Secuenciación de fragmentos de ADN Laura Margarita Márquez Valdelamar 1, Alejandra Serrato Díaz 2 y René Cerritos Flores3 Introducción El ADN es una de las moléculas más importantes para la vida. Consiste de una doble hélice donde cada una de las cadenas es un polímero integrado por miles o incluso millones de nucleótidos (Stansfield 1992). Cada nucleótido, está formado por un azúcar (desoxirribosa), una base nitrogenada que puede ser adenina (A), timina (T), citosina (C) o guanina (G) y un grupo fosfato (Stansfield 1992). El orden que tienen los nucleótidos en el ADN es lo que se denomina secuencia (Figura 1) y las técnicas y métodos que se utilizan para conocer esa secuencia son llamados de secuenciación (de Necochea y Canul 2004). Conocer el orden de los nucleótidos es una herramienta con infinidad de aplicaciones porque la diferencia fundamental entre todas las moléculas de ADN que forman el material genético de los seres vivos es la secuencia de estas cuatro bases nitrogenadas (de Necochea y Canul 2004). 1 2 3 Laboratorio de Secuenciación Genómica de la Biodiversidad y de la Salud, Instituto de Biología, UNAM, 3er Circuito Exterior, Ciudad Universitaria, D.F., 04510. Departamento de Hidrobiología, Edif. S 032, UAM-Iztapalapa, Av. San Rafael Atlixco 186, Col. Vicentina, Iztapalapa, 09340 México, D.F. A.P.55-535. alej@xanum.uam.mx. Laboratorio de Inmunología, Facultad de Ciencias, UNAM, Dr. Balmis 148, Col. Doctores, Cuauhtémoc 05726, México D.F. cerritos@miranda.ecologia.unam.mx. 231 Figura 1. Secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN. Modificado de http://www. brasilescola.com/biologia/vida-ou-nao-vida.htm, consultado el 31 de enero 2011. A partir del descubrimiento de las estructura de la molécula de ADN (Watson y Crick 1953), hace poco más de 50 años, se han producido millones de secuencias de especies de arqueas, bacterias y eucariontes. En los inicios de la secuenciación, obtener la secuencia de un fragmento de 5 o 10 nucleótidos resultaba un proceso muy costoso y complicado. Sin embargo, los avances científicos y tecnológicos han permitido tener hoy en día una gran cantidad de secuencias de ADN con información de importancia médica, ecológica, fisiológica y evolutiva. En 1976, Walter Fiers y colaboradores, secuenciaron el genoma completo del bacteriófago Ms2 de aproximadamente unas 3 500 pares de bases (pb). Pero es en 1977 cuando surgen dos técnicas modernas de secuenciación de ADN: la secuenciación química de Maxam y Gilbert (1977) (Figura 2) y el método que revolucionó a la biología molecular, la secuenciación enzimática de Sanger (Sanger et al. 1977a). La técnica enzimática se basa en la interrupción controlada de la replicación del ADN in vitro. Se realiza una PCR del fragmento que se va a secuenciar pero, a diferencia de una PCR convencional (ver capítulo de PCR), se utiliza un solo iniciador y se agregan dideoxinucleótidos (ddNTPs) que carecen del grupo hidroxilo en el extremo 3´ (Figura 3) y están marcados con radiactividad o con fluoróforos. Cuando se incorpora un dideoxinucleótido a la cadena en elongación, se termina su amplificación, de tal manera que al final, se tienen 232 Herramientas moleculares aplicadas en ecología Figura 2. Secuenciación química de Maxam-Gilbert. El fragmento de ADN que se desea secuenciar se desnaturaliza (1), se marca el extremo 5’ con radiactividad (2), la muestra se divide en cuatro alícuotas que son tratadas con diferentes reactivos químicos que cortan al ADN en bases específicas (A, T, C, G) (3), en cada alícuota, queda una colección de fragmentos de ADN de diferente tamaño que termina en una base específica. Los fragmentos se separan electroforéticamente en un gel de poliacrilamida (4) y se visualizan y analizan por medio de una radiografía (5). Modificada de http://www.nd.edu/~aseriann/maxam.html, consultado en enero 2011. A fragmentos de diferente longitud, cada uno terminando en un ddNTPs (Figura 4). Los fragmentos obtenidos, se separan y analizan electroforéticamente de manera manual o automática (Figura 5). Con esta técnica Fred Sanger y colaboradores (1977b) secuenciaron el primer genoma viral de ADN llamado PhiX174, de aproximadamente 5 500 pb y Secuenciación de fragmentos de ADN 233 Figura 3. Dideoxinucleótido. Al carecer del grupo hidroxilo en el extremo 3´ no permite que la polimerasa incorpore un nucleótido más. Modificada de http://personales.ya.com/geopal/biologia_2b/unidades/ejercicios/act13biointema6.htm, consultado en enero 2011. Figura 4. Fragmentos de ADN obtenidos después de la PCR de secuenciación, son de diferentes tamaños y cada una termina en una de las bases marcadas con un fluoróforo distinto. Modificada de http://perso.wanadoo.es/mcs955/adn_en_este_proyecto.htm, consultado en enero 2011. 234 Herramientas moleculares aplicadas en ecología Figura 5. Secuenciación automática de ADN. Se realiza una electroforesis del producto de PCR de secuenciación (Figura 4), los fragmentos migran de acuerdo a su tamaño (los pequeños migran más rápido), el fluoróforo con el que van marcados es detectado por un láser, éste envía una señal que es interpretada por el equipo en forma de un pico en un electroferograma. (Modificada de Pierce 2003). 11 genes. Desde entonces, este método ha sido utilizado ampliamente en muchas líneas de investigación, generando tal cantidad de secuencias que a principios de los ochenta fue necesario crear bases de datos universales para resguardar la información y hacerla accesible a los usuarios. En 1982, año en que se crea el Gen Bank a través del National Center for Biotechnology Information (NCBI), existían más de 2 000 secuencias y para principios del 2011 esta base de datos estaba integrada por más de 100 000 000 secuencias. En cuanto a genomas completos, en total se tienen registrados y en proceso de ser secuenciados cerca de 6 000 distintos, siendo los virus los que mayor número de variantes secuenciadas presenta (NCBI 2011). Se cuenta con las siguientes secuencias: 1 548 bacterias, 83 arqueas, 281 ecuariantes y 281 genomas. En 1995, año que representa un parteaguas en las ciencias genómicas, se secuencia el primer genoma completo de un organismo, de la bacteria oportunista Haemophilus influenzae, que causa múltiples infecciones en humano como meningitis, otitis, conjuntivitis y sinusitis (Fleischmann et al. 1995). El genoma de esta especie es de alrededor de 1, 800, 000 pb con más de 100 genes asociados con el proceso de infección (Fleischmann et al. 1995). A partir de ese año se comenzó la secuenciación de genomas, principalmente de microorganismos de importancia médica. Es hasta 2001 (International Human Genome Sequencing Consortium) que se publica parcialmente el genoma de la Secuenciación de fragmentos de ADN 235 Etapas de la técnica a) Obtención del fragmento que se desea secuenciar (templado o molde) b) Purificación del templado c) PCR de secuenciación d) Purificación del producto de PCR de secuenciación con sephadex e) Deshidratación de la muestra f) Desnaturalización con formamida g) Electroforesis de secuenciación h) Análisis 236 Herramientas moleculares aplicadas en ecología especie humana como resultado de trece años de trabajo con la colaboración de universidades y centros de investigación de los Estados Unidos de América, Canadá, Nueva Zelanda y Gran Bretaña (Hutchinson III 2007). Este genoma está compuesto por 3 080 millones de pares de bases y entre 20 000 y 25 000 genes codificantes para proteínas y el 90%, son secuencias no codificantes. Gracias al continuo desarrollo de las técnicas, equipos y herramientas de análisis, actualmente nos encontramos en la época de “secuenciación de la siguiente generación”, que consiste en métodos de secuenciación en paralelo, a gran escala, aplicables a genomas completos. Con estas técnicas se puede secuenciar un genoma humano en pocos días y en un solo laboratorio sin necesidad de clonar ningún fragmento (Shendure y Ji 2008). A pesar de los grandes avances en secuenciación, en este capítulo desarrollamos el protocolo para el método de secuenciación de Sanger, para fragmentos de no más de 1 500 pb en un equipo de secuenciación automático ABI Prism, porque esta técnica se sigue utilizando en la mayoría de laboratorios y es una herramienta muy robusta en muchas áreas de investigación. Protocolo Equipo • Espectrofotómetro • Termocicladora (PCR) • Vortex • Refrigerador 4 °C • Centrífuga para microtubos de 1.5 ml • Concentrador de vacío • Secuenciador automatizado ABI PRISM 3100 Material • Juego de micropipetas de 2, 10, 20, 100, 200 y 1000 µl • Gradillas para microtubos de 1.5 ml y para placas de 96 pozos • Microtubos de 1.5 ml. • Microtubos para PCR (el tamaño depende del termociclador que se ocupará) Secuenciación de fragmentos de ADN 237 • Puntas para micropipetas de 10, 200 y 1000 µl • Columnas Centrisep con Sephadex Applied Biosystems • Placas de 96 pozos para secuenciador 3100 AB • Tapas para placas de 96 pozos • Base para placas de 96 pozos • Juego de 4 capilares para secuenciador 3100 • Papel kimwipe • Plumones indelebles Reactivos • Big dye terminator V3.0 Applied Biosystems • Buffer 2.5 X para big dye V3.0 Applied Biosystems • Agua grado biología molecular • Templado de DNA • Iniciadores para la región a secuenciar 10 pmol/µl • Formamida Hi Di (CAS N°75-12-7) • Buffer EDTA 10X AB • Polímero para secuenciador AB 3100 POP6 Método 1. Obtención del fragmento que se desea secuenciar (templado) 1.1 El fragmento de ADN que se secuenciará depende completamente del objetivo del estudio. Se puede obtener mediante PCR o por clonación en algún vector. 1.2 Cerciorarse de tener en condiciones óptimas el templado, la calidad de la secuencia depende completamente de la calidad y cantidad del templado. En caso de que el fragmento a secuenciar sea un producto de PCR asegurarse de tener un solo producto. 2. Purificación del templado 2.2 Purificar el templado con el método que se elija, puede ser convencio- nal o con kits comerciales. 2.3 Cuantificar el templado purificado en un espectrofotómetro para asegurarse de tener la cantidad necesaria para la reacción (5 a 10 nanogramos por cada 100 pb). 238 Herramientas moleculares aplicadas en ecología 3. PCR de secuenciación 3.1 Preparar la reacción de secuenciación con: 2 µl de big dye, 2 µl de buffer 2.5X, la cantidad de templado determinada, 1 µl del iniciador y se completa la reacción a 10µl con agua bidestilada esterilizada o inyectable. 3.2 Colocar los microtubos en la termocicladora usando el siguiente programa: 96° C x 10 segundos 50° C x 5 segundos 60° C x 4 minutos Por 25 ciclos 4° C 4. Purificación del producto de PCR de secuenciación con sephadex 4.1 Dar golpes suaves a la tapa superior de las columnas Centrisep para que el sephadex (polvo blanco) se asiente en la parte inferior de la misma. 4.2 Quitar la tapa superior y agregar 0.8 ml de agua bidestilada esterilizada o inyectable. 4.3 Volver a poner la tapa superior y mezclar perfectamente en el vortex o por inversión de la columna. Es importante eliminar todas las burbujas que se forman golpeando suavemente la columna o con ayuda de una pipeta. 4.4 Colocar las columnas en una gradilla y dejar que el gel se hidrate a temperatura ambiente por al menos dos horas. Las columnas hidratadas pueden almacenarse hasta por 2 semanas a 4º C. Las columnas que se encuentran a 4 ºC deben alcanzar la temperatura ambiente antes de usarlas. 4.5 Agregar 10 µl de agua bidestilada esterilizada o inyectable a cada muestra que se va a purificar. 4.6 Quitar la tapa superior de las columnas Centrisep y después la tapa inferior. 4.7 Colocar inmediatamente cada columna en un tubo colector y esperar a que decante el agua excedente por gravedad. 4.8 Desechar el agua que se acumuló en el tubo colector. 4.9 Centrifugar la columna en una microcentrífuga a 730 x g (3 000 rpm) por dos minutos. 4.10 Colocar la columna (sin el tubo colector) en un tubo de 1.5 ml con el nombre de la muestra que se purificará en esa columna. 4.11 Tomar con una micropipeta la muestra (20 µl) y colocarla con cuidado en el centro de la columna de sephadex sin tocarla. Secuenciación de fragmentos de ADN 239 4.12 Colocar la columna junto con el microtubo en una microcentrífuga a 730 x g por dos minutos. 4.13 Desechar la columna. 5. Deshidratación de la muestra 5.1 Secar las muestras en un concentrador de vacío o dejando destapados los tubos en un lugar completamente oscuro hasta que no quede nada de agua (una vez que las muestras estén secas, se pueden almacenar envueltas en papel aluminio a 4 ºC o a -70 ºC hasta por 6 semanas). 6. Desnaturalización con formamida 6.1 Agregar a cada microtubo, con la muestra seca, 15 µl de formamida. 6.2 Centrifugar por 5 minutos a 13 000 rpm (después de este paso las muestras se pueden almacenar de 2 a 3 semanas a menos 20 ºC y cubiertas con papel aluminio). 7. Electroforesis de secuenciación 7.1 Cargar las muestras en una placa de 96 pozos. 7.2 Tapar la placa y colocarla en la base. 7.3 Oprimir la tecla Tray del equipo para que la charola se mueva hacia el frente. 7.4 Verificar que: las jeringas tengan polímero (POP6), los compartimentos de amortiguador tengan los niveles apropiados de buffer EDTA 1X y agua inyectable o bidestilada esterilizada en el resto de los compartimientos. 7.5 Colocar la placa en la charola y cerrar las puertas del secuenciador con cuidado. 7.6 Abrir, en la computadora, el programa 3100 Data Collection y capturar los datos de las muestras. 7.7 Iniciar la electroforesis. 8. Análisis 8.1 Al terminar la electroforesis analizar los resultados en el programa Sequencing Analysis. Métodos de análisis Interpretación de electroferogramas Un electroferograma es el gráfico que arroja el secuenciador después de analizar la electroforesis. Éste, muestra el orden de las bases a partir de curvas de 240 Herramientas moleculares aplicadas en ecología fluorescencia, una por cada base, y se puede visualizar en programas como Chromas y BioEdit que se obtienen de manera gratuita en internet. Es importante revisar los electroferogramas antes de continuar con los análisis de la muestra debido a que nos dan mucha información, incluyendo la calidad de la PCR y por ende la confiabilidad de los datos obtenidos (Figura 6). Figura 6. Interpretación de electroferogramas, a cada una de las bases le corresponde un color que el equipo interpreta como un pico y en la parte superior le asigna la base correspondiente. A) Secuencia correcta, a cada base corresponde un pico bien definido. B) Existe una contaminación de otra secuencia de ADN, por eso se ven los picos (secuencias) encimados, para solucionar este problema se debe hacer más específica la amplificación por PCR o clonar el fragmento. C) Cuando el producto no está bien purificado el templado o la concentración es menor a la recomendada, se termina la señal antes de que se lea todo el fragmento. Secuenciación de fragmentos de ADN 241 Comparación de la secuencia Una vez obtenida la secuencia de interés, independientemente del objetivo, es indispensable compararla con las secuencias disponibles en las diferentes bases de datos ubicadas en Internet. Este tipo de análisis se pueden llevar a cabo mediante programas de cómputo, los cuales usan distintos algoritmos de búsqueda, siendo el más usado el BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://www.ncbi.nlm.nih.gov). De esta manera se verifica si se logró secuenciar el fragmento que se esperaba. Consenso Se debe obtener la secuencia consenso al comparar el sentido Forward (5’-3’) y el sentido Reverse (3’-5’). Este paso es muy importante porque las polimerasas tienen diferentes porcentajes de fidelidad o en ocasiones existen problemas en la electroforesis de secuenciación y esto nos puede generar falsos polimorfismos. También es útil el consenso cuando el fragmento que se está analizando es mayor a 700 pb debido a que permite obtener un tamaño mayor de secuencia al complementar ambas cadenas (Figura 7). Figura 7. Secuencia consenso. Para poder comparar las dos hebras, se debe obtener el complemento de la secuencia reverse, se alinea con la forward y se obtiene un consenso al analizar los electroferogramas en los sitios que exista conflicto. Traducción Si se está trabajando con una región codificante es indispensable obtener la secuencia de la proteína para la que codifica la secuencia de ADN obtenida, ubicar los codones y poder, entre otras cosas, analizar tasas de mutación por posición de nucleótido. Este paso también permite evaluar si la secuencia consenso se obtuvo de manera apropiada. Con los distintos programas de cómputo, muchos de ellos disponibles dentro de la misma página del 242 Herramientas moleculares aplicadas en ecología NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), es posible conocer cuál es el marco de lectura correcto para esa secuencia de ADN codificante. Alineamiento Dependiendo del propósito del estudio, lo siguiente es generar hipótesis de homología de las bases al comparar y alinear las secuencias entre los organismos secuenciados. En un proceso de alineación de secuencias, el mecanismo básico es simplemente colocar en la misma posición a todas las bases. Para esto se utilizan programas de cómputo como CLUSTAL X que es el más usado. Esta herramienta se incluye en los diversos programas de edición de secuencias como BioEdit. Aplicaciones El avance en la secuenciación de los ácidos nucleicos ha generado un amplio conocimiento en el campo de la genómica. Actualmente se tiene una gran cantidad de información con aplicaciones innumerables. Entre otras cosas, la secuenciación ha permitido entender la asociación de enfermedades con la variabilidad genética, la función de genes, el patrón de expresión de genes nuevos, la similitud o variación genética entre especies diferentes, la organización de la información genética, el origen de algunos genes, etc. (Hutchinson III 2007, Shendure y Ji 2008). Al parecer, no hay un límite en las aplicaciones de la información que se obtiene de la secuenciación, incluso han surgido nuevas disciplinas como la filogeografía, filogenómica, metagenómica y genómica. A continuación mencionamos algunas de las áreas en las que las secuencias son frecuentemente utilizadas. Sistemática filogenética Actualmente, la sistemática filogenética es una de las disciplinas más integrales en biología. Tiene como objetivo detectar, describir y explicar la organización y el origen de la diversidad biológica (Moritz y Hillis 1996). Se ha convertido en la base de análisis de patrones biogeográficos, conductuales y ecológicos dentro de un marco evolutivo (Espinosa de los Monteros 2003). El éxito del uso de las secuencias de ADN en sistemática se debe a varias razones, entre las que se Secuenciación de fragmentos de ADN 243 pueden resaltar: el número de caracteres que se pueden obtener está limitado solo por el tamaño del genoma debido a que cada base se considera un caracter, estos caracteres son independientes a la influencia del ambiente (a diferencia de los cambios morfológicos generados por la plasticidad fenotípica), el genoma tiene regiones con diferentes tasas de evolución, todos los seres vivos comparten algunas regiones de ADN por lo que se puede incluir en un estudio a organismos de diferentes dominios (Woese 1977), se puede inferir la edad de los eventos de interés al calibrar el reloj molecular (Page y Holmes 1998, Moreau et al. 2004) y una secuencia de ADN se puede obtener a partir de una o pocas células (Martínez 1997). Biodiversidad El uso de secuencias ha sido útil para expandir la descripción de la biodiversidad y clarificar si algunas formas más o menos distintas en su fenotipo o aisladas geográficamente son especies diferentes o no (García-Moreno 2003). Por otro lado, solo hasta que se incluyeron secuencias de ADN en la determinación de especies, se ha podido identificar nuevas especies que fenotípicamente son idénticas a otras (Molbo et al. 2003). Filogeografía La filogeografía surge con la introducción de análisis de secuencias de ADN mitocondrial (ADNm) en estudios de poblaciones. Esta disciplina revolucionó las perspectivas históricas y filogenéticas de la estructura intraespecífica de las poblaciones y proporcionó un puente entre los estudios micro y macroevolutivos. Como el ADNm no se recombina, se hereda maternamente (en animales) y presenta una rápida tasa de evolución, se puede inferir la historia evolutiva de las poblaciones por medio de hipótesis genealógicas (Avise 1994), es recomendable también incorporar en el análisis marcadores nucleares para tener la historia biparental. Conservación de la biodiversidad Una de las aplicaciones más importantes de la secuenciación de ADN es la que se le ha dado en el área de conservación de la biodiversidad. Debido al 244 Herramientas moleculares aplicadas en ecología deterioro ambiental y a las altas tasa de extinción que se presentan en la actualidad, es fundamental describir lo más completo posible la biodiversidad y conocer los procesos evolutivos que están ocurriendo en las poblaciones para establecer prioridades de conservación (Moritz 1994, Frankham et al. 2002). El uso de secuencias de ADN también ha permitido el estudio de poblaciones de especies de difícil manejo o acceso como las ballenas, gracias a que el ADN se puede obtener de pequeñas cantidades de muestra, se utilizan dardos especiales para tomar una pequeña biopsia del animal sin causarle un daño significativo (Baker y Palumbi 1996) o se pueden hacer análisis a partir de excretas o pelo. Epidemiología Con las secuencias de regiones con tasas altas de mutación se puede inferir el origen y evolución de las enfermedades infecciosas así como conocer qué factores son los que permiten que éstas se propaguen (Page y Holmes 1998, Brown 1999). Código de Barras de la Vida El código de barras de la vida (The Barcode of Life, http://www.barcoding. si.edu), es un proyecto mundial en el que se planea secuenciar una región específica de cada una de las especies para poder identificarlos con precisión, rapidez y a partir de poco material. Entre sus principales aplicaciones está la determinación de especies que tienen complicados ciclos de vida con diferentes estadíos (Reséndiz 2004), conocimiento de comunidades biológicas y control de tráfico de especies. Ventajas y desventajas Una de las grandes ventajas al trabajar con secuencias es que el ADN se encuentra en todas las células de los organismos y se puede recuperar de tejido vivo o muerto. La mayoría de tejidos o fuentes de los que es posible extraer ADN se colectan fácilmente en el campo y en muchas ocasiones es suficiente menos de un gramo para extraerlo (véase capítulo de extracción de ADN). La Secuenciación de fragmentos de ADN 245 molécula de ADN es tan estable que puede permanecer intacta por cientos de años (Cano et al. 1993). Otra ventaja es que las diferentes regiones del genoma experimentan diferentes tasas de evolución. Por ejemplo, las regiones que codifican para genes están sujetas a selección natural, la cual previene la acumulación de mutaciones, en cambio, las regiones no codificantes son más variables porque pueden acumular cambios mutacionales de manera neutral (Parker et al. 1998). Esta tasa evolutiva diferencial permite realizar estudios a amplias escalas como la evolución del virus VIH en un solo paciente a lo largo de un mes o el árbol de la vida en la Tierra con seleccionar el fragmento adecuado para nuestro estudio (Page y Holmes 1998). También, se puede trabajar con secuencias de regiones mitocondriales o de cloroplasto que generalmente son heredadas de manera uniparental para desarrollar estudios de efecto fundador, hibridación y relaciones matrilineales (Lewin 2001). La principal desventaja de esta técnica es el costo. Sin embargo, los avances tecnológicos la hacen cada vez más barata, por ejemplo los secuenciadores son cada vez más precisos y solo requieren de cantidades mínimas de reactivos para obtener un buen resultado. Perspectivas La técnica de secuenciación de Sanger se continúa utilizando en un gran número de laboratorios e incluso se siguen produciendo equipos con gran capacidad de análisis de muestras, hoy en día es posible procesar 96 muestras en menos de una hora y media lo que hace más eficiente la obtención del resultado. Sin embargo, en los últimos años han surgido nuevos métodos que superan al método dideoxi. Estos métodos son “masivamente paralelos” y el número de secuencias que leen en un solo experimento es muy superior al logrado por la electroforesis capilar desarrollada en este capítulo. Estos métodos junto con los nuevos equipos de secuenciación hacen que un solo investigador en una sola corrida, obtenga lo que hace una década se lograba en varios años y con la colaboración de varios laboratorios (Hutchinson III 2007, Shendure y Ji 2008). La secuenciación es una de las técnicas moleculares que más ha crecido en los últimos años, por lo cual las perspectivas son muy amplias. En los últimos años, las plataformas de secuenciación de ADN de forma masiva en paralelo (Ronaghi et al.1998, Ronaghi 2000) están disponibles en laboratorios de va246 Herramientas moleculares aplicadas en ecología rios países (incluido México) reduciendo el costo de la secuenciación del ADN en más de dos órdenes de magnitud. La gran cantidad de información que se genera impone retos al desarrollo de protocolos robustos para la generación de bibliotecas de secuenciación, la creación de nuevos enfoques y métodos de análisis de datos, y un replanteamiento del diseño experimental. La próxima generación de la secuenciación del ADN permite el análisis exhaustivo de genomas, transcriptomas e interactomas que tiene el potencial de acelerar la investigación biológica y biomédica (Hutchinson III 2007, Shendure y Ji 2008). Se espera el surgimiento de nuevas líneas de investigación, así como surgieron hace algunos años, la filogenómica que tiene como objetivo generar propuestas filogenéticas con multigenes para explicar de una manera robusta la historia evolutiva y las relaciones entre grupos; o la metagenómica que busca secuenciar ADN del ambiente y con ello caracterizar a las especies que componen una comunidad y descubrir los genes de estas especies aun en organismos de difícil aislamiento y cultivo, como bacterias, arqueas, hongos, protozoarios (Vogel y Nalin 2003, Hutchinson III 2007, Shendure y Ji 2008). Bibliografía Avise J.C. 1994. Molecular markers, natural history and evolution. Chapman y Hall. New York, Estados Unidos de América. Baker C. S. y S.R. 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A structure for DNA. Nature 171: 737-738. Woese C.R. 1977. Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74:5088-5090. Secuenciación de fragmentos de ADN 249 Técnicas de Biología Molecular DNA I. Enzimas de restricción Análisis Las enzimas de restricción fueron aisladas de bacterias; su función natural es proteger contra DNA extraño II. Separación electroforética de moléculas de DNA – – (A) Geles de secuenciación (separación de bandas con 1 nt de diferencia) (B) Electroforesis para RFLP (sepración entre 100 a 10000 nt) + – + + (C) Electroforesis de campo pulsante (separación de DNA cromosomal) III. Secuenciación de DNA por el método de Sanger No acepta elongación de la cadena de nucleotidos por la DNA polimerasa • dsDNA molde (¿secuencia?) • 4 desoxiribonucleótidos (dNTPs) • cebador de DNA • DNA polimerasa 3’ 5’ 5’ 3’ Secuenciación automatizada de DNA Marcaje de un fragmento de DNA (obtención de una sonda) γ β α dCTP[αP32] Hibridación y reconocimiento de secuencias con alta homología 65oC 50oC IV. Southern Blot (detección de secuencias específicas de DNA) 1. Aislamiento de DNA 2. Cortar con enzimas de restricción 3. Separar fragmentos por electroforesis 4. Desnaturalizar el DNA 5. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon 6. Hibridar con sonda específica 7. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de fosforimager V. Northern blot (detección de secuencias específicas de RNA) A nivel de transcriptoma (RNA) Northern Blot 1. Aislamiento de RNA 2. Desnaturalizar el RNA 3. Separar por electroforesis desnaturalizante 4. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon 5. Hibridar con sonda específica 6. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de fosforimager Expresión de genes Bromuro de etidio Sonda P32 Southern Blot Northern Blot 28S 18S VI. Western Blot (detección de proteínas específicas con anticuerpos) La detección de proteínas sirve para conocer: 1. 2. 3. 4. 5. Niveles de expresión Isoformas Modificaciones postraduccionales Tiempo de vida media y degradación Localización subcelular VII. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cebador reverso cebador directo Desnaturalizar Alineamiento Polimerización 94-95ºC 55-65ºC 72ºC La amplificación es exponencial 1 2 4 8 En 40 ciclos se obtienen millones de copias del gen o fragmento particular de interés Pruebas de identidad (PCR a nivel de DNA) El RT-PCR se puede utilizar como alternativa del Northern blot DNA: PCR Amplificación directa Exones + intrones RNA: RT-PCR 1. Transcripción reversa (obtención de cDNA) 2. Amplificación por PCR Solo exones Después del PCR o RT-PCR los fragmentos se pueden clonar Los cebadores son diseñados con extremos reconocidos por enzimas de restricción VIII. DNA recombinante DNA A ligasa DNA AB DNA B Mutagénesis sitio dirigida La mutación se incluye en uno de los cebadores para el PCR Mutagénesis dirigida Se pueden generar proteínas mutadas manipulando su DNA Generalmente la mutagenesis se hace por PCR: - Introduccion de mutacion puntual (cambio de un aminoacido por otro) - Deleciones Vectores de clonación 1. Plásmidos 2. Fagos 3. Cósmidos 4. Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1. Plásmidos DNA doble cadena, circular, origen propio de replicación Se pueden clonar fragmentos entre 1,000 y 10,000 nucleótidos Marcadores de resistencia a antibióticos Permiten la selección de bacterias transformadas con el plásmido o con el DNA recombinante Otras características de los plásmidos Sitios de clonación múltiples: varias enzimas de restricción que solo cortan una vez en el plásmido Plásmidos de expresión Caracteristicas adicionales: - Promotor regulable - Terminador de la transcripcion - Sitio de reconocimiento por el ribosoma Obtención de múltiples copias de la molécula recombinante Múltiples copias de DNA recombinante Plásmido de bajo número de copias Plásmido de alto número de copias La transformación implica la introducción de DNA extraño a una célula hospedante Señalización celular 3 Cuatro tipos generales de receptores de membrana plasmática ✓ ✓ Segundos mensajeros Transportan la información generada en la superficie celular a los sensores y efectores internos Segundos mensajeros Los más frecuentes son: ✓ AMP cíclico (cAMP) ✓ GMP cíclico (cGMP) ✓ 1,2-diacilglicerol (DAG) ✓ inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) ✓ Calcio (Ca2+) Segundos mensajeros Todas las PLCs catalizan la misma reacción a partir del sustrato fosfatidilinositol 4,5 bifosfato o PIP2. La actividad enzimática de las PLCs produce dos segundos mensajeros: Diacilglicerol (DAG) Inositol 1,45 trifosfato (IP3) Activación artificial de la vía del AMPc ✓ La toxina colérica activa permanentemente a la Gs, incrementando los niveles de AMPc, afecta el flujo normal de iones en el intestino produciendo deshidratación. ✓ La forskolina, un producto vegetal, activa específicamente a la adenilil ciclasa. En pequeñas dosis se utiliza para tratar el glaucoma. ✓ La cafeína y teofilina (broncodilatador) inhiben a la PDE que degrada el AMPc, aumentando sus niveles. Entre otras cosas aumentan la frecuencia cardiaca y relaja el musculo liso de los bronquiolos. ✓ La toxina pertussis inhiben a la Gi (que permanece unida a GDP). Mecanismo de acción de la toxina pertussis Las subunidades S2 a S5 se unen a su receptor sobre la membrana celular. La subunidad S1 se internaliza al citoplasma y ADP ribosila la subunidad alfa de la proteina Gi. Al ser ribosilada por efecto de la toxina impide su función reguladora y por ende evita la reducción del AMPc, favoreciendo su acumulación. ✓ ✓ ✓ Proteínas blanco Intervienen en procesos celulares básicos. De acuerdo con el tipo de célula y de mensaje. Blanco del IP3: canales de Calcio • Concentración de Ca++ intracelular = 10-7 M • Concentración de Ca++ extracelular = 10-3 M Formación del complejo Ca++ Calmodulina Otra proteína de unión a calmodulina es troponina (músculo) • Calmodulina es ampliamente distribuida en todos los tejidos. • Cuatro sitios de unión a calcio. • Une a numerosas proteínas blanco (quinasas) • Acciona sobre mecanismos de actividad enzimática, canales iónicos y transcripcion de genes (CREB-también estimulado por AMPc) Vías del Ca++ y kinasas dependientes de CaM • Complejo Calciocalmodulina en su forma activa Kinasa – Ca – CaM dependiente Mecanismos de control de la concentración citosólica de Ca2+ ✓ Salida del RE por receptores de IP3 o de rianodina (se equilibra con calcio/ATPasa). ✓ Salida de la mitocondria por intercambiador sodio/calcio (se equilibra con el uniport). Procesos en los que participa el calcio como segundo mensajero • Excitabilidad nerviosa (liberación de neurotransmisores) • Contracción muscular (en los tres tipos musculares) • Secreción de hormonas • Regulación enzimática (PKC, PDE) • Coagulación de la sangre • Fertilización del ovulo (activación) • Muerte celular programada (apoptosis) ✓ ✓ ✓ ✓ La respuesta iniciada por la proteína blanco puede precipitar un cambio en la expresión génica, una alteración en la actividad de las enzimas metabólicas, una nueva configuración del citoesqueleto, un aumento o descenso de la movilidad celular, un cambio de la permeabilidad iónica, activación de la síntesis del DNA (ácido desoxirribonucleico) e incluso la muerte de la célula. Respuesta Las señales extracelulares pueden inducir respuestas celulares rápidas o lentas Vías protein kinasas Vía para la síntesis del Acido Araquidónico Procesos de Inflamación Implicados en Asma y Alergias Derivados del AA y algunas de sus acciones Ultimo ejemplo de receptores G • Los fotoreceptores (conos y bastones) de la retina contienen en la membrana de sus discos membranosos un pigmento llamado RODOPSINA. • La rodopsina esta formada por una porción proteica correspondiente a la OPSINA y una porción que corresponde al RETINAL derivado de la vitamina A Receptores de NT: metabotrópicos y ionotrópicos Foto-transducción en fotoreceptores Respuesta de fotoreceptor a la luz ¿Por qué tantos pasos? Amplificación cuando las enzimas activan las enzimas, el número de moléculas afectadas aumenta geométricamente en una cascada de enzimas ¿Por qué tantos pasos? Efectos genómicos Efectos genómicos Señalización celular Receptores Hay una diversidad de receptores en una célula y también varias moléculas señalizadores, o inductoras de una señal La célula esta rodeada de varias moléculas, ¿Cómo escoge la célula a cual se une y como se une? Genera que se tenga diferentes respuestas Agonistas vs Antagonistas ✓ Agonistas: Sustancias químicas que ocupan receptores y los activan ✓Antagonistas: Sustancias químicas que ocupan receptores pero no los activan. (bloquean el sitio de activación de los receptores) ¿De qué depende si se activa? Ejemplo: Rol de la Afinidad Acetilcolina tiene efecto de contracción en el musculo. Se han distinguido 5 subclases de receptores muscarínicos Amanita muscaria Sustancias producidas por plantas tiene receptores en humanos. Metabolitos secundarios utilizados para defenderse. Respuesta celular • 2 tipos básicos de respuesta celular: ✓ Receptor Función a) Detectar las señales que llegan b) Transmitir la información a los transductores internos que inician la ruta de señalización Tipos de receptores a) Receptores Intracelulares El ligando (moléculas hidrofóbicas como la testosterona o muy pequeñas como el óxido nítrico) atraviesa la membrana plasmática e interacciona con la proteína receptora en el interior celular. ➢ Citoplasmáticos ➢ Nucleares b) Receptores de superficie o extracelulares El ligando (una molécula hidrofílica o muy grande) interacciona con la proteína receptora en la superficie de la célula diana. Receptores de membrana • Estimulado por sustancias diferentes Tipos de receptores de superficie celular 1. Receptores asociados a canales de iones 2. Receptores asociados a proteínas G 3. Receptores asociados a enzimas ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ Receptores guanilato ciclasa, que catalizan la producción de GMPc en el citosol. Receptores tirosina kinasa, que fosforilan determinados residuos de tirosina de un pequeño grupo de proteínas señal intracelulares. Receptores asociados a tirosina kinasas, que están asociados a proteínas que tienen actividad tirosina kinasa. Receptores tirosina fosfatasa, que eliminan grupos fosfato de residuos de tirosina de determinadas proteínas señal intracelulares. Receptores serina/treonina kinasa, que fosforilan determinados residuos serina o treonina de algunas proteínas intracelulares. 1.Receptores asociados a canales de iones Regulados por voltage (voltage-gated channels) Requieren despolarización (raramente hiperpolarización) Regulados por ligando (ligand-gated channels) Ligandos extracelulares (neurotransmisores) Ligandos intracelulares (Ca+2, cAMP) Receptores ionotrópicos Respuesta iónica “Dependiente de ligando” ¿Cuál es el efecto de los canales iónicos? Los canales iónicos transporta cargas (las células tienen carga negativa) Las células tienen un gradiente eléctrico Cambio transitorio y local • El ingreso de cargas, sube el potencial de membrana (esta despolarizando) • Membrana en reposo 70 mV • Se propaga la despolarizacion Potencial y tiempo Si trazamos una grafica de los cambios de voltaje celular, tendremos algo así: Canales dependientes de ligandos Principales iones utilizados en flujos locales: Ca++ Calcio: gradiente extracelular + depósitos intracelulares (REL) El Ca++ esta almacenado en el RE. En el músculo es el retículo sarcoplãsmico ¿Cómo se controlan las acciones celulares? → Actividad enzimática Control de la actividad enzimática: ✓ Alosterismo ✓ Fosforilación ✓ Síntesis/degradación de enzimas Alosterismo Fosforilación: ATP – ADP Muchos procesos celulares se fosforilan y desfosforilan. ¿Cómo se activa e inactiva proteínas? Modificando a las proteínas: (A) Alosterismo (B) Fosforilación (kinasas) Modificación tridimensional de enzimas que ya existen [activación/inactivación] Síntesis de nuevas enzimas Tercera posibilidad: (C) Síntesis de enzimas de novo Señales extracelulares que se unen a receptores de superficie o receptores intracelulares • Naturaleza química de la señal (solubilidad en lípidos) 3er tipo de receptores: 3 tipos básicos de receptores membranales Receptores acoplados a proteínas G G protein-coupled receptors GPCR Ligandos naturales que se unen con GPCR Diversas de hormonas Neurotransmisores, Derivados del opio, Quimioatrayentes (moléculas que atraen células fagocíticas del sistema inmunitario), Odorantes y Saborizantes (moléculas detectadas por los receptores olfatorios y gustativos que inducen los sentidos del olfato y el gusto) y Fotones. Especificidad en GPCRs ✓El dominio extracelular determina la especificidad del ligando. ✓El dominio citoplasmático determina la especificidad de la proteína G. ✓Juntos, estos dos dominios enlazan a una hormona particular para una vía de señalización particular. Estructura del Receptor Diagrammatic representation of a typical member of the serpentine class of G-protein coupled receptor. White, red, blue, and green spheres represent amino acids. Serpentine receptors are so-called because they pass through the plasma membrane seven times. Structural characteristics include the three extracellular loops (EL-1, EL-2, EL-3) and three intracellular loops (IL-1, IL-2, IL-3). Most GPCRs are modified by carbohydrate attachment to the extracellular portion of the protein. Shown is typical N-linked carbohydrate attachment. The different colored spheres are involved in ligand-binding and associated G-protein binding as indicated in the legend. GPCR 7 dominios transmembranales Proteína G La proteína G: Proteína intracelular activada por GTP • Cambios en el receptor “se transmiten” a la proteína G • La proteína G activa, desencadena efectos intracelulares Secuencia de activación e inactivación de los receptores acoplados a proteínas G heterotriméricas En el paso 1, el ligando se une con el receptor, lo que altera su conformación y aumenta su afinidad por la proteína G con la que se une. En el paso 2, la subunidad G α libera su GDP, que se sustituye con GTP. En el paso 3, la subunidad G α se separa del complejo Gβγ y se une con un efector (en este caso, adenililciclasa), lo que activa al efector. El dímero Gβγ también puede unirse con un efector (no se muestra), como un canal iónico o una enzima. En el paso 4, la adenililciclasa activada produce cAMP. En el paso 5, la actividad de la GTPasa de G α hidroliza al GTP unido, lo que desactiva Gα. En el paso 6, Gα se relaciona de nueva cuenta con Gβγ, con lo que se reintegra la proteína G trimérica y el efector suspende su actividad. En el paso 7, el receptor ya se fosforiló por acción de una GRK y en el paso 8 el receptor fosforilado se unió con una molécula de arrestina, lo cual inhibe al receptor unido con ligando para que no active más proteínas G. Es probable que el receptor unido con la arrestina se capte por endocitosis. Superfamilia de proteínas G Triméricas Monoméricas •Ras •Rho •Rac Crecimiento celular Morfología celular •Rab Tráfico vesicular •Ran Transporte nuclear Gran diversidad de GPCRs Familias de proteínas: Algunos ejemplos, unos pocos tipos de proteína G: (alta convergencia de vías) Ejemplos de señales que estimulan AMPc 1er caso: AMP cíclico Básicamente sólo 2 vías intracelulares activadas por proteínas G La PKA fosforila (activa/inactiva) otras enzimas El AMPc activa por alosterismo a una quinasa Cascadas mediadas por proteína G: ✓ Activación de adenilato ciclasa ✓ Inhibición de adenilato ciclasa ✓ Estimulación de fosfodiesterasa (PDE) 2do caso: DAG + IP3 Receptor acoplado a proteína G-PLC-IP3-DAG Trastornos relacionados con los receptores unidos a proteína G Comunicación celular Objetivos • Entender los conceptos y las bases celulares y moleculares de la comunicación y la señalización celular. • Conocer los principales mecanismos de comunicación celular y su importancia en el mantenimiento de la homeostasis. La teoría celular ✓ Todo ser vivo está formado por una o más células. ✓ La célula es lo más pequeño que tiene vida propia, es la unidad anatómica y fisiológica del ser vivo. ✓ Toda célula procede de otra célula preexistente. ✓ El material hereditario pasa de la célula madre a las hijas. Unicelulares Multicelulares/pluricelulares (mayor grado de complejidad) En ambos casos la comunicación intercelular comparte los mismos principios Comunicación celular Es la capacidad que tienen todas las células de censar y dar una respuesta ante un estimulo mas allá de su membrana plasmática. Posibilita el funcionamiento de todas las formas de vida. Función de la comunicación celular Adaptación a los cambios que existen en el medio que les rodea para sobrevivir, gracias al fenómeno de la homeóstasis. • Coordinación de funciones locales (celulares y tejidos). • Coordinación de funciones sistémicas (aparatos y sistemas) • Control del ciclo reproductivo. Importancia de la Comunicación celular Ninguna célula vive aislada, su supervivencia, su integración en tejidos y órganos, así como sus funciones dependen directamente de una compleja red de comunicación que coordina, controla y modula su crecimiento, diferenciación y su metabolismo. La comunicación implica el envío y recepción de señales. La célula emite señales químicas que pueden ser detectadas por otras células. Señalización celular Todos los organismos multicelulares deben cooperar y comunicarse para mantener la homeostasis (Analogía a una red de personas conectadas). • Las células están interconectadas • Tal comunicación es vital para los organismos (moléculas especializadas en recibir la información). Complejo sistema de comunicación que gobierna la actividad celular Comunicación celular Al igual que la comunicación en humanos: Comunicación → ¿11? Español → ¿Una vez? Inglés → Activa (Corazón) → Inhibe (Intestino) Comunicación celular Capacidad que tienen todas las células de intercambiar información físico química con el medio ambiente y con otras células. ¿Qué es señalización celular? Se refiere al conjunto de procesos o etapas que ocurren de forma concatenada por el que una célula convierte una determinada señal o estímulo, de origen extra o intracelular, en otra señal o respuesta específica Importancia de señalización • Para coordinar constantemente sus actividades según los cambios del ambiente. • Formación y mantenimiento de tejidos especializados: Depende de la regulación coordinada del número de células, la morfología celular, localización celular y expresión de funciones diferenciadas (señalización intercelular) • Coordinar actividades fisiológicas: metabolismo intermediario, respuesta a señales externas, crecimiento celular, división celular, diferenciación y desarrollo (coordinación de la expresión de programas), movilidad celular, morfología celular. Se comunican a través de moléculas Moléculas que se encuentran: • Libres en el fluido extracelular • Embebidas en la matriz extracelular • Unidas a la superficie de células vecinas Proteínas Péptidos Aminoácidos Nucleótidos Esteroides Lípidos Gases… Señalización celular Mecanismos de la comunicación celular COMUNICACIÓN ELECTRICA ✓ Se encuentra principalmente en sistemas excitables ✓ Es rápido y requiere que las células se pueden acoplar entre sí, a través de vías de baja resistencia, como las uniones comunicantes (gap gap junctions) ✓ A través de los poros pasan metabolitos de bajo peso molecular y segundos mensajeros ✓ Este tipo de señalización mediante interacción directa célula-célula desempeña un papel fundamental en la regulación de las múltiples interacciones que tienen lugar entre los distintos tipos celulares del sistema inmune o durante el desarrollo embrionario, así como en el mantenimiento de los tejidos adultos. Mecanismos de la comunicación celular COMUNICACIÓN QUÍMICA 1. El mensaje a transmitir provoca la síntesis de la molécula química en la célula emisora. 2. Esta molécula señalizadora o ligando es liberada por la célula emisora. 3. La molécula es transportada hasta la célula receptora diana. 4. La molécula transmisora o ligando interacciona con la proteína receptora específica (receptor) situada en la superficie o en el interior de la célula diana. 5. Esta interacción genera una señal intracelular rápida (transducción), bien mediante la fosforilación o desfosforilación de proteínas intracelulares, o mediante la síntesis de un compuesto químico (segundo mensajero), que provoca un cambio en el comportamiento de la célula diana a distintos niveles. 6. Tras transmitir su mensaje, la molécula señalizadora original es eliminada y finaliza la respuesta celular. Mecanismos de señalización * Los mensajes son específicos. La comunicación mediante señales extracelulares presenta 6 pasos: 1. Síntesis 2. Liberación de la molécula señal por la célula productora 3. Transporte de la señal hacia la célula objetivo 4. Detección de la señal por una proteína receptora específica 5. Cambio del metabolismo, la función o el desarrollo de la célula objetivo 6. Eliminación de la señal Mecanismos de la señalización celular 1. Mecanismos de encendido ✓ Estímulo celular externo ✓ Receptor que convierte la señal ✓ extracelular en una señal intracelular Transductor, Amplificadores y segundos mensajeros que en el citosol forman una compleja red de señales y vías intracelulares) Sensores y efectores Respuesta celular ✓ ✓ 2. Mecanismos de apagado ✓ Endocitosis del receptor cuando ha ✓ unido el ligando y temporalmente puede secuestrarlo o degradarlo en los lisosomas. Eliminación de la molécula mensajera extracelular mediante enzimas extracelulares que destruyen mensajeros extracelulares específicos. Estímulos celulares y tipos de señalización intercelular Estímulos celulares se liberan de las células a través de tres mecanismos: ✓ Los estímulos anclados a la membrana son liberados por desprendimiento ectodermo ✓ Los estímulos formados en el citoplasma salen a través de la membrana plasmática ✓ Los estímulos empaquetados en vesículas se liberan por exocitosis. Tipos de señalización: ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ Juxtacrine o Comunicación célulacélula Autocrina Paracrinas Endocrina Comunicacíon Célula-Matriz Extracelular Tipos de comunicación celular • Autócrina • Parácrina • Endócrina • Exócrina: Las feromonas son moléculas sencillas, de peso molecular relativamente bajo y derivadas fundamentalmente de ácidos grasos o terpenos (ciertos hidrocarburos). Son producidas por sistemas glandulares cuyo contenido es vaciado al exterior en la mayoría de los casos en forma voluntaria. - Abejas (acido trans 9-ceto-2 decanoico (como modulador de la organización social) - Langosta migratoria (acelera el desarrollo de los individuos jóvenes de la especie, cuando es captada por ellos) - ¿En humanos?, estudios en la saliva (CMH) modificar la conducta de la otra persona. Señales autocrinas Ella misma se regula Ejemplos de autocrina Expansión clonal Tipos de comunicación celular Las moléculas secretadas pueden mediar tres tipos de señales: paracrina (mediadores locales), sináptica (neurotransmisores) y endocrina (hormonas). Ejemplos de parácrina: Prostaglandinas, citoquinas de diversos tipo, estaminas, bradicinina, serotonina, etc. Ejemplos de sináptica: acetilcolina, adrenalina, noradrenalina, dopamina, etc. Ejemplos de paracrina Uniones intimas, puntuales, formadas por unidades funcionales hexagonales Uniones en hendidura. La proteina transmembrana Cx 43, se oligomeriza (hexámero) y forma los conexones o hemicanales. Un canal e ‘Gap junction’ corresponde a la estructura que se establece cuando dos conexones, provenientes de dos células vecinmas se yuxtaponen. Moléculas de adhesión se agrupan en cuatro familias Células pancreáticas, insulina baña a las células Es la comunicación por contacto con otras células o con la matriz extracelular, mediante moléculas de adhesión celular (MAC). La adhesión entre células homólogas es fundamental para el control del crecimiento celular y la formación de los tejidos. El contacto entre células heterólogas es importante para el reconocimiento que realiza el sistema inmune. Ejemplos de endocrina Otros tejidos que no se consideraban como glándulas, ahora se conocen, ejemplo: • Los riñones (producen Vitamina D). • El corazón (péptido natriurético atrial). • Otros. Tipos de mensajeros No van a poder atravesar la mayoría de barreras endoteliales del cuerpo: Son mucho más estables. Se mantienen por mucho mayor tiempo. La estructura química genera estabilidad. • Barrera hemato-encefalica • Barrera hemato-placentaria • Barrera hemato-testicular. Altamente susceptibles a hidrolisis. Análisis de Proteínas Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección advansta Análisis de Proteínas Análisis de Proteínas: Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitación. Un manual de laboratorio de la empresa Advansta Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés. Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras. Esta guía de laboratorio describe los pasos involucrados en la realización de un Western blot, incluyendo la preparación de muestras, la separación de proteínas, la transferencia y la detección. Índice de Contenidos Página 1. Western Blot: Visión General 2 2. Preparación de las muestras 4 3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida 5 4. Transferencia Electroforética 11 5. Hibridación Anticuerpos 13 6. Detección 15 7. Solución de Problemas 17 8. Herramientas y Referencias Técnicas 21 1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4. Página 1 Western Blot: Visión General 1. Western Blot: Visión General Consulte los capítulos siguientes para obtener más detalles acerca de cada paso. a. Preparación de la muestra Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química. Los materiales de partida incluyen planta, tejidos animales, células cultivadas, levadura, o bacterias. La disrupción mecánica con un homogenizador disgrega los tejidos. Procesos adicionales logran el fraccionamiento subcelular Se usan tampones conteniendo detergentes para la lisis celular Figura 1. Preparación de muestras b. Electroforesis en gel de Acrilamida Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis. Se prepara un gel de acrilamida, bisacrilamida. El dodecilsulfato de sodio (SDS) añadido al gel se une a las proteínas y confiere, de forma proporcional a la masa de cada proteína, una carga negativa a cada una de ellas. Se añade un colorante de carga. Así, la migración de la muestra se puede monitorizar. Se utiliza una pipeta para cargar las muestras en los pocillos del gel Una fuente de alimentación proporciona el voltaje El gel se coloca dentro de un tanque de electroforesis lleno de tampón, que conducirá la corriente. La proteínas con carga negativa migran desde el ánodo. Figura 2. Electroforesis en Acrilamida c. Transferencia electroforética a una membrana Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana, dónde quedan inmovilizadas. El gel y la membrana se coloca entre papel de filtro y almohadillas de esponja.. Se aplica voltaje en el tanque de transferencia y las proteínas migran desde el gel a la membrana. Un cartucho aplica presión y mantiene un estrecho contacto entre el gel y la membrana. Figura 3. Transferencia de Proteínas a la Membrana Página 2 Análisis de Proteínas a. Hibridación del Anticuerpo La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos. A continuación se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana. Tras varios lavados de la membrana, se adiciona un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma específica al anticuerpo primario, proporcionando una forma de detección. Los materiales de partida incluyen tejidos vegetales, tejidos animales, células en cultivo, levadura, o bacterias. Figura 4. Hibridación de Anticuerpo e. Detección de las Bandas Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido, se procede a detectar la localización de la banda en la membrana. Para la detección de quimioluminiscencia, se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con el enzima peroxidasa (HRP); la adición de un sustrato de HRP provoca una reacción enzimática que da como resultado final la emisión de luz. Dicha luz puede ser detectada en una película de rayos X, o de forma digital, mediante un sistema de captación de imágenes. La detección de fluorescencia se basa en la captación de luz emitid por sustancias fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario. Página 3 Figura 5. Detección quimioluminiscente de las bandas de proteínas Preparación de la muestra 2. Preparación de la muestra Una adecuada preparación de la muestra es esencial para tener éxito en un ensayo de Western Blot. En la mayoría de ensayos, las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o mecánicos. El método elegido dependerá del tipo de muestra de partida, de la localización subcelular de la proteína y de las condiciones óptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el epítopo proteico. En la tabla 1 se resumen los métodos mecánicos que habitualmente se utilizan en la extracción de proteínas para inmunotransferencia. A menudo, en muestras tisulares de plantas y animales, se requiere el uso de un proceso mecánico para la disrupción de la compleja matriz celular. Disrupción mecánica que suele preceder a un proceso químico de lisis celular, mediante el uso de solución tampón que contiene detergentes, que va dirigida a enriquecer la proteína de interés dentro del extracto final. Las células en cultivo, frecuentemente, se suelen lisar utilizando una solución tampón con detergente y sin la aplicación de métodos mecánicos. La estructura química de los detergentes permite romper las membranas celulares y solubilizar las proteínas. Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se pueden clasificar según las características del grupo polar: iónicos si el grupo polar tiene carga positiva o negativa, no iónicos si no poseen carga o zwiteriónicos si poseen carga negativa y positiva y la carga neta es 0. La elección de la substancia detergente, depende en parte de la localización, dentro de la célula, de la proteína de interés, citoplasmática, unida a la membrana, dentro de orgánulos celulares como el núcleo y las mitocondrias, etc...Las proteínas citoplasmáticas se pueden unir a las proteínas del citoesqueleto, afectando así a los procesos de fraccionamiento subcelular. En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampón y detergentes, más utilizados habitualmente, según el tipo de proteína y localización subcelular. Tabla 1. Métodos físicos para la dirupción de muestras Método Descripción Tipo de muestra Licuadora La muestra se tritura mediante cuchillas rotatorias Gran cantidad de tejido Homogenizador Dounce Tubo de vidrio con pistón ajustado maja las células por acción de corte. Células tisulares; útil para protocolos de enriquecimiento de proteínas mitocondriales o nucleares Homogenizador de ultrasonidos Ondas de sonido Células, tejidos, bacemitidas por una terias. sonda para romper las membranas celulares Pulverización en Nitrógeno líquido La muestra se pulve- Tejido animal o o riza utilizando un vegetal mortero y una almirez refrigerados Perlas de vidrio La ruptura celular se Levaduras produce por agitación de las perlas de vidrio Tabla 2. Soluciones Tampón y detergentes, según el tipo de proteína de interés y la localización subcelular Tipo/Localización Proteína de interés Detergente o Solución Tampón TComentarios Nativa (no desnaturalizada) Detergente suave no iónico Evitar detergentes desnaturalizantes (SDS, Deoxicolatos) Citoplasmáticos (soluble) Tris-HCl Puede combinarse con métodos mecánicos, tales como el homogenizador Dounce Citoplasmático (unida a citoesqueleto) Tris-Triton Los detergentes Triton son suaves y no iónicos Membrana mitocon- NP-40, RIPA drial o nuclear (multiples detergentes), Triton X-100 Lisado total de células Para antígenos con niveles bajos de expresión pueden ser necesarios procesos de enriquecimiento NP-40, RIPA, Triton X-100 Página 4 Análisis de Proteínas Con la rotura celular, se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la proteína de interés. Por tanto, es importante evitar, durate la preparación de la muestra, cualquier actividad proteásica. Tabla 3. Inhibidores de fosfatasas y proteasas utilizans en la extracción de proteínas. Inhibidores Proteasas Concentración en Enzimas diana el Tampón de lisis La siguiente estrategia ayuda a evitar la degradación de proteínas: Aprotinina 1-2 µg/ml Proteasas de Serina EDTA 1-10 mM Mg++/Mn++ Metaloproteasas EGTA 1-10 mM Ca++ Metaloproteasas Leupeptin 1-2 µg/ml Proteasas de Serinas, Cisteinas Pepstatina A 1µg/ml Proteasas de Aspartico PMSF (17-170 µg/ml) O,1—1 mM Proteasas de Serina Inhibidores Fosfatasas Concentración en el Tampón de lisis Enzimas diana - Glicerofosfato 1 mM Fosfatasas Serina/ Treonina EDTA 1-10 mM Mg++/Mn++ Metaloproteasas EGTA 1-10 mM Ca++ Metaloproteasas Leupeptin 1-2 µg/ml Proteasas de Serinas, Cisteinas Pepstatina A 1µg/ml Proteasas de Aspartico PMSF (17-170 µg/ml) O,1—1 mM Proteasas de Serina Evitar excesivos ciclos de congelación/ descongelación. Trabajar rápido y mantener las muestras en frío durante todo el proceso. Añadir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis. Además de inhibir la actividad de la proteasa, puede ser interesante reducir la actividad de la fosfatasa alcalina, en particular en estudios de fosforilación. En la tabla 3 se muestran los inhibidores deproteasa y fosfatasa de uso más habitual. 3. Electroforesis en Acrilamida Las proteínas del extracto se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). En primer lugar, las proteínas, se revisten con carga negativa, mediante la acción del detergente Dodecilsulfato Sódico (SDS), así Las proteínas, se pueden separar en el gel según su tamaño (SDSPAGE). Medición de proteína total Previamente a la electroforesis, es importante determinar la concentración de proteínas por las siguientes razones: 1. Asegurar la carga de la cantidad correcta de proteínas en el gel. La cantidad de proteína óptima a cargar dependerá de la prevalencia de la proteína de interés y de la sensibilidad del anticuerpo primario. Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un mayor ruido de fondo y unión no específica de los anticuerpos. A menudo, para determinar la carga de proteína apropiada, se requiere hacer experimentos preliminares con cantidades seriadas de proteínas. Página 5 Nota: con el kit Afyon ™ SDS-PAGE de preparación de muestra, se puede controlar la cantidad de carga de la proteína mediante la cantidad de resina utilizada, evitando la necesidad de determinar la concentración de proteína. Por ejemplo, para 5 µg de proteína se utilizan 20 µl de resina Afyon. Información para pedidos K-02101-025 Afyon ™ SDS-PAGE ssmple preparation kit Electroforesis en Acrilamida 2. Realización de Western Blots cuantitativos o semi-cuantitativos. Si la cantidad de proteína cargada por carril es la misma, se pueden comparar los niveles relativos de la proteína de interés. Un experimento de Western Blot cuantitativo es útil para estudio de cambios de expresión de proteínas o de modificaciones proteicas como la fosforilación. Descripción del método Tabla 4. Métodos físicos para la dirupción de muestras Ensayo Descripción Ventajas Inconvenientes Bradford El colorante azul de Coomasie se une a las proteínas y sufre un cambio de absorvancia La realización de los ensayos son generalmente rápidos y sencillos Interferencia de SDS o de otros detergentes a altas concentraciones . Rango lineal pequeño. BCA Reducción de Compatible iones de Cu2+ con la mayo mediante interación con las ría de deterproteínas, el gentes ComercialBCA se une a los iones de mente dispoCu1+ y forman nible en forun producto mato comcoloreado que patible con se puede meagentes dir espectroforeductores. metricamente Menos varia(reacción de ción proteíBiuret) na-proteína que en el método Bradford. Lowry Similar al BCA (reacción de Biuret) Existen diversos métodos para medir la proteína total de una muestra. Los más habituales son los métodos Lowry, Bradford y Ácido Bincocinico (BCA) (Tabla 4). Estos ensayos colorimétricos se basan en las reacciones que se producen entre las proteínas de la muestra y los reactivos de detección. Con el fin de determinar la concentración de proteínas totales en una muestra, se debe realizar una curva estándar en cada ensayo. Esto se logra con la realización de un ensayo de concentración crecientes, de proteína pura. El estándar utilizado con mayor frecuencia es la albúmina de suero bovino (BSA), aunque se puede utilizar cualquier proteína producida en el laboratorio o disponible comercialmente. En la figura 6 se muestra un ejemplo de una curva estándar. Los valores de absorvancia se trazan en función del contenido conocido de la proteína estándar utilizada. El contenido de la proteína de interés en la muestra (línea verde) se puede determinar mediante la extrapolación de la absorvancia obtenida a la cantidad o concentración de proteína correspondiente. Interferencia con agentes quelantes o reductores del Cobre Muy bien cita- El tiempo de da en literatura ensayo puede ser mayor que en otros métodos No es práctico para grupos grandes de muestras Se pueden formar precipitados Hay muchos kits de determinación de proteínas disponibles comercialmente. La elección depende de muchos factores: El equipo de lectura disponible en el laboratorio (espectrofotómetro, lector de placas, etc…). Los reactivos del tampón de lisis - revisar el protocolo del fabricante para identificar sustancias interferentes. La cantidad de muestra disponible. La facilidad/rapidez del ensayo. Absorvancia Elección de un ensayo de proteínas Proteína (mg) Figura 6. Ejemplo de la curva estándar de un ensayo de proteínas. Se representa la absorvancia de las soluciones estándar que contienen la proteína conocida (línea roja). La concentración de la proteína de interés se puede determinar extrapolando la absorvancia obtenida en la curva patrón o estándar (línea verde de puntos). Página 6 Análisis de Proteínas Tampón de carga de muestras Una vez se tienen las muestras de proteína, se pueden conservar congeladas, teniendo cuidado en evitar ciclos repetitivos de congelación/ descongelación. Alternativamente, se pueden utilizar inmediatamente, combinándolas con un tampón de carga y cargar la muestra en un gel de electroforesis. Los componentes del tampón de carga varían, dependiendo de las condiciones deseadas. Los ingredientes típicos de un tampón de carga para detectar proteínas bajo condiciones desnaturalizantes/reductoras se describen en la Tabla 5. No se utilizarán ni SDS, beta mercaptoetanol o ditiotreitol, si se necesitan condiciones no desnaturalizantes /no reductoras. Previamente a la carga del gel, las muestras se someten a una incubación a 95ºC durante 5-10 minutos, para asegurar que la desnaturalización/ reducción es total. En condiciones no desnaturalizantes/no reductoras, esta incubación no es necesaria. En la Figura 7 se ilustra cual es el mecanismo de desnaturalización del SDS. La proteína se encuentra en su estado conformacional, manteniendo su carga intrínseca SDS El SDS se une a la proteína y da lugar a una linearización y a una uniformidad de la carga negativa de ésta. Figura 7. Mecanismo de desnaturalización por SDS de las proteínas. Tabla 5. Componentes del tampón de carga. Reactivo Propósito Glicero. Aportan Viscosidad/densidad para arrastrar la muestra la fondo del pocillo y evitar que se extienda a los pocillos adyacentes. Azul de Bromofenol Molécula colorante pequeña: Da color a la muestra para ayudar a la carga. Migra por delante de las proteínas, de modo que se puede hacer el seguimiento del movimiento de las muestras en el gel. SDS Detergente desnaturalizante Cola hidrofóbica que rodea la esqueleto peptídico. Unión a la proteína de forma regular, aportando carga negativa de forma proporcional al tamaño de la proteína. Evita las interacciones hidrofóbicas y rompe los enlaces de hidrógeno. Destruye la estructura secundaria/ terciaria y lineariza la proteína. Beta Mercaptoetanol o DTT Agentes reductores Evita la oxidación de cisteínas. Completan la linearización de la proteína al romper los puentes disulfuro. Tampón Tris Pepstatina A Mantiene el pH adecuado Nota: Los tampones de carga permiten ahorrar tiempo y garantizan que las muestras se separan de forma reproducible, carril a carril y gel a gel. Advansta dispone de tampones de carga reductores y no reductores. Información para pedidos R– 03018-B10 Non-reducing protein sample loading buffer (2x) R-03019-B10 Página 7 Reducing protein sample loading buffer (2x) Electroforesis en Acrilamida Gel de Electroforesis Si se requieren condiciones naturales para que el anticuerpo pueda detectar el epítopo, en la electroforesis no se añadirá SDS ni en el gel ni en el tampón de electroforesis. En esta situación, también conocida como PAGE nativo, las proteínas mantienen su estructura tridimensional y la migración en el gel depende de su masa: relación de carga de la proteína por encima de su tamaño. Sin embargo, la mayoría de ensayos Western Blot, se realizan en geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-PAGE) en condiciones desnaturalizantes. Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de reducción, las proteínas cargadas negativamente, cuando se someten a un campo eléctrico, migran al electrodo positivo. Debido a que el SDS iguala la carga en todas las proteínas, la tasa de migración viene determinada por su peso molecular. Las moléculas más pequeñas migran más rápidamente que aquellas con pesos moleculares mayores. Tabla 6. Componentes del gel de acrilamida en las electroforesis de proteínas Reactivos Propósito Acrilamida Moléculas que polimerizan para formar cadenas. Bisacrilamida Forman uniones con las cadenas de acrilamida para formar un entramado. SDS Mantiene la linearidad y la uniformidad de carga de las proteínas según la electroforesis. Tampón Tris Mantiene el pH adecuado. Persulfato de Amonio Generación de radicales libres que catalizan la reacción de polimerización. TEMED Aumenta la generación de radicales libres por el persulfato de amonio. Los geles de SDS-PAGE están disponibles comercialmente o se pueden elaborar en el propio laboratorio. Los geles pre-fabricados son muy prácticos pero debido al coste, no son tan rentables como los elaborados por el usuario. En la tabla 6, se describen los componentes químicos de un gel de SDS-PAGE. Elección del grosor del gel y del tamaño de poro El tipo de muestra y el peso molecular de la proteína de interés dictan el espesor y tamaño de poro del gel. Los espaciadores de gel (ver Figura 8) controlan el espesor del gel. Están disponibles en diversos tamaños. Los geles con mayor espesor, pueden aceptar mayor volumen de carga. También se procesarán más lentamente y requieren tiempos de transferencia mas largos que los geles más delgados El porcentaje del gel, según la cantidad de acrilamida y bisacrilamida, determina el tamaño del poro. A más porcentaje menos tamaño de poro. Tabla 7. Rango de separación de proteínas según el porcentaje de acrilamida. Porcentaje Rango Peso Molecular (kDa) 7,5 25-500 10 15-300 12 10-200 15 10-45 20 5-40 El tamaño de poro determina la ratio de separación de las proteínas. (tabla 7). Página 8 Análisis de Proteínas Elaboración del gel Si el gel de acrilamida esta elaborado en el laboratorio, los distintos reactivos se mezclan y se vierte en el molde, formado por el conjunto de dos cristales, espaciadores lateral, espaciador inferior, peines y un sistema de sujeción (Figura 8), dónde la acrilamida se polimeriza en aproximadamente 30 minutos. Para mejorar la nitidez de la banda el gel resolutivo se corona con una acrilamida de menor porcentaje (stacking gel). 1. Colocar los espaciadores de la parte inferior y laterales entre los cristales. 2. Tras fijación de los lados, verter el gel resolutivo y esperar que el gel se polimerice. 3. Colocar el peine en la parte superior del gel. Diseño Experimental; Controles y Estándares Antes de la carga del gel, es importante diseñar el experimento incorporando los controles y estándares necesarios para la validación de los resultados. Los tipos de estándares y controles utilizados incluyen: 4. Verter el ―stacking gel‖ y quitar el peine una vez el gel haya polimerizado. Lavar los pocillos con ddH20. El gel está listo para cargar las muestras y la electroforesis. Figura 8. Preparación del gel de electroforesis para la separación de proteínas. 1. Marcadores de Peso Molecular. Son una mezcla de proteínas purificadas de peso molecular conocido. Se utilizan para verificar si la proteína de interés está dentro del rango de tamaño apropiado. Disponible en diversos intervalos de pesos moleculares, así como teñidos o incoloros. Las versiones preteñidas se utilizan para controlar el progreso de la electroforesis y comprobar la eficacia de la posterior transferencia. Pueden estar marcadas por la detección por fluorescencia o quimioluminiscencia. Controles de carga Como norma general se utilizan proteínas con niveles de expresión constante para todas las muestras. Similar a los ―housekeeping genes‖ en Biología Molecular. Algunos tratamientos pueden alterar la expresión de estas proteínas ―housekeeping‖. Se utiliza para verificar que la carga de proteína por carril es más o menos igual, así los niveles de proteínas se pueden comparar de forma cuantitativa. La expresión cuantitativa de la proteína de interés puede normalizarse con la del control de carga para cada muestra. 2. Controles Positivos. Para verificar si el anticuerpo primario se une a la proteína correcta. Generalmente, si está disponible, son una muestra de la proteína de interés purificada. Puede ser una línea celular que sobreexprese la proteína de interés. Puede ser una muestra de tejido del que se conozca que expresa altos niveles de la proteína de interés. Se pueden utilizar otras especies como tejido de control si el anticuerpo tiene reactividad cruzada apropiada. Página 9 Péptidos de bloqueo Algunos proveedores ofrecen péptidos de bloqueo para sus anticuerpos. El péptido de bloqueo se mezcla con el anticuerpo primario antes de la incubación con la membrana y evita la uníón del anticuerpo a la proteína diana. Por tanto no se detectará ninguna banda. Estos estudios demuestran que el anticuerpo utilizado se une de forma específica a la proteína de interés. Electroforesis en Acrilamida Inicio de Electroforesis Muestra (pH 6,8) Las muestras se cargan en los pocillos del gel mediante una pipeta. Normalmente se cargan de 20 a 40 µg de proteína total por carril. Es importante conocer de antemano, el volumen que se puede cargar por pocillo, para así evitar sobrecargas que pueden dar lugar a la pérdida de muestra o derrames en pocillos adyacentes. Una vez finalizada la carga, el gel se somete a un campo eléctrico generado por una fuente de alimentación. El tampón utilizado durante la electroforesis, contiene Tris (mantiene el pH), Glicina (conductor electricidad) y SDS (mantiene las proteínas cargadas negativamente). El progreso en el gel se monitoriza observando el frente coloreado por el colorante presente en el tampón de carga y la posición de los marcadores de tamaño siempre que estos estén teñidos. La técnica de electroforesis más habitualmente utilizada es la de Laemmli. En este método, los valores de pH de la capa de gel de apilamiento o concentración (Stacking Gel) y el gel de resolución (Resolving Gel) son diferentes. La figura 9 ilustra el flujo de iones durante la electroforesis. Gly Proteinas CL- Stacking Gel pH 6,8 Gly Proteinas Resolving Gel pH 8,8 Tampón de Electroforesis (pH 8,3) La glicina tiene carga negativa en el tampón de electroforesis a pH 8,3. Con la aplicación de un campo eléctrico, la glicina, en el Stacking Gel, se aleja del electrodo negativo. La glicina empieza a perder su carga a pH 6,8 y ralentiza su movimiento. Los iones de cloruro avanzan por delante de la Gly. El aumento de la resistencia, obliga a las proteínas a alejarse, de forma apilada, del electrodo negativo. La glicina, debido a un mayor pH del ―Resolving Gel‖, aumenta su carga negativa y se mueve por delante de las proteínas. Las proteínas se separan según su peso molecular por el Figura 9. Concentración de bandas de proteínas por el flujo iónico en el sistema discontinuo de Laemmli. Página 10 Análisis de Proteínas 4. Transferencia a una Membrana Una vez la electroforesis del gel ha terminado, las proteínas se transfieren a una membrana. La membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las proteínas, permitiendo así que la hibridación de un anticuerpo las pueda detectar. La mayoría de los sistemas de transferencia utilizan la generación de un campo eléctrico para conducir a las proteínas desde el electrodo negativo al positivo. Los sistemas de transferencia están disponibles en formato semiseco o húmedo. Los sistemas semisecos son más rápidos y requeiren menor cantidad de volumen de Tampón que los sistemas húmedos, sin embargo no son apropiados para transferencia de proteínas de gran tamaño (>70 kDa) y pueden causar, según el sistema de detección, un mayor ruido de fondo. Ambos métodos requieren, para una transferencia efectiva de las proteínas, un estrecho contacto entre el gel y la membrana. Aunque ambas funcionan bien en experimentos de inmunotransferencia, las diferencias en sus características puden influir a la hora de la elección. La membrana de PVDF, ofrece una mayor resistencai mecánica, resistencia la SDS y una mayor unión que la nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa tiene la ventajas de proporcionar un menor ruido de fondo y que no requieren un pretratamiento con metanol. Recientemente se han desarrollado, con el objetivo de reducir el ruido de fondo al utilizar métodos de detección de fluorescencia, membranas PVDF de baja autofluorescencia. Previamente a la transferencia, tanto el gel como la membrana se equilibran en una solución tampón pre-enfriada. Típicamente, el tampón de transferencia contiene Tris, Glicina, SDS (opcional) y metanos (para membranas de nitrocelulosa). La figura 10 ilustra como se ensamblan el gel y la membrana en un transferencia semiseca o húmeda. Página 11 Figura 8. Transferencia de proteínas a una membrana. Nota: Advansta suministra membranas de transferencia pre -cortadas de nitrocelulosa o PVDF aptas de tamaño de minigel. El uso de membranas pre-cortadas permite ahorrar tiempo y elimina la contaminación accidental de las membranas con guantes o tijeras contamindas. Información para pedidos L-08001-010 Membrana PVDF baja fluorescencia 7x9 cm L-08002-010 Membrana Nitrocelulosa 0,45 µm 8x10 cm L-08003-010 Membrana Nitrocelulosa 0,22 µm 8x10 cm Electroforesis en Acrilamida A continuación se describen algunas sugerencias para la consecución exitosa de una transferencia: Evitar la manipulación de las membranas con las manos desnudas. Las proteínas y aceites de la piel pueden adherirse a la membrana y pueden dar lugar a manchas no deseadas en la membrana. Las burbujas de aire entre el gel y la membrana pueden causar transferencia defectuosa y desigual. Se pueden eliminar haciendo rodar suavemente una pipeta Pasteur por encima del ―sándwich‖ formado por el gel/ membrana/papel de filtro. No permitir un sobrecalentamiento durante la transferencia. Es aconsejable utilizar tampón frio, un sistema de refrigeración o hacer la transferencia en una cámara fría. Disminuir el voltaje o el tiempo si fuera necesario. Ajustar las condiciones de transferencia al tamaño de la proteína. Las proteínas más pequeñas se transferirán más rápidamente y pueden atravesar la membrana. Reducir o eliminar el SDS o utilizar una membrana con un tamaño de poro menor puede ayudar a una mayor retención de la proteína. Incrementar la cantidad de SDS y disminuir la concentración de Metanol pueden facilitar la transferencia de proteínas de gran tamaño. La aparición de marcadores de tamaño preteñidos en la membrana es indicación que se ha completado la transferencia. El colorante Ponceau S puede utilizarse para teñir la membrana y asegurarse de la eficacia de la transferencia. La membrana debe ser desteñida antes del proceso de transferencia. La tinción con Coomassie puede usarse para la tinción del gel una vez realziada la transferencia y comprobar los residuos de proteína en el gel. Bloqueo El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incubando con una solución diseñada para reducir los lugares de unión no específicos al anticuerpo. A menudo, son soluciones a base de proteínas, como la leche descremada en polvo o la albúmina de suero bovino (BSA). La primera elección, cuando se inicia un nuevo protocolo, es la utilización de la leche descremada en polvo, ya que es más rentable que el BSA, sin embargo y debido a la presencia de biotina en las fosfoproteínas, puede que no sea la mejor elección cuando se van a utilizar anticuerpos fosfoespecíficos o en métodos de detección de biotina. Es preferible, para estas y otras situaciones, el uso de agentes bloqueantes no proteicos. El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampón Tris salino) o en PBS (Tampón Fosfato salino); se puede añadir también detergente Tween 20. Una incubación durante una hora (temperatura ambiente o a 4ºC) suele ser suficiente para un bloqueo de los lugares de unión no específicos del anticuerpo. Si los niveles del ruido de fondo son demasiados altos, se pueden seleccionar otras soluciones de bloqueo alternativas. Nota: Advansta ofrece soluciones optimizadas de bloqueo y de lavado para su línea de reactivos de detección, WesternBright, así como soluciones tampón en polvo de PCS, TBS, ...que facilitan una rápida y fácil preparación Información para pedidos R-03024-D50 AdvanWashTM, 500 ml R-03023-D20 AdvanBlockTM-PF, 200 ml R-01038-020 AvantTM Buffer Pouches - PBS R-01039-020 AvantTM Buffer Pouches - TBS Página 12 Análisis de Proteínas 5. Hibridación del Anticuerpo. Después del proceso de bloqueo, la membrana se incuba con el anticuerpo primario. En general, los anticuerpos reconocen una secuencia de aminoácidos pequeña (epítopo) que queda expuesta al eliminar la estructura tridimensional de la proteína en condiciones desnaturalizantes y reductoras. Los geles nativos se pueden utilizar cuando los anticuerpos requieren de la proteína plegada para el reconocimiento del antígeno. Tabla 8. Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales. Anticuerpos Primarios: Monoclonal vs Policlonal. En la transferencia Western se pueden utilizar, tanto anticuerpos primarios monoclonales como policlonales. Los dos tipos tienen distintas ventajas y desventajas y se diferencian según la forma en la que se sintetizan. El primer paso en la producción de ambos anticuerpos, es la inyección de un antígeno en un animal, para provocar una respuesta inmune. Los anticuerpos policlonales se obtienen directamente a partir del suero del animal, comúnmente conejo, cabra, burro u oveja y son finalmente purificados y probados. Los anticuerpos policlonales reconocen múltiples epítopos del antígeno y en cambio los monoclonales reconocen un único epítopo de la proteína. Para la síntesis de un anticuerpo monoclonal, las células que sintetizan anticuerpos se aíslan del bazo del animal y se fusionan con células del mieloma. Lo hibridomas resultantes secretan anticuerpos al medio de cultivo, el cual se analiza y determina la afinidad al antígeno. Los hibridomas con secreción más estable se seleccionan y pueden ser cultivados indefinidamente. Algunas características de los anticuerpos monoclonales y policlonales se describen en la Tabla 8. Página 13 Anticuerpos Monoclonales Anticuerpos Policlonales Reconocimiento epitopo y sensibilidad Reconocimiento de un único epítopo Menos sensibilidad debido a que sólo un anticuerpo se une a cada proteína Reconocimiento múltiples epítopos en una proteína Más sensible debido a los multiples lugares de unión de anticuerpo en cada proteína. Bueno para proteínas poco abundantes. Reactividad cruzada potencial Reactividad cruzada menos probable. Potencial para reconocer otras proteínas que contengan el epítopo. Reactividad cruzada más probable. Mayor ruido de fondo potencial debido al reconocimiento de multiples epítopos. Reactividad cruzada con otras especies más probable. Tiempo requerido para su producción Largo Más corto Coste de Preparación Mayor coste - reMenor coste quiere personal capacitado y equipamiento especializado. Variabilidad Los lotes de un mismo hibridoma son muy estables. Tolerancia a condiciones variables Poca tolerancia Más tolerante a conpuede dejar de diciones variables. reconocer al antígeno en condiciones de desnaturalización/reducción de la proteína, o por modificaciones químicas (glicosilación fosforilación) o por diferencias en la secuencia peptídica debido a la presencia de polimorfismos. Propenso a cierta variabilidad entre lotes. Hibridación Anticuerpos Incubación de los anticuerpos El anticuerpo primario se diluye en tampón de bloqueo, TBST o en un tampón de disolución de anticuerpo comercial. El fabricante puede recomendar una cantidad inicial, pero a menudo la concentración óptima de anticuerpo debe determinarse empíricamente. La afinidad del anticuerpo, la abundancia de la proteína en la muestra y la sensibilidad del sistema de detección afectarán a la cantidad de anticuerpo a utilizar. Generalmente, un periodo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente suele ser suficiente. También es posible una incubación a 4ºC durante toda la noche. Durante la incubación, la membrana debe someterse a agitación suave y sumergida en la disolución, e incubar en un agitador de vaivén. Un menor volumen puede utilizarse si la membrana se sella dentro de una bolsa e incuba en un agitador orbital. En algunos casos, la disolución con el anticuerpo, puede reutilizarse. Si se utiliza acida sódica como conservante, debe ser totalmente lavada de la membrana, ya que puede eliminar la actividad de la peroxidasa e interferir en los métodos de detección. Después de la incubación con el anticuerpo primario, se procede a la eliminación del excedente mediante tampones de lavado (TBS, PBS, TBST o PBST). En métodos de detección indirectos (sección 6), es necesario un anticuerpo secundario apropiado. A continuación se describen las consideraciones a tener en cuenta a la hora de la elección de un anticuerpo secundario: Las especie del primer Ac dicta la elección del Ac secundario. Si el primer Ac es de conejo, el segundo Ac debe ser anti-conejo, o sea, deber ser producido en otra especie distinta a conejo. Para anticuerpos monoclonales se debe considerar la clase de Inmunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) y posiblemente la subclase (IgG1, IgG2a,…). Un anticuerpo con amplia especificidad inmunoglobulínica debería ser suficiente, ya que los anticuerpos específicos para sub-clases se utilian mayoritariamente, en experimentos de doble etiquetado u otras aplicaciones. Nota: Advansta ofrece una línea completa de anticuerpos secundarios marcados para detección mediante quimioluminscencia o fluorecencia. Información para pedidos R-05051-050 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 50 µl R-05051-250 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 250 µl R-05052-050 IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón, 50 µl R-05051-250 IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón, 250 µl R-05071-500 Anticuerpo Secundario conjugado HRP cabra-anti-ratón, 500 µl R-05072-500 Anticuerpo Secundario conjugado APC cabra-anti-conejo, 500 µl Página 14 Análisis de Proteínas 6. Detección. La detección de la proteína se puede hacer mediante métodos directos o indirectos, cada uno con sus ventajas e inconvenientes. Los métodos directos utilizan un anticuerpo primario conjugado con un marcaje detectable, como un enzima, biotina o molécula fluorescente. Los anticuerpos se pueden marcar mediante kits disponibles en le mercado u obtenerlos ya marcados. Lo métodos indirectos utilizan dos anticuerpos; un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario contra la especie del primer anticuerpo. En la detección indirecta, es el anticuerpo secundario el que está conjugado con un marcaje detectable. La figura 11,ilustra los métodos de detección directos e indirectos y en la Tabla 9 se resumen las ventajas e inconvenientes de los dos métodos. Métodos de detección. Los métodos más comúnmente utilizados para detectar proteínas son: 1. Quimioluminiscencia, 2. Fluorescencia y 3. Colorimetría. Figura 11 . Detección directa e indirecta de proteínas Tabla 9. Ventajas e Inconvenientes de los métodos de detección Indirecto Ventajas Amplificación de Menos pasos. señal debido a la Menos posibilidaunión de múltides de unión no ples Ac secundaespecífica. rios a cada Ac primario. Versátil - el mismo Ac secundario puede utilizarse para diversos anticuerpos de la misma especie. Inconvenientes Mayor posibilidad de unión no inespecífica. Más pasos. 1. Quimioluminiscencia. Los métodos de detección de quimioluminiscencia utilizan comúnmente anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP). La reacción entre el encima y el substrato produce luz, que puede ser detectada mediante la exposición de la membrana a una película de rayos X o captada de forma digital utilizando una cámara CCD. Directo Ventajas: muy sensible, la membrana puede tratarse para re-utilizarse, se pueden hacer multiples exposiciones en películas de rayos X, fácil de documentar. Puede ser más costoso. La inmunorreactividad del Anticuerpo puede estar afectada por el marcaje. Inconvenientes: requiere una habitación oscura (película rayos X) o sistemas de imagen caros, semicuantitativa - porque se basa en una reacción enzimática, la película tiene un rango dinámico limitado, la intensidad de la señal puede variar con la incubación o el tiempo de exposición, no son posibles detecciones multiplex (detección de mas de una proteína, sólo un color de reacción) Nota: LucentBlueTM es una película que ha sido optimizada para la detección de señales de quimioluminiscencia en experimentos realizados con los substratos WesternBright HRP, incluyedo WesternBrightTM ECL, Westernbright Quantum y WesternBright Sirius. Página 15 Información para pedidos L07014-100 Película Rayos X LucentBlueTM , 20x25 cm, 100 uds L07013-100 Película Rayos X LucentBlueTM , 13x18 cm, 100 uds Detección 2. Fluorescencia. Re-utilización de la membrana El anticuerpo secundario se une a un fluoróforo, que cuando es ―excitado‖ emite luz. La luz emitida, se detecta mediante un dispositivo capaz de medir la fluorescencia o mediante una cámara CCD provista con los filtros de longitud de onda apropiada. La imagen se digitaliza para su análisis. Después de captar la imagen, la membrana puede ser tratada para volver a ser utilizada para la detección de otra proteína. Este procedimiento puede conservar las muestras, pero consume mucho tiempo. Con la detección multiplex de fluorescencia, se pueden detectar múltiples proteínas de forma simultanea, es ideal para comparar la proteína de interés con un control de carga, o diferentes isoformas de la proteína. Las membranas PVDF son preferibles a la de nitrocelulosa en protocolos de lavados para reutilización. Ventajas: sensibilidad (la sensibilidad puede incrementarse utilizando el sistema streptavidina/ biotina), apto para ensayos multiplex con múltiples colorantes, amplio rango dinámico, no se requiere el uso de una cámara oscura, aporta datas cuantificables, fácil documentación de resultados, pueden usarse Ac primarios marcados (para proteínas abundantes) y eliminar pasos. Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento pueden ser costosos, no es tan sensible como la quimioluminiscencia (puede no ser apropiado para proteínas poco abundantes). 3. Colorimetría. Los métodos colorimétricos utilizan un Ac secundario que ha sido conjugado previamente a un enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina). El enzima convierte el colorante en un producto insoluble que es visible en la membrana. La cantidad de colorante convertido es proporcional al cantidad en la muestra. La intensidad de la tinción puede ser medida por espectrofotometría o por un densitómetro. Ventajas: sencilla de realizar, no requiere cámara oscura, las membranas se pueden documentar fácilmente mediante fotografía. Inconvenientes: no es tan sensible como los otros dos métodos, el color se desvanece con el tiempo. Nota: WesternBright TM MCF permite la detección, mediante la detección fluorescente multicolor, de dos proteínas en una sola membrana. Perfecto para aquellos experimentos en los que se necesite comparar la proteína de interés con un control de carga. Información para pedidos K-12021-010 WesternBrightTM fluorescent Western blotting kit Nota: Advansta suministra una línea completa de reactivos de detección de quimioluminiscencia optimizados para los diferenentes métodos, concentración de muestra y tipos experimentales. Información para pedidos K-12042-D10 WesternBrightTM Quantum Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana) K-12042-D10 WesternBrightTM Sirius Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana) K-12045-D20 WesternBrightTM ECL Western Blotting HRP Substrate (para 2000 cm2 de membrana) K-12042-D10 WesternBrightTM ECL Spray Página 16 Análisis de Proteínas 7. Solución de Problemas Solución de problemas con Western Blot A. No se puede ver la proteína de interés B. Tamaño incorrecto de la banda Preparación Muestra (ver 1) La proteína es menor de lo esperado (ver 7) Transferencia Inadecuada (ver 2) Unión ineficiente del Anticuerpo (ver 3, 4) Problemas con los reactivos (ver 5, 6) La proteína es mayor a lo esperado (ver 8, 9) C. Bandas artefactuales D. Problemas en la electroforesis E. Ruido de fondo excesivo Bandas Incompletas (ver 12) El gel polimeriza demasiado rápido o demasiado lento (ver 17,18,19) Bloqueo Insuficiente (ver 24) Bandas Difusas (ver 13) Rayas Verticales (ver 14) Bandas Múltiples (ver 10) Las bandas aparecen muy altas o muy bajas en el gel (ver 11) El gel corre demasiado rápido o demasiado lento (ver 20,21) Distorsión Lateral (ver 15) Frente corre curvado ―smiling‖ (ver 22) Bandas distorsionadas (ver 16) Frente corre inclinado (ver 23) Lavado inapropiado (ver 25) Contaminación Reactivos (ver 26) Elección de Membrana (ver 27) Unión no específica del Anticuerpo (ver 28) Revelado de la película (ver 29) Página 17 Solución de Problemas A. Problema Causa(s) Solución 1. Preparación Muestra Extracción ineficiente Intentar métodos alternativos; incluir control positivo en el gel Baja expresión de la proteína en el tejido o las células Cargar más cantidad de proteína total en el gel; concentrar utilizando Afyon, juntar múltiples muestras La proteína se ha degradado durante la extracción Usar inhibidores de proteasa en le tampón de lisis 2. Transferencia indadecuada 3. Unión ineficiente del Anticuerpo primario Tampón de transferencia preparado inco- Revisar el protocolo/disminuir metanol rrectamente/demasiado metanol en el tampón Proteínas de mayor tamaño necesitan mas tiempo/voltaje Repetir con un tiempo mayor/mayor voltaje Contacto insuficiente entre el gel y la membrana Revisar la almohadilla de fibra; sustituir si es muy delgada Baja afinidad del anticuerpo por la proteí- Incrementar la concentración del Antina o el anticuerpo es antiguo/débil cuerpo; comprar un anticuerpo nuevo y almacenarlo de forma apropiada El Anticuerpo tiene reactividad cruzada débil con las especies de interés Probar con un Anticuerpo primario de diferente origen El Anrticuerpo se ha eliminado con el lava- Usar menor numero de lavados; disminuir do la concentración de sales el tampón de lavado 4. Unión ineficiente del Anticuerpo secundario Antígeno enmascarado por el agente bloqueante (ej.: Leche,…) Utilizar un agente de bloqueo alternativo (ej.: BSA,…) Elección de especies errónea Usar Anticuerpos dirigidos contra la especie del Anticuerpo primario Concentración insuficiente del Anticuerpo Aumentar concentración o comprar uno o Anticuerpo antiguo Anticuerpo nuevo 5. Conjugado/Substrato Inac- Reactivos viejos o inestables tivo Peroxidasa (HRP) inactiva por azida sódica Mezclar conjugado + substrato en un tubo; o luminiscencia en oscuridad - conseguir un nuevo reactivo si no hay señal Evitar utilizar disoluciones conteniendo este agente conservante 6. Reactivo de detección (ECL) La disolución es antigua o está almacena- Comprar reactivo nuevo da de forma inapropiada B. Problema Causa (s) Solución 7. Proteína más pequeña de lo esperado Proteólisis; Congelación/descongelación de la muestra Uso de inhibidores de proteasa/muestras frescas Proteína variante (Splicing) Consultar literatura/utilizar controles apropiados Proteínas modificadas de forma natural (glicosilación, fosforilación, acetilación, etc…) Consultar literatura para encontrar aditivos que puedan eliminar grupos químicos Cambio de la expresión de la proteína en la línea celular Utilizar cultivos anteriores; incluir un control positivo 8. Proteína más larga de lo esperado y/o bandas múltiples 9. Proteína más larga de lo esperado Agregado de proteínas - puentes disulfuro Uso de DTT en tampón de muestra; pulso intactos de centrífuga previo a la carga de la muestra Página 18 Análisis de Proteínas B. Problema (continuación) Causa(s) Solución 10. Bandas Extras Unión no específica del Anticuerpo prima- Disminuir concentraciones; intentar un rio o secundario experimento de bloqueo de péptido (eliminará la proteína de interés) 11. La proteína aparece muy Porcentaje erróneo/no óptimo del gel alta o muy baja en la membrana Incrementar el porcentaje para proteínas de pequeño tamaño; disminuir para proteínas de gran tamaño C. Problema Causa(s) Solución 12. Bandas Incompletas Burbujas entre el gel y la membrana Usando una pipeta, hacer rodar por encima del paquete gel/membrana para forzar la salida de las burbujas 13. Bandas difusas Migración lenta Incrementar voltaje; asegurarse de la correcta preparación del tampón Las muestras no se han calentado correctamente Asegurarse que las muestras se han incubado durante 2 min a 90ºC antes de cargarlas en el gel El SDS del tampón es antiguo Preparar SDS nuevo para le tampón de muestra 14. Rayas en los carriles Alta concentración de sales en la muestra Disminuir la concentración de sal en el tampón de muestra Muestra muy concentrada o insuficiente SDS Incrementar concentración/usar más SDS 15. Distorsión lateral de las bandas Difusión de la muestra en los pocillos durante la carga Minimizar el tiempo de carga 16. Distorsión de las bandas Fallo en la completa polimerización de los Incrementar TEMED/AP pocillos Presión aplicada excesiva a la hora de montar el gel No apretar en exceso los tornillos del sistema, apretar hasta encontrar primera resistencia Burbujas en el gel debido al uso de cristales sucios Usar guantes en la preparación de los geles Uso de Etanol y H2O desionizada en la limpieza de los cristales Burbujas introducidas en el gel por el dispositivo de llenado (jeringa o pipeta) No expulsar totalmente el volumen de la mezcla del gel Burbujas de aire atrapadas por el peine Insertar el peine en ángulo y antes que se polimerice el gel D. Problema Causa (s) Solución 17. El gel no polimeriza Fallo al añadir el TEMED y AP Repetir con TEMED y AP La disolución AP es estable durante dos o tres días a 4ºC Preparar AP fresco El oxígeno inhibe la polimerización Aplicar isopropanol antes de verter el gel de apilamiento (stacking gel) TEMED/AP Insuficiente Incrementar la cantidad de TEMED/AP La disolución de AP ha perdido su actividad Preparar disolución fresca de AP 18. El gel polimeriza muy lento Página 19 Solución de Problemas D. Problema (continuación) Causa(s) Solución 19. El polimeriza demasiado rápido Cantidad excesiva de TEMED/AP Reducir la cantidad de TEMED/AP, manteniendo la relación entre ambos 20. Tiempo de carrera inusualmente largo Buffer de electroforesis demasiado concentrado Revisar protocolo; diluir el tampón en caso necesario Voltaje insuficiente Incrementar voltaje 21. Tiempo de carrera inusualmente corto Tampón demasiado diluido Revisar el protocolo; reemplazar tampón en caso necesario 22. Frente curvado (smiling) Migración demasiado rápida Disminuir voltaje Generación de calor Disminuir voltaje; refrigerar 23. Frente inclinado Burbuja atrapada entre los cristales en la parte inferior del gel Aguantar el gel en ángulo; colocar una esquina en el tanque inferior del sistema de electroforesis; lentamente volver a posición vertical E. Problema Causa(s) Solución 24. Bloqueo insuficiente La presencia de Biotina en la leche es incompatible con el uso de Estreptavidina, o la leche contiene el antígeno de interés Usar BSA Si utiliza AdvanBlock-PF con WesternBright MCF, algún Anticuerpo primario puede requerir un bloqueante proteico Incluir BSA o leche en la disolución AdvanBlock-PF utilizada en la dilución del Anticuerpo primario La disolución está demasiado diluida Incrementar con un 5% la disolución Tiempo de bloqueo muy corto Incrementar el tiempo de incubación Algunos detergentes no son efectivos a bajas temperaturas Incubar a temperatura ambiente en vez de toda la noche a 4ºC Número insuficiente de lavados Incrementar el número de lavados o la duración de cada uno de ellos 25. Condiciones de lavado inapropiadas Concentración insuficiente de detergente Incrementar la concentración de detergente o usar detergentes más fuertes (SDS, NP-40) 26. Contaminación de los reactivos Crecimiento bacteriano o fúngico en los tampones 27. Elección de tipo de mem- Las membranas PVDF pueden tener más brana ruido de fondo que las de Nitrocelulosa 28. Unión no específica del Anticuerpo primario o secundario 29. Sobreexposición de la imagen Revisar la turbidez de los tampones; preparar nuevos Elegir membranas de Nitrocelulosa Algunas membranas tienen alta autofluorescencia Utilizar únicamente membranas PVDF con baja autofluorescencia con Western Blots fluorescentes Membrana seca Estar seguro que la membrana esta húmeda durante todo el proceso Concentración muy alta del Anticuerpo o no purificado por afinidad Disminuir la concentración de Anticuerpo; intentar con Anticuerpo monoclonal o purificado por afinidad Mucha cantidad de proteína en el gel Disminuir la cantidad de proteína El tiempo excesivo de exposición a la pelí- Reducir los tiempos de exposición; si no es cula o al CCD posible incrementar la dilución de los Anticuerpos o cargar menor cantidad de muestra Página 20 Análisis de Proteínas 8. Herramientas y Referencias Técnicas g de Soluto Molaridad de una disolución = [Masa molecular de Soluto (g/mol) x (L de disolución) Tabla 10. Código genético y abreviaciones de los aminoácidos Segunda Posición U Primera posición U C A G C UUU UUC Fenilalanina (Phe, F) UUA UUG Leucina (Leu, L) CUU CUC CUA CUG Leucina (Leu, L) AUU AUC AUA Isoleucina (Ile, I) AUG Metionina (Met, M) GUU GUC GUA GUG Valina (Val, V) UCU UCC UCA UCG A Serina (Ser, S) CCU CCC CCA CCG Prolina (Pro, P) ACU ACC ACA ACG Treonina (Thr, T) GCU GCC GCA GCG Alanina (Ala, A) G UAU UAC Tirosina (Tyr, T) UGU UGC Cisteina (Cys, C) UAA UAG STOP UGA STOP UGG Triptófano (Trp, W) CAU CAC Histidina (His, H) CGU CGC CGA CGG Arginina (Arg, R) CAA CAG Glutamina (Gln, Q) AAU AAC Asparagina (Asn, N) AGU AGC Serina (Ser, S) AAA AAG Lisina (Lys, K) AGA AGG Arginina (Arg, R) GAU GAC A. Aspártico (Asp, D) Glicina (Gly, G) GAA GAG A. Glutámico (Glu, E) GGU GGC GGA GGG Tabla 11. Conversión entre masa y moles de proteína Tabla 12. Absorvancia a 280 nm de Proteinas habituale Peso molecular (Da) 1 µg 1 nmol Proteina 10.000 100 pmol o 6x1013 moléculas 10 µg IgG 1,35 20.000 20 pmol o 1,2x1013 50 µg IgM 1,2 100.000 10 pmol o 6x1012 moléculas 100 µg IgA 1,3 150.000 6,7 pmol o 4x1012 moléculas 150 µg Proteina A 0,17 Avidina 1,5 Estreptavidina 3.4 Albumina suero bovino 0,7 Página 21 moléculas A280 Uds por 1 mg&ml Herramientas y Referencias Tabla 13. Prefijos métricos mega 106 M Kilo 103 m mili 10-3 µ micro 10-6 Tabla 16. Masa molecular media de los aminoácidos nano 10-9 Códigos Aminoácidos pico 10-12 A Ala 71,08 femto 10-15 C Cys 103,1 atto 10-18 D Asp 115,1 E Glu 129,1 Tabla 14. Abreviaciones F Phe 147,2 ds doble cadena ( como en dsDNA) G Gly 57,05 ss cadena sencilla (como en ssDNA) H His 137,1 bp pares de base I Ile 113,2 kb kilobase; 1.000 bases o pares de base K Lys 128,2 Da Dalton, unidad de masa molecular L Leu 113,2 mol mol M Met 131,2 M molaridad, moles de soluto por litro de disolución N Asn 114,1 P Peo 91,12 K n K f a Masa molecular media Q Gln 128,1 Tabla 15.. Vida media de los Radioisótopos más habituales R Arg 156,2 Radioisótopo Vida media S Ser 87,08 Carbono-14 (14C) 5.730 años T Thr 101,1 Iodo-125 (125I) 60 días V Val 99,07 Fósforo-32 (32P) 14,3 días W Trp 186,2 Azufre-35 (35S) 87,4 días Y Tyr 163,2 Tritio (3H) 12,4 años Copyright © 2011 Advansta. All rights reserved. The Advansta logo is a registered trademark of the Company. AdvanBlock™, AdvanWash™, Afyon™, Avant™, LucentBlue™ and WesternBright™ are trademarks of the Company. All other trademarks, service marks and tradenames appearing in this brochure are the property of their respective owners. Página 22 Importador www.ecogen.com Ptge. Dos de Maig, 9-11 Tel./Fax: 94 450 26 01 08041 BARCELONA ecogen@ecogen.com C/ S. Hermenegildo, 16 Tel.: 91 444 06 62; Fax: 91 594 02 28015 MADRID ecogenm@ecogen.com DISTRIBUIDOR LOCAL Sevilla · Granada · Oviedo · Vigo · Zaragoza · Pamplona · Murcia · Valencia · Islas Canarias Advansta Corporation 1455 Adams Drive, Ste. 1160 | Menlo Park, CA 94025 Tel: 650.325.1980 | Fax: 650.325.1904 | Email: sales@advansta.com www.advansta.com SECUENCIACIÓN DEL ADN Secuenciar una molécula de ADN consiste en determinar en qué orden se disponen los cuatro nucleótidos (A, T, C y G) que componen la molécula. El primer método diseñado para secuenciar el ADN fue desarrollado por Allan Maxam y Walter Gilbert en 1977. Es un método químico que somete la molécula de DNA a distintos métodos de ruptura. Cada método escinde la molécula allí donde haya un nucleótido específico. Este método es bastante laborioso y, hoy en día, ha sido sustituido por métodos enzimáticos que, además, se pueden llevar a cabo de forma automatizada. El método de Sanger fue diseñado por Fred Sanger en 1977. También se conoce como método didesoxi o secuenciación por terminación de la cadena. Es un método enzimático que permite determinar la secuencia del molde a medida que se sintetiza su hebra complementaria. Se necesitan los siguientes componentes: • • • • • un ADN de cadena sencilla que actúa como molde un cebador para iniciar la síntesis de ADN los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) la enzima ADN-polimerasa los cuatro didesoxirribonucleótidos trifosfato (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP) que son utilizados por la ADN polimerasa para construir la nueva hebra pero, una vez incorporados, impiden la adición de nuevos nucleótidos. La secuenciación se lleva a cabo en cuatro tubos. Cada tubo contiene el molde, el cebador, los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP), la polimerasa y un didesoxirribonucleótido trifosfato (ddNTP) distinto en cada caso. En cada tubo, cuando la ADN polimerasa incorpora aleatoriamente un ddNTP la reacción se detiene, de manera que se generan fragmentos de distinta longitud, todos ellos con el mismo ddNTP terminal. Los diversos fragmentos se separan en función de su tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, una técnica que permite separar fragmentos de ADN cuya longitud difiere en un sólo nucleótido. A partir del gel se puede reconstruir la secuencia que se ha sintetizado, que es complementaria a la secuencia del molde. Mediante esta tecnología, se puede determinar la secuencia de moléculas de ADN de hasta 800 nucleótidos de longitud. MEJORAS EN EL MÉTODO DE SANGER Introduciendo ligeras variaciones en el método original de Sanger se ha conseguido automatizar el proceso. Esta es la principal razón de que se siga utilizando este método hoy en día, a diferencia del método de Maxam y Gilbert, que ya apenas se utiliza. Las mejoras introducidas son las siguientes: 1.- Los ddNTP terminadores de cadena están marcados fluorescentemente. Cada ddNTP se marca con un fluoróforo distinto, que no interfiere en la reacción de la polimerasa y que emite luz con una longitud de onda característica. De este modo, la reacción se lleva a cabo en un sólo tubo, no en cuatro. 2.- Se sustituye la ADN polimerasa por la Taq-polimerasa. De este modo es posible automatizar el proceso como si se tratara de una PCR. En cada ciclo aumenta de forma exponencial el número de fragmentos generados, cada uno marcado con una molécula fluorescente que emite luz de distinto color, en función del ddNTP terminal. Por eso, a este método también se le conoce como secuenciación cíclica. 3.- La separación de los fragmentos se realiza mediante electroforesis capilar, que es más rápida que la electroforesis en gel. Los fragmentos de distintos tamaños llegan al final del capilar, donde son excitados con un láser y se detecta la fluorescencia emitida por el ddNTP terminal. El color de esta fluorescencia determina de qué nucleótido se trata. El gráfico resultante se denomina electroferograma, en el que se observan picos de diversos colores. Cada color indica qué nucleótido ocupa cada posición en la molécula de ADN o, lo que es lo mismo, su secuencia. PIROSECUENCIACIÓN La pirosecuenciación es otro método enzimático que permite determinar la secuencia de una molécula de ADN. Se necesitan los siguientes componentes: • • • • • • un ADN de cadena sencilla que actúa como molde un cebador para iniciar la síntesis de ADN tres desoxirribonucleótidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) más desoxiadenosina alfa-tiotrifosfato (dATP•S, un derivado del dATP que puede ser utilizado normalmente por la ADN-polimerasa pero que no es reconocido por la luciferasa). cuatro enzimas: ADN polimerasa (que cada vez que añade un nuevo desoxirribonucleótido trifosfato a la cadena naciente genera una molécula de PPi), ATP sulfurilasa (que convierte el PPi en ATP en presencia de APS), luciferasa (que, en presencia de ATP, convierte la luciferina en oxiluciferina y genera un fotón de luz visible) y apirasa (que degrada los nucleótidos que no se han incorporado a la cadena naciente y el ATP generado por la sulfurilasa). adenosina 5'-fosfosulfato (APS) luciferina La pirosecuenciación es un método de síntesis, porque la secuencia del molde se determina a medida que se sintetiza su hebra complementaria. Para determinar cuál es la base que se añade durante la síntesis se lleva a cabo, en riguroso orden, una serie de reacciones enzimáticas: • 1.- El cebador hibrida con el molde y se incuba en presencia de las cuatro enzimas (ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa) y de los sustratos APS y luciferina. • 2.- Se añade uno de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (por ejemplo, dCTP) a la mezcla de reacción anterior. Si resulta ser el complementario a la hebra molde, se incorporará a la nueva cadena de ADN y se producirá una molécula de PPi por cada desoxirribonucleótido incorporado (ya que puede haber varias bases iguales seguidas en la secuencia del molde). Si no es el complementario al molde, se añade otro desoxirribonucleótido trifosfato (por ejemplo, dGTP). Si es el correcto, se formará PPi y si no, se añade un tercero (por ejemplo, dTTP). Si es el correcto, se formará PPi y si no, se añade dATP•S que, ahora sí, será incorporado a la nueva cadena de ADN. • 3.- En presencia de APS, la ATP sulfurilasa convierte el PPi en ATP. Este ATP provoca la conversión de luciferina en oxiluciferina mediante la enzima luciferasa. Esta reacción genera una cantidad de luz visible proporcional a la cantidad de ATP consumido. Esta luz es captada por un fotodetector, dando lugar a un pico en el pirograma. La altura del pico es proporcional al número de nucleótidos que se han incorporado. • 4. La apirasa degrada todos los desoxirribonucleótidos trifosfato (y el dATP•S) que no se han incorporado, así como el exceso de ATP producido por la reacción de la ATP sulfurilasa. Durante la pirosecuenciación, no se añade un nuevo desoxirribonucleótido trifosfato (etapa 2) hasta que la apirasa haya degradado por completo todos los nucleótidos no incorporados y el ATP. Secuenciación masiva en paralelo Los métodos de la primera generación son capaces de secuenciar hasta 100 kbases al día, con lo que se necesitan varios años para secuenciar el genoma humano. Durante esta última década se han desarrollado los denominados "métodos de segunda generación" que son capaces de llevar a cabo el proceso de secuenciación de forma muchísimo más rápida. Estos métodos se caracterizan porque secuencian de forma masiva y simultánea (en parealelo) la genoteca completa y permiten secuenciar la totalidad del genoma humano en cuestión de días. 454-pirosecuenciación La primera fase de este método consiste en la preparación de una genoteca. Se fragmenta el ADN genómico por métodos suaves como, por ejemplo, la nebulización, que genera fragmentos de entre 300 y 800 pares de bases. Se marcan los extremos de los fragmentos con dos tipos de adaptadores, que denominaremos A y B (uno permitirá que el fragmento se una a las esferas de agarosa y el otro es complementario al oligonucleótido que actuará como cebador en las fases de amplificación y secuenciación). Se seleccionan los fragmentos marcados en uno de sus extremos con el adaptador A y en el otro con el adaptador B. En la segunda fase se hace una PCR en emulsión, es decir, en una mezcla de aceite y agua. Para ello, primero se mezclan los fragmentos de la genoteca con esferas de agarosa recubiertas con un oligo complementario a uno de los adaptadores. Se hace la mezcla de forma que cada esfera sólo se una a un fragmento de la genoteca. Después se añade una emulsión que contiene, en su fase acuosa, todos los reactivos necesarios para la PCR. Cada esfera queda aislada en una gota acuosa rodeada de aceite y separada de las demás esferas. Cada gota se convierte en un microrreactor en el que se lleva a cabo la PCR. En cada gota aumenta exponencialmente el número de fragmentos de ADN (todos ellos idénticos) que, a su vez, se unen a los oligonucleótidos que recubren la esfera. Al final del proceso, cada esfera está recubierta de aproximadamente dos millones de fragmentos de ADN. A continuación, se deshace la emulsión y se depositan las esferas recubiertas de ADN en una placa que contiene cientos de miles de pocillos con un diámetro medio de 44 μm, de manera que en cada pocillo sólo cabe una esfera. Algunos pocillos pueden quedar vacíos. A continuación se añaden otras esferas más pequeñas sobre las que se han inmobilizado dos de las enzimas que intervienen en el proceso de pirosecuenciación (la sulfurilasa, que convierte el PPi en ATP, y luciferasa, que convierte la luciferina en oxiluciferina y genera un fotón de luz). En la tercera fase se lleva a cabo la pirosecuenciación. El sistema de flujo hace pasar de manera secuencial cada uno de los cuatro nucleótidos a través de la placa que contiene los pocillos. Se añaden siempre en el mismo orden (TACG) con lo que se consigue una secuenciación masiva en paralelo (cientos de miles de pocillos, cada uno con dos millones de fragmentos de ADN). Cada vez que en uno de los pocillos se incorpora un nucleótido se genera una señal quimioluminiscente que es recogida por una cámara digital. Esta señal es proporcional al número de nucleótidos que se incorporan en cada pocillo. La adición secuencial de los cuatro nucleótidos se repite 42 veces. En la cuarta fase se hace un análisis de las imágenes obtenidas en cada pocillo y se determina la secuencia de cada fragmento. A partir de esta colección de secuencias se reconstruye la secuencia genómica original por métodos computacionales.
