Actividad 5 - Universidad Autónoma de Yucatán

Universidad Autónoma de Yucatán
Facultad de Química
Métodos Ópticos, Eléctricos y Cromatográficos
Actividad 5 - Reconocimiento de la
instrumentación de un HPLC-DAD Agilent
Technologies 1200 series
Nombres:
Mauricio Albertos Pérez
Ángel Canul Santiago
Jesús Herrera Madera
Milton Puerto Ayala
Profesor:
Alfredo Araujo León
Fecha de entrega: 22/Mayo/2014
Reconocimiento de la instrumentación de un HPLC-DAD
Agilent Technologies 1200 series
La Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) ha tenido una creciente
difusión desde comienzos de la década de 1970, y hoy representa una de las
herramientas más empleadas en el laboratorio analítico moderno, ya sea se esté
dedicado a la investigación básica o aplicada, industrial, biológico o bromatológico,
entre otros aspectos importantes a los cuales se le puede aplicar. La
cromatografía líquida se puede clasificar de diversas formas, como las que se
explican a continuación:

Cromatografía Líquido-Sólido (LSC) o de adsorción.- Emplea una fase
estacionaria polar y una fase móvil no polar, en general con el agregado de
algún aditivo que provee selectividad.

Cromatografía Líquido-Líquido (LLC) o de partición.- En este tipo, las
moléculas de soluto se distribuyen entre dos líquidos: uno es la fase móvil,
y el otro la fase estacionaria, que se encuentra homogéneamente dispersa
en un soporte sólido, finamente dividido.

Cromatografía de Fase Ligada (BPC).- Las virtudes que ofrecía la LLC eran
muy claras, así como de igual forma sus limitaciones. Por ello, resultó
razonable reemplazar el tipo de unión a la fase estacionaria a su soporte,
haciéndola perdurable por medio de una unión química covalente.

Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC).- Se emplean rellenos en los
cuales la partícula está constituida por un polímero, unido a un grupo
funcional aniónico o catiónico. La selección del tipo de grupo funcional
permite escoger entre intercambiadores débiles y fuertes.

Cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC).- Se emplean materiales de
porosidad controlada, que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las
moléculas de la muestra según un orden decreciente de tamaño molecular
(las moléculas más grandes son las primeras en eluir, y las más pequeñas
son las últimas).
Los equipos de HPLC (figura 1) pueden clasificarse en integrados y
modulares. En los primeros, cada una de sus partes (reservorio de solventes,
bomba, inyector y detector) están reunidas en un gabinete y su intercambio o
conexión con otros componentes de la misma o diferente marca es difícil. En los
segundos, los módulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar
el equipo según la necesidad del analista sino aumentar su complejidad según esa
necesidad varíe.
Figura 1
Esquema de
un
cromatógrafo
líquido básico
modular
Las partes que conforman un cromatógrafo líquido básico, son las
siguientes:

Reservorio de la fase móvil.- El reservorio es el recipiente que contiene la
fase móvil. Puede ubicarse dentro de la caja negra de un equipo integrado
o externamente en un equipo modular, y en general algunos centímetros
sobre el nivel de la bomba para que la fuerza de gravedad dirija el solvente
hacia ésta, manteniendo llenas las conexiones.

Tuberías.- La fase móvil empleada en HPLC debe circular por tuberías que
conectan el reservorio de solvente con la bomba, la bomba con el inyector,
éste con uno o más detectores conectados en serie, y eventualmente con
un colector de fracciones o válvulas de distribución. Es evidente que estas
tuberías deberán ser inertes, y de acuerdo a su ubicación en el sistema
cromatográfico, resistentes a altas presiones.

Uniones.- Las uniones permiten conectar las tuberías, y con ellas, los
distintos componentes del sistema cromatográfico. Una unión consiste en
dos piezas de acople perfecto, la unión macho, consistente en una férula
que se afirma a la tubería conectora y un tornillo que se ajusta a la unión
hembra, presente en un conector o componente de un módulo, dejando un
volumen interno libre al solvente prácticamente nulo (volumen muerto cero).
Deben
ser
inertes
a
fases
móviles
y
muestras,
deben
cerrar
herméticamente y no deben contribuir en forma notable al ensanchamiento
de banda extracolumnar por la presencia de volúmenes muertos.

Bomba.- Las bombas de HPLC impulsan la fase móvil proveniente del
reservorio de solvente hacia el inyector, y desde allí hacia la columna. Su
caudal de trabajo puede ser muy variable, según la escala de trabajo
escogida. Existen bombas capaces de entregar caudales muy pequeños,
del orden de los microlitros/minuto, pasando a caudales de unos pocos
mililitros/minuto hasta para valores, mucho mayores para las separaciones
semipreparativas
y
preparativas.
Existen
bombas
reciprocantes,
a
diafragma y de jeringa.

Sistemas de gradientes.- El gradiente de solventes es comparable a la
programación de temperaturas en cromatografía de gases. En CG se varía
la temperatura en función del tiempo. En HPLC se varía la composición de
la fase móvil (contenido porcentual del componente fuerte de la mezcla),
comenzando
la
elución
con
un
solvente
débil
y
aumentando
progresivamente la proporción del componente fuerte. Esta variación puede
seguir un perfil lineal, cóncavo, convexo o una mezcla de estos perfiles en
un mismo cromatograma.

Inyector.- Es el dispositivo que permite introducir la muestra en solución sin
interrumpir el caudal de disolvente a través del sistema. El inyector debe
reunir una serie de características importantes como son: fácil operación,
ser inerte al ataque químico y capaz de soportar altas presiones, ser
preciso en cuanto a la cantidad de muestra introducida al sistema, no debe
provocar diluciones importantes de la solución inyectada, en casos
especiales puede requerirse que opere a altas temperaturas. Existen
inyectores automáticos y de válvulas de intercambio.

Detector.- Es la parte del equipo que permite ver y ubicar en tiempo y
espacio la posición de cada componente de una muestra a la salida de la
columna cromatográfica. Tienes características importantes, como son:
tener un amplio rango dinámico de respuesta, poseer una respuesta lineal,
no contribuir al ensanchamiento de banda extracolumnar, responder a
todos los solutos, tener la sensibilidad apropiada, no afectarse por cambios
de temperatura, poseer buena relación señal/ruido, no destruir la muestra y
tener una constante de tiempo baja. Existen dos tipos de detectores: Los
generales y los selectivos. De los primeros está el de índice de refracción,
el cual mide la diferencia de índice de refracción entre el solvente puro y el
solvente que contiene la muestra (es un detector universal y no destructivo),
tiene muchas variedades de detectores de este tipo como son el de
Fresnel, de deflexión e interferométrico. De los segundos, el más utilizado
es de UV, del cual existen dos tipos de detectores: los de longitud de onda
fija o fotométrico y los de longitud de onda variable o espectrofotométrico.
Otros tipos de los selectivos son los de fluorescencia y electroquímicos.

Sistema de toma y procesamiento de datos.- El registro y la eventual
manipulación se obtienen a partir de la señal proveniente del detector por
medio de un sistema de toma y procesamiento de datos, entre los que se
pueden citar: registrador gráfico, que convierte la señal en un gráfico del
tipo X-Y; integrador, que permiten no sólo obtener un cromatograma sino
también su tratamiento matemático para el cálculo de concentraciones;
computadora, básicamente, el integrador es una computadora de uso muy
específico, pero también existen las computadoras con el software
apropiado tanto el registro gráfico del cromatograma como los cálculos
apropiados, la manipulación de datos, el almacenamiento de ensayos,
generación de reportes, e incluso el manejo global de varios cromatógrafos
Cuando la muestra y la fase móvil son forzados a atravesar la fase
estacionaria, entran en juegos distintos tipos de interacción entre cada uno de
estos
componentes.
Interacciones
hidrofóbicas,
puentes
de
hidrógeno,
interacciones dipolares y electrostáticas, son las responsables de la mayor o
menos afinidad de cada uno de los componentes de la muestra por la fase móvil o
la fase estacionaria. Así el componente más afín a la fase estacionaria se retiene
más y tarda más en eluir (es decir, en salir de la columna) y el más afín a la fase
móvil se retiene menos y eluye antes.
La cromatografía tiene un lenguaje particular. Evidentemente, como cada
laboratorio no constituye una isla independiente y sus ensayos son compartidos,
publicados o discutidos en los medios que correspondas, se hace necesario
unificar ese lenguaje y estandarizar los términos empleados. Algunos de los
términos en este lenguaje particular son: el cromatograma, volumen de elución,
volumen muerto, línea base, tiempo de retención, tiempo de retención neto o
relativo, velocidad lineal, factor de capacidad, factor de separación, resolución,
platos teóricos, asimetría, ancho de pico, entre otros importantes.
Cuando se inyecta una mezcla de solutos al sistema cromatográfico, la
mezcla se separa y puede eventualmente recolectarse en forma fraccionada, de
modo de obtener los compuestos puros. Si en lugar de tiempos tomados
frecuentemente por comodidad se considera la retención en función del volumen
de elución, para recolectar un pico debe fraccionarse el total del volumen entre el
comienzo y la finalización de su señal. Existe un fenómenos que puede verse en
los cromatogramas, donde puede verse claramente que los picos o bandas menos
tenidos tienen menos ancho que los más retenidos. Este ensanchamiento de
banda es normal y como depende de la eficiencia de la columnas, los procesos
que la gobiernan se conocen como procesos de ensanchamiento de banda
intracolumnares. Existen efectos relacionados con estos últimos, como son el
proceso multipaso, la difusión longitudinal, la resistencia a la transferencia de
masa en la fase móvil y la resistencia a la transferencia de masa en la fase
estacionaria.
Existen
sin
embargo
otros
procesos
que
provocan
el
ensanchamiento de los picos y son producidos por factores instrumentales y
experimentales. Estos se conocen como procesos de ensanchamiento de banda
extracolumnares y si bien son inevitables, su conocimiento permite controlarlos y
eventualmente minimizarlos. Existen efectos relacionados con estos últimos, como
son el ensanchamiento de banda producido en el detector, producido por tuberías
y producido por el volumen de inyección.
En la última sesión de clase se logró entrar al laboratorio de cromatografía,
en el cual se pudieron observar los dos cromatógrafos de cromatografía líquida de
alta eficiencia con los que cuenta la Facultad de Química de la UADY. Los dos
funcionan bajo el mismo principio del HPLC, el primero de ellos es un equipo
Thermox de dos módulos que cuenta con un detector de UV sin arreglo de diodos,
éste se utiliza para docencia, servicios y para leer concentraciones altas, debido a
que no puede alcanzar a leer concentraciones muy bajas. El segundo es un
equipo Agilent, que se diferencia del primero en muchos aspectos, principalmente
porque el desgasificador es un módulo independiente, la inyección se puede
realizar de forma automática por medio de un robot que posee el sistema y de
igual forma tiene un termostato que puede mantener una temperatura constante a
la hora de realizar el estudio de las respectivas sustancias que se estén
analizando, con ello la precisión y la reproducibilidad es mejor en este tipo de
investigaciones. Otra diferencia del segundo equipo con respecto al primero es el
detector que posee, debido a que posee un detector universal, el de índice de
refracción.