UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICA. (Creada por Ley N° 25265) FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS ESCUELA PROFESIONAL DE AGRONOMÍA SUBVENCIÓN DE PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN PARA ESTUDIANTES DE PREGRADO - PROGRAMA 066 PROYECTO DE INVESTIGACIÓN LÍNEA DE INVESTIGACIÓN: SUELOS “CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE RIZOBIOS NATIVOS AISLADOS DE NÓDULOS DE TARWI (Lupinus mutabilis) EN LA COMUNIDAD CAMPESINA DE PALMIRA BAJA DEL DISTRITO DE ACORIA-HUANCAVELICA” RESPONSABLES : - CHILQUILLO QUISPE, Luz Marina - MACHUCA GALA, Roxana ASESOR : Mtro. Jesús Antonio Jaime Piñas FECHA DE REGISTRO : 20/09/2019 FECHA DE INICIO : Octubre, 2019 FECHA DE CULMINACIÓN : Mayo del 2020 HUANCAVELICA-PERÚ 2019 1 ÍNDICE ÍNDICE ................................................................................................................................ 2 CAPITULO I ........................................................................................................................ 4 PROBLEMA ........................................................................................................................ 4 1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................4 1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA....................................................................5 1.3. OBJETIVOS: GENERAL Y ESPECÍFICOS .........................................................5 1.3.1. 1.3.2. 1.4. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................... 5 OBJETIVO ESPECIFICO:............................................................................................... 5 JUSTIFICACIÓN ............................................................................................5 CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO ...................................................................................... 7 2.1. ANTECEDENTES ..........................................................................................7 2.2. BASES TEÓRICAS ........................................................................................8 2.3. HIPÓTESIS ................................................................................................. 15 2.4. DEFINICIÓN DE TÉRMINOS .......................................................................... 15 2.5. IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES ................................................................. 16 2.5.1. 2.5.2. 2.5.3. 2.5.4. 2.6. VARIABLE INDEPENDIENTE ....................................................................................... 16 VARIABLE DEPENDIENTE .......................................................................................... 16 VARIABLE INTERVINIENTE ........................................................................................ 16 VARIABLES A EVALUAR ............................................................................................ 16 DEFINICIÓN OPERATIVA DE VARIABLES. ..................................................... 17 CAPITULO III: METODOLOGÍA DE INVESTIGACIÓN .................................................... 18 3.1. ÁMBITO DE ESTUDIO .................................................................................. 18 3.2. TIPO DE INVESTIGACIÓN............................................................................. 18 3.3. NIVEL DE INVESTIGACIÓN ........................................................................... 18 3.4. MÉTODO DE INVESTIGACIÓN ...................................................................... 19 3.5. DISEÑO DE INVESTIGACIÓN ........................................................................ 19 3.6. POBLACIÓN, MUESTRA Y MUESTREO .......................................................... 20 3.6.1. 3.6.2. 3.6.3. Población: .................................................................................................................. 20 Muestra: ..................................................................................................................... 20 Muestreo: ................................................................................................................... 20 3.7. TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS .......................... 20 3.8. PROCEDIMIENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS ............................................ 20 3.9. TÉCNICA Y PROCESAMIENTO DE ANÁLISIS DE DATOS ................................. 23 2 CAPITULO IV: ASPECTO ADMINISTRATIVO ................................................................. 24 4.1. POTENCIAL HUMANOS................................................................................ 24 4.2. RECURSOS MATERIALES ............................................................................ 24 4.3. PRESUPUESTO .......................................................................................... 25 4.4. FINANCIAMIENTO. ...................................................................................... 25 4.5. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ................................................................ 25 BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................. 27 ANEXO .............................................................................................................................. 30 3 CAPITULO I PROBLEMA 1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA En la comunidad de Palmira baja – Acoria – Huancavelica cultivan como tarwi, maíz arveja, haba, cebada etc. Por lo cual el uso constante del suelo mediante los cultivos, desgastan y deterioran las condiciones físico químicas del mismo. Como consecuencia de los procesos habituales de humificación y mineralización existentes en el suelo, se puede establecer un balance entre ganancias y pérdidas de materia orgánica; Las pérdidas se producen de forma natural, aunque su velocidad de desaparición depende de las características del clima y de los suelos del lugar. Entonces los agricultores han incluido a las leguminosas en sus rotaciones de cultivo debido a esta capacidad fijadora en simbiosis con bacterias presentes en los nódulos y también el tarwi (Lupinus mutabilis) es utilizado como abono verde son los mejores aliados para el restablecimiento de la capacidad productiva de los suelos. Por otro lado, el tarwi sea silvestre o domesticada, es una planta de interés por poseer potencial nutritivo, medicinal, insecticida, ornamental, biocombustible, contribuye al restablecimiento de suelos degradados y se emplea en biorremediación. 4 1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ¿Cuáles son las especies de rizobios que nodulan en la raíz del cultivo de tarwi (Lupinus mutabilis) en la comunidad Palmira baja - Acoria - Huancavelica? 1.3. OBJETIVOS: GENERAL Y ESPECÍFICOS 1.3.1. OBJETIVO GENERAL Caracterizar morfológicamente rizobios nativos aislados de nódulos de tarwi (Lupinus mutabilis) en la comunidad campesina de Palmira baja del distrito de AcoriaHuancavelica. 1.3.2. OBJETIVO ESPECIFICO: Aislar los rizobios de nódulos radicales de Lupinus mutabilis. Caracterizar morfológicamente las bacterias de tarwi (Lupinus mutabilis) en la comunidad campesina de Palmira baja del distrito de Acoria-Huancavelica. Seleccionar los rizobios que forman nódulos en la raíz del cultivo de tarwi (Lupinus mutabilis). 1.4. JUSTIFICACIÓN Científico La presente investigación permitirá conocer las bacterias de rizobios nodulados en la raíz del cultivo de tarwi Lupinus mutabilis, para poder generar protocolos validados para el estudio de otras leguminosas de interés agropecuario. Socioeconómico El mundo muestra que requiere con urgencia alimentos producidos sin residuos químicos para una alimentación SANA, cuyas bases de producción se encuentra en las chacras o terrenos andinos, por lo que es de urgencia contribuir en generar propuestas sostenibles a fin de lograr mejores ingresos por la venta de las cosechas saludables y además de reducir los gastos que ocasionan al agricultor por la compra de los fertilizantes sintéticos. Ambiental 5 La leguminosa, como abono vivo, se convierte en una especie con grandes cualidades para la recuperación del suelo o restablecimiento de la fertilidad natural de las chacras en la región, por tanto, contribuirá en el ahorro de energía fósil (petróleo), así como también en la reducción de la contaminación del medio ambiente. 1.5. LIMITACIONES 6 CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO 2.1. ANTECEDENTES El tarwi (Lupinus mutabilis), es una leguminosa utilizada como alimentos desde los tiempos incaicos, se caracteriza por contener altos porcentajes de proteína y grasa, fijar nitrógeno atmosférico en el suelo, tener sabor amargo debido al contenido de alcaloides y ser adaptable a diversidades climáticas con mínimas exigencias del suelo. (Bertha-carita, 2015). (camarena, 2012) El lupino establecido como abono verde e incorpora al estado de floración, entre 36 a 66 t/ha de abono verde, ó 7 a 11,69 t/ha de materia seca y, aporta entre 288,4 a 501,12 kg de N por ha. Convirtiéndose de esta manera en una alternativa agroecológica. Las leguminosas del género Lupinus tienen como simbionte común al grupo dominante del género Bradyrhizobium, (sin embargo, utilizando secuencias del gen 16S rRNA se han encontrado otros géneros bacterianos como simbiontes de Lupinus, con una identidad del 99%, entre ellos: Microvirga zambiensis strain WSM3693 ( (Banasiewicz, 2016). Asimismo, en nódulos de Lupinus montanusse se han identificado tres géneros de bacterias: Rhizobium sp., Pseudomona ssp. y Brevibacillus sp. y no se identificaron al género Bradyrhizobium sp ; igualmente, se ha confirmado la nodulación de Lupinus albus por Ochrobactrum lupini (Willems, 2006) En el distrito de Corongo - Ancash, en diez especies del género Lupinus L. subtomentosus C.P. Sm, L. mutabilis Sweet., L. brachypremnon C.P Sm, L. carazensis Ulbr., L. lindleyanus J. Agardh, L. affmutabilis, L. eriocladus Ulbr, L. aridulus C.P. Sm, L. weberbaueri Ulbr., L. paniculatus Desr (P., 2010). Reportó sus correspondientes bacterias simbióticas, siete de las cuales pertenecen al género Bradyrhizobiumy tres a Mesorhizobium. Igualmente ( (Arone, 2013)al evaluar las bacterias endosimbiontes en nódulos radiculares de Medicago hispida mediante el gen 16S rRNA y otros, genes como atpD, 7 glnII, recA y nodC encontró como endófitos a los géneros Kaistia, Pseudomonas, Achromobacter, Stenotrophomonas, Xhanthomonas, Sphyngopyxis, Duganella y Rheinheimera. Estos resultados muestran que el análisis de la comunidad bacteriana dentro de los nódulos es esencial para mejorar nuestro conocimiento sobre las poblaciones bacterianas endófitas como un paso previo para estudiar las actividades y aplicaciones de endófitos en la agricultura. 2.2. BASES TEÓRICAS 2.2.1. El cultivo de tarwi. Según (Jacobsen, 2006) el tarwi es una leguminosa que fija nitrógeno (100 kg/ha), restituyendo la fertilidad del suelo cultivado en el área andina desde épocas preincaicas, se desarrolla en valles templados y aéreas alto andinas. Conocido con el nombre común: Aymara: tauri (Bolivia); quechua: tarwi, tahuri (Bolivia, Perú), chuchus muti (Cochabamba, Bolivia); chocho, chochito (Ecuador y norte de Perú); Castellano: altramuz, lupino, chocho; Ingles: Andean lupine, pearl lupin. El lupino o altramuz es de gran interés ecológico y agronómico, por ser una de las que más N fija en el suelo, repercutiendo muy positivamente sobre la agricultura y el medio ambiente, constituyéndose una de las mayores promesas de la agricultura sostenible. Su capacidad de crecer en suelos contaminados con metales pesados permite considerarla como una potencial planta fitorremediadora (Antón et al., 2006). 2.2.2. Taxonomía de tarwi. Según (Rodriguez, 2009). La clasificación taxonómica del tarwi es la siguiente: División : Embriofitas sifonógamas Sub División : Angiosperma Clase : Dicotiledóneas Sub Clase : Arquiclamídeas 8 Orden : Rosales (Fabales) Familia : Leguminosas (Fabaceae) Sub familia : Papilionoideas (Faboideae) Tribu : Genisteas Género : Lupinus Especie : mutabilis Nombre Científico : Lupinus mutabilis Sweet. Nombre Común : Tarwi, tahuri, Chocho, Altramuz, lupino. 2.2.3. Morfología. El tarwi es una planta generalmente anual, de crecimiento erecto y que puede alcanzar de 0.8m hasta más de 2m en las plantas más altas (Camarena, 2012). 2.2.3.1. Raíces y nódulos La raíz, que como en toda planta desempeña un rol de sostén y de conducción de la savia desde el suelo hasta los demás órganos, se caracteriza por ser gruesa y pivotante, el aspecto más sobresaliente es la alta cantidad de nódulos que tiene la raíz, pesando unos 50 g por planta, las raíces se asocian con bacterias llamadas Rhizobium spp., que pueden fijar nitrógeno del aire y que aportan entre 40 y 80 kg/ha de nitrógeno al año (Tapia, 2007). Citado por (Araujo, 2015), reporta que como toda leguminosa, el tarwi tiene una raíz pivotante vigorosa, ramificada, leñosa y poco profunda. Presenta múltiples ramificaciones y gran cantidad de raicillas y pelos radicales. En el Perú, las plantas de tarwi muestran generalmente en sus raíces primarias un gran número de nódulos que son bacterias nitrificantes llamadas Rhizobium que presentan un tamaño que varía de 1 a 3 cm. En los suelos donde hay presencia de estas bacterias, la formación de los nódulos comienza pocos días después de la germinación, al cortarlos presentan una coloración rojiza. 9 2.2.3.2. Tallo y ramificaciones Según (Camarena, 2012), la planta de tarwi posee un tallo que alcanza entre los 0.5 a 2 metros de altura, siendo su valor promedio aproximado de 1 metro, por lo general este es grueso, de forma cilíndrica, leñoso y ramificado (de acuerdo al eco tipo presente, este puede ser ramificado o no ramificado) y dependiendo del grado de leñosidad que la planta presente, su color variará de verde a gris castaño. 2.2.3.3. Hojas (Rodriguez, 2009) y (Araujo, 2015), mencionan que, mencionan que, la hoja del Tarwi es de forma digitada, generalmente conformada por 8 - 9 foliolos que varía entre ovalados a lanceolados. En la base de los peciolos existe pequeñas hojas estipuladas, muchas veces rudimentarias y estas se diferencias de las otras especies de Tarwi en las que las hojas tienen menos vellosidades. Las coloraciones de las hojas pueden variar de amarillo verdoso a verde oscuro, y esto depende del contenido de antocianina en la planta. Estas se diferencian de otras hojas de la especie Lupinus porque sus hojas tienen menos vellosidades. 2.2.3.4. Flores e inflorescencia El tarwi pertenece a la subfamilia Papilionoideas por lo cual presenta una corola grande de 1 a 2 cm, con cinco pétalos y compuesta por un estandarte, dos quillas y dos alas. Según el tipo de ramificación que presente la planta, puede tener hasta tres floraciones sucesivas. Se menciona que en una sola planta pueden existir hasta 1000 flores (Tapia, 2007). (Araujo, 2015), nos dice que la coloración de la flor varía entre el inicio de su formación hasta la maduración de un azul claro hasta uno muy intenso y de allí se origina su nombre científico, mutabilis, es decir que cambia. Los colores más comunes son los diferentes tonos de azul e incluso púrpura; menos frecuentes son los colores blanco, crema, rosado y amarillo. 10 2.2.3.5. Fruto (Marmolejo, 2010), mencionan que el fruto es una vaina de forma elíptica u oblonga, el tamaño varía de acuerdo a la variedad entre 6 a 12 cm de longitud y de 1,5 a 2,3 cm de ancho, con sus extremos agudos la cubierta es pubescente. Cada vaina puede obtener de 1 a 8 semillas que son elipsoidales a lenticulares de 4 a 15 mm. 2.2.3.6. Semilla (Gross, 1997), Citado por (callisaya, 2012), reporta que las semillas de tarwi están incluidas en número variable en la vaina y varían de forma (redonda, ovalada a casi cuadrangular), miden entre 0,5 a 1,5 cm. Un kilogramo tiene 3500 a 5000 semillas. La variación en tamaño depende tanto de las condiciones de crecimiento como del eco tipo o variedad. La semilla está recubierta por un tegumento endurecido que puede constituir hasta el 10% del peso total. Los colores del grano incluyen blanco, amarillo, gris, ocre, pardo, castaño, marrón y colores combinados como marmoleado, media luna, ceja y salpicado. 2.2.3.7. El Tarwi como abono verde El (lupinos mutabilis), son especialmente adecuadas para cobertura o abono verde porque proporcionan gran cantidad de material verde de calidad. Este material enriquece el suelo con principios nutritivos y minerales, además de devolver el nitrógeno que extrae de la planta durante su crecimiento. Sumado a ello, el nitrógeno proporcionado por las leguminosas queda retenido en el suelo durante largos períodos y es difícil que sean arrastrados por agua de lluvia. Es por ello que, agricultores de todo el mundo han incluido a las leguminosas en sus rotaciones de cultivo debido a esta capacidad fijadora en simbiosis con bacterias presentes en los nódulos. Esta práctica tradicional está basada en la observación empírica de que las leguminosas recuperan, mantienen o aumentan la fertilidad del suelo. Si un terreno se cultiva año tras año con una gramínea, la productividad irá disminuyendo y para restaurarla será preciso romper ese ciclo anual 11 cultivando alguna leguminosa. La mayoría de las plantas ven limitado su crecimiento por la cantidad de nitrógeno combinado del suelo, pero no así las leguminosas. Además, el análisis de nitrógeno total demuestra que cuando las leguminosas crecen sobre suelos pobres en nitrógeno aumentan la cantidad de nitrógeno fijado en el suelo. Como la única fuente posible de este nitrógeno adicional es la atmósfera, científicos Demostraron que las legumbres a diferencia de otras plantas pueden fijar nitrógeno atmosférico, siendo esta la base química para la práctica tradicional de rotación de cultivos (Lucero, 2018). Las leguminosas se emplean como abono verde con la finalidad de restablecer o mantener la fertilidad de los suelos, los géneros más destacados y con mayor potencial son Vigna, Lablab, Lupinus y Melilotus (Hernández, 1996). 2.2.3.8. El Tarwi como biocombustible Los tallos secos del Lupinus mutabilis sean cultivadas o silvestres se emplean como leña desde tiempos antiguos. Las familias campesinas trasladan estos tallos de la chacra a la vivienda y lo emplean como leña. El tallo seco, posee gran cantidad de celulosa y alto poder calorífico, por lo que se emplea como biocombustible, Asimismo, las cenizas producto del quemado de los tallos secos de tarwi constituyen un excelente repelente de insectos chupadores, rapadores, perforadores y cortadores de plantas tiernas en los cultivos andinos (Jacobsen, 2006). 2.2.3.9. El tarwi como uso medicinal. Farmacología. - Se han realizado estudios verificando las propiedades hipoglucemiantes en la sangre de las semillas de Lupinus mutabilis tanto cruda como cocinadas. Se han encontrados los siguientes metabolitos secundarios: alfa-tocoferol, γ-Tocoferol, esparteína, lupinina, lupanidina y ácidos grasos. (Peralta, 2019) El tarwi como uso sanidad. 12 La planta de tarwi se utilizan mayormente las personas que viven en campo como medicinal tanto para ello y para sus ganados, controlan diferentes enfermedades como: diabetes, males renales, resaca, etc. (Jacobsen, 2006). También se usan sus propiedades curativas para eliminar infestación de parásitos externos en el ganado vacuno (garrapatas), al mezclar el agua hervida amarga de tarwi con agua hervida de ajenjo y hollín de cocina. Con el producto de esta infusión, se baña al animal afectado y se repite hasta que quede libre de parásitos. (Galvez, 2008), citado por (Chirinos- Arias, 2015), menciona que es importante el recalcar que el tarwi es la única especie del género Lupinus que posee isoflavonas (un tipo de flavonoides) en sus semillas que son conocidas por sus propiedades antioxidantes. porque presenta compuestos Fito estrógenos no esteroídicos como las isoflavonas, las cuales poseen anillos fenólicos que se unen a los receptores de estrógeno. (Galvez, 2008). Como tamoxifen, usado para el tratamiento de cáncer de mama. (Davies, 2013). Por lo que ayudaría a la prevención de cáncer. 2.2.4. La simbiosis rizobio-leguminosa y su aporte en las chacras La fijación biológica del Nitrógeno (FBN) es el proceso responsable para la reducción del N2 a amonio (NH3). (France, 2009) y es llevado a cabo por microorganismos diazótrofos, particularmente por bacteria y arquea (Dixon, 2004). La enzima clave de la fijación de N2 es la nitrogenasa que consta, típicamente, de un ferro proteína (Fe-proteína, nitrogenasa reductasa) y de una molibdoferroproteína (MoFe-proteína, nitrogenasa). Cuando en el medio no hay disponibilidad de molibdeno, algunas bacterias como Azotobacter vinelandii o Rhodobacter capsulatus inducen la síntesis de nitrogenasas alternativas que contienen vanadio o hierro en lugar de molibdeno (Dixon, 2004). Se estima que la cantidad total de N que se adiciona al suelo es de unos 275 millones de toneladas métricas al año, de los que 30 se deben a causas naturales, como descargas eléctricas o erupciones volcánicas, 70 proceden de 13 la síntesis industrial debida a la producción de fertilizantes nitrogenados mediante el proceso Haber-Bosch, y 175 se producen mediante la fijación biológica del N2. (Felipe, 2006). La fijación biológica de N2 es, por tanto, un proceso de enorme interés en el ciclo biogeoquímico del N en la naturaleza ya que repone el contenido total de N en la biosfera y compensa las pérdidas que ocurren por des nitrificación (Philippot, 2007).Como ejemplo, baste decir que el empleo de alfalfa como cultivo en rotación incorpora al suelo entre 127 y 500 kg de N/ha/año (Altieri, 2005).La utilización de leguminosas constituye, por tanto, una alternativa para disminuir la aplicación de fertilizantes nitrogenados, lo que redunda en una disminución significativa tanto en términos económicos como de contaminación medioambiental. Las bacterias del orden Rhizobiales, conocidas genéricamente como rizobios, son α-Proteo bacterias, Gram-negativas, que pertenecen a los géneros Rhizobium, Ensifer (Sinorhizobium), Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Allorhizobium, Azorhizobium, Blastobacter, Methylobacterium, Devosia, Phyllobacteriumy Ochrobactrum (Sawada, 2003). Estos rizobios inducen en las raíces de sus plantas hospedadoras la formación de nódulos, que son los órganos donde tiene lugar el proceso de fijación de N2. La mayoría de los rizobios forman nódulos en las raíces, aunque Azorhizobium los ocasiona tanto en las raíces como en los tallos de Sesbaniarostrata, y Phyllobacteriumlos forma en las hojas de las plantas de las familias Myrsinaceae y Rubiaceae. Además de los rizobios, existen otras bacterias capaces de fijar nitrógeno en simbiosis con leguminosas, como son las la β-proteobacterias de los géneros Burkholderia y Ralstonia (Velazquez, 2006). En el interior de los nódulos, los rizobios se transforman en células especializadas, los bacteroides, que se caracterizan por sintetizar la enzima nitrogenasa que es la que reduce el N2 a amonio (NH 4+). Estudios de campo han demostrado que L. mutabilis es capaz de fijar alrededor de 200 kg de nitrógeno por hectárea. 2.2.5. Bacterias endófitas 14 Tomada literalmente, la palabra endófito significa "dentro de la planta" (endon, en griego, dentro de; phyton, planta), (Bacon C. y., 2000). Los endófitos son microorganismos que colonizan tejidos internos vivos de las plantas, sin causar ningún efecto negativo inmediato o daño aparente a la planta. De este modo, las bacterias endófitas se consideran aquellas aisladas de tejidos de plantas vivas desinfectadas superficialmente, o extraído de tejido interno de la planta, y que no causan síntomas visibles de enfermedad en la planta. (Hallmann, 1997). Estas bacterias se encuentran principalmente en los espacios intercelulares de los tejidos y, con menor frecuencia, intracelularmente y en tejidos vasculares, sin causar síntomas de enfermedad. 2.3. HIPÓTESIS Los rizobios nativos aislados de la raíz del cultivo de tarwi (Lupinus mutabilis) de la comunidad Palmira baja-Acoria-Huancavelica y caracterizadas morfológicamente son simbiontes que nodulan. 2.4. DEFINICIÓN DE TÉRMINOS Rhizobium. Es un género de bacterias gran-negativas del suelo que fijan nitrógeno atmosférico. Pertenece a un grupo de bacterias fijadoras de nitrógeno que se denominan colectivamente rizobios. Los nódulos radicales. Como en la mayoría de las leguminosas, la simbiosis entre la planta de lupino y las bacterias noduladoras, que viven en las raíces, tienen gran importancia. Los Rhizobium fijan el nitrógeno del aire y proporcionan a la planta sales nutrientes nitrogenadas. La formación de estos nódulos comienza a partir del quinto día después de la germinación. Los nódulos pueden alcanzar un diámetro de hasta 3 cm; y se encuentran de preferencia en la raíz primaria, por encima de la ramificación, así como en las raíces secundarias. Cada planta puede producir hasta 50g de nódulos en sus raíces. 15 Simbiosis. Viven con determinadas plantas (como por ejemplo las leguminosas) en su raíz, después de un proceso de infección inducido por la propia planta mediante la secreción de lectina, a las que aportan el nitrógeno necesario para que la planta viva y está a cambio le da cobijo. Rizosfera. Se encuentra en el suelo inmediata a las raíces vivas y cumplen una fijación N y le ayuda absorber los minerales de la planta. Comunidad microbiana. Suma de todos los microorganismos y los factores abióticos de un ambiente particular. Poblaciones de microorganismos: por crecimiento celular. Endófita. Son microorganismos unicelulares que viven sin causar daño en el interior de células o tejidos de plantas. Se le conoce como bacterias endófitas. Simbionte. - Es un organismo que tiene una relación de ayuda con otro organismo. Simbionte: Especie animal o vegetal que vive en simbiosis con otra especie diferente. Organismo que vive habitualmente en el espacio corporal de otro, pero sin perjudicarlo. 2.5. IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES 2.5.1. VARIABLE INDEPENDIENTE Rizobios de los nódulos del cultivo de tarwi (Lupinus mutabilis) de la comunidad campesina de Palmira baja del distrito de Acoria-Huancavelica. 2.5.2. VARIABLE DEPENDIENTE Diversidad de bacterias localizadas en los nódulos de (Lupinus mutabilis). 2.5.3. VARIABLE INTERVINIENTE Clima Propiedades del suelo Sanidad de las plantas de tarwi (Lupinus mutabilis). Medio de cultivo 2.5.4. VARIABLES A EVALUAR 16 Aislar los rizobios de nódulos radicales de tarwi (Lupinus mutabilis). Caracterizar morfológicamente las bacterias de tarwi (Lupinus mutabilis) en la comunidad campesina de Palmira baja del distrito de AcoriaHuancavelica. 2.6. DEFINICIÓN OPERATIVA DE VARIABLES. Variable Definición conceptual Definición operacional Indicador Escala Variable Los nódulos de Lupinus son de Nódulos se Presencia de Tamaño y independiente: crecimiento indeterminado, y obtendrá de las nódulos sanidad de Nódulos de por tanto mantienen un raíces de las Lupinus meristemo activo. Sin embargo, plantas de mutabilis no muestran las características Lupinus Mutabilis, típicas de los nódulos en la etapa de indeterminados: floración. nódulos Forma cilíndrica, meristemo apical, y en la zona infectada, un gradiente de diferenciación desde el meristemo hasta la base del nódulo. Se clasifican como un subtipo especial y único denominado nódulo lupinoide. Variable La diversidad de los microbios Los nódulos son Aislados Característi dependiente: endofíticos es la base para nichos del bacterianos cas Diversidad de entender sus diversas endosimbionte, a morfológica bacterias capacidades de producir partir de la cual se s de las localizadas en compuestos, vivir en diversos aíslan los colonias los nódulos de ambientes, asociarse a simbiontes de aisladas de Lupinus diferentes plantas, etc. Lupinus mutabilis, los nódulos. mutabilis. 17 CAPITULO III: METODOLOGÍA DE INVESTIGACIÓN 3.1. ÁMBITO DE ESTUDIO 3.1.1. Ubicación política Departamento : Huancavelica. Provincia : Huancavelica. Distrito : Acoria. Lugar : Palmira Alta. 3.1.2. Ubicación geográfica Latitud sur : 12°38´34.00´´ Longitud Oeste : 74°51´42.00´´ Altitud : 3898 msnm 3.1.3. Factores climáticos Temperatura promedio : 6.0 °C. Humedad relativa : 50% hasta 73% Precipitación promedio anual : 766 mm al año. 3.1.4. Duración Inicio : Octubre, 2019 Culminación : Mayo, 2020 3.2. TIPO DE INVESTIGACIÓN El presente trabajo de investigación es aplicada porque el propósito fundamental es dar soluciones a problemas prácticos la fertilidad natural de las chacras y dar soluciones a las personas que sufren como cáncer, colesterol, diabitis etc en la comunidad Palmira baja, por lo tanto, contribuirá en el ahorro de energía fósil (petróleo), así como también en la reducción de la contaminación del medio ambiente. 3.3. NIVEL DE INVESTIGACIÓN 18 El presente trabajo de investigación corresponde a la investigación descriptiva, orientada a la caracterización de los rizobios endosimbiontes en nódulos de (Lupinus mutabilis), crecidas en la comunidad Palmira baja-Acoria-Huancavelica. 3.4. MÉTODO DE INVESTIGACIÓN Se fundamenta en el Método Científico y utiliza como procesos lógicos la inducción y la deducción. 3.5. DISEÑO DE INVESTIGACIÓN El diseño de investigación es transversal descriptivo, porque los datos o información son recolectados en un solo momento; y corresponde a la investigación no experimental, cuyo flujo es el siguiente: Investigación no experimental Diseño transversal Descriptivo Diagrama del proceso de aislamiento e identificación del rizobios de Lupinus mutabilis. Recolección de nódulos Esterilización de nódulos Siembra y aislación de bacterias Purificación de bacterias Caracterización Morfológica Prueba Biológica 19 3.6. POBLACIÓN, MUESTRA Y MUESTREO 3.6.1. Población: La población estará conformada por 300 nódulos procedentes de 30 plantas de Lupinus mutabilis crecidas en la comunidad Palmira baja-Acoria-Huancavelica. 3.6.2. Muestra: Se tomarán 10 nódulos por cada planta 3.6.3. Muestreo: El tipo de muestreo a utilizar será el simple – aleatorio 3.7. TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS Técnicas de recolección de datos. Para la recolección de datos en el trabajo de investigación se utilizará la técnica de observación y medición, según la variable a evaluar, según la metodología antes ya descrita. Instrumentos de recolección de datos. Los instrumentos a utilizar en la recolección de datos, serán entre según el protocolo que se emplea en la caracterización de las bacterias y las pruebas biológicas. 3.8. PROCEDIMIENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS a) Recolección de Nódulos Para la recolección de los nódulos que servirán para el aislamiento de Rizobios se seleccionaran de 10 plantas vigorosas con hojas verdes y sanas, de las cuales se toman alrededor de 20 nódulos vivos e intactos, preservándolos en frascos de vidrio con material desecante (gel de sílica) hasta su siembra, aislamiento e identificación en el Laboratorio b) Esterilización de nódulos y aislamiento de sus endosimbiontes Los nódulos de cada planta se mezclarán y 12 de ellos se esterilizarán con HgCl 2 al 0.25% durante 5 minutos. Posteriormente, se lavarán abundantemente con agua destilada estéril. Cada uno de los nódulos se deposita en una placa Petri, se le 20 adicionará 2 gotas de agua estéril y se machacará con una varilla de vidrio también estéril. El extracto resultante se utilizará para inocular placas Petri que contengan medio YEM (Vincent, 1970). Para comprobar la eficacia de la esterilización, 3 nódulos sin machacar se harán rodar sobre placas rellenas con medio YEM. Todos los cultivos se incubarán a 30 ºC durante 8 d. Las unidades formadoras de colonias (UFCs) con diferente morfología que aparecen en las placas se seleccionarán mediante inspección con una lupa de aumento 10X y cada una de ellas se resiembra en placas Petri con medio YEM hasta la obtención de colonias morfológicamente uniformes. c) Cultivo Bacteriano Cada una de las cepas obtenidas se siémbrala en tubos de vidrio de 3 ml de medio liquido YEM y se incuba a 30 °C, en agitación a 120 r.p.m. durante 34 a 72 horas, tiempo necesario para que la densidad celular de las diferentes cepas bacterianas, determinada espectrofotométricamente a 600 mm de longitud de onda, fuera – 0,6. Posteriormente las células se recogen mediante centrifugación de los cultivos en una micro fuga a 12.000 r.p.m durante 3 minutos, a temperatura ambiente. Cuando de las cepas produce abundante polisacárido, las células se lavarán con sarkosil al 0.1 % en solución tampón TE (10 mM Tris-HCL, 1 Mm EDTA, pH 8.0). d) Esterilización de semillas, germinación e inoculación de las plántulas. Esterilización de semillas y germinación Las semillas de tarwi (Lupinus mutabilis), se esterilizarán de la siguiente manera: 1) Sumergir las semillas en una solución de HgCl2 al 2,5% durante 10 minutos en agitación. 2) Lavar con abundante agua destilada estéril. 3) Embeber en agua destilada estéril durante 1-2 horas a temperatura ambiente, en agitación. 4) Lavar abundantemente con agua estéril y colocar sobre placas Petri con agar al 1%. 21 5) Germinar en oscuridad a 30 º C hasta que las radículas alcancen 1-2 cm de longitud Solución nutritiva para el cultivo de plantas Se empleará la solución mineral descrita por (Rigaud y Puppo, 1975), cuya composición se describe a continuación: Macro elementos (por litro de agua) • KH2PO4 68 mg • K2HPO4 44 mg • SO4Mg x 7H2O 123 mg • K2SO4 174 mg • SO4Ca 173 mg • EDTA férrico (forma comercial Secuestrene) 25 mg. Micro elementos (por litro de agua): • MoO4Na2 x 2H2O 0,11 mg • BO3H3 2,85 mg • SO4Mn x 4H2O 3, 07 mg • SO4Zn x 7H2O 0, 55 mg • SO4Cu x 5H2O 0,2 mg La solución se esterilizará en autoclave a 120 ºC durante 20 minutos. Preparación de inóculos bacterianos Todos los inóculos bacterianos se obtendrán a partir de cultivos frescos en los correspondientes medios líquido, hasta obtener una suspensión bacteriana de, aproximadamente, 108 células viables por ml. La cantidad de células viables se estima calculando el número de UFCs. Cada semilla se inoculará con 1 ml de la correspondiente suspensión bacteriana. Cultivo de plantas Cultivo en jarra Leonard El cultivo se llevará a cabo utilizando Jarras Leonard (Leonard, 1943). Este sistema consta de dos recipientes independientes, de manera que el superior se 22 rellena con vermiculita y el inferior con solución nutritiva (Regaud, 1975). El conjunto se esterilizará mediante autoclave a 120 º C durante 20 minutos. En cada jarra se sembrará las semillas pre germinadas y se inoculará con 1 ml de la suspensión bacteriana en estudio. La capa superficial de vermiculita se cubrirá con una capa de perlita estéril, que evita la posible contaminación ambiental y refleja la luz por lo que previene el calentamiento excesivo de las semillas. Cada jarra se envuelve en papel opaco a la luz para evitar que ésta alcance las raíces. Las jarras se trasladarán a un invernadero funcionando en condiciones controladas (500 µeinstein x m-2 x s-1 de longitud de onda de onda, 400-700 nm de intensidad luminosa, fotoperiodo de 16/8 horas luz/oscuridad, 23/17 ºC de temperatura día/noche y 50% de humedad relativa). 3.9. TÉCNICA Y PROCESAMIENTO DE ANÁLISIS DE DATOS Para el análisis de datos se utilizará diversos softwares de bioinformática y estadística descriptiva, siguiendo la metodología (Talbi, 2011). Estadística descriptiva: tablas y gráficos de frecuencias. Estadística inferencia: Prueba de relación específico: Chi cuadrado de independencia. 23 CAPITULO IV: ASPECTO ADMINISTRATIVO 4.1. POTENCIAL HUMANOS. 4.1.1. Tesista : CHILQUILLO QUISPE, Luz Marina : MACHUCA GALA, Roxana Ciclo : X Ciclo Condición : Regular Escuela : EP Agronomía - Acobamba Facultad : Ciencias Agrarias. 4.1.2. Asesor : Mtro. Jesús Antonio Jaime Piñas Condición : Nombrado - Asociado Escuela : Agronomía - Acobamba Facultad : Ciencias Agrarias 4.2. RECURSOS MATERIALES Unidad de Medida Cantidad Insumos y reactivos Manitol g 500 350 350.00 MgSO4 x 7H2O g 250 52 52.00 Extracto de levadura Agua destilada Agar bacteriológico g l kg 500 100 1 25 4 550 25.00 400.00 550.00 HgCl2 g 100 160 160.00 SO4Ca g 250 106 106.00 Perlita kg 1 45 45.00 Materiales Generales 24 Precio Sub Total, S/. Unit. S/. Vermiculita Placas Petri Papel platina Algodón Botellas de tapa azul 1000 ml Jarras Leonard Materiales de escritorio Cuaderno Lapiceros Impresiones Copias USB kg Unidad Unidad Paquete Unidad Unidad 24 50 30 4 5 30 Unidad Unidad Unidad Unidad Unidad Sub total 2 21 1000 500 1 125 250.00 4 200.00 12 230.00 25 100.00 30 150.00 10 300.00 Sub total S/. 2,918.00 4 0.5 0.1 0.1 30 8.00 10.5.00 100.00 50.00 24.00 S/. 192.50 4.3. PRESUPUESTO Presupuesto del proyecto Insumos y reactivos Materiales de escritorio Movilidad y transporte Publicación Capacitación Costo total S/. Monto S/. 2918.00 192.50 150.00 350.00 500.00 4110.50 4.4. FINANCIAMIENTO. El presente trabajo será subvencionado por programa 066 de proyectos de investigación para estudiantes de pregrado. 4.5. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Meses ACTIVIDADES Presentación del proyecto N X 25 D E F M A M Compra de materiales X Muestreo de nódulos del cultivo de X tarwi. Aislamiento del rizobios X Pruebas de inoculación X X Identificación de rizobios X Análisis e interpretación de datos X X Redacción de informe final X Presentación del informe X 26 BIBLIOGRAFÍA Altieri, M. y. (2005). Agroecologia: teoria y practica para una agricultura sostenible. mexico. Araujo, R. (2015). Pracela de comparacion de compuestos de tarwi (lupinus mutabilis sweet) en dos localidades del valle del mantaro. tesis para optar el titulo de Ing. Agronomo, pp. 8-64. Arone, G. C. (2013). idntification of Ensifer strains isolated from root nodules of Medicago hispida grown in association with Zea mays in the quechua region of the Peruvian Andes. granada. Bacon, C. y. (2000). Microbial endophytes. New York. Banasiewicz, E. L. (2016). Use of rRNA gene for characterizacion of phosphate-solubilizing bacteria associated with corn. mexico. Bertha-carita, M. (12 de agosto de 2015). agricultura y ganaderia. Obtenido de monografias: monografias.com callisaya, I. 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Las Especies de Lupinus L. ( Fabaceae) y de sus simbiontes en el distrito de corongo- Ancash, Altramuces Legumbre- variedades, universidad nacional mayor de san marcos . Ancash: lima. Peralta, I. E. (2019). chochos en su punto: recetario. Quito. Philippot, L. H. (2007). Ecoogy of dinitrifying prokaryptes, in; agricultural soil. Sparks DL (ed). Adv. Agro, 249-304. Regaud, J. P. (1975). Indole-3 acetic catabolism by soybean bacteroids. J. Gen. Bacteriol. 88, 223-228. Rodriguez, B. P. (2009). evaluacion in vitro de la actividad antimicrobiana de los alcaloides de agua de coccion de proceso de desamar de gado del chocho (lupinus mutabilis sweet). Tesis de grado. Bioquímico Farmacéutico. . riobamba - ecuador: Escuela superior politecnica de CHIMBORAZO. Sawada H, K. L. (2003). changing concepts in the systemtics of bacterial nitrogen - fixing legume symbionts. Sawada, H. K. (2003). Changing concepts in the systematics of bacterial nitrogen-fixing legume symbionts. 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Obtenido de plant soil 287: 3-14: plant soil 29 ANEXO MATRIZ DE CONSISTENCIA CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE RIZOBIOS NATIVOS AISLADOS DE NÓDULOS DE TARWI (Lupinus mutabilis) EN LA COMUNIDAD CAMPESINA DE PALMIRA BAJA DEL DISTRITO DE ACORIA-HUANCAVELICA PROBLEMA General El cultivo de tarwi en una leguminosa andina cuyo cultivo y consumo necesitan ser revalorados por su adaptación a los suelos marginales, su tolerancia al estrés hídrico y su capacidad de fijar nitrógeno atmosférico en el suelo, que es ideal para sistemas de cultivos agroecológicos u orgánicos. Específicos ¿Qué especie de rizobios nodulan en la raíz del cultivo de tarwi (Lupinus mutabilis) en la comunidad Palmira baja - Acoria - Huancavelica? OBJETIVOS HIPÓTESIS General Los rizobios nativos Evaluar las bacterias endosimbióticas de aislados de la raíz del los nódulos radicales de lupinus mutabilis cultivo de tarwi crecidas en la comunidad Palmira baja- (Lupinus mutabilis) Acoria -Huancavelica. de la comunidad Palmira baja-AcoriaHuancavelica y caracterizadas morfológicamente son simbiontes que nodulan. Específicos Aislar los Rizobium de nódulos radicales de Lupinus mutabilis. Caracterizar morfológicamente las bacterias de tarwi (Lupinus mutabilis) en la comunidad campesina de Palmira baja del distrito de Acoria-Huancavelica. Seleccionar los Rizobium que forman nódulos en la raíz del cultivo de tarwi (Lupinus mutabilis). 30 VARIABLES Independiente Rizobios de los nódulos del cultivo de tarwi (Lupinus mutabilis) de la comunidad campesina de Palmira baja del distrito de Acoria-Huancavelica. Dependiente Diversidad de bacterias localizadas en los nódulos de Lupinus mutabilis. METODOLOGÍA Se fundamenta en el Método Científico y utiliza como procesos lógicos la inducción y la deducción, empleando metodologías Lezama. 2010; Arone et al. 2013. 31 32