamento es incrementada, la
temperatura y la velocidad del flujo son disminuidas y se escoge un gas con mayor
16
conductividad térmica (la mayoría de los gases orgánicos tienen calores de conductividad
bajos).
Este es un método no destructivo dependiente de concentración, con selectividad universal,
con un límite de detección de ~400 pg/ml de gas portador. Su modo de detección es debido
al cambio de resistencia del cable basado en la termoconductividad del gas cuando fluye a
través de la columna (Fig. 4).
Fig. 4. Detector de conductividad térmica6
Detector de ionización de flama (FID flame ionization detector)
El FID consiste de una flama hidrógeno/aire y una placa colectora. Las muestras que salen
de la columna pasan a través de la flama, la cual rompe las moléculas orgánicas y produce
iones. Los iones son colectados en un electrodo parcial y produce una señal eléctrica. Es
extremadamente sensible en un amplio rango dinámico. La única desventaja es que
destruye la muestra.
La muestra debe ser un combustible, esta entra en la base del detector, se mezcla con el
hidrógeno y entra a la flama. Hay compuestos con poca o sin respuesta al FID, compuesto
como el NH3, CS2, Nox, CO, CO2, O2, H2O, N2, compuestos perhalogenados, etc. La
respuesta está basada en el número de carbonos y otros elementos tales como halógenos y
el oxígeno presentes que reducen la combustión.
17
Este es un método destructivo dependiente de flujo de masa, con selectividad para
compuestos orgánicos, con un límite de detección de ~ 100pg/seg. Su modo de detección
es debido a la producción de iones en una flama resultando en una corriente que puede ser
medida (Fig. 5).
Fig. 5. Detector de ionización de flama6
Detector fotométrico de flama (FPD flame photometric detector)
Es uno de los más usados en los métodos selectivos de cromatografía de gases. El FPD
consiste de una flama reductora que produce especies quimioluminiscentes. Estas especies
emiten una luz característica que es óptimamente filtrada por la longitud de onda deseada,
la cual determina que componentes son los detectados. La luz filtrada es medida por un
fotomultiplicador (PMT) y transducida a una señal. Se puede agregar un segundo
fotomultiplicador, el cual permite una detección simultánea de una segunda señal.
Los filtros para FPD pueden ser seleccionados para diferentes componentes, pero los más
comunes son para la detección de sulfurados y fosforados en mezclas complejas. La
18
selectividad de FPD clásicos (como una porción por peso del carbono) es 105 para
sulfurados y 106 para fosforados.
La cromatografía de gases con FPD puede ser usada para detectar componentes sulfurados
en extractos crudos de aceite y en contaminantes de gas natural. También puede ser
utilizado para detectar pesticidas y herbicidas organofosforados, así como de componentes
sulfurados volátiles en el análisis de alimentos.
Este es un método destructivo dependiente de flujo de masa, con selectividad para S, P, Sn,
B, As, Ge,Se, Cr; con un límite de detección de ~ 100pg/seg. Su modo de detección es
debido a la producción longitudes de onda particulares resultando en una corriente que
puede ser medida.
Fig. 6 Detector fotométrico de flama6
19
Detector de captura de electrones (ECD electron capture detector)
Es altamente sensible a compuestos halogenados y por lo tanto muy útil en la detección de
pesticidas. Da un poco de respuesta a hidrocarburos y otros carbonilos conjugados. Para
este tipo de cromatografía la muestra debe contener una fase gaseosa electrófora. Este es
un sistema donde se detectan partículas ß por absorción de especies que contienen
halógenos, nitrilos, nitratos, organometales y dobles enlaces conjugados. Las partículas ß
son emitidas por una fuente de 63Ni, los electróforos las absorben reduciendo la corriente,
siendo esta la base de la respuesta(Fig. 7).
Fig. 7 Detector de captura de electrones6
Detector de fotoionización (PID photoionization GC detector)
Este tipo de detector es muy selectivo para los compuestos con hidrocarburos aromáticos o
con heteroátomos, los cuales tienen potenciales de ionización. Utiliza luz ultravioleta para
ionizar un analito, la longitud de onda oscila entre 106-150 nm. Los iones producidos son
colectados por electrodos siendo la corriente generada una medida de la concentración del
analito.
Este es un método no destructivo dependiente de concentración, con selectividad para
compuestos alifáticos, aromáticos, heterocíclicos, organosulfurados y algunos
organometálicos, cetonas, ésteres, aldehídos y aminas; con un límite de detección de
~2pg/seg. Su modo de detección es debido a los potenciales de ionización de los
compuestos analizados (Fig. 8).
20
Fig. 8 Detector de fotoionización6
Métodos
Análisis cualitativo
La cromatografía de gases es uno de los métodos físicos de separación más eficaces que se
conocen; cada componente de una muestra suministra tres unidades de información:
posición, altura y anchura de los picos en el cromatograma. La posición, un solo parámetro
expresado cuantitativamente expresado como dato de retención, suministra la información
cualitativa y los otros proporcionan la información cuantitativa.
Para simplificar el problema del análisis cualitativo se supone que el cromatograma se ha
registrado en las condiciones óptimas, los picos están totalmente separados con resolución
superior a la unidad y que cada uno de ellos corresponde a un solo compuesto. En los casos
favorables es posible identificar los componentes por la posición de los picos, pero por lo
general la ambigüedad es tan grande que el analista ha de completar la información con la
obtenida por otros métodos analíticos, siendo preferibles las técnicas multiparamétricas,
como la espectrometría de masas o la espectroscopía de infrarrojo.
21
En la siguiente tabla se resumen los procedimientos utilizados para identificar los picos
cromatográficos. No existe un método general aplicable a todos los problemas prácticos, la
información cromatográfica cualitativa depende del conocimiento previo de la composición
de las muestras y casi siempre se han de combinar varias de las operaciones incluidas en la
tabla para seguir identificaciones fiables. A pesar de los inconvenientes del método, la
cromatografía de gases en combinación con otras técnicas es el instrumento más eficaz
conocido hasta la fecha para determinar la composición cualitativa de mezclas complejas de
compuestos orgánicos.
Tabla. 1 Identificación cualitativa por cromatografía de gases2.
Solamente se estudia la identificación por procedimientos cromatográficos teniendo
siempre en cuenta que se ha de completar, excepto en los casos favorables, por análisis con
otros métodos. Entre los más eficientes están el de pasar directamente los efluentes a un
espectrómetro de masas, o de infrarrojo, colocados a la salida de la columna y el de
condensación y análisis por otras técnicas instrumentales o químicas.
Métodos de coincidencia
El método más simple de identificación cromatográfica consiste en comparar el volumen de
retención de un compuesto problema con el de un patrón, determinado en las mismas
condiciones operativas y en la misma columna. Como estas condiciones son difíciles de
mantener constantes en cromatogramas registrados sucesivamente y todavía más difíciles
en días diferentes, es mejor añadir el patrón como un marcador a la muestra problema y
comprobar si no coincide con alguno de los picos originales. Si por el contrario, aumenta la
22
altura de alguno de ellos, es una evidencia de la coincidencia de los volúmenes de
retención. La respuesta negativa no es ambigua; se puede afirmar que ninguno de los
componentes de la muestra es el patrón. Pero en caso contrario la ambigüedad es muy
grande, sobre todo si se analizan compuestos que no han sido previamente estudiados por
cromatografía de gases.
Al estudiar la probabilidad de que el pico que coincide con el patrón sea el patrón, la
certeza es la identificación de que un pico depende de sustancias eluidas cerca del mismo
con las que puede confundirse. Expresando cuantitativamente esta observación intuitiva se
tiene2:
ρ = h/(V1r-V2r)/δVr
ρ = número total de picos/número total de divisiones
Si se sabe de antemano que la mezcla solamente contiene carbono e hidrógeno, dato
suministrado por el análisis elemental orgánico, h sería el número posible de hidrocarburos
eluidos entre los volúmenes de retención V1r y V2r.
La menor diferencia de volúmenes de retención detectable, δVr al nivel de confianza de 95
% vale 4σVr (σVr es el error típico de las medidas duplicadas del volumen de retención).
En otras palabras si en un cromatograma fuera posible incluir todos los eluyentes posibles
entre V1r y V2r el número de sustancias que dentro del error experimental serían
simultáneamente eluidas sería ρ, o en densidad de los picos. En la práctica la distribución
de picos sigue la distribución de Poisson2.
pn = e-pρn/n!
en la que pn es la probabilidad de encontrar n solutos en el intervalo unitario δVr
Para reducir las identificaciones erróneas a 1 en 1000, solamente serán permisibles 4
eluyentes. Esto significa que en la mayoría de los casos prácticos es imposible la
identificación en éste nivel con una sola columna a partir de los datos de retención. La
única manera de eliminar esta dificultad es reducir ρ, y por tanto, pes. Esto es equivalente a
reducir δVr o h. La primera alternativa implica mejorar la precisión de las determinaciones
de rutina de las medidas de retención a un nivel superior al 1%, muy difícil de conseguir en
la practica. Por otra parte, es posible reducir fácilmente ρ por medio de otro tipo de
información, análisis elemental, técnicas instrumentales o separación en otras columnas
cromatográficas. Son evidentes las razones de la separación en varias columnas, pero una
discusión semicuantitativa aclara las limitaciones del tratamiento estadístico.
23
La probabilidad que se eluyan simultáneamente picos conteniendo más de un componente
en dos columnas diferentes A y B está dada por2:
pesA+B = pesA*pesB
como pesB <1 se deduce que pesA+B < pesA; y por ello la separación en dos columnas ha
reducido la probabilidad de identificación errónea debida a la elución simultánea.
Siguiendo este procedimiento y separando en suficiente número de columnas es posible
reducir pes a un valor muy pequeño. Sin embargo, para que se cumpla el procedimiento
estadístico la distribución de los eluyentes ha de ser aleatoria, no será válido el
razonamiento si el volumen de retención en la columna A está relacionado con el de la
columna B. Por lo tanto, el empleo de varias columnas reduce la probabilidad de
identificación errónea, más marcadamente cuando las columnas tienen comportamiento
muy diferente.
Retención relativa
Los volúmenes de retención dependen de un gran número de variables operativas, debido a
esto es difícil conseguir respuesta idéntica aún en columnas preparadas en las mismas
condiciones; por lo tanto, para identificar sustancias a partir de datos bibliográficos se han
de expresar las retenciones como variables reproducibles por diferentes equipos e
investigadores.
Se han utilizado dos procedimientos generales:
a) Cálculo de los volúmenes de retención específicos
b) Determinación de retenciones relativas a patrones
Es difícil determinar rutinariamente el volumen de retención específico porque se necesita
conocer con exactitud el peso de la fase estacionaria de la columna. En la práctica del
análisis cualitativo se emplea corrientemente la retención relativa. Los componentes y el
patrón han de registrarse en el mismo cromatograma. El cálculo es muy sencillo, se limita a
la realización de dos medidas de distancia, una desde el máximo del pico del problema al
pico del aire, y otra entre los máximos del patrón y el aire. La retención relativa de un
compuesto es independiente de la longitud de la columna, del flujo del gas portador y de la
cantidad de fase estacionaria; dependiendo solamente de la temperatura de separación y de
la naturaleza de la fase estacionaria.
Un inconveniente de la identificación por retenciones relativas es el gran número de
sustancias empleadas como referencia, que hace difícil determinar la coincidencia de los
datos publicados por diferentes autores. Es casi imposible en la práctica fijar un solo patrón
24
de referencia y su selección queda a disposición del especialista, por lo que existe gran
número de datos de poca aplicación a problemas particulares.
Optimización de flujos en capilaridad split/splitless en cromatografía de gases
Por definición estándar, una cromatografía de gases es optimizada cuando la sensibilidad y
resolución de una mezcla compleja es activado en el menor tiempo posible. Una
cromatografía de gases optimizada que está bien calibrada cuando 1) las soluciones
estándar de diferentes concentraciones son lineales, 2) los estándares a las mismas
concentraciones se reproducen en un periodo de tiempo específico y 3) bajos niveles de
concentración de picos tempranos y tardíos, acompañados con el menor ruido, son
indicativos de una cromatografía bien calibrada. Si alguno de los criterios antes
mencionados no se completan, todo debe ser repetido.
Un sistema optimizado es muy difícil de mantener. Un cambio directo en el flujo, puede
modificar completamente la forma de los picos y alterar toda la eficiencia de la columna.
Complicaciones mayores se obtienen cuando se utiliza un sistema de dos columnas y una
de ellas afecta el funcionamiento de la otra. Desafortunadamente, esto frecuentemente
aumenta el tiempo de análisis. La dificultad con la optimización es que esto involucra
muchas variables: 1) parámetros fijados como la longitud de la columna, diámetro interno,
y capacidad de adhesión de la película; 2) parámetros operacionales como la temperatura de
la columna, acarreador y flujo de gas, o los modos de inyección.
Optimización del flujo acarreador para mejorar la resolución de la columna
La resolución y separación de los picos son dos de los factores más importantes para la
resolución de la columna. Resolución es la capacidad de la columna para separar dos picos
adyacentes, dependientes de la selectividad y eficiencia. La eficiencia es la relación entre la
longitud del tiempo que gasta el soluto en salir de la columna y la anchura del pico sobre la
elución. Esto es determinado por el número efectivo de placas teóricas las cuales son
secciones ideales de la columna donde los solutos se equilibran entre la fase estacionaria
líquida y la fase gaseosa móvil. Expresado como4:
N = 5,54 [(tr-to)/w1/2] 2
Donde tr es el tiempo de retención del soluto, to es el tiempo de retención de una sustancia
sin retención o tiempo de volumen muerto, y w1/2 es el ancho del pico del soluto.
Un valor alto de N indica una gran capacidad de retención del soluto de la fase estacionaria
y una gran eficiencia de la columna. La presencia de un volumen muerto grande (to)
esconde la eficiencia de la columna pero puede ser reducido incrementando la velocidad
lineal del flujo del gas acarreador. La asociación entre la velocidad lineal y eficiencia de
25
columnas de capilaridad puede ser ilustrado más claramente sustituyendo la altura
equivalente a una placa teórica (H) por número efectivo de placas teóricas (N). En este
modelo, (N) está relacionado a la longitud de la columna (L) de acuerdo a H (HETP) =
L/N. La figura 9 muestra (H) como una función de la velocidad promedio (u) donde Hmin
y umin están bajo condiciones de flujo optimizados.
Fig. 9 Punto general de Van Deemter4.
Para disminuir la viscosidad e incrementar la eficiencia de la columna, se debe seleccionar
una velocidad de flujo lineal. En este valor, el tiempo de corrida es el más corto con una
muy baja pérdida de eficiencia. De acuerdo a umin la eficiencia máxima es obtenida pero
solo gastando mayor tiempo de corrida. La velocidades bajo umin caen en la parte de la
curva donde la eficiencia y el tiempo de corrida son los peores. En general, todos los
solutos se optimizan en algunos puntos directamente sobre umin pero moléculas grandes se
optimizan en velocidades más bajas que moléculas pequeñas.
El grado en el cual la velocidad lineal puede mejorar el comportamiento de la columna
cuando la programación de la temperatura es específica al gas acarreador como se muestra
en la figura 10. Claramente, el hidrógeno es la mejor elección para obtener la separación
más grande en el periodo de tiempo más corto debido a su menor viscosidad que otros
gases en temperaturas más altas. El helio, es una elección más práctica porque no se
necesitan precauciones de ventilaciones.
26
.
Fig.10 Efectos de usar diferentes gases acarreadores en el punto Van Deemeter4.
Antes de marcar el uso de flujo de acarreadores, se ajusta la fuente del acarreador que es
por lo menos 20 psi más grande que la presión de la cabeza de la columna. Esto es para
minimizar la resistencia del flujo de la columna para suplementar líneas y garantizar una
velocidad de flujo volumétrico constante entre el inyector, la columna y el detector. Para
medir la velocidad lineal, se inyecta una sustancia no retenible a la temperatura donde hay
mayor elución. Si a esto se le optimiza la temperatura, estará arriba del 50 % de la
eficiencia que puede ser perdida cuando se hacen rangos de 50 hasta 200 ºC. La velocidad
lineal es calculada usando la siguiente ecuación y entonces un valor promedio se obtiene de
un mínimo de tres mediciones4. Cuando la velocidad lineal se optimiza para el helio será
aproximadamente 21-40 cm/seg y para el hidrógeno de 50-80 cm/seg.
U (cm/seg) = longitud de la columna/RT del pico de lo no retenido
Es importante considerar el disfraz de la velocidad del flujo de gas cuando se optimiza la
velocidad lineal del acarreador, especialmente desde que el disfraz afecta la forma del pico,
linearidad y reproducibilidad. Esto podría ser porque la velocidad es optimizada pero no
parece ser porque el disfraz del flujo no lo esté. Las velocidades de flujo varían de acuerdo
al disfraz del gas y el tipo de detector.
Por ejemplo, con ECD el detector de gas necesita mantener un equilibrio de concentración
de electrones térmicos y un barrido efectivo de gas acarreador-soluto. La sensibilidad ECD
es inversamente proporcional al flujo, aunque un flujo fuerte se requiera para el barrido de
27
sustancias altamente retenidas para producir picos agudos. Para mantener una sensibilidad
satisfactoria en las velocidades de flujo en el ECD se utiliza 95 % de argón y 5 % de
metano como fuente de gas.
La resolución, la simetría de los picos y la sensibilidad podrían ser monitoreadas para
confirmar que la cromatografía de gases está calibrada correctamente y la velocidad lineal
está optimizada. La cantidad requerida de resolución y la simetría del pico es específica al
método de análisis. Normalmente, una buena resolución se encuentra entre 0.5-1.0 y un
rango aceptable PGF está entre 0.8 a 1.2 cuando están determinados por 1 y 2 (ver abajo).
1) Resolución= rt2-rt1/ Avg (w2+w1)
rt2 – rt1 es la diferencia en los tiempos de retención entre los dos picos, w2 es el ancho del
pico 2 y w1 es el ancho del pico 1.
2) PGF = 1.83 * el pico a 1/2 de altura / pico a 1/10 de altura
3) La sensibilidad está relacionada con la altura del pico a la base del mismo. Una porción
de 3:1 indica una sensibilidad adecuada.
Optimización de tiempo de purga y velocidad de split
Las muestras con splitless son frecuentemente usadas para análisis de componentes donde
una gran cantidad de muestra es inyectada a la columna. Durante el muestreo con splitless,
la muestra se inyecta dentro de la columna caliente y forma un vapor que consiste de
muestra, solvente y gas. Parte del gas sale por el respirador al pasar en el alineador. El
respirador del split se apaga en éste punto y se vuelve a prender después de 20 a 60 seg.
para prevenir que los vapores entren en contacto con la cabeza de la columna y sean
retenidos ahí. El tiempo de purga, o el tiempo que el respirador del split es abierto después
de la inyección, es crítico para la discriminación y reproducibilidad del cromatograma.
El muestreo con splitless puede ser optimizado usando “concentración de muestra /
solvente” para volver a concentrar la muestra en la columna caliente. Esta técnica es
extremadamente útil para adelgazar los picos y eliminar las trazas de solvente y la
interferencia de vapor retenido momentáneamente en la fase estacionaria. El solvente
humedece la fase estacionaria para retener a los solutos, por lo cual, esto permite una rápida
elución de los solutos. Para que ocurra la retención, la temperatura inicial del horno debe
ser 20ºC abajo del punto de ebullición del solvente.
Sin embargo, con solventes como el cloruro de metileno (punto de ebullición de 40ºC), la
concentración del solvente no es práctica porque la temperatura inicial del horno estará a
menos de la temperatura del cuarto. En este caso, el analizador debe aceptar los picos que
28
estén entre los solutos que eluyen al principio o tratar varias técnicas de inyección que sean
compatibles con el muestreo tipo splitless.
Una cabeza del alineador desactivada, sin lana de sílica es preferida para una mezcla ligera
de la muestra con el solvente. Ocasionalmente, la lana puede ser usada para ayudar a la
volatilización de los componentes de alto peso molecular. Un alineador de cuello de ganso
es una alternativa viable para un alineador delgado, diseñado específicamente para mejorar
la eficiencia del splitless y disminuir la degradación de la muestra. Una columna
moderadamente polar desactivada, puesta 1 o 2 cm abajo del punto de inyección, podría ser
utilizada siempre con splitless para minimizar el pegado de los picos y para tener una
migración uniforme del solvente.
Para tener un tiempo de purga óptimo, se comienza con un rango de purga de 0.2 a 1.5 min.
Si el tiempo es muy corto, menos de 0.1 min. los componentes más pesados no se
volatilizarán lo suficiente o no se crearía la “concentración del solvente”. Si hay una gran
diferencia entre el punto de ebullición del solvente y el del soluto, el tiempo de purga
necesitar estar cercano a 0.2 min. Ajustar el tiempo de purga en incrementos de 0.1 min.
hasta alcanzar el máximo de sensibilidad del soluto sin que haya trazas del solvente.
El muestreo tipo split es el método más popular porque inyectar muestras de 0.1 a 2 µl no
impide que haya una buena altura y sensibilidad en el pico. Si se obtiene la cantidad
máxima de eficiencia de la columna, las áreas del pico más pequeñas asociadas con el
muestreo tipo split reflejan una reducción en lo ancho lugar de lo alto del pico. Mejorar la
simetría del pico permite una mejor reproducibilidad y por lo cual da una mejor
cuantificación del área de los picos. Otra ventaja del split, es que se pueden usar columnas
más estrechas para tener una mejor resolución sin tener que volver a muestrear la columna.
Quizá el único inconveniente del split es que la cantidad inyectada a la columna podría no
ser representativa si la muestra no es completamente vaporizada. Esto es porque la muestra
entra en el alineador con el respirador split abierto y el extracto de la muestra y el
acarreador son purgados antes de que entren a la columna. Por esta razón, el método de
inyección split puede ser monitoreado siempre corriendo soluciones estándares de
concentraciones conocidas y analizar su reproducibilidad. La cantidad purgada en el
respirador del split está determinado por la velocidad del split4:
Velocidad del split (ml/min)=
Promedio del flujo del split+ promedio de flujo de columna/promedio de flujo de columna
Una velocidad de 100:1 indica que el 99 % de la muestra, el solvente y el acarreador se
purgaron a través del respirador del split. Para incrementar el flujo a través del respirador se
disminuye la presión o el flujo del acarreador a través de la columna.
Las diferencias en el peso molecular, concentración de la muestra, temperatura inicial del
programa y volumen de inyección afectan el split. Algunas de estas discrepancias pueden
ser minimizadas al seleccionar un alineador de inyección adecuado. Un alineador inerte,
empaquetado ligeramente con lana de sílica, es esencial para completar la filtración de
29
residuos no analizables y garantizar el calentamiento adecuado, mezclado y expansión del
vapor. Esto es particularmente importante cuando se inyectan componentes de alto punto de
ebullición.
Para mejorar la velocidad del split, colocar la temperatura del horno a la temperatura inicial
y ajustar flujo del respirador del split hasta que esté en 10 a 15 ml/min. El flujo a través del
respirador de purga pude estar entre 0.5 a 6 ml/min. y el flujo del acarreador en 2 a 5
ml/min. al final del detector.
Combinación de temperatura y programación de temperatura para completar la
optimización
La adición de control electrónico de presión a la programación de la temperatura mejora
dramáticamente la separación, reduce el tiempo de corrida y se obtiene una velocidad
óptima lineal para el soluto. Esto es porque la presión puede ser regulada precisamente y el
flujo programado continuamente durante la columna. El EPC puede ser corrido a presión
constante con un solo punto de entrada en toda la columna. Esto es similar a lo que el
gauger mecánico hace, excepto que los flujos son más estacionarios, permitiendo una
restauración más rápida del equilibrio del flujo después de un periodo de apagado. El EPC
puede ser también programado para tener una corrida de flujo constante, donde la presión
es ajustada automáticamente a los cambios de temperatura para corregir el volumen del gas
dentro de la columna dado a que el calor se expande al incrementar la temperatura.
En general, el flujo y presión constantes, promueven una elución más rápida de
componentes de alto peso molecular en temperaturas más bajas con mejor resolución. La
habilidad para correrlo a temperaturas bajas reduce significantemente la degradación termal
y mejora la longevidad de la columna.
Para optimizar el flujo constante, la presión de la cabeza de la columna debe incrementar
3.5 veces a la cantidad original en la columna por cada 200°C para compensar un
incremento en la viscosidad. Esto garantiza una alta eficiencia y un flujo constante, la cual,
bajo presión constante, puede gotear más del 50 %. Hay varios factores a considerar cuando
se programa un EPC, particularmente la longitud de la columna, diámetro interno,
velocidad de split y el goteo de la presión desde la cabeza hasta la cola de la columna. El
siguiente es un cálculo para mejorar el EPC y establecer una presión en la cabeza necesaria
para mantener un flujo constante mientras la temperatura se incrementa de T1 a T24:
Pi2 = [(T2/T1)1.7(pi2-po2)1+po2]1/2
Donde Pi es la presión gauge inicial + 1 atm y po es la presión de salida a 1 atm.
30
La programación de la presión envuelve simples y múltiples campos los cuales entran en el
panel de control en la misma manera como un programa de temperatura. Los cambios en la
presión pueden ocurrir en temperatura y tiempos específicos durante una corrida,
permitiendo una mejor optimización. Algunos puntos que garantizan una programación
exitosa son:
1. Seleccionar columnas que tengan mayor eficiencia que la requerida para la
separación.
2. La temperatura del horno inicial podría ser lo suficientemente baja como para
permitir separar componentes de bajo punto de ebullición pero más alta que la
temperatura mínima para la fase estacionaria de la columna.
3. Correr mezclas complejas en temperaturas iniciales bajas para dispersar os picos.
4. Siempre introducir un tiempo de sostenido inicial para soluto de rápida elución.
5. Incrementar las rampas de presión y temperatura para reducir los espacios en blanco
entre grupos. Comenzar con rampas de temperatura. Si los últimos picos de elución
son resueltos pobremente, reducir la temperatura e incrementar la presión.
Al incrementar la presión durante la inyección, el volumen de expansión de vapor puede ser
controlado para prevenir el regreso el cual podría ocurrir si la cantidad inyectada excede la
capacidad del buffer en la cabeza del alineador. En el pulso de presión, la cabeza de presión
es aumentada un poco después de la inyección, y se programa una inclinación para el
remanente de la corrida. Esto actualmente mejora el muestreo splitless porque expansión de
volúmenes más pequeños son producidos dado al menor tiempo gastado en la cabeza. No
hay suficiente tiempo para que el vapor se expanda hasta el inicio del alineador y salga por
el respirador del purgador. Puesto que el tiempo que la muestra permanece en el alineador
es reducido, hay menos contacto con sitios activos de superficies catalíticas del alineador.
Hay menos adsorción del alineador y descomposición de la muestra y por lo tanto la
resolución del pico es mejorada. Ocasionalmente, la delimitación de los picos puede ocurrir
con pulsos de presión, especialmente si usas “concentración de solventes” debido a que la
velocidad del flujo tiende a interferir con la concentración de la muestra en la columna.
Esto puede ser solucionado variando el tiempo de purga, los pulsos de presión y la
temperatura del horno.
Cuando se usa EPC con inyección tipo split, la velocidad del split puede ser programada
para cambiar durante la corrida o entre los métodos en una secuencia. También, puede ser
programado para apagarlo entre corridas para conservar la cantidad de gas acarreador. Si se
aplican pulsos de presión a la inyección tipo split, incrementa el flujo el cual podría reducir
la velocidad de split.
Con la programación de la temperatura y presión se han optimizado y mejorado los
procedimientos de corrida. Los programas computarizados como el ezGC &#153 proveen
aproximaciones más cercanas para condiciones ya optimizadas. Esto no remplaza los
métodos ya desarrollados pero puede eliminar los tiempos de corrida sesgados.
31
El software requiere que dos programas extremos sean usados como un rango 1) Una
presión o temperatura alta con un rampeo rápido y 2) una presión y temperatura inicial con
un rampeo bajo. Los resultados entran al programa, con la longitud de la columna, la
presión sobre el diámetro de la columna, la velocidad lineal, de tiempo muerto y otros
parámetros. Una serie de algorímetros determinan los mejores programas basados en la
termodinámica de retención para índices y cálculos.
Aplicaciones
Un intento para crear una compilación de aplicaciones deseadas para generar un manual
debe ser selectivo, en consecuencia la compilación casi siempre puede estar incompleta por
cromatógrafos individuales debido a la omisión de ejemplos que se consideran críticos para
algunos campos específicos. Por otra parte, algunos de los ejemplos incluidos pueden ser
criticados porque los eventos de separación en la cromatografía de gases pueden ser muy
rápidos y en muchos casos es posible generar resultados que son superiores a los mostrados
en las ilustraciones. Los avances que han permitido mejorar los métodos incluye a)
mejores métodos de preparación y almacenamiento de las muestras, b) mejoras en la
instrumentación comercial, incluyendo entradas superiores que llevan a cabo un mejor
proceso de inyección de la muestra y c) la disponibilidad de mejores columnas desactivadas
en un rango más amplio de diámetros y cubiertas de una gran variedad de fases
estacionarias. Las guías de aplicaciones para fases estacionarias en los análisis de las
diferentes áreas se muestran en catálogos tales como Supelco, Applied Science, Analabs,
etc.
Otra forma de clasificar las aplicaciones en la cromatografía de gases es dividir los datos de
la literatura en áreas de interés, pese a que la sobrelapación de algunos sea inevitable, una
serie de grados de redundancia puede ser evitada por la asignación de cuatro grandes
categorías:
a) Comida, sabores y fragancias. Productos naturales y las feromonas, análisis de
pesticidas; separación de enantiómeros.
b) Petróleo y químicos. Ácidos grasos; combustibles sintéticos, carbón y aceites;
separación de enantiómeros.
c) Ambientales. Contaminantes de agua, aire y tierra; halometanos en el agua hasta las
dioxinas en la tierra; análisis de pesticidas; separación de enantiómeros.
d) Médicas y biológicas. Ácidos grasos; niveles de alcohol y drogas en la sangre;
análisis de pesticidas; separación de enantiómeros.
Aplicaciones en comida, saborizantes y fragancias
En la mayoría de las investigaciones hechas sobre saborizantes se realizan por
cromatografía de gases, y las correlaciones sensoriales que se requieren para que haya
significancia en la determinación de sabores deben ser medidas por patrones de
32
cromatografía de gases. El análisis puede ser complicado debido a que los compuestos de
interés volatilizan usualmente en muy bajas concentraciones, y son frecuentemente
dispersados dentro de una matriz que contiene materiales los cuales podrían, si se quedan
dentro de la columna, acortar la vida de la muestra en un grado considerable. La
cromatografía puede ser extremadamente compleja y frecuentemente influenciada por los
métodos de preparación de la muestra.
La cromatografía de gases es ampliamente utilizada en el análisis de aceites esenciales,
donde la complejidad de la muestra puede ser en verdad un gran reto. Muchos de estos
productos son frágiles e importantes comercialmente y se utiliza la cromatografía de gases
para cuantificar componentes específicos que podrían ser indicativos de calidad del aceite y
para detectar adición de compuestos clandestinos como antioxidantes así como
componentes utilizados como diluyentes.
Un ejemplo de esto puede ser el aceite de limón al cual se adulteraba por la adición de
turpentina. De aquí que la cromatografía de gases es usada no solo para establecer cuales
son los materiales normales que contiene cada muestra, sino también aquellos componentes
cuya concentración aumenta el abuso del aceite (ejemplo: el p-cymeno). La complejidad el
aceite es tan alta que no se podría analizar su composición por una simple columna
cromatográfica, por lo que se usan columnas especializadas de polimetilsiloxano con
diferentes fases estacionarias, para producir una mejor separación de los compuestos así
como un tiempo de vida más largo.
Otro uso importante de la cromatografía de gases ha sido en el análisis de vinos
adulterados. Por ejemplo, en los vinos europeos fue de gran importancia en la detección de
dietilenglicol. El dietilenglicol es un material tóxico y se ha encontrado en niveles de 60
g/L en los vinos. También se pueden detectar contaminantes dentro de la comida
empaquetada por cromatografía de gases. Estos contaminantes están relacionados con
trazas de solventes residuales usados en las películas plastificadas del empaquetamiento
(por ejemplo, el 2-etilhexanol).
El dibromo de etileno (EDB) ha sido utilizado ampliamente para inhibir la infestación de
insectos en comida empaquetada, pero se demostró que este compuesto es carcinogénico en
altos niveles. Debido a la gran complejidad de las muestras de comida, la detección de estos
EDBs puede ser un problema, por lo que se han optimizado fases estacionarias que
permiten un aumento en la retención relativa y velocidad parcial de la volatilidad de los
compuestos, dando prioridad a la salida de los contaminantes.
Tabla 2. Columnas recomendadas para cromatografía de comida, sabores y fragancias4
Solutos
Fase estacionaria
Tipo de columna
Ácidos grasos volátiles en 10% SP-1000/1%H3PO4
PEGa
agua (C2 a C5)
Ácidos grasos bacterianos 3% SP-2100, Silar 5CP
1, 5, 225.
Aminoácidos
OV-17, OV-210
17
Carbohidratos
2330, 2340
225, 275
33
Aplicaciones relacionadas a químicos y petróleo
Los análisis de productos del petróleo incluyen la separación de mezclas de gases ligeros
hasta la caracterización de aceites crudos y materiales producidos en la licuación del
carbón. La diferenciación de hidrocarburos parafínicos, olefínicos y aromáticos son metas
normales, y algunas veces se requiere la detección de componentes nitrogenados y
sulfurados. Las preparaciones de hidrocarburos derivados de aceites o carbón licuado
pueden ser extremadamente complejas y también pueden incluir una variedad de otros
grupos funcionales. La cromatografía multidimensional puede ser requerida para el análisis
de estas mezclas complejas, la cual da una gran estimación de ciertos aditivos de octanos.
Las columnas empaquetadas todavía son utilizadas para algunas separaciones de
hidrocarburos ligeros, mezclas de gases, componentes sulfurados y nitrogenados de bajo
peso molecular; alcoholes y halocarbonos de bajo peso molecular. Estas columnas
normalmente se empaquetan con alúmina o algunos polímeros porosos como los
cromosorbos.
Las interacciones entre la fase estacionaria y los solutos hidrocarbonados están limitados
generalmente a fuerzas de dispersión; por ejemplo, la fase estacionaria de
metilpolisiloxano, cuya interacción con los solutos está limitada a las fuerzas de dispersión,
funciona bien para la separación de estos componentes. Mooney, et al. (1982) 4 demostaron
la separación de hidrocarbonos de bajo peso molecular en un sistema de válvula de entrada,
usando una columna de película apretada en condiciones subambientales. Estas columnas
son especialmente útiles para mezclas de baja ebullición. También se han diseñado
separaciones interesantes utilizando columnas tubulares de capa porosa (PLOT) cubiertas
con alúmina.
Estas columnas incrementan la retención de los hidrocarburos de bajo peso molecular en
altas temperaturas. Se diseñaron sistemas de multicolumnas de válvula de entrada, con
potencial de reflujo y/o redirección de fracciones individuales a tubos abiertos,
microempaquetados y columnas PLOT, para llevar a cabo separaciones que son difíciles de
duplicar con equipos convencionales o columnas tubulares abiertas.
La cromatografía multidimensional se utiliza para la separación de algunos componentes
menores como los aditivos “antiknock” en gasolinas. Levy y Yancey (1986) 4, describieron
un sistema para cuantificar aditivos oxigenados con las bases de características de retención
cuando las inyecciones de gasolina eran simultáneamente agregadas a dos columnas
diferentes.
Las pruebas de solventes han sido todo un reto, debido a la cantidad masiva del
constituyente principal que debe ser inyectado a la columna si la detección es para los
constituyentes menores; por ejemplo, el rango dinámico del sistema debe ser
suficientemente amplio para acomodar estas diferencias cuantitativas en los componentes.
34
Aplicaciones ambientales
Los análisis ambientales se enfocan a la detección y/o cuantificación de muchas substancias
diferentes en una diversidad de matrices. Estos análisis pueden ir desde químicos de
pesticidas y herbicidas hasta hidrocarburos aromáticos polinucleares (PAHs), compuestos
clorados mezclados en el aire, agua y tierra. En muchos casos el problema inicial es la
obtención y preparación de la muestra. Las muestras de agua son muy variables, desde agua
potable hasta aguas industriales.
En muchos casos las agencias de regulación de calidad tienen procedimientos estándar
específicos para el análisis de materiales dados en una matriz dada. Con algunas
excepciones los métodos de análisis oficiales son menos sensitivos y consumen mayor
tiempo que los métodos que se desarrollaron en los comienzos de la cromatografía. En
Estados Unidos, la agencia de protección ambiental (EPA) especificó procedimientos para
el monitoreo de efluentes industriales en 1977. Los métodos 603 hasta el 613 separan en 13
clases los 113 contaminantes orgánicos que son monitoreados por cromatografía de gases.
Los análisis cromatográficos se llevan a cabo por columnas tubulares abiertas, las cuales
dan una excelente precisión y tiempos de análisis muy cortos pese a la complejidad que
podría presentar la muestra. En estos análisis cromatográficos se usan fases estacionarias de
compuestos aromáticos para mejorar la separación de los solutos. Las mismas columnas se
usan para la separación de pesticidas y compuestos aromáticos clorados.
Aplicaciones médicas y biológicas
La detección en bajos niveles de componentes significativos en este campo tiene
requerimientos estrictos para los sistemas analíticos; esto es también cierto para otros
solutos activos como los pesticidas. Los altos niveles de solutos activos podrían necesitar
no solo la selección de columnas bien desactivadas, sino también de los sistemas analíticos
particulares, como desactivar el puerto de inyección del cromatograma. Cuando la
cuantificación es importante, las técnicas utilizadas por Schomburg (1979) 4 y Dandeneau
(1979) 4, podrían ser empleadas para establecer que la precisión del sistema se extiende a
los niveles medidos para el soluto en cuestión. Para solutos termolábiles se requieren
columnas frías de inyección (tabla 3).
35
Tabla 3. Fases estacionarias recomendables para las aplicaciones biológicas y químicas4
Solutos
Columnas empaquetadas
Columnas tubulares
Clinicas/Biomédicas
Cetosteroides
Silar 5CP
225
Colesterol, esteroides,
estrógenos
OV-17
17
Alcoholes en sangre
Carbopak/SP-1000
PEG
Drogas
Anfetaminas
Apiezon/KOH
Antidepresivos
SP-2250
Alcaloides
SP-2250, OV-17/H3PO4
Barbitúricos
SP-2250
1,5,17
Diuréticos
OV-17/H3PO4
Frecuentemente es deseable el análisis de un anestésico presente en el aire suministrado a
un paciente del que se encuentra en la atmósfera del cuarto, para lo cual se requiere un
sistema de detección rápido y normalmente se utiliza uno de conductividad térmica. Para
esto se utilizan columnas tubulares abiertas de diámetro largo muy apretadas para llevar a
cabo la separación de varios anestésicos en menos de 7 minutos; las columnas empacadas
llevan a cabo la separación en 28 minutos.
Algunas veces el envenenamiento de pacientes por solventes orgánicos volátiles son
evidentes por el hedor del paciente al respirar, pero en otros casos el diagnóstico es
facilitado por análisis de sangre. Los agentes más comunes en estos casos son los solventes
(aerosol, repelentes o anestésicos) los cuales incluyen bromocloro -difluorometano, nbutano, tetracloro de carbono, clorobutanol, etc.
Ramsey y Flanagan (1982) 4, usaron inyecciones de espacio principal o “headspace” en dos
columnas empaquetadas diferente y con una detección simultánea por captura de
electrones-ionización de flama (FID-ECD) para facilitar la detección e identificación rápida
de estos solutos en las muestras de sangre de pacientes envenenados. Es probable que con
la columna DB-624 se pueda tener un análisis más rápido y mejor.
La drogas son frecuentemente solutos más activos, y su derivatización es normalmente
requerida para su análisis en columnas empaquetadas. Se puede incrementar la forma inerte
de las columnas de sílica para permitir un análisis directo de estas drogas sin derivatizar. En
algunos casos, la derivatización es empleada para aportar estabilidad térmica y se puede
utilizar en ambas columnas, las empaquetadas y las tubulares abiertas.
En estudios de derivatización de aminas disfuncionales. Jacob, et al (1985) 4, establecieron
que con excepción de la efedrina, todas las drogas examinadas producían dos derivados
estereisómeros que eran resueltos en picos bien formados bajo las condiciones que ellos
usaron. Alm, et al. (1983) 4, inyectaron muestras simultáneas de drogas en dos columnas
36
diferentes, una empleando FID y la otra con detección de nitrógeno/fósforo (NPD), para
generar los datos de la Fig. 12.
Fig. 11. Análisis de una droga ilegal en un analizador de detector y columna doble4.
Aplicaciones en la industria
La cromatografía de gases es muy útil cuando pretendemos identificar los compuestos que
determinan una característica aromática conocida. Por lo tanto, es necesario conocer los
umbrales a partir de los cuales mejora o se desvirtúa nuestro producto, ya sea mediante
estudio bibliográfico o por detección olfatométrica. Esta información es un instrumento útil
para el seguimiento del producto en el proceso productivo, así como el control de otros
materiales enológicos, como son los tapones y las barricas. Algunos controles importantes a
efectuar durante la fase de crianza en vinos y cavas son métodos específicos para la
determinación de fenoles volátiles y compuestos azufrados. Concretamente en la cava, a
partir de la evolución de ciertos compuestos volátiles, entre ellos los vitispiranos, se calcula
el momento en el que tienen lugar las fases de autólisis y postautólisis durante la crianza.
Controlar el momento en que se desarrollan estas fases es importante debido a las
alteraciones organolépticas que conllevan.
La información que nos puede suministrar la GC en el control de calidad será más grande
cuanto mejor conozcamos el perfil cromatográfico de la fracción aromática de nuestro
producto. Por ello, hay que disponer de un amplio banco de datos del mismo en las
diferentes etapas de elaboración y en diferentes adiciones, y correlacionar estadísticamente
determinados compuestos con ciertas anomalías, o tipificar variedades que no contengan
algún compuesto específico que las identifique (como sucede en la mayoría de casos). No
37
obstante, se trata de análisis todavía demasiado laboriosos para constituir aplicaciones
rutinarias de control.
En todo caso, el análisis por cromatografía de gases no nos permite definir el perfil
aromático del vino analizado. El problema se agrava en aquellos compuestos para los que
no disponemos de patrones sintéticos y, por tanto, no es posible conocer sus propiedades
aromáticas.
Otras aplicaciones
También se hacen análisis cromatográficos para la determinación de metanos
trihalogenados, los cuales dañan la salud por la desinfección del agua de piscinas con cloro.
Se hacen análisis de componentes de la acrilamida. Se determinan los residuos de
ditiocarbamato en los alimentos dietéticos. La determinación de aceites minerales en el
agua. Análisis de herbicidas en campos de golf. Para determinar los grados de alcohol en
bebidas como la cerveza. Para la determinación de componentes aromáticos en alimentos y
bebidas.
Aplicaciones prácticas
Dentro de la investigación que se realiza en el Instituto de Biotecnología, en el
departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis, se realiza investigación sobre la
degradación enzimática de compuestos azufrados, como el dibenzotiofeno, presentes en
petróleo crudo y sus derivados. El azufre al ser oxidado durante el proceso de combustión,
se convierte en un contaminante atmosférico al formar ácido sulfhídrico, el cual forma parte
de la lluvia ácida. La detección de los productos de degradación se realiza por
cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. La cromatografía de gases nos
permite cuantificar la concentración de compuestos azufrados; y la espectrometría, el
análisis
de
los
productos
(fig.12).
38
Abundance
TIC: DBT.D
5500000
5000000
4500000
4000000
3500000
3000000
2500000
2000000
1500000
1000000
500000
Time
4.00
6.00
8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00
Time-->
A) cromatografía de gases.
Abundance
184
Scan 550 (11.368 min): DBT.D
600000
550000
500000
450000
400000
350000
300000
250000
200000
150000
139
100000
50000
92
63
m/z
0
32
50
100
150
215
246281 327
377
429
479
530562 605
200
250
300
350
400
450
500
550
600
659693
650
700
m/z-->
B) espectrometría de masas
Fig. 12 gráfica de detección de dibenzotiofeno.
Entre las aplicaciones de más importancia está la del ámbito de alimentos, debido a que es
de suma importancia tener conocimiento de los componentes cuya presencia cae dentro de
los parámetros permitidos en ciertos productos, aún a pesar de que no formen parte del
contenido original. Para ejemplificar este punto hacemos referencia al siguiente artículo de
divulgación. Se anexa publicación al finaldel trabajo.
39
López, M.G. 2001. Una sinfonía de aromas. Avance y perspectiva, Unidad Irapuato,
CINVESTAV. vol. 20. p. 421-424
Cromatografía de gases como método principal
**DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AMBIENTALES
CENTRO DE CIENCIAS DE LA ATMÓSFERA/UNAM. Distrito Federal
Investigación: Estudio de la composición orgánica semivolátil presente en las partículas
menores o iguales a 10 y 2.5 µm suspendidas en el aire por cromatografía de gases –
espectrometría de masas.
**LABORATORIO DE CALIDAD DEL AIRE/ITESM. Monterrey, Nuevo León
Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas y detector infrarrojo con
transformada de Fourier. Cromatógrafo de gases con detector de captura de electrones.
Detector de ionización de flama.
Monitoreos de emisiones en fuentes fijas, perimetrales y proyectos especiales en empresas.
http://uninet.mty.itesm.mx/ctl/labaire.html
**LABORATORIO DE NUTRICION Y ALIMENTOS
Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Coahuila
Responsable: Lic. Laura Olivia Fuentes Lara.
Investigación: Bromatológicos en forrajes y concentrados para consumo animal; en
alimentos de consumo humano (frutas, hortalizas, cereales, carnes rojas y pollo).
Determinación de ácidos grasos.
www.uaaan.mx/DirInv/texthtml/servicio.htm
** LABORATORIOS DE INVESTIGACIÓN QUÍMICA Y BIOQUÍMICA (LIQB)/TESE.
Ecatepec, Edo. Méx.
Cromatógrafo de gases Hewlett Packard con detector selectivo de masas y detector de
conductividad térmica. Cromatógrafo de gases Varian.
Investigación: Tratamiento de efluentes gaseosos por medio de catálisis química y
biofiltración. Restauración de suelos contaminados con hidrocarburos y plaguicidas.
Producción de pigmentos y enzimas de interés agroalimentario. Análisis externos (análisis
de compuestos orgánicos volátiles y semivolátiles).
http://tese.dns2go.com/index.asp?opcion=laboratorios
40
**Dr. Charles Rice
Agron 645-Microbiología del suelo
Depto de Agronomía./KSU. Kansas State, USA
Biomasa microbiana. Carbono y Nitrogeno mineralizable. Liberación de gases bajo
condiciones de fumigación.
http://www.oznet.ksu.edu/ed_agron645/lab/645GCinfo.htm
** Química atmosférica
Programa de Ingeniería Química Ambiental y de Química Ambiental (PIQAyQA)
Facultad de Química/UNAM. Distrito Federal
Cromatógrafo de gases Perkin Elmer
http://www.cneq.unam.mx/paidoteca/quimicaambiental/instalaciones.htm
** Centro de Investigaciones Químicas/UAEM. Cuernavaca, Morelos
Cromatógrafo de gases acoplado a un detector selectivo de masas (HP5973).
http://www.ciq.uaem.mx/ciq/servicios1.htm
**Laboratorio de Biogeoquímica UBIPRO/UNAM Iztacala, Distrito Federal
Cromatógrafo de Gases con detector de Espectrometría de Masas (Finnigan Mat).
http://www.iztacala.unam.mx/dip/ubiprolab_biogeoquimica.html
**Alcoholera de Zapopan. Jalisco
Comercialización de alcohol etílico.
http://www.alcoholera-zapopan.com/laboratorio.html
**Análisis en el Área de Alimentos y Fármacos
Laboratorio de instrumentación/CETI. Guadalajara, Jalisco.
http://www.ceti.mx/es/servicio_ext/tec_quimicas/lab_instrumentacion.phtml
Innovaciones
Se han hecho innovaciones aumentando los volúmenes de inyección al cromatógrafo
(LVI). En análisis de cromatografías de gases típicas normalmente solo una fracción del
volumen inyectado es de interés analítico, el resto solo interfiere o no es importante. Para
mejorar el análisis, aumentando la integridad analítica, disminuyendo la frecuencia de
retención etc. Se ha diseñado un sistema llamado ProSep.
41
El sistema ProSep consiste de 4 componentes, el módulo de precolumna, el cual es el
puerto de entrada, dos módulos control y una precolumna de vidrio o sílica la cual está
unida dentro de la precolumna de manera similar al alineador de vidrio split/splitless
(partido / sin partir) (paso 1). El flujo de la función ProSep se muestra en la siguiente
figura.
La inyección con el ProSep en el cromatógrafo de gases de manera split.
Debido a que ProSep provee alguna separación, los componentes inyectados son
organizados en la precolumna de acuerdo a su punto de ebullición, aquí el solvente, el
analito y la matriz son ordenados en el puerto y los solventes de bajo punto de ebullición
son rápidamente eluidos (paso 2).
Después de la eliminación del solvente, la columna de preseparación modula la
temperatura, cerrando el respirador split transfiriendo los solutos dentro de la columna
analítica (paso3).
Cuando ya se han transferido todos los solutos de interés, se abre de nuevo el respirador
split se abre de nuevo y la columna de preseparación aumenta la temperatura para hervir a
los componentes no deseados de la matriz (paso 4). Todos estos pasos son monitoreados
bajo softwares de la marca ProSepTM.
Fig. 13 Columnas de separación tipo ProSepTM 7.
42
Fig. 14 Cromatógrafo de gases con columnas y detectores ProSep7.
Cromatografía de gases y espectrometría de masas
Durante los últimos veinte años la espectrometría de masas (EM) y la cromatografía de
gases (GC) han demostrado repetidamente, en gran número de laboratorios en todo el
mundo, su versatilidad como métodos analíticos para la determinación estructural y
separación de compuestos orgánicos. Ambas técnicas han alcanzado últimamente un alto
grado de desarrollo en sus diversas facetas prácticas, habiéndose convertido
respectivamente e independientemente en dos métodos analíticos en los que se conjuntan
una gran rapidez, sensibilidad y poder resolutivo.
Aunque en la práctica hasta 1957 la cromatografía de gases y la espectrometría de masas
avanzaron por caminos diferentes pero paralelos en el campo del análisis orgánico, gracias
al gran potencial demostrado por los primeros intentos de combinación y a su rápido
desarrollo, en la actualidad la combinación directa cromatográfica de gases-espectrometría
de masas se reconoce como uno de los sistemas más eficaces a disposición del químico
analista para el estudio e identificación de mezclas complejas de productos orgánicos.
Conectando la salida de un cromatógrafo de gases a la cámara de ionización de un
espectrómetro de masas de puede obtener información estructural (espectro de masas) para
cada uno de los componentes de la mezcla original, previamente inyectada en el
cromatógrafo, a medida que estos son eluidos en serie de la columna cromatográfica. De
esta forma las limitaciones inherentes de la cromatografía de gases quedan
considerablemente reducidas en el análisis cualitativo. Dichas limitaciones surgen del
hecho de que mientras la cromatografía de gases pueda separar los componentes
43
individuales de una mezcla con un alto grado de poder resolutivo, no puede dar, en sentido
riguroso más que información preliminar sobre su estructura. Hay que señalar como
esencial que cualquier columna cromatográfica no es un instrumento analítico, sino tan solo
un medio de separación física.
Asimismo, desconectando ciertos detectores específicos (por ejemplo captura de electrones,
fósforo, etc.), los detectores cromatográficos solamente responden en general a la cantidad
de la muestra eluída de la columna. Por ello la utilización de los datos basados en el tiempo
de retención absoluto o relativo puede resultar un método adecuado para la identificación
tentativa de ciertos compuestos o mezclas relativamente simples o para las cuales se
dispone de los correspondientes patrones. Sin embargo, cuando esta metodología se intenta
llevar a extremos, como el análisis de mezclas de productos naturales de extrema
complejidad, los resultados así obtenidos carecen de la precisión cualitativa, sobre todo en
los casos que se requiere una programación de la temperatura del cromatógrafo de gases y
se carece de compuestos patrón. A este respecto, una de las áreas más activas de la
combinación cromatografía de gases-espectrometría de masas es en conclusión la
identificación de compuestos nuevos o no sospechados previamente.
44
Páginas web
http://home.nas.net/~dbc/cic_hamilton/gas.html
links a diferentes métodos.
http://tese.dns2go.com/index.asp?opcion=laboratorios
http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/GC/ imágenes
http://www.alcoholera-zapopan.com/laboratorio.html
http://www.cee.vt.edu/program_areas/environmental/teach/smprimer/gc/gc.html#intro
animaciones
http://www.ciq.uaem.mx/ciq/servicios1.htm GC centro de Investigaciones
Químicas/UAEM
http://www.chem.vt.edu/chem-ed/sep/gc/gcpics.html
cromatógrafos
http://www.dreamingearth.com/gas_chromatographs.html
GC y aromaterapia
http://www.essencefleur.com/Empresa2.htm GC en producción de perfumes
http://www.orbigen.com/protocols/Gas_Chromatography.html ligas a diferentes campos
(historia, técnicas, etc.)
http://www.shu.ac.uk/schools/sci/chem/tutorials/chrom/gaschrm.htm explicación general
http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Datanodes.html?prod_line_id=97503
3
reactivos, aparatos
http://www.uib.es/depart/dqu/dquo/pau/Cromatograf%92a/chrom10/chrom/GC/concept/ma
in.htm
conceptos generales con links a detectores
Bibliografía
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182pp.
2. Dabrio, M.V. 1971. Cromatografía de gases. Vol. II. Ed. Alahambra, S.A. España.
223pp.
3. Guntuzweiny, J.S. 2000. Handbook of chromatography, general data and principles.
Press Ed, USA. p. 1-25
4. Jennings, W. 1987. Analytical Gas Chromatography. Academic Press, Inc. Canada,
Japan, USA. 259pp.
5. Wilson, H.W. & M.S. Klee. 1997. Analysis of sulfur and phosphorus compounds
with a flame photometric detector on the Agilent 6890 Series Gas Chromatograph.
Innovating the HP way Manual. p.1-4
6. http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/GC/
7. http://www.bst.com.au/resources/tutorapp.pdf