Tecnología de Producción de Biomoléculas 7BV1 Hernández Banda Cristian Sebastian LACASA La lacasa (oxidorreductasa de oxígeno, EC 1.10.3.2) es una glucoproteína dimérica o tetramérica que forma parte de un grupo de enzimas llamadas polifenol oxidasas que contienen átomos de cobre en el centro catalítico y generalmente se llaman oxidasas multicobre. Una característica importante es el alto nivel de glucosilación (con restos de carbohidratos unidos covalentemente que van del 10 al 50% del peso total), lo que puede contribuir a la alta estabilidad de la enzima. Normalmente, la catálisis mediada por lacasa ocurre con la reducción de oxígeno a agua acompañada por la oxidación del sustrato. Las lacasas son oxidasas que oxidan los polifenoles, los fenoles sustituidos con metoxi, las diaminas aromáticas y una variedad de otros compuestos. Las lacasas están ampliamente distribuidas en plantas superiores y hongos (como Basidiomycetes, el género Trichoderma, Hongos de podredumbre blanca como Trametes sp. y ascomicetos del género Aspergillus) Aplicaciones Decoloración de tinte: La industria textil utiliza gran volumen de agua y productos químicos para el procesamiento de decoloración. La estructura química de los tintes proporciona una resistencia a la decoloración cuando se expone a la luz, el agua y otros productos químicos. Lacasa puede degradar estos tintes; es por eso por lo que se han desarrollado procesos basados en lacasa que incluyen tintes sintéticos y se utilizan en la industria en la actualidad. Biorremediación y Biodegradación: Bifenilos policlorados (PCB), benceno, tolueno, pentaclorofenol (PCP), 2,4-diclorofenol (2,4-DCP), entre otros son sustancias que se conocen por su efecto carcinógeno y mutagénico y son persistentes en el medio ambiente. Se ha demostrado que lacasas de Trametes versicolour y Pleurotus ostreatus son efectivas para la degradación de PCB y fenol. Industria del papel y la celulosa: La deslignificación con oxigeno catalizada por lacasa de la pasta kraft ofrece cierto potencial como sustituto del convencional blanqueo químico y tiene la ventaja de requerir una presión y temperatura mucho más bajas. Industria alimentaria: Las áreas de la industria alimentaria que se benefician del procesamiento con enzimas de lacasa incluyen el horneado, el procesamiento de jugo, la estabilización del vino y la biorremediación de aguas residuales. Tecnología de Producción de Biomoléculas 7BV1 Hernández Banda Cristian Sebastian Organismo productor de Lacasa Aplicación Trametes versicolor Filtración auxiliar Trametes versicolor Estabilización del vino Coriolopsis gallica Tratamiento de aguas residuales de cerveceras Trametes sp. Tratamiento de aguas residuales de destilerías Trametes versicolor; Pleurotus ostreatus Tratamiento de aguas residuales de molinos de oliva. Todas estas aplicaciones requieren grandes cantidades de enzimas, lo que hace que la producción de lacasa en plataformas de sobreexpresión sea potencialmente beneficioso. Sobreexpresión de Lacasa en Pichia pastoris El sistema de expresión de P. pastoris se usa comúnmente para lograr altos niveles de expresión de proteínas heterólogas. Se ha encontrado que esta levadura alcanza altas densidades celulares durante el crecimiento en un medio mínimo en un corto período de tiempo. Además, P. pastoris es un sistema de secreción eficiente y capaz de modificaciones postraduccionales (por ejemplo, glicosilación). López, Loera y Guerrero-Olazarán en 2009 lograron introducir los genes de lacasa de Trametes versicolor en la levadura P. pastoris para la expresión heteróloga. La enzima proveniente de esta especie de hongo es la más utilizada en la industria alimenticia y se ha demostrado su potencial biodegradante. Vector Los datos e información del gen de lacasa en T. versicolor fueron obtenidos de la base de datos NCBI. Utilizando el software Snapgene se obtuvo la secuencia del gen eliminando los intrones. Para insertar el gen en un vector de clonación, se usaron las regiones upstream y downstream del gen. En dichas secuencias se localizaron diversos sitios de restricción (upstream: AlwNI y PvuII; downstream: BsamI, BsaBI, BbvCI y BsgI). Con base en ellos se eligió un vector que contuvieran dichos sitios en lugares adecuados para la clonación y expresión de la proteína, es decir, que le proporcionaran la dirección correcta al inserto dentro del vector y que estuvieran cerca del promotor para poder expresar la proteína de interés. Tecnología de Producción de Biomoléculas 7BV1 Hernández Banda Cristian Sebastian El vector elegido fue pHIL-D2, un vector de 8210 pb para levaduras con BsaBI y PvuII como uno de los sitios de restricción en la región Polilinker. Este vector tiene las siguientes secuencias: Ori ColE1: Sitio de origen de Escherichia coli. Útil para poder generar múltiples copias del vector. Ori f1: Sitio de origen proveniente de un fago filamentoso. AOX1 promotor y terminador: Promotor inducible por metanol para la expresión de la proteína. AmpR: Gen de selección que proporciona resistencia a la ampicilina. Esta característica permite identificar las células que poseen el vector. pHIS4: Gen que codifica para una enzima trifuncional que participa en la biosíntesis de histidina. Transformación de Pichia pastoris Para la transformación de P. pastoris se utilizará una modificación del kit de transformación Pichia EasyComp de Thermo Fisher Scientific. El kit proporciona una alternativa a la electroporación y es un método rápido, económico y eficaz para la transformación ya que las soluciones incluidas están optimizadas para esta levadura. El protocolo especificado en el kit consiste en el uso de una solución para la preparación de células competentes junto con un choque térmico. Se menciona el uso de medio Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) adicionado con el antibiótico Zeocina para la eliminación de células no transformadas. Dicho antibiótico se cambiará por Ampicilina. Las soluciones incluidas en el kit son las siguientes: Solución de sorbitol con etilenglicol y dimetilsulfóxido (DMSO) para la preparación de células competentes. Polietilenglicol (PEG) para la transformación de células competentes. Solución salina para el lavado y sembrado de células transformadas. Pruebas de producción de Lacasa en P. pastoris PCR en tiempo real Para detectar la integración del gen de interés en el genoma de la levadura se utilizará PCR en tiempo real. Esta técnica permite ampliar y detectar al mismo tiempo ya que correlaciona el producto de la PCR de cada uno de los ciclos con una señal de intensidad de fluorescencia. Entre sus características están la alta especificidad, amplio rango de Tecnología de Producción de Biomoléculas 7BV1 Hernández Banda Cristian Sebastian detección y rapidez en la visualización del producto ya que no es necesario realizar una electroforesis posterior. Antes de la realización de la técnica se realizará una lisis de las levaduras transformadas utilizando la solución de liticasa de Arthrobacter luteus distribuida por Sigma. Dicha solución es una mezcla de líticasas, quitinasas, zimolasas y gluculasas. Posteriormente se congela la muestra a -80°C y se realiza un calentamiento a 92°C. Una vez que se aísla el DNA se procede a la realización de la PCR. Para la PCR se utilizarán primers 5’ y 3’ para los promotores AOX1, los cuales fueron utilizados para la expresión del gen de lacasa. Actividad enzimática de lasaca Para verificar la producción de lacasa por parte de P. pastoris modificada se medirá la oxidación de ABTS (ácido 2,2'–azino–bis–(3–etillbenzotiazolin–6–sulfonico)) por acción enzimática en cultivos libres de células. La reacción de oxidación provoca cambios en los espectros de absorción en la región del espectro visible, por lo que es posible cuantificar la cantidad de ABTS oxidado por la enzima por medio de espectrofotometría y de esta manera medir su actividad enzimática. Referencias (2018) Lyticase from Arthrobacter luteus. Missouri, Estados Unidos; Sigma-Aldrich. Consultado el 24/10/19. https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/Sigma-Aldrich/Product_Information_Sheet/1/l2524pis.pdf (2010) EasySelect ™ Pichia Expression Kit. 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