Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadoras de esporas aeróbicas
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4/9/2021 Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora… Página 1 Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690 Listas de contenidos disponibles en ScienceDirect Revista de métodos microbiológicos página de inicio de la revista: www.elsevier.com/locate/jmicmeth Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para diferenciación de aislamientos de bacterias aeróbicas formadoras de esporas de la miel T Ana C. López, Adriana M. Alippi⁎ Unidad de Bacteriología, Centro de Investigaciones de Fitopatología, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata, cc 31, calle 60 y 119, 1900 La Plata, Argentina INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO ABSTRACTO Palabras clave: Este estudio tuvo como objetivo evaluar la viabilidad de utilizar RFLP de genes de rRNA 16S amplificados por PCR mediante el uso de PCR-RFLP cebadores 27f / 1492r y una combinación de tres enzimas de restricción, Alu I, Cfo I y Taq I, para una rápida Bacilo Detectar una diferenciación principalmente de aislamientos del complejo de bacterias aeróbicas formadoras de esporas comúnmente Paenibacillus encontrado en muestras de miel. El método descrito produjo patrones únicos y distinguibles para diferenciar Brevibacillus entre 80 aislamientos pertenecientes a 26 especies diferentes de Bacillus , Brevibacillus , Lysinibacillus , Rummeliibacillus y Lisinibacilo Paenibacillus reportado en miel y otras fuentes de colmena. 1. Introducción milus, Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Brevibacillus borstelensis , Brevibacillus brevis, Brevibacillus laterosporus, Lysinibacillus fusiformis , “La miel es la sustancia dulce natural producida por las abejas melíferas de Lysinibacillus sphaericus, Paenibacillus alvei, Paenibacillus apiarius, néctar de plantas o de secreciones de partes vivas de plantas o ex- Larvas de Paenibacillus, Paenibacillus polymyxa y Rummeliibacillus stabe- creaciones de insectos chupadores de plantas en las partes vivas de las plantas, que el kisii ( Alippi, 1995; Alippi y col., 2004 ; Alippi y Abrahamovich, 2019 ; las abejas recolectan, transforman al combinarse con sustancias específicas de su Bartel et al., 2018 ; Evans y Armstrong, 2006; Gilliam, 1979, 1997 ; poseer, depositar, deshidratar, almacenar y dejar en el panal para que madure y Gilliam y Morton, 1978; Gilliam y Valentine, 1976 ; Iurlina y maduro" Fritz, 2005, Piccini y col., 2004 ; Sinacori et al., 2014 ; Snowdon y www.fao.org/input/download/standards/310/cxs_012e.pdf. La miel es una solución de azúcar sobresaturada que contiene pequeñas cantidades de Cliver, 1996 ; Wen et al., 2017 ). Dentro de esta comunidad, algunos grupos ácidos orgánicos, minerales, vitaminas, enzimas, proteínas y aminoácidos se componen de parientes filogenéticos cercanos, es decir , el Bacillus cereus ( Machado De-Melo et al., 2018). La calidad de la miel está influenciada por mi- sensu lato que consiste en Bacillus cereus sensu stricto, Bacillus anthracis , microorganismos, principalmente levaduras y bacterias formadoras de esporas; sin embargo, Bacillus mycoides; Bacillus cytotoxicus ; Bacillus pseudomycoides ; Bacilo La miel vendida comercialmente tiene una mínima contaminación microbiana debido a thuringiensis y Bacillus toyonensis (Guinebretière et al., 2013 ; Liu sus propiedades antibacterianas naturales, incluida la acidez, alta osmótica et al., 2018 ; Vilas-Boas et al., 2007) y el grupo Bacillus subilis compuesto presión, peróxido de hidrógeno y viscosidad ( Molan, 1992a, 1992b; de Bacillus subtilis , Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus athrophaeus, Ba- Mundo et al., 2004; Snowdon y Cliver, 1996 ). A pesar de las diversas cillus licheniformis; Bacillus mojavensis, Bacillus paralicheniformis , Bacillus factores inhibidores, algunos microorganismos pueden sobrevivir en la miel, pumilus , Bacillus safensis, Bacillus siamensis, Bacillus tequilensis, Bacillus cularmente bacterias formadoras de esporas, que son las principales fuentes de vallismortis, Bacillus velezensis y Bacillus xiamenensis (Dunlap y col., manipulación del tracto digestivo de larvas y abejas adultas, panales de cría, 2016; Jeyaram y col., 2011 ; Lai et al., 2014 ;). Además, Lysinibacillus fusi- polvo ambiental, aire, suelo, polen, néctar y superficies florales ( Gilliam, formis y Lysinibacillus sphaericus están estrechamente relacionados entre sí y 1979, 1997; Gilliam y Prest, 1978; Gilliam y Valentine, 1976). con otras especies de Lysinibacillus (Ahmed y col., 2007). La comunidad de bacterias formadoras de esporas aeróbicas reportadas en la miel Se han identificado bacterias aeróbicas formadoras de esporas de la miel. comprende Bacillus amyloliquefaciens , Bacillus badius, Bacillus cereus sensu utilizando diferentes metodologías, incluido el aislamiento en selectivos, diferentes lato, Bacillus circulans, Bacillus clausii , Bacillus coagulans, Bacillus firmus, medios de cultivo entiales o cromogénicos, microscopía, pruebas bioquímicas, Bacillus flexus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pu- y la secuencia del (los) gen (es) del ARNr 16S ( Alippi, 1995 ; Alippi et al., https://translate.googleusercontent.com/translate_f 1/12 4/9/2021 Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora… ⁎ Autor para correspondencia. Dirección de correo electrónico: alippi@biol.unlp.edu.ar (AM Alippi). https://doi.org/10.1016/j.mimet.2019.105690 Recibido el 21 de junio de 2019; Recibido en forma revisada el 15 de agosto de 2019; Aceptado el 15 de agosto de 2019 On-line el 16 de agosto de 2019 0167-7012 / © 2019 Elsevier BV Todos los derechos reservados. Página 2 AC López y AM Alippi Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690 tabla 1 Lista de cepas bacterianas y condiciones de cultivo utilizadas en este estudio con números de acceso y referencias de GenBank. Cepa Número de acceso Condiciones de cultivo a Colección de culturaB Referencia m39 MG004187.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m287b MG004189.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m163b MG004188.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m164b MG004193.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 mv35 MG004186.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 xx KP177517.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 m291b MG004190.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 N / AC TSA / 32 ° C CCT N/A ATCC 11778 AF290546 TSA / 32 ° C ATCC N/A m6c KP005456.1 TSA / 32 ° C UB-CIDEFI Minnaard y Alippi, 2016 mv33 KU230015.1 TSA / 32 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 m387 KP005455.1 TSA / 32 ° C UB-CIDEFI Minnaard y Alippi, 2016 m434 KU230027.1 TSA / 32 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 LPcer1 KX431225.1 TSA / 32 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 MexB KU230012.1 TSA / 32 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 MexC KU230013.1 TSA / 32 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 N/A MYPGP / 37 ° C ATCC N/A Fr231 KU232014.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 m448b KX685159.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 BclENT N/A MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI N/A N/A TSA / 30 ° C ATCC N/A N/A TSA / 32 ° C ATCC N/A NRRLB-1001 N/A TSA / 30 ° C NRRL N/A mv55 KU232018.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 mv68 MF187633.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abramovich, 2019 NRRL B-939 N/A TSA / 32 ° C NRRL N/A m327 MF187637.1 TSA / 32 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m435 KU232028.1 TSA / 32 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 ATCC 10206 N/A TSA / 32 ° C ATCC N/A m336 MF187638.1 TSA / 32 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m425 N/A TSA / 32 ° C UB-CIDEFI N/A ATCC 7061 T AY876289.1 TSA / 30 ° C ATCC N/A mv41aA MG366818.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 mv49b KU232016.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 mv74 MF972935.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 mv81 KU232019.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 m116 KU232020.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 m288 MF187635.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m332 MF187646.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m339 MG366884.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m350 KU232023.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 m357 MF187634.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m358 MG345110.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m360 MF187636.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m363 KU232024.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 m414 KU232026.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 NRRL B-543 N/A TSA / 30 ° C NRRL N/A m13 MF187645.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 cm45 MF187639.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m191 MF187644.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m329 KU232021.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 m334 KU232022.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 m347 KP175515.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 m392 MF187640.1 TSA / 30 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 ATCC 10792 T D16281.1 TSA / 32 ° C ATCC N/A mv50b KU232017.1 TSA / 32 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 Bacillus amyloliquefaciens Bacilo badius CCT 0196 Bacillus cereus Bacillus circulans ATCC 4515 Bacilo claussi Bacillus coagulans ATCC 35670 Bacilo firmus ATCC 8247 Bacillus licheniformis Bacillus megaterium Bacillus mycoides Bacillus pumilus Bacillus subtilis bacilo turingiensico https://translate.googleusercontent.com/translate_f 2/12 4/9/2021 Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora… m395 KU232025.1 TSA / 32 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 RC MF187641.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 m348 KP177514.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 Brevibacillus borstelensis Brevibacillus brevis ( continúa en la página siguiente ) 2 Página 3 AC López y AM Alippi Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690 Tabla 1 ( continuación ) Cepa Número de acceso Condiciones de cultivo a Colección de culturaB Referencia ATCC 8246 N/A MYPGP / 37 ° C ATCC N/A LAT169 KX102627.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 LAT170 KX431223.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 LAT171 KX431224.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Bartel et al., 2018 MG004185.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 ATCC 245 N/A MYPGP / 37 ° C ATCC N/A m533 MG001492.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 LMDZA MG004191.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 NRRL B-383 N/A MYPGP / 37 ° C NRRL N/A mv82 MF187643.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m291a MF187632.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 m420 MF187642.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 N/A MYPGP / 37 ° C ATCC N/A ATCC 9545 T NR_118956.1 MYPGP / 37 ° C ATCC Ash y col., 1991 PL36 N/A MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI N/A ATCC 13537 T KT363749.1 MYPGP / 37 ° C ATCC Dingman, 2015, inédito SAG 290 N/A MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI N/A SAG 10367 KT363748.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Dingman, 2015, inédito N/A MYPGP / 37 ° C NRRL N/A MF972934.1 MYPGP / 37 ° C UB-CIDEFI Alippi y Abrahamovich, 2019 Brevibacillus laterosporus Lysinibacillus fusiformis mv119 Lysinibacillus sphaericus Paenibacillus alvei Paenibacillus apiarius ATCC 29575 Paenibacillus larvae subsp. larvas Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens Paenibacillus polymyxa NRRL B-510 Rummeliibacillus stabekisii mv111 a TSA: Agar tríptico de soja, MYPGP: Müller-Hinton - Levadura - Peptona - Glucosa - Agar piruvato. b ATCC: Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville , Estados Unidos; CCT: Coleção de Culturas Tropical, Fundaçao André Tosello, Brasil; NRRL: Utilización del norte División de Investigación y Desarrollo, Peoria, Illinois, EE. UU.; UB-CIDEFI: Unidad de Bacteriología, Centro de Investigaciones de Fitopatología, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina. c N / A: No aplica. 2004 ; Alippi y Abrahamovich, 2019; Sinacori et al., 2014 ; Wen y col., 2. Materiales y métodos 2017 ). Técnicas microbiológicas clásicas, incluida la microscopía y Las pruebas bioquímicas son laboriosas y requieren mucho tiempo. Solo comparaciones 2.1. Cepas bacterianas, medios y condiciones de cultivo de secuencias de genes de ARNr 16S completas permiten la diferenciación entre especies estrechamente relacionadas, en particular dentro de B. cereus y B. subtilis Un total de 80 cepas de bacterias formadoras de esporas aeróbicas mesófilas grupos o especies de Lysinibacillus ; mientras que las secuencias parciales o de baja calidad enumerados en la Tabla 1 fueron examinados en este trabajo. La colección incluye 61 de los genes de ARNr 16S pueden producir una identificación errónea (Logan aislamientos de miel u otras fuentes de colmena pertenecientes a la Colección et al., 2009). ción de la UB-CIDEFI (Unidad de Bacteriología del Centro de In- Se han identificado cepas de bacterias formadoras de esporas estrechamente relacionadas. vestigaciones de Fitopatología) y 19 cepas de International Cul- Utilizado varios métodos novedosos o sofisticados, incluido el análisis Colecciones actuales ( Tabla 1). Todos los aislamientos se cultivaron de forma rutinaria en lisis de los espaciadores transcritos intergénicos (ITS) del rRNA 16Se23S, es decir , ITS- agar tríptico de soja (TSA) (Britania®, Argentina) o en Müller-Hinton - Huella digital por PCR o ITS-RFLP ( Daffonchio et al., 1998 ; Haque y Agar levadura-péptona-glucosa-piruvato (MYPGP) ( Dingman y Russel, 2005 ; Shaver y col., 2002 ); Espectroscopia Raman (Hutsebaut Stahly, 1983) a la temperatura adecuada según la especie et al., 2006 ), Desorción / ionización láser asistida por matriz, tiempo de probado ( Tabla 1). vuelo- Masa (MALDI-TOF-MS) (Fernández-No et al., 2013 ; Pomastowski et al., 2019 ; Shu y Yang, 2017) y aprendizaje automático asistido 2.2. Preparación de ADN, amplificación por PCR y análisis RFLP de ARNr 16S Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) ( Bağcıoğlu et al., genes 2019 ). Sin embargo, la mayoría de estas técnicas requieren un alto nivel de experiencia. pertise y equipo caro. Por otro lado, los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción Las células bacterianas para la extracción de ADN se cultivaron en el temperatura y medio en condiciones aeróbicas durante 24 a 48 h de actividad. Se ha empleado el análisis (RFLP) de los genes de ARNr 16S amplificados por PCR. según la especie utilizada ( Cuadro 1). Para la preparación de ADN, un rápido examinar la diversidad de varias especies formadoras de esporas aisladas de El procedimiento que utiliza células enteras de placas se utilizó como se describió anteriormente. diferentes fuentes ( Alippi et al., 2002 ; Ash et al., 1991; Jeyaram y col., escrito ( Alippi y Aguilar, 1998). Imprimaciones universales 27f (5´AGAGTT 2011 ; López y Alippi 2007, 2008 ; Manzano et al., 2003; Vaerewijck TGATCMTGGCTCAG 3 ′) y 1492r (5´ TACGGYTACCTTGTTACGACTT et al., 2001; Vardhan y col., 2011 ; Wu et al., 2006 ). Sin embargo, estos 3 ') descrito por Yu et al. (2013) fueron empleados. Se llevaron a cabo PCR Los estudios se han centrado en la diferenciación de un número limitado de en un volumen final de 25 μl según un protocolo descrito previamente especies o grupos específicos aislados de diversos nichos ecológicos. (Yu y col., 2013). Después de la amplificación del producto de PCR de aproximadamente https://translate.googleusercontent.com/translate_f 3/12 4/9/2021 Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora… A la luz de las consideraciones anteriores, el objetivo de este estudio Aproximadamente 1492 pb, se incubaron submuestras de 2 μl con endonucleasas fue evaluar la viabilidad de utilizar RFLP de rRNA 16S amplificado por PCR Rsa I, Hae III, Alu I, Hinf I, Taq I y Cfo I, de acuerdo con las especificaciones del fabricante. gen (s) mediante el uso de cebadores universales 27f / 1492r para un bajo costo, rápido especificaciones (Promega®, CABA, Buenos Aires, Argentina). RFLP analizado cribado para una diferenciación principalmente del complejo de esporas aeróbicas La lisis se realizó por electroforesis en un gel de agarosa al 1.6% a 70 V para formando bacterias a partir de la miel. 2 h. Se analizaron todos los aislamientos enumerados en la Tabla 1 . 3 Página 4 AC López y AM Alippi Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690 Tabla 2 Alu I, Cfo I, Hae III, Hin fI, Rsa I y Taq I y patrones RFLP obtenidos en Números de acceso de secuencias seleccionadas de ARNr 16S y genomas completos de silico coincidió con los obtenidos experimentalmente cuando el (los) gen (es) del ARNr 16S Tipo de cepas (T) utilizadas para análisis y comparaciones in silico . las secuencias eran casi de longitud completa (> 1400 nucleótidos) (Tablas 3 y 4). Son La secuenciación del gen ARNr 16S proporciona resultados de alta calidad en Número de acceso Número de acceso Gen de ARNr 16S genoma completo NR_118950.1 FN597644 Bacillus anthracis ATCC14578 T AE016879 GCA_000007845.1 análisis, particularmente en el caso de bacterias formadoras de esporas aeróbicas Bacillus atrophaeus JCM 9070 T AB021181 GCA_001584335.1 (Logan y col., 2009). Bacilo badius ATCC 14574 T X77790.1 JXLP01000009 Bacillus cereus ATCC 14579 T AF290546.1 AE016877 Bacillus circulans ATCC 4513 T AY724690.1 AY724690 Bacillus clausii DSM 8716 T X76440.1 CP019985 se observaron cuando las longitudes de secuencia eran <1400 nt ( Tablas 3 y 4). Bacillus cytotoxicus NVH 391 T CP000764 GCA_000017425.1 Por ejemplo, las cepas de B. amyloliquefaciens xx y mv35 mostraron diferencias Bacillus coagulans ATCC 7050 T AB271752.1 CP009709 encias en las bandas de firma obtenidas in silico para enzimas de restricción Bacilo firmus NBRC 15306 T NR_112635.1 BCUY01000205 Bacillus flexus NBRC 15715 T NR_024691.1 BCVD01000224 Bacillus licheniformis ATCC 14580 T NR_074923.1 AE017333 Bacillus mojavensis RO-H-1 T JH600280 GCA_000507105.1 y B. megaterium cepa m435 para Alu I, y B. pumilus cepas m350 y Bacillus megaterium ATCC 14581 T NR_112636.1 JJMH01000057 m116 para Cfo I ( Tablas 3 y 4 ). Estas discrepancias in silico fueron solo Bacillus mycoides ATCC 6462 T NR_115993.1 ACMU01000002 encontrado cuando las secuencias analizadas eran inferiores a 1350 pb. Nunca- Bacillus paralicheniformis KJ-16 T KY694465 GCA_001042485.2 Bacillus pumilus ATCC 7061 T NR_043242.1 ABRX01000007 Bacillus pseudomycoides DSM 12442 T ACMX01000133 GCA_000161455.1 patrón para cada enzima de restricción cuando se prueba experimentalmente Bacillus safensis FO-36b T ASJD01000027 GCA_003097715.1 (Cuadro 4 ). Jeyaram et al. Han informado resultados similares . (2011) Bacilus siamensis KCTC 3613 T AJVF01000043 GCA_000262045.1 cuando examinaron cepas pertenecientes al grupo B. subtilis para Bacilo simple NBRC 15720 T NR_042136.1 BCVO01000086 Bacillus subtilis IAM 12118 T NR – 112116.2 ABQL01000001 Bacillus tequilensis KCTC 13622 T AYTO01000043 GCA_000507145.1 Bacillus thuringiensis ATCC 10792 T D16281.1 ACNF01000156 gen de ARNr usando cebadores universales 27f / 1492r seguido de restricción Bacilo toyonensis BCT-7112 T CP006863 GCA_000496285.1 digestión usando Alu I, Cfo I, Hae III, Hin fI, Rsa I y Taq I, claramente Bacilo vallismortis DV1 -F-3 T JH600273 N/A especies diferenciadas estrechamente relacionadas. Dentro de toda la colección analizando Bacillus velezensis CR-502 T AY603658 GCA_001461825.1 Bacilus xiamenenis HYC-10 T AMSH01000114 GCA_000300535.1 Brevibacillus borstelensis NRRL NRS- AB112721 GCA_003710865.1 Brevibacillus brevis NBRC 15304 T AB271756.1 GCA_003385915.1 (Cuadro 4) y nos permitió distinguirlo de otros estrechamente relacionados Brevibacillus laterosporus DSM 25 T NR_112212.1 CP017705 Lysinibacillus fusiformis ATCC 7055 T NR_112569.1 GCA_003049525.1 bacterias reportadas en la miel y de otras especies dentro de B. subtilis Lysinibacillus sphaericus NBRC NR_112627.1 GCA_002982115.1 Paenibacillus alvei DSM 29 T AJ320491 GCA_000293805.1 B. mycoides, B. pumilus, B. thuringiensis y Br. borstelensis, respectivamente Paenibacillus apiarius NRRL NRS- NR_118834.1 GCA_002161865.1 que mostró patrones de restricción de Alu I específicos de la especie ( Tabla 5 ). Cuando NR_118956.1 GCA_002003265.1 KT363749.1 GCA_002007765.1 Paenibacillus polymyxa ATCC 842 T AJ320493.1 AFOX01000032 Rummeliibacillus stabekisii KSC-SF6g T DQ870754.1 N / Aa identificación bacteriana, dependiendo de la calidad de la secuencia. Como Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350 T 1438 T ATCC 9545 T ATCC 13537 T a de cepas de referencia deben utilizarse para comparaciones y filogenia Nuestros resultados corroboraron este criterio ya que al comparar RFLP patrones obtenidos tanto in silico como experimentalmente, algunas diferencias Alu I y Taq I ( Tabla 3 ), mientras que no se detectaron diferencias en un gel (Cuadro 4). Se observó una situación similar para la cepa LPcer1 de B. cereus Sin embargo, las cepas pertenecientes a la misma especie mostraron un RFLP único. enzimas de estricción Rsa I y Cfo I. En el presente estudio, un RFLP simple mediante amplificación por PCR del 16S lizados aquí, se detectaron un total de 88 patrones de restricción para todos los endonucleasas de restricción probadas ( Tabla 5 y Fig.1). Por ejemplo, el grupo (Tabla S1). Se obtuvieron resultados similares para B. badius , B. cereus sensu stricto, B. circulans, B. clausii, B. coagulans, B. firmus, B. megaterium, 15095 T Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens calidad; una secuencia casi completa (> 1400 nt, <0,5% de ambigüedad) Se encontró que el patrón de restricción Alu I de B. licheniformis era único 818 T Paenibacillus larvae subsp. larvas Las secuencias de genes de ARNr 16S en bases de datos públicas son a veces de baja utilizando Cfo I, ocho patrones de restricción específicos de especies únicos para B. cereus sensu stricto, B. megaterium, B. mycoides, B. thuringiensis, Br. borstelensis, Se observaron L. fusiformis, L. sphaericus y R. stabekisii, respectivamente. (Cuadro 5 ). En el caso de Hae III, se obtuvieron nueve patrones únicos para N / A: No aplica. B. badius, B. circulans, B. clausii, B. coagulans, B. firmus, Br. laterosporus, P. alvei, P. apiarius y P. polymyxa ( Cuadro 5). Cuando se usa Hinf I, 10 Se detectaron patrones únicos para B. badius, B. cereus sensu stricto, B. circulans, B. clausii, B. coagulans, B. firmus, P. alvei, P. larvae subsp. 2.3. Análisis in silico de secuencias de genes de ARNr 16S larvas, P. larvae subsp. pulvifaciens y R. stabekisii. Al usar Rsa I, Se obtuvieron nueve patrones únicos para B. amyloliquefaciens, B. coagu- Veintiséis especies diferentes pertenecientes a 5 géneros diferentes de lans, B. licheniformis, P. alvei, P. apiarius, P. larvae subsp. larvas, P. larvae Se analizaron las bacterias formadoras de esporas reportadas en la miel. In silico RFLP subsp. pulvifaciens , P. polymyxa y R. stabekisii. Finalmente, al probar El análisis se realizó utilizando endonucleasas Rsa I, Hae III, Alu I, Hin fI, Taq I, se visualizaron nueve patrones únicos para B. circulans, B. coagulans, Taq I y Cfo I, respectivamente. Un total de 94 fragmentos de restricción teóricos B. firmus, fr. laterosporus, P. alvei, P. apiarius, P. larvae subsp. larvas, P. Los patrones de ment se obtuvieron utilizando el software http: //nc2.neb. larvas subsp. pulvifaciens y P. polymyxa. com / NEBcutter2 /. Probamos treinta y nueve secuencias de ARNr 16S de cultivos tipo En el caso de grupos estrechamente relacionados, es decir , B. cereus y B. subtilis (Bağcıoğlu et al., 2019 ; Fan et al., 2017, Guinebretière et al., 2013 ; extraído de NCBI GenBank ( Tablas 2 y 3) y cincuenta y nueve ARNr 16S Dunlap y col., 2016 ; Hutsebaut y col., 2006; Haque y Russel, 2005 ; secuencias de cepas obtenidas de muestras de miel previamente Jeyaram y col., 2011 ; Manzano et al., 2003; Shaver y col., 2002 ; Vilas- portadoAlippi y Abrahamovich, 2019; Bartel et al., 2018; Minnaard Boas et al., 2007), la técnica descrita aquí nos permitió diferenciar y Alippi, 2016 ) (Tablas 1 y 3). identificar especies estrechamente relacionadas. Como especies dentro de B. cereus grupo reportado en miel ( B. cereus sensu stricto, B. mycoides y B. thuringiensis ) se pueden separar utilizando AluI ( Tabla 5 y Fig.2 A) o https://translate.googleusercontent.com/translate_f 4/12 4/9/2021 Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora… 3. Resultado y discusión Cfo I (Tabla 5 y Fig.2 B). B. cereus sensu stricto, B. thuringiensis y B. mycoides mostraron distintos fragmentos Alu I de aproximadamente 600 pb (Fig.1 A, carril Para determinar si los amplicones específicos de la especie de Bacillus, C y Fig. 2 A, carril 1); 593 pb (Fig. 1A, carril L y Fig. 2A, carriles 3 y Brevibacillus, Lysinibacillus, Rummeliibacillus, y Paenibacillus cepas 4) y 550 pb (Fig. 1A, carril J y Fig. 2A, carril 2), respectivamente. En de miel , se realizaron digestiones de restricción con Además, cuando se utiliza Cfo I, B. cereus sensu stricto mostró un distintivo 4 Página 5 AC López y AM Alippi Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690 ) página Siguiente sobre I Taq 907-359-214-50. 907-359-147-6. 891-292. 819-359-107 909-499-34. 771-541-138-62 771-528-138-45 771-540-138-41 771-484-129-9-6 772-465-127 771-223-138-10 771-483-425 770-541-122-31-14 561-409-380-120-35 561-408-380-120-8 535-380-374-120 908-534-35 904-312-232-39 582-500-467 500-408-359-168-33 500-359-176-51 908-573-48 907-507-6 545-488 771-541-138-11 771-506-138-6 905-359-173-44 906-359-147-6 906-359-38-38 892-359-145. 906-33-26 882-359-145 896-572-45-9 500-407-359-110-33 500-407-359-147-66 771-542-138-35. (continuado GeneBank. I Rsa 501-466-406-99. 501-437-406-75. 501-443-406-59. 501-406-343-35 439-406-354-146-68-18-11. 495-406-355-146-110 478-406-355-146-97 444-406-355-149-106. 439-406-355-146-53. 422-407-355-146-34 443-406-293. 420-406-355-146-52 438-406-357-146-111-18-11 433-406-355-146-130-19-11-5 409-406-355-146-70-20-11 406-368-355-146-104-19-11 491-406-357-149-146 438-406-357-146-101-18-11 451-406-357-146-140-18-11 501-435-406-96-19-11 503-453-406-102-19-11 438-406-357-146-110-18-11 438-406-357-146-74-18-11 405-357-146-112-11-2 444-406-355-146-110 439-406-355-146-75 501-436-406-91 501-407-406-75-19-11 468-467-406 501-416-406-73. 463-406-96 470-406-96 446-406-356-146-139-18-11 501-446-406-134-19-11 501-407-406-75-19-11 468-406-355-146-111 de secuencias ARNr I 16S Hinf 605-372-316-154-25. 606-372-287-129-25. 605-372-293-114-25. 605-372-193-90-25 975-319-123-25 977-345-165-25 977-328-172-25 977-324-164-25. 977-289-108-25 978-272-89-25 824-293-25 977-270-105-25 607-351-318-166-25-20 790-372-318-25 730-373-289-25 764-372-248-25 979-366-204 547-371-318-156-60-25 978-331-195-25 605-372-315-151-25 605-372-333-155-25-4 978-318-165-25 978-288-129-25 866-167 977-294-165-25 977-289-130-25 605-371-287-146-25 605-371-287-128-25 605-371-319-25-21 605-371-267-128-25. 371-314-25-25 605-314-25-25 917-275-194-60-51-25 605-372-326-189-25 605-372-287-130-25 977-318-166-25 publicado sobre basado I Taq y I, sitio III Hae Rsa 599-457-289-105-22. 599-457-260-81-22. 599-457-266-65-22. 599-457-166-41-22 564-365-292-91-74-34-2.2 565-457-291-117-34-22. 565-457-301-103-34-22 565-460-297-112-34-22 565-457-262-59-34-22 566-457-212-40-34-33-22 565-266-255-34-22 565-457-243-58-34-22 438-406-357-146-111-18-11 627-264-216-208-85-78-22-5 567-264-217-184-85-78-22 601-264-216-143-85-78-22 404-367-236-155-92-85-76-44 564-459-213-107-44-34-34-22 598-459-226-146-78-22 599-457-288-102-22 599-457-306-108-22 598-459-200-120-78-22 598-459-183-80-78-22 459-319-137-118 565-457-267-116-34-22 565-457-262-81-34-22 598-457-260-97-22 598-457-260-79-22 598-429-292-22 598-457-240-79-22 598-287-58-22 598-459-240-79-22 479-458-221-145-85-78-34-22 599-457-269-140-22 599-457-260-81-22 556-457-291-117-34-22. fI, Hin III, Hae I, reconocimiento 4 pb a con Director de Finanzas I, Alu enzimas I por Director de Finanzas 869-426-235. 869-359-191 869-165-149. 869-319-97 352-345-336-223-182-2-2. 586-394-346-182-2-2. 569-381-346-182-2-2 585-393-346-182-2-2 530-346-337-182-2-2 513-347-318-182-2-2 534-351-182-71-2-2 511-346-336-182-2-2 392-348-336-216-182-2-2 414-346-337-214-182-6-2-2-2 354-346-338-193-182-2-2 388-346-337-182-152-2-2 385-348-336-222-182-2-2 395-348-336-222-182-2-2 433-348-245-236-182-101-2-2 380-346-337-219-182-2-2 388-346-337-237-182-2-2 531-350-348-182-2-2 528-358-348-182-2-2 396-348-181-77-27-2-2 535-394-346-182-2-2 530-359-346-182-2-2 867-385-229 868-359-191 868-250-223 868-357-171. 747-218 900-250-223 423-347-336-230-182-2-2 869-342-218 869-359-191 559-395-346-182-2-2 restricción seis generado con pares) base adquirido (en bandas Talla I Firma Alu 430-265-207-201-186-173-68. 430-265-207-186-173-134-24. 430-207-187-186-173. 430-265-207-186-173-94 429-392-206-186-176-53 599-224-186-174-169-81-58-21 599-224-186-174-156-64-58-21 599-224-186-174-168-60-58-21 599-224-186-174-112-79-9 600-398-186-93-58-21-8 601-224-174-114-29 599-224-186-174-111 824-265-170-84-56-50-38 454-419-218-186-88-86-54 419-394-219-186-88-85-26 428-419-218-186-88-70 616-473-209-174-77 824-425-124-53-51 615-265-209-199-88-86-67 823-265-210-141-73-33 823-265-163-141-69-33 615-265-209-134-86-54 615-265-209-123-88-86-24-10 388-265-209-123-48 552-224-186-174-169-58-47-30-21 552-224-186-174-134-58-47-25-21 428-265-207-186-160-88-85-62 429-265-207-186-134-88-85-24 429-265-207-186-88-85-56-25 429-265-207-186-132-88-85-4 429-186-126-88-85-51 429-265-186-130 615-463-208-88-85-63 430-265-207-186-173-130-51 430-265-207-186-173-134-24 599-224-186-174-170-58-54-21 fragmentos restricción de https://translate.googleusercontent.com/translate_f 5/12 4/9/2021 Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora… predicción T T amyloliquefaciens 23350 3 Especies T 434 T badius cereus 14574 14579 11778 T T T circula clausii 4513 8716 T T T coagulanos firmus flexo licheniformis megaterio 15306 15715 14580 7050 14581 T T mycoides 6462 pumilus 7061 T T simplex subtilis 15720 12118 T thuringiensis 10792 Bacilo ATCC m39-m287b-m163b-m164b-m291b mv35xx Bacilo ATCC Bacilo ATCC ATCC m6c-mv33 LPcer1 m387MexB MexC Bacilo ATCC Bacilo DSMFr231 m448b Bacilo ATCC Bacilo NBRC Bacilo NBRC Bacilo ATCC mv55-mv68 Bacilo ATCC m327m435Bacilo ATCC m336Bacilo ATCC m330-m288-m339-m354-m357-m358 mv41aA-m363-m414-m360-mv49bmv74mv81m350m116 Bacilo NBRC Bacilo YO SOY m392-cm45-m191-m13-m347-329-334 Bacilo ATCC Mesa Teórico 5 Página 6 AC López y AM Alippi Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690 I Taq 772-494-137-8 771-269-138-7 499-395-357-202-33 499-395-303-202-9 499-395-320-202-35 894-339-202-35 894-275-202-6 879-562-45-29 908-506-8908-562-45 908-505-6789-568-120-50 789-504-120-9 645-528-260-56 788-473-120-49-7 789-515-120-28 701-513-120 789-570-120-42 904-531-14 904-508-10 I Rsa 440-406-356-146-63 440-406-339 412-400-355-146-119-19-11-9 415-398-355-146-74-19-11 424-405-355-146-101-19-11 454-405-355-146-110 425-405-355-146-46 503-448-406-129-18-11 503-411-406-73-18-11 503-415-406-66-18-11 503-409-406-72-18-11 484-340-170-146-144-137-91 443-340-235-170-146-73-15 596-526-311-34-22 489-405-344-146-38-15 462-405-344-146-80-15 462-405-344-146-80-15 476-405-342-147-136-15 434-406-357-146-101-18-11 409-406-357-146-75-18-11 I Hinf sitio 978-290-118-25 870-290-25 1001-263-183-39 1001-263-129-15 1001-252-156-41-9-2 1001-304-165 1001-275-101 978-328-184-25 978-291-128-25 978-295-121-25 978-289-127-25 1167-335-25 1103-294-25 801-338-325-25 1072-332-25-8 919-313-195-25 919-313-195-25 799-370-327-25 893-339-156-85 893-314-130-85 III Hae 566-457-263-69-34-22. 565-301-263-34-22 598-457-177-134-44-34-22 598-457-173-80-44-34-22 598-457-199-107-44-34-22 457-410-199-188-116-78-22 457-410-188-170-78-52-52 598-459-223-135-78-22 598-459-186-79-78-22 598-459-190-78-72-22 598-459-184-78-78-22 1124-308-73-22 1133-267-22 596-526-311-34-22 286-247-235-231-215-123-78-22 286-247-240-231-208-123-78-22 286-247-240-231-208-123-78-22 689-288-222-222-44-34-22 598-459-209-70-44-37-34-22 598-459-184-70-44-34-22-11 reconocimiento 4 pb a con enzimas I Director 531-347-347-182-2-2 de Finanzas 531-346-182-122-2-2 412-346-337-181-175-31-2-2 358-346-337-181-151-31-1-1 385-346-337-208-181-2-2 394-346-337-181-177-31-2-2 346-337-330-181-148-31-2-2 413-348-336-232-182-2-2 357-348-336-195-182-2-2 400-348-336-232-182-2-2 356-348-336-193-182-2-2 421-346-336-239-181-2-2 357-346-336-198-181-2-2 348-344-336-242-181-34-2-2 348-336-324-244-181-2-2 366-348-336-217-181-2-2 364-348-336-181-101-2-2 423-346-336-231-181-2-2 382-360-348-182-165-8-2-2 380-359-348-182-161-8-2-2 restricción seis con adquirido bandas I Firma Alu 600-224-186-174-122-58-26-21 599-224-186-174-162-26 403-229-210-200-98-81-33-4 403-212-207-205-189-81-74-33-4 425-403-212-161-159-46-43-12 452-403-212-181-179-46-33 403-370-212-161-152-46-33 615-246-209-207-174-64 615-209-207-190-174-27 615-216-209-207-174-64. 615-209-207-189-174-25 461-419-216-186-157-88 419–216-186-116-88 587-422-186-160-88-46 637-364-186-163-73-14 637-406-186-135-74-14 637-404-186-73-20-14 419-390-216-186-88-87-72-62 615-215-209-207-86-85-32 615-209-207-192-86-85 larvas . .pulvifaciens subsp subsp apiarius larvas larvas ) T borstelensis brevis T stabekisii T laterosporus fusiforme T https://translate.googleusercontent.com/translate_f sphaericus T alvei T polymyxa T 6/12 4/9/2021 Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora… T continuado ( 3 NRS-1438 Especies 15304 T 25 7055 15095 T 29 NRS-1438 9545 B-14154 13537 T 842 mv50b m395 Brevibacillus NRRL RC-m348 Brevibacillus NBRC Brevibacillus DSMlat169-lat170-lat171 Lisinibacilo ATCC mv119 Lisinibacilo NBRC m533-LMDZ Paenibacillus DSMmv82-m420-m291a Paenibacillus NRRL Paenibacillus ATCC Paenibacillus NRRL ATCC Paenibacillus ATCC Rummeliibacillus KSC-SF6g mv111 Mesa 6 Página 7 AC López y AM Alippi Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690 ) página Siguiente sobre I Taq 907-359-147 910-500 771-540-138 770-541-122 561-408-380-120 910-535 904-312-232 500-359-176 910-500 771-540-138 907-359-147 500-359-176 771-540-138 499-395-323-202 499-395-323-202 894-275-202 910-500 910-500 789-504-120 continuado ( I Rsa 501-437-406 438-406-354-146 444-406-355-149106 438-406-357-146 409-406-355-146 491-406-357-149146 438-406-357-146 503-453-406-102 438-406-357-146 439-406-355-146 501-407-406 501-407-406 440-406-356-146 405-398-355-146 425-405-355-146 425-405-355-146 503-410-406 503-410-406 443-340-235-170146 sitio I Hinf I. Taq reconocimiento y I, 4 pb a Rsa I, con 606-372-287-130 975-319-123 977-324-164 607-351-318-166 764-372-248 979-366-204 547-371-318-156 606-372-287-130 978-288-130 978-289-130606-372-287-130 606-372-287-130 978-288-130 1001-263-1291001-263-1291001-263-129978-288-130 978-288-130 1100-294 III Hinf III, enzimas Hae 600-457-260 564-365-292 565-460-297-112 438-406-357-146111 600-264-216-143 404-367-236-155 564-459-213-107 600-457-260 598-457-173 565-460-297-112 600-457-260 600-457-260 565-460-297-112 598-457-173 598-457-173 457-410-188-170 598-457-173 598-457-173 1133-267 Hae I, restricción Director de Finanzas I, seis Alu con I Director de Finanzas 869-359-191 352-345-336-223182 585-393-346-182 395-348-336-216182 354-346-338-193182 395-348-336-222182 395-348-336-222182 388-346-337-237 571-424-348-182 535-394-346-182 868-359-191 869-359-191 531-347-347-182 358-346-337-181151 385-346-337-208181 395-348-336-216182 415-350-336-232182 360-350-336-190 420-350-335-232182 con adquirido digesto pb bandas I 1490 de Firma Alu 430-265-210-186170 430-390-205-186170 600-224-186-170 824-265-170 428-420-220-190. 620-470-200-170 824-425-125 823-265-210-170 615-265-210-170 552-224-186-170 430-265-210-186 430-265-210-186170 593-220-186-170 400-210-190 425-403-210-160 425-403-210-160 615-210-200-170 615-210-200-170 420-390-220-190 fragmento ARNr 16S Amplificado por PCR a de pares) mv41aA-m363-m414-m360-mv49b-mv74-mv81- base (en Talla fragmentos -434LPcer1-m387-MexB-MexC restricción T https://translate.googleusercontent.com/translate_f -mv50b-m395 borstelensis brevis T -m330-m288-m339-m354-m357-m358 laterosporus fusiforme sphaericus alvei 7/12 4/9/2021 Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora… amyloliquefaciens badius 4 cereus circula 11778-m6c-mv33 4515 0196 clausii coagulanos firmus 35670 8247 detectable Especies Bacilo m39-m287b-m163b-m164b-m291b-mv35-xx Bacilo CCT Bacilo ATCC Bacilo ATCC Bacilo Fr231-m448b-BcIENT Bacilo ATCC Bacilo ATCC licheniformis 1001-mv55-mv68 megateriomycoidespumilus subtilis thuringiensis 15304 B B-939-m327-m435 10206-m336-m425 7061 B-543-m392-cm45-m191-m13-m347-329-334 10792 m350-m116 Bacilo NRRL Bacilo NRRL Bacilo ATCC Bacilo ATCC Bacilo NRRL 245-m533-LMDZA B-383-mv82-m420-m291a Bacilo ATCC Brevibacillus RC-m348Brevibacillus NBRC Brevibacillus LAT169-LAT170-LAT171 Lisinibacilo mv119 Lisinibacilo ATCC Paenibacillus NRRL Mesa Gel 7 Página 8 AC López y AM Alippi Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690 Cuadro 5 Patrones de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) de amplificación por PCR Genes de ARNr 16S entre las especies aeróbicas formadoras de esporas utilizadas en este estudio. Especies I Taq I Rsa 487-339-234-170 489-405-344-146 462-405-344-146 476-405-342-147136 434-406-357-146101 sitio I Hinf 800-338-325 1072-332 920-313-195 800-338-325 893-314-130 reconocimiento 4 pb a con III enzimas Hae Patrón obtenido con enzima de restricción: 645-528-260 788-473-120 701-513-120 789-570-120 910-500 596-526-311 286-247-235-231215 286-247-240-231215 689-288-222 598-457-173 Alu yo Cfo I Hae III Hinf yo Rsa I Taq I Bacillus amyloliquefaciens A A A A A A Bacilo badius B B B B B B Bacillus cereus sensu stricto C C C C C C Bacillus circulans D D D D B D Bacilo clausii mi B mi mi D mi Bacillus coagulans F D F F mi F Bacilo firmus GRAMO D GRAMO GRAMO B GRAMO Bacillus licheniformis H mi A A F H Bacillus megaterium I F H H B B Bacillus mycoides J GRAMO C H B C Bacillus pumilus K A A A GRAMO A Bacillus subtilis A A A A GRAMO H bacilo turingiensico L H C H C C Brevibacillus borstelensis METRO I H I D I Brevibacillus brevis norte mi H I H I Brevibacillus laterosporus norte D I I H J Lysinibacillus fusiformis O J H H I B Lysinibacillus sphaericus O K H H I B Paenibacillus alvei PAG L J J J K Paenibacillus apiarius Q B K K K L Paenibacillus larvae subsp. R B L L L METRO R B L METRO METRO norte Paenibacillus polymyxa PAG L METRO K norte O Rummeliibacillus stabekisii O METRO H norte O B Total 18 13 13 14 15 15 larvas Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens restricción seis con I Director de Finanzas 352-345-336-220182 352-345-336-220182 352-345-336-220182 420-350-335-232180 380-360-350-180160 fragmento de aproximadamente 585 pb (Figura 1B, carril C y Fig.2B, carril 1), mientras que B. adquirido thuringiensis y B. mycoides mostraron distintos fragmentos C fo I de aproximadamente 531 pb (Fig. 1B, carril H, y Fig. 2B, carril 3) y 535 pb (Fig. 1B, carril G, bandas y Fig. 2B, carril 2), respectivamente. Es interesante señalar que todos las especies pertenecientes al grupo B. cereus presentan una Taq I distinta I Firma Alu 590-420-186-160 640-400-186 640-400-186 420-390-220-190 615-215-210-200 patrón (C) diferente al resto de Bacillus y parientes de fuentes de colmena ( Tabla 4 y Fig.1F, patrón C). Miembros de este grupo mostró un alto grado de similitud con solo 7-9 nucleótidos dispersos diferencias en la secuencia del gen del ARNr 16S ( Ash et al., 1991 ; Daffonchio et al., 1998; Wu et al., 2006 ), estas diferencias fueron suficientes para permitir Identificación por PCR-RFLP en el presente estudio. Además, probamos in silico el resto de especies del grupo, es decir , B. anthracis, B. cytotoxicus, B. pseudomycoides y B. toyonensis y pudieron discriminar entre ellos utilizando Cfo I (Tabla S2). Manzano y col. (2003) encontró diferencias entre estas especies mediante el uso de la digestión enzimática de gyrB por Sau3A I, mientras que Daffonchio et al. (1988) no encontraron diferencias aparentes en su análisis del ARNr 16S-23S ITS. En estudios previos, encontramos diferentes diferencias entre B. cereus y B. mycoides con un ensayo de PCR-RFLP utilizando Cebadores específicos de bacilo U1 / U2 seguidos de digestión con Alu I o Hae III (Alippi et al., 2002). Además, dentro del grupo de B. subtilis estrechamente relacionado , la combinación de los patrones de restricción Alu I y Taq I o Rsa I obtenidos para B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus y B. licheniformis nos permitieron diferenciar identificarlos dentro del grupo y a partir de los generados por el resto de las especies probadas y reportadas en la miel (Tabla 5 , Fig.1A patrones A, H, y K). Por ejemplo, un fragmento de 825 pb después de la digestión con Alu I fue larvas 10367 pulvifaciens subsp. subsp. encontrado en todas las cepas de B. licheniformis analizadas, mientras que está ausente en el resto de los grupo ( Tabla 4 y Fig.1A, patrón H). Además, cepas de B. licheniformis carecía de un fragmento de 430 pb que estaba presente en el resto del grupo ) stabekisii apiarius continuado larvas T -PL36 larvas polymyxa T -SAG290-SAG https://translate.googleusercontent.com/translate_f (Tabla 4 y Fig.1A, patrón H). Por otro lado, las cepas de B. pumilus carecía de un fragmento de Alu I de 170 pb presente en el resto del grupo (Tabla 4 y Fig. 1A, patrón K). Cuando se usa Taq I, las cepas de B. 8/12 4/9/2021 Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora… 29575 ( 4 Especies 9545 13537 B-510 subtilis y B. licheniformis mostraron un patrón distintivo (H) diferente de el patrón (A) observado en las cepas de B. pumilus y B. amyloliquefaciens (Tabla 4 y Fig.1 F). Además, lospatrones de restricción de Rsa I obtenidos permitieron Paenibacillus ATCC Paenibacillus ATCC Paenibacillus ATCC Paenibacillus NRRL Rummeliibacillus mv111 Mesa 8 Página 9 AC López y AM Alippi Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690 Fig. 1. Patrones de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) de genes de ARNr 16S amplificados por PCR encontrados entre todos los aislamientos aeróbicos formadores de esporas analizados ( n = 80) digeridos con (A) Alu I, (B) Cfo I, (C) Hae III, (D) Hinf I, (E) Rsa I y (F) Taq I, respectivamente. (A) Alu I: Carril MM: Marcador de tamaño molecular en escalera de 100 pb (InbioHighway®, Tandil, Buenos Aires, Argentina) (el tamaño se indica a la izquierda en pb). Carriles: A, B. amyloliquefaciens m39; B, B. badius CCT 0196; C, B. cereus m6c; D, B. circula ATCC 4515; E , B. clausii Fr231; F, B. coagulans ATCC 35670; G, B. firmus ATCC 8247; H, B. licheniformis mv55; I, B. megaterium m327; J, B. mycoides m425; K, B. pumilus m330; L, B. thuringiensis mv50b; M, Br. borstelensis RC; N, Br. laterosporus LAT170; O, L. sphaericus m533; P, P. alvei m291a; Q, P. apiarius ATCC 29575; R, P. larvae subsp. larvas PL36. (B) Cfo I: Carril MM: Marcador de tamaño molecular en escalera de 100 pb (InbioHighway®, Tandil, Buenos Aires, Argentina). Carriles: A, B. amyloliquefaciens m39; B, B. badius CCT 0196; C, B. cereus ATCC11778; D, B. circula ATCC 4515; E, B. licheniformis mv68; F, B. megaterium m435; G, B. mycoides m425, H , B. thuringiensis ATCC10792 T ; Yo, fr. borstelensis m348; J, L. fusiformis mv119; K, L. sphaericus LMDZA; L, P. alvei mv82; M, R. stabekisii mv111. (C) Hae III. Carriles: MM: Marcador de tamaño molecular en escalera de 100 pb (InbioHighway®, Tandil, Buenos Aires, Argentina) (el tamaño se indica a la izquierda en pb); A, B. amyloliquefaciens m163b; B, B. badius CCT 0196; C, B. cereus mv33; D, B. circula ATCC 4515; E, B. clausii Fr231; F, B. coagulans ATCC 35670; G, B. firmus ATCC 8247; H, B. megaterium m327; Yo, fr. laterosporus LAT170; J, P. alvei m420; K, P. apiarius ATCC 29575; L, P. larvae subsp. larvas PL36; M, P. larvae subsp. pulvifaciens ATCC13537 T . (D) Hinf I. Carriles: MM, Marcador de tamaño molecular en escalera de 100 pb (InbioHighway®, Tandil, Buenos Aires, Argentina); A, B. subtilis m191 ; B, B. badius CCT 0196; C , B. cereus LPcer1; D, B. circulans ATCC 4515; E, B. clausii Fr231; F, B. coagulans ATCC 35670; G, B. firmus ATCC 8247; H, B. thuringiensis ATCC10792 T ; Yo, fr. laterosporus LAT169; J, P. alvei m291a; K, P. apiarius ATCC 29575; L: P. larvae subsp. larvas PL36; M, P. larvae subsp. pulvifaciens ATCC13537; N, R. stabekisii mv111. (E) Rsa I: MM: marcador de tamaño molecular 100 pb escalera (InbioHighway®, Tandil, Buenos Aires, Argentina) (el tamaño se indica a la izquierda en pb); carril A, B. amyloliquefaciens m39; B, B. badius CCT0 196; carril C, B. cereus m6c; D, B. clausii Fr231; E, B. coagulans ATCC 35670; F, B. licheniformis mv68; G, B. pumilus m360; H, Br. laterosporus LAT169; I, L. fusiformis mv119; J, P. alvei mv82; K, P. apiarius ATCC 2957; L, P. larvae subsp. larvas PL36; M, P. larvae subsp. pulvifaciens ATCC13537 T ; N, P. polymyxa NRRLB-510; O, R. stabekisii mv11. (F) Taq I: Carriles: MM, marcador de tamaño molecular en escalera de 100 pb (InbioHighway®, Tandil, Buenos Aires, Argentina), A , B. amyloliquefaciens mv35; B, B. badius CCT0196; C, B. cereus m387; D, B. circula ATCC 4515; E, B. clausii m448b; F, B. coagulans ATCC 35670; G, B. firmus ATCC 8247; H, B. subtilis m347; Yo, fr. borstelensis RC; J, Br. laterosporus LAT171; K, P. alvei m420; L, P. apiarius ATCC 29575; M: P. larvae subsp. larvas PL36; N, P. larvae subsp . pulvifaciens SAG 290; O, P. polymyxa NRRL B-510. para diferenciar B. subtilis (G) y B. licheniformis (F) de B. amy- con Alu I, Hae III, Hinf I y Taq I (Tabla 4 y Fig.1Carriles A, C, D y F loliquefaciens (A) y B. pumilus (A) ( Cuadro 5 y Fig. 1 E). Similar respuesta D y G, respectivamente); B. clausii mostró Alu I, Hae III, Hinf I y Los resultados fueron observados por Jeyaram et al. (2011) con un ensayo PCR-RFLP Patrones de Taq I ( Tabla 4 y Fig.1A, C, D y F, carriles E); B. coagulans utilizando cebadores fD1 / rD1 seguido de una restricción con Rsa I o Cfo I. también mostró patrones de Alu I, Hae III, Hinf I, Rsa I y Taq I (Tabla 4 y Sin embargo, Wu et al. (2006) encontraron algunas limitaciones al intentar dis- Figura 1A, C, D, E y F, carriles F, F, F, E y F, respectivamente), y finalmente, tinguish entre los miembros del grupo B. subtilis y también tres especies Las cepas de B. megaterium mostraron patrones únicos de Alu I y Cfo I (Tabla 4 y en el grupo de B. cereus mediante el uso de restricción de ADN ribosómico amplificado Fig. 1A, línea I y Fig.1B, carril F). Wu observó resultados similares Análisis (ARDRA) de amplicones de PCR obtenidos con cebadores BeK1. Sobre et al. (2006) con aislamientos de B. badius, B. clausii y B. coagulans para por otro lado, cuando se prueban in silico, todas las especies pertenecientes a B. Alu I y Taq I. subtilis que no se han reportado en la miel, la combinación de Alu I, Cfo I, Rsa I y Taq I nos permitieron diferenciarlos (Tabla S1). Dentro del resto de las especies de Bacillus , B. badius mostró Alu I único , https://translate.googleusercontent.com/translate_f Al analizar especies de Brevibacillus , Br. borstelensis, fr. brevis y fr. laterosporus mostró patrones únicos de Alu I, Taq y Hae III respectivamente que nos permitió diferenciarlos del resto de esporas aeróbicas 9/12 4/9/2021 Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora… Patrones de Hae III y Hinf I ( Tabla 4 y Fig.1 A carril B, Fig.1 C, carril B, formadores encontrados en la miel ( Tabla 5 ). Además, las tres especies pueden ser diferentes y Fig.1D, carril B); B. circulans y B. firmus mostraron patrones distintos diferenciados entre ellos mediante el uso de Cfo I (Cuadro 5). Fue previamente 9 Página 10 AC López y AM Alippi Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690 Declaración de intereses en competencia Ninguno. Expresiones de gratitud Esta investigación fue apoyada por la Agencia Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (ANPCyT, Argentina, Beca No. PICT 20172014). ACL es miembro de la Carrera de Investigación Científica del CONICET (CCT La Plata, Argentina), y AMA es Miembro del Comité Científico Carrera Investigadora del CIC (Prov. Bs. As.), Argentina. Referencias Ahmed, I., Yokota, A., Yamazoe, A., Fujiwara, T., 2007. Propuesta de Lysinibacillus boronitolerans gen.nov . sp. nov., y transferencia de Bacillus fusiformis a Lysinibacillus fusiformis peine. nov. y Bacillus sphaericus a Lysinibacillus sphaericus comb. nov. En t. J. Syst. Evol. Microbiol. 57, 1117–1125. Alippi, AM, 1995. Detección de esporas de larvas de Bacillus en medio selectivo argentino. Microbiología 11, 343–350. Alippi, AM, Abrahamovich, E., 2019. 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Se informó anteriormente que una combinación de siete restricciones endonucleasas ( Alu I, Msp I, Hae III, Hin fI, Cfo I, Rsa I y Taq I) y espeLos cebadores específicos U1 / U2 podrían separar 25 especies diferentes de Paenibacillus entre ellos excepto en el caso de P. borealis y P. macquariensis ( Alippi et al., 2002 ). Wu y col. (2006) desarrollaron un protocolo PCR-ARDRA utilizando Bacebadores específicos de cillus B-K1F / B-K1R para amplificación por PCR y dos enzimas de restricción ( Alu I y Taq I) para diferenciar 15 cepas de referencia el género Bacillus revelado por análisis comparativo de ARN ribosómico de subunidades pequeñas secuencias. Letón. Apl. Microbiol. 13, 202-206 . Bağcıoğlu, M., Fricker, M., Johler, S., Ehling-Schulz, M., 2019. Detección e identificación ción de Bacillus cereus , Bacillus cytotoxicus , Bacillus thuringiensis , Bacillus mycoides y Bacillus weihenstephanensis mediante espectroscopia FTIR basada en aprendizaje automático. Parte delantera. 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Caracterización y elaboración de perfiles de Bacillus subtilis , Bacillus cereus y Bacillus ( n = 2) especies, pero el procedimiento fue restringido por su incapacidad para licheniformis mediante huellas dactilares masivas MALDI-TOF. Microbiol de alimentos. 33, 235–242. diferenciar especies estrechamente relacionadas dentro de B. subtilis y B. cereus grupos y algunas especies de Paenibacillus y Bacillus . En conclusión, hemos encontrado que un ensayo de PCR-RFLP utilizando universal cebadores 27f / 1492r y una combinación de tres enzimas de restricción, Alu I, Cfo I y Taq I, fue adecuado para distinguir 26 especies diferentes de Bacillus, Brevibacillus, Lysinibacillus, Rummeliibacillus y Paenibacillus. El método es simple y se puede utilizar para una preselección. y aislar la diferenciación de las especies aeróbicas formadoras de esporas, que https://doi.org/10.1016/j.fm.2012.09.022. Gilliam, M., 1979. Microbiología del polen y pan de abeja: El género Bacillus . 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Bacillus cytotoxicus sp. nov. es una nueva especie termotolerantes del muestras, teniendo en cuenta que un problema potencial será el hallazgo de especies de bacterias nuevas o no descritas en una muestra. https://translate.googleusercontent.com/translate_f Grupo de Bacillus cereus asociado ocasionalmente con intoxicación alimentaria. En t. J. Syst. Evol. Microbiol. 63, 31–40. Haque, A., Russell, NJ, 2005. Caracterización fenotípica y genotípica de Bacillus 10/12 4/9/2021 Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora… cereus aislado del arroz de Bangladesh. International J. Food Microbiol. 98, 23–34. Hutsebaut, D., Vandroemme, J., Heyrman, J., Dawyndt, P., Vandenabeele, P., Moens, L., Se pueden encontrar datos complementarios a este artículo en línea en https: // doi.org/10.1016/j.mimet.2019.105690 . 10 Página 11 AC López y AM Alippi 2006. 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